特許 6386448 ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現する組換えアデノウィルス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6386448

(24)【登録日】2018年8月17日

(45)【発行日】2018年9月5日

(54)【発明の名称】ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現する組換えアデノウィルス

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/00 20060101AFI20180827BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20180827BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20180827BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20180827BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20180827BHJP

   C07K 14/56 20060101ALN20180827BHJP

   C07K 14/57 20060101ALN20180827BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20180827BHJP

【ＦＩ】

   C12N7/00ZNA

   C12N15/861 Z

   A61K35/76

   A61K48/00

   A61P31/12 171

   !C07K14/56

   !C07K14/57

   !C07K7/08

【請求項の数】5

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2015-514906(P2015-514906)

(86)(22)【出願日】2013年5月31日

(65)【公表番号】特表2015-523858(P2015-523858A)

(43)【公表日】2015年8月20日

(86)【国際出願番号】KR2013004784

(87)【国際公開番号】WO2013180501

(87)【国際公開日】20131205

【審査請求日】2016年5月24日

(31)【優先権主張番号】10-2012-0058410

(32)【優先日】2012年5月31日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】514304865

【氏名又は名称】大韓民国（マネージメント：ミニストリー オブ アグリカルチャー、フード アンド ルーラル アフェアーズ、アニマル アンド プラント クァランティン エージェンシー）

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ （ＭＡＮＡＧＥＭＥＮＴ ＭＩＮＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ， ＦＯＯＤ ＡＮＤ ＲＵＲＡＬ ＡＦＦＡＩＲＳ， ＡＮＩＭＡＬ ＡＮＤ ＰＬＡＮＴ ＱＵＡＲＡＮＴＩＮＥ ＡＧＥＮＣＹ）

(74)【代理人】

【識別番号】100132230

【弁理士】

【氏名又は名称】佐々木 一也

(74)【代理人】

【識別番号】100082739

【弁理士】

【氏名又は名称】成瀬 勝夫

(74)【代理人】

【識別番号】100087343

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 智廣

(74)【代理人】

【識別番号】100198269

【弁理士】

【氏名又は名称】久本 秀治

(72)【発明者】

【氏名】キム ス ミ

(72)【発明者】

【氏名】パク ジョン ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】リー クァン ニョン

(72)【発明者】

【氏名】コー ヨウン ジョン

(72)【発明者】

【氏名】リー ヒャン シム

(72)【発明者】

【氏名】シン ユン キュン

(72)【発明者】

【氏名】キム ビョウン ハン

【審査官】 飯室 里美

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０２６９３７２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０５９４６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００２／０８７３３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Biologicals，２０１０年 ９月，vol. 38, issue. 5，page. 586-593

【文献】 Gene Therapy, 2001, Vol.8, p.864-873

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ７／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ブタインターフェロンアルファ遺伝子、配列番号１の塩基配列を有する口蹄疫ウィルス２Ａ遺伝子、及びブタインターフェロンガンマ遺伝子の順に配列された、配列番号２の塩基配列を含むことを特徴とする組換えアデノウィルス。

【請求項2】

前記ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマ遺伝子を同時に発現することを特徴とする請求項１に記載の組換えアデノウィルス。

【請求項3】

前記組換えアデノウィルスは、アデノウィルスベクターであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の組換えアデノウィルス。

【請求項4】

前記組換えアデノウィルスは、口蹄疫ウィルスを抑制することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の組換えアデノウィルス。

【請求項5】

請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えアデノウィルスを含む口蹄疫ウィルス抑制剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、口蹄疫ウィルスの抑制効果を示す組換えウィルスに係り、さらに詳しくは、口蹄疫２Ａ遺伝子の挿入を通じてブタインターフェロンアルファ及びインターフェロンガンマを同時に発現させてブタインターフェロンアルファ及びガンマを一括処理して口蹄疫ウィルスに対する抑制効果を増強させることのできる組換えアデノウィルスに関する。

