特許 6385343 昆虫抵抗性および除草剤耐性ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6385343

(24)【登録日】2018年8月17日

(45)【発行日】2018年9月5日

(54)【発明の名称】昆虫抵抗性および除草剤耐性ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１

(51)【国際特許分類】

   A01H 5/00 20180101AFI20180827BHJP

   A01H 5/10 20180101ALI20180827BHJP

   A01H 6/54 20180101ALI20180827BHJP

   C12N 15/32 20060101ALI20180827BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20180827BHJP

   C12N 15/82 20060101ALN20180827BHJP

【ＦＩ】

   A01H5/00 A

   A01H5/10

   A01H6/54

   C12N15/32ZNA

   C12N15/54

   !C12N15/82 154Z

【請求項の数】2

【全頁数】53

(21)【出願番号】特願2015-520388(P2015-520388)

(86)(22)【出願日】2013年6月25日

(65)【公表番号】特表2015-522283(P2015-522283A)

(43)【公表日】2015年8月6日

(86)【国際出願番号】US2013047539

(87)【国際公開番号】WO2014004458

(87)【国際公開日】20140103

【審査請求日】2016年6月24日

(31)【優先権主張番号】61/663,700

(32)【優先日】2012年6月25日

(33)【優先権主張国】US

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-12588

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】501035309

【氏名又は名称】ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100126354

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 尚

(74)【代理人】

【識別番号】100176094

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 満

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】バード，ナーサン

(72)【発明者】

【氏名】ブラッドフィッシュ，グレゴリー，エー．

(72)【発明者】

【氏名】キュイ，ユンシン，コリー

(72)【発明者】

【氏名】ドリップス，ジェームス，イー．

(72)【発明者】

【氏名】ホフマン，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】パレディ，ダヤカール

(72)【発明者】

【氏名】パーカスト，ドーン，エム．

(72)【発明者】

【氏名】トレド，サンドラ ジー．

(72)【発明者】

【氏名】ウィギンズ，バリー

(72)【発明者】

【氏名】ショウ，ニン

(72)【発明者】

【氏名】ウースレイ，アーロン，ティ．

【審査官】 藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５３８１５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５２５７４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０７５４２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 生物工学会誌 (2007) 第85巻、第2号、第57−62頁

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ０１Ｈ ５／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１４のヌクレオチド配列を含むダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含むゲノムを含むダイズ種子であって、前記ゲノムがＣｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１ＡｃおよびＰＡＴ遺伝子を発現するヌクレオチド配列を含み、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−１２５８８の下で寄託されている、ダイズ種子。

【請求項2】

前記ゲノムが配列番号１の１２５８位〜１２８８位；配列番号１の１２２３位〜１３２３位；配列番号１の１１７３位〜１３７３位；配列番号１の１０７３位〜１４７３位；配列番号２の１６０位〜１９０位；配列番号２の１２５位〜２２５位；および配列番号２の７５位〜２７５位からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびにその相補物を含む、請求項１に記載のダイズ種子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張：本開示は、２０１２年６月２５日出願の米国特許仮出願第６１／６６３，７００号の優先権を主張するものである。その中の情報は完全に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃ ｓｙｎｐｒｏ（Ｃｒｙ１Ａｃ）をコードする遺伝子は、昆虫抵抗性、例えば、鱗翅目の昆虫に対する抵抗性をトランスジェニック植物に付与することができ、ＰＡＴ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子は、除草剤ホスフィノトリシン（グルホシネート）に対する耐性をトランスジェニック植物に付与することができる。ＰＡＴは、昆虫抵抗性トランスジェニック作物の作出における選択マーカーとして、および除草剤グルホシネートに対する商業的なレベルの耐性をトランスジェニック植物に付与するための両方に使用するために、ダイズにおいて首尾よく発現されている。

【0003】

植物における導入遺伝子の発現は、おそらくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）のため、または組み込み部位に近い転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の近傍にあることに起因して、植物ゲノムにおけるそれらの位置の影響を受けることが公知である（Weisingら、Ann. Rev. Genet 22巻：421〜477頁、1988年）。同時に、ゲノム内の異なる位置に導入遺伝子が存在することが、植物の全体的な表現型に違ったふうに影響を及ぼす。この理由のために、多くの場合、対象の導入された遺伝子の最適な発現を特徴とする特定の導入遺伝子イベントを同定するためには、多数の導入遺伝子イベントをスクリーニングすることが必要である。例えば、植物および他の生物体において、イベント間で導入された遺伝子の発現のレベルが広範に変動する可能性があることが観察された。発現の空間パターンまたは時間パターンにも差があることがある。例えば、種々の植物組織における導入遺伝子の相対的な発現量の差は、導入される遺伝子構築物中に存在する転写調節エレメントから予測されるパターンに対応しない可能性がある。このために、何百から何千もの異なるイベントを作出し、それらのイベントを、導入遺伝子の所望の発現レベルおよび発現パターンを有する単一のイベントについて商業目的のためにスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子の発現の所望のレベルまたはパターンを有するイベントは、従来の育種方法を使用して、有性異系交雑によって導入遺伝子を他の遺伝的背景に遺伝子移入するために有用である。そのような交雑の後代は、元の形質転換体の導入遺伝子の発現特性を維持する。この戦略を使用して、その土地の生長条件によく適合する多数の品種における信頼性の高い遺伝子発現を確実にする。

【0004】

有性交雑の後代が対象の導入遺伝子または導入遺伝子の群を含有するかどうかを決定するために、特定のイベントの存在を検出することができることが望ましい。さらに、特定のイベントを検出するための方法は、例えば、組換え作物に由来する食物の市販前承認および表示を必要とする規制に合致するため、または、環境のモニタリング、圃場内の作物の形質のモニタリング、または作物収穫で得られる生産物のモニタリングにおいて使用するため、ならびに、規制条項および契約条項に従う関係者のコンプライアンスを確実にすることにおいて使用するために役立つ。

【0005】

トランスジェニックイベントの存在は、これらに限定されないが、核酸プローブを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡのハイブリダイゼーションを含めた当技術分野で公知の任意の核酸検出方法によって検出することが可能である。これらの検出方法では、一般に、多くのＤＮＡ構築物に関して、コード領域を交換することができるので、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子などの遺伝エレメントを使用することに焦点を合わせることも多い。結果として、そのような方法は、挿入された異種ＤＮＡに近接する隣接ＤＮＡのＤＮＡ配列が既知でなければ、異なるイベント、特に、同じＤＮＡ構築物または非常に類似した構築物を使用して作出されたイベント間を識別するためには有用でない可能性がある。例えば、イベント特異的なＰＣＲアッセイは、トウモロコシイベントＤＡＳ−５９１２２−７について米国特許出願第２００６／００７０１３９号に記載されている。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を同定するための単純かつ識別力のある方法を有することが望ましい。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示の実施形態は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１と称されダイズの細胞のゲノム内の特定の部位に挿入されている、本明細書に記載のｃｒｙ１Ｆｖ３（ｃｒｙ１Ｆ）、ｃｒｙ１Ａｃ ｓｙｎｐｒｏ（ｃｒｙ１Ａｃ）およびｐａｔ ｖ６（ｐａｔ）を含む、新しい昆虫抵抗性かつ除草剤耐性のトランスジェニックダイズ形質転換イベントに関する。代表的なダイズ種子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に、パラグラフ［００３３］において識別される受託番号で寄託されている。このイベントを含有するダイズ植物のＤＮＡは、ダイズゲノム内の挿入ＤＮＡの位置を特徴付ける本明細書に記載の接合部／隣接配列を含む。配列番号１および配列番号２は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に特徴的である。より詳細には、配列番号１のｂｐ１２７３／１２７４、配列番号２のｂｐ１７５／１７６および３１６／３１７、にある接合部を取り囲む配列が、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に特徴的である。下のパラグラフ［００１２］には、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有するダイズのＤＮＡの特性であるこれらの接合部を含む配列の例が記載されている。

【0007】

一実施形態では、本開示は、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）に対して抵抗性であり、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むゲノムを有するダイズ植物またはその部位を提供する。別の実施形態では、本開示は、そのような植物の種子を提供する。

【0008】

別の実施形態では、本開示は、昆虫を昆虫抵抗性ダイズ植物に曝露させて、それにより昆虫を防除するステップを含む、昆虫を防除する方法であって、ダイズ植物がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１が存在することの特徴である配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列；ならびにその相補物を含有するゲノムを有する方法を提供する。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１にｃｒｙ１Ｆ ｖ３（ｃｒｙ１Ｆ）遺伝子およびｃｒｙ１Ａｃ ｓｙｎｐｒｏ（ｃｒｙ１Ａｃ）遺伝子が存在することにより、例えば、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ハッショウマメイモムシ（velvetbean caterpillar））、エピノチア・アポレマ（Epinotia aporema）、オモイデス・インジカタス（Omoides indicatus）、ラチプルシア・ヌ（Rachiplusia nu）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、スポドプテラ・コスモイデス（Spodoptera cosmoides）、スポドプテラ・エリダニア（Spodoptera eridania）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘリコベルパ・ゼア（Heliocoverpa zea）、スピロソーマ・ビルギニカ（Spilosoma virginica）およびエラスモパルパス・リグノセルス（Elasmopalpus lignosellus）に対する抵抗性が付与される。

【0009】

別の実施形態では、本開示は、ダイズ作物において雑草を防除する方法であって、グルホシネート除草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列；ならびにその相補物を含有するゲノムを有するダイズ植物を含み、これらの配列が、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の存在に特徴的である、方法を提供する。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１にｐａｔ遺伝子が存在することにより、グルホシネート除草剤に対する耐性が付与される。

【0010】

別の実施形態では、本開示は、ダイズＤＮＡを含む試料においてダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、配列番号１のｂｐ１〜１２７３内の隣接配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第１のプライマー、および配列番号１のｂｐ１２７４〜１５７７内の挿入断片配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第２のプライマーと接触させ、前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップ、または
（ｂ）前記試料を、配列番号２のｂｐ１〜１７５内の挿入断片配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第１のプライマー、および配列番号２のｂｐ１７６〜１６８７内の隣接配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第２のプライマーと接触させるステップ、および
（ｃ）前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップ
を含む方法を提供する。

【0011】

別の実施形態では、本開示は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、配列番号１のｂｐ１〜１２７３および配列番号２のｂｐ１７６〜１６８７からなる群から選択される隣接配列およびその相補物に選択的に結合する第１のプライマー；ならびに配列番号３、またはその相補物に選択的に結合する第２のプライマー；と接触させるステップと、
（ｂ）前記試料をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、
（ｃ）前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップと
を含む方法を提供する。

【0012】

別の実施形態では、本開示は、ダイズ植物を育種する方法であって、第１の植物と第２のダイズ植物を交雑させて第３のダイズ植物を作出するステップであり、前記第１の植物が配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列；ならびにその相補物を含むＤＮＡを含む、ステップと、前記第３のダイズ植物を、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５およびその相補物を含むＤＮＡの存在についてアッセイするステップとを含む方法を提供する。

【0013】

別の実施形態では、本開示は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に特徴的である、単離されたＤＮＡ分子を提供する。そのような分子は、配列番号１および２に加えて、配列番号１のｂｐ１２７３〜１２７４および配列番号１のｂｐ１２７３／１２７４接合部から各方向に少なくとも１０ｂｐを含む、長さが少なくとも２５ｂｐの分子；配列番号２の１７５〜１７６および配列番号２のｂｐ１７５／１７６接合部から各方向に少なくとも１０ｂｐを含む、長さが少なくとも２５ｂｐのアンプリコン；を含む。例は、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５、ならびにその相補物である。

【0014】

別の実施形態では、本開示は、ダイズの粒、種子、または種子ミールにおいて害虫を防除する方法であって、前記粒、種子、または種子ミールが、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むＤＮＡを含むことによって実証される、前記粒、種子、または種子ミールにダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含めるステップを含む方法を提供する。

【0015】

本開示の実施形態は、これらに限定されないが、花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉、ならびに栄養細胞の核、花粉細胞、種子および種子ミール、および卵細胞を含めた、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有するダイズ植物の細胞および植物の部位も包含する。

【0016】

一部の実施形態では、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１は、例えば、他の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫抑制タンパク質ならびに転写調節配列（すなわち、ＲＮＡ干渉、ｄｓＲＮＡ、転写因子など）を含めた他の形質と組み合わせることができる。追加的な形質は、植物の育種、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有するトランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えによる標的化組み込みによる新しい形質の付加によって植物ゲノムに掛け合わせることができる。

【0017】

他の実施形態は、例えば、ｐａｔ遺伝子発現カセットを含めた、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含むポリヌクレオチド配列を削除することを含む。ポリヌクレオチド配列を削除したら、改変されたイベントを特定の染色体上の部位で再標的化し、そこで追加的なポリヌクレオチド配列にダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を掛け合わせることができる。

【0018】

一実施形態では、本開示は、配列番号１および配列番号２に記載の隣接配列間の第０３染色体に位置するダイズ染色体上の標的部位を包含する。

【0019】

一実施形態では、本開示は、配列番号１および２に記載のゲノム配列間、すなわち、配列番号１のｂｐ１〜１２７３と配列番号２のｂｐ１７６〜１６８７の間の第０３染色体上の位置に異種核酸を挿入するステップを含むトランスジェニックダイズ植物を作製する方法を包含する。

【0020】

さらに、本開示の実施形態は、試料（例えば、ダイズの）中の本主題のイベントの存在を検出するためのアッセイも提供する。アッセイは、ダイズゲノムに挿入された組換え構築物のＤＮＡ配列、および挿入部位に隣接しているゲノム配列に基づくことができる。アッセイの実施において有用なキットおよび条件も提供される。

【0021】

本開示の実施形態は、一部において、ｐＤＡＢ９５８２由来のＴ−ＤＮＡをトランスジェニックダイズ系統に挿入することによって生じる境界領域のＤＮＡ配列のクローニングおよび分析にも関する。これらの配列は独特である。挿入断片配列および接合部配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成することができ、これを生成した。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによってこれらのイベントを同定することができることが実証された。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、本開示のイベントを含むダイズ系統を一意的に同定することができる。

【0022】

ある実施形態は、昆虫を昆虫抵抗性ダイズ植物に曝露させて、それにより昆虫を防除するステップを含む、昆虫を防除する方法であって、前記ダイズ植物が、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される配列を含むＤＮＡを含み、前記配列がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の存在に特徴的である、方法を提供する。

