特許 6385335 ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフを利用した蛋白質翻訳量調整システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6385335

(24)【登録日】2018年8月17日

(45)【発行日】2018年9月5日

(54)【発明の名称】ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフを利用した蛋白質翻訳量調整システム

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20180827BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180827BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/63 100Z

   C12P21/02 CZNA

【請求項の数】6

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2015-502983(P2015-502983)

(86)(22)【出願日】2013年7月16日

(65)【公表番号】特表2015-525562(P2015-525562A)

(43)【公表日】2015年9月7日

(86)【国際出願番号】JP2013069958

(87)【国際公開番号】WO2014014122

(87)【国際公開日】20140123

【審査請求日】2016年6月21日

(31)【優先権主張番号】61/672,219

(32)【優先日】2012年7月16日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504132272

【氏名又は名称】国立大学法人京都大学

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【弁理士】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(72)【発明者】

【氏名】齊藤 博英

(72)【発明者】

【氏名】遠藤 慧

(72)【発明者】

【氏名】井上 丹

【審査官】 布川 莉奈

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−１４２２５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Molecular and Cellular Biology，１９９２年，Vol. 12, No. 5，pp. 1959-1966

【文献】 The EMBO Journal，１９９０年，Vol. 9, No. 12，pp. 4127-4133

【文献】 Plant Molecular Biology，２００３年，Vol. 52，pp. 357-369

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフを利用した蛋白質翻訳を制御する方法であって、
（1)５’末端にＣａｐ構造、
（2)前記Ｃａｐ構造の３’側に、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体からなる１以上のＲＮＡモチーフ、および
（3)ＲＮＡモチーフの３’側に、(a)ベイトオープンリーディングフレーム（ベイトＯＲＦ）、(b)イントロンおよび(c)インターナルリボゾームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を含む配列から成るＯＮスイッチカセットを含んでなる５’ＵＴＲ調節構造部およびその３’側に目的蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列を有するｍＲＮＡを細胞に導入し、前記ＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質により当該蛋目的蛋白質翻訳を開始させるステップを含む方法であって、
前記ベイトＯＲＦは、その３’末端から５００塩基以内に終止コドンを有する配列であり、
前記ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列が、L7Aeタンパク質の結合配列、MS2ファージのコートタンパク質の結合配列およびBacillusstearothermophilusリボソームタンパク質S15の結合配列からなる群より選択される結合配列であり、
前記変異体が、前記ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列である、方法。

【請求項2】

前記ベイトＯＲＦが、Renillaluciferaseの５’側から４５７番目に終止コドンを挿入した配列である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記イントロンが、ヒトβグロビンイントロンである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

次の構造を含んでなる５’ＵＴＲ調節構造部；
（1)５’末端にＣａｐ構造、
（2)前記Ｃａｐ構造の３’側に、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体からなる１以上のＲＮＡモチーフ、および
（3)ＲＮＡモチーフの３’側に、(a)ベイトオープンリーディングフレーム（ベイトＯＲＦ）、(b)イントロンおよび(c)インターナルリボゾームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を含む配列から成るＯＮスイッチカセットおよびその３’側に目的蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列を有するｍＲＮＡであって、前記ベイトＯＲＦは、イントロンから３２０塩基以上離れて終止コドンを有する配列であり、
前記ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列が、L7Aeタンパク質の結合配列、MS2ファージのコートタンパク質の結合配列およびBacillusstearothermophilusリボソームタンパク質S15の結合配列からなる群より選択される結合配列であり、
前記変異体が、前記ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列である、ｍＲＮＡ。

【請求項5】

前記ベイトＯＲＦが、Renillaluciferaseの５’側から４５７番目及び／または４６６番目に終止コドンを挿入した配列である、請求項４に記載のｍＲＮＡ。

【請求項6】

前記イントロンが、ヒトβグロビンイントロンである、請求項４に記載のｍＲＮＡ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフを利用した蛋白質翻訳量調整システムに関するものである。

【背景技術】

【0002】

種々の遺伝子を細胞に導入し、翻訳、発現させることは、生物学的システムを操作し、理解するためにより一層の必要性を増している。低分子に反応した翻訳調整システムが広く知られており、導入遺伝子の発現に用いられてきている。これらの方法は、種々の遺伝子の発現を同等に調整する技術であった。

【0003】

これまでに、真核生物において、外因性遺伝子からの蛋白質の発現の定量的な調節は、テトラサイクリンなどの添加される低分子に応答する転写因子に大きく依存していた（Deans TL, Cantor CR, Collins JJ (2007) A tunable genetic switch based on RNAi and repressor proteins for regulating gene expression in mammalian cells. Cell 130:363-372.）。そして、添加されるエフェクター分子の濃度が、転写因子の活性を決定していた。これらのエフェクター分子と転写因子との組み合わせは、細胞内の複数の標的遺伝子の転写レベルを、同等に調節するものである。図１６は、このような従来のシステムを概念的に示す図である。

【0004】

哺乳類細胞において、目的遺伝子の転写後調整についても報告がある。Okano H et al. (2005) Function of RNA-binding protein Musashi-1 in stem cells. Exp Cell Res. 306: 349-356.

【0005】

本発明者らは、古細菌のリボソーム蛋白質であるＬ７Ａｅ蛋白質が結合するＲＮＡモチーフであるｋｉｎｋ−ｔｕｒｎＲＮＡモチーフを組み込んだ標的ｍＲＮＡを設計し、このｍＲＮＡの翻訳を強く抑制する、「翻訳ＯＦＦスイッチ」システムを報告した（ＷＯ２００９／０６６７５７）。図１５にｋｉｎｋ−ｔｕｒｎＲＮＡモチーフの構造及び、かかるシステムの概要を示す。このシステムは、Ｏｎ−Ｏｆｆのスイッチのように機能するが、定量的な翻訳調節をするためには、その用途が限定されているものである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

単一の調整因子を使用することによって、複数種類の外因性遺伝子の発現を、個別に独立して調整することは、きわめて重要性を持つ。しかし、そのようなシステムは、未だ報告されていない。本発明はこのような課題を解決するためになされたものである。本発明者らは、ＲＮＡ−蛋白質複合体由来の塩基配列もしくはその変異体からなるＲＮＡモチーフと、このＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質とを用いて、目的遺伝子をコードするｍＲＮＡの翻訳調節をすることを考えた。そして、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（以下、５’ＵＴＲと省略して指称する）にＲＮＡモチーフを導入し、導入されるＲＮＡモチーフの数、及び導入箇所の５’末端からの距離を変えることにより、定量的な翻訳抑制が可能となることを発見し、本発明を完成するに至った。

【課題を解決するための手段】

【0007】

すなわち、本発明は、一実施の形態によれば、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフを利用した蛋白質翻訳量調整方法であって、
（１）５’末端にＣａｐ構造、
（２）前記Ｃａｐ構造の３’側に、スペーサー、および
（３）前記スペーサーの３’側に、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体からなる１以上のＲＮＡモチーフ
を含んでなる５’ＵＴＲ調節構造部およびその３’側に目的蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列を有するｍＲＮＡを、前記ＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質の存在下で、細胞に導入するステップを含み、
前記スペーサーの塩基数が少ないほど蛋白質の翻訳量が抑制され、前記ＲＮＡモチーフの数が多いほど蛋白質の翻訳量が抑制される、方法である。

【0008】

本発明は、別の実施の形態によれば、ｍＲＮＡの蛋白質翻訳量の抑制方法であって、
（１）５’末端にＣａｐ構造、
（２）前記Ｃａｐ構造の３’側に、スペーサー、および
（３）前記スペーサーの３’側に、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体からなる１以上のＲＮＡモチーフ
を含んでなる５’ＵＴＲ調節構造部を目的蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列の５‘側に設けるステップを含み、
前記スペーサーの塩基数が少ないほど蛋白質の翻訳量を抑制し、前記ＲＮＡモチーフの数が多いほど蛋白質の翻訳量を抑制する、方法である。

【0009】

本発明は、また別の実施の形態によれば、次の構造を含んで成る５’ＵＴＲ調節構造部；
（１）５’末端にＣａｐ構造、
（２）前記Ｃａｐ構造の３’側に、スペーサー、および
（３）前記スペーサーの３’側に、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体からなる１以上のＲＮＡモチーフ、
およびその３’側に目的蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列を含んでなるｍＲＮＡであって、ＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質の存在下で目的蛋白質の翻訳量が抑制されるｍＲＮＡである。

【0010】

本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、以下の工程を含む、細胞内で任意の量のタンパク質を翻訳する外来性ｍＲＮＡを選択する方法である。
（１）前述のｍＲＮＡを、対応するＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質を発現する細胞へ導入する工程、および
（２）当該タンパク質の翻訳量を測定し、所望の翻訳量を呈する上記ｍＲＮＡを同定する工程。

【0011】

本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、異なる目的蛋白質の遺伝子をコードする複数の異なるｍＲＮＡからの目的蛋白質の発現量を、独立に、異なるレベルで調節する方法であって、
５’末端にＣａｐ構造を有し、第一の目的蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列を有し、前記Ｃａｐ構造の３’側であって開始コドンの５’側に、スペーサーと、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体からなる１以上の第一のＲＮＡモチーフとを含んでなる第一の調節構造部が設けられている第一のｍＲＮＡを、前記ＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質の存在下で、細胞に導入するステップと、
５’末端にＣａｐ構造を有し、第二の目的蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列を有し、前記Ｃａｐ構造の３’側であって開始コドンの５’側に、スペーサーと、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体からなる１以上の第二のＲＮＡモチーフとを含んでなる第二の調節構造部が設けられている第二のｍＲＮＡを、前記ＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質の存在下で、細胞に導入するステップと
を含み、前記第一の調節構造部と、前記第二の調節構造部とで、前記スペーサーの塩基数及び／または前記ＲＮＡモチーフの数が異なり、
前記第一のＲＮＡモチーフと前記第二のＲＮＡモチーフとが同一であるか、または前記第一のＲＮＡモチーフと前記第二のＲＮＡモチーフとが同一の蛋白質に特異的に結合するが同一の蛋白質に対して異なる解離定数を有する変異体である、方法である。

【0012】

本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフを利用した蛋白質翻訳を制御する方法であって、
(1)５’末端にＣａｐ構造、
(2)前記Ｃａｐ構造の３’側に、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体からなる１以上のＲＮＡモチーフ、および
(3)ＲＮＡモチーフの３’側に、(a)ベイトオープンリーディングフレーム（ベイトＯＲＦ）、(b)イントロンおよび(c)インターナルリボゾームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を含む配列から成るＯＮスイッチカセット
を含んでなる５’ＵＴＲ調節構造部およびその３’側に目的蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列を有するｍＲＮＡを細胞に導入し、前記ＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質により当該蛋目的蛋白質翻訳を開始させるステップを含む方法であって、前記ベイトＯＲＦは、その３’末端から５００塩基以内に終止コドンを有する配列である、方法である。

【0013】

本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、次の構造を含んで成る５’ＵＴＲ調節構造部；
(1)５’末端にＣａｐ構造、
(2)前記Ｃａｐ構造の３’側に、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体からなる１以上のＲＮＡモチーフ、および
(3)ＲＮＡモチーフの３’側に、(a)ベイトオープンリーディングフレーム（ベイトＯＲＦ）、(b)イントロンおよび(c)インターナルリボゾームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を含む配列から成るＯＮスイッチカセット
およびその３’側に目的蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列を有するｍＲＮＡであって、前記ベイトＯＲＦは、その３’末端から５００塩基以内に終止コドンを有する配列である、ｍＲＮＡである。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、複数の異なるｍＲＮＡからの異なる蛋白質の発現量を、同一の活性因子の存在下で、独立に異なるレベルで調整することができ、翻訳の制御を定量的に実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、ＲＮＡモチーフの数とスペーサーの塩基長とにより目的蛋白質の翻訳を調整することができるｍＲＮＡの５’ＵＴＲ調整構造部の可変性を示す概念図である。

【図2】図２は、スペーサーと一つのＫｔモチーフとを設けた５’ＵＴＲ調整構造部を備えるｍＲＮＡを模式的に示す図である。

【図3】図３は、一つのＫｔモチーフを有する５’ＵＴＲ調整構造部を備え、ECFPをコードするｍＲＮＡと、かかるｍＲＮＡに対し、スペーサーをさらに導入し、その塩基長さを変えてチューニングする実施態様を示す図である。

【図4】図４は、スペーサーと一つのＫｔモチーフとを設けた５’ＵＴＲ調整構造部を備えるｍＲＮＡ、及びスペーサーと一つのｄＫｔモチーフとを設けた５’ＵＴＲ調整構造部を備えるｍＲＮＡについて、それぞれのモチーフの５’末端からの距離に対する、翻訳効率の関係を示すグラフである。

