特許 6388941 ビタミンＤ代謝物を測定するための２５−ＯＨビタミンＤ誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6388941

(24)【登録日】2018年8月24日

(45)【発行日】2018年9月12日

(54)【発明の名称】ビタミンＤ代謝物を測定するための２５−ＯＨビタミンＤ誘導体

(51)【国際特許分類】

   C07D 495/04 20060101AFI20180903BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20180903BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20180903BHJP

   C07C 33/14 20060101ALN20180903BHJP

【ＦＩ】

   C07D495/04 103

   G01N33/53 H

   G01N33/53 U

   G01N33/543 511D

   !C07C33/14CSP

【請求項の数】23

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2016-532339(P2016-532339)

(86)(22)【出願日】2014年8月1日

(65)【公表番号】特表2016-532695(P2016-532695A)

(43)【公表日】2016年10月20日

(86)【国際出願番号】EP2014066620

(87)【国際公開番号】WO2015018757

(87)【国際公開日】20150212

【審査請求日】2017年4月25日

(31)【優先権主張番号】102013215580.8

(32)【優先日】2013年8月7日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】502057669

【氏名又は名称】オルゲンテック ディアグノスティカ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100135633

【弁理士】

【氏名又は名称】二宮 浩康

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】ヴキッチ ソスキッチ

(72)【発明者】

【氏名】ローベアト ポッペ

【審査官】 三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０００−５０３６４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−０５３１１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５０６４２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of the Chemical Society，１９６０年，pp.5176-5179

【文献】 Steroids，２０００年，Vol.65，pp.281-294

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ １／００−４０９／４４

Ｃ０７Ｂ ３１／００− ６１／００

Ｃ０７Ｄ２０１／００−５２１／００

Ｇ０１Ｎ ３３／４８− ３３／９８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）

【化1】

［式中、
Ｒは、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルキル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルケニル基であり、
Ｌは、リンカーであり、かつ
Ｗは、色素、酵素、電気化学的に検出可能な基および発光基から選択される直接的に検出可能な標識基であるか、あるいはビオチン、炭水化物構造および親和性タグから選択される間接的に検出可能な標識基である］
による構造を有するビタミンＤ化合物。

【請求項2】

Ｌが、Ｃ原子、および任意にヘテロ原子、例えばＮ、Ｏおよび／またはＳから選択される６〜１１０個の原子の鎖長を有するリンカーである、請求項１に記載のビタミンＤ化合物。

【請求項3】

Ｌが、Ｃ原子、および任意にヘテロ原子、例えばＮ、Ｏおよび／またはＳから選択される８〜８０個、１２〜６０個または３０〜５０個の原子の鎖長を有するリンカーである、請求項１に記載のビタミンＤ化合物。

【請求項4】

Ｌが、
式（ＩＩ）

【化2】

［式中、

【化3】

Ｙは、−Ｏ−、または−ＣＨ₂−であり、
Ｒ¹およびＲ²は、互いに独立して、Ｈ、またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルであり、かつ
ｍは、１〜３０であり、かつ
ｎは、１〜１２であり、
その際、Ｑ₁と前記基Ｗとが結合しており、かつＱ₂と式（Ｉ）によるビタミンＤ化合物の基体とが結合しており、かつ

【化4】

はそれぞれ、Ｑ₂と前記ビタミンＤ化合物の基体との結合箇所か、またはＱ₁と前記基Ｗとの結合箇所を示す］
による構造により表されることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の化合物。

【請求項5】

Ｙが、−Ｏ−であることを特徴とする、請求項４に記載の化合物。

【請求項6】

【化5】

Ｙが、−Ｏ−であり、
Ｒ¹およびＲ²が、互いに独立して、Ｈ、またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルであり、ｍが、１〜３０であり、かつ
ｎが、１〜１２であることを特徴とする、請求項４または５に記載の化合物。

【請求項7】

Ｒ¹およびＲ²が、Ｈである、請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

Ｒが、ヒドロキシ基を有するビタミンＤ側鎖を表す、請求項１から７までのいずれか１項に記載の化合物。

【請求項9】

Ｒが、
式（ＩＩＩ）

【化6】

による構造、または式（ＩＶ）

【化7】

による構造を表すことを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項に記載の化合物。

【請求項10】

式（Ｉｂ）

【化8】

または式（Ｉｃ）

【化9】

による構造を有する、請求項１から９までのいずれか１項に記載の化合物。

【請求項11】

請求項１から１０までのいずれか１項に記載の化合物の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）式（Ｖ）

