特許 6386465 抗ヘマグルチニン抗体及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6386465

(24)【登録日】2018年8月17日

(45)【発行日】2018年9月5日

(54)【発明の名称】抗ヘマグルチニン抗体及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/08 20060101AFI20180827BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20180827BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180827BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180827BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180827BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180827BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20180827BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20180827BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/08ZNA

   C12N15/13

   C12N5/10

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   A61K39/395 N

   A61P31/16

【請求項の数】17

【全頁数】100

(21)【出願番号】特願2015-541997(P2015-541997)

(86)(22)【出願日】2013年11月12日

(65)【公表番号】特表2016-503413(P2016-503413A)

(43)【公表日】2016年2月4日

(86)【国際出願番号】US2013069567

(87)【国際公開番号】WO2014078268

(87)【国際公開日】20140522

【審査請求日】2016年11月11日

(31)【優先権主張番号】61/725,859

(32)【優先日】2012年11月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】シュイ， ミン

(72)【発明者】

【氏名】バラージュ， メルセデス

(72)【発明者】

【氏名】チャイ， ニン

(72)【発明者】

【氏名】チェン， ナンシー

(72)【発明者】

【氏名】チウ， ヘンリー

(72)【発明者】

【氏名】チン， チャオユイ

(72)【発明者】

【氏名】リン， チョンホア

(72)【発明者】

【氏名】ルパーダス， パトリック ジェー．

(72)【発明者】

【氏名】ナカムラ， ジェラルド アール．

(72)【発明者】

【氏名】パク， ヒョンジュ

(72)【発明者】

【氏名】スウェム， リー アール．

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０２９９９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５２８９０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 SCIENCE，２０１１年 ８月，Vol. 333 (6044)，p. 850-856

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）及び三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体であって、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号１９１及び１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１９３のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号１９６のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号１９７、１９８及び１９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
抗ヘマグルチニン抗体。

【請求項2】

抗体が、配列番号１３６、１４０、１４４、１４６、１５０、１５２、及び２３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離された抗ヘマグルチニン抗体。

【請求項3】

抗体が、配列番号１３４、１３８、１４２、１４８、及び２３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離された抗ヘマグルチニン抗体。

【請求項4】

抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１３４、１３８、１４２、１４８，及び２３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３６、１４０、１４４、１４６、１５０、１５２、及び２３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗ヘマグルチニン抗体。

【請求項5】

抗体が、配列番号１３５、１３９、１４３、１４５、１４９、及び１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗ヘマグルチニン抗体。

【請求項6】

抗体が、配列番号１３３、１３７、１４１、及び１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗ヘマグルチニン抗体。

【請求項7】

抗体が、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号１３３、１３７、１４１、及び１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１３５、１３９、１４３、１４５、１４９、及び１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗ヘマグルチニン抗体。

【請求項8】

必要とする個体において、Ａ型インフルエンザウイルス感染を治療、抑制、又は予防するための医薬であって、請求項１から７の何れか一項に記載の抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物の有効量を含む、医薬。

【請求項9】

医薬が、追加の治療剤を更に含む、請求項８に記載の医薬。

【請求項10】

追加の治療剤が、ノイラミニダーゼ阻害剤、抗ヘマグルチニン抗体、又は抗Ｍ２抗体である、請求項９に記載の医薬。

【請求項11】

請求項１から７の何れか一項に記載の抗体を含む組成物。

【請求項12】

請求項１から７の何れか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。

【請求項13】

請求項１から７の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。

【請求項14】

請求項１３に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項15】

抗体が産生されるように、請求項１４に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。

【請求項16】

医薬の製造における、請求項１から７の何れか一項に記載の抗ヘマグルチニン抗体の使用。

【請求項17】

医薬は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療、抑制、又は予防のためである、請求項１６に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１２年１１月１３日に出願された米国仮出願第６１／７２５８５９号の利益を主張し、それは参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が本明細書中で参照することにより援用される。２０１３年１０月３１日に作成された、前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ４９８２ＲｌＷＯ＿ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名され、２２７５９８バイトの大きさである。

【0003】

発明の分野
本発明は、抗ヘマグルチニン抗体、抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物、及びそれを使用する方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

インフルエンザウイルスの感染は、世界中で毎年、３から５百万の間の重篤疾患の症例と２５００００から５００００人の死亡を引き起こしている。米国だけで、人口の５％から２０％が毎年インフルエンザウイルスに感染し、これらの感染の大部分はＡ型インフルエンザウイルスに起因する。（例えば、Dushoff et al, (2006) Am J Epidemiology 163: 181-187; Thompson et al, (2004) JAMA 292: 1333-1340; Thompson et al, (2003) JAMA 289: 179-186）。米国では、毎年およそ２０万人がインフルエンザ関連の合併症で入院し、７０００から３００００人の死亡をもたらしている。医療費におけるインフルエンザウイルス感染に関連した負担と生産性の損失は甚大である。入院及び死亡は、高齢者、子供、及び慢性の疾患などの高リスクのグループで主に発生する。

【0005】

インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属するセグメント化された膜エンベロープ型のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。Ａ型インフルエンザウイルスは、９つの構造タンパク質及び１つの非構造タンパク質からなり、ヘマグルチニン（ＨＡ又はＨ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ又はＮ）、及びマトリックスタンパク質２（Ｍ２）の３つのウイルス表面タンパク質が含まれる。インフルエンザウイルスゲノムのセグメント化された性質は、異なるインフルエンザウイルス株を用いた細胞の混合感染の間に、遺伝子再集合のメカニズム（即ち、ゲノムセグメントの交換）が起きることを可能にする。ウイルス表面タンパク質のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼの抗原特性が改変されると、毎年恒例のインフルエンザの流行が発生する。改変された抗原性のメカニズムは２つある：パンデミックを引き起こす可能性がある、少なくとも２つのウイルスのサブタイプによる、宿主細胞の同時感染後に、ヒトと動物ウイルス間の遺伝子再配列によって引き起こされる抗原シフト；及び、インフルエンザの流行を引き起こす可能性がある、ウイルス表面上のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼタンパク質の小さな変化によって引き起こされる抗原ドリフト。

【0006】

Ａ型インフルエンザウイルスは更に、それらの表面上に提示される、別のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼのウイルスタンパク質に応じて、種々のサブタイプに分類することができる。各Ａ型インフルエンザウイルスサブタイプは、そのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼタンパク質の組み合わせによって同定される。１６の既知のＨＡサブタイプ（Ｈ１−Ｈ１６）及び９つの既知のＮＡサブタイプ（Ｎ１−Ｎ９）がある。１６のヘマグルチニンサブタイプは更に２つの系統学的グループに分類される：グループ１は、ヘマグルチニンＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、及びＨ１６のサブタイプを含み；グループ２はヘマグルチニンＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５のサブタイプを含む。

【0007】

ヘマグルチニンは宿主細胞へのウイルスの付着及び侵入を促進する；ノイラミニダーゼは、感染細胞からのウイルス出芽のために必要とされる。Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンは、二つの構造的に異なる領域−球状頭部領域及びストーク又はステム領域−を含む。球状頭部領域は、標的細胞へのウイルス付着に関与する受容体結合部位を含む。ヘマグルチニンのストーク（又はステム）領域は、ウイルスエンベロープと、感染した細胞のエンドソーム膜との間の膜融合に必要である融合ペプチドを含む。（例えば、Bouvier and Palese (2008) Vaccine 26 Suppl 4: D49-53; Wiley et al, (1987) Ann Rev Biochem 556:365-394を参照）。

【0008】

インフルエンザウイルス感染のための現在の治療は、オセルタミビル及びザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤を含む。オセルタミビルは、Ａ型インフルエンザウイルス感染のために、広く使用されている予防的及び早期治療の治療の選択肢である。（例えば、Kandel and Hartshorn (2001) BioDrugs: Clinical Immunotherapy, Biopharmaceuticals and Gene Therapy 15:303-323;Nicholson et al, (2000) Lancet 355: 1845-1850; Treanor et al, (2000) JAMA 283: 1016-1024; and Welliver et al., (2001) JAMA 285:748-754を参照）。しかし、オセルタミビルによる治療は、有意な臨床上の利益を提供するためには、発症から４８時間以内に開始しなければならない。（例えば、Aoki et al (2003) J Antimicrobial Chemotherapy 51 : 123-129を参照）。この義務は、治療を求める時点で、最適な４８時間の治療ウィンドウを典型的には超えている重症患者を治療するオセルタミビルの性能を危うくしている。従って、重要な焦点は、インフルエンザウイルスに感染した入院患者を治療するインフルエンザウイルス治療薬を同定することに置かれている。一つの戦略は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのストーク上の高度に保存されたエピトープを標的とするヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の開発に（モノクローナル抗体）に焦点をあてている。（例えば、Corti et al, (2011) Science 333:850-856; Ekiert et al., (2009) Science 324:246-251; Ekiert et al., (2011) Science 333:843-850; Sui et al., (2009) Nature Structural & Molecular Biology 16:265-273; Dreyfus et al., (2012) Science 337: 1343-1348; Wu et al., (2012) J Virology 2012.09.034; Clementi et al., (2011) PLoS One 6: 1-10を参照。国際特許出願公開番号：国際公開第２００９／１１５９７２号、国際公開第２０１１／１１７８４８号、国際公開第２００８／１１０９３７号、国際公開第２０１０／０１０４６６号、国際公開第２００８／０２８９４６号、国際公開第２０１０／１３０６３６号、国際公開第２０１２／０２１７８６号、国際公開第２０１０／０７３６４７号、国際公開第２０１１／１６００８３号、国際公開第２０１１／１１１９６６号、国際公開第２００２／４６２３５号及び国際公開第２００９／０５３６０４号；米国特許第５６３１３５０号及び第５５８９１７４号も参照のこと）。

【0009】

幾つかの報告は、ヘマグルチニンに結合し、広くＡ型インフルエンザウイルスを中和するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を記載している。例えば、Ｃｏｒｔｉら（上記）は、ヒト血漿細胞からクローニングされ、グループ１及びグループ２のヘマグルチニンサブタイプの両方に属するヒトＡ型インフルエンザウイルスを中和することが示された抗体ＦＩ６ｖ３を記載している。ＦＩ６ｖ３ ｍＡｂは、約１０４０００人のヒト形質細胞を分析した壮大なる努力の結果として発見された。更に、Ｄｒｅｙｆｕｓら（上記）は、最近、ファージディスプレイパニングによる抗体ＣＲ９１１４の同定を記載しており；抗体ＣＲ９１１４は、Ａ型インフルエンザウイルス及びインフルエンザＢ型ウイルスのヘマグルチニンの間で共有される高度に保存されたストークのエピトープに結合することが示された。

【0010】

これらの報告にもかかわらず、必要性が、グループ１とグループ２のＡ型インフルエンザウイルスサブタイプに対して有効である、新規なＡ型インフルエンザウイルス治療法のために当該技術分野において依然として存在する。本発明は、この必要性を満たし、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療のための他の利点を提供する。

【発明の概要】

【0011】

本発明は、抗ヘマグルチニン抗体、抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物、及びそれを使用する方法を提供する。

【0012】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）及び三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１７９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１８０及び１８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１８２、１８３、１８４、１８５、及び１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号１８７のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号１８８、１８９及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0013】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ及び／又は六つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１７９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１８０及び１８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１８２、１８３、１８４、１８５、及び１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号１８７のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号１８８、１８９、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0014】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＬＶＲ−Ｌ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１８２、１８３、１８４、１８５、及び１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号１８７のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号１８８、１８９及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0015】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＬＶＲ−Ｈ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１７９のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１８０及び１８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0016】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１８２、１８３、１８４、１８５、及び１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号１８７のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号１８８、１８９及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0017】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１７９のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１８０及び１８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；

【0018】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１１１及び１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１１３、１１７、１１９、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、及び１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0019】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１１３、１１７、１１９、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、及び１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0020】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１１１及び１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0021】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで、重鎖は、配列番号１１０、１１４、及び１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１１２、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、及び１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0022】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１１２、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、及び１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0023】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１１０、１１４及び１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0024】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）及び三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号１９１及び１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１９３のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号１９６のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号１９７、１９８及び１９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0025】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ及び／又は六つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号１９１及び１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１９３のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号１９６のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号１９７、１９８及び１９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0026】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＬＶＲ−Ｌ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号１９６のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１９７、１９８、及び１９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0027】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＬＶＲ−Ｈ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈｌは、配列番号１９１及び１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１９３のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む。

【0028】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号１９６のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号１９７、１９８、及び１９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0029】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号１９１及び１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号１９３のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む。

【0030】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１３４、１３８、１４２、１４８、及び２３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３６、１４０、１４４、１４６、１５０、１５２、及び２３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0031】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１３６、１４０、１４４、１４６、１５０、１５２、及び２３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0032】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１３４、１３８、１４２、１４８、及び２３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0033】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで、重鎖は、配列番号１３３、１３７、１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、及び、軽鎖は、配列番号１３５、１３９、１４３、１４５、１４９，及び１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0034】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１３５、１３９、１４３、１４５、１４９及び１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0035】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１３３、１３７、１４１及び１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0036】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）及び三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２００のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２０１のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０２のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２０３のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２０４のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む。

【0037】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ及び／又は六つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２００のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２０１のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０２のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２０３のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２０４のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む。

【0038】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＬＶＲ−Ｌ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２０３のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２０４のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む。

【0039】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＬＶＲ−Ｈ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２００のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２０１のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む。

【0040】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２０３のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２０４のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む。

【0041】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２００のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２０１のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む。

【0042】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１５４及び１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む。

【0043】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0044】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１５４及び１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0045】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで、重鎖は、配列番号１５３及び１５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１５５のアミノ酸配列を含む。

【0046】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0047】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１５３及び１５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0048】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）及び三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２０６のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２０７のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０８のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２０９のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２１０のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む。

【0049】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ及び／又は六つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２０６のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２０７のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０８のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２０９のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２１０のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む。

【0050】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＬＶＲ−Ｌ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２０９のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２１０のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む。

【0051】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＬＶＲ−Ｈ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２０６のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２０７のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０８のアミノ酸配列を含む。

【0052】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２０９のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２１０のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む。

【0053】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２０６のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２０７のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２０８のアミノ酸配列を含む。

【0054】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む。

【0055】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0056】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0057】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで、重鎖は、配列番号１５９のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む。

【0058】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0059】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0060】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）及び三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２１２のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２１３のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２１４のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２１５のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２１６のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号２１７のアミノ酸配列を含む。

【0061】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ及び／又は六つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２１２のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２１３のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２１４のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２１５のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２１６のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号２１７のアミノ酸配列を含む。

【0062】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＬＶＲ−Ｌ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２１５のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２１６のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２１７のアミノ酸配列を含む。

【0063】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＬＶＲ−Ｈ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２１２のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２１３のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む。

【0064】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２１５のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２１６のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２１７のアミノ酸配列を含む。

【0065】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２１２のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２１３のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む。

【0066】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１６４のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む。

【0067】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0068】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0069】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで、重鎖は、配列番号１６３のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む。

【0070】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0071】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１６３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0072】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３）及び三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２１８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２１９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２２０のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２２１のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２２２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号２２３のアミノ酸配列を含む。

【0073】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ及び／又は六つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２１８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２１９のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２２０のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２２１のアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２２２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号２２３のアミノ酸配列を含む。

【0074】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＬＶＲ−Ｌ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２２１のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２２２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２２３のアミノ酸配列を含む。

【0075】

幾つかの実施態様において、本発明は、三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＬＶＲ−Ｈ３）を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２１８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２１９のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む。

【0076】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号２２１のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号２２２のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２２３のアミノ酸配列を含む。

【0077】

幾つかの実施態様において、本発明は、少なくとも一つ、二つ、及び／又は三つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ヘマグルチニン抗体を提供し、ここで、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号２１８のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号２１９のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む。

【0078】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１６８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。

【0079】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0080】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0081】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、ここで、重鎖は、配列番号１６７のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む。

【0082】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0083】

幾つかの実施態様において、本発明の単離された抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0084】

本発明はまた、本発明の抗ヘマグルチニン抗体をコードする単離された核酸を提供する。本発明はまた、本発明の抗ヘマグルチニン抗体をコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明はまた、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。ベクターは、任意のタイプのもの、例えば、発現ベクターなどの組み換えベクターであって良い。種々の宿主細胞の何れかを使用することができる。一実施態様において、宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌である。別の実施態様において、宿主細胞は真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。