【図5】図５は、Ｋｔモチーフの変異体である、ＫｌモチーフおよびＫｌ２モチーフの二次構造を示す図である。

【図6】図６は、複数のＫｌモチーフを設けた５’ＵＴＲ調整構造部を備えるｍＲＮＡを模式的に示す図である。

【図7】図７は、スペーサーとＫｌモチーフとを設けた５’ＵＴＲ調整構造部を備えるｍＲＮＡにおいて、Ｋｌモチーフの数と、スペーサーの長さ（５’末端からのＫｌモチーフの距離）と、翻訳効率の関係を示すグラフである。

【図8】図８は、スペーサーとＫｌモチーフとを設けた５’ＵＴＲ調整構造部を備えるｍＲＮＡ、及び、スペーサーとＫｔモチーフとを設けた５’ＵＴＲ調整構造部を備えるｍＲＮＡにおいて、モチーフの数と、スペーサーの長さ（５’末端からのモチーフの距離）と、翻訳効率の関係を示すグラフである。

【図9】図９は、単一のトリガー蛋白質の存在下で、同時にかつ独立して、５’ＵＴＲ調節構造部の構造が異なり、コードする目的蛋白質も異なる二つのｍＲＮＡの翻訳を調整するシステムを概念的に示す図である。

【図10】図１０は、５’ＵＴＲ調整構造部が異なる４種のｍＲＮＡについて、転写後の相対的なｍＲＮＡのレベルを示す図である。

【図11】図１１は、５’ＵＴＲ調整構造部及び目的蛋白質遺伝子が異なる二種類のｍＲＮＡを１セットとして、９種のセットについて同時に発現させた場合のEGFP及びECFPの蛍光プロファイルを示す図である。

【図12】図１２は、ＭＳ２ＳＬモチーフ及びＦｒ１５モチーフの二次構造を示す図である。

【図13】図１３は、スペーサーとＭＳ２ＳＬモチーフとを設けた５’ＵＴＲ調整構造部を備えるｍＲＮＡにおいて、ＭＳ２ＳＬモチーフの数と、スペーサーの長さ（５’末端からのＭＳ２ＳＬモチーフの距離）と、翻訳効率の関係を示すグラフである。

【図14】図１４は、スペーサーとＦｒ１５モチーフとを設けた５’ＵＴＲ調整構造部を備えるｍＲＮＡにおいて、Ｆｒ１５モチーフの数と、スペーサーの長さ（５’末端からのＦｒ１５モチーフの距離）と、翻訳効率の関係を示すグラフである。

【図15】図１５は、ｋｉｎｋ−ｔｕｒｎＲＮＡモチーフの構造、及び従来技術によるｋｉｎｋ−ｔｕｒｎＲＮＡモチーフを組み込んだ標的ｍＲＮＡによる翻訳ＯＦＦスイッチシステムを概念的に示す図である。

【図16】図１６は、従来技術による、エフェクター分子／転写因子の組み合わせによって細胞内の複数の標的遺伝子の転写レベルを同等に調節するシステムを概念的に示す図であり、エフェクター分子の濃度が、転写因子の活性を決定することを示す。

【図17】図１７は、ＯＮスイッチカセットを概念的に示す図であり、（Ａ）は、トリガー蛋白質が存在しない場合にはベイトORFが翻訳されＩＲＥＳ配列以下の遺伝子が翻訳されないことを示し、（Ｂ）は、トリガー蛋白質が存在する場合に、トリガー蛋白質の働きによりベイトORFが翻訳されず、ＩＲＥＳ配列以下の遺伝子が翻訳されることを示す。

【図18】図１８（Ａ）から（Ｄ）は、ＯＮスイッチカセットにおいてＫｔモチーフまたはｄＫｔモチーフ（陰性対照）およびトリガー蛋白質として、Ｌ７ＡまたはＭＳ２コート蛋白質（陰性対照）の組み合わせを導入したＨｅｌａ細胞のＤｓＲｅｄ（トリガー蛋白質の発現）およびEGFP（翻訳対象）を示す顕微鏡像を示す。図１８（Ｅ）は、各組み合わせにおけるＤｓＲｅｄの蛍光量に対するEGFPの蛍光量比を示すグラフである。図１８（Ｆ）は、各組み合わせにおけるｍＲＮＡの量を示すグラフである。

【図19】図１９（Ａ）は、ＯＮスイッチカセットまたはＯＦＦスイッチカセットおよびＫｔモチーフまたはＦｒ１５モチーフの組み合わせにおけるｍＲＮＡプラスミドとトリガー蛋白質プラスミドの量比に対するEGFPの蛍光量を示すグラフである。図１９（Ｂ）は、ＯＮスイッチカセットまたはＯＦＦスイッチカセットおよび各Ｋｔモチーフ変異体の組み合わせにおける解離定数（Ｋｄ）に対するEGFPの蛍光量を示すグラフである。図１９（Ｃ）及び（Ｄ）は、コグネートインプットタンパク質(それぞれ、L7Ae、S15）及びノンコグネートインプットタンパク質(それぞれ、MS2CP、L7KK）の転写活性を評価するウェスタンブロット分析の結果を示す。

【図20】図２０（Ａ）は、ＰＴＣありもしくはなし（ONもしくはONn）のスイッチインバーターモジュールの概念図（左図）であり、グラフは反転されたスイッチからのEGFPの蛍光強度を示す（右図）。図２０（Ｂ）は、ｓｉＲＮＡにより誘導されたＮＭＤ因子であるSMG1、UPF1、UPF2のノックダウン後のウェスタンブロット分析の結果を示しており、GAPDHもまた溶解物の内部対照として分析した。図２０（Ｃ）は、それぞれのインバータースイッチ(ON-Kt またはON-dKt)及びトリガー蛋白質(MS2 またはL7Ae)を導入した、ｓｉＲＮＡ処理をした細胞におけるEGFP蛍光の平均強度を示すグラフである。

【図21】図２１（Ａ）は、ベイトORFにおいて改変した一連のスイッチインバーターモジュールを示す概念図であり、320 nt (ON32)、160 nt (ON16)、80 nt (ON8)は、ＰＴＣとスプライス部位との距離を示し（左図）、それぞれのインバータースイッチ及びトリガー蛋白質を導入した細胞におけるEGFP蛍光の平均強度を示すグラフ（右図）である。図２１（Ｂ）は、ショートキメライントロン（133nt、ONc）を有するスイッチインバーターモジュールの概念図、及びインバータースイッチ（ONc-KtまたはONc-dKt）とトリガー蛋白質（MS2またはL7Ae）を導入した細胞におけるEGFP蛍光の平均強度を示すグラフである。

【図22】図２２は、インバータースイッチ(ON switch, ON-Kt (左図)またはその親ＯＦＦスイッチ、OFF-Kt (右図)及びトリガー蛋白質（L7Aeまたはその 変異体 (L7-KまたはL7-KK) または陰性対照(N. C.)）を導入したＨｅｌａ細胞のフローサイトメトリー分析のグラフを示す図である。

【図23】図２３（Ａ）は、インバータースイッチ(ON-Kt またはON-dKt)を発現する、それぞれの量(100ng、50ng、25ng)のプラスミドを導入した細胞におけるEGFP蛍光の平均強度を示すグラフである。図２３（Ｂ）は、異なる種類のプロモーター(CMV (ON-KtまたはON-dKt), RSV プロモーター (R-ON-KtまたはR-ON-dKt) or EF1αプロモーター (E-ON-KtまたはE-ON-dKt))を有するプラスミドとともにインバータースイッチを導入した細胞におけるEGFP蛍光の平均強度を示すグラフである。

【図24】図２４（Ａ）は、ＯＦＦスイッチにより制御される抗アポトーシス遺伝子Bcl-xLを発現するプラスミド、及びＯＮスイッチ(ON-Kt-B)により制御されるアポトーシス遺伝子Bim-ELをEGFPの代わりに発現するプラスミドの概念図であり、図２４（Ｂ）は、それぞれのＯＮスイッチ (ON-Kt-BまたはON-dKt-B) 及び及びトリガー蛋白質(MS2またはL7Ae)を誘導した後のAnnexin V陽性細胞の誘導についてのフローサイトメトリー分析を示すグラフである。

【図25】図２５（Ａ）は、ＯＮスイッチまたはＯＦＦスイッチを、L7Aeとともに、もしくはL7Aeなしで導入した場合に発現されるEGFPもしくはECFPの平均強度を示すグラフである。図２５（Ｂ）は、ＯＮ (Fr15及び／またはKt) スイッチ及びＯＦＦ (dFr15及び／またはdKt) スイッチを、L7Ae及び／またはS15とともに、もしくはL7Ae及び／またはS15なしで導入した場合に発現されるEGFPもしくはECFPの平均強度を示すグラフである。図２５（Ｃ）は、ベイトORFにPTCを備えるEGFPをRenilla luciferaseの代わりに含むモジュール(ON2)の概念図である。図２５（Ｄ）は、ＯＮスイッチまたはＯＦＦスイッチ(それぞれ、ON2-KtまたはON2-dKt)及びトリガー蛋白質(MS2またはL7Ae)を導入した細胞のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。以下の実施形態は本発明を限定するものではない。

【0017】

本発明は、第一実施の形態によれば、蛋白質の翻訳量を調整する方法に関する。蛋白質の翻訳量を調整する方法は、５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡを用いることにより実施する。５’ＵＴＲ調整構造部は、Ｃａｐ構造の３’側であって開始コドンの５’側に設けられたスペーサーと、さらにこのスペーサーの３’側 であって開始コドンの５’側に１以上のＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列とを含んでなる。この、５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡを、調整構造部に含まれるＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合する蛋白質の存在下、細胞中に導入することにより、５’ＵＴＲ調整構造部の構造特性に依存して、当該ｍＲＮＡがコードする蛋白質の翻訳を調整することができる。ここで、本明細書において、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体を、「ＲＮＡモチーフ」と指称する。また、ＲＮＡモチーフに特異的に結合し、翻訳の調節において必須の要素として機能する蛋白質を、「トリガー蛋白質」とも指称する。

【0018】

まず、５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡについて、説明する。本実施形態における、５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡは、５’末端にＣａｐ構造を有し、開始コドンを有し、所望の目的蛋白質遺伝子をコードするように設計され、人工的に作製された非天然のｍＲＮＡであって、真核生物細胞内で翻訳され、当該ｍＲＮＡにコードされた目的蛋白質を発現することができるｍＲＮＡである。

【0019】

開始コドンから３’側の構造については、任意の天然もしくは非天然の既知のｍＲＮＡの構造に基づいて、当業者が設計することができる。典型的には、開始コドンと、オープンリーディングフレームと、３’ＵＴＲにポリＡ配列とを備えるように塩基配列を決定することができる。

【0020】

本発実施形態による５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡにおいて、５’ＵＴＲは、５’末端にＣａｐ構造である７メチルグアノシン５’リン酸を備える。真核生物のｍＲＮＡ翻訳において必須の構造だからである。

【0021】

５’ＵＴＲ調整構造部は少なくとも一以上のＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体を備える。本発明において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とは、天然の、既知のＲＮＡ−蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用モチーフの、ＲＮＡ側の配列として知られている塩基配列と、試験管内進化法により得られた人工的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフにおけるＲＮＡ側の配列である塩基配列とが含まれる。ＲＮＡ−蛋白質複合体とは、生体において多数確認されている蛋白質とＲＮＡとの会合体であり、複雑な構造を持つ３Ｄオブジェクトである。

【0022】

天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、通常、約１０〜８０塩基で構成されており、特定の蛋白質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成することが知られている。このような天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、以下の表１及び表２、及びウェブサイト上で利用できるデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂｋ２６．ｂｓｅ．ｋｙｕｔｅｃｈ．ａｃ．ｊｐ／ｊｏｕｈｏｕ／ｉｍａｇｅ／ｄｎａ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｒｎａ／ｒｎａ．ｈｔｍｌから選択することができる。

【0023】

【表1】

【0024】

【表2】

【0025】

人工のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とは、人工的に設計したＲＮＡ−蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用モチーフの、ＲＮＡ側の塩基配列である。このような塩基配列は、通常、約１０〜８０塩基で構成されており、特定の蛋白質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成するように設計する。このような人工的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列としては、特定の蛋白質に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが例示される。標的となる所望の蛋白質に対して特異的に結合するＲＮＡアプタマーは、例えば、in vitro selection法またはSELEX法として知られている進化工学的手法により得ることができる。このときのトリガー蛋白質は、当該RNAアプタマーが結合する蛋白質となる。例えば、以下の表３に挙げる塩基配列が知られており、これらもまた本発明のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列として用いることができる。

