特許 6384685 組換えタンパク質の発現増進のための遺伝子断片を含むベクター及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6384685

(24)【登録日】2018年8月17日

(45)【発行日】2018年9月5日

(54)【発明の名称】組換えタンパク質の発現増進のための遺伝子断片を含むベクター及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20180827BHJP

   C12N 5/16 20060101ALI20180827BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180827BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/63 ZZNA

   C12N5/16

   C12P21/02 C

【請求項の数】5

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2016-574044(P2016-574044)

(86)(22)【出願日】2015年6月16日

(65)【公表番号】特表2017-518069(P2017-518069A)

(43)【公表日】2017年7月6日

(86)【国際出願番号】KR2015006098

(87)【国際公開番号】WO2015194834

(87)【国際公開日】20151223

【審査請求日】2017年2月14日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0073443

(32)【優先日】2014年6月17日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】505448855

【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(74)【代理人】

【識別番号】100148596

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 和弘

(72)【発明者】

【氏名】リー， ウン ギョ

(72)【発明者】

【氏名】リー， ホン‐ウォン

(72)【発明者】

【氏名】カン，シン ヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム， ヨン‐グ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン， ジュン キ

(72)【発明者】

【氏名】アン，ジョンオー

(72)【発明者】

【氏名】カン， スン ヒー

(72)【発明者】

【氏名】キム， チョン ソク

(72)【発明者】

【氏名】リー， ヒョク ウォン

(72)【発明者】

【氏名】リー， ジン ギョム

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０００−５０３２０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０２３７８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−１５２１２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Appl. Microbiol. Biotechnol.(2012), Vol.93, p917-930

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｎ １／００〜 ７／０８

Ｃ１２Ｐ １／００〜４１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなる遺伝子断片がプロモーターの上流及び目的遺伝子の下流のうち少なくとも一つの位置に挿入された、動物細胞内目的遺伝子の発現増加用組換えベクター。

【請求項2】

前記組換えベクターのプロモーターは、ウイルス由来または哺乳類由来のプロモーターであることを特徴とする請求項１に記載の目的遺伝子の発現増加用組換えベクター。

【請求項3】

前記配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなる遺伝子断片は、下記方法で選抜することを特徴とする請求項１に記載の目的遺伝子の発現増加用組換えベクター：
１）ＣＨＯ−Ｋ１遺伝子断片を獲得してベクターライブラリを構成するステップ；
２）前記ベクターライブラリをＣＨＯ−Ｋ１細胞株に形質導入して選択培地で培養した後、蛍光タンパク質発現率が遺伝子断片を挿入しないベクターを導入した対照群より高い細胞等を分類するステップ；
３）ステップ２）で分類した細胞等を単一クローンで培養して導入された遺伝子断片を捜すステップ；及び
４）捜し出した前記遺伝子断片の配列を分析するステップ。

【請求項4】

請求項１に記載の組換えベクターによって形質転換された動物細胞。

【請求項5】

１）請求項１に記載の発現増加用組換えベクターを製作するステップ；
２）前記発現増加用組換えベクターを動物細胞に形質転換するステップ；及び
３）前記形質転換された動物細胞を培養して生産されたタンパク質を獲得するステップを含む目的タンパク質を生産する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、動物細胞における組換えタンパク質の発現増進のためのＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞由来の新規遺伝子断片及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

高生産性を有する動物細胞株の製作は、当該生産目的タンパク質の産業的利用価値と連結され、このための過程には長時間と高費用が必要となる。高生産性動物細胞株を製作するために優先して考慮する点は、生産しようとする組換えタンパク質を効率よく発現するためのベクターの製作である。ベクターの構造を如何に製作するのかにより、追ってさらに高い価値を持つ生産細胞株の獲得に多くの影響を及ぼし得る。動物細胞内に挿入された外来遺伝子の発現は、染色質上に挿入されることによって安定化されるところ、挿入される位置によって発現率が変わり、細胞の生長や代謝にも影響を及ぼし得る。染色質に挿入された外来遺伝子は、時間の経過に伴い消滅する場合もあるので、遺伝子の発現が減少することを最小化し、発現率が最大に増進された細胞株の選別のために多くの研究が進められてきて、ベクター構造の変形はこれに至大なる大きな影響を及ぼすものと知られている。