【0085】

本発明は更に、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を産生する方法を提供する。例えば、本発明は、（本明細書で定義されるように、完全長抗体及びその断片を含む）、抗ヘマグルチニン抗体を作製するための方法であって、適切な宿主細胞中で抗体又はその断片が産生されるように、抗ヘマグルチニン抗体又はその断片をコードする本発明の組み換えベクターを発現させることを含む方法を提供する。幾つかの実施態様において、本方法は、核酸が発現されるように、本発明の抗ヘマグルチニン抗体（又はその断片）をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含む。本方法は更に、宿主細胞培養物又は宿主細胞培養培地から、抗ヘマグルチニン抗体又はその断片を回収することを含み得る。

【0086】

本発明はまた、本発明の抗ヘマグルチニン抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤を提供する。薬学的製剤は更に、追加の治療薬（例えば、オセルタミビル又はザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤；別の抗ヘマグルチニン抗体又は抗Ｍ２抗体などの別の抗体；その他）を含んでも良い。

【0087】

本発明はまた、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物を提供する。組成物は更に、追加の治療薬（例えば、オセルタミビル又はザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤；別の抗ヘマグルチニン抗体又は抗Ｍ２抗体などの別の抗体；その他）を含んでも良い。

【0088】

また、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防に使用のための本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防に使用のための本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む薬学的組成物を提供する。本発明は更に、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療に使用のための本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療に使用のための本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む薬学的組成物を提供する。本発明は更に、Ａ型インフルエンザウイルス感染の抑制に使用のための本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の抑制に使用のための本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む薬学的組成物を提供する。

【0089】

本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物はまた、医薬の製造に使用することができる。医薬は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の抑制、治療、又は予防において使用のためであり得る。ある実施態様において、医薬は更に、追加の治療薬（例えば、オセルタミビル又はザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤；別の抗ヘマグルチニン抗体又は抗Ｍ２抗体などの別の抗体；その他）を含んでも良い。

【0090】

本発明はまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染を抑制するための方法であって、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含み、それによってＡ型インフルエンザウイルス感染を抑制する方法を提供する。本発明はまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染を治療するための方法であって、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含み、それによってＡ型インフルエンザウイルス感染を治療する方法を提供する。本発明はまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染を予防するための方法であって、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含み、それによってＡ型インフルエンザウイルス感染を予防する方法を提供する。

【0091】

本発明はまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染を抑制、治療、又は予防するための方法であって、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を含む組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与し、及び、患者に追加の治療薬の有効量を投与することを含み、それによってＡ型インフルエンザウイルス感染を抑制、治療、又は予防する方法を提供する。幾つかの実施態様において、追加の治療薬は、オセルタミビル又はザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤である。他の実施態様において、追加の治療薬は別の抗ヘマグルチニン抗体である。更に他の実施態様において、追加の治療薬は抗Ｍ２抗体である。このような併用療法の様々な態様において、治療薬は、およそ同時に投与される、一緒に投与されるか、又は逐次的に又は連続的に投与される。特定の実施態様において、抗ノイラミニダーゼ阻害剤は、本発明の抗ヘマグルチニン抗体の投与前に投与される。

【0092】

別の実施態様において、本発明は、医薬の製造における本発明の抗ヘマグルチニン抗体の使用を提供する。医薬は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の抑制、治療、又は予防において使用のためであり得る。ある実施態様において、医薬は更に、追加の治療薬（例えば、オセルタミビル又はザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤；別の抗ヘマグルチニン抗体又は抗Ｍ２抗体などの別の抗体；その他）を含んでも良い。

【0093】

別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明の核酸の使用を提供する。医薬は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の抑制、治療、又は予防において使用のためであり得る。ある実施態様において、医薬は更に、追加の治療薬（例えば、オセルタミビル又はザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤；別の抗ヘマグルチニン抗体又は抗Ｍ２抗体などの別の抗体；その他）を含んでも良い。

【0094】

別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明の発現ベクターの使用を提供する。医薬は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の抑制、治療、又は予防において使用のためであり得る。ある実施態様において、医薬は更に、追加の治療薬（例えば、オセルタミビル又はザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤；別の抗ヘマグルチニン抗体又は抗Ｍ２抗体などの別の抗体；その他）を含んでも良い。

【0095】

別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明の宿主細胞の使用を提供する。医薬は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の抑制、治療、又は予防において使用のためであり得る。ある実施態様において、医薬は更に、追加の治療薬（例えば、オセルタミビル又はザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤；別の抗ヘマグルチニン抗体又は抗Ｍ２抗体などの別の抗体；その他）を含んでも良い。

【0096】

別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明の製造品の使用を提供する。医薬は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の抑制、治療、又は予防において使用のためであり得る。ある実施態様において、医薬は更に、追加の治療薬（例えば、オセルタミビル又はザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤；別の抗ヘマグルチニン抗体又は抗Ｍ２抗体などの別の抗体；その他）を含んでも良い。

【0097】

別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明のキットの使用を提供する。医薬は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の抑制、治療、又は予防において使用のためであり得る。ある実施態様において、医薬は更に、追加の治療薬（例えば、オセルタミビル又はザナミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤；別の抗ヘマグルチニン抗体又は抗Ｍ２抗体などの別の抗体；その他）を含んでも良い。

【0098】

様々な態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体はヘマグルチニンに結合する。幾つかの態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体は、グループ１のヘマグルチニンに結合し、グループ２のヘマグルチニンに結合し、又はグループ１及びグループ２のヘマグルチニンに結合する。他の態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体はヘマグルチニンに結合し、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する。幾つかの実施態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体は、インビトロ、インビボ、又はインビトロ及びインビボで、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する。

【図面の簡単な説明】

【0099】

【図1A-1B】図１Ａ及び図１Ｂは、ＳＣＩＤ／ベージュマウスでの濃縮に先立って、ワクチン接種後７日目のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの（図１Ａ）、及び、抗原プレミックスを含む場合及び含まない場合でのＳＣＩＤ／ベージュマウスでの濃縮後８日目からの（図１Ｂ）、抗ヘマグルチニン陽性（ヘマグルチニンＨ３＋及びヘマグルチニンＨ１＋）形質芽細胞のＦＡＣＳ分析を示すデータを、それぞれ上のパネル及び下のパネルで説明する。

【図2】図２は、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスを含まない場合（円）及びＰＢＭＣ／抗原プレミックス含む場合（四角）における、個々のＳＣＩＤ／ベージュマウス由来のＰＢＭＣの脾臓内注入後８日目から得られた脾細胞の分析を、ヘマグルチニン（Ｈ１）^＋／ＣＤ３８^ｈｉｇｈのパーセントとして示すデータを説明する。長方形は、ヘマグルチニンＨ１＋形質芽細胞を提示したマウスを示している。

【図3】図３は、本発明の抗ヘマグルチニン抗体による、様々なインフルエンザＡグループ１及びグループ２のウイルス株のインビトロ中和を示すデータを説明する。

【図4A-4B】図４Ａ及び４Ｂは、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）による、様々なインフルエンザＡグループ１（図４Ａ）及びグループ２（図４Ｂ）のウイルス株のインビトロ中和を示すデータを説明する。

【図5A-5B】図５Ａ及び５Ｂは、モノクローナル抗体８１．３９ ＳＶＳＨ−ＮＹＰ（配列番号１７１として開示された「ＳＶＳＨ」）による、様々なインフルエンザＡグループ１（図５Ａ）及びグループ２（図５Ｂ）のウイルス株のインビトロ中和を示すデータを説明する。

【図6】図６は、モノクローナル抗体３９．１８ Ｂ １１による、様々なインフルエンザＡグループ１のウイルス株のインビトロ中和を示すデータを説明する。

【図7】図７は、モノクローナル抗体３６．８９による、様々なインフルエンザＡグループ１及びグループ２のウイルス株のインビトロ中和を示すデータを説明する。

【図8】図８は、モノクローナル抗体ｍＡｂ９ ０１Ｆ３による、様々なインフルエンザＡグループ１及びグループ２のウイルス株のインビトロ中和を示すデータを説明する。

【図9】図９は、モノクローナル抗体ｍＡｂ２３ ０６Ｃ２による、様々なインフルエンザＡグループ１及びグループ２のウイルス株のインビトロ中和を示すデータを説明する。

【図10】図１０は、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＣｖ１による、ヘマグルチニンＨ５発現性の偽ウイルスのインビトロ中和を示すデータを説明する。

【図11】図１１は、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）による、Ｈ７Ｎ７ウマインフルエンザウイルスのインビトロ中和を示すデータを説明する。

【図12A-12B-12C-12D】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄは、様々なＡ型インフルエンザウイルス株（Ａ／ＰＲ／８／１９３４（ＰＲ８）、図１２Ａ；Ａ／Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／１９７３（ＰＣ７３）、図１２Ｂ；Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８（ＨＫ６８）、図１２Ｃ）；及びＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８ （Ａｉｃｈｉ６８）、図１２Ｄ）により感染され、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の様々な量を投与されたマウスの生存パーセントを示すデータを説明する。

【図13】図１３は、Ａ／ＰＲ／８／１９３４Ａ型インフルエンザウイルス株により感染され、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＣｖ１の様々な量を投与されたマウスの生存パーセントを示すデータを説明する。

【図14】図１４は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８Ａ型インフルエンザウイルス株（高いＩＣ５０を有するＡ型インフルエンザウイルス）により感染され、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＣｖ１の様々な量を投与されたマウスの生存パーセントを示すデータを説明する。

【図15】図１５は、Ａ／Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／１９７３ンフルエンザＡ型ウイルス株により感染され、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＣｖ１の様々な量を投与されたマウスの生存パーセントを示すデータを説明する。

【図16】図１６は、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８Ａ型インフルエンザウイルス株により感染され、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＣｖ１の様々な量を投与されたマウスの生存パーセントを示すデータを説明する。

【図17】図１７は、Ａ型インフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／１９３４により感染され、モノクローナル抗体３９．２９ Ｄ８Ｃ２とモノクローナル抗体３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）又はオセルタミビル（タミフル（登録商標））との５０：５０混合物を投与されたマウスの生存パーセントを比較するデータを説明する。

【図18】図１８は、Ａ型インフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／１９３４により感染され、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）、オセルタミビル（タミフル（登録商標））、又はモノクローナル抗体３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）とオセルタミビル（タミフル（登録商標））との組合せを投与されたマウスの生存パーセントの比較を示すデータを説明する。

【図19A-19B】図１９Ａ及び１９Ｂは、Ａ型インフルエンザウイルス株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）により感染され、感染後４８時間又は７２時間で、モノクローナル抗体３９．２９ Ｄ８Ｃ２（図１９Ａ）、モノクローナル抗体８１．３９ Ｂ１Ｃ１（時１９Ｂ）、又はオセルタミビル（タミフル（登録商標））を投与されたフェレットの生存パーセントの比較を示すデータを説明する。

【図20】図２０は、ヘマグルチニンＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７からのヘマグルチニンアミノ酸配列のアミノ酸配列アラインメントを示し、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＣｖ１とヘマグルチニン結合性エピトープとのヘマグルチニン接触残基（影付き）を示している。

【図21A-21B】図２１Ａ及び２１Ｂは、ビオチン標識化モノクローナル抗体３９．２９のＡ／ＮＷＳ／１９３３からのヘマグルチニンＨ１（図２１Ａ）及びＡ／ＨＫ／８／１９６８からのヘマグルチニンＨ３（図２１Ｂ）への結合と競合する、本発明の様々なモノクローナル抗体の競合ＥＬＩＳＡ実験からのデータを説明する。

【図22A-22B】図２２Ａ及び２２Ｂは、モノクローナル抗体８１．３９ Ｂ１Ｃ１の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１１３及び１１１）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３７）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図23A-23B】図２３Ａ及び２３Ｂは、モノクローナル抗体８１．３９ ＳＶＳＨ−ＮＹＰ（配列番号１７１として開示された「ＳＶＳＨ」）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１１７及び１１５）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３７）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図24A-24B】図２４Ａ及び２４Ｂは、モノクローナル抗体８１．３９ Ｂ１Ｆ１の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１１９及び１１１）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３７）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図25A-25B】図２５Ａ及び２５Ｂは、モノクローナル抗体８１．３９ ＳＶＤＳ（配列番号１７２として開示された「ＳＶＤＳ」）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１１３及び１１５）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３７）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図26A-26B】図２６Ａ及び２６Ｂは、モノクローナル抗体８１．３９ ＳＶＳＳ（配列番号１７３として開示された「ＳＶＳＳ」）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１２２及び１１５）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３７）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図27A-27B】図２７Ａ及び２７Ｂは、モノクローナル抗体８１．３９ ＳＶＤＨ（配列番号１７４として開示された「ＳＶＤＨ」）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１２４及び１１５）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３７）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図28A-28B】図２８Ａ及び２８Ｂは、ｍＡｂ ８１．３９ ＳＶＳＨ（配列番号１７１として開示された「ＳＶＳＨ」）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１２６及び１１５）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３７）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図29A-29B】図２９Ａ及び２９Ｂは、モノクローナル抗体８１．３９ ＳＶＳＨ．ＮＦＰ（配列番号１７１として開示された「ＳＶＳＨ」）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１２８及び１１５）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３７）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図30A-30B】図３０Ａ及び３０Ｂは、モノクローナル抗体８１．３９ ＳＶＤＳ．Ｆ（配列番号１７２として開示された「ＳＶＤＳ」）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１３０及び１１５）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３７）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図31A-31B】図３１Ａ及び３１Ｂは、モノクローナル抗体８１．３９ ＳＶＤＳ．Ｙ（配列番号１７２として開示された「ＳＶＤＳ」）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１３２及び１１５）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３７）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図32A-32B】図３２Ａ及び３２Ｂは、モノクローナル抗体３９．２９ Ｄ２Ｃ４の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１３６及び１３４）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２４５）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図33A-33B】図３３Ａ及び３３Ｂは、モノクローナル抗体３９．２９ Ｄ８Ｃ２の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１４０及び１３８）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２４５）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図34A-34B】図３４Ａ及び３４Ｂは、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＣｖ１の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１４４及び１４２）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２４５）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図35A-35B】図３５Ａ及び３５Ｂは、モノクローナル抗体３９．２９ Ｄ８Ｅ７の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１４６及び１３８）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２４５）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図36A-36B】図３６Ａ及び３６Ｂは、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＦＰＰ（配列番号１７５として開示された「ＮＦＰＰ」）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１５０及び１４８）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２４５）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図37A-37B】図３７Ａ及び３７Ｂは、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＹＰＰ（配列番号１７６として開示された「ＮＹＰＰ」）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１５２及び１４８）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２４５）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図38A-38B】図３８Ａ及び３８Ｂは、モノクローナル抗体３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号２３５及び２３４）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変３−３０＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ３−３０＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２４５）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図39A-39B】図３９Ａ及び３９Ｂは、モノクローナル抗体３９．１８ Ｂ１１の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１５６及び１５４）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変１−６９＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ１−６９＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３８）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図40A-40B】図４０Ａ及び４０Ｂは、モノクローナル抗体３９．１８ Ｅ１２の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１５６及び１５８）の、免疫グロブリンカッパ可変３−１５＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ３−１５＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変１−６９＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ１−６９＊０１）（それぞれ配列番号２３６及び２３８）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図41A-41B】図４１Ａ及び４１Ｂは、モノクローナル抗体３６．８９の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１６２及び１６０）の、免疫グロブリンカッパ可変１−５＊０３生殖系列（ＩＧＫＶ１−５＊０３）及び免疫グロブリン重鎖可変１−１８＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ１−１８＊０１）（それぞれ配列番号２３９及び２４０）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図42A-42B】図４２Ａ及び４２Ｂは、モノクローナル抗体９．０１Ｆ３の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１６６及び１６４）の、免疫グロブリン軽鎖可変１−４４＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ１−４４＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変１−２＊０２＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ１−２＊０２）（それぞれ配列番号２４１及び２４２）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【図43A-43B】図４３Ａ及び４３Ｂは、モノクローナル抗体２３．０６Ｃ２の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（それぞれ配列番号１７０及び１６８）の、免疫グロブリンカッパ可変２−３０＊０１生殖系列（ＩＧＫＶ２−３０＊０１）及び免疫グロブリン重鎖可変４−３９＊０１生殖系列（ＩＧＨＶ４−３９＊０１）（それぞれ配列番号２４３及び２４４）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの番号付けによる番号である。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び接触ＣＤＲが示されている。

【発明を実施するための形態】

【0100】

本発明の実施態様の詳細な記述
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の改変を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。