【0026】

【表3】

【0027】

本実施形態において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、その塩基配列の由来となるＲＮＡ−蛋白質複合体の解離定数Ｋｄが、約０．１ｎＭ〜約１μＭ程度であるものが好ましい。

【0028】

また、これらのＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列自体に加え、このような配列の変異体も本発明によるＲＮＡモチーフに包含される。本発明でいう変異体とは、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合する蛋白質との間の解離定数Ｋｄが１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以上高い変異体もしくは１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以下の変異体である。このような変異体は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを有するmRNAにおける所望の蛋白質の翻訳量になるように適宜選択して用いることができる。ここで、解離定数Ｋｄがより高いモチーフを有するmRNAからの翻訳効率は増加し、解離定数Ｋｄがより低いと翻訳効率が減少することに留意する。また、このような変異体の塩基配列は、当該ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列（正鎖）に対する相補的な配列を有する核酸（相補鎖）とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の塩基配列であってもよい。ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,San Diego CA）に教示されるように、結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度の洗浄条件、さらに厳しくは「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件で洗浄しても正鎖と相補鎖とがハイブリダイズ状態を維持する条件を挙げることができる。具体的には、当該ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列と少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を有する塩基配列からなる。かかる変異体は、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合する蛋白質との間で、一定の結合を保持し、翻訳抑制に寄与することができる。

【0029】

本実施形態によるＲＮＡモチーフの具体的な例としては、ＲＮＡのメチル化やシュードウリジン化といったＲＮＡ修飾に関わることが知られているＬ７Ａｅ（Ｍｏｏｒｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｖｏｌ． １２， ｐｐ． ８０７−８１８ （２００４））が結合する塩基配列である、５’−ＧＧＧＣＧＵＧＡＵＧＣＧＡＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣ−３’（配列番号１）、その変異体である、ｋｉｎｋ−ｌｏｏｐ（配列番号２）、ｋｉｎｋ−ｌｏｏｐ２（配列番号３）が挙げられる。

【0030】

別の具体例としては、ＭＳ２コート蛋白質が特異的に結合するＲＮＡモチーフであるＭＳ２ステムループモチーフ（22：Keryer-Bibens C, Barreau C, Osborne HB (2008) Tethering of proteins to RNAs by bacteriophage proteins. Biol Cell 100:125-138）（配列番号４）、バチルスのリボソーム蛋白質Ｓ１５が結合するＲＮＡモチーフであるＦｒ１５（24：Batey RT, Williamson JR (1996) Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with 16 S rRNA: I. Defining the minimal RNA site. J Mol Biol 261:536-549）（配列番号５）が挙げられる。

【0031】

さらなる具体例には、アミノアシル化を行う酵素であって、自身のｍＲＮＡに結合し、翻訳を阻害するフィードバック阻害を持つことが知られているＴｈｒｅｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｃｅｌｌ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ．） ｖ９７， ｐｐ．３７１−３８１ （１９９９））が結合する塩基配列である、５’−ＧＧＣＧＵＡＵＧＵＧＡＵＣＵＵＵＣＧＵＧＵＧＧＧＵＣＡＣＣＡＣＵＧＣＧＣＣ−３’（配列番号６）、およびその変異体がある。また、癌細胞特異的な内在性蛋白質であるＢｃｌ−２ファミリーＣＥＤ−９由来のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列である、Ｒ９−２；５’−ＧＧＧＵＧＣＵＵＣＧＡＧＣＧＵＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＧＵＡＵＡＧＣ−３’ （配列番号７）、およびその変異体、ＮＦ−ｋａｐｐａＢに結合するＲＮＡ配列のアプタマー由来の塩基配列およびその変異体が挙げられる。

【0032】

本実施形態において、５’ＵＴＲ調整構造部に必要に応じて含まれるスペーサーは、１塩基以上からなる部分であって、５’末端のＣａｐ構造と、ＲＮＡモチーフとの間に位置する。スペーサーを構成する塩基配列は、任意の配列であってよく、特に限定されないが、特定の二次構造あるいは三次構造を形成するものでなく、具体的には、開始コドンを含まず、特定の遺伝子をコードしていない塩基配列であることが好ましい。なお、本実施形態においては、スペーサーが存在しなくてもよく、以下、本明細書においてはスペーサーが存在しない場合は、スペーサーを構成する塩基数が０の場合として説明する。

【0033】

本実施形態において、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、その５’末端から、Ｃａｐ構造、スペーサー、ＲＮＡモチーフを順に備えてなる。図１に、Ｃａｐ構造を省略した５’ＵＴＲ調整構造部の概念図を示す。

【0034】

スペーサーは、Ｃａｐ構造の３’側に隣接して設けられる。本明細書において、「隣接して」とは、Ｃａｐ構造とスペーサーとの間に塩基を含まない場合を意味するが、制限酵素サイトなど手技上必要な１〜６個以下の塩基を間に含む場合もある。
スペーサーの長さは、所望のmRNAの翻訳量に合わせて任意の塩基数であってよく、０〜１０００塩基、０〜９００塩基、０〜８００塩基、０〜７００塩基、０〜６００塩基、０〜５００塩基、０〜４５０塩基、０〜４００塩基、０〜３５０塩基、０〜３００塩基、０〜２５０塩基、０〜２００塩基、０〜１５０塩基、０〜１００塩基、０〜５０塩基、０〜４０塩基、０〜３０塩基、０〜２０塩基または０〜１０塩基が例示される。好ましくは、０〜３５０個の塩基である。この時、制限酵素サイトなど実施形態において必須な塩基配列についてもスペーサーの塩基配列としても良い。ここで、構成塩基数が少ないスペーサーほど翻訳抑制効果が大きく、翻訳効率が低いｍＲＮＡとすることができる。スペーサーを構成する塩基数を増減することで、翻訳効率がほぼ連続的に調節されたｍＲＮＡを設計することができる。

【0035】

例えば、スペーサーとして、表４に記載の配列が例示される。

【表4】

【0036】

一以上のＲＮＡモチーフは、スペーサーの３’側に隣接して設けられる。ここでも、「隣接して」とは、スペーサーとＲＮＡモチーフとの間に、１〜６個以下の塩基を間に含む場合もあるが、好ましくは、スペーサーとＲＮＡモチーフとの間に含まれる塩基配列はスペーサーとして見なす。ＲＮＡモチーフを複数含む５’ＵＴＲ調整構造部においては、ＲＮＡモチーフと隣り合うＲＮＡモチーフとは「隣接して」いてよい。また、最も３’側に位置するＲＮＡモチーフと開始コドンとの間には、例えば、制限酵素サイトとして約１〜６塩基の配列が存在するように設計することが好ましい。任意の数のＲＮＡモチーフをスペーサーの３’側に導入するように設計することができる。例えば、１〜８個とすることができ、特には、１〜４個とすることができるが、これらの特定の数には限定されない。

【0037】

導入するＲＮＡモチーフの数が多いほど、ｍＲＮＡがコードする目的蛋白質の翻訳抑制効果が大きく、ゆえに、翻訳効率は低くなる。したがって、５’ＵＴＲ調整構造部にＲＮＡモチーフを一つ備えるｍＲＮＡ、５’ＵＴＲ調整構造部にＲＮＡモチーフを二つ備えるｍＲＮＡ、５’ＵＴＲ調整構造部にＲＮＡモチーフを三つ備えるｍＲＮＡ、５’ＵＴＲ調整構造部にＲＮＡモチーフを四つ備えるｍＲＮＡは、その他の５’ＵＴＲの構造が同じであれば、その順に、ｍＲＮＡの翻訳効率が低い。

【0038】

５’ＵＴＲ調整構造部において、ＲＮＡモチーフは主としてその数により翻訳効率を調整することができる。この場合の翻訳効率は、ＲＮＡモチーフの数を増減することにより、離散的に調節される。例えば、ＲＮＡモチーフの数は、1個から20個であり、好ましくは、1個以上または2個以上であり、20個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下または4個以下である。

【0039】

上記のように、本発明のｍＲＮＡにおける５’ＵＴＲの全塩基長は、スペーサーの長さとRNAモチーフの数で決定される。ただし、本実施形態に係るｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、その全領域で複雑な三次構造を形成することは好ましくない。ＲＮＡモチーフにトリガー蛋白質が結合することによって、翻訳調整が機能するため、トリガー蛋白質が結合できないような立体構造となった場合に、調整機能が確保できない可能性があるからである。設計したｍＲＮＡの５’ＵＴＲが複雑な三次構造を形成する可能性は、コンピュータ上で適当なソフトウェア、例えば、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＳｔｕｄｉｏまたはＣｅｎｔｒｏｉｄＦｏｌｄといったソフトウェアを用いて計算することにより決定できる。そして、そのような複雑な三次構造をとることを避けるように設計することができる。あるいは、実際にｍＲＮＡを作製した後に、インビトロでｍＲＮＡとトリガー蛋白質との結合を確認することにより、あるいは細胞中でトリガー蛋白質不在下での翻訳を確認することにより、トリガー蛋白質が結合することができないために、翻訳調整が機能し得ない構造であることを確認することができる。

【0040】

本実施形態による５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡは、トリガー蛋白質の存在下で、５’ＵＴＲに調整構造部が存在せず、同じ遺伝子をコードするｍＲＮＡと比較して、翻訳が抑制され、翻訳効率が低くなる。いっぽう、トリガー蛋白質が存在しない条件下では、５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡと、５’ＵＴＲに調整構造部を有さない同じ遺伝子をコードするｍＲＮＡとの翻訳効率は、ほぼ同程度である。そして、５’ＵＴＲ調整構造部の配列が異なるｍＲＮＡは、通常、翻訳効率が異なる。これらのｍＲＮＡの特性を利用して、例えば、５’ＵＴＲに調整構造部を有さないｍＲＮＡと比較して、トリガー蛋白質の存在下で、約０％〜約９９％の間の任意の値の翻訳効率を実現するｍＲＮＡを設計することができる。翻訳効率と、スペーサーを構成する塩基数、ＲＮＡモチーフの数との関係は、例えば、複数種類の異なる５’ＵＴＲ調整構造部を設けたｍＲＮＡを設計、作製し、その翻訳効率を測定して、標準曲線を作成して決定することができる。前述のように連続的な調整を可能にするスペーサーを構成する塩基数、離散的な調整を可能にするＲＮＡモチーフ数の両者を適宜使い分けて５’ＵＴＲの構造を設計することで、精確な翻訳調整が可能となる。

【0041】

他の実施形態として、翻訳効率は、スペーサーを構成する塩基数、ＲＮＡモチーフの種類と数で決定されることから、これらの可変要素を組み合わせて多数の調整構造部を有する５’ＵＴＲを含むｍＲＮＡを作製し、この中から所望の翻訳効率を有する組み合わせを選択することによって、所望の翻訳効率を有する５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡを得ることが可能となる。

【0042】

５’ＵＴＲに調整構造部を設けた任意のｍＲＮＡが設計でき、塩基配列が決定されれば、当業者であれば、既知の複数の遺伝子工学的手法を用いて、そのようなｍＲＮＡを製造することができる。一例として、ｍＲＮＡを発現ベクターにより細胞中で発現させる方法が例示される。このとき、宿主となる細胞で機能し得るプロモーターと５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡとを機能的に連結させた配列を有する発現ベクターを細胞内に導入することで行い得る。ここで、発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びセンダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。また、プロモーターとして、EF-αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF-αプロモーター、CAGプロモーター、LTRおよびCMVプロモーターなどが用いられ得る。さらに、発現ベクターは、適宜、エンハンサー、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。ここで、選択マーカー遺伝子として、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストシチジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。別の例として、発現ベクターを用いることなく、ｍＲＮＡを直接細胞に導入する場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて細胞に導入することができる。ｍＲＮＡは、所望のｍＲＮＡの配列を有する鋳型DNAからＲＮＡポリメラーゼ法を用いて合成し、さらに、合成されたＲＮＡの5’末端を例えば、m7Gキャップアナログ（Promega）を用いて５’末端にキャップ構造を付与する事によってｍＲＮＡとして製造することができる。