【0003】

外部から伝達した遺伝子を細胞内に維持させながら増進された効果をみることができるようにする方法中の一つが、シス調節性因子（ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）を利用することである。シス調節性因子を含むベクターを利用して目的タンパク質をコーディングする遺伝子を細胞に導入する場合、染色質挿入位置に係わりなく目的タンパク質の発現を維持させることができ、発現増進の役割も担うことができる。マトリクス付着部位（ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ、ＭＡＲｓ）、汎用オープニングエレメント（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ、ＵＣＯＥｓ）、位置調節部位（ｌｏｃｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎｓ、ＬＣＲｓ）、インシュレータ（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）エレメント、安定化−反抑制子エレメント（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ、ＳＴＡＲｓ）などがその代表的な例であり、各遺伝子因子を利用したベクターシステムの構築と応用は、非常に主な分野として扱われてきた（Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２９、５９３−５９７、２０１１）。

【0004】

治療用タンパク質の生産細胞株として広く利用されているＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞遺伝子由来のシス調節性因子はＥＡＳＥ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）のみ知られており、これ以外は全て人間やマウス由来の遺伝子から多様な方法を介して発見してきた。ＥＡＳＥの発見は、腫瘍壊死因子レセプター（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を多量発現する生産細胞株に挿入されたベクターの遺伝的位置を見付けることにより発見された（ＡＥ Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９７）。既存に発見されていたシス調節性因子は、殆どバイオ医薬品生産会社で産業的、商業的に利用しているため、既存と違う方式でＣＨＯ細胞遺伝子由来の新しいシス調節性因子を選別し、これを含んだ組換えベクターを保有することは、バイオシミラーなどの多様なバイオ医薬品の開発過程に有効なものと見込まれる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとすする課題】

【0005】

本発明の目的は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなる遺伝子断片が挿入された目的遺伝子の発現増加用組換えベクターを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

前記目的を達成するため、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなる遺伝子断片が挿入された目的遺伝子の発現増加用組換えベクターを提供する。

【発明の効果】

【0007】

本発明に基づき、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に組換えタンパク質の発現増進のためのＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞由来の新規遺伝子断片を含んだベクターを形質転換すれば、目的タンパク質の発現能が増進されるので、これは治療用抗体などの生物医薬品の生産に有効に利用することができるはずである。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】プロモーターの前に動物細胞の遺伝子断片を挿入して目的遺伝子の発現を増進させる本発明の概略的模式図である。

【図2】ＥＧＦＰ／ｐｃＤＮＡＺｅｏ（ａ）とＥＧＦＰ／ｐｃＤＮＡＺｅｏ−Ｅ７７（ｂ）ベクターの模式図である。

【図3a】Ｅ７７が蛍光度の増進された細胞株の形成に寄与することを検証したグラフである：図３ａは細胞群間の差異を比べたものであり、図３ｂはＧＦＰ発現上位５０個の単一細胞株の間の蛍光度を比べたものである。

【図3b】Ｅ７７が蛍光度の増進された細胞株の形成に寄与することを検証したグラフである：図３ａは細胞群間の差異を比べたものであり、図３ｂはＧＦＰ発現上位５０個の単一細胞株の間の蛍光度を比べたものである。

【図4a】図４ａは、ｐＧＩＺベクターＣＭＶプロモーターの５’部分にＥ７７（配列番号１）、Ｅ７７逆順を含んだベクターとＥ７７を３’部分に含んだベクター、５’と３’全てにＥ７７を含んだベクターの一部を示す模式図と、これらベクターによる蛍光度発現の差異を比べたグラフである。