【0101】

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。

【0102】

「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。

【0103】

用語「抗ヘマグルチニン抗体」及び「ヘマグルチニンに結合する抗体」は、抗体が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを標的とすることを含む、ヘマグルチニンを標的とすることにおいて、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でヘマグルチニンに結合する抗体を指す。一実施態様において、抗ヘマグルチニン抗体の、無関係な、非ヘマグルチニンタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のヘマグルチニンへの結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ヘマグルチニンへ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍから１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍから１０^−１３Ｍ）である。ある実施態様において、抗ヘマグルチニン抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの異なる株、サブタイプ及び分離株由来のヘマグルチニン間で保存されているヘマグルチニンのエピトープに結合する。

【0104】

用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。

【0105】

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。「抗体断片」はまた、ヘマグルチニンに結合し、Ａ型インフルエンザウイルスを中和するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。

【0106】

参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。

【0107】

用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。

【0108】

抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは更に、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３に、ＩｇＧ_４、ＩｇＧ_４、ＩＧＡ_１、及びＩｇＡ_２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0109】

本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）；及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。

【0110】

「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。

【0111】

薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。

【0112】

用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。

【0113】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。

【0114】

用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

【0115】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。

【0116】

「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

【0117】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。

【0118】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全て又は実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。

【0119】

本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成するか、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。本明細書における典型的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（MacCallum et al.J. Mol.Biol.262:732-745 (1996)）；
（ｄ）ＨＶＲのアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せを含む。

【0120】

特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。

【0121】

「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。

【0122】

「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。

【0123】

「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％又は９９％を超える純度にまで精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。

【0124】

「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。

【0125】

「抗ヘマグルチニン抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。

【0126】

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」なる修飾語句は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解釈されるべきものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。

【0127】

「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。

【0128】

「天然型抗体」は、様々な構造を有する、天然に生じる免疫グロブリンを指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。

【0129】

用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。

【0130】

「参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテック社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、特にデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。

【0131】

アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと一致しない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。

【0132】

用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。

【0133】

「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。

【0134】

本明細書で用いられる用語「ヘマグルチニン」は、特に断らない限り、任意のインフルエンザウイルス源からの任意の天然型ヘマグルチニンを指す。その用語は、「完全長」、未処理のヘマグルチニン、並びに、インフルエンザウイルス又はインフルエンザウイルス感染細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のヘマグルチニンを包含する。その用語はまた、ヘマグルチニンの天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。様々なＡ型インフルエンザウイルス株からの例示的なヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２２５（Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７からのＨ２）、２２６（Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９からのＨ３）、２２７（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からのＨ５）、２２８（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ＮＳＷ／１／１９９７からのＨ７）、２２９（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からのＨ１）、２３０（Ａ／ＮＳＷ／１９３３からのＨ１）、２３１（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８／１９６８からのＨ３）、２３２（Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３からのＨ７）、及び２３３（Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１９１８）に示される。

【0135】

本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（treat）」又は「治療している（treating）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス感染の発生又は再発を予防すること）、症状の軽減（軽減すること）又は緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。

【0136】

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology、第６版、 W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 91頁）を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。

【0137】

本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。

【0138】

ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、抗ヘマグルチニン抗体及びその使用に部分的に基づいている。所定の実施態様において、ヘマグルチニンに結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス感染の診断、治療又は予防のために有用である。

【0139】

Ａ．典型的な抗ヘマグルチニン抗体
一態様において、本発明は、ヘマグルチニンに結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体は、ヘマグルチニンに結合し、グループ１のヘマグルチニンに結合し、グループ２のヘマグルチニンに結合し、又はグループ１及びグループ２のヘマグルチニンに結合する。他の実施態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体は、インビトロでＡ型インフルエンザウイルスを中和する。他の実施態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体は、インビボでＡ型インフルエンザウイルスを中和する。更に他の実施態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体は、Ａ型インフルエンザウイルス感染を減少させ、Ａ型インフルエンザウイルス感染を予防し、Ａ型インフルエンザウイルス感染を抑制し、又はＡ型インフルエンザウイルス感染を治療する。幾つかの実施態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体は、インフルエンザウイルスの膜と感染細胞のエンドソーム膜との間のヘマグルチニン媒介性の融合を、阻止、抑制、又は減少させる（従って、ウイルスＲＮＡの感染細胞の細胞質への侵入を阻止、抑制、又は減少させ、よって、インフルエンザウイルス感染の更なる伝播を阻止、抑制、又は減少させる）。

【0140】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ，三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0141】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0142】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0143】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0144】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0145】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0146】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0147】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0148】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0149】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８０及び１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８２、１８３、１８４、１８５及び１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８８、１８９、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0150】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１８０及び１８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0151】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１８２、１８３、１８４、１８５、及び１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１８８、１８９、及び１９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0152】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0153】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0154】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0155】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0156】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0157】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0158】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0159】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0160】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１８９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0161】

別の態様において、本発明は、配列番号１１１及び１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0162】

別の態様において、本発明は、配列番号１１３、１１７、１１９、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、及び１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0163】

別の態様において、本発明は、配列番号１１１及び１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１３、１１７、１１９、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、及び１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0164】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0165】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0166】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0167】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0168】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0169】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0170】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0171】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0172】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0173】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0174】

別の態様において、本発明は、配列番号１１０、１１４、及び１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体を提供する。

【0175】

別の態様において、本発明は、配列番号１１２、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、及び１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0176】

別の態様において、本発明は、配列番号１１０、１１４、及び１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１１２、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、及び１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0177】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0178】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0179】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0180】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0181】

一実施態様において、本発明は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0182】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１２３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0183】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１２５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0184】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１２７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0185】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0186】

一実施態様において、本発明は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0187】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0188】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0189】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0190】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0191】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１９１及び１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0192】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１９７、１９８、及び１９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0193】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0194】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0195】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0196】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0197】

別の態様において、本発明は、配列番号１３４、１３８、１４２、１４８、及び２３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0198】

別の態様において、本発明は、配列番号１３６、１４０、１４４、１４６、１５０、１５２、及び２３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0199】

別の態様において、本発明は、配列番号１３４、１３８、１４２、１４８、及び２３４，からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１３６、１４０、１４４、１４６、１５０、１５２、及び２３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0200】

一実施態様において、本発明は、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0201】

一実施態様において、本発明は、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0202】

一実施態様において、本発明は、配列番号１４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0203】

一実施態様において、本発明は、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0204】

一実施態様において、本発明は、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0205】

一実施態様において、本発明は、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0206】

一実施態様において、本発明は、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0207】

一実施態様において、本発明は、配列番号２３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0208】

別の態様において、本発明は、配列番号１３３、１３７、１４１、及び１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体を提供する。

【0209】

別の態様において、本発明は、配列番号１３５、１３９、１４３、１４５、１４９、及び１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0210】

別の態様において、本発明は、配列番号１３３、１３７、１４１、及び１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１３５、１３９、１４３、１４５、１４９、及び１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0211】

一実施態様において、本発明は、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0212】

一実施態様において、本発明は、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0213】

一実施態様において、本発明は、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0214】

一実施態様において、本発明は、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１４５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0215】

一実施態様において、本発明は、配列番号１４７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１４９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0216】

一実施態様において、本発明は、配列番号１４７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１５１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0217】

一実施態様において、本発明は、配列番号１４７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0218】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0219】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0220】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0221】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0222】

別の態様において、本発明は、配列番号１５４及び１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0223】

別の態様において、本発明は、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0224】

別の態様において、本発明は、配列番号１１４及び１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0225】

一実施態様において、本発明は、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0226】

一実施態様において、本発明は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0227】

別の態様において、本発明は、配列番号１５３及び１５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体を提供する。

【0228】

別の態様において、本発明は、配列番号１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0229】

別の態様において、本発明は、配列番号１５３及び１５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変及び配列番号１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0230】

一実施態様において、本発明は、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0231】

一実施態様において、本発明は、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0232】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0233】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0234】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0235】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0236】

別の態様において、本発明は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0237】

別の態様において、本発明は、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0238】

一実施態様において、本発明は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0239】

別の態様において、本発明は、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体を提供する。

【0240】

別の態様において、本発明は、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0241】

別の態様において、本発明は、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0242】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0243】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0244】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0245】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0246】

別の態様において、本発明は、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0247】

別の態様において、本発明は、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0248】

一実施態様において、本発明は、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0249】

別の態様において、本発明は、配列番号１６３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体を提供する。

【0250】

別の態様において、本発明は、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0251】

別の態様において、本発明は、配列番号１６３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0252】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、又は六つのＨＶＲを含む抗ヘマグルチニン抗体を提供する。

【0253】

一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0254】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つ、二つ、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。

【0255】

その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0256】

別の態様において、本発明は、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0257】

別の態様において、本発明は、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0258】

一実施態様において、本発明は、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0259】

別の態様において、本発明は、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体を提供する。

【0260】

別の態様において、本発明は、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0261】

別の態様において、本発明は、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。

【0262】

上記実施形態の何れにおいても、本発明の抗ヘマグルチニン抗体はヒト化されている。一実施態様において、抗ヘマグルチニン抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。

【0263】

その他の態様において、抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１１１、１１５、１３４、１３８、１４２、１４８、１５４、１５８、１６０、１６４、１６８、及び２３４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。所定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ヘマグルチニン抗体は、ヘマグルチニンへ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、配列番号１１１、１１５、１３４、１３８、１４２、１４８、１５４、１５８、１６０、１６４、１６８、又は２３４において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１１１、１１５、１３４、１３８、１４２、１４８、１５４、１５８、１６０、１６４、１６８、又は２３４のＶＨ配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。

【0264】

その他の態様において、抗ヘマグルチニン抗体が提供され、その抗体は、配列番号１１３、１１７、１１９、１２２，、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３６、１４０、１４４、１４６、１５０、１５２、１５６、１６２、１６６、１７０、及び２３５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、所定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ヘマグルチニン抗体は、ヘマグルチニンへ結合する能力を保持する。所定の実施態様において、配列番号１１３、１１７、１１９、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３６、１４０、１４４、１４６、１５０、１５２、１５６、１６２、１６６、１７０、又は２３５において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ヘマグルチニン抗体は、配列番号１１３、１１７、１１９、１２２，、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３６、１４０、１４４、１４６、１５０、１５２、１５６、１６２、１６６、１７０、又は２３５のＶＬ配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。

【0265】

別の態様において、抗ヘマグルチニン抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号１１１、１１５、１３４、１３８、１４２、１４８、１５４、１５８、１６０、１６４、１６８、又は２３４、及び配列番号１１３、１１７、１１９、１２２，、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３６、１４０、１４４、１４６、１５０、１５２、１５６、１６２、１６６、１７０、又は２３５のそれぞれのＶＨ及びＶＬ配列を、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。

【0266】

更なる態様において、本発明は、本明細書に与えられた抗ヘマグルチニン抗体と同一エピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号１１１のＶＨ配列及び配列番号１１３のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１１７のＶＬ配列；配列番号１１１のＶＨ配列及び配列番号１１９のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１１３のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１２２のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１２４のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１２６のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１２８のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１３０のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１３２のＶＬ配列；配列番号１３４のＶＨ配列及び配列番号１３６のＶＬ配列；配列番号１３８のＶＨ配列及び配列番号１４０のＶＬ配列；配列番号１４２のＶＨ配列及び配列番号１４４のＶＬ配列；配列番号１３８のＶＨ配列及び配列番号１４６のＶＬ配列；配列番号１４８のＶＨ配列及び配列番号１５０のＶＬ配列；配列番号１４８のＶＨ配列及び配列番号１５２のＶＬ配列；配列番号１４８のＶＨ配列及び配列番号１４０のＶＬ配列；配列番号２３４のＶＨ配列及び配列番号２３５のＶＬ配列；配列番号１５４のＶＨ配列及び配列番号１５６のＶＬ配列；配列番号１５８のＶＨ配列及び配列番号１５６のＶＬ配列；配列番号１６０のＶＨ配列及び配列番号１６２のＶＬ配列；配列番号１６４のＶＨ配列及び配列番号１６６のＶＬ配列；又は配列番号１６８のＶＨ配列及び配列番号１７０のＶＬ配列を含む、抗ヘマグルチニン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。

【0267】

本発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかに記載の抗ヘマグルチニン抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ヘマグルチニン抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）_２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。

【0268】

更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗ヘマグルチニン抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる：

【0269】

１．抗体親和性
ある実施態様において、本明細書において提供される抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍから１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍから１０^−１３Ｍ）を有する。

【0270】

一実施態様において、Ｋｄは放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施態様において、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原により実施される。例えば、非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（^１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイ条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ））のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［^１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する（例えば、Presta et al, Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。次いで、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０^ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ^ＴＭガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。

【0271】

別の実施態様によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いるアッセイが、〜１０反応単位（ＲＵ）で固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施される。一実施態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ、Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０^ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）エバリュエーションソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる会合速度が１０^６Ｍ^１ｓ^−１を上回る場合、会合速度は、分光計、例えばストップフローを備えた分光光度計（ストップフロー）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ^ＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される漸増濃度の抗原の存在下、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する、蛍光消光技術を用いて測定することができる。

【0272】

２．抗体断片
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。

【0273】

ダイアボディーは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディはまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。

【0274】

単一ドメイン抗体は、抗体の、重鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号（Ｂ１）を参照）。

【0275】

抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。

【0276】

３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

【0277】

所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。

【0278】

ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989）；米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号、及び７０８７４０９号； Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。

【0279】

ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリースクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。

【0280】

４．ヒト抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて、又は本明細書に記載される技術を用いて生成することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。

【0281】

ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）も参照のこと。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。

【0282】

ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されたヒト抗体が、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。

【0283】

ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に説明する。

【0284】

５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。

【0285】

所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリーはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の非再配列Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号を含む。

【0286】

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。

【0287】

６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはヘマグルチニンに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ヘマグルチニンの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまた、ヘマグルチニンを発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。

【0288】

多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号（Ａ１））、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号；及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。

【0289】

「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号（Ａ１）を参照）。

【0290】

本明細書中の抗体又は断片はまた、ヘマグルチニン並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。

【0291】

７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成され得る。

【0292】

ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。

【0293】

保存的置換は、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「例示的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。

【0294】

【0295】

アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．

【0296】

非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを伴うこととなる。

【0297】

置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0298】

改変（例えば、置換）を、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179196 (2008)を参照）、及び／又は抗原に接触する残基で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーが、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するする別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲを標的としたアプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。

【0299】

所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。そのような改変は、ＨＶＲ中の抗原と接触する残基以外であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。

【0300】

突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。
代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。

【0301】

アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。

【0302】

ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。

【0303】

抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。

【0304】

一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ、Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。フコース非修飾抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ａ１）、Ｐｒｅｓｔａ、Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２号（Ａ１）、Ａｄａｍｓら、具体的には実施例１１）、及びノックアウト細胞株、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。

【0305】

抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。

【0306】

このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。

【0307】

そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔｔら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載されている。

【0308】

ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。

【0309】

ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；第５８２１３３７号（例えば、Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わりとして、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定もまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。

【0310】

エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。

【0311】

ＦｃＲへの改善又は減少した結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。

【0312】

所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。

【0313】

幾つかの実施態様において、改変された（即ち、改善され又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。

【0314】

増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ａ１）（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。

【0315】

これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一以上の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）を有するものが含まれる。

【0316】

Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。

【0317】

ｄ）システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の一以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中で更に記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。

【0318】

ｅ）抗体誘導体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な付加的な非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。

【0319】

その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体、及び非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005）。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。

【0320】

Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗ヘマグルチニン抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＨＥＲ３抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。

【0321】

抗ヘマグルチニン抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。

【0322】

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照）。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、更に精製することができる。

【0323】

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。

【0324】

グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。

【0325】

植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載）を参照。

【0326】

脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977）に記載された２９３又は２９３Ｔ細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の評価については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。

【0327】

Ｃ．アッセイ
本明細書において提供される抗ヘマグルチニン抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、同定され、スクリーニングされ、又は特徴づけることができる。

【0328】

１．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。

【0329】

その他の態様において、ヘマグルチニンの結合について、本発明に記載される任意の抗ヘマグルチニン抗体と競合する抗体を同定するために、競合アッセイが用いられる。所定の実施態様において、このような競合する抗体は、本発明に記載される抗ヘマグルチニン抗体により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する（例えば、配列番号１１１のＶＨ配列及び配列番号１１３のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１１７のＶＬ配列；配列番号１１１のＶＨ配列及び配列番号１１９のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１１３のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１２２のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１２４のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１２６のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１２８のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１３０のＶＬ配列；配列番号１１５のＶＨ配列及び配列番号１３２のＶＬ配列；配列番号１３４のＶＨ配列及び配列番号１３６のＶＬ配列；配列番号１３８のＶＨ配列及び配列番号１４０のＶＬ配列；配列番号１４２のＶＨ配列及び配列番号１４４のＶＬ配列；配列番号１３８のＶＨ配列及び配列番号１４６のＶＬ配列；配列番号１４８のＶＨ配列及び配列番号１５０のＶＬ配列；配列番号１４８のＶＨ配列及び配列番号１５２のＶＬ配列；配列番号１４８のＶＨ配列及び配列番号１４０のＶＬ配列；配列番号２３４のＶＨ配列及び配列番号２３５のＶＬ配列；配列番号１５４のＶＨ配列及び配列番号１５６のＶＬ配列；配列番号１５８のＶＨ配列及び配列番号１５６のＶＬ配列；配列番号１６０のＶＨ配列及び配列番号１６２のＶＬ配列；配列番号１６４のＶＨ配列及び配列番号１６６のＶＬ配列；配列番号１６８のＶＨ配列及び配列番号１７０のＶＬ配列を含む抗ヘマグルチニン抗体）。

