特許 6385988 グリコシル化された免疫グロブリンの調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6385988

(24)【登録日】2018年8月17日

(45)【発行日】2018年9月5日

(54)【発明の名称】グリコシル化された免疫グロブリンの調製方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/02 20060101AFI20180827BHJP

   C12N 5/16 20060101ALI20180827BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20180827BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20180827BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180827BHJP

【ＦＩ】

   C12P21/02 C

   C12N5/16

   C07K16/00

   C07K16/28

   C12N15/09 Z

【請求項の数】14

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2016-147229(P2016-147229)

(22)【出願日】2016年7月27日

(62)【分割の表示】特願2015-36676(P2015-36676)の分割

【原出願日】2010年10月25日

(65)【公開番号】特開2017-19799(P2017-19799A)

(43)【公開日】2017年1月26日

【審査請求日】2016年8月26日

(31)【優先権主張番号】09013455.2

(32)【優先日】2009年10月26日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(73)【特許権者】

【識別番号】000003311

【氏名又は名称】中外製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(72)【発明者】

【氏名】フランツェ，ラインハルト

(72)【発明者】

【氏名】平島 親

(72)【発明者】

【氏名】リンク，トマス

(72)【発明者】

【氏名】高木 良智

(72)【発明者】

【氏名】田熊 晋也

(72)【発明者】

【氏名】津田 祐理子

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５３３３６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第９２／０１９７５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５０７８２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−２９２５９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０２／００２７９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／１０４１８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０５−２２７９７０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ ２１／００−２１／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）免疫グロブリンをコードする核酸を含む真核細胞を、培地中の単位時間当たり利用できるグルコースの量が一定に維持され、かつ単位時間当たりその培地中でその細胞が最大限に利用できる量の８０％未満の一定値に制限された培地中で培養し、そして
ｂ）培養物から免疫グロブリンを回収する
ことを含み、
前記培養がフェドバッチ培養であり、
培地中に存在するグルコースの量がその培養に際して前設定した値以下に低下した時点で流加を開始する、
免疫グロブリンの調製方法。

【請求項2】

前記一定値が８０％未満であって１０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記一定値が５０％〜１０％であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記一定値が４５％〜２０％であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

前記一定値が８０％未満であって２０％を超えることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

培養がフェドバッチ培養であり、その際、流加を培養２日目または３日目に開始することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

培養をｐＨ６．５から７．５までのｐＨ値で行なうことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

培養をｐＨ６．９から７．３までのｐＨ値で行なうことを特徴とする、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

培養をｐＨ６．９５からｐＨ７．０５までのｐＨ値、またはｐＨ７．１５からｐＨ７．２５までのｐＨ値で行なうことを特徴とする、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

免疫グロブリンがクラスＧまたはクラスＥの免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

真核宿主細胞がＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、昆虫細胞、およびＳｐ２／０細胞を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

真核細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

宿主細胞の培養を６〜２０日間実施することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

免疫グロブリンが抗ＩＬ−６Ｒ抗体であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書には、細胞における免疫グロブリン調製の分野の方法であって、調製される免疫グロブリンのグリコシル化パターンを培養条件に基づいて改変できる方法を記述する。

【背景技術】

【0002】

近年、免疫グロブリンの生産は常に増加しており、近い将来に免疫グロブリンは各種疾患の処置に利用できる最大グループの療法薬となるであろうと思われる。免疫グロブリンの影響はそれらの特異性から生じる；それには、それらの特異的な標的認識および結合の機能、ならびに抗原／Ｆｃ受容体の結合と同時または結合後の特異的作用の活性化が含まれる。

【0003】

特異的な標的認識および結合は、免疫グロブリンの可変部により仲介される。作用が生じる他の免疫グロブリン分子部分は、翻訳後修飾、たとえばグリコシル化パターンである。翻訳後修飾は実際に、免疫グロブリンの有効性、安定性、免疫原力潜在性、結合などに対して影響をもつ。それに関連して、補体依存性細胞傷害性（complement-dependent cytotoxicity）（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞性細胞傷害性（antibody-dependent cellular cytotoxicity）（ＡＤＣＣ）、およびアポトーシス誘導に対処しなければならない。

【0004】

免疫グロブリンのグリコシル化パターン、すなわち結合した糖構造体の糖の組成および数が生物学的特性に強い影響をもつことが報告された(たとえば、Jefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16を参照)。哺乳動物細胞により産生される免疫グロブリンは２〜３質量％の炭水化物を含有する(Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-5557)。これは、たとえばクラスＧの免疫グロブリン（ＩｇＧ）において、マウス由来のＩｇＧにおける２．３個のオリゴ糖残基(Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394)、およびヒト由来のＩｇＧにおける２．８個のオリゴ糖残基と同等であり(Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457)、これらのうち一般に２個はＦｃ領域、残りは可変部に位置する(Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31)。

【0005】

クラスＧの免疫グロブリンのＦｃ領域において、オリゴ糖残基はアミノ酸残基２９７、すなわちアスパラギン残基（Ａｓｎ^２９７と表記される）にＮ−グリコシル化により導入される可能性がある。Youingsらは、ポリクローナルＩｇＧ分子の１５％〜２０％でＦｃ
領域にさらに他のＮ−グリコシル化部位が存在することを示した(Youings, A., et al., Biochem. J., 314 (1996) 621-630;たとえば、Endo, T., et al., Mol. Immunol. 32 (1995) 931-940も参照)。不均一な、すなわち非対称的なオリゴ糖プロセシングのため、異なるグリコシル化パターンをもつ多数のイソ形免疫グロブリンが存在する(Patel, T.P., et al., Biochem. J. 285 (1992) 839-845; Ip, C.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399; Lund, J., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748)。同時に、オリゴ糖の構造および分布は高度に再現性があり（すなわち、非ランダム）、かつ部位特異的である(Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292)。

【0006】

免疫グロブリンの幾つかの特性はＦｃ領域のグリコシル化に直接関連する(たとえば、Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292; Lund, J., et al., J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969; Lund, J., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Wright, A. and Morrison, S.L., J. Immunol. 160 (1998) 3393-3402を参照)；たとえば、熱安定性および溶解性(West, C.M., Mol. Cell. Biochem. 72 (1986) 3-20)、抗原性(Turco, S.J., Arch. Biochem. Biophys. 205 (1980) 330-339)、免疫原性(Bradshaw, J.P., et al., Biochim. Biophys. Acta 847 (1985) 344-351; Feizi, T. and Childs, R.A., Biochem. J. 245 (1987) 1-11; Schauer, R., Adv. Exp. Med. Biol. 228 (1988) 47-72)、クリアランス速度／循環半減期(Ashwell, G. and Harford, J., Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554; McFarlane, I.G., Clin. Sci. 64 (1983) 127-135; Baenziger, J.U., Am. J. Path. 121 (1985) 382-391; Chan, V.T. and Wolf, G., Biochem. J. 247 (1987) 53-62; Wright, A., et al., Glycobiology 10 (2000) 1347-1355; Rifai, A., et al., J. Exp. Med. 191 (2000) 2171-2182; Zukier, L.S., et al., Cancer Res. 58 (1998) 3905-3908)、ならびに特異的生物活性(Jefferis, R. and Lund, J., Antibody Engineering, ed. by Capra, J.D., Chem. Immunol. Basel, Karger, 65 (1997) 111-128)。

【0007】

グリコシル化パターンに影響を及ぼす要因が調べられた：たとえば、発酵培地中のウシ胎仔血清の存在(Gawlitzek, M., et al., J. Biotechnol. 42(2) (1995) 117-131)、緩衝作用条件(Muething, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334)、溶存酸素
濃度(Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31; Kunkel, J.P., et al., J. Biotechnol. 62 (1998) 55-71; Lin, A.A., et al., Biotechnol. Bioeng. 42 (1993)
339-350)、オリゴ糖の位置およびコンホメーション、ならびに宿主細胞タイプおよび細
胞増殖状態(Hahn, T.J. and Goochee, C.F., J. Biol. Chem. 267 (1992) 23982-23987; Jenkins, N., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 975-981)、細胞のヌクレオチド−糖代謝(Hills, A.E., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 239-251)、栄養素制限(Gawlitzek, M., et al., Biotechnol. Bioeng. 46 (1995) 536-544; Hayter, P.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 39 (1992) 327-335)、特にグルコース制限(Tachibana, H., et al., Cytotechnology 16 (1994) 151-157)、ならびに細胞外ｐＨ(Borys, M.C., et al., Bio/Technology 11 (1993) 720-724)。