【図4b】図４ｂは、Ｅ７７（配列番号１）、Ｅ７７−ｔ１（配列番号２）、Ｅ７７−ｔ２（配列番号３）及びＥｘ７７（配列番号４）を含んだベクターの一部を示す模式図と、これらベクターによる蛍光度発現の差異を比べたグラフである。

【図4c】図４ｃ〜図４ｆのヒストグラムは、各ベクターによって形成された細胞群の蛍光発現度を対照群と比べて示したグラフである。

【図4d】図４ｃ〜図４ｆのヒストグラムは、各ベクターによって形成された細胞群の蛍光発現度を対照群と比べて示したグラフである。

【図4e】図４ｃ〜図４ｆのヒストグラムは、各ベクターによって形成された細胞群の蛍光発現度を対照群と比べて示したグラフである。

【図4f】図４ｃ〜図４ｆのヒストグラムは、各ベクターによって形成された細胞群の蛍光発現度を対照群と比べて示したグラフである。

【図5a】図５ａは、対照群及びＥ７７とＥｘ７７を含んだ抗体発現ベクターを導入した細胞群に対する単位細胞当りの抗体生産量を分析したグラフである。

【図5b】図５ｂは、図５ａグラフに対する詳細な資料である。

【図5c】図５ｃ〜図５ｅの点グラフ（ｄｏｔ ｐｌｏｔ）は、各細胞群の抗体生産量を蛍光分析した結果である。

【図5d】図５ｃ〜図５ｅの点グラフ（ｄｏｔ ｐｌｏｔ）は、各細胞群の抗体生産量を蛍光分析した結果である。

【図5e】図５ｃ〜図５ｅの点グラフ（ｄｏｔ ｐｌｏｔ）は、各細胞群の抗体生産量を蛍光分析した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下、本発明を詳しく説明する。

【0010】

本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなる遺伝子断片が挿入された目的遺伝子の発現増加用組換えベクターを提供する。

【0011】

本発明において、『ベクター』とは、好適な宿主内でＤＮＡを発現させることができる好適な調節配列に作動可能に連結されている外部ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ作製物をいう。本発明のベクターは、典型的に発現のためのベクターとして構築され得る。好ましくは、本発明のベクターは、組換えペプチドまたはタンパク質を発現させるためのベクターである。さらに、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主細胞にして構築され得る。本発明の組換え発現ベクターは、例えば、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターなどであってよい。本発明の目的上、プラスミドベクターを利用することが好ましい。かかる目的に用いられ得る典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当りに数百個のプラスミドベクターを含むよう、複製が効率よく行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターに形質転換された宿主細胞が選抜され得るようにする抗生剤耐性遺伝子、及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片が挿入可能な制限酵素切断部位を含む構造を有している。適した制限酵素切断部位が存在しないとしても、通常の方法に係る合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を用いれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にリゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。本発明に利用されるベクターは、当業界に公知の多様な方法を介して構築されてよく、これに対する具体的な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は本明細書に参照として挿入される。

【0012】

前記遺伝子断片は、前記目的遺伝子の前または前記目的遺伝子の後または前記目的遺伝子の前と後に同時に挿入するのが好ましいが、これに限定しない。

【0013】

本発明の具体的な実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなる遺伝子断片を、目的遺伝子の前または前記目的遺伝子の後または前記目的遺伝子の前と後に同時に挿入した。

【0014】

前記ポリヌクレオチドは、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）−Ｋ１細胞由来であるのが好ましいが、これに限定しない。

【0015】

前記組換えベクターのプロモーターは、ウイルス由来または哺乳類由来のプロモーターであるのが好ましく、具体的にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであるのがより好ましいが、これに限定しない。

【0016】

前記ベクターは、目的遺伝子、内部リボゾーム進入点（ＩＲＥＳ、Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）及び選別遺伝子を含むのが好ましく、前記選別遺伝子はゼオシン耐性遺伝子（ＺｅｏＲ）であるのがより好ましいが、これに限定しない。