【背景技術】

【0002】

口蹄疫（Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ；ＦＭＤ）は、蹄が二つに分かれた動物に感染されるウィルス水疱性疾病であり、速い複製及び速い伝播力が特徴である。この疾病は、その経済的な重要性により、国際獣疫事務局（ＯＩＥ）によりリストＡ（Ｌｉｓｔ Ａ）疾病として分類されており、畜産物の国家間交易において非常に重要な要素として働いている。病原体は一本鎖の両極性ＲＮＡウィルスであり、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）及びアフトウイルス（Ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）属に属し、７つの異なる血清型（Ａ、Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３）に分類されている。

【0003】

口蹄疫は、突発時に防御対策として用いられている緊急ワクチンを豚に接種した場合（緊急ワクチン接種）、平均７日後に口蹄疫ウィルス感染に対する防御能が形成される（Ｊ．Ｓ．Ｓａｌｔ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｖａｃｃｉｎｅ １６：７４６−７５４）。しかしながら、豚の場合、ワクチンによる抗体形成が遅く、排出するウィルス量が牛よりも遥かに多い。なお、豚は、感染後２４時間以内にウィルスを呼吸器に排出するため、ワクチンの接種後から防御能の形成前までウィルスの伝播の危険性は一層高くなる。

【0004】

このため、これに対する対備策として、口蹄疫ウィルス抑制剤が提示されている。中でも、組換えアデノウィルスを伝達システムとして用いたインターフェロンアルファを含むタイプＩインターフェロンを適用して口蹄疫ウィルスを効果的に防御した研究結果が報告されて以来（Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５：５４９８−５５０３）、インターフェロンガンマを発現する組換えアデノウィルスをインターフェロンアルファ発現アデノウィルスと混用して向上した抑制効果を確認した（Ｍａｒａｅｓ ＭＰ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：７１２４−７１３５）。インターフェロンアルファは、最も広く知られている直接的なウィルス抑制物質であり、インターフェロンガンマは、補助Ｔ細胞（Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ）及びナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）においてサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の分泌を誘導する役割を果たしてウィルスに対する直間接的な抑制効果を示す。このようにインターフェロンアルファ及びガンマを併用することから様々な免疫誘導に有利であるメリットがあるにも関わらず、インターフェロンガンマの抗ウィルス効果がアルファよりも相対的に低いため単に混用する場合に抑制効率が下がるという欠点がある。

【0005】

一方、口蹄疫ウィルス２Ａシーケンスは、口蹄疫ウィルス遺伝子内において自己開裂（ｓｅｌｆ ｃｌｅａｖａｇｅ）が起こる部分であり、遺伝子内に挿入した場合に遺伝子転写後に自己開裂を引き起こして２つのタンパク質の発現を可能にする。２Ａシーケンスは、同じ役割を果たす配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）シーケンスよりも遺伝子が小さいだけではなく、遺伝子が開裂されて２つのタンパク質となる効率が約９倍ほど高いという研究結果が報告されている（ＳＨ Ｈａ ｅｔ ａｌ， ２０１０， Ｐｌａｎｔ ｂｉｏｔｅｃｈ， ８：９２８−９３８）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

そこで、本発明者らは、現在、動物への適用に最適であり、抑制効果に対する可能性が高いインターフェロンを用いてより安価に且つ手軽にウィルスを動物においてより効果的に抑制することのできる抑制剤を開発して提示しようとしており、口蹄疫２Ａシーケンスを挿入することにより、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現すると、これらのインターフェロンを一括で処理する効果があり、より効率よく口蹄疫ウィルス抑制効果が得られるということを見出し、本発明を完成するに至った。

【0007】

したがって、本発明の目的は、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現することのできる組換えウィルスを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

前記目的を達成するために、本発明は、ブタインターフェロンアルファ、口蹄疫ウィルス２Ａ及びブタインターフェロンガンマ遺伝子の順に配列された、配列番号２の塩基配列を含む組換えアデノウィルスまたはプラスミドを提供する。

【発明の効果】

【0009】

本発明の組換えアデノウィルスは、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現することができて、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを一括で処理することができ、且つ、これらのそれぞれのインターフェロンを単独でまたは組み合わせて使用するときよりもさらに経済的であり、簡単に使用することができ、より効率的であり、しかも、高いレベルの口蹄疫ウィルス抑制効果を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、ブタインターフェロンアルファ及びガンマを同時に発現する組換えアデノウィルスの産生のためのデザイン戦略を示す図である。