【0043】

次に、このようにして調製されたｍＲＮＡを用いて細胞内で目的蛋白質の翻訳を調整する方法は以下の方法により実施することができる。上記５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡは、調整構造部に含まれるＲＮＡモチーフに特異的に結合するトリガー蛋白質の存在下で機能する。かかる方法においては、５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡと、調整構造部に含まれるＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質とを細胞に導入することが必要である。したがって、一実施の形態によれば、細胞内で蛋白質の翻訳を調整する方法は、５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡと、調整構造部に含まれるＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質とを細胞に導入するステップとを含む。

【0044】

５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡを細胞内に導入するステップは、上述した方法で当該ｍＲＮＡを発現する発現ベクターまたは当該ｍＲＮＡを導入することで成し得る。この時の導入量は、導入される細胞、導入方法および導入試薬の種類により異なり、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。

【0045】

トリガー蛋白質は、ＲＮＡモチーフによって決定される。このようなトリガー蛋白質は、特に限定されないが、表１から３に記載の蛋白質が例示される。好ましくは、トリガー蛋白質は、着目する細胞において内在的に発現する蛋白質である。トリガー蛋白質は、５’ＵＴＲに調整構造部に含まれるＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質を含むものであれば、さらにほかの機能を有する蛋白質と融合された融合蛋白質であってもよい。トリガー蛋白質を細胞に導入するステップは、当該蛋白質をコードする遺伝子を有する発現ベクターまたは、蛋白質導入ドメイン（PTD）または細胞透過ペプチド（CPP）と融合させた当該蛋白質を細胞に導入することにより実施することができる。ここで、PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT (Frankel, A. et al, Cell 55,1189-93 (1988)又はGreen, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998))、K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynB1 (Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、およびHSV由来のVP22等の蛋白質の細胞通過ドメインを用いたものが例示される。また、CPPとして、11R (Cell Stem Cell, 4,381-384 (2009))及び9R (Cell Stem Cell, 4, 472-476 (2009))などのポリアルギニンが例示される。このとき、細胞内で発現されるトリガー蛋白質の量を増減するために、導入するプラスミドベクターの数を変化させることにより、さらに、５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡの翻訳を調整することもできる。特に限定されないが、例えば、５’ＵＴＲに調整構造部を設けたｍＲＮＡとトリガー蛋白質の比が、例えば、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１，６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９または１：１０となるように、トリガー蛋白質を発現するプラスミドベクター細胞に導入することができる。

【0046】

本発明ではさらに、ＯＮスイッチカセットをｍＲＮＡの遺伝子の開始コドンの５’側およびＲＮＡモチーフの３’側に設置することで、翻訳抑制を逆転させ、トリガー蛋白質の存在下でのみｍＲＮＡからの蛋白質翻訳が行われるように制御することができる。ここで、ＯＮスイッチカセットとは、変異オープンリーディングフレーム（ベイトＯＲＦ）、イントロンおよびインターナルリボゾームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を５’側から順に含む配列から成る。ここで、ベイトＯＲＦとは、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）によりＲＮＡ分解を行わせるため、任意の遺伝子をコードする配列のうち、イントロンと結合する３’末端から３２０塩基以上離れて終止コドンを有する変異ＯＲＦである。本発明において、ベイトＯＲＦは、任意のコード遺伝子であってよい。ベイトＯＲＦとしては、特に限定されないが、Renilla luciferaseの５’側から４５７番目、４６６番目の塩基に終止コドンを挿入した配列（配列番号１７もしくは配列番号８１）、またはEGFPの５’側から１７２番目の塩基に終止コドンを挿入した配列（配列番号８２）が例示される。また、イントロンとはスプライソソームが結合する配列を有していればよく、例えば、５’末端側にGT配列および３’末端側にAG配列を有した２０塩基以上の配列が挙げられる。好ましくは、ヒトβグロビンイントロン（配列番号１８）またはキメライントロン（配列番号８３）である。

【0047】

このような、ＯＮスイッチカセットを有する５’ＵＴＲ調整構造部を有するｍＲＮＡを細胞に導入し、トリガー蛋白質により当該目的蛋白質の翻訳を開始させることができる。また、５’ＵＴＲ調整構造部において、上述したようにスペーサーおよびＲＮＡモチーフの数を適宜調整することで、翻訳量を制御することができる。

【0048】

本発明は、一実施形態によれば、単一のトリガー蛋白質の存在下で、５’ＵＴＲの調整構造部が異なり、かつコードする目的蛋白質が異なる複数のｍＲＮＡの翻訳調節を、同時に行うことができる。このような翻訳調節方法においては、最初に５’ＵＴＲの調整構造部及び目的蛋白質遺伝子が異なる複数のｍＲＮＡを設計する。一例として、二種のｍＲＮＡを同時に翻訳調節する場合について説明するが、三種、四種あるいは五種以上のｍＲＮＡを同時に翻訳調節することもでき、以下に述べるのと同様の設計手法にしたがって複数のｍＲＮＡを設計、調製し、細胞に導入することによって翻訳調節を実施することができる。

【0049】

このとき、設計する第一のｍＲＮＡは、５’末端にＣａｐ構造を有し、第一の目的蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列を有するものとする。そして、第一の５’ＵＴＲの調整構造部は、０〜３５０塩基のスペーサーと、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体からなる１以上の第一のＲＮＡモチーフを含むように設計する。第二のｍＲＮＡも同様に、５’末端にＣａｐ構造を有し、第二の目的蛋白質の遺伝子をコードする塩基配列を有するものとし、第二の５’ＵＴＲの調整構造部も、０〜３５０塩基のスペーサーと、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ由来の塩基配列もしくはその変異体からなる１以上の第二のＲＮＡモチーフを含むように設計する。その後、この２種のｍＲＮＡを同時に細胞へ導入することで、第一の目的蛋白質の遺伝子と、第二の目的蛋白質の遺伝子とは、それぞれ異なり、発現させたい所望の遺伝子とすることができる。

【0050】

ここで、４種の蛋白質の遺伝子を体細胞に導入することによる、人工多能性幹細胞（iPS細胞）の製造を、Papapetrou EP et al. (2009) Stoichiometric and temporal requirements of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc expression for efficient human iPSC induction and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA 106: 12759-12764に従って例示する。Oct3/4蛋白質をコードする遺伝子を第一の目的蛋白質の遺伝子、Sox2蛋白質をコードする遺伝子を第二の目的蛋白質の遺伝子、Klf4蛋白質をコードする遺伝子を第一の目的蛋白質の遺伝子、および、c-Myc蛋白質をコードする遺伝子を第一の目的蛋白質の遺伝子として、上記の方法で、Oct3/4蛋白質のみ残りの３種の蛋白質より３倍ほど翻訳量が多くなるように設計して体細胞へ導入するとiPS細胞の製造効率が高くなるといった利益が考えられる。

【0051】

第一のＲＮＡモチーフと、第二のＲＮＡモチーフとは、同一であってもよい。あるいは、第一のＲＮＡモチーフと第二のＲＮＡモチーフとが同一のトリガー蛋白質に特異的に結合するが、異なる解離定数を有する変異体の関係にあってもよい。単一のトリガー蛋白質の存在下で翻訳調節が機能する必要があるためである。

【0052】

第一のＲＮＡモチーフと、第二のＲＮＡモチーフとのそれぞれの数は、同一であっても異なっていても良く、また、スペーサーの数及び配列の種類も、同一であっても異なっていても良いが、第一の５’ＵＴＲ調整構造部と、第一の５’ＵＴＲ調整構造部とが全体として異なる構造であり、異なる翻訳効率を達成する必要がある。所望の翻訳効率を達成する５’ＵＴＲ調整構造部は、本明細書の上記開示内容に従い、当業者が適宜設計することができる。

【0053】

第一のｍＲＮＡ及び第二のｍＲＮＡが設計できたら、これらを通常の方法に従って調製し、トリガー蛋白質を発現する細胞にこの調整したｍRNAを導入する、または同一の細胞に、トリガー蛋白質またはその発現遺伝子と同時に導入する。これにより、翻訳調節方法を実施することができる。

【0054】

従来、プロモーターの種類やその導入量を調整することによって、外来性遺伝子の発現量を調節してきたが、本実施形態を用いることによって、外来性遺伝子を安定的に所望量の翻訳で細胞に発現させることができることで、例えば、外来性遺伝子を細胞に発現させるリプログラミング技術のような最適な遺伝子の発現量が求められる分野において、所望の遺伝子発現量を多段階で調整することで、リプログラミングにより最適な細胞変換を達成することができるといった利点が得られる。

【0055】

本発明はまた別の実施形態によれば、細胞内で任意の量のタンパク質を翻訳する外来性ｍＲＮＡを選択する方法であって、（１）上記５’ＵＴＲ調節構造部を有するいずれかのｍＲＮＡを、対応するＲＮＡモチーフに特異的に結合する蛋白質を発現する細胞へ導入する工程と、（２）当該タンパク質の翻訳量を測定し、所望の翻訳量を呈する上記ｍＲＮＡを同定する工程とを含んでなる。
（１）の工程は、第一の実施形態において説明したように、５’ＵＴＲ調節構造部を有するいずれかのｍＲＮＡを設計し、発現ベクターを用いて、あるいは、発現ベクターを用いることなくｍＲＮＡを直接細胞に導入することにより実施することができる。第一の実施形態において例示した内容は、本実施形態においてもすべて適用することができる。
（２）の工程は、当該ｍＲＮＡより翻訳された蛋白質の量を測定することで実施することができる。ここで、蛋白質の量の測定は、所望の蛋白質に対する抗体を用いて標識して、あるいは翻訳される蛋白質が蛍光を呈する蛋白質の場合は当該蛍光を用いて、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）、ウェスタンブロット法、およびフローサイトメトリーといった当業者に周知の方法を用いて実施することができる。

【実施例】

【0056】

以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものではない。

【0057】

[実施例１ Ｓｐ−Ｋｔ−EGFP、Ｋｔ−Ｓｐ−EGFP及びＫｔ−EGFPの翻訳効率の測定]
古細菌のリボソーム蛋白質であるＬ７Ａｅ蛋白質が結合するＲＮＡモチーフであるｋｉｎｋ−ｔｕｒｎＲＮＡモチーフを５’ＵＴＲに設け、EGFPの遺伝子をコードする三種のｍＲＮＡを設計した。ｋｉｎｋ−ｔｕｒｎＲＮＡモチーフを、以下、本明細書において、Ｋｔモチーフと指称する。図２に設計の概要を示す。図２（Ａ）は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおいて、５’末端から、Ｃａｐ構造、スペーサー、Ｋｔを配置した構造であり、Ｓｐ−Ｋｔ−EGFPと指称する。図２（Ｂ）は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおいて、５’末端から、Ｃａｐ構造、Ｋｔモチーフ、スペーサーを配置した構造であり、Ｋｔ−Ｓｐ−EGFPと指称する。また、図示はしていないが、５’ＵＴＲにスペーサーを設けずに、Ｃａｐ構造、Ｋｔを配置した構造のｍＲＮＡも設計した。これを、Ｋｔ−EGFPと指称する。Ｓｐ−Ｋｔ−EGFP、Ｋｔ−Ｓｐ−EGFP及びＫｔ−EGFPの５’ＵＴＲの詳細な配列は、下記の表５に示す。下記（１）に記載の方法にしたがって、これらのｍＲＮＡを発現するプラスミドを作製した。

【0058】

次に、下記（２）に従って、トリガー蛋白質としてＬ７Ａｅを発現するプラスミドを作製し、下記（３）〜（５）に従って、それぞれのｍＲＮＡを発現するプラスミドを細胞にトランスフェクションし、その翻訳効率を測定した。その結果、Ｓｐ−Ｋｔ−EGFP、Ｋｔ−EGFPでは発現が抑制されたのに対し、Ｋｔ−Ｓｐ−EGFPではそのような効果はみられなかった。この結果から、５‘末端とＫｔの間にスペーサーがあることでＬ７Ａｅによる翻訳抑制効果が、０．０１９から０．２３と減少することが分かった。

【0059】

[実施例２ ５’末端からのＫｔモチーフの位置を変えたｍＲＮＡの調製]
次に、５’末端から１８塩基、５１塩基、６７塩基、９４塩基、１２０塩基、１４５塩基、及び３２０塩基目に、Ｋｔモチーフの５’末端の塩基が位置するようにスペーサーを設けたｍＲＮＡを設計した。Ｋｔモチーフの数は一つとした。それぞれのｍＲＮＡにおける５’ＵＴＲの塩基配列は、下記表５の１８ｎｔ−Ｋｔ、５１ｎｔ−Ｋｔ、６７ｎｔ−Ｋｔ、９４ｎｔ−Ｋｔ、１２０ｎｔ−Ｋｔ、１４５ｎｔ−Ｋｔ、３２０ｎｔ−Ｋｔに示す。これらのｍＲＮＡを発現するプラスミドを作製し、その翻訳効率を調べた。図３にｍＲＮＡの設計の概要を示す。その結果、Ｋｔに特異的に結合するトリガー蛋白質であるＬ７Ａｅ蛋白質の存在下において、翻訳効率は、スペーサーの塩基数が多いほど、すなわちＫｔの５’末端からの距離が長いほど高い結果となった。逆に言えば、Ｋｔモチーフが５’末端の近傍に位置するほど、翻訳の抑制が強くなることがわかった。Ｋｔモチーフの５’末端からの距離に対する、翻訳効率を示すグラフを図４に示す。