【0023】

ある実施形態は、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、またはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）を昆虫抵抗性ダイズ植物に曝露させ、それにより昆虫を防除するステップを含む、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）、またはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）を防除する方法であって、前記ダイズ植物が、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される配列を含むＤＮＡを含み、前記配列がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の存在に特徴的である、方法を提供する。

【0024】

ある実施形態は、ダイズ作物において雑草を防除する方法であって、グルホシネート除草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される配列からなる群から選択される配列を含むＤＮＡを含むダイズ植物を含み、前記配列がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の存在に特徴的である、方法を提供する。

【0025】

ある実施形態は、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む単離されたＤＮＡ配列を提供する。

【0026】

ある実施形態は、ダイズ植物を育種する方法であって、第１の植物と第２のダイズ植物を交雑させて第３のダイズ植物を作出するステップであり、前記第１の植物が配列番号１の１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むＤＮＡを含む、ステップと、前記第３のダイズ植物を、配列番号１の１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むＤＮＡの存在についてアッセイするステップとを含む方法を提供する。

【0027】

ある実施形態は、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される少なくとも１つの配列、ならびにその相補物を含む接合部配列を含む単離されたＤＮＡ分子を提供する。ある実施形態は、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）に対して抵抗性であり、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、ならびにその相補物を有するＤＮＡを含む、ダイズ植物またはその部位を提供する。

【0028】

ある実施形態は、ダイズミール、ダイズ粉（soy flour）、ダイズタンパク質濃縮物、およびダイズ油（soy oil）からなる群から選択される生産品である、ダイズ植物またはその部位に由来する組成物を提供する。

【0029】

ある実施形態は、ダイズの粒、種子、ミール、または粉において害虫を防除する方法であって、前記粒、種子、ミール、または粉が配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むＤＮＡを含むことによって実証される、前記粒、種子、ミール、または粉にダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含めるステップを含む方法を提供する。

【0030】

ある実施形態は、そのゲノム内に、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択されるＤＮＡ配列、ならびにその相補物を含むダイズ種子を提供する。別の実施形態は、そのゲノム内にダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃおよびｐａｔを含み、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−１２５８８の下で寄託されている代表的なダイズ種子を有するダイズ種子を提供する。別の実施形態は、これらの２つの実施形態のいずれかのダイズ種子を生長させることによって作出されるダイズ植物を提供する。別の実施形態は、このダイズ植物によって産生されるダイズ種子であって、そのゲノム内に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−１２５８８の下で寄託されているダイズ種子に存在するものであるダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のｃｒｙ１Ｆ遺伝子、ｃｒｙ１Ａｃ遺伝子およびｐａｔ遺伝子を含む種子を提供する。別の実施形態は、花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉からなる群から選択され、前記イベントを含む、このダイズ植物の部位を提供する。別の実施形態は、ダイズミール、ダイズ粉（soy flour）、およびダイズ油（soy oil）からなる群から選択される生産品である、ダイズ植物またはその部位に由来する組成物を提供する。

【0031】

さらなる実施形態では、ダイズ植物は、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む。ある実施形態は、グルホシネート除草剤に対する耐性を示し、前記耐性が前記イベントまたは前記ゲノムにおいてコードされるタンパク質の発現に起因するものである、上記の実施形態の植物の後代ダイズ植物を提供する。

【0032】

別の実施形態は、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含むゲノムを含むダイズ種子を提供する。別の実施形態は、このダイズ種子を生長させることによって作出される植物を提供する。

【0033】

ある実施形態は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含むトランスジェニックダイズ植物またはその部位であって、代表的なダイズ種子がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−１２５８８の下で寄託されているダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含む、トランスジェニックダイズ植物またはその部位を提供する。

【0034】

種子寄託物
本開示の一部として、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含むダイズ系統の少なくとも２５００種子がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０に寄託され、制限なく一般に公開されている（しかし、特許権に支配される）。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５８８と称される寄託物は、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ ｏｎ ２３／Ｆｅｂｒｕａｒｙ／２０１２を代表して作製された。この寄託物は、特許手続のための種子寄託物に関するブタペスト条約の条項に従い、その下で作製されたものであり、また、それに従い、その下で維持される。

【0035】

配列の簡単な説明
配列番号１はダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１についての５’ＤＮＡ隣接境界配列である。ヌクレオチド１〜１２７３はゲノム配列である。ヌクレオチド１２７４〜１５７７は挿入断片配列である。

【0036】

配列番号２は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１についての３’ＤＮＡ隣接境界配列である。ヌクレオチド１〜１７５は挿入断片配列である。ヌクレオチド１７６〜３１６は、ｐＤＡＢ９５８２から再配置された配列である。ヌクレオチド３１７〜１６８７はゲノム配列である。

【0037】

配列番号３は、ｐＤＡＢ９５８２のＴ鎖のＤＮＡ配列であり、下の表１において注釈を付けている。

【0038】

配列番号４は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー８１６１５＿ＦＷ２である。

【0039】

配列番号５は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー８１５１６＿ＲＶ１である。

【0040】

配列番号６は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー８１５１６＿ＲＶ２である。

【0041】

配列番号７は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー８１５１６＿ＲＶ３である。

【0042】

配列番号８は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー５’ＩＲＥｎｄ−０１である。

【0043】

配列番号９は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー５’ＩＲＥｎｄ−０２である。

【0044】

配列番号１０は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマーＡｔＵｂｉ１ＯＲＶ１である。

【0045】

配列番号１１は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマーＡｔＵｂｉ１ＯＲＶ２である。

【0046】

配列番号１２は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー３ＴＡＴＥｎｄ０５である。

【0047】

配列番号１３は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー３’ＰＡＴＥｎｄ０６である。

【0048】

配列番号１４は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の予測される配列である。５’ゲノム隣接配列、ｐＤＡＢ９５８２Ｔ鎖挿入断片、および３’ゲノム隣接配列を含む。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】ｃｒｙ１Ｆ ｖ３、ｃｒｙ１Ａｃ ｓｙｎｐｒｏおよびｐａｔ ｖ６遺伝子発現カセットを含有するｐＤＡＢ９５８２のプラスミドマップである。

【図2】ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の５’境界配列および３’境界配列を確認するためのプライマーの位置を示す図である。

【図3】ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１におけるゲノム配列配置を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

イベントダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１挿入物の両端を配列決定し特徴付けた。イベント特異的なアッセイを開発した。イベントは、ダイズゲノム（ダイズの第０３染色体）上にマッピングされた。イベントを別の優良な系統に、遺伝子移入し得る。

【0051】

上の背景技術のセクションにおいて言及されている通り、導入遺伝子の植物ゲノムへの導入および組み込みは、いくつかのランダムなイベントを伴う（したがって発現される所与の挿入物について「イベント」と称する）。すなわち、多くの形質転換技法、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換、微粒子銃形質転換（すなわち遺伝子銃）、および炭化ケイ素媒介性形質転換（すなわちＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））などを用いると、導入遺伝子がゲノム内のどこに挿入されるかは予測不可能である。したがって、挿入断片の両側の隣接植物ゲノムＤＮＡを同定することは、所与の挿入イベントを有する植物を同定するために重要であり得る。例えば、挿入断片と宿主ゲノムとの接合領域にわたってＰＣＲアンプリコンを生成するＰＣＲプライマーを設計することができる。このＰＣＲアンプリコンを使用して、独特のまたは別個の種類の挿入イベントを同定することができる。

【0052】

本開示の実施形態の説明に役立つように、また当業者がこれらの実施形態を実施する指針となるために、本明細書において定義および例が提供される。特に断りのない限り、用語は、当業者による従来の使用法に従って理解される。米国特許法施行規則第１．８２２条に明記されているＤＮＡ塩基の命名法を使用する。

【0053】

本明細書で使用される場合、用語「後代」は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含む親植物の任意の世代の子孫を意味する。

【0054】

トランスジェニック「イベント」は、植物細胞を異種ＤＮＡ、すなわち、対象の導入遺伝子を含む核酸構築物で形質転換すること、植物のゲノムに導入遺伝子を挿入することによって生じる植物の集団を再生させること、および特定のゲノム上の位置への挿入を特徴とする特定の植物を選択することによって作出される。用語「イベント」は、元の形質転換体および異種ＤＮＡを含むその形質転換体の後代を指す。用語「イベント」は、その後代がゲノムＤＮＡ／導入遺伝子ＤＮＡを含む、形質転換体と別の品種との間の有性異系交雑によって作出される後代も指す。反復親との戻し交雑を繰り返した後であっても、形質転換された親由来の挿入された導入遺伝子ＤＮＡおよび隣接ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ／導入遺伝子ＤＮＡ）は、交雑の後代において同じ染色体上の位置に存在する。用語「イベント」は、元の形質転換体由来のＤＮＡ、および挿入ＤＮＡを含む一方の親系統（例えば、元の形質転換体および自殖によって生じる後代）と挿入ＤＮＡを含有しない親系統との有性交雑の結果として、対象の導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る後代に伝達されることが予測され得る挿入ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡのすぐ近接の隣接ゲノム配列を含むその後代も指す。

【0055】

「接合部配列」または「境界の配列」は、ゲノムに挿入されたＤＮＡが、挿入点に隣接するダイズのネイティブなゲノム由来のＤＮＡに連結している点にわたり、植物の遺伝物質中の一方または他方の接合部配列の特定または検出は、十分にイベントに特徴的である。本明細書に記載のダイズイベントにおける挿入物にわたるＤＮＡ配列および同様の長さの隣接ＤＮＡが包含される。そのような特徴的な配列の特定の例が本明細書において提供されるが、挿入物の接合部、または挿入物とゲノム配列との接合部とオーバーラップする他の配列も特徴的であり、本開示の実施形態に従って使用することができる。

【0056】

本開示の実施形態は、そのような隣接配列、接合部配列、および挿入断片配列を使用してイベントを特定することに一部関する。関連するＰＣＲプライマーおよびアンプリコンは、本開示の実施形態に包含される。本開示の実施形態に従って、挿入ＤＮＡおよびその端までわたるアンプリコンを使用するＰＣＲ分析方法を使用して、対象の登録商標を持つトランスジェニックダイズ系統に由来する商業化されたトランスジェニックダイズの品種または系統を検出または特定することができる。

【0057】

隣接／接合部配列は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に特徴的である。これらの配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成した。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによって、異なるダイズ遺伝子型においてこれらのダイズ系統を同定することができることが実証された。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、これらのダイズ系統を一意的に同定することができる。本明細書において同定される配列は独特である。

【0058】

本開示の実施形態の検出技法は、植物育種と併せて、１つまたは複数の追加的な対象の形質を後代に与える取り組みにおいて、対象のイベントを含む親植物を別の植物系統と交雑した後に、どの後代植物が所与のイベントを含むかを決定するために特に有用である。これらのＰＣＲ分析方法は、ダイズの育種計画ならびに品質管理、特に商業化されたトランスジェニックダイズ種子に有益である。これらのトランスジェニックダイズ系統のＰＣＲ検出キットも、現在製造され、使用することができる。これは、製品登録および製品管理にも有益である。

【0059】

さらに、隣接ダイズ／ゲノム配列を使用して、それぞれの挿入断片の遺伝子位置を特異的に同定することができる。この情報を使用して、それぞれのイベントに特異的な分子マーカー系を作製することができる。これらは、育種戦略を加速させるために、および連鎖データを確立するために使用することができる。

【0060】

さらに、隣接配列の情報を使用して、導入遺伝子の組み込みプロセス、ゲノムの組み込み部位の特性、イベントの選別、導入遺伝子およびそれらの隣接配列の安定性、ならびに遺伝子発現（特に遺伝子サイレンシング、導入遺伝子のメチル化パターン、位置の影響、およびＭＡＲＳ［マトリックス付着領域］などの潜在的な発現関連エレメントなどに関連する）を試験し、特徴付けることができる。

【0061】

本開示全てに照らして、本開示の実施形態は、パラグラフ［００３３］において識別されるＡＴＣＣ寄託番号の下で入手可能な種子を包含することが明白でなければならない。本開示の実施形態は、パラグラフ［００３３］において識別されるＡＴＣＣ寄託番号で寄託された種子から生長させた除草剤耐性ダイズ植物も包含する。本開示の実施形態は、前記植物の部位、例えば、葉、組織試料、前記植物体によって生産される種子、花粉なども包含する（植物のこれらの部分は、ｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃ、ｐａｔ、ならびに配列番号１および配列番号２を含む）。

【0062】

さらに、本開示の実施形態は、寄託されている種子から生長させた植物の後裔植物および／または後代植物、好ましくは除草剤耐性ダイズ植物であって、本明細書に記載の検出可能な野生型接合部／隣接配列を含むゲノムを有する植物も包含する。本明細書で使用される場合、用語「ダイズ」は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘを意味し、ダイズ植物を用いて育種することができるその全品種を包含する。

【0063】

本開示は、本開示の植物を少なくとも一方の親として使用して交雑を行うプロセスをさらに包含する。例えば、本開示は、本明細書において例示されている植物のいずれかを一方の親または両親として有するＦ_ｉハイブリッド植物を包含する。また、本開示のそのようなＦ_ｉハイブリッドによって生産される種子も本開示の範囲内である。本開示は、例示した植物と、異なる（例えば、純系の親）植物を交雑し、得られたハイブリッド種子を収穫することによってＦ_ｉハイブリッド種子を作出するための方法を包含する。本開示は、雌親または雄親のいずれかである、例示した植物を包含する。得られる植物の特性は、親植物を慎重に考察することによって改良することができる。

【0064】

本開示の昆虫抵抗性／グルホシネート耐性ダイズ植物は、本明細書で言及されている系統の任意の１つの種子から生長させたダイズ植物からなる第１の親ダイズ植物と、第２の親ダイズ植物との有性交雑を最初に行い、それによって複数の第１の後代植物を作出すること；次いで、グルホシネートに対して抵抗性である第１の後代植物を選択すること；第１の後代植物を自殖させ、それによって、複数の第２の後代植物を作出すること；次いで、第２の後代植物から、グルホシネートに対して抵抗性である植物を選択することによって育種することができる。これらのステップは、第１の後代植物または第２の後代植物を第２の親ダイズ植物または第３の親ダイズ植物と戻し交雑することをさらに含んでよい。次いで本開示のダイズ種子を含むダイズ作物、またはその後代を植え付けることができる。