【0330】

抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。

【0331】

典型的な競合アッセイにおいて、固定化ヘマグルチニンは、ヘマグルチニンに結合する第一の標識された抗体、及びヘマグルチニンへの結合について第一の抗体と競合する能力について試験される第二の未標識の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化ヘマグルチニンが、未標識の第二の抗体でなく、標識された第一の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。ヘマグルチニンへの第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の非結合抗体が除去され、固定化されたヘマグルチニンに結合した標識の量が測定される。もし、固定化されたヘマグルチニンに結合した標識の量が、対照サンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、ヘマグルチニンへの結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。

【0332】

２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗ヘマグルチニン抗体及びその断片を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンへ特異的に結合すること、Ａ型インフルエンザウイルスを中和すること等を含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体、及び抗体又はその断片を含む組成物もまた提供される。

【0333】

所定の実施態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。このようなアッセイの例示的な記述については、実施例４、５、６、７、８、９、１０，及び１３を参照。

【0334】

Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、一以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ヘマグルチニン抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0335】

一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、第５７１４５８６号、第５７３９１１６号、第５７６７２８５号、第５７７０７０１号、第５７７０７１０号、第５７７３００１号、及び第５８７７２９６号を参照；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)）；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含む一以上の薬物とコンジュゲートしている。

【0336】

その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。

【0337】

その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例として、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、及びＬｕの放射性同位元素を含む。検出のためにコンジュゲートを使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば、再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。

【0338】

抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al. Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。

【0339】

本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。

【0340】

Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施態様において、本明細書で提供される抗ヘマグルチニン抗体の何れかは、生物学的サンプル中のヘマグルチニン又はＡ型インフルエンザウイルスの存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的サンプルは、例えば、肺、上気道、鼻管、血液、痰などの細胞若しくは組織を含み、又は鼻若しくは咽喉スワブによって得られた生物学的サンプルを含む。

【0341】

一実施態様において、診断又は検出の方法において使用のための抗ヘマグルチニン抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のヘマグルチニン又はＡ型インフルエンザウイルスの存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様において、本方法は、抗ヘマグルチニン抗体のヘマグルチニンへの結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ヘマグルチニン抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体が抗ヘマグルチニン抗体とヘマグルチニンとの間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、例えばヘマグルチニンが患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ヘマグルチニン抗体が抗ヘマグルチニン抗体を用いた治療に好適な被検体を選択するために使用される。

【0342】

本発明の抗体を用いて診断され得る例示的な障害は、子供、幼児、成人、及び高齢者におけるＡ型インフルエンザウイルス感染を含む、Ａ型インフルエンザウイルス感染を含む。

【0343】

ある実施態様において、標識された抗ヘマグルチニン抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。

【0344】

Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗ヘマグルチニン抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される一以上の担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980)）とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。

【0345】

典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。

【0346】

本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、更に、ノイラミニダーゼ阻害剤、抗ヘマグルチニン抗体、抗Ｍ２抗体などを提供することが望ましい場合がある。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。

【0347】

活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンなどの調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。

【0348】

徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形をしている。

【0349】

インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。

【0350】

Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供される抗ヘマグルチニン抗体のいずれかを、治療方法で使用することができる。

【0351】

一態様では、医薬として使用するための抗ヘマグルチニン抗体が提供される。更なる態様において、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療、予防、又は抑制における使用のための抗ヘマグルチニン抗体が提供される。ある実施態様において、治療の方法に使用される抗ヘマグルチニン抗体が提供される。所定の実施態様において、本発明は、個体に抗ヘマグルチニン抗体の有効量を投与することを含む、Ａ型インフルエンザウイルス感染を有する個体を治療する方法における使用のための抗ヘマグルチニン抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス膜と感染細胞のエンドソーム膜との間のヘマグルチニン媒介性融合を、予防、抑制、又は減少させ、従って、感染細胞の細胞質へのウイルスＲＮＡの侵入を阻止し、感染の更なる伝播を阻止することにおいて使用のための抗ヘマグルチニン抗体を提供する。ある実施態様において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染を予防、抑制、又は治療するために、抗ヘマグルチニン抗体の有効量を個体に投与することを含む、Ａ型インフルエンザウイルス感染を予防、抑制、又は治療する方法における使用のための抗ヘマグルチニン抗体を提供する。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。

【0352】

更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ヘマグルチニン抗体の使用を提供する。一実施態様において、医薬はＡ型インフルエンザウイルス感染の治療のためである。更なる実施態様において、本医薬は、Ａ型インフルエンザウイルス感染を有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、Ａ型インフルエンザウイルス感染を治療する方法における使用のためである。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、医薬は、Ａ型インフルエンザウイルス膜と感染細胞のエンドソーム膜との間のヘマグルチニン媒介性融合を、予防、抑制、又は減少させ、従って、感染細胞の細胞質へのウイルスＲＮＡの侵入を阻止し、感染の更なる伝播を阻止するためである。更なる実施態様において、医薬は、Ａ型インフルエンザウイルス感染を予防、抑制、又は治療するために、医薬の有効量を個体に投与することを含む、Ａ型インフルエンザウイルス感染を予防、抑制、又は治療する方法における使用のためである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。

【0353】

更なる態様にて、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染を治療するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、このようなＡ型インフルエンザウイルス感染を有する個体に、抗ヘマグルチニン抗体の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、この方法は、本明細書に記載するように、少なくとも一の追加の治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。

【0354】

本発明は、個体（例えば、被験体又は患者）において、Ａ型インフルエンザウイルス感染を、抑制、予防、又は治療するのに有効な抗ヘマグルチニン抗体を提供する。幾つかの態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体は、個体のＡ型インフルエンザウイルス感染を予防するために、予防的に個体を治療するのに有効である。

【0355】

幾つかの態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を用いた治療に適した個体は、Ａ型インフルエンザウイルス感染に罹患しているか又は罹患していると疑われる個体である。幾つかの実施態様において、そのような抗体は、子供、幼児、成人、及び高齢者を含む。幾つかの実施態様において、個体は、Ａ型インフルエンザウイルス感染で入院している。他の実施態様において、Ａ型インフルエンザウイルス感染に罹患している個体は、一以上の併存疾患、例えば、免疫不全、妊娠、肺疾患、心臓疾患、腎疾患、又は共感染（例えば、細菌性又はウイルス性肺炎などの細菌感染症又はウイルス感染症）に罹患している。

【0356】

幾つかの態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を用いた個体の治療は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の重症度を軽減させ、Ａ型インフルエンザウイルス感染の期間を減少させ、又はＡ型インフルエンザウイルス感染性を低下させる。他の態様では、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を用いたＡ型インフルエンザウイルス感染の治療は、入院期間の短縮、集中治療室（ＩＣＵ）使用の必要性（ＩＣＵ）の低下又は防止、補助された又は機械的換気の必要性の低下又は防止、補給用酸素使用の必要性の低下又は防止及び死亡率の低下を含む、付加的な利点を提供する。幾つかの態様において、入院期間の減少は、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、又は５日以上である。幾つかの態様において、集中治療室（ＩＣＵ）使用の必要性（ＩＣＵ）の低下は、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、又は５日以上である。幾つかの態様において、補助された又は機械的換気の必要性の低下は、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、又は５日以上である。幾つかの態様において、補給用酸素使用の必要性の低下は、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、又は５日以上である。幾つかの態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を用いた個体の治療は、Ａ型インフルエンザウイルス感染疾患の症状、例えば、発熱、鼻炎、悪寒、喉の痛み、筋肉痛、体の痛み、頭痛、咳、鼻づまり、脱力感又は疲労、チカチカ痛む目又は流涙、及び一般的な不快感などを軽減させる。

【0357】

幾つかの態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を用いた個体の治療は、呼吸数の正常化までの時間の短縮又は酸素飽和度の正常化までの時間の短縮など、呼吸機能の正常化までの時間を短縮させる。幾つかの態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を用いた個体の治療は、補給用酸素投与を行わないで２４時間にわたって測定される場合、通常の酸素飽和度に戻る時間、例えば、約９２％以上の酸素飽和度までの時間を短縮する。他の態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を用いた個体の治療は、心拍数、血圧、呼吸数、及び体温などのバイタルサインの正常化までの時間を短縮させる。

【0358】

幾つかの態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体を用いた個体の治療は、例えば、インフルエンザウイルスの力価などのウイルス学的評価項目を改善する。ウイルス力価は、当業者に周知の種々の方法、例えば、ｑＰＣＲ又は組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって測定される場合、例えばウイルスの曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定することができる。幾つかの実施態様において、治療は、ｑＰＣＲ又はＴＣＩＤ５０により測定される場合、ウイルスのＡＵＣにおいて５０％以上の減少をもたらす。

【0359】

本発明の様々な態様において、本明細書中に提供される抗ヘマグルチニン抗体は、症状の発症（例えば、病気の発症）後、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、及び約９６時間で投与された場合、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療において有効である。他の態様において、本明細書中に提供される抗ヘマグルチニン抗体は、症状の発症後約２４時間から４８時間の間に投与される場合（例えば、個体は２４時間から４８時間症候性である）、症状の発症後約４８時間から７２時間の間に投与される場合、又は症状の発症後約７２時間から９６時間の間に投与される場合、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療において有効である。本発明のある実施態様において、本発明の抗ヘマグルチニン抗体は、Ａ型インフルエンザウイルス感染を治療すること又は減少させることに有効であり、症状の発症後４８時間を超えて、現在の標準治療（例えば、オセルタミビル）の治療ウィンドウを拡張する。

【0360】

更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗ヘマグルチニン抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ヘマグルチニン抗体のいずれか、及び薬学的に許容される担体を含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ヘマグルチニン抗体のいずれかと、例えば後述されるような少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。

【0361】

本発明の抗体は、治療において、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも一の追加の治療剤と同時投与され得る。ある実施態様において、追加の治療剤は、ノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、ザナミビル、リン酸オセルタミビル、アマンタジン、リマンタジン）、抗Ｍ２抗体、抗ヘマグルチニン抗体などである。幾つかの態様において、ノイラミニダーゼ阻害剤と同時投与される、本発明の抗ヘマグルチニン抗体による、Ａ型インフルエンザウイルスに罹患した個体の治療は、何れかの薬剤単独での治療と比較して、相乗的な治療効果を提供する。

【0362】

上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療又は薬剤の投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。一実施態様において、抗ヘマグルチニン抗体の投与、及び追加の治療剤の投与は、お互いに、約１カ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、約１、２、３、４、５、若しくは６日以内、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１６、２０、２４時間以内に生じる。

【0363】

本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、及び鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。

【0364】

本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。

【0365】

疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体の約１μｇ／ｋｇから４５ｍｇ／ｋｇ（例えば１．０ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。一つの典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。抗体の例示的な用量は、約１．０ｍｇ／ｋｇから約４５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約１．０ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。このように、約１．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、又は４５ｍｇ／ｋｇの一又は複数（又はその何れかの組合せ）の用量が、患者に投与されうる。このような用量は、例えば、毎日、２日毎、３日毎など、間欠的に投与することができる。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与されても良い。投薬は、例えば、２００ｍｇ、４００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、１０００ｍｇ、１２００ｍｇ、１４００ｍｇ、１５００ｍｇ、１６００ｍｇ、１８００ｍｇ、２０００ｍｇ、２２００ｍｇ、２４００ｍｇ、２５００ｍｇ、２６００ｍｇ、２８００ｍｇ、３０００ｍｇ、３２００ｍｇ、３４００ｍｇ、３６００ｍｇなど固定用量とすることも可能である。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。

【0366】

上記の製剤又は治療方法の何れかが、抗ヘマグルチニン抗体の代わりか又は抗ヘマグルチニン抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。

【0367】

Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ液バッグ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；及び（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。

【0368】

上記の製造品の何れかは、抗ヘマグルチニン抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。

【実施例】

【0369】

ＩＩＩ．
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。

【0370】

実施例１：ファージディスプレイによる抗ヘマグルチニン抗体の同定
インフルエンザウイルスワクチン接種したヒトドナーからのファージライブラリーの構築
Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに対する抗体は、以下のように季節性インフルエンザウイルスワクチンを接種されたヒトドナーから単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から構築されたファージディスプレイライブラリーを用いて同定された。

【0371】

供血７日前に季節性インフルエンザＦｌｕｖｉｒｉｎ（登録商標）ワクチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｌｏｔ＃１１１７９６Ｐ１）を接種された正常なヒトのドナーからのロイコパック（Ｌｅｕｋｏｐａｃｓ）は、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｃｉｆｉｃ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から入手された。ＰＢＭＣは、標準的な方法論を用いてロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｓ）から単離された。ＰＢＭＣは、ＦＡＣＳにより、ＣＤ１９＋／ＣＤ２０⁻形質芽球細胞に対して選別された。ＣＤ１９＋／ＣＤ２０⁻選択型形質芽細胞からのＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して抽出され、ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して逆転写により単離されたＲＮＡから生成された。ヒト可変重鎖（ＶＨ）、可変カッパ（ＶＫ）、及び可変軽鎖（ＶＬ）遺伝子は、以下のバック（ｂａｃｋ）及びフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）ＤＮＡプライマー混合物を用いて、ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅された。

【0372】

【0373】

得られた増幅されたｃＤＮＡ産物は、以下の重複プライマーを用いて、オーバーラップＰＣＲを使用してｓｃＦｖへと組み立てられた。

【0374】

【0375】

精製されたｓｃＦｖ ｃＤＮＡ断片（１μｇ）及びファージミドベクターｐ２０５６ＢＮＮ（２μｇ）は、ＢｓｓＨＩＩ及びＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を用いて消化された。ファージミドベクターｐ２０５６ＢＮＮは、ＢｓｓＨＩＩ、Ｎｈｅｌ、及びＮｃｏｌ制限部位を含むように操作された、ｐＳ２０２５ｅの修飾バージョンである（Sidhu et al, (2004) J Mol Biol 338:299-310）。次いで、ｓｃＦｖ ｃＤＮＡ断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｐ２０５６ＢＮＮベクターにライゲーションされた（６：１のＭ比）。得られたｃＤＮＡ／ファージライゲーション生成物はＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて精製され、エレクトロコンピテントセルＳＳ３２０大腸菌細胞に形質転換された。ファージライブラリーの大きさは、ＬＢ／カルベニシリンプレートに１：１０希釈されたライブラリー培養物の１０μｌを蒔くことによって、推定された。ライブラリー培養物はその後さらに増幅され、６０ｍｌの２ＹＴ培地の全容量中で増殖され、ファージｓｃＦｖ発現は、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージによる同時感染により誘導された。カナマイシンは、後にライブラリー培養物に添加され、３０℃で３０時間振とうしながらインキュベートされた。次いで、ライブラリー培養物は、細胞をペレット化するために、遠心分離された。ファージ−ｓｃＦｖを含有する上清を、５×ＰＥＧ／２．５ＭのＮａＣｌで沈殿させ、ＰＢＳに再懸濁した。

【0376】

抗ヘマグルチニン抗体を同定するためのファージライブラリー選別及びスクリーニング
（実施例２において、以下に記載のように生成された）Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンのＨ１及びＨ３タンパク質が、ファージライブラリーの選別のための抗原として使用された。ヘマグルチニンＨ１及びＨ３抗原が、高結合性９６ウェルマキシソーププレート上にコーティングされた。プレート及びファージライブラリーは、ファージブロッキング緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ））で予めブロックされ、室温で２時間インキュベートされた。ブロックされたファージライブラリー（１００μｌ）は、ヘマグルチニンコーティングされたウェルに添加され、３時間インキュベートされた。結合していないファージは、０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを使用して、プレートから洗浄され、結合したファージは、３０分間、１００μｌの５０ｍＭのＨＣ１と５００ｍＭのＮａＣｌを用いて溶出され、続いて１００μｌの１ＭＴｒｉｓ塩基（ｐＨ７．５）で中和された。回収されたファージを、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞中で増幅した。得られたファージを沈殿させ、ヘマグルチニンタンパク質に対するパニング／選択の別のラウンドに供された。続くパニング／選択ラウンドの間に、抗体ファージは、同一又は異なるヘマグルチニン抗原と共にインキュベートされた。プレート洗浄のストリンジェンシーは、１５回の洗浄から４０回の洗浄へと徐々に増加された。