【図2】図２は、組換えアデノウィルスにおけるブタインターフェロンアルファ及びガンマの発現をウェスターンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）により確認した写真である。

【図3】図３は、組換えアデノウィルス力価別の口蹄疫ウィルスの抑制度を比較したグラフである。

【図4】図４は、ブタインターフェロンアルファ及びガンマを同時に発現する組換えアデノウィルスの方がそれぞれを単独で発現する組換えアデノウィルスよりもマウスにおける口蹄疫ウィルス抑制効果が増強されていることを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明は、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマの遺伝子を一つの遺伝子に挿入し、口蹄疫２Ａシーケンスを前記インターフェロン遺伝子の間に挿入して２種類のインターフェロンが同時に発現されるように講じられた組換えウィルスを提供し、特に、ウィルスベクターとしてアデノウィルスベクターが使用可能である。

【0012】

また、本発明は、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマの遺伝子を一つの遺伝子に挿入し、口蹄疫２Ａシーケンスを前記インターフェロン遺伝子の間に挿入して２種類のインターフェロンが同時に発現されるように講じられたタンパク質発現ベクターを提供し、特に、タンパク質発現ベクターとしてプラスミドが使用可能である。

【0013】

本発明の組換えウィルスまたはプラスミドは、ブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマを同時に発現することから、インターフェロンを単独でまたは組み合わせて使用するときよりもさらに経済的であり、簡単に使用することができ、より効率的に口蹄疫ウィルスを抑制することができる。

【0014】

また、本発明は、上記の組換えウィルスまたはプラスミドを含む口蹄疫ウィルス抑制剤を提供する。本発明の組換えウィルスは、同じ力価を適用するときに、インターフェロンアルファ及びガンマをそれぞれ別々に発現する組換えウィルスを利用する場合と比較して遥かに高い口蹄疫ウィルス抑制効果を示す。この理由から、本発明の組換えウィルスは、一つのウィルスで２種類の効果を出すことが可能であり、小さな力価で同じ効果を提供することができて、効能が増大された新規な口蹄疫抑制剤として利用することができる。また、インターフェロンアルファ及びガンマをそれぞれ別々に発現する組換えウィルスを用いる場合よりも半分の組換えウィルス力価を使用するので、２倍の経済的な費用節減性及び簡便性を図ることができ、しかも、高力価のウィルス接種により起こる副作用を低減することができる。さらに、インターフェロンの広範な抗ウィルス効果を考慮したとき、種々のウィルス疾病に適用可能であると予想される。

【0015】

以下、本発明を下記の実施例を挙げてより具体的に説明する。これらの実施例は本発明の内容を理解するために提示されるものであり、本発明の権利範囲がこれらの実施例に限定されることはなく、当業界において通常的に知られている変形、置換及び挿入などを行うことができ、これに対するものも本発明の範囲に含まれる。

【実施例】

【0016】

［実施例１］ 組換えアデノウィルスの製作
ＣＭＶプロモータの後ろにブタインターフェロンアルファ及びブタインターフェロンガンマシーケンスを挿入し、両遺伝子の間に口蹄疫ウィルス２Ａ遺伝子を入れて同時に発現させ、これについては、図１に例示されている。

【0017】

より具体的に、ブタインターフェロンアルファ遺伝子は、Ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈａ １であり、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ｎｏ．ＮＭ＿２１４３９３の遺伝情報を採用し、ブタインターフェロンガンマ遺伝子はＧｅｎｅｂａｎｋ ｎｏ．ＡＹ２９３７３３の遺伝情報を採用した。なお、配列番号１に示す口蹄疫ウィルス２Ａシーケンス（ＣＡＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣ：配列番号１）を二つのブタインターフェロン遺伝子の間に配置して配列番号２に示す遺伝子を（株）Ｂｉｏｎｅｅｒにおいて合成した。このとき、合成遺伝子配列の５’末端にはＮｈｅＩ制限酵素部位を、３’末端にはＸｂａＩ制限酵素部位を入れてクローニング可能なようにし、インターフェロンアルファ部分の終止コドンは除去し、インターフェロンガンマの３’末端に終止コドンを配置した。なお、インターフェロン遺伝子部分の豚における効果的なタンパク質の発現のためにコドン出現頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）の評価を行った。