【0060】

対照として、下記表５の各ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの塩基配列において、下線部のＧ、Ａを、それぞれＣに置換したｍＲＮＡを作製し、１８ｎｔ−ｄＫｔ、５１ｎｔ−ｄＫｔ、６７ｎｔ−ｄＫｔ、９４ｎｔ−ｄＫｔ、１２０ｎｔ−ｄＫｔ、１４５ｎｔ−ｄＫｔ、３２０ｎｔ−ｄＫｔ、とした。下線部のＧ、Ａを、それぞれＣに置換すると、Ｌ７Ａｅ蛋白質が結合しなくなることが知られている。なお、ｄＫｔは、Ｋｔモチーフを不活性化した構造体である。これらについても、Ｌ７Ａｅ蛋白質の存在下において、同様の方法で翻訳効率を調べた。結果は、翻訳効率を示すグラフを同様に図４に示した。Ｋｔモチーフを構成する塩基のうちの２つを、Ｃに置換したｄＫｔモチーフを挿入したｍＲＮＡでは、ｄＫｔモチーフの５’末端からの距離によらず、翻訳の抑制は生じなかった。

【0061】

【表5-1】

【表5-2】

表中、開始コドンはボールド体で表示した。Ｋｔモチーフの両端にあたる、ＢｇｌＩＩ部位及びＢａｍＨＩ部位は、イタリック体で表示した。下線は、Ｋｔモチーフを不活性化してｄＫｔモチーフとする際にＣに置換された塩基である。

【0062】

これらの結果により、本発明における目的蛋白質の翻訳制御には、目的蛋白質をコードするｍＲＮＡとトリガー蛋白質であるＬ７Ａｅとの結合が必須であり、オープンリーディングフレームとｍＲＮＡの５’末端の距離、すなわちスペーサーが必須の要素ではないことが示された。そして、Ｌ７Ａｅの発現量（存在量）が一定であっても、翻訳効率は、スペーサーの長さにほぼ比例して増加することがわかった。すなわち、ｍＲＮＡの５’末端とＲＮＡモチーフ（Ｋｔモチーフ）の距離により、目的蛋白質の翻訳を定量的に調整することができることがわかった。

【0063】

[実施例３ 二次元的アプローチ]
実施例１、２の結果において、ＫｔモチーフとＬ７Ａｅによる翻訳の抑制は、約２％〜約２０％の間であることがわかった。ＫｔモチーフがｍＲＮＡの５’末端から１６４塩基より離れた場合はそれ以上の抑制は見られず、約２０％の翻訳効率となる。本実施例においては、翻訳調整が可能な範囲を広げるために、Ｋｔモチーフに換えて、Ｋ−ｌｏｏｐ ＲＮＡモチーフを導入したｍＲＮＡを用いることとした。Ｋ−ｌｏｏｐ ＲＮＡモチーフの構造を、図５（Ａ）に示す。また、以下、本明細書において、Ｋ−ｌｏｏｐ ＲＮＡモチーフを、Ｋｌモチーフと指称する。Ｋｌモチーフは、Ｋｔモチーフと比較して、Ｌ７Ａｅへの結合力が５００倍程度弱いことがわかっている。そのため、Ｋｌモチーフを設けたｍＲＮＡのＬ７Ａｅ存在下における翻訳の抑制は、ＫｌモチーフをＫｔモチーフに換えた以外は同条件のｍＲＮＡのＬ７Ａｅ存在下における翻訳の抑制より、弱いものとなる。

【0064】

本発明者らは、Ｋｌモチーフを設けた複数種類のｍＲＮＡを調製した。図６に概要を示す。具体的には、Ｋｌモチーフの数を１つとしたｍＲＮＡ（図６（Ａ））、Ｋｌモチーフの数を２つとしたｍＲＮＡ（図６（Ｂ））、さらにＫｌモチーフの数を３、４としたｍＲＮＡ（図６（Ｃ））を調製した。さらに、これらのｍＲＮＡにおいて、もっとも５’末端に近いＫｌモチーフの５’末端からの距離を、１８塩基、６７塩基、１２０塩基、１６４塩基とし、開始コドン、オープンリーディングフレーム及び３’ＵＴＲの構造は同一とした１６種類のｍＲＮＡを調製した。詳細を下記の表６に示す。複数のＫｌモチーフを含む場合、隣り合うＫｌモチーフ間の距離は、６塩基とした。

【0065】

【表6-1】

【表6-2】

表中、開始コドンはボールド体で表示し、下線は、Ｋｌモチーフを示す。

【0066】

これらの１６種類のｍＲＮＡについて、実施例１、２と同様の方法で翻訳効率を測定した。結果を図７及び図８に示す。図７及び図８のグラフに示されるように、Ｋｌモチーフの数が多いほど、また、ＫｌモチーフがｍＲＮＡの５’末端の近くに存在するほど、EGFPの翻訳効率が抑制されていることがわかる。すなわち、導入されるＫｌモチーフの数、及びＫｌモチーフ挿入位置の二つのパラメータを用いることにより、翻訳効率をかなり精密に調整できることがわかった。図８においては、比較のために、Ｋｌに変えて、一つのＫｔモチーフを同様にして導入したｍＲＮＡの翻訳効率についてもグラフに示す。Ｋｌモチーフを導入した１６種類のｍＲＮＡにおいて、目的蛋白質の翻訳調整が可能な範囲は、約３％〜約７５％の範囲であった。

【0067】

さらに、Ｋｌモチーフを改変したＫｉｎｋ ｌｏｏｐ ２モチーフを同様に導入したｍＲＮＡを設計し、プラスミドを構築した。以下、本明細書において、Ｋｉｎｋ ｌｏｏｐ ２モチーフを、Ｋｌ２モチーフと指称する。Ｋｌ２モチーフの構造を図５（Ｂ）に示す。この実験では、二種のｍＲＮＡを設計した。いっぽうは、Ｋｌ２モチーフを１つ、ｍＲＮＡの５’末端から３２塩基目に導入した。もういっぽうは、Ｋｌ２モチーフを２つ、５’末端に近いＫｌモチーフの５’末端からの距離が、５’末端から３２塩基目となるように設計した。詳細を下記表７に示す。オープンリーディングフレームは、ECFP遺伝子をコードするものとした。そして、それぞれについて、ベクターを作製し、Ｌ７ＡｅもしくはＭＳ２ＣＰの存在する細胞にトランスフェクトし、フローサイトメトリー測定により翻訳効率を測定した。３回の実験の結果、Ｋｌ２モチーフを１つ導入したｍＲＮＡの平均翻訳効率は、0.84であり、Ｋｌ２モチーフを２つ導入したｍＲＮＡの平均翻訳効率は、0.093であった。

【0068】

【表7】

表中、開始コドンはボールド体で表示し、下線は、Ｋｌ２モチーフを示す。

【0069】

レポーター遺伝子の発現が転写後に調節されたものであるかを確認するために、細胞内で一時的に発現した、設計したｍＲＮＡの量を、リアルタイム定量PCRで調べた。この実験では、Ｋｌモチーフの数が１もしくは４であり、もっとも５’末端に近いＫｌモチーフの５’末端からの距離が、１８塩基もしくは１６４塩基の場合の４種類のｍＲＮＡについて測定した。結果を図１０に示す。図１０のグラフから、相対的なｍＲＮＡの転写レベルは、５’ＵＴＲの構造やトリガー蛋白質の結合に影響を受けないことが確認された。

【0070】

[実施例４ 一つの細胞における、二つの異なるｍＲＮＡの同時コントロール]
次に、エフェクター分子である単一のトリガー蛋白質が、同時にかつ独立して、異なるように調節されたシス調節因子を有する複数の遺伝子の発現を調節することができるのかを調べた。図９にこの実験の概念図を示す。同一のトリガー蛋白質に特異的に結合するＲＮＡモチーフを有し、かつ５’ＵＴＲ調節構造部の構造が異なるｍＲＮＡをコードする第１のレポータープラスミドと第２のレポータープラスミドを含むプラスミドのセットを設計した。そして、これらのプラスミドを、当該ＲＮＡモチーフに特異的に結合するトリガー蛋白質が存在する細胞及び存在しない細胞にトランスフェクトした。第１のレポータープラスミドは、５’位置にひとつのＫｔモチーフもしくはｄＫｔモチーフを有するEGFPをコードするｍＲＮＡであった（図２（Ａ）の構造を参照）。第２のレポータープラスミドは、ECFP（enhanced cyan fluorescent protein）をコードするｍＲＮＡであって、その５’ＵＴＲに、実施例３で用いたような二次元的にアレンジされたＫｌモチーフを有するものであった。第１のレポータープラスミド及び第２のレポータープラスミドの各セットは、三段階に調節された発現効率を有するｍＲＮＡを発現するように構成されていた。低い発現効率の構築物は、Ｋｔ−EGFP、１８ｎｔ−３ｘＫｌ−ECFPであり、高い発現効率の構築物は、ｄＫｔ−EGFP、１２０ｎｔ−１ｘＫｌ−ECFPであり、中間程度の発現効率の構築物は、Ｓｐ−Ｋｔ−EGFP、６７ｎｔ−３ｘＫｌ−ECFPであった。これらを以下の表８に示す。９種類のセットをそれぞれ、表８に示す番号により指称する

【0071】

【表8】

【0072】

Ｋｔモチーフ及びＫｌモチーフの両方に対してトリガー蛋白質として機能するＬ７Ａｅ蛋白質の非存在下では、９種のセットをトランスフェクトしたすべての細胞において、EGFP及びECFPは一様に発現し、異なる５’ＵＴＲ構造には関係なかった。いっぽう、Ｌ７Ａｅ蛋白質の存在下では、EGFP及びECFPの発現効率は、各ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの構造によって異なり、９種類の異なる蛍光プロファイルが得られた。結果を図１１に示す。図１１中の番号は、上記表８中のセットに対応する。各ｍＲＮＡのアウトプット、すなわち各ｍＲＮＡが翻訳されて生じる蛋白質の量が、他のｍＲＮＡのアウトプットと異なることは、Ｌ７Ａｅ蛋白質が、５’ＵＴＲ調整構造部及び目的蛋白質遺伝子が異なる二種類のｍＲＮＡの翻訳を、同時に、かつ独立して調整することができることを示している。

【0073】

[実施例５ ほかのＲＮＰモチーフを用いたアプローチ]
次に、このような翻訳抑制が、ほかのＲＮＰモチーフを５’ＵＴＲ調整構造部に設けたｍＲＮＡの場合も同様にみられるかどうかについて実験した。本実施例においては、ＭＳ２コート蛋白質とこれに特異的に結合するＲＮＡモチーフとの組み合わせ、及び、バチルスのリボソーム蛋白質Ｓ１５とこれに特異的に結合するＲＮＡモチーフとの組み合わせ、においても、同様の結果を得ることができることを示す。

【0074】

（ａ）ＭＳ２コート蛋白質
図１２（Ａ）に、ＭＳ２コート蛋白質が特異的に結合するＲＮＡモチーフであるＭＳ２ステムループモチーフの二次構造を示す。以下、本明細書において、ＭＳ２ステムループモチーフを、ＭＳ２ＳＬモチーフと指称する。ＭＳ２ＳＬモチーフを導入した５’ＵＴＲを設けた４種のｍＲＮＡを調製した。ＭＳ２ＳＬモチーフの数は、１個、及び２個の間で変化させ、最も５’末端に近いＭＳ２ＳＬモチーフの、５’末端からの距離は、１８塩基、６７塩基で変化させた。オープンリーディングフレーム及び３’ＵＴＲの構造は４種のｍＲＮＡに共通の構造とした。詳細を下記の表９に示す。