【0065】

２つの異なるトランスジェニック植物を交配して、それぞれ独立に分離して付加された２つの外因性遺伝子を含有する子孫を作出することもできることがまた理解される。適切な後代を自殖させることにより、付加された外因性遺伝子のどちらについてもホモ接合性である植物を作出することができる。栄養繁殖のように、親植物との戻し交雑および非トランスジェニック植物との異系交雑も意図されている。種々の形質および作物のために一般に使用される他の育種方法は当技術分野で公知である。反復親である望ましいホモ接合性の栽培品種または純系統に、単純に遺伝した、高度に遺伝性の形質の遺伝子を伝達するために戻し交雑育種が使用されてきた。伝達される形質の供給源は、供与親と称されている。生じた植物は、反復親（例えば、栽培品種）の属性および供与親から伝達された望ましい形質を有することが予測される。最初の交雑の後、供与親の表現型を保有する個体を選択し、反復親と繰り返し交雑（戻し交雑）する。生じた親は、反復親（例えば、栽培品種）の属性および供与親から伝達された望ましい形質を有することが予測される。

【0066】

同様に、本開示の実施形態の昆虫抵抗性／グルホシネート耐性ダイズ植物を、当技術分野で公知の方法を用いて追加的な導入遺伝子で形質転換することができる。形質転換技法、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換、微粒子銃形質転換（すなわち遺伝子銃）、および炭化ケイ素媒介性形質転換（すなわちＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））などを用いて、追加的な導入遺伝子（複数可）をダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のゲノムに導入することができる。新しく挿入された導入遺伝子を含有するトランスジェニック植物の選択および特徴付けを完了して、本開示の実施形態のｃｒｙ１Ｆ遺伝子、ｃｒｙ１Ａｃ遺伝子、ｐａｔ遺伝子に加えて、新規の導入遺伝子の安定な組み込み体を含有する植物を同定することができる。

【0067】

本開示の実施形態のＤＮＡ分子は、マーカー利用育種（ＭＡＢ）法において分子マーカーとして使用することができる。本開示の実施形態のＤＮＡ分子は、当技術分野で公知の通り、遺伝的に連鎖している作物学的に有用な形質を特定する方法（例えば、ＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰおよびＳＳＲなど）において使用することができる。ＭＡＢ法を使用して、本開示の実施形態のダイズ植物（またはその後代および任意の他のダイズの栽培品種または品種）との交雑の後代において昆虫抵抗性および除草剤耐性形質を追跡することができる。ＤＮＡ分子はこの形質についてのマーカーであり、当技術分野で周知のＭＡＢ法を使用して、本開示の実施形態の少なくとも１つのダイズ系統、またはその後代が親または祖先であったダイズ植物における除草剤抵抗性形質（複数可）を追跡することができる。本開示の実施形態の方法を使用して、対象イベントを有する任意のダイズ品種を特定することができる。

【0068】

本開示の実施形態は、本開示に例示された植物を用いて育種するステップを含む、昆虫抵抗性／除草剤耐性ダイズ植物を作出する方法を包含する。より詳細には、前記方法は、本開示に例示された２つの植物、または本開示に例示された１つの植物と任意の他の植物とを交雑するステップを含んでよい。好ましい方法は、前記交雑の後代を、本開示の実施形態に従って検出可能なイベントおよび好都合な品種性能（例えば、収量）について前記後代を分析することによって選択するステップをさらに含む。例えば、本開示の実施形態を用いて、他の望ましい形質、例えば、農業形質、病害に対する耐性もしくは抵抗性、線形動物に対する耐性もしくは抵抗性および成熟日を含む植物を用いた育種サイクルを通して本主題のイベントを追跡することができる。対象イベントおよび所望の形質を含む植物を検出し、特定し、選択し、例えば育種のさらなるラウンドに直ちに使用することができる。対象イベント／形質は、さらなる昆虫抵抗性形質（複数可）および／または別の除草剤耐性形質と育種を通じて組み合わせ、本開示の実施形態に従って追跡することもできる。後者の実施形態は、本主題のイベントを、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ハッショウマメイモムシ（velvetbean caterpillar））、エピノチア・アポレマ（Epinotia aporema）、オミオデス・インディカタ（Omiodes indicata）、ラチプルシア・ヌ（Rachiplusia nu）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、スポドプテラ・コスモイデス（Spodoptera cosmoides）、スポドプテラ・エリダニア（Spodoptera eridania）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘリコベルパ・ゼア（Heliocoverpa zea）、スピロソーマ・ビルギニカ（Spilosoma virginica）およびエラスモパルパス・リグノセルス（Elasmopalpus lignosellus）を含めた鱗翅目の種に対する抵抗性を付与するｃｒｙ１Ｆ遺伝子およびｃｒｙ１Ａｃ遺伝子と組み合わせて含む植物である。

【0069】

したがって、本開示の実施形態は、例えば、グリホサート抵抗性（例えば、抵抗性植物または細菌のＥＰＳＰＳ、ＧＯＸ、ＧＡＴ）、グルホシネート抵抗性（例えば、ｄｓｍ−２、ｂａｒ）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害性除草剤への抵抗性（例えば、イミダゾリノン［イマゼタピルなど］、スルホニル尿素系、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピリミジニルチオベンゾエート系、および他の化学物質［Ｃｓｒ１、ＳｕｒＡなど］）、ブロモキシニル抵抗性（例えば、Ｂｘｎ）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシルフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤に対する抵抗性、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）の阻害剤に対する抵抗性、光化学系ＩＩ阻害性除草剤に対する抵抗性（例えば、ｐｓｂＡ）、光化学系Ｉ阻害性除草剤に対する抵抗性、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ（ＰＰＯ）阻害性除草剤に対する抵抗性（例えば、ＰＰＯ−１）、フェニル尿素除草剤に対する抵抗性（例えば、ＣＹＰ７６Ｂ１）、ジカンバ分解酵素（例えば、ＵＳ２００３０１３５８７９を参照されたい）をコードする形質と組み合わせることができ、その他のものを、単独で、または多数の組合せで積み重ねて、雑草のシフト（weed shift）および／または上述のクラスの任意の除草剤に対する抵抗性を有効に制御する、または妨げる能力をもたらすことができる。

【0070】

さらに、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に、１つまたは複数の追加的なインプット形質（例えば、昆虫抵抗性、病原体抵抗性、もしくはストレス耐性など）またはアウトプット形質（例えば、生産量の増加、油プロファイルの改良、繊維品質の改良など）を組み合わせることができる。したがって、本開示の実施形態を使用して、任意の数の作物害虫を柔軟かつ費用効果的に制御する能力を伴う改良された作物の品質の完全な作物パッケージをもたらすことができる。

【0071】

植物細胞の特定の染色体上の部位内に、相同組換えによってポリヌクレオチド配列を組み込むための方法は、当技術分野の範囲内で記載されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１１１１８８Ａ１号に記載の部位特異的な組み込みでは、ドナーポリヌクレオチド配列の染色体上の標的への導入を媒介するためのリコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用が記載されている。さらに、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ２００８／０２１２０７号には、１つまたは複数のドナーポリヌクレオチド配列をゲノムの特定の位置内に組み込むためのジンクフィンガー媒介相同組換えが記載されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６７２０４７５号に記載のＦＬＰ／ＦＲＴ、または参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６５８７７２号に記載のＣＲＥ／ＬＯＸなどのリコンビナーゼの使用を利用して、ポリヌクレオチド配列を特定の染色体上の部位に組み込むことができる。最終的に、ドナーポリヌクレオチドを特定の染色体上の位置に標的化するためのメガヌクレアーゼの使用が、Puchtaら、PNAS USA 93巻（1996年）5055〜5060頁）に記載されている。

【0072】

植物細胞内に部位特異的に組み込むための他の方法は、一般に、公知であり、適用可能である（Kumarら、Trends in Plant Sci. 6巻（4号）（2001年）155〜159頁）。さらに、いくつかの原核生物および下等真核生物において同定された部位特異的な組換え系を植物における使用に適用することができる。そのような系の例としては、これらに限定されないが、酵母であるジゴサッカロマイセス・ロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）のｐＳＲ１プラスミ由来のＲ／ＲＳリコンビナーゼ系（Arakiら（1985年）J. Mol. Biol. 182巻：191〜203頁）、およびファージＭｕのＧｉｎ／Ｇｉｘ系（MaeserおよびKahlmann（1991年）Mol. Gen. Genet. 230巻：170〜176頁）が挙げられる。

【0073】

本開示の一部の実施形態では、既存のトランスジェニックイベントに近接して新しい導入遺伝子（複数可）を組み込む、または掛け合わせることが望ましい。トランスジェニックイベントは、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定発現、ならびに、多数の環境区域における、およびそれ全てにわたる除草剤耐性および農業生産力を含めた効力の優れた組合せなどの独特の特性に基づいて選択された好ましいゲノム遺伝子座と考えることができる。組み込まれた導入遺伝子を含む後代植物は、既存の形質転換体の導入遺伝子の発現特性を維持すべきである。さらに、組み込まれたイベントを含む後代植物のゲノム隣接配列および染色体上の位置はすでに同定されているので、以前に開発された、イベントを検出し、確認するためのアッセイを、イベントを含む後代植物に利用することができる。最終的に、既存の導入遺伝子の近くに連結された特定の染色体上の位置に新しい導入遺伝子を組み込むことにより、従来の育種方法を使用した有性異系交雑による導入遺伝子の他の遺伝的背景への遺伝子移入が促進される。

【0074】

本開示の一部の実施形態では、トランスジェニックイベントからポリヌクレオチド配列を削除することが望ましい場合がある。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１９１８７７号に記載の導入遺伝子の削除では、染色体に組み込まれたトランスジェニックイベントから、遺伝子発現カセットからなるポリヌクレオチド配列を除去するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用が記載されている。除去されるポリヌクレオチド配列は、選択マーカーであってよい。ポリヌクレオチド配列を削除および除去したら、改変されたトランスジェニックイベントを、ポリヌクレオチド配列を挿入することによって再標的化することができる。ポリヌクレオチド配列を削除し、その後、改変されたトランスジェニックイベントを再標的化することにより、選択マーカーの再使用、または特定の遺伝子が発現することによって生じる、植物のトランスクリプトームに対する意図されたものではない変化を克服する能力などの利点がもたらされる。

【0075】

本開示は、本明細書において、異種核酸を挿入するために使用することができ、ダイズゲノム内の第０３染色体上の特定の部位を開示している。したがって、本開示の実施形態は、対象とする異種核酸をこの予め確立した標的部位に、またはこの標的部位の付近に導入するための方法を提供する。本開示の実施形態は、開示されている標的部位またはそのような部位の概ね近くに挿入された任意の異種ヌクレオチド配列を含むダイズ種子および／またはダイズ植物も包含する。そのような標的化組み込みを実現するための１つの選択肢は、本明細書において例示されているｐａｔ発現カセットの代わりに異なる挿入断片を削除することおよび／または置換することである。この一般的な点について、例えば、またこれらに限定することなく、本開示の実施形態に従って標的化相同組換えを使用することができる。

【0076】

本明細書で使用される場合、遺伝子、イベントまたは形質を「掛け合わせること」は、所望の形質を１つのトランスジェニック系統に組み合わせることを指す。植物育種家は、それぞれが所望の形質を有する親同士の交雑を行い、次にこれらの所望の形質を両方とも有する子孫を同定することによってトランスジェニック形質を掛け合わせる。遺伝子を掛け合わせるための別の方法は、形質転換の間に、２種以上の遺伝子を同時に植物の細胞核に移入することによる。遺伝子を掛け合わせるための別の方法は、トランスジェニック植物を、対象とする別の遺伝子を用いて再形質転換することによる。例えば、遺伝子を掛け合わせることを用いて、例えば、２種以上の異なる昆虫形質、昆虫抵抗性形質（複数可）および病害抵抗性形質（複数可）、２種以上の除草剤への抵抗性形質、および／または昆虫抵抗性形質（複数可）および除草剤抵抗性形質（複数可）を含めた２種以上の異なる形質を組み合わせることができる。対象の遺伝子に加えて選択マーカーを使用することも、遺伝子を掛け合わせることと考えることができる。

【0077】

「相同組換え」とは、２つのヌクレオチド配列が相互作用して（組み換えられて）新しい組換えＤＮＡ配列を形成し得る類似したヌクレオチド配列を含有する対応する部位を有するヌクレオチド配列の任意の対の間の反応を指す。類似したヌクレオチド配列の部位は、本明細書ではそれぞれが「相同配列」と称される。一般に、相同組換えの頻度は、相同配列の長さが増加するにつれて増加する。したがって、相同組換えは、同一には満たない２つのヌクレオチド配列間で起こり得るが、組換え頻度（または効率）は、２つの配列間の相違が増加するにつれて減退する。組換えは、ドナー分子および標的分子のそれぞれの１つの相同配列を使用して実現することができ、それによって「単一乗換え」組換え産物を生成することができる。あるいは、標的ヌクレオチド配列およびドナーヌクレオチド配列のそれぞれに２つの相同配列を置くことができる。ドナー上の２つの相同配列と標的上の２つの相同配列との間の組換えにより、「２重乗換え」組換え産物が生成する。ドナー分子上の相同配列が、操作される配列（例えば、対象の配列）に隣接する場合、標的分子との２重乗換え組換えにより、対象の配列が元々標的分子上の相同配列の間にあったＤＮＡ配列と交換された組換え産物がもたらされる。２重乗換え組換えイベントによって標的とドナーとの間でＤＮＡ配列を交換することは、「配列交換」と称される。

【0078】

本開示の実施形態の好ましい植物、または種子は、そのゲノム内に、本明細書において同定される、作動的なｃｒｙ１Ｆヌクレオチド配列、ｃｒｙ１Ａｃ ｓｙｎｐｒｏヌクレオチド配列およびｐａｔヌクレオチド配列と、本明細書において同定される、挿入断片の両側の少なくとも２０〜５００以上の連続した隣接ヌクレオチドを一緒に含む。別段の指定のない限り、隣接配列に言及する場合、それは配列番号１および２について特定されたものを指す。これらの隣接配列の全部または一部は、イベントを含む親系統の有性交雑の結果として挿入ＤＮＡを受け取る後代に伝達されることが予測され得る。