【0008】

たとえばＮＳ０骨髄腫細胞における免疫グロブリンの組換え発現により、オリゴマンノース構造体およびトランケート型オリゴ糖構造体の増加が観察された(Ip, C.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399; Robinson, D.K., et al., Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735)。グルコース飢餓条件下で、グリコシル化の変動、たとえばより小さな前駆オリゴ糖の結合またはオリゴ糖部分の完全な不存在が、ＣＨＯ細胞、ネズミ３Ｔ３細胞、ラット肝癌細胞、ラット腎細胞およびネズミ骨髄腫細胞において観察された(Rearick, J.I., et al., J. Biol. Chem. 256 (1981) 6255-6261; Davidson, S.K. and Hunt, L.A., J. Gen. Virol. 66 (1985) 1457-1468; Gershman, H. and Robbins, P.W., J. Biol. Chem. 256 (1981) 7774-7780; Baumann, H. and Jahreis, G.P., J. Biol. Chem. 258 (1983) 3942-3949; Strube, K.-H., et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 3762-3771; Stark, N.J. and Heath, E.C., Arch. Biochem. Biophys. 192 (1979) 599-609)。低グルタミン／グルコース濃度に基づく方法がWong, D.C.F., et al., Biotechnol. Bioeng. 89 (2005) 164-177により報告された。

【0009】

日本国特許出願JP 62-258252には哺乳動物細胞の潅流培養が記述され、一方、US 5,443,968にはタンパク質分泌細胞のフェドバッチ（fed-batch）培養法（流加培養法）が報告されている。WO 98/41611には、低い乳酸産生を特徴とする代謝状態に細胞を適応させるのに有効な細胞培養法が報告されている。物質を産生させるために細胞を培養する方法がWO 2004/048556に報告されている。Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534には、グルコースの不存在下でインキュベートした哺乳動物細胞はマンノース−９含有構造体の代わりにマンノース−５含有構造体をタンパク質へ伝達することが報告されている。ｐＣＯ２の依存性は、グルコース制限に際してＣＨＯ細胞の増殖、代謝およびＩｇＧ産生に影響を及ぼすことがTakuma, S., et al. in Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1479-1488により報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】JP 62-258252

【特許文献2】US 5,443,968

【特許文献3】WO 98/41611

【特許文献4】WO 2004/048556

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Jefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16

【非特許文献2】Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-5557

【非特許文献3】Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394

【非特許文献4】Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457

【非特許文献5】Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31

【非特許文献6】Youings, A., et al., Biochem. J., 314 (1996) 621-630

【非特許文献7】Endo, T., et al., Mol. Immunol. 32 (1995) 931-940

【非特許文献8】Patel, T.P., et al., Biochem. J. 285 (1992) 839-845

【非特許文献9】Ip, C.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399

【非特許文献10】Lund, J., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748

【非特許文献11】Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292

【非特許文献12】Lund, J., et al., J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969

【非特許文献13】Lund, J., FASEB J. 9 (1995) 115-119

【非特許文献14】Wright, A. and Morrison, S.L., J. Immunol. 160 (1998) 3393-3402

【非特許文献15】West, C.M., Mol. Cell. Biochem. 72 (1986) 3-20

【非特許文献16】Turco, S.J., Arch. Biochem. Biophys. 205 (1980) 330-339

【非特許文献17】Bradshaw, J.P., et al., Biochim. Biophys. Acta 847 (1985) 344-351

【非特許文献18】Feizi, T. and Childs, R.A., Biochem. J. 245 (1987) 1-11

【非特許文献19】Schauer, R., Adv. Exp. Med. Biol. 228 (1988) 47-72

【非特許文献20】Ashwell, G. and Harford, J., Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554

【非特許文献21】McFarlane, I.G., Clin. Sci. 64 (1983) 127-135

【非特許文献22】Baenziger, J.U., Am. J. Path. 121 (1985) 382-391

【非特許文献23】Chan, V.T. and Wolf, G., Biochem. J. 247 (1987) 53-62

【非特許文献24】Wright, A., et al., Glycobiology 10 (2000) 1347-1355

【非特許文献25】Rifai, A., et al., J. Exp. Med. 191 (2000) 2171-2182

【非特許文献26】Zukier, L.S., et al., Cancer Res. 58 (1998) 3905-3908

【非特許文献27】Jefferis, R. and Lund, J., Antibody Engineering, ed. by Capra, J.D., Chem. Immunol. Basel, Karger, 65 (1997) 111-128

【非特許文献28】Gawlitzek, M., et al., J. Biotechnol. 42(2) (1995) 117-131

【非特許文献29】Muething, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334

【非特許文献30】Kunkel, J.P., et al., J. Biotechnol. 62 (1998) 55-71

【非特許文献31】Lin, A.A., et al., Biotechnol. Bioeng. 42 (1993) 339-350

【非特許文献32】Hahn, T.J. and Goochee, C.F., J. Biol. Chem. 267 (1992) 23982-23987

【非特許文献33】Jenkins, N., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 975-981

【非特許文献34】Hills, A.E., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 239-251

【非特許文献35】Gawlitzek, M., et al., Biotechnol. Bioeng. 46 (1995) 536-544

【非特許文献36】Hayter, P.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 39 (1992) 327-335

【非特許文献37】Tachibana, H., et al., Cytotechnology 16 (1994) 151-157

【非特許文献38】Borys, M.C., et al., Bio/Technology 11 (1993) 720-724

【非特許文献39】Robinson, D.K., et al., Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735

【非特許文献40】Rearick, J.I., et al., J. Biol. Chem. 256 (1981) 6255-6261

【非特許文献41】Davidson, S.K. and Hunt, L.A., J. Gen. Virol. 66 (1985) 1457-1468

【非特許文献42】Gershman, H. and Robbins, P.W., J. Biol. Chem. 256 (1981) 7774-7780

【非特許文献43】Baumann, H. and Jahreis, G.P., J. Biol. Chem. 258 (1983) 3942-3949

【非特許文献44】Strube, K.-H., et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 3762-3771

【非特許文献45】Stark, N.J. and Heath, E.C., Arch. Biochem. Biophys. 192 (1979) 599-609

【非特許文献46】Wong, D.C.F., et al., Biotechnol. Bioeng. 89 (2005) 164-177

【非特許文献47】Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534

【非特許文献48】Takuma, S., et al. in Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1479-1488

【発明の概要】

【0012】

真核細胞が産生するポリペプチドのグリコシル化パターンにおけるマンノース−５糖構造体の量を、培養プロセスで細胞に流加するグルコースの量に基づいて改変できることが見出された。利用できるグルコースの量を減らすことによって、たとえばＤＧＬ値を１．０からより小さな、たとえば０．８、０．６、０．５、０．４または０．２の値に変化させることによって、グリコシル化パターンにおけるマンノース−５糖構造体の量の改変を達成できる。ＤＧＬ値またはそれぞれ単位時間当たり利用できるグルコースの量を、一定にかつ単位時間当たり規定した低い値に維持しなければならない。

【0013】

本明細書に記述する第一観点は、真核細胞においてポリペプチド（一態様においては免疫グロブリン）を調製するための下記の工程を含む方法である：
ａ）ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を用意し、
ｂ）グルコース制限度（degree of glucose limitation）（ＤＧＬ）が一定に維持され、かつＤＧＬが０．８未満である条件下で、その細胞を培養し、そして
ｃ）培養物からポリペプチドを回収する；
その際、マンノース−５糖構造体を含むポリペプチドの画分は、マンノース−５糖構造体を含むポリペプチドの量、ポリペプチドＧ（０）イソ型の量、ポリペプチドＧ（１）イソ型の量、およびポリペプチドＧ（２）イソ型の量を含めた合計の１０％以下である。