【0017】

前記配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列からなる遺伝子断片は、下記方法で選抜されたものであるが、これに限定しない：
１）ＣＨＯ−Ｋ１細胞株由来の遺伝子断片を獲得してベクターライブラリを構成するステップ；
２）前記ベクターライブラリをＣＨＯ−Ｋ１細胞株に形質導入して選択培地で培養した後、蛍光タンパク質発現率が遺伝子断片を挿入しないベクターを導入した対照群より高く表れた細胞等を分類するステップ；
３）前記ステップ２）で分類した細胞等を単一クローンで培養して導入された遺伝子断片を捜すステップ；及び
４）前記捜し出した遺伝子断片の配列を分析するステップ。

【0018】

併せて、本発明は、前記組換えベクターを利用して目的遺伝子を生産する方法を提供し、具体的に
１）目的遺伝子の発現増加用組換えベクターを製作するステップ；
２）前記目的遺伝子の発現増加用組換えベクターを動物細胞に形質転換するステップ；及び
３）前記形質転換された動物細胞を培養して生産されたタンパク質を獲得するステップを含む目的遺伝子を生産する方法を提供する。
［発明を実施するための形態］

【0019】

以下、実施形態は専ら本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に基づき、本発明の範囲がこれら実施形態によって制限されないというのは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者において自明であるといえる。

【0020】

実施例１：ＣＨＯ細胞遺伝子断片を挿入したベクターライブラリの製作
本発明の目的を達成するため、緑色蛍光タンパク質発現ベクターを構築し、これにＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ−６１（商標））の遺伝子断片を挿入してライブラリを獲得する方式を進めた。先ず、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株のゲノムをＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ＆ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用してＣＨＯ−Ｋ１細胞から獲得した。抽出したゲノムＤＮＡは、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（ＮＥＢ）の処理濃度と温度、時間を異にして多様な条件で処理して断片に作った。ＤＮＡ １μｇ当たり２ユニットから２倍ずつ１０回まで希釈したＳａｕ３ＡＩ制限酵素を反応させ、３７℃、２５℃、１６℃及び４℃それぞれの温度で時間別に反応させ、反応が終了したＤＮＡはアガロースゲルに電気泳動した。電気泳動を実施したアガロースゲルからｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用して大きさ別にＤＮＡを抽出し、これをベクターに挿入する遺伝子断片として利用した。

【0021】

緑色蛍光タンパク質発現ベクターは、動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を基本ベクターにして、マルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）のＮｈｅＩ、ＸｂａＩ制限酵素の位置にｅＧＦＰを挿入して構築した。Ｓａｕ３ＡＩを処理した遺伝子断片の挿入のため、ＣＭＶプロモーターが始まる地点にＢａｍＨＩ制限酵素配列を生成し、これをＧＦＰ／ｐｃＤＮＡＺｅｏと名付けた。このように構築したベクターにＢａｍＨＩ制限酵素とＣＩＡＰを処理し、前記準備した遺伝子断片を接合させて大腸菌ＤＨ５αに導入した。ベクターを導入した大腸菌を、アンピシリンを含んだ固形培地プレートに塗抹して３７℃で一晩培養した。プレートに育ったコロニーの数を確認し、挿入していた遺伝子断片の大きさに従ってプレート等を分類し、コロニーをＬＢ培地フラスコに集めた。一つのフラスコに集めたコロニーを３時間ほど培養した後、ＤＮＡ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用してベクターを獲得した。獲得したそれぞれの試料をＤＮＡ ｐｏｏｌと名付け、これをベクターライブラリとして利用した。

【0022】

実施例２：形質導入及び細胞分類
前記実施例１で製作されたベクターライブラリをＣＨＯ−Ｋ１細胞株に形質導入し、選択培地での培養を介して緑色蛍光タンパク質を多様に発現する細胞群を獲得し、蛍光−活性化細胞分類器（ＦＡＣＳ）を介して対照群より高い蛍光値を有する細胞等を分類した。