【0079】

本開示の実施形態は、本開示の実施形態の植物の再生可能な細胞の組織培養物を包含する。また、そのような組織培養物から再生された植物も、特に前記植物が例示されている品種の形態学的性質および生理的性質の全てを発現することができる場合、包含される。本開示の実施形態の好ましい植物は、寄託されている種子から生長させた植物の生理的特性および形態学的特性の全てを有する。本開示の実施形態は、そのような種子および対象の品質形質を保有する種子の後代をさらに含む。

【0080】

本明細書で使用される場合、「系統」は、少なくとも１つの形質について、個体間で遺伝的変異をほとんど示さない、または示さない植物の群である。そのような系統は、何世代か自家受粉させ、選択すること、または組織または細胞の培養技法を使用して、単一の親から栄養繁殖させることによって創出することができる。

【0081】

本明細書で使用される場合、用語「栽培品種」および「品種」は同義であり、商業生産のために使用される系統を指す。

【0082】

「安定性」または「安定な」は、所与の構成要素に関しては、構成要素が代々、好ましくは、少なくとも３世代維持されることを意味する。

【0083】

「商業的有用性」は、従来の農業設備を使用して農業者が作物を生産することができるように、および従来の圧搾および抽出用設備を使用して記載の構成要素を有する油を種子から抽出することができるように良好な植物生長力および高い稔性を有することと定義される。

【0084】

「作物学的に優良」は、系統が対象イベント（複数可）に起因する昆虫抵抗性および除草剤耐性に加えて、例えば生産量、成熟度、病害抵抗性などの望ましい作物学的特性を有することを意味する。これらの作物学的特性およびデータポイントの全てを使用して、そのような植物を、そのような植物を定義するために使用する特性の範囲内の一点として、または一端もしくは両端で特定することができる。

【0085】

本開示に照らして当業者に理解されるように、検出キットの好ましい実施形態は、例えば、「接合部配列」または「移行部配列」（ダイズゲノムの隣接配列と挿入断片配列が接する場所）を対象とし、かつ／またはそれを含むプローブおよび／またはプライマーを含んでよい。これは、例えば、一方のまたは両方の接合部配列（挿入断片と隣接配列が接する場所）を同定するために設計されたポリヌクレオチドプローブ、プライマー、および／またはアンプリコンを含む。１つの一般的な設計は、隣接領域内でハイブリダイズする１つのプライマー、および挿入断片内でハイブリダイズする１つのプライマーを有する。そのようなプライマーは、多くの場合、およそ、それぞれの長さが少なくとも約１５残基である。この配置を用いて、プライマーを使用して、本開示の実施形態のイベントの存在を示す検出可能なアンプリコンを生成／増幅することができる。これらのプライマーを使用して、上に示されている接合部配列にわたる（およびそれを含む）アンプリコンを生成することができる。

【0086】

隣接配列に「接している」プライマー（複数可）は、一般には、約１２００塩基を越えて、または接合部を越えてハイブリダイズするようには設計されない。したがって、典型的な隣接プライマーは、挿入断片の最初から隣接配列に入って１２００塩基の範囲内のどちらかの鎖の少なくとも１５残基を含むように設計され得る。すなわち、配列番号１の塩基対１〜１２７３および／または配列番号２の塩基対１７６〜１６８７由来の（またはそれとハイブリダイズする）適切なサイズの配列を含むプライマーは、本開示の実施形態の範囲内である。挿入プライマーは、配列番号１４の挿入断片のどこにでも、塩基対１２７３から１８７３および１３０５８から１３６５８のどこにでも同様に設計することができ、また、例えば、そのようなプライマーの設計のために非排他的に使用することができる。

【0087】

当業者は、さまざまな標準のハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲの条件の下で、ハイブリダイズするようにプライマーおよびプローブを設計することができ、ここでプライマーまたはプローブが例示された配列と完全に相補的ではないことも認識されよう。すなわち、ある程度のミスマッチまたは縮重が容認され得る。およそ２０ヌクレオチドのプライマーについて、例えば、一般には、ミスマッチ塩基がアンプリコンと逆のプライマーの内部または末端にある場合、１または２ヌクレオチド程度は逆の鎖と結合しなくてよい。種々の適切なハイブリダイゼーション条件が以下に提供される。イノシンなどの合成ヌクレオチド類似体は、プローブにも使用することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ならびにＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブも使用することができる。重要なのは、そのようなプローブおよびプライマーが、本開示の実施形態のイベントの存在に対して特徴的である（独自に特定し、区別することができる）ことである。

【0088】

ＰＣＲ増幅において、例えば、軽微な配列決定のエラーを生じる可能性があるエラーが起こり得ることに留意するべきである。すなわち、別段の指定のない限り、本明細書において列挙されている配列は、ダイズのゲノムＤＮＡから長いアンプリコンを生成し、次いでそのアンプリコンをクローニングし、配列決定することによって決定した。ゲノムＤＮＡから配列決定するために十分なアンプリコンを生成するために必要な多数回の増幅を考慮すると、このように生成し、決定した配列においてわずかな差異および軽微な不一致が見いだされることは珍しいことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定のエラーまたは不一致に起因して必要になる調整はいずれも本開示の実施形態の範囲内であることを認識し、留意するべきである。

【0089】

例えば、イベントを創出する間に配列を挿入する場合、いくらかのゲノム配列が欠失することは珍しくないことにも留意すべきである。したがって、本主題の隣接配列と、例えばＧＥＮＢＡＮＫに列挙されているゲノム配列との間にもいくらかの差異が出現する可能性がある。

【0090】

ＤＮＡ配列「挿入断片」の構成成分が図面に例示されており、以下の実施例においてより詳細に考察されている。これらの構成要素のＤＮＡポリヌクレオチド配列、またはその断片を、本開示の実施形態の方法においてＤＮＡプライマーまたはプローブとして使用することができる。

【0091】

本開示の一部の実施形態では、ダイズ植物由来の植物および種子などにおける導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。本明細書において提供される本主題の５’導入遺伝子／ゲノムの挿入領域接合部配列（配列番号１の塩基対１〜１２７３と配列番号１４の塩基対１〜１２７３の間）、そのセグメント、ならびに例示された配列の相補物およびその任意のセグメントを含むＤＮＡ配列が提供される。本明細書において提供される本主題の３’導入遺伝子／ゲノムの挿入領域接合部配列（配列番号２の塩基対１７６〜１６８７と配列番号１４の塩基対１３６５９〜１５１７０の間）、そのセグメント、ならびに例示された配列の相補物およびその任意のセグメントを含むＤＮＡ配列が提供される。挿入領域の接合部配列は、ゲノムに挿入された異種ＤＮＡと、挿入部位に隣接しているダイズの細胞由来のＤＮＡの接合部にわたる。そのような配列は、所与のイベントに対して特徴的であり得る。

【0092】

これらの挿入断片および境界の配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成することができる。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによって、異なるダイズ遺伝子型において本開示の実施形態のダイズ系統を同定することができることが実証された。これらおよび他の関連する手順を用いて、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含むダイズ系統を一意的に同定することができる。したがって、そのようなプライマー対に由来するＰＣＲアンプリコンは独特であり、これらのダイズ系統を同定するために使用することができる。

【0093】

一部の実施形態では、新規の導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の連続した断片を含むＤＮＡ配列は本開示の態様である。導入遺伝子挿入断片配列の十分な長さのポリヌクレオチドおよび３つの上述のダイズ植物の１つまたは複数由来のダイズのゲノム配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列および／またはこれらのダイズ植物の１つまたは複数に対して特徴的なアンプリコン産物を生成するためのプライマー配列として有用である配列が包含される。

【0094】

関連する実施形態は、本明細書において特定されるＤＮＡ配列（例えば、配列番号１およびそのセグメントなど）の導入遺伝子部分の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、またはその相補物、およびこれらの配列由来の同様の長さのダイズの隣接ＤＮＡ配列、またはその相補物に関する。そのような配列は、ＤＮＡ増幅方法において、ＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを使用して生成されるアンプリコンは、本明細書で言及されるダイズイベントのいずれかに対して特徴的である。したがって、本開示の実施形態は、そのようなＤＮＡプライマーによって生成されるアンプリコンも包含する。

【0095】

本開示の実施形態は、試料中の、本明細書で言及されるダイズイベントに対応するＤＮＡの存在を検出する方法も包含する。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、これらのダイズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、前記イベント（複数可）に対して特徴的であるアンプリコンを生成するプライマーセットと接触させるステップと；（ｂ）核酸の増幅反応を実施し、それによって、アンプリコンを生成するステップと；（ｃ）アンプリコンを検出するステップとを含んでよい。

【0096】

本開示の実施形態の別の検出方法は、試料中の、前記イベントに対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記ダイズイベントの由来のＤＮＡとハイブリダイズさせ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で対照のダイズ植物（対象のイベントがないＤＮＡ）とハイブリダイズしないプローブと接触させるステップと；（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップと；（ｃ）プローブのＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出するステップとを含む方法を包含する。

【0097】

さらに別の実施形態では、本開示は、本開示の実施形態のダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含むダイズ植物を作出する方法であって、（ａ）第１の親ダイズ系統（前記系統の植物にグルホシネート耐性を付与する本開示の実施形態の発現カセットを含む）と第２の親ダイズ系統（この除草剤耐性形質を欠く）を有性交雑し、それによって、複数の後代植物を作出するステップと；（ｂ）分子マーカーを使用することによって後代植物を選択するステップとを含む方法を包含する。そのような方法は、場合によって、後代植物を第２の親ダイズ系統と戻し交雑して、前記昆虫抵抗性およびグルホシネート耐性形質を含む真の育種（true-breeding）ダイズ植物を作出するさらなるステップを含んでよい。

【0098】

本開示の別の態様によると、前記イベントを用いて交雑の後代の接合性を決定する方法が提供される。前記方法は、ダイズＤＮＡを含む試料を本開示の実施形態のプライマーセットと接触させるステップを含んでよい。前記プライマーは、前記ダイズイベント由来のゲノムＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、前記ダイズイベントに対して特徴的である第１のアンプリコンを生成する。そのような方法は、核酸の増幅反応を実施し、それによって、第１のアンプリコンを生成するステップと；第１のアンプリコンを検出するステップと；ダイズＤＮＡを含む試料を、第２のプライマーセットと接触させるステップと（前記第２のプライマーセットは、ダイズ植物由来のゲノムＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、前記イベントのポリヌクレオチド配列を含まないネイティブなダイズのゲノムＤＮＡの内在性配列を含む第２のアンプリコンを生成する）；核酸の増幅反応を実施し、それによって、第２のアンプリコンを生成するステップとをさらに含む。この方法は、第２のアンプリコンを検出するステップと、試料中の第１のアンプリコンと第２のアンプリコンとを比較するステップであって、両方のアンプリコンが存在することにより、試料が、導入遺伝子挿入物の接合性を示すステップとをさらに含む。

【0099】

ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示されている組成物およびＤＮＡの検出の技術分野で周知の方法を使用して開発することができる。このキットは、試料中の対象のダイズイベントＤＮＡを特定するために有用であり、このＤＮＡを含有するダイズ植物を育種するための方法に適用することができる。キットは、例えば、本明細書に開示されているアンプリコンと相補的であるＤＮＡ配列、または対象イベントの導入遺伝子の遺伝エレメントに含有されるＤＮＡと相補的であるＤＮＡ配列を含有する。これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応において、またはＤＮＡのハイブリダイゼーション方法においてプローブとして、使用することができる。キットは、検出方法を実行するために必要な試薬および材料も含有することができる。

【0100】

「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、または酵素など）を付着させた単離された核酸分子である。そのようなプローブは、標的核酸の鎖、本開示の実施形態の場合では、ダイズ植物由来であるかイベント由来のＤＮＡを含む試料由来であるかにかかわらず、前記ダイズイベントの１つ由来のゲノムＤＮＡの鎖にハイブリダイズできる。本開示の実施形態によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用することができるポリアミドおよび他のプローブ材料も含む。

【0101】

「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって標的ＤＮＡ鎖とアニーリングしてプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、次いでポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離された／合成された核酸である。本開示の実施形態のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸の増幅方法によって標的核酸配列を増幅するためのそれらの使用を指す。

【0102】

プローブおよびプライマーは、一般に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、または１０００または２０００または５０００ポリヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。そのようなプローブおよびプライマーは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本開示の実施形態によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有するが、標的配列とは異なり、標的配列とハイブリダイズする能力を保持するプローブを従来の方法によって設計することができる。

【0103】

プローブおよびプライマーを調製し、使用するための方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、1〜3巻Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989年に記載されている。ＰＣＲのプライマー対は、公知の配列から、例えば、その目的のためのコンピュータプログラムを使用することによって得ることができる。

【0104】

本明細書に開示されている隣接ＤＮＡおよび挿入断片の配列に基づくプライマーおよびプローブを使用して、従来の方法によって、例えば、そのような配列を再クローニングし、配列決定することによって、開示されている配列を確認すること（および、必要であれば、補正すること）ができる。

【0105】

本開示の実施形態の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅の方法を使用して、試料中のトランスジェニックイベント由来のＤＮＡの存在を特定することができる。核酸分子またはその断片は、ある特定の状況下で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書で使用される場合、２つの核酸分子は、２つの分子が、逆平行の、二本鎖核酸構造を形成することができる場合、互いと特異的にハイブリダイズすることができると言える。核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示す場合、その「相補物」であると言える。本明細書で使用される場合、分子は、分子の一方のあらゆるヌクレオチドが、他方のヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性」を示すと言える。完全な相補性を示す分子は、一般に、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニーリングしたままであることが可能になるのに十分な安定性で互いとハイブリダイズする。従来の高ストリンジェンシー条件はSambrookら、1989年に記載されている。

【0106】

２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、互いとアニーリングしたままであることを可能にするために十分な安定性で互いとハイブリダイズすることができる場合、「最小相補性」を示す。従来の低ストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989年に記載されている。核酸分子がプライマーまたはプローブとしての機能を果たすためには、用いる特定の溶媒および塩濃度の下で安定な二本鎖構造を形成できるために配列と最小相補性があると示すことのみが必要である。

【0107】

用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェンシー条件」は、Sambrookら、1989年、9.52〜9.55において考察されている特定のハイブリダイゼーション手順による、核酸プローブの標的核酸（すなわち、対象とする特定の核酸配列）とのハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambrookら、1989年、9.47〜9.52および9.56〜9.58も参照されたい。