【0014】

一態様において、ＤＧＬを０．８から０．２までの範囲で一定に維持する。さらに他の態様において、ＤＧＬを０．６から０．４までの範囲で一定に維持する。他の態様において、マンノース−５糖構造体を含むポリペプチドの画分は、マンノース−５糖構造体を含むポリペプチド、ポリペプチドＧ（０）イソ型、ポリペプチドＧ（１）イソ型、およびポリペプチドＧ（２）イソ型を含めた合計の８％以下である。さらに他の態様においてポリペプチドは免疫グロブリンであり、一態様においてクラスＧまたはＥの免疫グロブリンである。

【0015】

本明細書に記述する他の観点は、免疫グロブリンを調製するための下記の工程を含む方
法である：
ａ）免疫グロブリンをコードする核酸を含む哺乳動物細胞を用意し、
ｂ）培地中の単位時間当たり利用できるグルコースの量が一定に維持され、かつ単位時間当たりその培地中でその細胞が最大限に利用できる量の８０％未満に制限された培地中で、前記の真核細胞を培養し、そして
ｃ）細胞または培地から免疫グロブリンを回収する。

【0016】

一態様において、培地中の単位時間当たり利用できるグルコースの量は一定に維持され、かつ８０％から２０％までの範囲の値に制限される。さらに他の態様において、この範囲は６０％から４０％までである。他の態様において、培地中の細胞はその培地中で生存可能な細胞である。

【0017】

本明細書に記述する観点の一態様において、真核細胞はＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、昆虫細胞、またはＳｐ２／０細胞から選択される。一態様において、真核細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。本明細書に記述する観点の他の態様において、培養は約ｐＨ７．０から約ｐＨ７．２までの範囲のｐＨ値で行なわれる。

【0018】

本明細書に記述する観点のさらに他の態様において、培養は連続培養またはフェドバッチ培養である。本方法は、他の態様において、ポリペプチドを精製する最終工程を含むことができる。さらに他の態様において、細胞を６〜２０日間、または６〜１５日間、培養する。さらに他の態様において、細胞を６〜８日間培養する。

【0019】

本明細書に記述する他の観点は免疫グロブリンを含む組成物であり、その際、組成物は本明細書に記述する方法で調製されたものである。
一態様において、免疫グロブリンは抗ＩＬ−６Ｒ抗体である。さらに他の態様において、抗ＩＬ−６Ｒ抗体はトシリズマブ（Tocilizumab）を含む。他の態様において、抗ＩＬ−６Ｒ抗体に結合したマンノース−５糖構造体は８％以下である。さらに他の態様において、マンノース−５糖構造体は６％以下である。他の態様において、マンノース−５糖構造体は４％以下である。さらに他の態様において、抗ＩＬ−６Ｒ抗体に結合したＧ（０）糖構造体は４０％から４６％までの範囲であり、抗ＩＬ−６Ｒ抗体に結合したＧ（２）糖構造体は９％から１１％までの範囲である。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、ＤＧＬ制御を用いたフェドバッチ方式における生細胞密度（ａ）および細胞生存率プロフィール（ｂ）である；中空丸：初発細胞密度８×１０^５細胞／ｍｌ；中実三角：初発細胞密度１０×１０^５細胞／ｍｌ；中空四角：初発細胞密度１２×１０^５細胞／ｍｌ。

【図2】図２は、免疫グロブリン産生におけるフェドバッチ方式でのＤＧＬの経時的変化である；丸：初発細胞密度８×１０^５細胞／ｍｌ；三角：初発細胞密度１０×１０^５細胞／ｍｌ；四角：初発細胞密度１２×１０^５細胞／ｍｌ。

【図3】図３は、免疫グロブリン産生におけるフェドバッチ方式によるＤＧＬに基づく流加培地の流加プロフィールである；丸：初発細胞密度８×１０^５細胞／ｍｌ；三角：初発細胞密度１０×１０^５細胞／ｍｌ；四角：初発細胞密度１２×１０^５細胞／ｍｌ

【図4】図４は、ＤＧＬ制御でのフェドバッチ方式による免疫グロブリン産生プロフィールである；中空丸：初発細胞密度８×１０^５細胞／ｍｌ；中実三角：初発細胞密度１０×１０^５細胞／ｍｌ；中空四角：初発細胞密度１２×１０^５細胞／ｍｌ；中実小丸：一定流加法：ＦＲ＝０．０２ｇグルコース／時間（対照）。

【図5】図５は、細胞のフェドバッチ培養に際してのＤＧＬの時間経過である：菱形：単一流加培地流加で毎日流加，四角：二種流加培地流加で毎日流加；三角：単一流加培地流加でプロフィール流加；Ｘ：二種流加培地流加でプロフィール流加。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本明細書には下記の工程を含む、免疫グロブリンの調製方法を記述する：
ａ）免疫グロブリンをコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、０．８未満の一定のＤＧＬ（すなわち、単位時間当たり利用できるグルコースの量が一定であり、かつ単位時間当たりその細胞が最大限に利用できるグルコースの量の８０％以下である）の培地中で培養し、そして
ｂ）細胞または培地から免疫グロブリンを回収する。

【0022】

本明細書に記述する方法で免疫グロブリンを得ることができ、その際、マンノース−５糖構造体を含む免疫グロブリンの量は調整したＤＧＬ値に依存し、その量はマンノース−５糖構造体を含む免疫グロブリンの量、および免疫グロブリンＧ（０）イソ型の量、および免疫グロブリンＧ（１）イソ型の量、および免疫グロブリンＧ（２）イソ型の量の合計のうちの画分である。一態様において、ＤＧＬは０．８から０．２までである。この態様において、画分は１０％以下である。他の態様において、ＤＧＬは０．６から０．４までである。この態様において、画分は６％以下である。本明細書に記述する方法で、マンノース−５糖構造体をもつ免疫グロブリンの画分が、マンノース−５糖構造体を含む免疫グロブリンの量、免疫グロブリンＧ（０）イソ型の量、免疫グロブリンＧ（１）イソ型の量、および免疫グロブリンＧ（２）イソ型の量を含む合計の１０％以下である免疫グロブリンを得ることができる。他の態様において、画分は液体クロマトグラフィー法で測定した面積％画分である。一態様において、ＤＧＬは０．８から０．２までの範囲に維持される。他の態様において、ＤＧＬは０．６から０．２までの範囲に維持される。さらに他の態様において、ＤＧＬは０．６から０．４までの範囲に維持される。一態様において、単位時間当たり細胞が最大限に利用できるグルコースの量は、すべての化合物が過剰にある（すなわち、細胞の増殖を制限する化合物がない）培養に際して利用されるグルコースの平均量であり、少なくとも５回の培養に基づいて決定される。一態様において、この画分は培養７日目に測定される。

【0023】

本発明を実施するのに有用な、当業者に既知の方法および技術は、たとえば下記に記載されている：Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes
I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Glover, N.D. (ed.), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985); Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture (1986); Miller, J.H. and Calos, M.P. (eds.), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1987); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, N.Y., W.H. Freeman and Co (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones, N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J. (ed.), Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, Second Edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)。

【0024】

組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチドの多数の誘導体を製造することができる。そのような誘導体は、たとえば個々のまたは数個のアミノ酸位置において、置換、変更または交換により修飾されたものであってもよい。誘導体化は、たとえば部位特異的変異誘発により実施できる。そのようなバリエーションは当業者が容易に実施できる(Sambrook, J.,
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA (2001); Hames, B.D. and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England)。