【0023】

具体的に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｇｉｂｃｏ）を１０％含んだＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地で培養し、形質導入はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して製造社の指針に従い行った。形質導入の４８時間後、トリプシン処理して細胞を分離し、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれている選択培地に１０％ｖ／ｖになるように移して２週間培養した。遺伝子断片を挿入しないＧＦＰ／ｐｃＤＮＡＺｅｏベクターを導入した細胞も同様の過程を介して細胞群を生成し、これは蛍光−活性化細胞分類器（ＦＡＣＳＡｒｉａ、ＢＤ）を利用して高発現群の細胞等を分類する時に対照群として利用した（図１）。

【0024】

その結果、対照群に比べて蛍光タンパク質発現が高い細胞等の割合が０．１〜０．２％ほどになることを確認し、これらを分離して細胞を獲得した。

【0025】

実施例３：単一細胞株の形成及び遺伝子断片の分析
前記実施例２で分類した細胞等を単一細胞株に培養し、各細胞内に導入されたベクターが有する遺伝子断片を確認する作業を行った。

【0026】

具体的に、分類した細胞等は、単一細胞株に獲得するため９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌに分株した後、大凡２〜３週培養してマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｂｉｏｔｅｃｋ）でＧＦＰ蛍光度を測定した。これを介して高い蛍光度を見せる単一細胞株等を１００個ほど選別し、Ｔ２５フラスコに培養し、飽和状態に至るまで細胞培養を行った。以後、各細胞をフラスコから分離し、流細胞分析器を利用してＧＦＰ Ｍｅａｎ値を得、これを介して各細胞株の発現を比べた。高い発現量を有する細胞株等が如何なる遺伝子断片が挿入されたベクターを含んでいるのかを確認するため、各細胞等からゲノムＤＮＡを抽出してこれを鋳型にし、下記表１のプライマーを利用してＰＣＲを行った。プライマーは、ベクターのＣＭＶプロモーター前のＢａｍＨＩ制限酵素を基準に前後配列を取って製作した。挿入された遺伝子配列を確認するため、ｃａｅ−ｓｅｑ−Ｆプライマー（配列番号８）とｃａｅ−ｓｅａ−Ｒプライマー（配列番号９）を利用し、９５℃で１分、６０℃で１分、そして７２℃で４分の条件で合計３０回のＰＣＲ反応を行って増幅した。ＰＣＲ増幅が十分行われていないクローン等の遺伝子に対しては、ＣＭＶプロモーターの中間部分に該当するｃａｅ−ＣＭ−Ｒプライマー（配列番号７）をリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーとして利用し、このとき、約３００ｂｐのＰＣＲ産物が出るものらは、遺伝子断片が挿入されずにセルフリゲーション（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）で生成されたベクターを有するクローンに分類した。

【0027】

【表1】

【0028】

その結果、高い蛍光度値を有する配列の大部分が、約３ｋｂの大きさを有する遺伝子断片を含んでいることを確認した。これらＰＣＲ産物の配列分析の結果、類似の配列を有することが確認可能であって、最も高い蛍光値を有する細胞株７７番の遺伝子に対し、ｇＤＮＡ−Ｆプライマー（配列番号５）とｇＤＮＡ−Ｒプライマー（配列番号６）を利用してＰＣＲを行い、実施例１で構築していたＧＦＰ／ｐｃＤＮＡＺｅｏベクターのＢａｍＨＩ部位にＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を利用してＰＣＲ生成物を挿入した後、全体配列を分析した。Ｅ７７配列を配列番号１と名付け、全体配列分析の結果をＮＣＢＩとＣＨＯｇｅｎｏｍｅウェブサイトのブラスト（Ｂｌａｓｔ）に入力して分析した。分析の結果、Ｅ７７は、２８９５ｂｐの大きさを有するＤＮＡであって、ＣＨＯ−Ｋ１遺伝子のうち二つの断片が繋がっていることを確認した。前方の配列は、ＡＦＴＤ０１１４１２４６の４１７０−５６９８ｂｐの配列と９５％相同性を有することを確認し、この配列をＥ７７−ｔ１（配列番号２）と名付けた。後方の配列は、ＡＦＴＤ０１０８２４７１の１３５８２−１５０２１ｂｐの配列と９９％相同性を有することを確認し、この配列をＥ７７−ｔ２（配列番号３）と名付けた。