【0377】

パニング及び選別の２〜３ラウンドの後、ヘマグルチニン特異的ファージの著しい濃縮が観察された。９６のファージクローンが、それらがヘマグルチニンＨ１及び／又はＨ３に特異的に結合したかどうかを決定するために、ライブラリー選別から選択された。ヘマグルチニンタンパク質への特異的結合を提示するファージクローンの可変領域が、固有の免疫グロブリン核酸配列を含むファージクローンを同定するために配列決定された。バックグラウンドよりも少なくとも５倍でヘマグルチニンＨ１及び／又はＨ３に結合した固有のファージ抗体が、更に特徴付けられた。目的のファージ由来のクローンは、個々のクローンのＶＬ及びＶＨ領域を、ＬＰＧ３及びＬＰＧ４発現ベクターにそれぞれクローニングすることにより、ＩｇＧに再フォーマットされ、哺乳動物２９３細胞において一過性に発現され、そしてプロテインＡカラムを用いて精製された。二つの抗体（ｍＡｂ９及びｍＡｂ２３）が、更なる分析のために同定された。（下記の実施例５を参照）。

【0378】

実施例２：形質芽細胞の濃縮及び発現
Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンに対する希な抗体を発見し、同定するために、以下の形質芽細胞の濃縮及び増殖技術が開発された。（その全体が参照により本明細書に援用される、同時係属中の特許出願、米国特許出願シリアル番号６１／７２５７６４を参照のこと）。

【0379】

供血７日前に季節性インフルエンザＦｌｕｖｉｒｉｎ（登録商標）ワクチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｌｏｔ＃１１１７９６Ｐ１）を接種された正常なヒトのドナーからのロイコパック（Ｌｅｕｋｏｐａｃｓ）は、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｃｉｆｉｃ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から入手された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、標準的な方法論を用いてロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｓ）から単離された。６から８週齢の雌ＳＣＩＤ／ベージュマウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）から購入され、実験動物管理に関する米国協会の指針（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に従って、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈで収容され、維持された。全ての実験的研究は、実験動物の管理と使用に関する指針及び関連法規に従って、ＡＡＡＬＡＣｉ認定施設におけるＧｅｎｅｎｔｅｃｈ実験動物研究の施設内動物管理使用委員会の承認の下で実施された。健常なヒトドナーからのロイコパック（Ｌｅｕｋｏｐａｃ）又は血液は、書面によるインフォームドコンセントが提供され、倫理的承認が、施設内倫理委員会から付与された後に得られた。

【0380】

インビボでの抗原駆動型形質芽細胞の濃縮及び増殖は、次のようにＰＢＭＣの脾臓内移植を用いて行われた。単離されたＰＢＭＣは、ヘマグルチニン抗原（百万Ｂ細胞の各々に対して０．１−２μｇ）と共に再懸濁され、３７℃で３０分間インキュベートされた（ＰＢＭＣ／抗原プレミックス）。このインキュベーション後、ＰＢＭＣは、非結合抗原を除去するために洗浄された。交差反応性ヘマグルチニン抗体を産生した形質芽細胞を濃縮するために、ＰＢＭＣ／抗原プレミックス及び単一細胞選別に使用されたヘマグルチニン抗原変異体が、インフルエンザＦｌｕｖｉｒｉｎ（登録商標）ワクチン中に含まれるヘマグルチニン抗原変異体と区別するために、具体的に選択された。従って、本研究で用いられたヘマグルチニン抗原は、Ａ型インフルエンザウイルス分離株Ａ／ＮＷＳ／１９３３からのＨ１ヘマグルチニン（グループ１のＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン）、Ａ型インフルエンザウイルス分離株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８／１９６８からのＨ３ヘマグルチニン（グループ２のＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン）、Ａ型インフルエンザウイルス分離株Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３からのＨ７ヘマグルチニン（グループ２のＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン）を含んでいた。ヘマグルチニン抗原は、標準的な分子生物学的技術を使用してＧｅｎｅｎｔｅｃｈで生成された。

【0381】

６−８週齢の雌のＳＣＩＤ／ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）は、セシウム１３７の供給源を使用して３５０ラドで亜致死的に照射された。ポリミキシンＢ（１１０ｍｇ／Ｌ）及びネオマイシン（１．１ｇ／Ｌ）が、照射後７日間、飲料水に添加された。照射後４時間で、各マウスの左脇腹は剃毛され、Ｂｅｔａｄｉｎｅ（登録商標）（Ｐｕｒｄｕｅ Ｐｈａｒｍａ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）と７０％アルコールで調製された。外科的処置は、無菌の外科的手順を用いて麻酔下で行われた。１ｃｍの皮膚切開が、各マウスの肋骨境界線のすぐ下でなされ、続いて腹壁及び腹膜の切開が行われた。各マウスの脾臓を慎重に露出させ、３０μｌのＰＢＳ中に再懸濁された５０Ｘ１０^６のヒトＰＢＭＣが注射された。切開部は、５−Ｏ Ｖｉｃｒｙｌ（登録商標）縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）及び外科用ステープルを使用して、筋肉層内及び皮膚において閉じられた。抗原特異的な細胞選別実験のために、マウスは、移植後８日目に屠殺され、その脾臓が採取された。

【0382】

マウスから得られた脾臓細胞の単一細胞懸濁液は、ＣＤ３８^ｈｉｇｈ／ＩｇＧ＋発現としてヒトＩｇＧ＋形質芽細胞を定義する、抗ヒトモノクローナル抗体ＣＤ３８ ＰＥＣｙ７ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）及びＩｇＧ Ｄｙｌｉｇｈｔ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）のカクテルで染色された。単離された脾臓細胞の懸濁液内のマグルチニン交差反応性形質芽細胞を同定するために、細胞は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ラベリングキット（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて、以前にそれぞれ、ＦＩＴＣ又はＰＥに結合された、Ａ型インフルエンザウイルス分離株Ａ／ＮＷＳ／１９３３からのヘマグルチニンＨ１及びＡ型インフルエンザウイルス分離株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８／１９６８からのヘマグルチニンＨ３によって染色された。

【0383】

図１Ａは、ＳＣＩＤ／ベージュマウスの濃縮の前に（即ち、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスの前に）、ワクチン接種されたＰＢＭＣの７日目からの抗ヘマグルチニン陽性形質芽細胞の代表的なＦＡＣＳデータ分析を示す。図１Ｂは、ＳＣＩＤ／ベージュマウス濃縮後の移植後の８日目からのヘマグルチニン陽性形質芽細胞の代表的ＦＡＣＳデータ分析を示し、上側及び下側のパネルはそれぞれ、プレミックス無しと抗原プレミックスとを比較している。図１Ａ及び１Ｂに示すように、脾臓内注射前のＰＢＭＣ／抗原プレミックスは、高頻度のＨ３／Ｈ１^＋抗ヘマグルチニン形質芽細胞をもたらした。

【0384】

以下の表２は、本明細書に記載するように、ＳＣＩＤ濃縮の前後における、抗Ｈ１^＋／抗Ｈ３^＋形質芽細胞の頻度の比較を示す。表２に示すように、抗Ｈ１^＋／抗Ｈ３^＋形質芽細胞の頻度は、ＳＣＩＤ／ベージュマウスの濃縮を含まないで観察されたものと比較して、本発明のＳＣＩＤ／ベージュマウスの濃縮方法を用いて大幅に増加した。

【0385】

【0386】

次いで、試料は、アリア高速セルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において、ヨウ化プロピジウム死細胞の排除の存在下で分析され、抗ヘマグルチニン特異的形質芽細胞は、５％の低ＩｇＧウシ胎児血清を補充した、５０μｌのＲＰＭＩ細胞培養培地を含む、９６ウェル組織培養プレート中に単一細胞の方法で選別された。（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）。５百万の生細胞は、全ての分析プロファイルについて記録された。プロファイルは、Ｆｌｏｗｊｏバージョン９．４．１１ソフトウェアによって分析された。

【0387】

図２は、プレミックス無し（丸）及び抗原プレミックス（四角）を比較した、確率論的応答を示す、個々のＳＣＩＤ／ベージュマウスからの、移植後８日目から得られた脾細胞の分析を示す。データは、抗Ｈ１^＋／ＣＤ３８^ｈｉｇｈ形質芽細胞のパーセントとして示されている。長方形は、抗Ｈ１^＋形質芽細胞を提示したマウスを示している。

【0388】

これらの結果は、広範なヘマグルチニン交差反応性形質芽細胞が、インフルエンザウイルスＡ型グループ１（例えば、ヘマグルチニンＨ１）及びグループ２（例えば、ヘマグルチニンＨ３、ヘマグルチニンＨ７）のヘマグルチニン抗原が、脾臓内移植の前にＰＢＭＣとインキュベートされる場合に検出されたことを示している。これらの結果は、インフルエンザワクチン接種ドナーからの、ヘマグルチニン抗原に感作されたＰＢＭＣのインビトロ刺激は、ＳＣＩＤ／ベージュマウスのレシピエント内で、形質芽細胞のヘマグルチニン抗原特異的濃縮を促進することを示していた。

【0389】

実施例３：単一形質芽細胞からのＩｇＧクローニング
（上述の）ヘマグルチニンＨ１及びＨ３交差反応性ヒト形質芽細胞は、単一細胞に選別され、約９５０の形質芽細胞をもたらした。単一形質芽細胞は、５％の低ＩｇＧ胎児ウシ血清を含む、５０μｌのＲＰＭＩを含む、Ｕ底の９６−ウェルマイクロウェルプレートに直接選別された。プレートは、６００×ｇで５分間遠心分離されＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）、培地は、注意深く吸引することにより除去された。細胞は再懸濁され、同じ手順に従って、９０μｌのＰＢＳで２回洗浄された。

【0390】

可変重鎖及び軽鎖可変をコードするｃＤＮＡを生成するために、各細胞は、２ユニットのＲＮａｓｅｏｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、０．５ｍＭの４ｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、３７．５ｍＭのＫＣ１、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｍａｒｂｌｅｈｅａｄ、ＭＡ）、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｍＭのトリスｐＨ８．３、０．２５ｐｍｏｌのＩｇＧ_１−４定常、κ鎖定常及びλ鎖定常領域特異的オリゴヌクレオチド（下を参照）及び４０ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含有する、逆転写酵素（ＲＴ）反応混合物の６μｌに再懸濁された。

【0391】

【0392】

反応物は、４５℃、５０℃、５５℃のそれぞれで、３×３０分間隔でインキュベートされた。インキュベーション後、反応混合物は、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で１５μｌまで希釈された。最初のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＩｇＧ重鎖、κ鎖及びλ鎖を増幅するために、製造業者によって提供されるプロトコルに従い、２μｌの上記の希釈ＲＴカクテル及びＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して実施された。ＰＣＲ増幅は、以下に示される、可変重鎖及び軽鎖生殖系列、及び定常領域の配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドを用いて行われた。

【0393】

【0394】

重鎖及び軽鎖のＰＣＲ増幅反応は、それぞれ以下のように二つの反応に分けられた：重鎖ファミリーのＶＨ．１，２，３（プライマーＩＧＶＨ１ａ、ＩＧＶＨ１ｂ、ＩＧＶＨ２、ＩＧＶＨ３）及びＶＨ．４，５，６，７（プライマーＩＧＶＨ４、ＩＧＶＨ５、ＩＧＶＨ６、及びＩＧＶＨ７）；κ鎖ファミリーのＶＫ．１，２，３（プライマーＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、及びＩＧＫＶ３）及びＶＫ．４，５，６（プライマーＩＧＶＫ４、ＩＧＶＫ５、及びＩＧＶＫ６）；及びλ鎖ファミリーのＶＬ．１，２，３，４，５（ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ４、及びＩＧＬＶ５）及びＶＬ．６，７，８，９（プライマーＩＧＬＶ６、ＩＧＬＶ７、ＩＧＬＶ８、及びＩＧＬＶ９）。タッチダウンＰＣＲ増幅プロトコルが、温度サイクリングのために使用された。

【0395】

反応後、ＰＣＲ増幅産物は、ＰＣＲ増幅反応物の各々からの過剰のヌクレオチド及びプライマーを除去するために、エキソヌクレアーゼ１（Ｅｘｏ）及びエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で処理された（Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｍａｒｂｌｅｈｅａｄ、ＭＡ）。最初のＰＣＲ増幅産物は、サンガー配列決定を用いて、重鎖及び軽鎖の両方の可変配列を決定するために、直接配列決定された。二回目のネステッドＰＣＲ増幅は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して哺乳動物シグナル配列及び定常領域のクローニング配列を挿入するために、生殖系列に一致した重鎖及び軽鎖可変オリゴヌクレオチドを使用して行われた。

【0396】

【0397】

ＰＣＲ増幅反応は、ＧＣを用いるＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を使用して、製造業者の推奨に従って、設定された。ＰＣＲ増幅反応後、増幅産物は、上記のようにＥｘｏ／ＳＡＰにより処理された。可変重鎖及び可変軽鎖をコードするＰＣＲ増幅産物は、制限エンドヌクレアーゼを含まない手順を使用して、哺乳動物発現ベクターに挿入された。２０μｌのＰＣＲ増幅産物が、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発プロトコルを使用して、ＩｇＧ１、κ、及びλ鎖の一本鎖ＤＮＡのヒト鋳型にアニールされた。（Kunkel(1985)PNAS 82:488-492を参照）。正確に挿入された構築物は、ＤＮＡ配列決定により確認された。重鎖及び軽鎖をコードする核酸を含有するプラスミドが、一過性発現のために、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、２９３Ｔヒト胚腎臓細胞中に同時導入され、下の実施例４に記載されるように、発現及び結合ついて分析された。

【0398】

実施例４：ヘマグルチニンのＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ
上記のように得られたモノクローナル抗ヘマグルチニン抗体の、様々なヘマグルチニンサブタイプに結合する能力が、以下のようにＥＬＩＳＡによって試験された。上記のように、ヘマグルチニンを発現する様々なプラスミドが、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた。これらは、Ａ型インフルエンザウイルスの、ＨＩＮｌ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１９１８からのヘマグルチニンＨ１、Ｈ３Ｎ２／Ｐｅｒｔｈ／２００９からのヘマグルチニンＨ３、Ｈ５Ｎ ｌ／Ｖｉｅｔ／２００４からのヘマグルチニンＨ５、及びＨ７Ｎ７／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２００３からのヘマグルチニンＨ７を含んでいた。２日後、細胞は、５０ｍＭトリス、ｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００＋プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）中に溶解された。核は、遠心分離により清澄化され、得られた溶解物は−８０℃で保存された。

【0399】

ＥＬＩＳＡスクリーニングのために、３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）は、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのスノードロップレクチン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた。プレートは洗浄され、次いで、様々な発現されたヘマグルチニンを含む細胞溶解物の希釈物でコーティングされた。プレートは洗浄され、抗ヘマグルチニン抗体の様々な希釈物、その後ヤギ抗ヒトＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともにインキュベートされた。プレートは洗浄され、ＴＭＢ（３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン）基質の検出のために処理された。

【0400】

およそ９５０の形質芽細胞は、上の実施例２に記載される単一細胞選別から得られた。このうち、８４０のモノクローナル抗体が、一過性に２９３Ｔ細胞で発現され、ヘマグルチニンサブタイプＨ１、Ｈ３、Ｈ５、及びＨ７への結合についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングされ、Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１又はグループ２のヘマグルチニンに結合した８２のモノクローナル抗体、及びＡ型インフルエンザウイルスのグループ１とグループ２のヘマグルチニンの両方に結合した２０のモノクローナル抗体を生じた。

【0401】

実施例５：インビトロでのＡ型インフルエンザウイルスの中和
広範なヘマグルチニンサブタイプへの結合性、及びインビトロにおける、インフルエンザＡ型のグループ１とグループ２のウイルスの分離株のパネルの中和を誘発する、本発明の抗ヘマグルチニン抗体の能力が、以下のように調べられた。