【0025】

用語“核酸”は、天然に存在するか、または一部もしくは全体が天然に存在しない核酸分子であって、ポリペプチドをコードするものを表わす。核酸は、単離されるかあるいは化学的手段で合成できるＤＮＡフラグメントの構築体（build up）であってもよい。核酸は、たとえば発現プラスミドにおいて、または真核細胞のゲノム／染色体において、他の核酸に組み込むことができる。用語“プラスミド”には、シャトルプラスミドおよび発現プラスミドが含まれる。一般にプラスミドは、それぞれ原核細胞におけるプラスミドの複製および選択のための複製起点（たとえば、ＣｏｌＥ１複製起点）および選択マーカー（たとえば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性遺伝子）を含めた、原核細胞増殖ユニットをも含むであろう。当業者には、たとえばポリペプチドのアミノ酸配列を、各アミノ酸配列をコードする対応する核酸に変換するための手順および方法が周知である。したがって核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によっても、またそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列によっても特徴付けられる。

【0026】

用語“発現カセット”は、少なくとも含まれる構造遺伝子が細胞において発現し、場合により細胞から分泌されるのに必要なエレメント、たとえばプロモーター、ポリアデニル化部位、ならびに３’側および５’側−非翻訳領域を含む核酸を表わす。

【0027】

用語“遺伝子”は、たとえば染色体上またはプラスミド上のセグメントであって、ポリペプチドの発現に必要なものを表わす。遺伝子は、コード領域のほかに、プロモーター、イントロン、および１以上の転写ターミネーターを含めた、他の機能性エレメントを含む。“構造遺伝子”は、遺伝子のシグナル配列を含まないコード領域を表わす。

【0028】

用語“発現”は、細胞内での構造遺伝子の転写および翻訳を表わす。細胞内での構造遺伝子の転写のレベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量に基づいて測定できる。たとえば、選択した核酸から転写されるｍＲＮＡは、ＰＣＲにより、またはノーザンハイブリダイゼーションにより定量できる(たとえば、Sambrook et al. (前掲)を参照)。核酸によりコードされるポリペプチドは、種々の方法により定量できる；たとえば、ＥＬＩＳＡによるか、そのポリペプチドの生物活性の測定によるか、またはそのような活性とは無関係な方法、たとえばウェスタンブロット法もしくはラジオイムノアッセイの使用、そのポリペプチドを認識してそれに結合する抗体の使用による(たとえば、Sambrook et al. (前掲)を参照)。

【0029】

用語“細胞”は、ポリペプチドをコードする核酸（一態様においては異種ポリペプチド）が導入された細胞を表わす。用語“細胞”は、プラスミド／ベクターの増殖のために用いる原核細胞と、構造遺伝子の発現のために用いる真核細胞の両方を含む。一態様において、免疫グロブリンの発現のための真核細胞は哺乳動物細胞である。他の態様において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、およびハイブリドーマ細胞から選択される。真核細胞はさらに昆虫細胞、たとえば毛虫の細胞（ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）、ｓｆ細胞）、ショウジョウバエの細胞（キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））、蚊の細胞（ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、セスジヤブカ（ヒトスジシマカ）（Aedes albopictus））、およびカイコの細胞（カイコガ（Bombyx Mori））などから選択できる。

【0030】

用語“ポリペプチド”は、自然界または合成のいずれで生成したかにかかわらず、ペプチド結合により連結したアミノ酸残基のポリマーを表わす。約２０アミノ酸残基未満のポリペプチドを“ペプチド”と呼ぶことができる。１００アミノ酸残基を超えるポリペプチド、または１より多いポリペプチドを含む共有結合および非共有結合した凝集物を“タンパク質”と呼ぶことができる。ポリペプチドは非アミノ酸成分、たとえば炭水化物基を含
む場合がある。非アミノ酸成分はそのポリペプチドを産生する細胞によってポリペプチドに付加される可能性があり、細胞のタイプに応じて異なる可能性がある。本明細書中でポリペプチドはそれらのアミノ酸配列によりＮ末端からＣ末端方向に規定される。それらへの炭水化物基などの付加物は一般に明記されないが、それにもかかわらず存在する可能性がある。

【0031】

用語“異種ＤＮＡ”または“異種ポリペプチド”は、その細胞内に自然界では存在しないＤＮＡ分子もしくはポリペプチドまたはＤＮＡ分子の集団もしくはポリペプチドの集団を表わす。細胞種に由来するＤＮＡ（すなわち内在性ＤＮＡ）が宿主のものではないＤＮＡ（すなわち外来ＤＮＡ）と結合するならば、特定の細胞にとって異種であるＤＮＡ分子はその細胞種に由来するＤＮＡを含む可能性がある。たとえば、細胞のものではないＤＮＡセグメント（たとえば、ポリペプチドをコードするもの）が細胞のＤＮＡセグメント（たとえば、プロモーターを含む）に作動可能な状態で連結したものを含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子とみなすことができる。同様に、異種ＤＮＡ分子は外来プロモーターに作動可能な状態で連結した内在性構造遺伝子を含むことができる。異種ＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドは“異種”ポリペプチドである。

【0032】

用語“発現プラスミド”は、発現させるべきポリペプチドをコードする少なくとも１つの構造遺伝子を含む核酸を表わす。一般に、発現プラスミドは下記のものを含む；原核細胞プラスミド増殖ユニット：これには、複製起点、および選択マーカー、たとえば大腸菌（E. coli）については真核細胞選択マーカーが含まれる；ならびに目的とする構造遺伝
子（単数または複数）の発現のための１以上の発現カセット：これらはそれぞれ、プロモーター、少なくとも１つの構造遺伝子、および転写ターミネーター（ポリアデニル化シグナルを含む）を含む。遺伝子発現は通常はプロモーターの制御下に置かれ、そのような構造遺伝子はプロモーターに“作動可能な状態で連結”しているべきである。同様に、調節エレメントとコアプロモーターは、その調節エレメントがそのコアプロモーターの活性を調節するならば、作動可能な状態で連結している。

【0033】

用語“単離されたポリペプチド”は、付随する細胞成分、たとえばそのポリペプチドと共有結合していない炭水化物、脂質、または他のタンパク性もしくは非タンパク性の不純物を本質的に含まないポリペプチドを表わす。一般に、単離されたポリペプチドの調製物は、ある態様においてはそのポリペプチドを高純度形態で、すなわち少なくとも約８０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、９５％を超える純度、または９９％を超える純度で含有する。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含有することを示すための１方法は、調製物のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ｐａｇｅ）およびそのゲルのクーマシーブリリアントブルー染色の後に単一バンドが出現することによる。しかし、用語“単離された”は、同じポリペプチドが別の物理的形態、たとえば二量体で、または別のグリコシル化もしくは誘導体化形態で存在するのを除外しない。

【0034】

免疫グロブリンは一般に５つの異なるクラスに配属される：ＩｇＡ（クラスＡの免疫グロブリン）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ。これらのクラス間で、免疫グロブリンはそれらの全体的構造および／またはアミノ酸配列が異なるが、同じ構築ブロックをもつ。完全な免疫グロブリンは２対のポリペプチド鎖から構成される：それぞれ、免疫グロブリン軽ポリペプチド鎖（短い：軽鎖）および免疫グロブリン重ポリペプチド鎖（短い：重鎖）を含む。これらの鎖は可変部と定常部を含む。軽鎖においては両領域とも１ドメインからなり、これに対し重鎖においては可変部は１ドメインからなり、定常部は最高５つのドメインからなる（Ｎ末端からＣ末端方向へ）：Ｃ_Ｈ１ドメイン、場合によりヒンジ部ドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメイン、Ｃ_Ｈ３ドメイン、および場合によりＣ_Ｈ４ドメイン。免疫グロブリンはＦａｂ領域とＦｃ領域に分けることができる。軽鎖全体、重鎖可変ドメイン、
およびＣ_Ｈ１ドメインをＦａｂ領域（フラグメント抗原結合領域）と呼ぶ。Ｆｃ領域は、Ｃ_Ｈ２ドメイン、Ｃ_Ｈ３ドメイン、および場合によりＣ_Ｈ４ドメインを含む。