【0029】

実施例４：緑色蛍光タンパク質を利用したＥ７７の効果の分析
前記実施例３で獲得したＥ７７（配列番号１）の効果を検証するため、遺伝子断片を挿入していない対照群ベクターＧＦＰ／ｐｃＤＮＡＺｅｏ（図２ａ）とＥ７７を挿入したベクターＧＦＰ／ｐｃＤＮＡＺｅｏ−Ｅ７７（図２ｂ）とを利用し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に形質導入を行って緑色蛍光タンパク質の発現を確認した。

【0030】

具体的に、これら各ベクターを形質導入し、４８時間後、ゼオシン選択培地に１ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度の細胞を各フラスコに入れ、２〜３週ほど培養することにより安定した細胞株（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｐｏｏｌ）を形成した。さらに、形質導入の４８時間後、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに限界希釈（ｌｉｍｉｔｅｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）方式を利用して細胞を５０ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで入れ、細胞群毎に１００個ほどの単一クローンを獲得して各細胞に対する蛍光値を確認した。

【0031】

その結果、全体細胞を安定した細胞群に形成した時にＧＦＰ発現する細胞の割合が、対照群の場合に２７．３％である反面、Ｅ７７を含んだベクター導入細胞群の場合に４２％の発現率を確認することができた（図３ａ）。同一個数のプレートから獲得した単一細胞株の個数は、対照群の場合に８４個、Ｅ７７の場合に１１４個であり、このうちＧＦＰが発現される細胞株の数はそれぞれ５０、８０個で、全体数を基準に５９．５％、７０％の割合のＧＦＰ発現細胞株を有することになることを確認した。このように選別された単一細胞株のうち蛍光値が２００００より高い細胞株の個数が、対照群の場合に４個、Ｅ７７の場合に１３個で差があることを観察した。ＧＦＰの蛍光値が高い細胞株５０個を比べたことで、全体的なＧＦＰの発現量に差があることを確認した（図３ｂ）。これに基づき、Ｅ７７をＣＭＶプロモーターの前方に挿入する場合、目的タンパク質であるＧＦＰの発現量が増進された細胞等を、対照群に比べてさらに多く確保できることを確認した。

【0032】

実施例５：ベクターにおける方向と位置によるＥ７７効果の分析
シス調節性因子のうち一部の因子は、ベクターに挿入される方向や目的遺伝子との位置的関係に従ってその効果が増加することもあり得ると知られている。これに基づき、Ｅ７７の場合、ベクターに入る方向性と位置による影響性があるのかに対して確認した。細胞群を形成し、細胞群が表す蛍光度を比べる時、選択マーカーがＣＭＶプロモーターと別のプロモーターによって発現される 場合、ＧＦＰを発現しない細胞等が多く発生するので、これによる誤差を減少させるため、選択マーカーであるゼオシン耐性遺伝子（ＺｅｏＲ）を発現しようとする緑色蛍光タンパク質と一つの転写単位に発現できるよう、ＩＲＥＳを利用してＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＺｅｏＲの形態に発現されるようにベクターを構成した。ＩＲＥＳはｐＩＲＥＳ ｖｅｃｔｏｒ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から獲得し、ＧＦＰ、ＩＲＥＳ、ＺｅｏＲそれぞれの遺伝子のＰＣＲを行った後、ＩＲＥＳとＺｅｏＲ ＰＣＲ産物を鋳型にして第二のＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ−ＺｅｏＲ ＰＣＲ産物とＧＦＰ ＰＣＲ産物を鋳型にして第三のＰＣＲを行うことによりＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＺｅｏＲ遺伝子を獲得した。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ ベクターにＰｖｕＩＩ制限酵素を処理し自己接合してゼオシン耐性遺伝子が除去されたベクターを構成し、このマルチクローニングサイトにＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＺｅｏＲ遺伝子を挿入してベクターを構成した。このベクターはｐＧＩＺと名付けた。このような構成を有するベクターにＥ７７（配列番号１）をＣＭＶプロモーターの５’部位に挿入し、これを逆順に入れた７７Ｅ挿入ベクターも構成した。さらに、ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＺｅｏＲ遺伝子の３’部分にＥ７７を入れたベクターと、５’、３’両方の部位に入れたベクターとを構成した（図４ａ）。このような構成を有するベクターを形質導入した細胞は、選択培地培養を介して安定した細胞群を形成し、流細胞分析器（Ｇｕａｖａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて各細胞群の蛍光度を比べた。５’部分にＥ７７を逆順に入れたベクターの場合、対照群に比べて増加する効果がないことを見せるので、Ｅ７７が方向性を有していることを観察した。３’部分にＥ７７を挿入したベクターの場合、５’部分に挿入したベクターとほぼ同様に５０％の発現率の増加を見せ、Ｅ７７を前後に挿入したベクターの場合、３０％程度の発現率の増加を見せた。