【0108】

構想される適用に応じて、標的配列に対するハイブリダイゼーションの選択性のさまざまな程度を実現するために、ストリンジェントな条件のさまざまな条件またはプローブもしくはプライマーのポリヌクレオチド配列の縮重を使用することができる。高い選択性を必要とする適用のために、一般には、あるポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列をハイブリダイズさせるために比較的ストリンジェントな条件を用いることがある。例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによってもたらされるような比較的低塩かつ／または高温の条件を選択することがある。ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション濾過器を高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃）で少なくとも２回洗浄することを伴ってよい。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することは、当業者に公知である。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、低ストリンジェンシーである５０℃で約２．０×ＳＳＣから高ストリンジェンシーである５０℃で約０．２×ＳＳＣまでから選択することができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、低ストリンジェンシー条件である室温、約２２℃から高ストリンジェンシー条件である約６５℃まで増加させることができる。温度と塩との両方が変動してよい、または、温度もしくは塩濃度のいずれかは、他方の変数が変化する一方で一定に保たれてよい。そのような選択的な条件は、もしあれば、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチを少し容認する。ハイブリダイゼーションによってＤＮＡ配列を検出することは当業者に周知であり、米国特許第４，９６５，１８８号および同第５，１７６，９９５号の教示は、ハイブリダイゼーション分析の方法の例である。

【0109】

特に好ましい実施形態では、本開示の実施形態の核酸は、高ストリンジェンシー条件下で、本明細書において例証または提案される、その相補物および断片を含めたプライマー（またはアンプリコンもしくは他の配列）の１つまたは複数と特異的にハイブリダイズする。本開示の一態様では、本開示の実施形態のマーカー核酸分子は、本明細書において例示された配列の１つに記載されている核酸配列、またはその相補物および／もしくは断片を有する。

【0110】

本開示の別の態様では、本開示の実施形態のマーカー核酸分子は、そのような核酸配列と、８０％から１００％の間または９０％未満から１００％の間の配列同一性を共有する。本開示の別の態様では、本開示の実施形態のマーカー核酸分子は、そのような配列と９５％から１００％の間の配列同一性を共有する。そのような配列は、遺伝的交雑の後代を特定するための植物育種方法において、マーカーとして使用することができる。プローブの標的ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションは、当業者に公知の任意の数の方法によって検出することができ；それらとしては、これらに限定されないが、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを挙げることができる。

【0111】

特定の増幅プライマー対を使用する標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはその相補物）を有するプライマーが結合し得る標的核酸配列のみとハイブリダイズすること、および好ましくは特有の増幅産物、アンプリコンを生成することを可能にする条件である。

【0112】

用語「（標的配列）に特異的な」は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含む試料中の標的配列のみとハイブリダイズすることを示す。

【0113】

本明細書で使用される場合、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物を指す。例えば、有性交雑によって生じたダイズ植物が、本開示の実施形態のダイズ植物由来のトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含有するかどうかを決定するために、ダイズ植物の組織試料から抽出したＤＮＡを、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位の近接する植物のゲノム内の隣接配列に由来するプライマー、および挿入された異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーを含むプライマー対を使用して、イベントＤＮＡの存在に対して特徴的であるアンプリコンを生成する核酸の増幅方法に供することができる。アンプリコンは、ある長さであり、同じくイベントに対して特徴的である配列を有する。アンプリコンの長さは、プライマー対の全て合わせた長さ足す１ヌクレオチド塩基対、および／またはプライマー対の全て合わせた長さ足す約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、またはそれ以上のヌクレオチド塩基対（上に列挙されている増大のいずれかを足すまたは引く）にわたってよい。あるいは、プライマー対は、挿入断片のヌクレオチド配列全体を含むアンプリコンが生成されるように、挿入ＤＮＡの両側の隣接配列に由来してもよい。植物のゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入ＤＮＡ配列からある距離に位置してよい。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から最大約２万ヌクレオチド塩基対までにわたることができる。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡの熱増幅反応において形成される可能性があるプライマー二量体を特に除外する。

【0114】

核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた当技術分野で公知の種々の核酸の増幅方法のいずれかによって実現することができる。種々の増幅方法が当技術分野で公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている。２２ｋｂに至るまでのゲノムＤＮＡを増幅するためにＰＣＲ増幅方法が開発されてきた。これらの方法ならびにＤＮＡ増幅の技術分野で公知の他の方法を、本開示の実施形態の実施において使用することができる。本明細書において提供される配列に由来するプライマーを使用してイベントからそのような配列を増幅し、その後ＰＣＲアンプリコンまたはクローニングされたＤＮＡの標準のＤＮＡ配列決定を行うことにより、本主題のダイズイベント由来の異種導入遺伝子ＤＮＡ挿入断片の配列または隣接ゲノム配列を検証すること（および必要であれば、補正すること）ができる。

【0115】

これらの方法によって生成されるアンプリコンは、複数の技法によって検出することができる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムを用いた染色は、ＤＮＡアンプリコンを検出する周知の一般的な方法である。別のそのような方法は、近接する隣接ゲノムＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列の両方とオーバーラップするＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計する遺伝子ビット分析（Genetic Bit Analysis）である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェル内に固定化されている。対象の領域のＰＣＲ後（挿入配列内の１つのプライマーおよび近接する隣接ゲノム配列内の１つのプライマーを使用する）、一本鎖のＰＣＲ産物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼおよび予測される次の塩基に特異的な標識したｄｄＮＴＰを使用する一塩基伸長反応の鋳型としての機能を果たし得る。結合した産物の分析は、蛍光シグナルの量の定量化によって完了することができる。蛍光信号により、上首尾の増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長に起因して、挿入断片／隣接配列が存在することが示される。

【0116】

別の方法は、Winge（Innov. Pharma. Tech. 00巻:18〜24頁、2000年）に記載されているようなパイロシークエンス技法である。この方法では近接するゲノムＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドを設計する。このオリゴヌクレオチドを、対象の領域（挿入配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）由来の一本鎖のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせるために設計された、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’−ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰを個々に加え、それが取り込まれた結果、測定される光信号がもたらされる。光信号により、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基または多塩基の伸長が上首尾であり、したがって導入遺伝子挿入断片／隣接配列が存在することが示される。

【0117】

蛍光偏光は、本開示の実施形態のアンプリコンを検出するために使用することができる別の方法である。この方法に従って、オリゴヌクレオチドを、ゲノムの隣接ＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするように設計する。このオリゴヌクレオチドを、対象の領域（挿入ＤＮＡ内の１つのプライマーおよび隣接ゲノムＤＮＡ配列内の１つのプライマー）由来の一本鎖のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識したｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。一塩基伸長により、ｄｄＮＴＰが取り込まれる。蛍光標識したｄｄＮＴＰの取り込みは、蛍光光度計を使用して偏光の変化として測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長の成功によって、導入遺伝子挿入断片／隣接配列が存在することを示す。

【0118】

ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し、定量する方法である。簡単に述べると、ゲノムの隣接と挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。特異的な増幅の間に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ校正機構により、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部分から蛍光部分が放出される。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によって、隣接配列／導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。

【0119】

ポリヌクレオチド配列の検出において使用するための分子ビーコンが記載されている。簡単に述べると、隣接ゲノムＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブの独特の構造により、蛍光部分およびクエンチング部分が極めて近傍に保たれる二次構造が含有される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。ＰＣＲ増幅が上手くいった後、ＦＲＥＴプローブが標的配列にハイブリダイズすることにより、プローブの二次構造が除去され、蛍光部分およびクエンチング部分が空間的に分離される。蛍光シグナルが結果として生じる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によって、隣接ゲノム配列／導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。

【0120】

ダイズゲノム内の挿入するために優れた位置を開示し、本開示の実施形態は、この遺伝子位置の概ね近くに少なくとも１つの非ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１挿入断片を含むダイズ種子および／またはダイズ植物も含む。１つの選択肢は、本明細書において例示されているダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１挿入断片を異なる挿入断片で置換することである。一般的には、例えば、特定の実施形態において、標的化相同組換えが使用される。この種類の技術は、例えば、ＷＯ０３／０８０８０９Ａ２および対応する公開された米国特許出願（Ｕ．Ｓ．２００３０２３２４１０）の主題である。したがって、本開示の実施形態は、本明細書において同定される隣接配列の全てまたは認識できる部分が隣接する異種挿入断片（多コピーのｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃまたはｐａｔ遺伝子の代わりにまたはそれと一緒に）を含む植物および植物細胞を包含する（配列番号１のｂｐ１−１２７３および配列番号２のｂｐ１７６−１６８７）。ｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃまたはｐａｔの１つの追加的なコピー（または複数の追加的なコピー）も、この／これらのように挿入の標的とすることができる。

【0121】

本明細書において言及または引用された全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明確な教示と相反しない限りは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の実施例は、本開示の実施形態を実施するための手順を例示するため、および本開示のある特定の好ましい実施形態を実証するために含まれる。これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。当業者には、以下の実施例に開示されている技法は、それを実施するための好ましい方式を例示するために使用される特定の手法を表していることが理解されたい。しかし、当業者には、本開示に照らして、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、なお同様または類似の結果を得ながら、これらの特定の実施形態において多くの変更を行うことができることが理解されたい。別段の指定のない限り、全ての百分率は重量により、特に断りのない限り、全ての溶媒混合物の割合は体積による。

【0122】

別段の指定のない限り、以下の略語が使用されている。
ｂｐ 塩基対
℃ 摂氏温度
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ キロベース
μｇ マイクログラム
μＬ マイクロリットル
ｍＬ ミリリットル
Ｍ モル質量
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ 植物転写単位または発現カセット
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＳＣ 塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムとの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ７．０
ＴＢＥ トリス塩基、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ８．３．
（実施例）

【実施例1】

【0123】

ｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１ＡｃおよびＰＡＴダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５Ｊの形質転換および選抜
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含むトランスジェニックダイズ（Glycine max）を、ダイズ子葉節の外植片をアグロバクテリウム媒介形質転換によって生成した。Ｔ鎖ＤＮＡ領域内に選抜マーカー、ｐａｔｖ６および対象の遺伝子ｃｒｙ１Ｆｖ３およびｃｒｙ１ Ａｃ ｓｙｎｐｒｏを含むバイナリーベクターｐＤＡＢ９５８２（図１）を保有する武装解除したアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１（Hoodら、1993年）を使用して形質転換を開始した。ｐＤＡＢ９５８２のＴ鎖ＤＮＡ配列は配列番号３に示され、下の表１において注釈を付けている。

【0124】

【表1】

【0125】

Zengら（2004年）の手順を改変して用いてアグロバクテリウム媒介形質転換を行った。簡単に述べると、ダイズ種子（Ｍａｖｅｒｉｃｋ栽培品種）を基本培地上で発芽させ、子葉節を単離し、アグロバクテリウムに感染させた。アグロバクテリウムを除去するために、苗条誘導（shoot initiation）培地、苗条伸長培地、および発根培地にセフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した。グルホシネートによる選択を使用して、形質転換されていない苗条の生長を阻害した。選択された苗条を、根を発生させるために発根培地に移し、次に、小植物を順化させるために土壌混合物に移した。

【0126】

選択された小植物の頂小葉にグルホシネートを塗布して推定形質転換体についてスクリーニングした。スクリーニングされた小植物を温室に移して、気候順化させ、次に葉にグルホシネートを塗布して耐性を再確認し、推定形質転換体であるとみなした。スクリーニングされた植物の試料を採取し、選択マーカー遺伝子および／または対象の遺伝子を確認するための分子解析を行った。Ｔ_０植物を温室内で自家受精させてＴ_ｉ種子を生じさせた。

【0127】

このイベント、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１は、独立した形質転換分離株から生成した。Ｔ_ｉ植物を戻し交雑し、その後の世代にわたって優良品種に遺伝子移入した。イベントをその独特の特性、例えば、単一の挿入部位、正常なメンデル分離、安定発現、ならびに昆虫抵抗性、除草剤耐性および農業生産力を含めた効力の優れた組合せに基づいて選抜した。以下の実施例は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を特徴付けるために使用したデータを含有する。

【実施例2】

【0128】

ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５Ｊにおけるタンパク質の発現の特徴付け
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１において発現させた組換え型のＣｒｙ１Ｆタンパク質、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質、およびＰＡＴタンパク質の生化学的性質を特徴付けた。定量的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、タンパク質の生化学的性質を特徴付け、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１におけるこれらのタンパク質の発現を確認するために用いることができる、当技術分野の範囲内で公知の生化学的アッセイである。

【0129】

実施例２．１：植物組織におけるＰＡＴタンパク質、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質、およびＣｒｙ１Ａｃタンパク質の発現
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現を解析するために調製した。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からＰＡＴタンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、ＰＡＴ ＥＬＩＳＡキットをサンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者（Ｅｎｖｉｒｏｌｏｇｉｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）の推奨プロトコールに従って使用した。このアッセイにより、発現されたＰＡＴタンパク質の濃度を測定した。

【0130】

界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からＣｒｙ１Ｆタンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、Ｃｒｙ１Ｆ ＥＬＩＳＡキットをサンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）の推奨プロトコールに従って使用した。このアッセイにより、発現されたＣｒｙ１Ｆタンパク質の濃度を測定した。

【0131】

０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からＣｒｙ１Ａｃタンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、Ｃｒｙ１Ａｃ ＥＬＩＳＡキットをサンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）の推奨プロトコールに従って使用した。このアッセイにより、発現したＣｒｙ１Ａｃタンパク質の濃度を測定した。

【0132】

ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１において、検出解析を実施して発現の安定性および遺伝性を垂直方向（世代間）および水平方向（世代内の系列間）の両方で調査した。

【0133】

実施例２．２：植物組織におけるＣｒｙ１Ｆタンパク質、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質およびＰＡＴタンパク質の発現
上記のプロトコルを使用してダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１におけるＣｒｙ１Ｆタンパク質、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質およびＰＡＴタンパク質のレベルを決定した。ダイズの葉組織から、可溶性の抽出可能なタンパク質を、定量的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）方法を使用して測定した。Ｔ_２〜Ｔ_６世代のダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１で発現は安定であり（分離性でない）、系列全てにわたって一貫していた。表２に、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１におけるトランスジェニックタンパク質の平均発現レベルが列挙されている。