【0035】

本明細書中で用いる用語“免疫グロブリン”は、１以上のポリペプチドからなるタンパク質を表わす。エンコーディング免疫グロブリン遺伝子は、種々の定常部遺伝子および無数の免疫グロブリン可変部遺伝子を含む。“免疫グロブリン”には、一態様において、モノクローナル抗体、およびそのフラグメント、たとえば単離された重鎖、または重鎖定常部、ならびに融合ポリペプチドであって少なくとも免疫グロブリン重鎖Ｃ_Ｈ２ドメインを含むものが含まれる。本明細書に記述する方法の一態様において免疫グロブリンは完全な免疫グロブリンであり、他の態様において免疫グロブリンは完全な免疫グロブリンのＦｃ領域である。他の態様において、免疫グロブリンは免疫グロブリン、または免疫グロブリンフラグメント、または免疫グロブリンコンジュゲートである。

【0036】

用語“免疫グロブリンフラグメント”は、少なくとも免疫グロブリン デルタ、イプシロンもしくはアルファ重鎖のＣ_Ｈ２ドメイン、および／または免疫グロブリン イプシロンもしくはデルタ重鎖のＣ_Ｈ３ドメインを含む、ポリペプチドを表わす。その誘導体およびバリアントであって、Ｃ_Ｈ２ドメインまたはＣ_Ｈ３ドメイン中のＮ−グリコシル化モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒが変化していないものも包含される。

【0037】

用語“免疫グロブリンコンジュゲート”は、少なくとも免疫グロブリン デルタ、イプシロンもしくはアルファ重鎖のＣ_Ｈ２ドメインおよび／または免疫グロブリン イプシロンもしくはデルタ重鎖のＣ_Ｈ３ドメインが、非免疫グロブリンポリペプチドに融合したものを含むポリペプチドを表わす。それらにおいて、Ｃ_Ｈ２ドメインまたはＣ_Ｈ３ドメイン中のＮ−グリコシル化モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒは変化していない。

【0038】

免疫グロブリン重鎖のＣ_Ｈ２ドメインのＡｓｎ^２９７（ＩｇＧ、ＩｇＥ）もしくはＡｓｎ^２６３（ＩｇＡ）に、および／またはＣ_Ｈ３ドメインのＡｓｎ^３９４、Ａｓｎ^４４５、またはＡｓｎ^４９６（ＩｇＥ、ＩｇＤ）に結合したオリゴ糖は、二分岐（biantennary）
構造をもつ(Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394)、すなわちそれらはコア構造
Man(α1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc→Asn
からなり、末端ＧｌｃＮＡｃ残基に任意選択的Ｆｕｃ（α１−６）結合をもつ。このコア構造の末端マンノースに次式をもつ２つの外側アームが結合している：
Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-6)→Man、および
Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-3)→Man
これらにおいて末端ガラクトース残基は任意選択的である（Ｍａｎ＝マンノース、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコース、Ｇａｌ＝ガラクトース；Ｆｕｃ＝フコース）。

【0039】

【表1】

【0040】

用語“免疫グロブリンＧ（０）イソ型の量、免疫グロブリンＧ（１）イソ型の量、および免疫グロブリンＧ（２）イソ型の量”は、免疫グロブリンのアスパラギン（Ａｓｎ）にＮ−結合した種々の異種二分岐オリゴ糖の量の合計を表わす。Ｇ（２）イソ型はオリゴ糖構造体の外側アームそれぞれに末端ガラクトース残基をもち、Ｇ（１）イソ型は（α１−６）または（α１−３）結合した外側アームのいずれかのみにガラクトース残基を保有し、Ｇ（０）イソ型は両方の外側アームにガラクトース残基を保有しない。

【0041】

用語“マンノース−５糖構造体”は、ポリペプチドのＡｓｎ残基に連結して、５つのマンノース残基および２つのＮ−アセチルグルコースコア残基を含むかあるいはそれらからなる三分岐（triantennary）構造を形成した、オリゴマンノース構造体を表わす。

【0042】

本明細書に記述する１観点は、下記の工程を含む免疫グロブリンの調製方法である：
ａ）免疫グロブリンをコードする１以上の核酸を含む真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞を、培地中の単位時間当たり利用できるグルコースの量が一定に維持され、かつ単位時間当たりその培地中でその細胞が最大限に利用できる量の８０％未満の値に制限された培地中で培養し、そして
ｂ）細胞または培地から免疫グロブリンを回収し、これにより免疫グロブリンを調製する。

【0043】

この方法で、マンノース−糖５構造体を含む免疫グロブリンを最大で１０％含む免疫グロブリンが得られる。この１０％は、マンノース−５糖構造体を含む免疫グロブリンの量、免疫グロブリンＧ（０）イソ型の量、免疫グロブリンＧ（１）イソ型の量、および免疫グロブリンＧ（２）イソ型の量の合計に基づいて計算される。

【0044】

用語“グルコース制限度”とそれの略号“ＤＧＬ”は、本明細書中で互換性をもって使用でき、培養物中の単一細胞の現時点のグルコース比消費速度−対−その単一細胞または同じ種類の単一細胞の既知の最大グルコース比消費速度の比を表わす。グルコース制限度は下記のとおり定義される：

【0045】

【数1】

【0046】

ここで、
ｑＧｌｃ＝単一細胞の現時点のグルコース比消費速度；
ｑＧｌｃ_ｍａｘ＝その単一細胞または同じ種類の単一細胞について既知の最大グルコース比消費速度。

【0047】

ＤＧＬはＤＧＬ_{ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ}と１の間で変動させることができ、ここでＤＧＬ_{ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ}（＜１および＞０）は完全な増殖制限を表わし、１は無制限または完全なグルコース過剰を表わす。

【0048】

ポリペプチド、たとえば免疫グロブリンへの糖構造体の導入は翻訳後修飾である。各細胞のグリコシル化操作は不完全であるため、発現した各ポリペプチドは、種々の糖構造体を含むグリコシル化パターンで得られる。したがって、ポリペプチドはそれを発現する細胞から、同一ポリペプチド、すなわち同一アミノ酸配列をもつものの、異なるグリコシル化形態を含む組成物の形態で得られる。個々の糖構造体の合計はグリコシル化パターンとして表わされ、これには糖構造体を全く含まないポリペプチド、異なるプロセシングを受
けた糖構造体および／または異なる組成の糖構造体を含むポリペプチドが含まれる。

【0049】

糖構造体のひとつはマンノース−５糖構造体（高マンノース、Ｍａｎ５、Ｍ５、またはオリゴ−マンノースとも表記される）である。培養時間の長期化に伴って、またはグルコース飢餓状態で、マンノース−５糖構造体を含む組換え産生されたポリペプチドの画分が増加すると報告されている(Robinson, D.K., et al., Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735; Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534)。

【0050】

真核細胞が産生するポリペプチドのグリコシル化パターンにおけるマンノース−５糖構造体の量を、培養プロセスで細胞に流加するグルコースの量に基づいて改変できることが見出された。グルコースの量を減らすことによって、すなわちＤＧＬ値を１．０からより小さな、たとえば０．８、０．６、０．５、０．４または０．２の値に変化させることによって、グリコシル化パターンにおけるマンノース−５糖構造体の量の改変を達成できることが見出された。一態様において、ＤＧＬ値は０．８から０．２まで、または０．６から０．４までの範囲内の値で一定に維持される。すなわち、ポリペプチド、一態様において免疫グロブリンの調製は、グリコシル化パターンにおいて規定量のマンノース−５糖構造体を含むポリペプチドを得るために、培養細胞が利用できるグルコースの量を制限した条件下で実施できる。細胞が（一態様においては、対数増殖している細胞が）単位時間当たり最大限に利用できるグルコースの量の８０％以下の量のグルコースを単位時間当たり利用できる（すなわち、０．８以下のＤＧＬをもつ）培養により、１．０のＤＧＬをもつ培養と比較してマンノース−５糖構造体の量が変化したグリコシル化パターンをもつポリペプチドが得られることが見出された。一態様において、細胞密度は生細胞密度である。さらに、得られるポリペプチド収率が増大する。