【0033】

実施例６：変形された形態のＥ７７効果の分析
前記実施例３で言及したところのように、Ｅ７７は、二つの遺伝子断片からなっている。これに伴い、それぞれの断片だけが存在する時、その効果がＥ７７と同様に表れ得るのか否かと、前方の遺伝子断片が属した遺伝子部分を前後に拡張した配列も効果があるのかを分析した。

【0034】

具体的に、Ｅ７７（配列番号１）を構成する遺伝子断片の前部をＥ７７−ｔ１（配列番号２）、後部をＥ７７−ｔ２（配列番号３）と名付け、Ｅ７７−ｔ１断片が属した遺伝子を拡張した配列をＥｘ７７（配列番号４）と名付けた。Ｅｘ７７は、ｗｗｗ．ｃｈｏｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇのＣＨＯゲノムデータベースのうち、ＣＨＯ−Ｋ１［ＡＴＣＣ］＿ｇｅｎｂａｎｋ＿ｃｏｎｔｉｇヌクレオチドデータベースの相同性検索を介して得られたＡＦＴＤ０１１４１２４６遺伝子の２６３９−７７８６ｂｐに該当する部分である。ＡＦＴＤ０１１４１２４６遺伝子は、ＮＷ＿００３６１５５５２遺伝子（ＣＨＯ−Ｋ１［ＡＴＣＣ］＿ｒｅｆｓｅｑ＿ｓｃａｆｆｏｌｄデータベースの相同性分析）の一部分に属する遺伝子断片（ｃｏｎｔｉｇ）として未だその役割が糾明されていない状態なので、当該ベクターに挿入した遺伝子断片は、次の通りに獲得した。Ｅ７７が含まれているベクターを鋳型にし、プライマーＥ７７−Ｆ（配列番号１０）、Ｅ７７−ｔ１−Ｒ（配列番号１１）を利用してＰＣＲを行って獲得した遺伝子断片をＥ７７−ｔ１（配列番号２）と名付け、プライマーＥ７７−ｔ２−Ｆ（配列番号１２）、Ｅ７７−Ｒ（配列番号１３）を利用してＰＣＲを行って獲得した遺伝子断片をＥ７７−ｔ２（配列番号３）と名付けた。Ｅｘ７７（配列番号４）は、ＣＨＯ−Ｋ１ゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、プライマーＥｘ７７−Ｆ（配列番号１４）、Ｅｘ７７−Ｒ（配列番号１５）を利用した。ＰＣＲを介して獲得した遺伝子断片は、ｐＧＩＺベクターのＣＭＶプロモーターが始まるＢａｍＨＩ位置にＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔを利用して挿入した。ＰＣＲとＩｎ−ｆｕｓｉｏｎのために利用したプライマーは、下記表２の通りである。