【0134】

【表2】

【実施例3】

【0135】

ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の挿入断片および隣接境界領域におけるＤＮＡ配列のクローニングおよび特徴付け
ゲノムの挿入部位を特徴付け、説明するために、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の隣接ゲノムＴ−ＤＮＡ境界領域の配列を決定した。１２７３ｂｐの５’隣接境界配列（配列番号１）および１３７１ｂｐの３’隣接境界配列（配列番号２）を含むダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のゲノム配列を確認した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の境界配列に基づくＰＣＲ増幅により、境界領域がダイズ起源であること、および接合領域がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に独特の配列であることが検証された。接合領域をダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のイベント特異的な同定のために使用することができる。さらに、Ｔ鎖の挿入部位を、形質転換されていないダイズのゲノム由来の同定された隣接境界配列の領域に対応するゲノムの断片を増幅することによって特徴付けた。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を形質転換されていないゲノム配列と比較することにより、Ｔ鎖の組み込みの間に元の遺伝子座から約２１ｂｐが欠失したことが明らかになった。全体的に、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の挿入断片および境界配列を特徴付けることにより、ｐＤＡＢ９５８２由来のＴ鎖のインタクトなコピーがダイズゲノム内に存在することが示された。

【0136】

【表3】

【0137】

【表4】

【0138】

【表5】

【0139】

実施例３．１：ダイズのゲノム配列の確認
５’隣接境界および３’隣接境界を第０３染色体由来のダイズ（Glycine max）全ゲノムショットガン配列に対しアラインメントし、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の導入遺伝子がダイズゲノムの第０３染色体に挿入されたことが示されている。ダイズゲノムからダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の挿入部位を確認するために、異なるプライマー対を用いてＰＣＲを行った（図２、表３、表４、および表５）。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１由来のゲノムＤＮＡおよび他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニックダイズ系統由来のゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。５’境界配列が正確であることを確認するために、Ａｔ Ｕｂｉ１０プロモーター遺伝子エレメント、例えば、ＡｔＵｂｉ１ＯＲＶ１に結合するように設計したプライマー、および、ダイズゲノムの第０３染色体上のクローニングされた５’末端境界に結合するように設計したプライマー、８１６１５＿ＦＷ２と称されるプライマーを、Ａｔ Ｕｂｉ１Ｏプロモーター遺伝子エレメントから５’末端境界配列にわたるＤＮＡセグメントを増幅するために使用した。同様に、クローニングされた３’境界配列を確認するために、ｐａｔ特異的なプライマー、例えば、３’ＰＡＴＥｎｄ０５、ならびに、８１６１５＿ＲＶ１および８１６１５＿ＲＶ２と称される、クローニングされた３’末端境界配列に従って設計したプライマーを、ｐａｔ遺伝子から３’境界配列にわたるＤＮＡセグメントを増幅するために使用した。予測されたサイズを有するＤＮＡ断片は、各プライマー対を用いたダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のゲノムＤＮＡからのみ増幅されたが、他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニック対照由来のＤＮＡ試料からは増幅されなかった。結果は、クローニングされた５’境界配列および３’境界配列が、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のＴ鎖挿入断片の隣接境界配列であることを示している。

【0140】

ダイズゲノム内のＤＮＡ挿入物をさらに確認するために、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のＴ鎖挿入断片を含有しないゲノムＤＮＡにおいてダイズ境界配列にわたるＰＣＲ増幅を完了した。５’末端境界配列に従って設計したプライマー８１６１５＿ＦＷ２、および３’末端境界配列に対して設計した１つのプライマー８１６１５−ＲＶ３を使用して、ｐＤＡＢ９５８２Ｔ鎖が組み込まれた遺伝子座を含有したＤＮＡセグメントを増幅した。予測通り、８１６１５＿ＦＷ２および８１６１５＿ＲＶ３のプライマー対を用いて完了したＰＣＲ反応により、全ての他のダイズ対照系統からおよそ１．８ｋｂのＤＮＡ断片が生じたが、ｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１からは生じなかった。同定されたダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の５’境界配列および３’境界配列を第０３染色体由来のダイズ（Glycine max）全ゲノムショットガン配列とアラインメントすることにより、元の遺伝子座からの約２１ｂｐの欠失が明らかになった（図３）。これらの結果により、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の導入遺伝子がダイズゲノムの第０３染色体の部位に挿入されたことが実証された。

【実施例4】

【0141】

ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のサザンブロットによる特徴付け
サザンブロット分析を使用して、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の組み込みパターンを確立した。これらの実験により、ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｆ導入遺伝子のダイズゲノム内への組み込みおよびその完全性を実証するデータが生成した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１は、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由来のｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｆ ＰＴＵの単一コピーを含有する全長の、単純な組み込みイベントであると特徴付けられた。

【0142】

サザンブロットのデータにより、Ｔ鎖断片がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のゲノムに挿入されたことが示唆された。詳細なサザンブロット分析を、ｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のＴ鎖組み込み領域に含有されるｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｆ遺伝子に特異的なプローブ、およびプラスミド内に位置する切断部位を有し、プラスミドまたはプラスミドとダイズのゲノムＤＮＡの接合部にわたる断片（境界断片）内にハイブリダイズ断片を生じる説明的な制限酵素を使用して行った。サザンハイブリダイゼーションによって示された制限酵素とプローブの組合せについての分子量は、このイベントに独特であり、その同定パターンを確立した。これらの分析により、ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＦＰＴＵの再配置を伴わずにプラスミド断片がダイズのゲノムＤＮＡに挿入されたことも示された。

【0143】

実施例４．１
ダイズの葉の試料の収集およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有する個々のダイズ植物から回収した葉組織からゲノムＤＮＡを抽出した。さらに、ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｆ遺伝子が存在しない物質系統の代表である遺伝的背景を含有する従来のダイズ植物であるＭａｖｅｒｉｃｋからｇＤＮＡを単離した。標準のＣＴＡＢ法の後、凍結乾燥した葉組織から個々のゲノムＤＮＡを抽出した。抽出した後、ＤＮＡを、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して分光蛍光分析によって定量した。

【0144】

実施例４．２
ＤＮＡの消化および分離
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１をサザンブロットによって分子キャラクタリゼーションするために、１０マイクログラム（１０μｇ）のゲノムＤＮＡを消化した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１および非トランスジェニックダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡを、各ＤＮＡ試料にＤＮＡ１μｇ当たりおよそ５ユニットの選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を加えることによって消化した。各試料を、およそ３７℃で一晩インキュベートした。単独消化のために、制限酵素ＡｓｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｓｉＩ、およびＮｄｅＩを個々に使用した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。二重消化のために制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＬＩを一緒に使用した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。さらに、陽性ハイブリダイゼーション対照試料を、プラスミドＤＮＡであるｐＤＡＢ９５８２を非トランスジェニックダイズ品種であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡと混ぜ合わせることによって調製した。プラスミドＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ反応混液を、試験試料の場合と同じ手順および制限酵素を用いて消化した。

【0145】

消化物を一晩インキュベートした後、Ｑｕｉｃｋ−Ｐｒｅｃｉｐ Ｐｌｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）２５μＬを加え、消化されたＤＮＡ試料を、イソプロパノールを用いて沈澱させた。沈澱したＤＮＡペレットを、１×ローディング緩衝液（０．０１％ブロモフェノールブルー、１０．０ｍＭのＥＤＴＡ、１０．０％グリセロール、１．０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５）１５μＬに再懸濁させた。次いで、ＤＮＡ試料および分子サイズマーカーを、０．４×ＴＡＥ緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いた０．８５％未満のアガロースゲルにより、３５ボルトでおよそ１８〜２２時間、電気泳動して断片の分離を実現した。ゲルを臭化エチジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で染色し、ＤＮＡを紫外線（ＵＶ）の下で可視化した

【0146】

実施例４．３
サザン転写およびメンブレン処理
サザンブロット分析を基本的にＭｅｍｅｌｉｎｋら（１９９４年）に記載されている通り実施した。簡単に述べると、ＤＮＡ断片を電気泳動によって分離し、可視化した後、ゲルを、０．２５ＭのＨＣｌを用い、およそ２０分にわたって脱プリン化し、次いで、変性溶液（０．４ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ）におよそ３０分間、その後、中和溶液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのトリス、ｐＨ７．５）に少なくとも３０分間曝露させた。ナイロンメンブレンへのサザン転写を、１０×ＳＳＣを伴うウィッキング系を用いて一晩実施した。転写後、ＵＶ架橋によってＤＮＡをメンブレンに結合させ、その後、メンブレンを２×ＳＳＣ溶液で簡単に洗浄した。このプロセスにより、ハイブリダイゼーションのためのサザンブロットメンブレンの準備ができた。

【0147】

実施例４．４
ＤＮＡプローブの標識化およびハイブリダイゼーション
標識したプローブを使用してナイロンメンブレンに結合したＤＮＡ断片を検出した（表６）。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識されたヌクレオチド［ＤＩＧ−１１］−ｄＵＴＰを、遺伝子エレメントに特異的なプライマーを使用してプラスミドｐＤＡＢ９５８２から増幅されたＤＮＡ断片にＰＣＲに基づいて組み込むことによってプローブを生成した。ＰＣＲ合成によるＤＮＡプローブの生成を、ＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を製造者の推奨手順に従って使用して行った。

【0148】

標識したプローブをアガロースゲル電気泳動によって解析して、それらの質および数量を決定した。次いで、基本的にＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に関して記載されている手順を用いて、特異的な断片を検出するために、所望の量の標識したプローブをナイロンメンブレン上の標的ＤＮＡとハイブリダイズさせるために使用した。簡単に述べると、固定されたＤＮＡを含有するナイロンメンブレンブロットを２×ＳＳＣで簡単に洗浄し、ハイブリダイゼーションビン中の予め温めたＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２０〜２５ｍＬと、ハイブリダイゼーションオーブン内、およそ４５〜５５℃で約２時間にわたってプレハイブリダイズさせた。次いで、プレハイブリダイゼーション溶液をデカントし、サーマルサイクラー中でおよそ５分間加熱することによって変性させた所望の量の特異的なプローブを含有する予め温めたＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ約１５ｍＬと交換した。次いで、ハイブリダイゼーションステップをハイブリダイゼーションオーブン内、およそ４５〜５５℃で一晩行った。

【0149】

プローブハイブリダイゼーションの最後に、プローブを含有するＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを清潔なチューブ内にデカントし、およそ−２０℃で保管した。これらのプローブは、製造者の推奨手順に従って２回再使用することができた。メンブレンブロットを簡単にすすぎ、清潔なプラスチック容器中で低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて室温でおよそ５分にわたって２回洗浄し、その後、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて２回、それぞれおよそ６５℃で１５分間洗浄した。メンブレンブロットを、ＤＩＧ Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の１×マレイン酸緩衝液を用いておよそ５分にわたって簡単に洗浄した。その後、１×ブロッキング緩衝液で２時間にわたってブロッキングし、同じく１×ブロッキング緩衝液中の抗ＤＩＧ−ＡＰ（アルカリホスファターゼ）抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と一緒に最低でも３０分間インキュベートした。１×洗浄緩衝液を用いて２〜３回洗浄した後、特異的なＤＮＡプローブはメンブレンブロットに結合したままであり、ＤＩＧ標識されたＤＮＡ標準物質を、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を製造者の推奨に従って使用して可視化した。１つまたは複数の時点でブロットを化学発光フィルムに曝露させて、ハイブリダイズした断片を検出し、分子サイズ標準物質を可視化した。フィルムをＡＬＬ−Ｐｒｏ １００ Ｐｌｕｓフィルム現像剤（Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を用いて現像し、画像をスキャンした。検出されたバンドの数およびサイズを各プローブについて実証した。記載の通りＤＩＧ検出後に可視化されるＤＩＧ−Ｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ ＩＩ（ＤＩＧ ＭＷＭ ＩＩ）およびＤＩＧ−Ｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ ＶＩＩ（ＤＩＧ ＭＷＭ ＶＩＩ）を使用して、サザンブロット上にハイブリダイズした断片サイズを決定した。

【0150】

【表6】

【0151】

実施例４．５
サザンブロットの結果
ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＦＰＴＵの公知の制限酵素部位に基づく、特定の消化物およびプローブに関して予測された断片サイズおよび観察された断片サイズが表７に示されている。これらの消化およびハイブリダイゼーションから２種類の断片を同定した：公知の酵素部位がプローブ領域に隣接し、ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＦＰＴＵの挿入領域内に完全に含有されている内部の断片、および公知の酵素部位がプローブ領域の一端に位置し、第２の部位がダイズゲノム内にあると予測される境界断片。ほとんどの場合、ＤＮＡ断片の組み込み部位はそれぞれのイベントに独特であるので、境界断片のサイズはイベントごとに変動する。境界断片により、組み込まれたＤＮＡに対して制限酵素部位を位置づける手段およびＤＮＡ挿入物の数を評価する手段がもたらされる。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有するダイズの多世代に対して完了したサザンブロット分析により、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由来の低コピー、インタクトなｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＦＰＴＵが、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のダイズゲノムに挿入されたことを示唆するデータがもたらされた。

【0152】

【表7】

【0153】

制限酵素ＡｓｅＩおよびＮｓｉＩは、プラスミドｐＤＡＢ９５８２に独特の制限部位を結合および分割する。続いて、これらの酵素を、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１におけるｃｒｙ１Ａｃ遺伝子挿入断片を特徴付けるために選択した。７２８６ｂｐより大きいまたは９４７９ｂｐより大きい境界断片は、それぞれＡｓｅＩおよびＮｓｉＩで消化した後、プローブとハイブリダイズすることが予測された（表７）。それぞれＡｓｅＩおよびＮｓｉＩ消化を使用したとき、約８５００ｂｐおよび１００００より大きいｂｐの単一のｃｒｙ１Ａｃハイブリダイゼーションバンドが観察された。プローブがこのサイズのバンドにハイブリダイズすることにより、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のダイズゲノム内にｃｒｙ１Ａｃ遺伝子に対する単一の挿入部位が存在することが示唆される。制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＬＩを、ｃｒｙ１Ａｃ植物転写単位（ＰＴＵ、プロモーター／遺伝子／ターミネーター）を含有する断片を放出し、二重消化をさせるために選択した（表７）。予測された４５５０ｂｐの断片は、ＮｏｔＩおよびＡｐａＬＩ二重消化した後、プローブを用いて観察された。酵素を用いてｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１試料を消化し、その後プローブとハイブリダイズさせることで得られた結果により、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由来のインタクトなｃｒｙ１ＡｃＰＴＵの単一コピーがダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のダイズゲノムに挿入されたことが示された。