【化10】

［式中、
Ｒは、請求項１から９までのいずれか１項に定義されている通りである］
による構造を有する化合物のＣ−３原子のヒドロキシ基上で求核置換反応を行い、その際、前記ヒドロキシ基をＣ−３立体中心上での立体配置の反転下に基Ｘで置換することにより、式（ＶＩ）

【化11】

［式中、
Ｒは、請求項１から９までのいずれか１項に定義されている通りであり、かつ、Ｘは、保護されていてもよいヒドロキシ基、保護されていてもよいチオール基、保護されていてもよい第１級アミノ基、または保護されていてもよい第２級アミノ基である］
による構造を有する化合物を取得するステップ、
（ｂ）標識基Ｗを、リンカーを介して前記式（ＶＩ）による構造を有する化合物の基Ｘに結合させることにより、式（Ｉ）による構造を有する化合物を取得するステップ、この場合、前記標識基Ｗは、色素、酵素、電気化学的に検出可能な基および発光基から選択される直接的に検出可能な標識基であるか、あるいはビオチン、炭水化物構造および親和性タグから選択される間接的に検出可能な標識基である、
を含む、前記方法。

【請求項12】

サンプル中のビタミンＤを定量的に測定するためのインビトロ法であって、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の化合物をトレーサーとして使用し、その際、検査すべきサンプルが生物学的液体である、前記インビトロ法。

【請求項13】

前記生物学的液体が、血液、血清、血漿または乳汁から選択される、請求項１２に記載のインビトロ法。

【請求項14】

以下のステップ：
ａ）ビタミンＤを含むサンプルを前記トレーサーと接触させるステップ、
ｂ）前記トレーサーの検出量から前記サンプル中のビタミンＤの総濃度を推定することができる条件下で、前記トレーサーを定量的に測定するステップ
を含み、その際、前記トレーサーの測定を免疫学的方法により行うことを特徴とする、請求項１２または１３に記載のインビトロ法。

【請求項15】

前記トレーサーの測定を競合的免疫学的方法により行うことを特徴とする、請求項１４に記載のインビトロ法。

【請求項16】

前記トレーサーの測定のために抗体を使用し、前記抗体が前記側鎖Ｒを特異的に認識することを特徴とする、請求項１４または１５に記載のインビトロ法。

【請求項17】

前記抗体がＣ２５上にヒドロキシ基を有するビタミンＤ３またはビタミンＤ２側鎖を特異的に認識することを特徴とする、請求項１６に記載のインビトロ法。

【請求項18】

前記トレーサーを、前記サンプルに、前記化合物の最終濃度が０．２〜１００ｎｇ／ｍｌに調整される量で添加することを特徴とする、請求項１２から１７までのいずれか１項に記載のインビトロ法。

【請求項19】

測定すべきビタミンＤがＣ−２５上にヒドロキシ基を有し、かつ、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２およびその混合物を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１２から１８までのいずれか１項に記載のインビトロ法。

【請求項20】

前記ビタミンＤが２５−ヒドロキシビタミンＤ３および／または２５−ヒドロキシビタミンＤ２であることを特徴とする、請求項１９に記載のインビトロ法。

【請求項21】

請求項１から１０までのいずれか１項に記載の化合物を含み、場合によっては結合されたビタミンＤを遊離させるための試薬、および任意に希釈剤、担体、溶媒、補助剤、安定剤、保存剤および／または分散剤をさらに含む、ビタミンＤ測定用試薬。

【請求項22】

ビタミンＤを請求項１２から２０までのいずれか１項に記載のインビトロ法で測定するための、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の化合物、または請求項２１に記載の試薬の使用。

【請求項23】

請求項１に記載の式（Ｉ）による構造を有する化合物か、あるいは請求項１０に記載の式（Ｉｂ）または式（Ｉｃ）による構造を有する化合物を製造するための、式（ＶＩ）

【化12】

［式中、
Ｒは、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルキル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルケニル基であり、かつ
Ｘは、ＮＨＲ³、ＯＨ、またはＳＨであり、
その際、Ｒ³は、ＨまたはＣ₁〜Ｃ₆アルキルである］
による構造を有する化合物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｃ−３立体中心上でリンカーを介して標識基に結合されている新規のビタミンＤ化合物に関する。本発明はさらに、前記ビタミンＤ化合物の製造方法および前記化合物を製造するための中間生成物の使用にも関する。