【0075】

【表9】

表中、開始コドンはボールド体で表示し、下線は、ＭＳ２ＳＬモチーフを示す。

【0076】

Ｈｅｌａ細胞にこれら４種のｍＲＮＡを導入してその翻訳効率を調べた。ＭＳ２ＳＬモチーフを設けたｍＲＮＡをＭＳ２コート蛋白質の存在下で発現させた場合の結果を図１３に示す。ここでも、Ｌ７Ａｅ及びＫｔモチーフもしくはＫｌモチーフの組み合わせを用いた場合と同様に、モチーフの数が多いほど、またモチーフの導入位置がｍＲＮＡの５’末端に近いほど、翻訳効率が抑制されることがわかった。

【0077】

（ｂ）バチルスのリボソーム蛋白質Ｓ１５
図１２（Ｂ）に、バチルスのリボソーム蛋白質Ｓ１５が結合するＲＮＡモチーフであるＦｒ１５モチーフの二次構造を示す。Ｆｒ１５モチーフを導入した５’ＵＴＲを設けた４種のｍＲＮＡを調製した。Ｆｒ１５モチーフの数は、１個、及び２個の間で変化させ、最も５’末端に近いモチーフの、５’末端からの距離は、１８塩基、６７塩基で変化させた。オープンリーディングフレーム及び３’ＵＴＲの構造は４種のｍＲＮＡに共通の構造とした。詳細を下記の表１０に示す。

【0078】

【表10】

表中、開始コドンはボールド体で表示し、下線は、Ｆｒ１５モチーフを示す。

【0079】

上記（ａ）と同様にして、Ｈｅｌａ細胞にこれら４種のｍＲＮＡを導入してその翻訳効率を調べた。Ｆｒ１５モチーフを含むｍＲＮＡをバチルスのリボソーム蛋白質Ｓ１５の存在下で発現させた場合の結果を図１４に示す。上記（ａ）と同様に、Ｆｒ１５モチーフの数が多いほど、またＦｒ１５モチーフの導入位置がｍＲＮＡの５’末端に近いほど、翻訳効率が抑制されることがわかった。

【0080】

実施例５の結果からは、Ｌ７Ａｅ蛋白質に結合するＲＮＡモチーフであるＫｔモチーフやその変異体であるＫｌモチーフ、Ｋｌ２モチーフのみならず、他のＲＮＡ−蛋白質複合体モチーフ由来のＲＮＡモチーフとそれに特異的に結合する蛋白質との組み合わせを用いた場合でも、翻訳効率を定量的に調整することができることがわかった。

【0081】

[実施例６ インバーターONスイッチカセットを所有するｍＲＮＡの調製]
図１７に示す通り、Ｋｔ−EGFP（３２ｎｔ−Ｋｔ）のＲＮＡモチーフと翻訳する遺伝子の開始コドンとの間に、下記（１）に示した方法でベイトORF（ここではｈＲｌｕｃ遺伝子）、βグロビンのイントロンおよびＩＲＥＳを結合したカセットを挿入した（ＯＦＦスイッチ）。ここで、ベイトＯＲＦの開始コドンから４５７番目及び４６６番目 (タンデムPTC)に終止コドン（未成熟終止コドン(PTC)）を挿入したカセットも作製した（ＯＮスイッチカセット：配列番号５５）。ＯＮスイッチカセットをｍＲＮＡへ挿入した場合、トリガー蛋白質の働きによりベイトORFが翻訳されず、ＩＲＥＳ配列以下の遺伝子が翻訳される。従って、トリガー蛋白質（インプット）の存在下で所望の蛋白質（アウトプット）を翻訳させることができると考えられる。一方、トリガー蛋白質（インプット）の非存在下ではベイトORFの翻訳が進むが、イントロンの５００ｂｐ以上、上流に終止コドンがあることからナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）によりＲＮＡ崩壊が起こり、当該ｍＲＮＡが分解され所望の蛋白質（アウトプット）の翻訳が起きないと考えられる。そこで、ＯＮスイッチとＫｔモチーフまたはｄＫｔモチーフを有するｍＲＮＡを発現するプラスミドとＬ７ＡｅまたはＭＳ２をコードするｍＲＮＡを発現するプラスミドをそれぞれ１：０．２の比率で同時に細胞に導入した。すると、ＫｔモチーフとＬ７Ａｅを同時に発現させた場合にのみEGFPの発現が見られた（図１８（Ａ））。PCR法でプラスミド導入して２４時間後のｍＲＮＡの量を測定したところ、この結果に比例してＫｔモチーフとＬ７Ａｅを同時に発現させた場合にそのｍＲＮＡ量が多かった（図１８（Ｂ））。フローサイトメトリー分析により、プラスミドのコグネートペア(L7Ae / ON-Kt)によりトランスフェクトされた細胞は、ノンコグネートペアによりトランスフェクトされた細胞と比較して、平均して、５倍から７倍のEGFP蛍光を示すことがわかった（図１８（Ｅ））。これらの結果は、ＯＮスイッチカセット（cis-acting module）のｍＲＮＡへの挿入が、ＯＦＦスイッチを、ＯＮスイッチへと、効果的に反転させたことを示す。

【0082】

トランスフェクション後２４時間存在するスイッチｍＲＮＡの量を、定量的ＲＴ−PCR分析により決定した（図１８（Ｆ））。予想通り、コグネートペア(L7Ae/ON-Kt)によりトランスフェクトされた細胞におけるＯＮスイッチｍＲＮＡの量は、ノンコグネートペアによりトランスフェクトされた細胞におけるＯＮスイッチｍＲＮＡよりも１．７倍も多かった。このことは、挿入されたモジュールが、細胞内におけるスイッチｍＲＮＡの定常状態レベルを増加させることを示している。

【0083】

設計したモジュールの分子メカニズムをさらに調べるために、タンデムPTCを除去した欠損モジュールを構築した。その結果、ベイトＯＲＦの終止コドンとイントロンのスプライシング部位との距離は、４３ヌクレオチド（ｎｔ）であった。図２０（Ａ）のＯＮｎを参照。ＯＮｎは、親ＯＦＦスイッチに挿入され、PTCを除去することで、L7Aeの不在下であってもEGFP産生を増加すること、それゆえ、インバーターモジュールの能力が破壊されることがわかった（図２０（Ａ））。このことは、ＯＮスイッチカセットの定常的な抑制が、ＰＴＣ依存性であることを示す。
次に、ＮＭＤ調整蛋白質因子（ＳＭＧ１、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２）を、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いてノックダウンした(図２０（Ｂ）)。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの２日後、同じプラスミドのセットがトランスフェクトされ、インバータースイッチの挙動を評価した。これらの因子のノックダウンはEGFP発現を増加させ、それぞれ、Ｌ７Ａｅの非存在下及び存在下でのEGFP発現のアップレギュレーションをさらに減少させた（図２０（Ｃ））。このことは、スイッチの反転が、これらの因子に依存的であることを示す。

【0084】

さらに、PTCsとモジュールのスプライス位置の距離を短くした、いくつかのＯＮスイッチカセット構築物を作製した（図２０（Ｃ））。この距離を３２０ｎｔまで短くしても、モジュールに対して、スイッチを反転するのには十分であった。しかし、これよりも距離を短くすると、例えば、１６０ｎｔにまで短くすると、短い距離がＮＭＤをトリガーするのに効率的ではないという以前の証拠と調和しなかった。これらの結果をまとめると、このインバーターモジュールの機能は、ＮＭＤのメカニズムに依存することが示される。

【0085】

続いて、他のトリガー蛋白質でも同様の結果が得られるかどうかを確認するため、ＫｔもしくはＦｒ１５モチーフとＯＦＦスイッチ、またはＫｔもしくはＦｒ１５モチーフとＯＮスイッチの組み合わせに対して、ＯＮスイッチまたはＯＦＦスイッチ（アウトプットプラスミド）に対して、Ｌ７ＡｅまたはＳ１５（インプットプラスミド）を複数の割合で用いてEGFPの発現を確認した（図１９（Ａ））。親ＯＦＦスイッチと、反転されたＯＮスイッチにおいて、観察されたＳ１５システム挙動の関連性は、Ｌ７Ａｅシステムにおける挙動と類似していた（図１９（Ａ）；ＯＮ−Ｆｒ１５及びＯＦＦ−Ｆｒ１５）。さらに、ウェスタンブロット分析を行い、実験条件下におけるインプットタンパク質レベルを決定した（図１９（Ｃ）及び図１９（Ｄ））。Ｌ７ＡｅまたはＳ１５の発現レベルは、インプットプラスミドの量に応じて増加し（アウトプットプラスミドの０．２〜５倍）、実験条件下では飽和することはなかった。

【0086】

さらに、Ktモチーフ、すなわちＬ７Ａｅ（Ｋｄ値（解離定数）は1.6 nM）の２種類の変異体である、K37A変異体（L7K:Ｋｄ値は15 nM）及びK78A二重変異体(L7KK: Ｋｄ値は680 nM)を用いて、同様の実験を行った。その結果、解離定数が大きいほど、ＯＮスイッチを用いた場合にEGFPの発現は減少し、ＯＦＦスイッチを用いた場合にEGFPの発現は増加した（図１９（Ｂ）及び図２２）。これらのデータから、スイッチインバーターモジュールは、一般に、親ＯＦＦスイッチからＯＮスイッチを得ることができることがわかった。このようなＯＮスイッチ及びＯＦＦスイッチは、インプット分子の量及び、インプットとセンサリーＲＮＡモチーフとの相互作用の親和性に関連して、同一のインプットに応答して、同様の効率を示す。

【0087】

理想的には、インバータースイッチのインプットシグナルに対する反応は、親スイッチの反応に対して、正確に逆であるべきである。反転されたON-Fr15スイッチの定常状態（抑制状態）と完全な解放状態との間のダイナミックレンジは、親OFF-Fr15スイッチの定常状態（解放状態）と完全な抑制状態との間のダイナミックレンジと類似していた（図１９（Ａ））。これに対し、２つのスイッチの抑制状態及び解放状態に対応するアウトプットの絶対値は、同一の条件下で異なっていた。変換後の絶対値がいくつかの応用において調整される必要があれば、細胞内のｍＲＮＡレベルを、プロモーター強度やプラスミド取込み効率を変えることによって最適化することができる。このやり方で、図１９（Ａ）に示したカーブの垂直方向へのシフトの影響を補うことが期待できる。実際に、アウトプットプラスミドを希釈することで、EGFP発現の絶対値が変化したが、反転の前後における同様のダイナミックレンジは維持された。このことは、ＮＭＤ要素が、実験条件下で飽和しないことを示している。（図２３（Ａ）)。さらに、このモジュールが、CMVプロモーターに加え、RSVプロモーターやEF1αプロモーターなどの他のプロモーターによる制御下でも有効であることがわかった（図２３（Ｂ）)。これらのプロモーターは、EGFP発現レベルを変化させたが、プラスミドの希釈の場合と同様に、反転の前後で、類似の倍率変化（fold change）を維持した。このことは、インバータースイッチからのアウトプット蛋白質のレベルを、異なるプロモーターを用いて、及び／または異なるプラスミド濃度を用いて、調整可能であることを示す。

【0088】

アウトプット発現の最低限度及び最高限度は、インバータースイッチの使用可能なレンジを決定する。上記のＬ７Ａｅ応答性スイッチの場合は、対応する使用可能なレンジは、OFF-KtからON-Ktへの変換により狭くなった（図１９（Ａ）。ON-Ktの応答は、OFF-Ktのみを抑制したインプット蛋白質レベルにおけるその最大限度レベルから、その最大レベルの半分であり、これは、１０倍より大きい相違に該当する。IRESによって駆動されるアウトプット蛋白質の合成は、ＩＲＥＳがＮＭＤの結果として崩壊した後にブロックされる。ゆえに、ＮＭＤがＩＲＥＳ不活性化に非常に効率的に結合した場合に、このシステムにおける最低限のアウトプットレベルを低減させることができる。ＩＲＥＳ活性の促進は、アウトプットレベルを増加することによりモジュールの性能をも高めることができる。これは、ＩＲＥＳに駆動される蛋白質合成が、一般的にＣａｐ依存性の翻訳よりも効率が低いためである。

【0089】

我々のシステムが、細胞の表現型を、アポトーシス経路を通じて調節することができるかについて調べた（図２４（Ａ））。ＯＦＦスイッチが、抗アポトーシス性Bcl-xLの翻訳を抑制して、アポトーシスを誘導することは、既に示されている(Saito, H., et al. Nat Commun 2, 160 (2011))。同様にして、アウトプットEGFP蛋白質をプロアポトーシス性Bim-ELに代えて、インプット蛋白質Ｌ７Ａｅ依存的にBim-ELを発現させる、アポトーシスを調節可能なスイッチを設計した（図２４（Ａ））。対応するプラスミドによるトランスフェクションの後、Annexin V陽性のアポトーシス細胞の数を、フローサイトメーターを使って評価した。予測通り、Annexin V陽性細胞は、プラスミドのコグネートペア（L7Ae及びON-Kt-B）を注入した場合特異的に増加した（図２４（Ｂ））。