【0051】

用語“細胞が単位時間当たり最大限に利用できるグルコースの量”は、単一細胞が最適増殖条件下で対数増殖期に何ら栄養素制限のない培養において単位時間当たり最大限に消費または利用または代謝できるグルコースの量を表わす。したがって、細胞が単位時間当たり最大限に利用できるグルコースの量は、何ら栄養素制限のない培養において細胞が最適増殖条件下で対数増殖期に単位時間当たり代謝するグルコースの量を測定することにより決定できる。利用できるグルコースの量をそれ以上増加させても、細胞が単位時間当たり最大限に利用できるグルコースの量はそれ以上は増加しない、すなわち変化しないであろう。この量が単一細胞の最大グルコース消費レベルを規定する。これは、遺伝子修飾した形の細胞がよりいっそう高い最大グルコース消費レベルをもつ可能性がないことを意味するものではない。あるいは、細胞が単位時間当たり最大限に利用できるグルコースの量は、これまでの培養およびモニターされたデータに基づいて決定できる。

【0052】

本明細書に記述する方法は、測定および制御のための努力が最小限に抑えられることに関連して特に実施するのが簡単であり、特に経済的である。
限定ではないが、たとえば栄養素供給が不十分であると、培養細胞は不経済な状態で増殖して栄養素を最大速度で消費する。消費される培地栄養素のひとつはグルコースであり、これは培養細胞が細胞の代謝のためのエネルギーおよび構築ブロックを産生するために代謝する。過剰のグルコースの存在下では、細胞の代謝はグルコースについて最大の代謝回転速度で進行している。細胞が単位時間当たり最大限に利用できるグルコースの量は、たとえば、制限されたグルコースでの、すなわちその細胞が単位時間当たり利用できる量より少ないグルコース量での培養にも用いられる同じ培養条件を用いてまたは同じ培養条件下で培養された、過剰のグルコースの存在下で対数増殖している細胞のグルコース消費量から決定できる。この最大量は、固定した時間範囲の最初と最後の細胞密度およびグルコース濃度を測定することによって、容易に計算できる。この値は、普通は０．００６から１９０ｍｍｏｌ／時間／１０^９細胞までの範囲にある(Baker, K.N., et al., Biotechnol. Bioeng. 73 (2001) 188-202; WO 98/41611; Muething, J., et al., Biotechnol. Bi
oeng. 83 (2003) 321-334; WO 2004/048556)。一態様において、標準的なプロセス条件下にｐＨ７．０で、ｑＧｌｃ_ｍａｘは約０．１４２ｍｍｏｌ／時間／１０^９細胞である。

【0053】

本明細書に記述する方法は、一態様において、単位時間当たり利用できるグルコースの量が一定に、かつ単位時間当たりその細胞が最大限に利用できるグルコースの量の８０％以下（０．８≧ＤＧＬ＞０）に維持される条件下で実施され、一態様においては利用できるグルコースの量は一定に、かつ６０％以下（０．６≧ＤＧＬ＞０）に、他の態様においては５０％以下（０．５≧ＤＧＬ＞０）に、さらに他の態様においては約４０％に維持される。本出願で用いる用語“約”は、その数値が厳密な数値ではなく、それはある範囲の中央点にすぎないことを表わし、その際、その数値は最大１０％変動できる；すなわち、用語“約４０％”は４４％から３６％までの範囲（ＤＧＬ＝０．４４〜０．３６）を表わす。

【0054】

一態様において、培養は、単位時間当たりその細胞が最大限に利用できるグルコースの量の８０％〜１０％の範囲で一定に維持される量のグルコースを単位時間当たり利用できる状態で行なわれる（０．８≧ＤＧＬ≧０．１）。他の態様において、利用できるグルコースの量は６０％〜１０％の範囲で一定に維持される（０．６≧ＤＧＬ≧０．１）。さらに他の態様において、利用できるグルコースの量は５０％〜１０％の範囲で一定に維持される（０．５≧ＤＧＬ≧０．１）。他の態様において、利用できるグルコースの量は４５％〜２０％の範囲で一定に維持される（０．４５≧ＤＧＬ≧０．２）。同様に、ある態様において、利用できるグルコースの量は８０％〜６０％の範囲で一定に維持される（０．８≧ＤＧＬ≧０．６）。

【0055】

一態様において本方法は、ＤＧＬが一定に約０．４の値に維持される条件下で細胞を培養する工程を含み、これによれば培養は１．０〜０．５のＤＧＬで開始され、ＤＧＬを約０．４の値に低下させ、その後はこのＤＧＬを一定に維持することを含む。一態様において、ＤＧＬの低下は１００時間以内の期間である。用語“ＤＧＬを一定に維持する”および文法的にそれの均等物は、そのＤＧＬ値がある期間維持されること、すなわちＤＧＬ値の変動がその数値の１０％以内であることを表わす（たとえば、図２を参照）。

【0056】

免疫グロブリンは、産生後に、直接または細胞を破壊した後に回収される。回収された免疫グロブリンは、一態様において、当業者に既知の方法で精製される。タンパク質精製のために種々の方法が十分に確立され、広く使用されている；たとえば、微生物タンパク質によるアフィニティークロマトグラフィー（たとえば、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（たとえば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）および混合型交換）、チオ親和性（thiophilic）吸着（たとえば、ベータ−メルカプトエタノールその他のＳＨリガンドによる）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（たとえば、フェニル−セファロース、アザ−アレン親和性（aza-arenophiliｃ）樹脂、またはｍ−アミノフェニルボロン酸による）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（たとえば、Ｎｉ（ＩＩ）−およびＣｕ（ＩＩ）−アフィニティー材料による）、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法（たとえば、ゲル電気泳動、毛細管電気泳動）(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。

【0057】

たとえば、免疫グロブリンの精製法は一般に多工程クロマトグラフィー部分を含む。第１工程で、たとえば、プロテインＡまたはプロテインＧによるアフィニティークロマトグラフィーにより、免疫グロブリンではないポリペプチドを免疫グロブリン画分から分離する。その後、たとえばイオン交換クロマトグラフィーを実施して、個々のクラスの免疫グロブリンを分離し、かつ第１カラムから共溶出した痕跡量のプロテインＡを除去する。最後に、クロマトグラフィー工程を用いて免疫グロブリン単量体を同じクラスの多量体およ
びフラグメントから分離する。

【0058】

一般的なクロマトグラフィー法およびそれらの使用は当業者に既知である。たとえば下記を参照：Heftmann, E. (ed.), Chromatography, 5^th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Deyl, Z. (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Poole, C. F. and Poole, S. K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001);またはAusubel, F. M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1990)。

【0059】

一態様において、回収した免疫グロブリンを、集団の量、すなわちマンノース−５糖構造体を含む免疫グロブリン、免疫グロブリンＧ（０）イソ型、免疫グロブリンＧ（１）イソ型、および免疫グロブリンＧ（２）イソ型の量の合計に対する、マンノース−５糖構造体を含む免疫グロブリンの量により特性分析する。本明細書に記述する方法によれば、マンノース−５糖構造体を含む免疫グロブリンの量は集団の１０％以下であり、他の態様においては集団の８％以下であり、さらに他の態様においては集団の６％以下である。

【0060】

本明細書に記述する方法は、ある態様において、連続培養として、フェドバッチ培養として、またはその組合わせとして、たとえばフェドバッチ培養として開始した後に連続培養に切り換えて、実施できる。さらに、本明細書に記述する方法は種々の様式で実施できる。たとえば一態様においては、ＤＧＬ値が１．０未満の条件下で、すなわちたとえば利用できるグルコースの量が単位時間当たりその細胞がその培養で最大限に利用できるグルコースの量の８０％以下である条件下で培養する前に、過剰のグルコース、すなわちＤＧＬ値が１．０の状態で培養する。他の態様において、たとえば前規定した細胞密度（たとえば、一態様において１０^５細胞／ｍｌ）を得るために、標準培地に含有される量のグルコース、たとえば１〜１０ｇ／ｌ（培地）で培養を開始する。さらに他の態様において、培養の開始を過剰量のグルコースの存在下で、すなわち１．０のＤＧＬで行ない、そして単位時間当たりある量のグルコースを添加する；これは単位時間当たりその細胞がその培養で最大限に利用できるグルコースの量の８０％以下である。他の態様においては、培地中に存在するグルコースの量がその培養に際して前設定した値以下に低下した時点で流加を開始する。最後の２例では、培養に際して利用できるグルコースの量は培養における細胞の代謝によって減少する。