【0402】

ＭＤＣＫ細胞を、透明底イメージングプレート付きの黒９６ウェル（Ｃｏｓｔａｒ ３９０４）中で、１０％ＦＢＳを単一の２５％のコンフルエントな単層として補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。各Ａ型インフルエンザウイルスサブタイプ／株は、インフルエンザ培地中で（ＤＭＥＭ＋０．２％ＢＳＡ、２μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理されたトリプシン）ＭＯＩが１まで希釈され、そして各抗体の種々の濃度（０．０２ｎＭから１６００ｎＭの範囲）で３７℃で１時間インキュベートされた。各抗体／インフルエンザウイルス混合物は、５％ＣＯ_２インキュベーター中で、３７℃で１６時間、ＭＤＣＫ細胞に感染させ、その後、細胞は冷却した１００％エタノールで細胞を固定化された。
固定化細胞は、次いで、細胞核を可視化し、総細胞数を決定するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃Ｈ３５７０）で染色された。細胞はまた、感染した細胞の数を決定するために、Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質に特異的な広範に反応性のモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ＃ＭＡＢ８２５８）で染色された。

【0403】

細胞は、Ｉｍａｇｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して画像化され、データ画像はＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ３．１ソフトウェアを用いて分析された。感染細胞の割合は測定され、Ｘ軸上のＬｏｇ１０抗体濃度に対してＹ軸上にプロットされた。全ての中和アッセイは三通りに完了された。データは、非線形回帰用量応答曲線を用いて適合され、図３に、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）による、ｎＭでのＩＣ_５０値として示されている。

【0404】

各Ａ型インフルエンザウイルス株のヘマグルチニン（ＨＡ）サブタイプは、図３に示す表に提供される。

【0405】

インビトロでの中和の用量反応曲線は、インフルエンザＡ型グループ１ウイルス株とグループ２ウイルス株の広範なパネルに対して、本明細書に記載のモノクローナル抗体の様々な濃度を用いて作製された。図４Ａ及び４Ｂは、インフルエンザＡ型グループ１ウイルス株とグループ２ウイルス株のパネルに対する、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の中和曲線をそれぞれ示している。図４Ａ及び４Ｂに示すように、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）は、試験されたＡ型インフルエンザウイルス株のインビトロでの中和において有効であった。（図３も参照）。更に、図５Ａ及び５Ｂは、インフルエンザＡ型グループ１ウイルス株とグループ２ウイルス株のパネルに対する、ｍＡｂ ８１．３９ ＳＶＳＨ−ＮＹＰ（配列番号１７１として開示された「ＳＶＳＨ」）の中和曲線をそれぞれ示している。図５Ａ及び５Ｂに示すように、ｍＡｂ ８１．３９ ＳＶＳＨ−ＮＹＰ（配列番号１７１として開示された「ＳＶＳＨ」）は、試験されたＡ型インフルエンザウイルス株のインビトロでの中和において有効であった。（図３も参照）。

【0406】

本発明の４つの抗ヘマグルチニン抗体（具体的には、ｍＡｂ ３９．１８ Ｂ １１、ｍＡｂ ３６．８９、ｍＡｂ９．０１Ｆ３、及びｍＡｂ２３．０６Ｃ２）は、グループ１又はグループ２のインフルエンザウイルス株の何れかの、しかし両方ではなく、インビトロでの中和に有効であった。具体的には、ｍＡｂ ３９．１８ Ｂ１１は、調べられたグループ１のＡ型インフルエンザウイルスパネル全体のインビトロでの中和に有効であったが、グループ２のＡ型インフルエンザウイルス株を中和することはできなかった。（図６及び図３を参照）。逆に、ｍＡｂ ３６．８９、ｍＡｂ９．０１Ｆ３、及びｍＡｂ２３．０６Ｃ２は、調べられたグループ２のＡ型インフルエンザウイルスパネル全体を中和することができたが、試験されたグループ１のＡ型インフルエンザウイルス分離株を中和することはできなかった。（ｍＡｂ ３６．８９、ｍＡｂ９．０１Ｆ３、及びｍＡｂ２３．０６Ｃ２についてのインビトロ中和曲線を示している、図７、図８、及び図９を参照；図３も参照のこと）。

【0407】

まとめると、これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体は、インビトロで、様々なＡ型インフルエンザウイルス分離株／株を、用量依存的に中和することができることを示した。更に、これらの結果は、本明細書に記載される形質芽細胞の濃縮方法は、９５０の単離された形質芽細胞のみから、グループ１及びグループ２のＡ型インフルエンザウイルス株の両方を中和することができるモノクローナル抗体の同定をもたらすことを示していた。

【0408】

Ｈ５Ｎ１Ａ型インフルエンザウイルスを中和することにおいて、本発明の抗体の有効性を試験するために、ヘマグルチニンＨ５を発現するように操作された偽型ウイルスを使用して、インビトロでの中和実験も行われた。特に、Ｈ５ヘマグルチニン表面タンパク質を有するＨＩＶ偽型ウイルスは、２９３Ｔ細胞上のｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１との中和について、以下のように試験された。Ｈ５偽型ウイルスは、３つのプラスミド：Δ８．９、ＦＣＭＶ−ＧＦＰ、及び、Ａ型インフルエンザウイルス分離株Ｈ５Ｎ１／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からのヘマグルチニンＨ５を発現するプラスミドによる２９３Ｔ細胞の同時導入により生成された。ウイルスは、２０％スクロースを使用した超遠心によって精製された。感染のために、偽型ウイルスは、９６ウェルプレートで培養された標的の２９３Ｔ細胞を添加する前に、様々な量のｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１と共にインキュベートされた。２日後、感染した細胞の数は、ＧＦＰ陽性細胞を計数することにより決定された。感染は、使用される最小の抗体濃度で、感染した細胞の数に対して正規化された。結果を図１０に示す。図１０に示すように、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１は、ヘマグルチニンＨ５表面タンパク質を発現する偽型ウイルスに対して用量依存性のインビトロ中和を示した。これらのデータは、本発明の抗体は、Ｈ５Ｎ１Ａ型インフルエンザウイルス株の治療及び予防に有効であることを示唆した。

【0409】

ウマインフルエンザウイルスは、以下のように、インビトロで中和活性を示す本発明の抗体の能力について試験された。Ｈ７Ｎ７ Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／１／Ｐｒａｇｕｅ／５６Ａ型インフルエンザウイルスを、高度の感染性を達成するまで、ＭＤＣＫ細胞に感染させた。得られた、Ｈ７Ｎ７ Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／１／Ｐｒａｇｕｅ／５６Ａ型インフルエンザウイルスは、（ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１について上述される方法を使用して）ＭＤＣＫ細胞における中和アッセイにおいて使用された。これらの実験の結果は図１１に示される。図１１に示すように、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）は、ヘマグルチニンＨ７表面タンパク質を発現するＨ７Ｎ７ Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／１／Ｐｒａｇｕｅ／５６インフルエンザウイルスに対して、用量依存性のインビトロでの中和を示した。

【0410】

まとめると、これらの結果は、本発明の抗ヘマグルチニン抗体は、様々なＡ型インフルエンザウイルス株に対する用量依存性の中和活性を示すことを示した。具体的には、２つの抗ヘマグルチニン抗体（ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）及びｍＡｂ ８１．３９ ＳＶＳＨ−ＮＹＰ（配列番号１７１として開示された「ＳＶＳＨ」）は、グループ１のＡ型インフルエンザウイルス株（Ａ／ＣＡ／７／２００９、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ／３／２００６、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ａ／ＰＲ／８／１９３４、及びＡ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７）及びグループ２のＡ型インフルエンザウイルス株（ＡＶｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／１９７５、Ａ／Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／１９７３、Ａ／ＨＫ／８／１９６８、及びＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８）の両方の中和を含む、調べられた全てのＡ型インフルエンザウイルス株を中和することにおいて有効であった。

【0411】

さらに、これらの結果は、本発明の抗ヘマグルチニン抗体（例えば、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）（図４Ａ及び４Ｂ）及びｍＡｂ ８１．３９ ＳＶＳＨ−ＮＹＰ（配列番号１７１として開示された「ＳＶＳＨ」）（図５Ａ及び５Ｂ））は、様々な異なる季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株、Ｈ３Ｎ２Ａ型インフルエンザウイルス株、Ｈ２Ｎ２Ａ型インフルエンザウイルス株、１９５７年の日本でのパンデミックに関連付けられているＡ型インフルエンザウイルス株（Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７）の中和において有効であることを示していた。これらの結果は、本発明の抗体は、季節性インフルエンザウイルス感染及びインフルエンザパンデミックに関連したＡ型インフルエンザウイルス株の治療及び予防に有効であることを示していた。

【0412】

実施例６：マウスにおけるｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）のインビボ有効性
マウスにおけるＡ型インフルエンザウイルス感染に対する、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）のインビボ有効性は以下のように行われた。ＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）は、インフルエンザ培地（ＤＭＥＭ、０．２％ＢＳＡ、２μｇ／ｍＬ ＴＰＣＫ−処置トリプシン）で希釈された様々なＡ型インフルエンザウイルス株の５０μｌにより、最小のＬＤ_１００用量で、経鼻的に感染させた。ある範囲のインビトロでのＩＣ_５０値を示す、４つの異なるＡ型インフルエンザウイルス株が、Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ＩＣ_５０ ２．０ｎＭ）、マウスあたり４０ＰＦＵで使用；Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８（ＶｉｒａＰｕｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ＩＣ_５０ ４５．１ｎＭ）、マウスあたり３ＰＦＵで使用；Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／１９７３（ＶｉｒａＰｕｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ＩＣ_５０ ２．２ｎＭ）、マウスあたり１．５×１０^４ＰＦＵで使用；及びＨ３Ｎ２ Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（ＶｉｒａＰｕｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ＩＣ_５０ ３５ ｎＭ）、マウスあたり２×１０ＰＦＵで使用；を含む、この実験のシリーズにおいて使用された。インフルエンザウイルス感染は、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の静脈内投与の前に、７２時間進行させた。

【0413】

Ａ型インフルエンザウイルス感染後７２時間後、様々な量のｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）が、ＰＢＳ２００μｌ中、９００μｇ／マウス（およそ４５ｍｇ／ｋｇ）、３００μｇ／マウス（およそ１５ｍｇ／ｋｇ）、及び１００μｇ／マウス（およそ５ｍｇ／ｋｇ）の用量で、マウスに静脈内投与された。対照の処置動物は、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の試験された最高の等価な用量（即ち、およそ４５ｍｇ／ｋｇ）で、ｍＡｂ ｇＤ５２３７（単純ヘルペスウイルスのＤ糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体（ＨＳＶ））を投与された。マウスは、感染後２１日目まで、身体状態と生存について毎日モニターされ、また、毎日体重が測定された。全てのｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）投与対全ての４つのＡ型インフルエンザウイルス株に感染した対照は、Ｐ＜０．０１のログランク検定を与えた。

【0414】

図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ及び１２Ｄは、Ａ型インフルエンザウイルスのＡ／ＰＲ／８／１９３４、Ａ／Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／１９７３、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８，及びＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８のそれぞれに感染後、７２時間で、様々な量のｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）を投与されたマウスのパーセント生存率（経時的、日数で）を示す。図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ及び１２Ｄに示されるように、１００％の死亡率が、対照抗体を投与された感染したマウスにおいて１４日目で観察された。しかし、本発明のモノクローナル抗体を投与された、感染したマウスは、生存率の増加を示した。特に、１００％生存率は、インフルエンザウイルス Ａ／Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／１９７３又はインフルエンザウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８により感染されたマウスにおいて、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の全用量で観察された。（図１２Ｂ及び１２Ｄを参照）。

【0415】

これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体は、種々のＡ型インフルエンザウイルス感染を治療するのに有効であることを示した。更に、これらのデータは、本発明のモノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザウイルス感染後少なくとも７２時間までに投与された場合に、Ａ型インフルエンザウイルス感染を治療するのに有効であることを示した。

【0416】

実施例７：マウスにおけるｍＡｂ３９．２９ ＮＣｖ１のインビボ有効性
マウスにおけるｍＡｂ３９．２９ ＮＣｖ１のインビボ有効性を試験するために、抗体は、ある範囲のインビトロでＩＣ_５０値を示す、４つの異なるＡ型インフルエンザウイルス分離株を感染させたマウスに静脈内投与された。ＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）は、インフルエンザ培地（ＤＭＥＭ、０．２％ＢＳＡ、２μｇ／ｍＬ ＴＰＣＫ処置トリプシン）に希釈された異なるＡ型インフルエンザウイルス株の５０μｌにより、最小のＬＤ_１００用量で、経鼻的に感染させた。

【0417】

一組の実験では、Ａ型インフルエンザウイルス分離株Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＰＲ１９３４が、マウス当たり４０ＰＦＵで使用された。感染後７２時間で、抗ヘマグルチニンｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１は、２００μｌのＰＢＳ中に、およそ１５ｍｇ／ｋｇ、およそ５ｍｇ／ｋｇ、およそ１．７ｍｇ／ｋｇ、又はおよそ０．５６ｍｇ／ｋｇで、静脈内投与された。対照処置動物は、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１のの試験された最高の等価な用量で、ＨＳＶのＤ糖タンパク質に特異的である、ｍＡｂ ｇＤ５２３７を与えられた。マウスは、感染後２１日目まで、身体状態と生存についてモニターされ、また、体重が測定された。

【0418】

Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＰＲ／８／１９３４感染マウスにおいて、マウスあたり１５ｍｇ／ｋｇでのｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１の単回静脈内投薬は、対照ＩｇＧ抗体で観察されたものと比較して有効であった。（図１３を参照）。具体的には、１００％の死亡率は、１２日目までに対照治療群において観察されたが、一方、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１の１５ｍｇ／ｋｇの単一用量は、感染したマウスの８７．５％を救った。ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１のマウスあたり１００μｇの三倍低い用量（およそ５ｍｇ／ｋｇ）は、いくばくかの有効性を示し、動物の２５％を致死的攻撃から守ることができたが、およそ１．７ｍｇ／ｋｇ又はおよそ０．５６ｍｇ／ｋｇの用量では、対照処置群で観察されたものを超えて、最小限の有効性を示した。（図１３を参照）。

【0419】

別の組の実験では、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１のインビボでの有効性は、Ａ／ＰＲ８／１９３４よりも１０倍高いインビトロでのＩＣ_５０を有する、マウス適合型Ｈ３Ｎ２ Ｈｏｎｇ ＫｏｎｇＡ型インフルエンザウイルス株（Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８）に対して調べられた。上述の以前の実験で観察されたように、Ａ型インフルエンザウイルス感染後、対照抗体で処置されたマウスは、１２日目までに１００％の死亡率を示した。（図１４を参照）。ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１のおよそ４５ｍｇ／ｋｇ又はおよそ１５ｍｇ／ｋｇでの単一用量は、それぞれマウスの８７．５％及び７５％を守ることができた。Ａ／ＰＲ８／１９３４及びＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８Ａ型インフルエンザウイルス感染モデルの両方における、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１のインビボでの１５ｍｇ／ｋｇの最小有効用量は、これらの２つの株の間で、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１のインビトロでのＩＣ_５０値に観察された対比にもかかわらず、非常に類似している。（図３及び図１４を参照）。

【0420】

ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１のインビボでの有効性を更に探究するために、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１の用量漸増が、２つの更なるＡ型インフルエンザウイルス株；Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ（Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／１９７３）及びＡｉｃｈｉ （Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８）に対して試験された。
ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１は、２．９ｎＭのＰｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓに対してインビトロでのＩＣ_５０を有し、それはＡ／ＰＲ８／１９３４のそれと非常に類似しており、一方、Ａｉｃｈｉは、３５．０ｎＭのインビトロのＩＣ５０を有し、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８のそれと近接した値である。図１５及び図１６に示すように、１００％の死亡率は、対照処置動物において、Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ及びＡｉｃｈモデルのそれぞれに対して、１２日目及び１０日目までに観察された。モノクローナル抗体３９．２９ ＮＣｖ１は、試験した全ての用量（例えば、４５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１．７ｍｇ／ｋｇ）で、両方のＡ型インフルエンザウイルス株に対して非常に有効性を示した。

【0421】

これらのデータは、一部に、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１のインビトロでのＩＣ_５０とインビボでの最小有効用量との間にほとんど相関は存在しないことを示唆した。それにもかかわらず、感染後７２時間で静脈内投与された１５ｍｇ／ｋｇの単回投与は、これらのインフルエンザウイルス株に対するインビトロＩＣ_５０値の範囲にもかかわらず、４つ全てのＡ型インフルエンザウイルスのマウスモデルで有効であった。