【0090】

２つ独立したｍＲＮＡを、ＯＦＦスイッチ及びＯＮスイッチにより、同時に調節した（図２５（Ａ））。インバータースイッチ(ON-KtまたはON-dKt）の挙動、及びそれらの改変した親スイッチ(OFF-KtまたはOFF-dKt)を同時に分析した（図２５（Ａ））。予測通り、Ｋｔを含有するＯＮスイッチと、ＯＦＦスイッチの両者とも、Ｌ７Ａｅの存在下で、アウトプットとしてのEGFP及びECFPをそれぞれ、特異的にアップレギュレートし、あるいはダウンレギュレートした。特には、同一の細胞に取り込まれたＯＦＦスイッチとＯＮスイッチが、ぞれぞれの機能に影響を与えることはなかった。さらに、ほかのインプット蛋白質であるＳ１５を利用した別のＯＮスイッチを用い、ＯＦＦスイッチ(OFF-KtまたはOFF-dKt)とＯＮスイッチ(ON-Fr15または ON-dFr15)が、それぞれ対応するインプットであるL7Ae及び S15に特異的に応答することを確認した（図２５（Ｂ））。

【0091】

［ディスカッション］
シグナルの反転は回路において、最も基礎的なプロセスの一つである。電気工学と同様に、複雑な生物学的回路も、たくさんのシグナル反転を利用している (Stapleton, J.A. et al. ACS Synth. Biol. 1, 83-88 (2011), Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R. & Benenson, Y. Science 333, 1307-1311 (2011), and Wang, B., Kitney, R.I., Joly, N. & Buck, M. Nat Commun 2, 508 (2011))。多くの場合、合成生物学者は、トランス作用性因子とセンサーとの組み合わせをインバーターモジュールとして用いてきた。このアプローチは、各反転につき、少なくとも一つの固有の調節性の組み合わせを必要とし、一つの細胞中で反転を生じさせるには、シグナル回路間でのクロストークを避けるために高度な独立性の組み合わせを必要とすることが、主要な問題であった。この潜在的な落とし穴を避けるために、近年は、多数の直交する制御性の組み合わせ（orthogonal regulatory pairs）を生成することが行われてきた(Mutalik, V.K., Qi, L., Guimaraes, J.C., Lucks, J.B. & Arkin, A.P. Nat. Chem. Biol. 8, 447-454 (2012))。多数の直交する組み合わせが開発され、新たなトランス作用性因子とセンサーの組み合わせが作られる可能性があるが、そのような組み合わせの数は有限である。これに対して、シス作用性モジュールにより製造されたＯＮスイッチにより、さらなる因子がなくても、インプット分子が、アウトプット蛋白質のレベルを直接的に決定することが可能となる。さらに、このシス作用性モジュールは、トランス作用性モジュールと比較して、同様の効率で複数のシグナルの反転を可能にすることができるため、有利である。トランス作用性モジュールの場合は、各インバータースイッチのダイナミックレンジは異なっているであろうし、対応するモジュールの特質によって決定されるであろう。

【0092】

本発明は、インバーターモジュール(図２１（Ｂ）)の性能を損なうことなく、オリジナルのβ-globin intron (476 nt)を、より短いキメライントロン(133 nt)に置換することに成功した。さらに、ＰＴＣとイントロンのスプライス部位との距離を短縮した(320nt)モジュールも、性能を保持していた(図２１（Ａ）)。この結果から、これらの要素を用いて、より小型のモジュールを設計することが可能であることが示唆される。さらに、他のベイトORF (EGFP遺伝子の部分)を含有するモジュールは、インバーターとして機能した(図２５（Ａ）及び２５（Ｂ）)。ゆえに、ベイトORFは、所望の蛋白質コード配列と置換することができる可能性が高い。

【0093】

このモジュールは、ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲが、低分子、ＲＮＡ，蛋白質を含む種々のインプット分子と真核細胞内で反応する、入手可能な翻訳ＯＦＦスイッチから新たなＯＮスイッチを開発するために用いることができる(Saito, H. et al. Nat. Chem. Biol.6, 71-78 (2010), Saito, H., Fujita, Y., Kashida, S., Hayashi, K. & Inoue, T. Nat Commun 2, 160 (2011), Werstuck, G. & Green, M.R. Science282, 296-298 (1998), Hanson, S., Berthelot, K., Fink, B., McCarthy, J.E. & Suess, B. Mol. Microbiol. 49, 1627-1637 (2003), and Paraskeva, E., Atzberger, A. & Hentze, M.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 951-956 (1998))。さらに、このモジュールは、ＯＮスイッチ(Schlatter, S. & Fussenegger, M. Biotechnol. Bioeng. 81, 1-12 (2003))をＯＦＦスイッチに反転させることも可能である。これは、インバータースイッチからの、IRESによって駆動されるアウトプット蛋白質の製造は、親スイッチのアウトプットに対応するベイトORFのｃａｐ依存性翻訳活性に反比例するためである。

【0094】

最後に、本研究において我々が実証した方法は、細胞質における蛋白質の検出を可能にするが、代替的なスプライシングを用いることにより、遺伝子回路を調節する核蛋白質の発現を検出しうる他の合成ＲＮＡデバイスも報告されている(Culler, S.J., Hoff, K.G. & Smolke, C.D. Science 330, 1251-1255 (2010))。したがって、現在、核または細胞質において働く上記2種類のスイッチが利用可能である。

【0095】

以下に、上記実施例１〜６において用いたｍＲＮＡ及びトリガー蛋白質を発現するプラスミドベクターの具体的な作製方法、細胞への導入方法、及び各種の測定方法などの共通の手順について説明する。

【0096】

（１）レポータープラスミドの構築
本実施例において、EGFPを発現するレポータープラスミドであるｐＫｔ−EGFP、及びｐｄＫｔ−EGFPは、Gossen M, Bujard H (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:5547-5551.に記載のｐｌ ｂｏｘＣ／Ｄ−EGFP、ｐｌ ｂｏｘＣ／Ｄ ｍｕｔEGFPにそれぞれ対応するように作製した。EGFPのコード領域をECFPに置換することによって、同様にしてｐＫｔ−ECFP、及びｐｄＫｔ−ECFPを作製した。尚、ｐＫｔ−EGFP及びｐＫｔ−ECFPの５’ＵＴＲの配列は、上記表５の、３２ｎｔ−Ｋｔと一致する。

【0097】

スペーサー配列は、ＬａｃＺから、PCRにより増幅した。このとき、プライマーセットとしては、(5’-CCCGGGATCCGATCCCGTCGTTTTACAAC-3’（配列番号５６） / 5’-AGATCTACCGGTCAGGCTGCGCAAC-3’ （配列番号５７）及び 5’-GGATCCGCTAGCGATACACCGCATC-3’ （配列番号５８） / 5’-ACTAGTAGATCTCAATGGCAGATCCCAG-3’ （配列番号５９）の組み合わせを用いた。なお、本明細書において、プライマーセットは、フォワードプライマー、リバースプライマーの順に記載」した。スペーサー配列を、ｐＫｔ−EGFPのＢａｍＨＩ−ＡｇｅＩ部位、及びＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ部位の間で消化し、ライゲートして、プラスミドｐＫｔ−Ｓｐ−EGFP及びｐＳｐ−Ｋｔ−EGFPを、それぞれ作製した。同様にして、ｐｄＫｔ−EGFPから、ｐｄＫｔ−Ｓｐ−EGFP及びｐＳｐ−ｄＫｔ−EGFPを作製した。

【0098】

ｐＫｔ−ECFP及びｐｄＫｔ−ECFPは、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）で平滑化し、セルフライゲーションさせて、最も短い５’ＵＴＲのスペーサー（１８ｎｔ）を作製した。もっとも長いスペーサー配列（３２０ｎｔ）は、上述のｐＫｔ−ECFP及びｐｄＫｔ−ECFPのＮｈｅＩ-ＢｇｌＩＩサイトの間に挿入された二つのスペーサーフラグメントを連結することにより得た。そのほかのスペーサーは、同様にして、レポータープラスミドの５’ＵＴＲに挿入された適切なプライマーのセットを増幅させることにより得られた。用いたすべての５’ＵＴＲの配列を、上記表５に示す。

【0099】

オリゴヌクレオチドＫｌのペアは、5’-CATGGGATCCGGGTGTGAACGGTGATCACCCGA-3’（配列番号６０） / 5’-GATCTCGGGTGATCACCGTTCACACCCGGATCC-3’ （配列番号６１）であった。オリゴヌクレオチドＫｌ２のペアは、5’-CATGGGATCCGGACGTACGTGTGAACGGTGATCACGTACGCCGA-3’（配列番号６２） / 5’-GATCTCGGCGTACGTGATCACCGTTCACACGTACGTCCGGATCC-3’（ 配列番号６３）であった。オリゴヌクレオチドＭＳ２ＳＬのペアは、5’-CATGGGATCCGGTGAGGATCACCCATCGA-3’（配列番号６４） / 5’-GATCTCGTTGGGTGTTCCTCTCCGGATCC-3’（ 配列番号６５）であった。これらをアニーリングし、クローニングベクターにクローン化した。Ｆｒ１５は、DNA templates (5’-GGGATGTCAGGTGCAGGCCAGACCGAAGTCCTCTCCTGCCCTCAAGTCTTTCGACCATCCCTATAGTGAGTCGTATTAGC-3’（配列番号６６）)から、プライマーセット(5’-GCTAATCCATGGGATCCTCGGTCGAAAGACTTGAGGGC-3’（ 配列番号６７） / 5’-CCCAGATCTCGTCAGGTGCAGGCCAGAC-3’（配列番号６８）)を用いてPCRにより増幅した。そして、ＮｃｏＩ及びＢｇｌＩＩにより消化し、同様にしてクローニングベクターにクローン化した。それぞれのＲＮＡモチーフは、５’末端をＢａｍＨＩを用いて、３’末端をＢｇｌＩＩを用いて、クローニングベクターに連結した。そして、単一のまたは複数のＲＮＡモチーフを、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩを用いた消化によりクローニングベクターから抽出し、Ｋｔモチーフを５’末端から６７番目、１２０番目、１６４番目のヌクレオチドにおいて含む各ベクターのＢｇｌＩＩ-ＢａｍＨＩ部位の間に挿入した。ＲＮＡモチーフの同じフラグメントを、ｐＫｔ−ECFPのＢａｍＨＩ部位に挿入し、平滑化及びセルフライゲーションにより、５’末端から１８番目のヌクレオチドに位置するようにした。

【0100】

ＯＮスイッチカセットは、ナンセンス変異を有するRenilla luciferase（ｈＲｌｕｃ）、βグロビンイントロンおよびＩＲＥＳ２により構成した。簡潔には、次の方法で作製した。pLP1（インビトロジェン）をBamH1およびBglIIで消化し、βグロビンイントロンを抽出し、pIRES2-EGFP（クロンテック）のBamH1サイトに挿入した。得られたプラスミドをBamH1で消化し、Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔで平滑化後、セルフライゲーションさせて、BamH1サイトを除去した（psBIntIRES2-EGFP）。pGL4.73のNheI-NcoIサイトへｐｌ ｂｏｘＣ／Ｄ−EGFPから消化した５‘ＵＴＲを挿入し、さらに、プライマーセット(5’- GTGACCTGACATCGAGGAGGATA -3’（ 配列番号６９） / 5’- TCGTCTCAGGACTCGATCACGTCC -3’（ 配列番号７０）)を用いてRenilla luciferaseのＷ１５３およびＷ１５６をPCRによりストップコドンへ変換した。続いて、NheI-SmaIサイトで消化してpsBIntIRES2-EGFPへ５‘ＵＴＲおよび変異Renilla luciferaseを挿入しＯＮスイッチカセットを有するプラスミドを作製した。ＯＦＦスイッチカセットを有するプラスミドは同様に、ストップコドンへ変換していないRenilla luciferaseを用いて作製した。

【0101】

（２）トリガープラスミドの作製
次に、Ｋｔに特異的に結合する蛋白質を発現するトリガープラスミドを作製した。Ｋｔに特異的に結合する蛋白質は、そのＮ末端でＯｎｅ−ＳＴｒＥＰ−ｔａｇ（ＩＢＡ）に融合されており、Ｃ末端でｍｙｃタグ、及びＨｉｓタグに結合され、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ＩＲＥＳ駆動ＤＳＲｅｄＥｘｐｒｅｓｓを有するものであった。