【0061】

一態様において、本明細書に記述する方法では単位時間当たり利用できるグルコースの量または添加するグルコースの量（最大限に利用できるグルコースの量より少ない）を同じ値に、すなわち一定に維持する。たとえば、単位時間当たり最大限に利用できるグルコースの量の５０％の量を利用できるように制御する場合、この制御量（ＤＧＬ値に基づく）はグルコース制限流加を実施しているすべての期間に適用される。ただし、この数値は生細胞の絶対密度に依存した相対値であるので、生細胞密度が培養中に変化する（すなわち、それは初期に増加し、最大に達し、その後、再び低下する）のに伴って、利用できるグルコースの絶対量は変化する。相対値は一定に（すなわち、たとえば８０％に）維持されるけれども絶対基準値が変化する（すなわち、生細胞密度が増大する）ので、相対的な絶対値も変化する（すなわち、増加する数値の８０％も増加する）。

【0062】

用語“単位時間当たり”は、固定した時間範囲、たとえば１分、１時間、６時間、１２時間、または２４時間を表わす。一態様において、単位時間は１２時間または２４時間で
ある。本出願で用いる用語“単位時間当たり利用できるグルコースの量”は、下記のものの合計を表わす：１）固定した時間範囲の開始時の培養の培地中に含有されるグルコースの量、および２）その単位時間中に添加した、すなわち流加したグルコースの量。したがって、ある量のグルコースを細胞培養培地に、たとえば培養容器に添加すると、これは固定した時間範囲の開始時の培地中のグルコースの量を前決定量まで増加させる。この量のグルコースは、固体として、水に溶解して、緩衝液に溶解して、または栄養培地に溶解して添加することができ、その際、水および緩衝液はグルコースを含有すべきではない。添加されるグルコースの量は、利用できるグルコースの量から培養容器内の培地中に存在するグルコースの量を差し引いたものに相当する。この量のグルコースを添加するプロセスは、前記の単位時間中に１回添加として、少量の等分の多数回添加として、または連続添加として実施できる。

【0063】

本明細書に記述する方法はいかなる種類の培養にも、またいかなる培養規模にも適切である。たとえば、一態様において、この方法は連続法またはフェドバッチ法に用いられる；他の態様において培養容量は１００ｍｌから５０，０００ｌまでであり、他の態様においては１００ｌから１０，０００ｌまでである。本明細書に記述する方法は、マンノース−５糖構造体をもつ免疫グロブリンが１０％以下、または８％以下、または６％以下である免疫グロブリンの調製に有用である。一態様において、免疫グロブリンは免疫グロブリンＧまたはＥである。本明細書に記述する方法は真核細胞を含み、この細胞は免疫グロブリンの重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸、および免疫グロブリンの軽鎖またはそのフラグメントをコードする核酸を含む。真核細胞は、一態様においてＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＢＨＫ細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＨＥＫ細胞、および昆虫細胞から選択される。

【0064】

当業者はグルコースの量のほか、種々の細胞が最適増殖のために要求する培地の組成および成分ならびに栄養素濃度を周知しており、その細胞の培養に適切な培地を選択するであろう(たとえば、Mather, J.P., et al., Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Vol. 2 (1999) 777-785を参照)。

【0065】

一態様において、本明細書に記述する方法に従った培養に際して細胞が利用できるはずのグルコースの量は、培養容器内において特定の培養時点でその容量の培養容器および最大限に利用できるグルコースの量で普通に達成できる生細胞密度に、単位時間当たりの対数増殖中の細胞数、および意図するＤＧＬを掛けることにより計算される。より詳細には、その実際の時点以前の培養中のグルコース濃度の経過および培養中の細胞密度の経過から、将来のグルコース濃度および細胞密度の経過を推定する。この推定を用いて、意図するＤＧＬを達成するために添加しなければならないグルコースの量を、次式により計算する：
(グルコース添加量[グルコースpg/ml/時間])＝
(現時点の細胞密度[細胞/ml])×(細胞の最大グルコース消費速度[グルコースpg/細胞/時
間])×(DGL値)−培養容器内の培地中に存在するグルコースの量
一態様において、培養のｐＨ値はｐＨ６．５〜ｐＨ７．８である。他の態様において、ｐＨ値はｐＨ６．９〜ｐＨ７．３である。さらに態様において、ｐＨ値はｐＨ７．０〜７．２である。実施例１に概説するように、一定流加法で制限グルコース流加とｐＨ値７．０を組み合わせると、ｐＨ値７．２と比較してＭ５含量を規定値、すなわち８％未満に効率的に調節できることが見出された。それぞれ７．０または７．２のｐＨ値でフェドバッチ法での培養に際して、ＤＧＬ制御法を用いるとＭ５含量を５．５％未満に調節できることが見出された。培養のｐＨ値を低下させるとＤＧＬ値の低下によるＭ５量の増加に対抗できることが見出された。

【0066】

培養は、一態様において２７℃〜３９℃で、他の態様において３５℃〜３７．５℃で実
施される。
本明細書に記述する方法では、糖構造体を含むいずれかのポリペプチド、たとえば免疫グロブリン、インターフェロン、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、プラスミノーゲンアクチベーター、エリスロポエチンなどを調製できる。

【0067】

本明細書に記述する方法における培養は、哺乳動物細胞培養のためのいずれかの撹拌式または振とう式装置、たとえば発酵槽タイプのタンク培養装置、エアリフト（air lift）タイプの培養装置、培養フラスコタイプの培養装置、スピナーフラスコタイプの培養装置、マイクロキャリヤータイプの培養装置、流動床タイプの培養装置、中空繊維タイプの培養装置、ローラーボトルタイプの培養装置、または充填床タイプの培養装置を用いて実施できる。

【0068】

本明細書に記述する方法は、一態様において最高１５日間実施される。他の態様において、培養は６〜１５日間行なわれる。一態様において、免疫グロブリンは抗ＩＬ−６Ｒ抗体である。

【0069】

本明細書に記述する方法を、たとえばEP 0 409 607、EP 0 628 639、US 5,670,373、またはUS 5,795,965（本明細書にそれらの全体を援用する）に記述されたヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体について例示する；この抗体およびそれを発現する細胞系は本発明の時点で我々の実験室において十分な量で入手できたからである。これは本発明の範囲を限定するものではない。

【0070】

以下の実施例および図面は本発明の理解を補助するために示すものであり、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に示される。ここに示す方法において本発明の精神から逸脱することなく改変をなしうることを理解すべきである。

【実施例】

【0071】

材料および方法
細胞系：
組換え産生される免疫グロブリンのマンノース−５糖構造体の量を改変できるＣＨＯ細胞系の例は、EP 0 409 607およびUS 5,795,965による抗ＩＬ−６Ｒ抗体をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞系である。この組換えＣＨＯ細胞の培養のためには、本発明の方法によるグルコース補給を実施できる限り、いかなる培地も使用できる。培地の例はＩＭＤＭ、ＤＭＥＭもしくはＨａｍのＦ１２培地、またはその組合わせであり、それらを培地成分とグルコースの質量比が受け継がれるように本明細書に記述する方法に適合させた。培地からグルコースを排除し、それを別個に培養に添加することもできる。

【0072】

培養：
抗ＩＬ−６Ｒ抗体を発現するＣＨＯ細胞を１ｌまたは２ｌの発酵容器で培養した。流加培地は１５〜４０ｇ／ｌのグルコースを含有していた。グルコースは、たとえば４００ｇ／ｌのグルコースを含有する別個の濃厚溶液で流加することができた。ｐＨ７．０から７．２までの範囲のｐＨ値で培養を実施した。

【0073】

糖構造体の決定：
ＩｇＧグリコシル化パターンの分析のために、Kondoらによる方法(Kondo, A., et al.,
Agric. Biol. Chem. 54 (1990) 2169-2170)を用いた。ＩｇＧを、培地の遠心上清から小規模プロテインＡカラムを用いて精製した。精製ＩｇＧのオリゴ糖をＮ−グリコシダーゼＦ(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)により放出させ、還元末端を２−アミ
ノピリジンで標識した。標識したオリゴ糖を逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。質量分析およびオリゴ糖の標準品の両方により、各ピークの帰属を判定した。