【0018】

＜ブタインターフェロンアルファ及びガンマを同時に発現するための遺伝子配列（両端にＮｈｅＩ、ＸｂａＩ制限酵素配列を含む；配列番号２）＞
ＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣＡＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＧＡＣＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＴＧＡＧＧＣＴＴＴＣＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＧＧＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＴＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＧＡＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＴＧＡＧＣＴＡＣＡＣＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＡＧＣＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＣＴＡＡＡＧＧＡＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＧＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＣＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＡＧＡＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＴＴＡＡＣＧＧＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＣＧＣＡＡＡＧＣＧＡＴＣＡＧＣＧＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＣＡＣＧＴＴＣＴＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡ

【0019】

組換えアデノウィルスの製作のために、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（クローンテック社製）にＮｈｅＩ、ＸｂａＩ制限酵素部分を介して遺伝子クローニングを行った後、遺伝子分析（シーケンシング）を通じて確認した。次いで、このクローニングされたｐＳｈｕｔｔｌｅベクタープラスミドを、非常に稀に存在するＰＩ−ＳｃｅＩ及びＩ−Ｃｅｕに対する制限酵素サイトをＰＩ−ＳｃｅＩ及びＩ−Ｃｅｕを用いて切断し、線形化された目的遺伝子断片をＡｄｅｎｏ−Ｘ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ（ＰＩ−ＳｃｅＩ及びＩ−Ｃｅｕ前処理）に結さつ（ライゲーション）した。次いで、制限酵素Ｓｗａ Ｉで処理して未挿入の自己連結（セルフライゲーション）や非組換えアデノウィルスＤＮＡを除去した。次いで、形質転換（トランスフォーメーション）及び遺伝子プレップを行った組み換えられたプラスミド（発現しようとする遺伝子がアデノウィルスＤＮＡと組み換えられる）を選択した。確認された遺伝子をＰａｃ Ｉ酵素で処理して線形化させた後、２９３ Ａ細胞に形質感染（トランスフェクション）させた。細胞において８０％以上の細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ；ＣＰＥ）が見られると、組換えアデノウィルスを収穫した。産生されたアデノウィルスは、Ｖｉｒａｂｉｎｄ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（セルバイオラブス社製）を用いてウィルスのみを精製した後、力価（ＴＣＩＤ₅₀）を測定して保管した。

【0020】

［実施例２］ ブタインターフェロンアルファまたはガンマの発現確認
組換えアデノウィルスにおけるブタインターフェロンアルファ及びガンマの発現有無を確認するためにウェスターンブロット方法を利用した。ウェスターンブロットを行う前日にＩＢＲＳ−２（豚腎臓細胞）を準備して７５ｃｍ²のフラスコに敷き、翌日に９０％の細胞断層が形成されれば、新たな培地に希釈した約１×１０⁸ＴＣＩＤのアデノウィルスをそれぞれ接種した。接種４８時間後に培地を回収してＡｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ（ミリポア社製）を用いて濃縮した後にウェスターンブロットに供した。タンパク質発現の比較のために、ブタインターフェロンアルファを発現するアデノウィルス（Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α）、ブタインターフェロンガンマを発現するアデノウィルス（Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γ）、ブタインターフェロンアルファ及びガンマを同時に発現するアデノウィルス（Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-αγ）を一緒に実験した。ブタインターフェロンアルファの確認のために抗ＩＦＮアルファ単一クローン抗体Ｋ９（サーモサイエンティフィック社製）を５００倍に希釈して使用し、ブタインターフェロンガンマの確認のためには抗ブタＩＦＮ−ガンマ多重クローン抗体（サーモサイエンティフィック社製）を５００倍に希釈して使用した。ＥＣＬ^TMプライムウェスターンブロット検出試薬（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製）を用いて発色し、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてイメージを得、これを図２に示す。