【0422】

実施例８：マウスにおける重度のＡ型インフルエンザウイルス感染におけるｍＡｂ３９．２９及びオセルタミビルのインビボでの有効性
マウスにおいて、本発明の抗ヘマグルチニン抗体の有効性とリン酸オセルタミビル（タミフル（登録商標））のそれとを比較するために、以下の研究が行われた。６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）は、致死量の１００倍（５×１０^４ ＰＦＵ／マウス）での５０μｌのＨ１Ｎ１ Ａ／ＰＲ／８／１９３４により、経鼻的に感染させられた。感染後４８時間で、抗ヘマグルチニン抗体 ３９．２９（ｍＡｂ ３９．２９ Ｄ８Ｃ２とｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の５０：５０混合物）が、２００μｌのＰＢＳ中でおよそ１５ｍｇ／ｋｇ又は対照ＩｇＧの単一用量として静脈内投与された。これらの実験において、５日間１日２回（ＢＩＤ）２ｍｇの投与からなるオセルタミビルの投薬レジメンは、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の単回の３００μｌｇの静脈内投与量（〜１５ｍｇ／ｋｇ）と比較された。ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）又はオセルタミビル対対照のログランク検定はｐ＜０．０１を与え、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）対オセルタミビルの最大尤度検定はｐ＜０．０５を与えた。（オセルタミビル（即ち、タミフル（登録商標））は、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃａｔ． Ｎｏ． ０７０１０００．から入手された）。

【0423】

図１７に示すように、１００％の死亡率は、対照のＩｇＧ（ｍＡｂ ｇＤ５２３７）で処置された動物において９日目までに観察された。オセルタミビルによる５日間のＢＩＤ処置のみが、マウスの３７．５％を致死から守った。しかしながら、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）混合物の１５ｍｇ／ｋｇの単回投与量は、致死性のＡ型インフルエンザウイルスの曝露から感染した動物の８７．５％を守った。（図１７を参照）。ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）混合物の１５ｍｇ／ｋｇの単回投与量は、Ａ型インフルエンザウイルスにより重篤に感染したマウスにおいて、オセルタミビルよりも良好に機能した。

【0424】

これらの結果は、本発明のモノクローナル抗体の単一用量は、オセルタミビルによる５日間の処置よりも、Ａ型インフルエンザウイルス感染を治療することにおいていっそう有効であることを示した。

【0425】

実施例９：オセルタミビルの同時投与を含む場合及び含まない場合の、マウスにおけるｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）のインビボ有効性
オセルタミビルの投与は、症状の発症後４８時間以内に与えられた場合、ヒトＡ型インフルエンザウイルス感染を低減させるのに有効である。不幸なことに、オセルタミビルは、４８時間以上症候性であった患者では、最小限の有効性を示している。従って、本発明のモノクローナル抗体とオセルタミビルの同時投与は、何れかの治療単独に対して改善された有効性を示すかを試験するために以下の実験が実施された。
これらの実験は、実施例８に上述される重篤なマウスインフルエンザ感染モデルを用いて行われた。簡潔には、雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、Ａ／ＰＲ／８／１９３４の１００倍致死量（５×１０^４ｐｆｕ）で感染させられた。ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の１００μｇ（およそ６ｍｇ／ｋｇ、以前に決定された準有効用量）の単一用量、対照ＩｇＧ、オセルタミビル２ｍｇを１日２回（ＢＩＤ）、又はｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の単一用量と５日間のオセルタミビル処置の組合せの静脈内投与の７２時間前に、組合せ処置対ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）又はオセルタミビルのログランク検定は、ｐ＜０．０１を与えた。

【0426】

予想されるように、ＩｇＧで処置された動物は、感染後９日目で１００％の死亡率を示した。（図１８を参照）。対照で処置された動物で観察された致死率は、オセルタミビルのみ又はｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の準有効量を受けたグループと非常に類似していた。しかしながら、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＷＰＰ（配列番号１７７として開示された「ＮＷＰＰ」）の準有効量＋オセルタミビルの同時投与は、何れかの処置単独で観察されたものに比べて、生存率を著しく改善し、８７．５％の生存率をもたらした。（図１８を参照）。

【0427】

これらの結果は、オセルタミビル、ノイラミニダーゼ阻害剤と組合わせて使用される本発明のモノクローナル抗体を使用した併用療法の間に、Ａ型インフルエンザウイルス感染の処置への相乗効果が生じることを示した。

【0428】

実施例１０：本発明の抗ヘマグルチニン抗体は、フェレットＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス感染モデルにおいて、オセルタミビルよりも良好に機能する。
フェレットのＡ型インフルエンザウイルス感染モデルは、多くの場合、抗インフルエンザ治療薬の予防的及び治療的有効性を調べるために使用される。フェレットはヒトＡ型インフルエンザウイルス感染に対する臨床的に関連する動物モデルと考えられている。（Matsuoka et al., (2009) Current Protocols in Microbiology, Chapter 15, Unit 15G 12を参照）。

【0429】

フェレットにおいてＨ５Ｎ１Ａ型インフルエンザウイルスのヒト分離株に対するｍＡｂ ３９．２９ Ｄ８Ｃ２ 及びｍＡｂ ８１．３９ Ｂ１Ｃ１のインビボ有効性を調べるために、以下の研究が実施された。フェレットＨ５Ｎ１研究は、Ｌｏｖｅｌａｃｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、ＮＭ）にて契約に基づいて完了された。雄のフェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ ｐｕｔｏｒｉｕｓ ｆｕｒｏ）は、強毒性Ｈ５Ｎ１ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４Ａ型インフルエンザウイルス株の１×１０ｐｆｕ（ＬＤ９０用量）の鼻腔内投与量で曝露された。動物は、静脈内投与による抗体、又は強制経口投与によるオセルタミビル（タミフル（登録商標））を受ける４８又は７２時間前に感染された。対照で処置された動物は、ｍＡＢ ｇＤ５２３７、ＨＳＶのＤ糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体の２５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与量を受けた。抗インフルエンザ処置された動物は、インフルエンザウイルス感染後、４８又は７２時間後に、３９．２９ Ｄ８Ｃ２又はｍＡｂ ８１．３９ Ｂ１Ｃ１の何れかの２５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与量を受けた。各抗体投与群は、１０匹のフェレットを含んだ。オセルタミビルで処置された動物は、５日間、２５ｍｇ／ｋｇの経口投与を１日２回受けた。動物は、体重減少、発熱、及び身体状態について毎日モニターされた。

【0430】

Ｈ５Ｎ１感染と一致して、感染したフェレットの大部分は、感染後４８時間までに上気道疾患の初期徴候を示した。Ｈ５Ｎ１の致死量により予想されるように、陰性対照抗体処置群は、接種後１４日までに９０％の死亡率を示した。（図１９Ａ及び１９Ｂを参照）。

【0431】

対照的に、インフルエンザウイルス感染後４８又は７２時間の何れかで、ｍＡｂ ３９．２９ Ｄ８Ｃ２の単一用量を受けたフェレットは、それぞれ８０％及び９０％未満の生存率（２０％未満及び１０％未満の致死率）を示した。（図１９Ａを参照）。同様に、感染後４８又は７２時間の何れかで、ｍＡｂ ８１．３９ Ｂ１Ｃ１の単一用量を受けたフェレットは、それぞれ１００％及び８０％の生存率（０％及び２０％の致死率）を示した。（図１９Ｂを参照）。処置開始時間にかかわらず、オセルタミビルを処置された群は、５０％未満の致死率を示した。

【0432】

これらの結果は、本発明の広範に中和性の抗ヘマグルチニン抗体は、フェレットにおける重度のＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１感染の治療において非常に保護的であって、Ａ型インフルエンザウイルス感染後４８及び７２時間で投与されると、オセルタミビルよりも良好に機能することを示した。

【0433】

実施例１１：結晶化及びデータ収集
本発明の抗体のヘマグルチニン交差反応性についての構造的基盤を調べるために、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１ Ｆａｂ断片は、以下のようにヒトＡ型インフルエンザウイルス株Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９からの組換えヘマグルチニンＨ３と共に共結晶化された。

【0434】

タンパク質の発現及び精製
ヘマグルチニン中和についての構造的基盤をより良く理解するために、ヘマグルチニンと複合体を形成したｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１ Ｆａｂ断片の結晶構造が決定された。Ｐｅｒｔｈ Ｈ３ヘマグルチニンの細胞外ドメインをコードする核酸（Ｈ３ＦＪＡ，Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９、アミノ酸残基２５−５２０（全長ヘマグルチニンＨ３（Ｈ３ＨＡ）のアミノ酸残基について配列番号２２６））が、ｐＡＣＧＰ６７ベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に、インフレームで、トロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧＳ、配列番号１０６）三量体化「フォールドン」配列（ＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧ、配列番号１０７）、及びＣ末端６×Ｈｉｓタグ（配列番号１０８）と共にクローニングされた。組換えバキュロウイルスは、Ｈ３ＨＡ−ｐＡＣＧＰ６７ベクター及び線状化バキュロウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によるＳｆ９細胞の同時導入によって作製された。

【0435】

Ｈ３ＨＡ組換えタンパク質を産生するために、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ＰＲＯ細胞は、１の感染効率（ＭＯＩ）を用いて組換えバキュロウイルスに感染させられ、２７℃で７２時間増殖された。細胞上清は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＣａＣｌ_２、及び１ｍＭのＮｉＣｌ_２で処理され、その後、遠心分離され、濾過された。次いで、培地は濃縮され、２０ｍＭイミダゾールを含有する、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ＴＢＳ）に、接線流濾過によってバッファー交換され、そしてタンパク質はＮｉ−アガロースで捕獲され、２００ｍＭイミダゾールを含有するＴＢＳ中に溶出された。フォールドンタグは、一晩、トロンビンによって切断され、そしてＨ３ＨＡは濃縮され、更に、ＴＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１６／６０サイズ排除カラムで精製された。

【0436】

ヘマグルチニン−Ｆａｂ複合体を作成するために、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１ Ｆａｂ（ＰｈｏＡプロモーターの調節下にある）は、大腸菌中で３０℃で一晩発現された。細胞は、１５分間、６，０００ｒｐｍで遠心分離によってペレット化され、２５ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭのＰＭＳＦを補充されたＰＢＳ中で顕微溶液化によって溶解された。細胞破片は、４℃で１時間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離によって除去された。得られた上清は、プロテインＧカラムに通され、Ｆａｂは０．５８％酢酸で溶出された。ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１ Ｆａｂの更なる精製が、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨを５．５中で、０から１ＭのＮａＣｌの勾配を使用して、ＳＰセファロースクロマトグラフィーによって達成された。ＨＡ／３９．２９複合体を作成するために、Ｈ３ＨＡは、過剰のｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１ Ｆａｂと共に一晩インキュベートされ、その後濃縮され、ＴＢＳ中でＳ２００サイズ排除クロマトグラフィーにかけられ、複合体を単離した。複合体は、結晶化試験のために１０ｍｇ／ｍｌに濃縮された。

【0437】

結晶化
Ｈ３ＨＡ／３９．２９ ＮＣｖ１ Ｆａｂ複合体の結晶の生成は、沈殿剤としてＰＥＧ３００４０％を使用して、０．１Ｍリン酸／クエン酸緩衝液、ｐＨ４．２（条件Ｃ６、ＪＣＳＧ＋スパースマトリックススクリーン、Ｑｕｉａｇｅｎ）で見いだされた。回折品質の結晶は、最終的に、０．１μｌのタンパク質と０．１μｌ０．１Ｍリン酸／クエン酸、ｐＨ４．２、４０％＞ＰＥＧ３００、及び０．７％＞１−ブタノールを含むシッティングドロップ中で１９℃で増殖させた。結晶は、母液中で凍結保護され、その後瞬間冷凍され、液体窒素中で保管された。データはカナダの光源ビームラインＣＭＣＦ−０８ＩＤで凍結冷却条件下で収集され、ＭＯＳＦＬＭとＳＣＡＬＡを用いて処理された。結晶は空間群Ｉ２１３に属し、単位格子定数はａ＝ｂ＝ｃ＝２００．４、α＝β＝γ＝９０°であった。

【0438】

構造決定
初期位相は、検索モデルとしてＨ３ＨＡ（ＰＤＢ３ＳＤＹ）の構造を用いて、ＰＨＡＳＥＲによる分子置換によって得られた。続いて、ＦａｂのＦｃ及びＦｖ部分は、ＰＨＡＳＥＲを用いて別々に配置され、Ｐｈｅｎｉｘによる剛体精密化の初回ラウンドを受けた。モデルは、ＣＯＯＴによる調整と、Ｐｈｅｎｉｘによるシミュレートアニーリングは、座標、及びＢ因子の精密化の複数の繰り返しラウンドが行われた。アスパラギン結合型グリコシル化部位で発見された糖分子がＰｈｅｎｉｘからＣａｒｂｏｌｏａｄパッケージを使用して追加され、精密化の最終ラウンドはＲＥＦＭＡＣ５を用いて行われた。最終モデルは、３．１ÅでＲ／Ｒｆｒｅｅ値がそれぞれ１９．９及び２５．５％まで精密化された。Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙによって計算されたラマチャンドラン統計は、残基の８９．７％が好ましい領域にあり、１．１％が異常値にあることを示している。接触は、タンパク質界面、表面、及びアセンブリ（ＰＩＳＡ）ソフトウェア使用して分析され、構造図は、ＰｙＭＯＬを用いて作成された。

【0439】

実施例１２：Ｈ３ヘマグルチニン上の３９．２９エピトープの構造的特徴づけ
上記実施例１１に記載されるように、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１ Ｆａｂ断片は、ヒトＡ型インフルエンザウイルス株Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９からの組換えＨ３ヘマグルチニンと共結晶化された。抗体／ヘマグルチニン複合体の結晶構造は、３．１Åの分解能で決定された。Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９ Ｈ３ヘマグルチニンの全体構造は、ＨＡ２ヘリックス１／ヘリックス２のリンカーの僅かな再配置と乱れを除いて、以前に決定されたヘマグルチニンの構造に類似していた。これらの位置での乱れは、以前に低ｐＨの結晶化条件下で確認されており、ｐＨ４．２で結晶化されているこの複合体と一致している（Ekiert et al, (2011) Science 333:843-850）。抗体／ＨＡ複合体は、未切断のＨ３ ＨＡ三量体の各単量体に結合した単一のｍＡｂ３９．２９ Ｆａｂ分子を示していた。ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１ Ｆａｂ断片の軽鎖及び重鎖断片の両方とも全体を通じて良好に解像され、ＨＡとのＦｖの相互作用の精密な検証を可能にしている。

【0440】

ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１に対するエピトープは、Ｈ３ヘマグルチニンのストーク領域において、大まかにＨＡ２ヘリックスＡ上にあると決定された。ヘマグルチニンストークのこの領域は、グループ１のヘマグルチニンサブタイプを発現するＡ型インフルエンザウイルスの広範なる中和エピトープとして最初に同定され（Ekiert et ah, (2009) Science 324:246-251; Sui et al, (2009) Nature Structural & Molecular Biology 16:265-273)）、より最近では、グループ１及びグループ２のヘマグルチニンサブタイプを保有するＡ型インフルエンザウイルス株の中和エピトープとして同定された（Corti et al, (2011) Science 333:850-856）。ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１抗体は、重鎖と軽鎖の広範な接触を、ヘマグルチニンのストーク表面積のおよそ１１７５Å^２を埋めるために使用している。ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１の重鎖は、ＨＡ２ヘリックスＡに近接し、Ａｓｎ５４で保存されたグループ２ヘマグルチニンのグリコシル化部位の下にある非極性の浅い溝へと挿入する、伸長した疎水性ＣＤＲＨ３ループを広く介する結合に寄与している。ＣＤＲＨ３ループは、Ｐｈｅ９９側鎖の外へ伸長し、Ｈ３ヘマグルチニンのＴｈｒ３３４、Ｉｌｅ３９０、及びＩｌｅ３９３と相互作用し、一方、Ｈ３ヘマグルチニンのＡｓｎ５４に結合したＧｌｃＮＡｃと主鎖の極性接触している。ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖのＣＤＲＨ３ループは、Ｇｌｙ１００でβターンを作り、Ｖａｌ９８とＩｌｅ１００Ａの間のループ間主鎖の接触により安定化されている可能性がある。Ｉｌｅ１００Ａは、保存されたＨ３ヘマグルチニンＴｒｐ３６６と相互作用するように下に向いており、一方でＶａｌ９８及びＰｒｏ１００Ｃはまた、Ｈ３ヘマグルチニンストークとファンデルワールス接触している。重鎖／軽鎖界面に存在している、Ｐｒｏ１００ＤとＴｒｐ１００Ｅは長いＣＤＲＨ３ループを終結させ、所定の位置にループを固定するように作用している。