【0154】

制限酵素ＮｄｅＩおよびＮｓｉＩは、プラスミドｐＤＡＢ９５８２の制限部位に結合し、切断する。続いて、これらの酵素を、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１におけるｃｒｙ１Ｆ遺伝子挿入断片を特徴付けるために選択した。５５６９ｂｐより大きい境界断片および９４７９より大きい境界断片は、それぞれＮｄｅＩおよびＮｓｉＩで消化した後、プローブとハイブリダイズすることが予測された（表７）。ＮｄｅＩおよびＮｓｉＩを使用したとき、それぞれ約７５００ｂｐおよび１００００ｂｐより大きい単一のｃｒｙ１Ｆハイブリダイゼーションバンドが観察された。プローブがこのサイズのバンドにハイブリダイズすることにより、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のダイズゲノム内にｃｒｙ１Ｆ遺伝子に対する単一の挿入部位が存在することが示唆される。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを、ｃｒｙ１Ｆ植物転写単位（ＰＴＵ；プロモーター／遺伝子／ターミネーター）を含有する断片を放出させるために選択した（表７）。予測された７７３２ｂｐの断片が、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後にプローブを用いて観察された。ｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１試料を酵素で消化し、その後プローブとハイブリダイズさせることで得られた結果により、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由来のインタクトなｃｒｙ１Ｆ ＰＴＵがダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のダイズゲノムに挿入されたことが示された。

【0155】

実施例４．６：骨格配列が存在しないこと
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１にスペクチノマイシン抵抗性遺伝子（ｓｐｅｃＫ）、Ｏｒｉ Ｒｅｐエレメントおよび複製開始タンパク質ｔｒｆＡ
（ＴＲｆ Ａエレメント）が存在しないことを検証するために、サザンブロット分析も行った。適切な陽性対照（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡにｐＤＡＢ９５８２を付加したもの）および陰性対照（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡ）をサザン分析に含めた場合、スペクチノマイシン抵抗性、Ｏｒｉ Ｒｅｐエレメントまたはｔｒｆ Ａエレメントに対する特異的なハイブリダイゼーションは予測されなかった。ＮｓｉＩ消化し、ｓｐｅｃＲ特異的なプローブとハイブリダイズさせた後、陽性対照試料（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡにｐＤＡＢ９５８２を付加したもの）において、１５３２０ｂｐの、１つの予測されたサイズのバンドが観察された。ｓｐｅｃＲプローブは陰性対照の試料およびダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の試料とはハイブリダイズしなかった。同様に、ＮｓｉＩ消化し、ｔｒｆＡプローブとハイブリダイズさせた後、１５３２０ｂｐの、１つの予測されたサイズのバンドが陽性対照試料（ｐＤＡＢ９５８２プラスｍａｖｅｒｉｃｋ）において検出されたが、陰性対照の試料およびダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の試料では検出されなかった。ＮｄｅＩ消化し、ＯｒｉＲｅｐ特異的なプローブとハイブリダイズさせた後、５３２９ｂｐの、別の予測されたサイズのバンドが陽性対照試料（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡにｐＤＡＢ９５８２を付加したもの）において検出されたが、陰性対照の試料およびダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の試料では検出されなかった。これらのデータは、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１にスペクチノマイシン抵抗性遺伝子、Ｏｒｉ Ｒｅｐエレメントおよび複製開始タンパク質ｔｒｆＡが存在しないことを示している。

【実施例5】

【0156】

農業形質および収量圃場試験ならびに除草剤耐性
反復農業試験を実行して、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の農業での有効性をヌル同質遺伝子系統であるＭａｖｅｒｉｃｋと比較した。圃場試験の大多数について、米国全土にわたって地理的に別個の場所に設置し、そこでダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有するダイズ品種を栽培した。追加的な圃場試験をこれらの場所の外で完了し、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有するダイズ品種を、好ましくない場所で生長させることにより生じる潜在的なストレスに曝露させるために選択した。少数の圃場試験の中での環境の変動性に起因して、いくつかの現場では試験を中止した。

【0157】

実験を、場所ごとの反復数２の完全乱塊法計画（randomized complete block design）として設定した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含めて８種をエントリーした。各小区画は作条２つ、長さ１２．５フィートからなり、３０インチ離して植えた。季節を通して、圃場の小区画を通常の農業習慣の下で維持し、雑草がない状態に保った。

【0158】

試験用の種子はプエルトリコにおいて冬の間に冬季苗床で作出した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋの種子を、種子が原因のいかなる変動性も最小限にするために同じ苗床で生長させ、同様に処理した。次に、種子を北アメリカに戻し、そこで包装し、種々の植え付け場所に分配した。季節を通していくつもの農業特性を測定した。これらの特性およびデータを収集した生長段階は表８に列挙されている。

【0159】

【表8】

【0160】

生育期の最後に、全ての場所からのデータを合わせ、全場所にわたる分析を実施した。ＪＭＰ（登録商標）Ｐｒｏ ９．０．３（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用してデータ解析を行った。解析のために混合モデルを使用し、エントリーを固定効果とみなし、場所、エントリーごとの場所、および反復効果を変量とみなした。この解析からの最小二乗平均が表９において報告されている。有意なエントリー効果が測定された変数についてはその後にスチューデントのＴ検定を使用して平均分離（mean separation）を実施して、ＭａｖｅｒｉｃｋとダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の比較を行った。有意性を決定するための確率水準はｐ＝０．０５に設定した。

【0161】

【表9】

【0162】

開花までの日数、成熟度および種子１００個の重量を除き、測定された全ての形質についてダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１とＭａｖｅｒｉｃｋの間で同等性が示された。ダイズイベントｐＤＡＢ．８１６．１５．１はＭａｖｅｒｉｃｋの約２日後に開花した。２日の遅延は生産者にとって大きな遅延ではなく、作物の生産力を損なうものではない。小区画内の植物のおよそ５０％が開花を示した時に小区画の開花とみなした。同様に、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５は季節の最後にＭａｖｅｒｉｃｋの１日後に成熟したが、この遅延によって作物の生産力が損なわれるような著しい農業上の差異は生じなかった。同様に、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５の種子１００個の重量はＭａｖｅｒｉｃｋと統計学的に異なったが、これによって収量の有意な減少は生じなかった。結果は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５がＭａｖｅｒｉｃｋとは発育の仕方が異なり得るが、差異は最小限であり、商業的に生長させたダイズの正常範囲の外には出ないことを示している。

【0163】

ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の除草剤耐性を試験するために、プエルトリコ、サンタイサベルにおける有効性試験において該イベントを植えた。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を作出するために最初に形質転換した栽培品種Ｍａｖｅｒｉｃｋを各苗床に植え、実験に対照として含めた。Ｔ_３苗床の種子はＴ_２段階における単一植物選択から得、Ｔ_４苗床の種子はＴ_３段階における単一植物選択から得た。各世代において４系列のイベントを試験した。作条４つの広さ、７．５フィートの長さの小区画に各系列を植えた。作条間の間隔は３０インチであった。プエルトリコの日の短さを補償するために、小区画を光の下でおよそ２．５週間にわたって生長させた。各苗床にグルホシネートを４１１ｇ ａｅ／ｈａの比率で噴霧した。対照植物であるＭａｖｅｒｉｃｋの１つの小区画に、グルホシネートを同じ比率で噴霧し、第２の小区画には噴霧せず、イベントに対する対照比較として使用した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１はグルホシネート除草剤施用に対する耐性を示した。対照的に、除草剤処理に対して耐性のＭａｖｅｒｉｃｋ植物は存在しなかった。

【実施例6】

【0164】

ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１についての殺虫活性の特徴付け
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のＣｒｙ１Ａｃタンパク質およびＣｒｙ１Ｆタンパク質によってもたらされる、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ハッショウマメイモムシ）、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（ツマジロクサヨトウ（fall armyworm））およびヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）（タバコバッドワーム（tobacco budworm））を含めた鱗翅目の昆虫を含めたダイズ害虫からの植物の保護のレベルを特徴付けるために、圃場および温室での評価を行った。

【0165】

およそ４週齢の植物に対して温室試験を行った。１５の植物を使用してダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋ対照を評価した。試験した各昆虫種（Ａ．ゲムマタリス（A. gemmatalis）、Ｐ．インクルデス（P. includes）、およびＳ．フルギペルダ（S. frugiperda）新生幼虫）について、合計４５のリーフディスク／植物／昆虫種のために各植物から３つのリーフディスクを切り取った。１．４ｃｍのリーフパンチを２％の素寒天の上部の試験アリーナに置き、新生幼虫１匹を外寄生させ、穴のあいたプラスチックの蓋で密閉した。

【0166】

外寄生させた後に死亡率および葉の消費を評価した。穏やかな触針に反応しなかった幼虫は死亡したとみなした。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有する植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照上に置いた昆虫よりも有意に高かった（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）について死亡率８６％、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）について死亡率１００％、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）について死亡率１００％）。表１０。昆虫に消費されたリーフディスクの百分率を視覚的にスコアリングすることによって葉の損傷を評価した。温室での実験から得られた結果により、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１では、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、およびスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の外寄生に対して、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物と比較して有意に低い葉の損傷および高い昆虫の死亡率が持続したことが示された。

【0167】

圃場で生長させたダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１植物の有効性評価を、プエルトリコ、サンタイサベルの種子増加苗床小区画から葉の試料を収集し、これらの葉をバイオアッセイするためにＩＮ、インディアナポリスに送ることによって行った。Ｔ_３ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１植物のための苗床小区画は、４つの作条に配置されたおよそ１８０の植物からなった。各作条は長さ２．３ｍであり、７６．２ｃｍの間隔があけられ、個々の植物は各作条内に５．１ｃｍの間隔で植えられた。分裂組織のおよそ４節下に位置する完全に増大した主茎の三出葉１枚のバイオアッセイを行った。三出葉組織をイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を有する１０の個々のダイズ植物および１０の個々の「Ｍａｖｅｒｉｃｋ」植物から、切除した。葉を包装して実験室に移した。実験室において、各三出葉から直径３．３３ｃｍのリーフディスク１つまたは２つを押し抜き、合計１６のリーフディスクを準備した。各リーフディスクを２％の寒天の上部の試験アリーナに置き、新生ヨトウガ（S. frugiperda）幼虫１匹を外寄生させ、穴のあいたプラスチックの蓋で密閉した。リーフディスクを、制御された環境のチャンバー内で７日間保持し、７日の時点で死亡率および葉の消費を評価した。穏やかな触針に反応しない幼虫は死亡したとみなした。

【0168】

外寄生させた後の死亡率および葉の消費を評価した。穏やかな触針に反応しなかった幼虫を死亡したとみなした。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有する植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照上に置いた昆虫（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）について死亡率０％）よりも有意に高かった（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）について死亡率６８％）。表１０。昆虫に消費されたリーフディスクの百分率を視覚的にスコアリングすることによって葉の損傷を評価した。この葉のバイオアッセイから得られた結果により、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の幼虫では、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の幼虫よりも有意に低い葉の損傷および昆虫の生存（高い昆虫の死亡率としても説明される）が持続したことが示された。

【0169】

ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の有効性を第１の圃場試験（表１０の第１の圃場試験）において評価した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有する、Ｔ_４世代からのダイズ種子、および形質転換されていないダイズ品種Ｍａｖｅｒｉｃｋの種子を、完全乱塊法計画、反復数２で植えた。各反復小区画は作条２つ、長さ２．３ｍおよび０．７６ｍの間隔からなった。作条内に、作条当たり種子４０個を５．７ｃｍの間隔で植えた。試験種子を植え、一方の反復にグルホシネート除草剤を４１１ｇ ａｅ／ｈａで噴霧し、他方の反復にはこれを噴霧せず、その結果、Ｍａｖｅｒｉｃｋ植物に関して噴霧していない反復のみがバイオアッセイのために生存した。

【0170】

ダイズ植物がＲ２生長段階になった時にバイオアッセイのために葉を収集した。バイオアッセイのために葉を収集する数日前に、同じ植物の１節下の葉（および古い葉）からリーフパンチを取得し、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質およびＣｒｙ１Ｆタンパク質の発現について、実施例２に記載のものと同様のＥＬＩＳＡ法を使用して分析した（表１２）。分裂組織の４節下に位置し、損傷または変色の徴候が示されてない完全に増大した主茎の三出葉をバイオアッセイのために切除した。反復当たり１５の植物のそれぞれから三出葉を１枚切除した。葉を１５℃で保管し、バイオアッセイした。各三葉の小葉を切除し、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の小葉のそれぞれの中心から直径３．３３ｃｍのディスクを１枚切り取り、Ｍａｖｅｒｉｃｋの小葉それぞれから直径３．３３ｃｍのディスクを２枚切り取った。これらのリーフディスクをそれぞれ、３２ウェルのプラスチックバイオアッセイトレーの別々の標識したウェルに入れた。各ウェルは寒天の薄い層を含有した。新生Ｐ．インクルデンス（P. includens）の幼虫、新生Ａ．ゲムマタリス（A. gemmatalis）の幼虫、または新生ヨトウガ（S. frugiperda）の幼虫１匹を各リーフディスク上に置いた。換気をもたらすためにバイオアッセイトレーを穴のあいた接着性のプラスチックシートで密閉した。各種について、幼虫３０匹をダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１からの葉組織に曝露させ、幼虫３０匹をＭａｖｅｒｉｃｋからの葉組織に曝露させた。外寄生させたリーフディスクを保持するプラスチックトレーを２５℃、相対湿度（ＲＨ）４０％で保持した。７日後に、幼虫について、死亡した（鋭い針を用いて刺激しても動かない）か、発育が阻止された（Ｍａｖｅｒｉｃｋの葉の上に保持された幼虫よりもサイズが小さい）か、または生きている（サイズおよび刺激に対する応答が正常である）かを決定した。

【0171】

外寄生させた後の死亡率を評価した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有する植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照上に置いた昆虫よりも有意に高かった（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）について死亡率９７％、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）について死亡率１００％、およびシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）について死亡率１００％）。表１０。この葉のバイオアッセイから得られた結果により、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）、およびシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）の幼虫では、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）、およびシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）の幼虫よりも有意に低い昆虫の生存（高い昆虫の死亡率としても説明される）が持続したことが示された。