【0074】

グルコースの測定：
YSI 2700 SELECT（商標）分析計(YSI, Yellow Springs, OH, USA)を用い、製造業者の
マニュアルに従った方法でグルコース濃度を測定した。

【0075】

生細胞密度の測定：
自動イメージプロセシングおよび分析システム(CEDEX（登録商標）; Innovatis, Germany)、ならびにトリパンブルー色素排除法を用いて、生細胞密度を測定した。

【0076】

実施例１
ＤＧＬ制御およびｐＨが抗体産生およびマンノース−５糖構造体（Ｍ５）含量に及ぼす影響
ヒト化した抗ＩＬ−６受容体抗体（トシリズマブ(Tocilizumab）, RoACTEMRA（登録商
標）)を産生するＣＨＯ細胞株を用いて試験を実施した；これは、日本国公開特許公報第99902/1996の参考例２に記載された方法に従い、国際特許出願公開No. WO 92/19759 (US 5,795,965、US 5,817,790、およびUS 7,479,543に対応する)の例１０に記述されたヒト伸
長因子Ｉαプロモーターを用いて調製された。

【0077】

定速流加法で、ｐＨ制御が免疫グロブリン産生に及ぼす影響を観察した。表２は、定速流加法でｐＨ制御が抗体オリゴ糖産生およびＭ５含量に及ぼす影響を示す。

【0078】

【表2】

【0079】

ｐＨ７．０では、マンノース−５糖構造体（Ｍ５）の量は５．５％未満に調節された。ＤＧＬ値は細胞密度の変化のため０．８０から０．２１まで低下した。他方、ｐＨ７．２ではＭ５の量は８．７％と２５．２％の間で変動し、ｐＨ７．０の場合より高かった。ｐＨ７．２におけるＤＧＬ値は０．７３から０．２５までの範囲であった。さらに、この場合、ｐＨ７．２での免疫グロブリン産生は１２０％を超えた（ｐＨ７．０に比較した相対値）。定速流加法で免疫グロブリン産生がより高いと、より高い８％を超えるＭ５含量が誘導される。したがって、定速流加法でｐＨ７．０に制御して、ｐＨ７．２に制御した方法と比較してＭ５含量をより低い値、すなわち８％未満に効率的に調節できた。

【0080】

種々のｐＨでのフェドバッチ方式による免疫グロブリン産生のために、ＤＧＬ制御法（＝一定相対量流加法）も採用し、Ｍ５含量を分析した。表３は、流加開始後２〜３日目のＤＧＬ制御およびｐＨが免疫グロブリン産生およびＭ５含量に及ぼす影響を示す。

【0081】

【表3】

【0082】

ｐＨ７．０において、０．２から０．８までの範囲のＤＧＬでＤＧＬ制御法を適用した。その結果、Ｍ５含量は４．０％以下に調節された。他方、ｐＨ７．２ではＤＧＬ値を０．４から０．６までの範囲で操作した。この場合、Ｍ５含量を５．５％未満に制御できた。

【0083】

実施例２
種々のＤＧＬ値での培養
抗ＩＬ−６Ｒ抗体をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞の培養を種々のＤＧＬ値で実施した。結果を下記の表４にまとめる。

【0084】

【表4】

【0085】

定速流加法と比較して、ＤＧＬ値０．４〜０．６での制御ＤＧＬ法はマンノース−５含量の低下を示す。
実施例３
種々の流加法での培養
抗ＩＬ−６Ｒ抗体をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞の培養を１種類のＤＧＬ値で、ただし種々の流加法を用いて実施した。結果を下記の表５にまとめる。

【0086】

【表5】

【0087】

単一流加培地流加実験では、すべての栄養素およびグルコースを含有する単一の流加物を用いた。二種培地流加実験では、すべての栄養素およびグルコースを含有する２種類の流加物を用いた：第１流加物はすべての栄養素および１５ｇ／ｌの低濃度のグルコースを含有し、第２流加物は高濃度のグルコースを含有する。これらの種々の流加実験を、一方の設定では流加速度を毎日調整して実施し、他方の設定では以前の培養における生細胞密度変化記録計に基づく前決定プロフィールに従って実施した。表５から分かるように、生存率および生細胞密度は採用した流加法とは無関係に類似する。

【0088】

実施例４
フェドバッチ方式による免疫グロブリン調製のためのグルコース制限度（ＤＧＬ）制御
ＣＨＯ細胞（８．０〜１２×１０^５細胞／ｍｌ）を前記の無血清培地に接種した。細胞を３７℃、９８％相対湿度、および１０％ ＣＯ_２の雰囲気で増殖させた。フェドバッチ培養で、主発酵槽へ培養開始から２日目または３日目に流加するように、グルコースを含有する培地の流加を開始した。流加法はグルコース制限度（ＤＧＬ）を制御するための米国特許出願公開公報 US 2006/0127975 A1による方法に従った。ＤＧＬは、観察されたグ
ルコース比消費速度−対−これらの細胞が自由にグルコースを利用できる場合の既知の最大グルコース比消費速度の比として定義できる（ＤＧＬ＝Ｑ（ｇｌｃ）／Ｑ（ｇｌｃ）_ｍａｘ，ここで、Ｑ（ｇｌｃ）＝現時点で観察されたグルコース比消費速度；Ｑ（ｇｌｃ）_ｍａｘ＝これらの細胞についての既知の最大グルコース比消費速度）。

【0089】

図１は、この培養の生細胞密度および細胞生存率プロフィールを示す。図２に示すように、種々の細胞密度でＤＧＬを０．４〜０．５の値になるように制御した。その時点の細胞密度に応じて流加速度を１日１回または２回変化させた。図３は、フェドバッチ方式によるＤＧＬに基づく流加プロフィールを示す。細胞密度に応じて流加速度を０．８〜１．６ｍｌ／時間で変化させた。この流加法を適用して、図４に示す免疫グロブリン産生プロフィールが得られた。表６に示すように１０×１０^５細胞／ｍｌおよび１２×１０^５細胞／ｍｌの接種サイズを用いると、７日目に免疫グロブリン産生はほぼ同じであり、一定流加法（グルコース０．０２ｇ／時間の流加速度）での免疫グロブリン産生の１２０％を超えた。初期細胞密度の差２０％にもかかわらず、ＤＧＬ制御法ではほぼ同等の免疫グロブリン力価を得ることができた。さらに、接種サイズを８．０×１０^５細胞／ｍｌに設定した場合、流加開始点の２０時間の遅れにもかかわらず、得られた免疫グロブリンは７日目に１１０％（相対値）を超えた。これらの結果において、ＤＧＬ制御法は種々の接種サイズで安定な免疫グロブリン産生を達成できた。

【0090】

実施例５
ＤＧＬ制御がオリゴ糖のマンノース−５糖構造体およびガラクトシル化に及ぼす影響
ＤＧＬ制御を用いるフェドバッチ培養により産生された免疫グロブリンについて、グリ
コシル化パターンを分析した。表６は、ＤＧＬ制御フェドバッチ培養から得られた免疫グロブリンについてのオリゴ糖分析の結果を、一定流加法（流加速度：グルコース０．０２ｇ／時間）と比較して示す。８．０×１０^５細胞／ｍｌの接種サイズでは、マンノース−５糖構造体（Ｍ５）の含量は２．８％であった。１０×１０^５細胞／ｍｌおよび１２×１０^５細胞／ｍｌの接種サイズでは、Ｍ５含量はそれぞれ４．１％および３．８％であった。すべての培養条件で、ＤＧＬ制御法はＭ５含量を５．０％未満に調節できた。

【0091】

一方、各条件で、免疫グロブリンＧ（０）イソ型および免疫グロブリンＧ（２）イソ型は、それぞれ４０％から４６％まで、および９．０％から１１％までの範囲で制御された。

【0092】

【表6】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】