【0441】

ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１の軽鎖はまた、３つ全ての軽鎖ＣＤＲループ並びにフレームワーク残基によりＨ３ヘマグルチニンストークと接触しており、Ｈ３ヘマグルチニンストークとの相互作用に著しく寄与している。およそ１１００Å^２のヘマグルチニンの埋もれた表面積のうち、約６０％は軽鎖によってもたらされている（軽鎖及び重鎖においてそれぞれ６４０Å^２対４８０Å^２）。ＣＤＲＬ１のＡｓｎ３２は、Ｈ３のＨＡ２ヘリックスＡの残基Ａｓｐ３９１とＡｓｎ３９４と水素結合しており、ＣＤＲＬ１のＨｉｓ３１はＨ３ヘマグルチニンのＡｓｎ３７６側鎖に対してスタックしている。ＣＤＲＬ２ループにあるＳｅｒ５２はまた、Ａｓｎ３９８と極性接触している。ＣＤＲＬ３ループ内で、Ａｓｎ９３の主鎖はＡｓｐ３９１と接触し、一方Ｔｒｐ９４はＨＡ２ヘリックスＡのＬｙｓ３８４とカチオン−π相互作用している。興味深いことに、ｍＡｂ ３９．２９はまた、主にＩｇＫＶ３のβ鎖６にあるＳＧＳＧＳＧリピート（配列番号１０９）のＨ３ヘマグルチニンポリペプチドのアミノ酸残基４０３から４０５との主鎖相互作用を介して、ヘマグルチニンと多くのフレームワーク接触している。ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１のＳｅｒ６７はまた、Ｈ３ヘマグルチニンのＡｓｐ４８とＴｈｒ４０４と極性相互作用している。

【0442】

３つ全てのｍＡｂ３９．８９ ＮＣｖ１軽鎖ＣＤＲループは、埋もれた全表面積の約６０％を占めており、Ｈ３ ＨＡストークエピトープの結合に寄与している。軽鎖接触のこの大きな依存性は、既知のヘマグルチニングループ１とグループ２の結合及び中和抗体の中でユニークであり、抗体Ｆ１６ｖ３軽鎖は埋もれた表面積に対してほんの２０％の寄与であり、抗体ＣＲ９１１４軽鎖はエピトープと接触しない。

【0443】

構造的に保存されているが、グループ１とグループ２のヘマグルチニンサブタイプは、一次アミノ酸配列レベルで有意に異なっている。ｍＡｂ３９．２９ ＮＣｖ１ Ｈ３ＨＡ接触残基を他のヘマグルチニンサブタイプと比較するために、我々は、インフルエンザウイルスＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９からのＨ３ヘマグルチニンのアミノ酸配列を、他のインフルエンザウイルス株由来の代表的なヘマグルチニンアミノ酸配列：Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からのＨ１ＨＡ；Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７からのＨ２ＨＡ；Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からのＨ５ＨＡ；及びＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ＮＳＷ／１／１９９７からのＨ７ＨＡとアラインした。結晶構造中で、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９からのＨ３ヘマグルチニンのアミノ酸番号付けは、アラインメントに使用されるヘマグルチニンＨ３配列と一致している。ヘマグルチニンの配列アラインメントは、ｃｌｕｓｔａｌＷと、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からのヘマグルチニンＨ１；Ａ／Ｊａｐａｎ／３０５／１９５７からのヘマグルチニンＨ２；Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１９／２００９からのヘマグルチニンＨ３；Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からのＨ５；及びＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ＮＳＷ／１／１９９７からのＨ７に対応するアミノ酸配列使用して作成された。結晶構造は、３９．２９ ＮＣｖ１ Ｆａｂ断片とヘマグルチニンＨ３のストークとの間の接触残基を決定するために使用された。

【0444】

アラインメントを図２０に示す。ヘマグルチニン接触残基（灰色で影付き）は、ｍＡｂ３９．２９ ＮＣｖ１の４．５Å以内の残基として定義される。ｍＡｂ３９．２９ ＮＣｖ１のＦａｂにより、その利用可能な表面積の５０％以上が埋もれた各アミノ酸残基にはアスタリスクが表示されている。

【0445】

このエピトープに対するｍＡｂ３９．２９ ＮＣｖ１の結合に大きく寄与する接触残基の間で、高度の配列保存が観察される（図２０を参照）。この観察は、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１は、上記結晶構造に見られる同じストークエピトープを介して、グループ１とグループ２のヘマグルチニン分子に結合することを示唆している。このエピトープはＦＩ６ｖ３抗ヘマグルチニン抗体に対して同定されたヘマグルチニンエピトープに類似している（Ｃｏｒｔｉら（２０１１）、上記）。しかしながら、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１は、ヘマグルチニンストークに対してＦＩ６ｖ３とは異なる向きで結合する。ＨＡとの複合体の３９．２９ ＮＣｖｌ、Ｆ１６ｖ３、及びＣＲ９１１４構造の比較は、３つ全ての抗体は、ＨＡ２のヘリックスＡ及び隣接する非極性基を含むエピトープに結合することが明らかにした。しかし、３つの抗体の各々は特有の結合配向を有し、３９．２９ ＮＣｖ１と比較した場合、各重鎖はＨＡ上で同様の地形的位置に結合しているが、軽鎖の位置は、−６０°（ＦＩ６ｖ３）又は−１２０°（ＣＲ９１１４）だけ回転している。また、ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１に特有なのは、β鎖６のフレームワークのＩｇＫＶ３軽鎖ＳＧＳＧＳＧリピート（配列番号１０９）は、Ｈ３ ＨＡと接触していることである。従って、３９．２９構造は、この高度に保存されたエピトープの結合に対する第三の解決法を表し、Ａ型インフルエンザウイルスの広範な中和についてＨＡ２ヘリックスＡに係合することの重要性を固めている。

【0446】

ヒトＡ型インフルエンザウイルス株Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９からのＨ３ヘマグルチニンとの複合体のｍＡｂ ３９．２９の結晶学データは、以下の接触位置：３４、３６、５４、７０、２９２、２９４、３０５、３０７、３３４、３６３、３６４、３６５、３６６、３７９、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８７、３９０、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、４０１、４０３、４０４、及び４０５を明らかにした。抗体ＦＩ６ｖ３は、以下の接触位置：３３４、３５２、３５６、３６３、３６４、３６５、３６６、３８１、３８３、３８４、３８６、３８７、３８８、３９０、３９１、３９３、３９４、３９７、３９８、４０１、及び４０２を明らかにした。アミノ酸残基の位置は、Ａ型インフルエンザウイルス株Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９からのＨ３ヘマグルチニン（配列番号２２６）に対応する。（国際出願公開番号：国際公開第２０１０／０１０４６６号及び国際公開第２０１３／０１１３４７号；Corti et al. (2011) Science 333:850-856を参照）。一部に重複が観察されるが、ｍＡｂ ３９．２９は、ＦＩ６ｖ３よりもヘマグルチニン内部で、より多くの接触位置を示した。

【0447】

ｍＡｂ ３９．２９ ＮＣｖ１及びＦＩ６ｖ３抗体のＣＤＲは、配列相同性を有しておらず、両方の抗体は、類似しているが同一ではないストークエピトープに異なる方法で係合するという事実は、抗体には、保存されたストークのエピトープに結合し、広くＡ型インフルエンザウイルスを中和する様々な方法があることを示唆している。

【0448】

実施例１３：競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡアッセイは、インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／１９３３からのヘマグルチニンＨ１及びインフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８／１９６８．からのヘマグルチニンＨ３を用いて開発された。ヘマグルチニンをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートは、ビオチン標識化ｍＡｂ ３９．２９の飽和濃度を添加する前に、試験抗体を種々の濃度（Ｘ軸）で結合させた。試験抗体がｍＡｂ３９．２９のヘマグルチニンエピトープを競合した場合、ビオチンＥＬＩＳＡシグナル（Ｙ軸）は増加する試験抗体濃度の関数として減少した。結合データは、ｎＭで与えられたＥＣ５０値を決定するために、非線形用量反応曲線に適合させた。

【0449】

ｍＡｂ３９．２９ ＩｇＧは、製造業者の推奨プロトコル（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に従って、アミンカップリングを介してビオチン化された。ビオチン化ｍＡｂの最終ストック濃度は１３．２ｍＭであった。使用のための最適濃度を決定するために、ビオチン化された３９．２９は、固定化された、Ａ型インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／１９３３からのＨ１ヘマグルチニン及びＡ型インフルエンザウイルスＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８／１９６８からのＨ３ヘマグルチニンに対して連続的滴定された。組換えヘマグルチニンＨ１とＨ３タンパク質は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２μｇ／ｍｌに希釈され、９６ウェルのＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）上に分注された（１００μｌ）。プレートを、４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳでリンスし、次いで１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳによって室温で１時間ブロックした。

【0450】

次いで、各プレートは、連続希釈されたビオチン化ｍＡｂ３９．２９の１００μｌを、１．０％ＢＳＡ及び０．０５％ポリソルベート２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳ中での１／３希釈物を含む８８ｎＭの初期濃度で開始して与えられた。
１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、次いでストレプトアビジン結合型西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の１：５０００希釈物１００μｌと共に室温で３０分間インキュベートされた。インキュベーション後、プレートは洗浄され、ＴＭＢ基質１００μｌを用いて現像された（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ． Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。プレートは、Ｏ．Ｄ．４５０ｎＭで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ．）で読まれた。ビオチン化ｍＡｂの最適濃度は、１ｎＭであると決定された。

【0451】

種々の濃度（ｘ軸）の本発明のモノクローナル抗体３９．１８、３６．８９、８１．３９ ３９．２９、ｍＡｂ ９、ｍＡｂ ２３と対照ＩｇＧが、室温で３０分間、ヘマグルチニンコーティングされたプレートを用いてインキュベートされた。初期濃度は、２００ｎｍであり、続いて３倍連続希釈がなされた。ビオチン化ｍＡｂ３９．２９は、１ｎＭでの最終的なサブ飽和濃度まで添加された。１時間のインキュベーション後、プレートは洗浄され、ストレプトアビジン結合型西洋ワサビペルオキシダーゼの１：５０００希釈物１００μｌと共に４５分間インキュベートされた。プレートは洗浄され、次いでＴＭＢ溶液を用いて現像された。試験抗体がｍＡｂ３９．２９のＨＡエピトープを競合した場合、ビオチンＥＬＩＳＡシグナル（Ｙ軸）は増加する試験抗体濃度の関数として減少した。結合データは、ｎＭで与えられたＥＣ５０値を決定するために、非線形用量反応曲線に適合させた。

【0452】

図２１Ａと２１Ｂは、Ａ／ＮＷＳ／１９３３からのＨ１ＨＡ（図２１Ａ）又はＡ／ＨＫ／８／１９６８からのＨ３ＨＡ（図２１Ｂ）に対する結合についてのｍＡｂｓの競合ＥＬＩＳＡ解析の結果を示す。結果は、ｍＡｂ ３９．２９、ｍＡｂ ８１．３９、ｍＡｂ ３９．１８、及びｍＡｂ ３６．８９の全てが、重複するヘマグルチニンストークエピトープに結合することを示していた（図２１Ａ及び２１Ｂ）。具体的には、ｍＡｂ ８１．３９及びｍＡｂ ３９．１８は、ヘマグルチニンＨ１のストーク上でｍＡｂ ３９．２９の結合と競合し、一方ｍＡｂ ８１．３９及びｍＡｂ ３６．８９は、ヘマグルチニンＨ３上に同定されたストークエピトープに対するｍＡｂ ３９．２９による結合と競合する（図２１Ｂ）。

【0453】

競合ＥＬＩＳＡアッセイを使用することにより、モノクローナル抗体８１．３９、３９．１８、３６．８９、ｍＡｂ ９，及びｍＡｂ ２３は、構造解析により同定されたヘマグルチニンの高度に保存されたストークエピトープに結合することが確立された。具体的には、ｍＡｂ ８１．３９とｍＡｂ ３９．１８は、グループ１のＨ１ヘマグルチニンのストーク上でｍＡｂ ３９．２９の結合と競合する。更に、ｍＡｂ ８１．３９、ｍＡｂ ３６．８９、ｍＡｂ ９，及びｍＡｂ ２３は、グループ２のＨ３ヘマグルチニン上に同定されたストークに対するｍＡｂ ３９．２９による結合と競合する。予想されるように、ｍＡｂ ３９．１８は、グループ１のインフルエンザＡ型分離株のみ中和するので、グループ２のヘマグルチニン上のエピトープに対するｍＡｂ ３９．２９の結合と競合しない。同様に、ｍＡｂ ３６．８９、ｍＡｂ ９，及びｍＡｂ ２３は、グループ２のインフルエンザＡ型分離株を中和するだけであり、従って、グループ１のＨ１ヘマグルチニンに対するｍＡｂ ３９．２９の結合と競合しない。これらの実験からのデータは、以下の表３に要約される。

【0454】

【0455】

実施例１４：健常なボランティアにおける抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の安全性及び薬物動態
年齢１８歳以上の健常なヒト男性及び女性の被験者におけるｍＡｂ ３９．２９−ＮＷＰＰの第１相単回用量漸増試験が実施された。健康な成人被験者における安全性、認容性、及び薬物動態を調べるための初回投薬は、ｍＡｂ３９．２９の単一用量（１．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、又は４５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与によって実施された。ｍＡｂ３９．２９は、４５ｍｇ／ｋｇの用量レベルにおいて少なくとも５８日間、及び１．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルにおいて１２０日間の追跡調査期間後に全ての用量レベルで安全であり、十分に許容された。試験薬物に関連する重篤な有害事象は報告されなかった。ｍＡｂ ３９．２９の血清濃度は、初期の急速な分布相とその後の遅い排出相を伴う二相性の体内動態を示した。ｍＡｂ３９．２９は、線形の薬物動態（ＰＫ）を実証した。Ｃｍａｘの平均値は、１．５ｍｇ／ｋｇの用量群において３３．５μｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｋｇの用量群において１１８０μｇ／ｍＬの用量に比例した様式で増加した。同様に、群の平均のＡＵＣ_０−無限大は、１．５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの用量群に対してそれぞれ５１８及び５５３０μｇ／ｍＬ＊日であって、およそ用量に比例している。健常な男性及び女性被験者において利用可能なＰＫデータに基づいて、ｍＡｂ ３９．２９は、約２０日の平均半減期（１９．３から２２．２の平均範囲）を有する典型的なＩｇＧ１のヒト抗体のものと一致したＰＫプロファイルを有するように見えた。

【0456】

実施例１５：抗Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗体の第２相試験
本発明の抗Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗体の第２相臨床試験は以下のように実施される。Ａ型インフルエンザウイルス感染に罹患している入院している個人に、本発明の抗Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗体を、１．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、又は４５ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内投与によって投与される。あるいは、個人は、１２０ｍｇ、４００ｍｇ、１２００ｍｇ、又は３６００ｍｇの固定用量で抗体を投与される。個体はまた、抗Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗体の投与前、投与時、又は投与後に、オセルタミビル（タミフル（登録商標））（現在の標準治療）を投与される。一般的に、後続の用量が意図されるものの、抗体の一回の投薬レジメンが使用される。本発明のＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗体の投与は、インフルエンザＡ型感染性の減少、入院期間の短縮、集中治療室の使用の必要性の低下又は阻止、補助装置付き又は機械的換気の必要性の低下又は阻止、酸素補給用途の必要性の低下又は阻止を含む、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療に有効性を示す。本発明の結果の抗Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗体の投与は、呼吸機能の正常化までの時間の短縮（例えば、呼吸数の正常化までの時間の短縮、又は酸素飽和度の正常化までの時間の短縮など）、補給酸素の投与を行わないで２４時間にわたって測定される場合に、正常酸素飽和度、例えば約９２％以上の酸素飽和度に戻るまでの時間の短縮、又は心拍数、血圧、呼吸数、及び体温などのバイタルサインの正常化までの時間の短縮によって、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療における有効性を示している。

【0457】

統計解析
統計は、ＪＭＰバージョン９．０．２ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて計算された。生存実験は、ログランク検定を用いて比較された。Ｐ値＜０．０５は、有意と考えられた。ＩＣ_５０値曲線と値がプロットされ、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ソフトウェアを用いて計算された。

【0458】

前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許及び本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25B】

【図26A】

【図26B】

【図27A】

【図27B】

【図28A】

【図28B】

【図29A】

【図29B】

【図30A】

【図30B】

【図31A】

【図31B】

【図32A】

【図32B】

【図33A】

【図33B】

【図34A】

【図34B】

【図35A】

【図35B】

【図36A】

【図36B】

【図37A】

【図37B】

【図38A】

【図38B】

【図39A】

【図39B】

【図40A】

【図40B】

【図41A】

【図41B】

【図42A】

【図42B】

【図43A】

【図43B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]