【0035】

遺伝子断片を挿入したｐＧＩＺベクターに形質導入した細胞は、選択培地培養を介して安定した細胞群を形成し、流細胞分析器（Ｇｕａｖａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて各細胞群の蛍光度を比べた。

【0036】

【表2】

【0037】

その結果、各細胞群の蛍光値を比べた結果、対照群に比べて３０〜５０％ほどの細胞等が高い発現量を有していることを確認した（図４ｂ）。さらに、遺伝子断片Ｅ７７−ｔ１（配列番号２）及びＥ７７−ｔ２（配列番号３）の効果がＥ７７（配列番号１）に比べては多少低いものの、対照群よりは高い値を見せていることを確認し、Ｅｘ７７（配列番号４）はＥ７７（配列番号１）よりさらに高い値を有していることを見せた。この結果を介し、Ｅ７７（配列番号１）の一部配列と一部配列が属した遺伝子配列も、目的タンパク質の発現増進に影響を及ぼし得ることを確認した（図４ｃ、図４ｄ、図４ｅ及び図４ｆ）。

【0038】

実施例７：Ｅ７７を利用したベクターの抗体生産量の分析
蛍光タンパク質以外のタンパク質発現率にＥ７７（配列番号１）とＥｘ７７（配列番号４）が影響を及ぼし得るのかを確認するため、Ｅ７７（配列番号１）とＥｘ７７（配列番号４）が挿入された抗体生産ベクターを構築し、動物細胞に導入して抗体の生産量を測定した。

【0039】

具体的に、抗体生産ベクターは、一つの転写単位として発現させるため、ＣＭＶプロモーターを始めとして抗体の重鎖と軽鎖がＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）で連結され発現されるようにし、前記実験と同様にＥ７７とＥｘ７７をそれぞれＣＭＶプロモーターの前のＢａｍＨＩ位置に挿入した。ゼオシン耐性遺伝子が別のプロモーターによって発現されるので、内部対照群を構築するため、ゼオシン遺伝子にＩＲＥＳ−ＧＦＰを連結して緑色蛍光タンパク質が共に発現されるようにした。このように構築されたベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ−６１（商標））に形質導入して選択培地で安定的細胞群を形成した後、蛍光物質であるＰＥが結合された抗体で染色を行い、流細胞分離器を利用して上位５％の発現率を見せる細胞等を分類した。分類された細胞等の抗体生産量を測定するため、１ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でプレートに培養し、４日が経過した後、培養液を収去して細胞の数を測定した。培養液は、遠心分離後、上澄液を２０℃に保管し、追って酵素結合免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を介して抗体の量を測定した。酵素結合免疫分析はＩｇＧ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂ）を利用して行い、製造社の指針に従って行った。定量的な分析とともに細胞に対する抗体蛍光染色を再度行い、流細胞分析器を介して定性的な分析も進めた。

【0040】

４日間培養した後に確認した結果、Ｅ７７（配列番号１）を挿入したベクターが導入された細胞群が、対照群に比べて３倍ほど増加した抗体生産量と、５倍ほど増加した単位細胞当りの生産量とを見せ、Ｅｘ７７（配列番号４）を挿入したベクターが導入された細胞群は、対照群に比べて３倍ほど増加した単位細胞当りの生産量を確認した（図５ａ及び図５ｂ）。流細胞分析器を介し、対照群は５．１６％の細胞が抗体を発現していることを確認した。これに比べ、Ｅ７７（配列番号１）導入細胞群の場合に４６．８％、Ｅｘ７７（配列番号４）導入細胞群の場合に３４．９％の細胞が抗体を発現しているので、安定的に形成された細胞群で抗体発現率が大幅に増加したことを確認した（図５ｃ、図５ｄ及び図５ｅ）。

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図3a】

【図3b】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図4e】

【図4f】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図5e】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]