【0021】

［実施例３］ ＥＬＩＳＡを用いたブタインターフェロンアルファまたはガンマの定量及びタンパク質の確認
前記製造した組換えアデノウィルスにおいて発現されるブタインターフェロンアルファ及びガンマをＰｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法） Ｋｉｔ（ユーエスシーエヌライフサイエンス社製）及びＰｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社製）を用いて定量した。その結果を下記表１に示す。

【0022】

【表1】

【0023】

前記表１に示すように、１×１０⁴力価のＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγにおいてＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-αまたはＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γにおけるタンパク質量と同等なレベルでタンパク質が発現されることが確認され、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγにおいては意図の通りにインターフェロンアルファ及びガンマが両方とも発現されることが確認された。

【0024】

［実施例４］ 組換えアデノウィルスの力価別の口蹄疫ウィルスの抑制度の評価（試験管内分析）
組換えアデノウィルスの力価別の口蹄疫ウィルスの抑制度を評価した。このために、ＩＢＲＳ−２（豚腎臓細胞）を準備して７５ｃｍ²のフラスコに敷き、翌日に９０％の細胞断層が形成されたときに、各力価別に１０倍に段階的に希釈して組換えアデノウィルスを接種した。翌日に上澄液を除去した後に６００ ＴＣＩＤ₅₀の口蹄疫ウィルスを接種し、接種１時間後に培地を交換した。口蹄疫ウィルス接種４８時間後に上澄液を回収してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで口蹄疫ウィルスの複製数を測定した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、口蹄疫の３Ｄ部分を目的とするプライマーセンス５’−ＧＧＡＡＣＹＧＧＧＴＴＴＴＡＹＡＡＡＣＣＴＧＴＲＡＴ−３’（配列番号３）、アンチセンス５’−ＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧＧＡ−３’（配列番号４）と、プローブ５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＡＤＣＧＣＡＧＧＴＡＡＡＧＹＧＡＴＣＴＧＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号５）及びＡＢＩ ７５００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った（Ｓｕ−Ｍｉ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｈＲＮＡｓ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ Ｕ６ ａｎｄ ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ， ２０１０， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８７：３０７−３１７）。その結果を図３に示す。

【0025】

図３を参照すると、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγは、力価値とは無関係に、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γよりも優れた口蹄疫ウィルスの抑制効果を示し、１０００ＴＣＩＤ₅₀以下ではＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-αよりも優れた口蹄疫ウィルスの抑制効果を示し、特に、１００ＴＣＩＤ₅₀においては、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α及びＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γと比較して遥かに優れた口蹄疫ウィルスの抑制効果を示すということを確認することができる。

【0026】

［実施例５］ 組換えアデノウィルスによる口蹄疫ウィルスの抑制効果の評価（生体内分析）
この実験のために、実験群当たりに１５匹または１４匹（Ａｄ−ｎｕｌｌ対照群）にして、合計５９匹のＩＣＲマウス６日齢個体を準備し、個体当たりに２×１０⁷ ＴＣＩＤ₅₀のアデノウィルスを接種した。接種２４時間後に口蹄疫ウィルスを２５０ＬＤ₅₀接種した後、７日間の生存率を観察し、その結果を図４に示す。

【0027】

図４から明らかなように、観察したところ、初期である３日目からＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγを接種したマウス群（８０％生存率）の方が、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α（６０％生存率）またはＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γ（３３％生存率）の接種群よりも高い生存率を示し、接種７日目にはＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγが約４０％の生存率を示すのに対し、Ａｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-α及びＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ-γの接種群は２０％代の生存率を示した。したがって、本発明の産生物であるＡｄ−ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮαγの接種時に、同じ力価のインターフェロンを別途に接種したときよりも向上した口蹄疫抗ウィルス効果を示すということがマウス実験においても証明された。

【配列表フリーテキスト】

【0028】

配列番号１：口蹄疫ウィルス２Ａシーケンス
配列番号２：ブタインターフェロンアルファ及びガンマを同時に発現するための遺伝子配列（両端にＮｈｅＩ、ＸｂａＩ制限酵素配列を含む）
配列番号３：ＲＴ−ＰＣＲに用いるセンスプライマーの配列
配列番号４：ＲＴ−ＰＣＲに用いるアンチセンスプライマーの配列
配列番号５：ＲＴ−ＰＣＲに用いるプローブの配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]