【0172】

ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の有効性を第２の別の圃場試験（表１０の第２の圃場試験）で評価した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有する、Ｔ_４世代からのダイズ種子および形質転換されていないダイズ品種Ｍａｖｅｒｉｃｋの種子を完全乱塊法計画、反復数４で植えた。各反復小区画は作条４つ、長さ６．１ｍおよび１．０２ｍの間隔からなった。作条内に、作条当たり種子１６０個を３．８ｃｍの間隔で植えた。ネイティブな害虫集団を誘引するために試験小区画の間およびその周りの追加的な作条にＭａｖｅｒｉｃｋを植えた。

【0173】

ダイズ植物がＲ２生長段階になった時にバイオアッセイのために葉を収集した。追加的なバイオアッセイのための葉を、ダイズ植物がＲ５生長段階になった時に同じ植物から収集した。各バイオアッセイのために葉を収集する数日前に、同じ植物の１節下の葉からリーフパンチを取得し、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質およびＣｒｙ１Ｆタンパク質について実施例２に記載のものと同様のＥＬＩＳＡ法を使用して分析した（表１２）。分裂組織の４節下に位置し、損傷または変色の徴候が示されてない完全に増大した主茎の三出葉をバイオアッセイのために切除した。反復当たり１５の植物のそれぞれから三出葉を１枚切除し、反復当たり三葉４枚をＰ．インクルデンス（P. includens）のバイオアッセイのために使用し、反復当たり三葉４枚をヨトウガ（S. frugiperda）のバイオアッセイのために使用し、反復当たり三葉４枚をＨ．ビレセンス（H. virescens）のバイオアッセイのために使用し、反復当たり三葉３枚をＡ．ゲムマタリス（A. gemmatalis）のバイオアッセイのために使用した。各三葉の両側の小葉を切除し、寒天の薄い層を含有する別々の標識したペトリ皿に入れた。Ｐ．インクルデンス（P. includens）、Ａ．ゲムマタリス（A. gemmatalis）、ヨトウガ（S. frugiperda）、またはＨ．ビレセンス（H. virescens）の二齢の幼虫２匹を各小葉上に置いた。Ｐ．インクルデンス（P. includens）、ヨトウガ（S. frugiperda）、およびＨ．ビレセンス（H. virescens）については、幼虫６４匹をダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋ植物からの葉組織に曝露させた。Ａ．ゲムマタリス（A. gemmatalis）については、幼虫４８匹をダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋ対照植物からの葉組織に曝露させた。外寄生させた小葉を保持するペトリ皿を蓋で覆い、２５℃、ＲＨ４０％で保持した。４日後に、幼虫について、死亡した（鋭い針を用いて刺激しても動かない）か、瀕死である（幼虫は刺激には応答するが、端に置いても元に戻ることができない）か、発育が阻止された（Ｍａｖｅｒｉｃｋの葉の上に保持された幼虫よりもサイズが小さい）か、または生きている（サイズおよび刺激に対する応答が正常である）かを決定した。

【0174】

Ｒ５段階でのバイオアッセイ手順は、ヨトウガ（S. frugiperda）およびＨ．ビレセンス（H. virescens）について、小葉３枚全てを各三葉から切除し、二齢の幼虫１匹を各小葉上においたことを除いてＲ２段階で使用した手順と同じであった。これにより、ヨトウガ（S. frugiperda）およびＨ．ビレセンス（H. virescens）の幼虫４８匹がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋからの小葉に曝露された。

【0175】

Ｒ２の葉のバイオアッセイとＲ５の葉のバイオアッセイの両方について、外寄生させた後の死亡率を評価した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有する植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照上に置いた昆虫よりも有意に高かった（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）に関してＲ２の葉のバイオアッセイについて死亡率６９％およびＲ５の葉のバイオアッセイについて死亡率５４％、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）に関してＲ２の葉のバイオアッセイとＲ５の葉のバイオアッセイの両方について死亡率１００％、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）に関してＲ２の葉のバイオアッセイについて死亡率９５％およびＲ５の葉のバイオアッセイについて死亡率７０％、ならびにシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）に関してＲ２の葉のバイオアッセイについて死亡率１００％およびＲ５の葉のバイオアッセイについて死亡率９８％）。表１０。この葉のバイオアッセイから得られた結果により、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）およびヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）の幼虫では、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）およびヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）の幼虫よりも有意に低い昆虫の生存（高い昆虫の死亡率としても説明される）が持続したことが示された。

【0176】

第２の圃場試験で生長させたダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋダイズ植物からダイズのさやを収集し、Ｈ．ビレセンス（H. virescens）の幼虫を用いてバイオアッセイした。各反復小区画内でランダムに選択した６つの植物から主茎の一番上のさや２つを切除した。さやのセットそれぞれをプラスチックペトリ皿に入れ、二齢のＨ．ビレセンス（H. virescens）の幼虫１匹を外寄生させた。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋ対照植物から収穫されたさやのセットに幼虫２４匹が曝露されるように実験を設計した。ペトリ皿を上記の切除した葉のバイオアッセイと同じ条件下で保持した。２日後に、葉のバイオアッセイについて記載されている手順を使用してＨ．ビレセンス（H. virescens）の幼虫の生存を観察した。

【0177】

ダイズのさやに外寄生させた後の死亡率を評価した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有するダイズのさやの上に置いた昆虫の死亡率はＭａｖｅｒｉｃｋ対照のさやの上に置いた昆虫よりも有意に高かった（ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）に関するダイズのさやのバイオアッセイについて死亡率５０％）。表１０。圃場で生長させたダイズのさやでのこのアッセイから得られた結果により、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に曝露させたヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）の幼虫では、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させたヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）の幼虫よりも有意に低い昆虫の生存（高い昆虫の死亡率としても説明される）が持続したことが示された。

【0178】

圃場において、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋ対照のダイズ植物の頂端部（２つ〜３つの増大している三出葉および未成熟のさやの集団を有する主茎の一番上の部分）にＨ．ビレセンス（H. virescens）の卵を外寄生させた。Ｈ．ビレセンス（H. virescens）の卵をおよそ２０個有するチーズクロスの切片を各反復小区画内でランダムに選択した５つの植物（全部で２０の植物を試験した）の頂端部に置き、プラスチックで覆った紙クリップを用いて定位置に保持した。布製のメッシュの袋を頂端部にかぶせ、メッシュの袋の開放端を主茎の周りでビニールタイを用いて固定した。メッシュの袋の代表的なセットにおいて卵の孵化を毎日モニターした。全ての卵が孵化した後に、５つの植物に取り付けた各メッシュの袋内で生きているＨ．ビレセンス（H. virescens）の幼虫の数を計数した。

【0179】

ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のダイズの頂端部の生きている昆虫の幼虫の平均数は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照の頂端部の昆虫よりも有意に低かった（ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）に関するダイズの頂端部のバイオアッセイについて０．００数の昆虫）。表１１。このアッセイから得られた結果により、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に曝露させたヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）の幼虫では、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させたヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）の幼虫よりも有意に少ない数の昆虫の生存が持続したことが示された。

【0180】

試験小区画内のネイティブなＰ．インクルデンス（P. includens）の幼虫の計数を週に１回、４週間にわたって行った。各小区画の中央の２つの作条から試料採取した。中央の２つの作条の間のランダムに選択した位置に９１ｃｍ×９１ｃｍの白い布を置いた。シートの一端に近接する作条の区分内の植物を布の上に曲げ、１５回振って、存在するあらゆる昆虫を取り出した。布の逆端にある作条についてこのプロセスを繰り返した。幼虫を種およびサイズごとに計数した。長さが６ｍｍ未満の幼虫を小さな幼虫として計数し、長さが６ｍｍ以上の幼虫を大きな幼虫として計数した。次の測定を行う前に布から全ての昆虫を除去した。布を中央の２つの作条の間の第２のランダムに選択した位置に移動させ、試料採取プロセスを繰り返し、これにより、各試料採取日に小区画当たり２つの副試料をもたらした。

【0181】

ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の１．８２ｍの作条にわたって計数された昆虫の平均数は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照の１．８２ｍの作条にわたって計数された昆虫の数よりも有意に低かった（シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）について０．００数の昆虫）。表１１。このアッセイから得られた結果により、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１へのシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）の外寄生は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させたシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）の外寄生よりも有意に少ないことが示された。

【0182】

これらの反復実験から得られた結果により、試験した全ての昆虫種について、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に曝露させた鱗翅目の幼虫では、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させた幼虫よりも有意に低い生存が持続したことが示された。したがって、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１はこの広い範囲の害虫に殺虫活性を有する。

【0183】

【表10】

【0184】

【表11】

【0185】

【表12】

【実施例7】

【0186】

ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の予測される配列
配列番号１４にダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の予測される配列が提供されている。この配列は、５’ゲノム隣接配列、ｐＤＡＢ９５８２の予測されるＴ鎖挿入断片および３’ゲノム隣接配列を含有する。配列番号１４に関して、残基１〜１２７３は５’ゲノム隣接配列であり、残基１２７４〜１３６５８はｐＤＡＢ９５８２Ｔ鎖挿入の残基であり、１３６５９〜１３８２１はｐＤＡＢ９５８２プラスミドからの再配置の残基であり、残基１３８２２〜１５１７０は３’隣接配列である。したがって挿入断片の５’末端に関して接合部配列または移行部は配列番号１４の残基１２７３〜１２７４に生じる。したがって挿入断片の３’末端に関して接合部配列または移行部は配列番号１４の残基１３６５８〜１３６５９に生じる。

【0187】

配列番号１４はダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の予測表示であり、配列番号１、配列番号２、およびｐＤＡＢ９５８２のｔ鎖のアラインメントから組み立てられたものであることに留意すべきである。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のＴ鎖挿入断片の実際の配列は配列番号１４からわずかに逸脱する可能性がある。Ｔ鎖挿入を植物細胞のゲノムに導入する形質転換プロセスの間に、挿入断片のいくつかの欠失または他の変更が起こることは珍しくない。さらに、ＰＣＲ増幅において、軽微な配列決定のエラーを生じる可能性があるエラーが起こり得る。例えば、本明細書において列挙されている隣接配列は、ダイズのゲノムＤＮＡからアンプリコンを生成し、次いでアンプリコンをクローニングし、配列決定することによって決定した。ゲノムＤＮＡから配列決定するために十分なアンプリコンを生成するために必要な多数回の増幅を考慮すると、このように生成し、決定した配列においてわずかな差異および軽微な不一致が見いだされることは珍しいことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定のエラーまたは不一致に起因して必要になる調整はいずれも本開示の範囲内であることを認識し、留意するべきである。したがって、本明細書において提供されるプラスミド配列の関連するセグメントは、いくつかの軽微な変動を含んでよい。したがって、本開示の挿入断片配列に対していくらかの範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は本開示の範囲内である。配列番号１４の配列に対する同一性とは、本明細書で例示または記載されている配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であってよい。隣接配列プラス挿入断片配列の配列は、寄託された種子を照会することで確認することができる。したがって、配列番号１４とダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の実際のＴ鎖挿入との間のいくつかの差異を同定することができる。

【0188】

本開示の原理が例示され、記載され、本開示は、そのような原理から逸脱することなく取り合わせおよび詳細を改変することができることが当業者には明らかであるはずである。我々は添付の特許請求の範囲の主旨および範囲内に入る全ての改変について特許請求する。

【0189】

本明細書において引用されている刊行物および公開特許文書は全て、個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、以下の態様を含む。
[１]
昆虫を昆虫抵抗性ダイズ植物に曝露させて、それにより昆虫を防除するステップを含む、昆虫を防除する方法であって、前記ダイズ植物が配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される配列を含むＤＮＡを含み、前記配列が、ダイズイベント９５８２．８１６．１５．１の存在に特徴的である、方法。
[２]
前記昆虫がシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）である、[１]に記載の方法。
[３]
前記昆虫がアンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ハッショウマメイモムシ）である、[１]に記載の方法。
[４]
前記昆虫がスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（ツマジロクサヨトウ）である、[１]に記載の方法。
[５]
前記昆虫がヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）（タバコバッドワーム）である、[１]に記載の方法。
[６]
ダイズ作物において雑草を防除する方法であって、グルホシネート除草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される配列を含むＤＮＡを含むダイズ植物を含み、前記配列がダイズイベント９５８２．８１６．１５．１の存在に特徴的である、方法。
[７]
配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む単離されたＤＮＡ配列。
[８]
ダイズ植物を育種する方法であって、
第１のダイズ植物と第２のダイズ植物を交雑させて第３のダイズ植物を作出するステップであり、前記第１のダイズ植物が配列番号１の１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むＤＮＡを含む、ステップと、前記第３のダイズ植物を、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列およびその相補物を含むＤＮＡの存在についてアッセイするステップとを含む方法。
[９]
配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される少なくとも１つの配列およびその相補物を含む接合部配列を含む単離されたＤＮＡ分子。
[１０]
シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）に対して抵抗性であり、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列およびその相補物を有するＤＮＡを含む、ダイズ植物またはその部位。
[１１]
[１０]に記載の植物の種子。
[１２]
ダイズミール、ダイズ粉、ダイズタンパク質濃縮物、およびダイズ油からなる群から選択される生産品である、[６]に記載のダイズ植物またはその部位に由来する組成物。
[１３]
ダイズの粒、種子、ミール、または粉において害虫を防除する方法であって、前記粒、種子、ミール、または粉が配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列およびその相補物を含むＤＮＡを含むことによって実証される、前記粒、種子、ミール、または粉にダイズイベント９５８２．８１６．１５．１を含めるステップを含む方法。
[１４]
ゲノム内に、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択されるＤＮＡ配列；ならびにその相補物を含むダイズ種子。
[１５]
[１４]に記載のダイズ種子から生長させたダイズ植物。
[１６]
花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉からなる群から選択され、前記ダイズイベント９５８２．８１６．１５．１を含む、[１５]に記載のダイズ植物の部位。
[１７]
ダイズミール、ダイズ粉（soybean flour）、およびダイズ油（soybean oil）からなる群から選択される生産品である、[１５]に記載のダイズ植物またはその部位に由来する組成物。
[１８]
配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含むトランスジェニックダイズ植物。
[１９]
ダイズイベント９５８２．８１６．１５．１を含むトランスジェニックダイズ植物またはその部位であって、代表的なダイズ種子がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−１２５８８の下で寄託されているダイズイベント９５８２．８１６．１５．１を含む、トランスジェニックダイズ植物またはその部位。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]