【0102】

ｐＩＲＥＳ２−DsRed-Expressは、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＩＲＥＳ２−ｄｒｉｖｅｎ DsRed-Express発現カセットを含むフラグメントを、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩ-ＮｏｔＩ部位にクローニングした。ｐ４ＬａｍｂｄａＮ２２−３ｍEGFP−Ｍ９由来のＨｉｎｄＩＩＩで消化したフラグメントは、得られた発現ベクターに挿入した。４回繰り返されたＬａｍｂｄａ Ｎ２２ ｐｅｐｔｉｄｅは、PCRで増幅されペプチドタグに融合されたＲＮＡ結合蛋白質により置換された。Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ Ｌ７Ａｅのオープンリーディングフレームは、以下のプライマーセットを使用して増幅した(5’-GAATCCATGGGATCCATGTACGTGAGATTTGAGGTTC-3’（ 配列番号７１） / 5’-CACCAGATCTCTTCTGAAGGCCTTTAATCTTCTC-3’（ 配列番号７２））。次に、ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＭＳ２ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎのオープンリーディングフレームは以下のプライマーセットを使用して増幅した（5’-CACCATGGGATCCGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTC-3’ （ 配列番号７３） / 5’-TATGAGATCTGTAGATGCCGGAGTTGGC-3’ （ 配列番号７４））。さらに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓ１５のオープンリーディングフレームは、以下のプライマーセットを使用して増幅した（5’-GACACCATGGGATCCGCATTGACGCAAGAGCG-3’ （ 配列番号７５） / 5’-TATGAGATCTTCGACGTAATCCAAGTTTCTCAAC-3’ （ 配列番号７６）)。これのプライマーは、それぞれ、プラスミドｐＬ７Ａｅ、プラスミドＭＳ２−EGFP、及び、25： Scott LG, Williamson JR (2001) Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with its 5’-translational operator mRNA. J Mol Biol 314:413-422に基づいて新たに合成されたプラスミド由来であった。

【0103】

ＲＳＶプロモーター及びEF1αプロモーターは、それぞれ、pLP2 (Invitrogen) 及び KW239_p5E-hEF1α(Dr. K. Woltjenよりご提供いただいた)由来のプライマーセット5’-GAGGGGGATTAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGC-3’ / 5’-GTTGTTGC TAGCTCGAGCTTGGAGGTGC-3’、及び5’-GAGGGGGATTAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGC-3’ / 5’-GTTGTTGC TAGCTCGAGCTTGGAGGTGC-3’を用いて、PCRにより増幅した。これらを、AseI及びNheIにより消化し、pON-Kt/dKtのAseI-NheIサイトに挿入して、それぞれ、pR-ON-Kt/dKt 及び pE-ON-Kt/dKtを得た。

【0104】

より短いモジュール（ON32、ON16、ON8）は、リバースプライマー(5’-TGATCAGGGCGATATCCTCCTCG-3’)と特殊なフォワードプライマー(それぞれ、5’-GTCCAGATTGTCCGCAACTACAACG-3’, 5’-GCCAGGAGGACGCTCCAG-3’, 5’-TAGAGTCGGGGCGGCCGGGATC-3’)を用いて、PCR-based deletion methodにより作製した。生じたプラスミドのAgeI-Bsp1407Iフラグメントは、pON-Kt/dKtに戻した。イントロンを置換するために、キメライントロン及びＰＴＣを含むhRluc遺伝子を、それぞれ、pRL-TK (Promega) 及びpON-Ktからのプライマーセット5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’ / 5’-CATGGTTGTGGCCATATTATCATCG-3’, 及び5’-CGATGATAATATGGCCACAACCATGGCAAAGCAACCTTCTGATG-3’ / 5’-GCCCCGC AGAAGGTCTAGAATCAATGCATTCTCCACACCAG-3、を用い、PCRにて増幅した。PCR産物は、IRESのPCR産物とPCRにより連結し、EcoRV及びHindIIIで消化して、pON-Kt/dKtのEcoRV-HindIIIサイトに挿入した。pON2-Kt及びpON2-dKt構築物は、pON-Kt及びpON-dKtと類似しているが、PTCを生成するのに用いたプライマーセットが5’-CCCACCCTCGTGACCAC-3’ / 5’-TCAGGGCACGGGC AG-3’である点で異なっていた。

【0105】

IRES及びBim-ELは、pIRES2-EGFP 及び pBim (Saito, H., Fujita, Y., Kashida, S., Hayashi, K. & Inoue, T. Nat Commun 2, 160 (2011).)から、それぞれ、プライマーセット5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’ / 5’-CATGGTTGTGGCCATATTATCATCG-3’. 及び5’-CGATGATAATATGGCCACAACCATGGCAAAGCAACCTTCTGATG-3’ / 5’-GCCCCGCAGAAGGTCTAGAATCAATGCATTCTCCACACCAG-3’を用いて、PCRにより増幅した。これらのフラグメントは、プライマーセット5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’ / 5’-AAGCTTGCGGCCGCCCCGCAGAAGGTCTAGA-3’を用いて再びPCRで連結し、HindIII 及びNotIで消化して、pON-Kt/dKtのHindIII-NotIサイトに挿入し、それぞれ、pON-Kt/dKt-Bを得た。

【0106】

（３）細胞培養及びトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞は、10% のウシ胎児血清(Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan) 及び 1% antibiotic-antimycotic solution (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)を含むダルベッコ改変イーグル培地(GIBCO, Carlsbad, CA）中で、37°C、5% CO₂で培養した。5 × 10⁴ cellsを２４ウェルプレートに播種し、２４時間後、７０〜９０％のコンフルエントに達した細胞を、1μlの リポフェクタミン 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、製造者の指示に従い、プラスミドで一過性にトランスフェクトした。二つのプラスミドをトランスフェクションした実験(実施例１〜３、５)においては、0.1 μgのリポータープラスミド及び0.5 μgのトリガー蛋白質プラスミドを細胞にトランスフェクトした。三つのプラスミドをトランスフェクションした実験（実施例４)においては、それぞれのリポータープラスミド0.1 μg、及びトリガー蛋白質プラスミド0.3 μgを用いた。培地は、トランスフェクションの４時間後に交換した。

【0107】

（４）フローサイトメトリー測定
トランスフェクションの２４時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、100 μl の 0.25% Trypsin-EDTA (GIBCO)中で、37°Cにおいて２分間インキュベートした。100 μlの培地を添加したのち、細胞を35 μm のストレイナー (BD Biosciences, San Jose, CA)を通過させ、FACS Aria (BD Biosciences)で分析した。ECFPの蛍光を測定するために、励起には４０８ｎｍの半導体レーザーを用い、４５０／４０ｎｍのフィルターを用いた。EGFP及びDsRed-Expressの蛍光を測定するために、励起には４８８ｎｍの半導体レーザーを用い、それぞれ、５３０／３０ｎｍ及び６９５／４０ｎｍのフィルターを用いた。

【0108】

（５）フローサイトメトリー分析
死細胞は、FSC（前方散乱光）およびSCC(側方散乱光)を用いて除外した。この実験において、翻訳効率は、ＤｓＲｅｄの蛍光強度が１０００±１００の範囲にある細胞に対して、ＲＮＡモチーフに結合しない陰性対照であるＲＮＡ結合蛋白質（例えば、ＭＣ２ＣＰ）の存在下におけるEGFPまたはECFP蛍光強度の平均値に対する対応するＲＮＡ結合蛋白質（例えば、Ｌ７Ａｅ）の存在下におけるEGFPまたはECFP蛍光強度の平均値の比として算出した。３種同時のトランスフェクションにおいては、蛍光レベルは、EGFP、ECFPまたはDsRed-Expressのそれぞれのみを発現する細胞に基づいて補正された。トランスフェクトされていない細胞は、DsRed-Expressの蛍光レベル（＜１００）に基づいて除外した。すべての実験は３回繰り返し、平均値及び標準偏差値を示した。

【0109】

（６）ｔｏｔａｌＲＮＡの単離及びｃＤＮＡ合成
トランスフェクションの２４時間後に冷却したＰＢＳで細胞を洗浄し、製造者の指示にしたがって、RNAqueous-4PCR キット（Ambion社製）を用いて、ｔｏｔａｌＲＮＡを単離した。350 μlの細胞懸濁液／結合溶液を用い、ＲＮＡは50μl のMilli-Qウォーターで２回溶出させた。混入したＤＮＡは、製造者の指示にしたがって、TURBO DNA-freeキット（Ambion社製）を用いて除去した。200 ngの抽出されたｔｏｔａｌＲＮＡから、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ溶液は１０倍に希釈し、5 μlのアリコートを定量的PCR分析に用いた。

【0110】

（７）定量的PCR分析
定量的PCR分析は、Light Cycler 480 SYBR Green I Master 及びLight Cycler 480 instruments (Roche, Basel, Switzerland)を用いて実施した。反応溶液は、レポーターECFP、またはネオマイシン耐性遺伝子のＲＮＡレベルを測定するために、それぞれ、プライマーセット(5’-GAAGCGCGATCACATGGT-3’（ 配列番号７７） / 5’-CCATGCCGAGAGTGATCC-3’ （配列番号７８）)または (5’-GGCTACCCGTGATATTGCTG-3’ （ 配列番号７９） / 5’-GCGATACCGTAAAGCACGA-3’ （配列番号８０）)を、最終濃度で５００ｎＭとなるように含んだ。一連のレポータープラスミドの１０倍希釈溶液（５０ｆｇ〜５ｎｇ）は、標準として用いた。レポーターECFPｍＲＮＡの相対量は、同一のプラスミドからレポーターとして発現されるネオマイシン耐性遺伝子量に対する割合として決定した。すべての実験は３回繰り返し、平均値及び標準偏差値を示した。

【0111】

（８）ＲＮＡｉ ノックダウン
合計で2.5 × 10⁴の細胞を、２４ウェルプレートに播種し、２４時間後に、1 μｌ のStem Fect RNA transfection kit (Stemgent, Cambridge, MA)を製造者の指示に従って用い、細胞を20 pmol のsiRNAでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に培地を交換した。４８時間後、プラスミドのセットを、上記のようにトランスフェクトした。２４時間後、BD Accuriを用いて細胞をフローサイトメトリー分析した。以前の報告２８にしたがって、今回の実験では、siRNAの配列は、以下の通りとした。5’-GUGUAUGUGCGCCAAAGUATT-3’ / 5’-UACUUUGGCGCACAUACACTT-3’ (SMG1), 5’-GAUGCAGUUCCGCUCCAUUTT-3’ / 5’-AAUGGAGCGGAACUGCAUCTT-3’ (UPF1), 5’-CAACAGCCCUUCCAGAAUCTT-3’ / 5’-GAUUCUGGAAGGGCUGUUGTT-3’ (UPF2), 及び5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’ / 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’ (n.c., ノンサイレンシング陰性対照)。

【0112】

（９） ウェスタンブロット分析
トランスフェクション実験は、２４ウェルプレートと比較して、4倍大きいスケールの6ウェルプレートで行った。24時間後（プラスミドトランスフェクション）、または４８時間後（ＲＮＡｉノックダウン）に、トランスフェクトされた細胞を２ｍＬのＰＢＳで2回洗浄し、０．３ｍＬのＲＩＰＡバッファー中に抽出した。合計の蛋白質濃度は、BCA Protein assay (Thermo, Rockford, IL)により測定した。１０μｇのサンプルは、SDS-PAGEに展開し、製造者の指示に従って iBlot (Invitrogen)を用い、ＰＶＤＦ膜に転写した。さらに、標識抗体、次いで、HRP標識二次抗体でプローブした。SMG1 抗体及びRENT1抗体は、Bethyl laboratories (Montgomery, TX)から入手し、 UPF2 rabbit monoclonal antibody (D3B10) は、 Cell Signaling laboratory (Danvers, MA) から入手した。ブロットは、Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, Billerica, MA)及びImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)により検出した。

【0113】

（１０） アポトーシス分析
この実験では、DsRed-Expressに代えてEGFPを発現する代替的なインプットプラスミドを用いた。プラスミドによるトランスフェクションの24時間後に、細胞と培地を回収し、製造者の指示に従って、Annexin V, Pacific Blue conjugates (Invitrogen)により染色し、FACS Aria cell sorterを用いて分析した。トランスフェクションされなかった細胞は、EGFP蛍光に基づき、ゲートアウトした。2回の実験の平均及び標準偏差を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

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