【0002】

本発明のもう１つの対象は、本発明によるビタミンＤ化合物をトレーサーとして使用してビタミンＤを定量的に測定するための方法である。さらに本発明は、本発明による化合物を含むビタミンＤ測定用試薬、およびビタミンＤを測定するための前記試薬の使用に関する。

【0003】

ヒトにはビタミンＤの十分な供給が不可欠である。ビタミンＤの最も一般的な生理学的形態は、ビタミンＤ₃またはビタミンＤ₂である。ビタミンＤ₃（コレカルシフェロール）の極めて重要な生理活性誘導体は、２５ＯＨＤ３（２５−ヒドロキシビタミンＤ₃またはカルシジオール）および１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃またはカルシトリオール）である。一般的に、大部分のビタミンＤ₃は他のビタミンのように食品で摂取されるのではなく、皮膚におけるＵＶ光の作用下に生成される。これに関して、７−ジヒドロキシコレステロールがＵＶ照射によりプロビタミンＤ₃に転化され、その際、不安定な中間生成物が再構成されてビタミンＤ₃となる。食品では、ビタミンＤ₃は特に脂肪分の多い魚に含まれている。体内での生成が可能なビタミンＤのもう１つの形態はビタミンＤ₂（カルシフェロールまたはエルゴカルシフェロール）であり、これは真菌において生成され、かつ食品での摂取が可能である。十分な量のビタミンＤのもう１つの供給源は、ビタミンＤ₃剤およびビタミンＤ₂剤である。

【0004】

ビタミンＤおよびその天然の誘導体は、極めて疎水性の高い分子である。血液中では、ビタミンＤの運搬はビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）との複合体において行われる。ＤＢＰはアルブミンファミリーに属し、かつビタミンＤ、ビタミンＤ代謝物および脂肪酸を結合する。

【0005】

肝臓では、ビタミンＤは、シトクロムＰ４５０によってＣ−２５の位置で酸化される。生じる２５ＯＨＤ（２５−ヒドロキシビタミンＤ₃または２５−ヒドロキシビタミンＤ₂）は、主に循環中に存在するビタミンＤ代謝物である。血清中の２５ＯＨＤの濃度は、ヒトのビタミンＤの状態を評価するための指標としての役割を果たす。

【0006】

腎臓および他の組織においては、２５ＯＨＤから、ビタミンＤの生理活性形態である１，２５（ＯＨ）₂Ｄへの転化が行われる。この１，２５（ＯＨ）₂Ｄは、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）への結合後にビタミンＤ応答配列（ＶＤＲＥ）遺伝子活性を制御する。

【0007】

ビタミンＤの十分な供給は、正常な骨の強化、並びにカルシウムおよびリン酸塩吸収の調節にとって重要である。１，２５（ＯＨ）₂ＤによるＶＤＲの活性化によって腸のカルシウム吸収の効率は約３０％上昇し、かつリン酸塩吸収は約８０％上昇する。２５ＯＨＤの血清濃度が３０ｎｇ／ｍｌ未満に低下した場合、これによって腸内でのカルシウム吸収が明らかに減少し、かつパラチロイドホルモン濃度が増加する。ビタミンＤの欠乏は骨折リスクの増大を伴う骨粗鬆症の本質的な要因であると考えられ、かつ他の健康上のリスクと関連している。血清中のビタミンＤ濃度が食物摂取および日光曝露に依存して大きく変動するのに対して、２５ＯＨＤの血清濃度はビタミンＤ供給の状態を調べるための良好な指標の一つであると考えられる。従って、血清中の２５ＯＨＤ濃度の測定は医療診断において日常的に行われている。

【0008】

血清中の２５ＯＨＤの測定は、好ましくは競合的結合分析によって行われる。この場合、サンプルの２５ＯＨＤ濃度は、ビタミンＤ結合タンパク質、例えば２５ＯＨＤ特異的抗体からの放射性標識または化学標識されたビタミンＤ誘導体の排除により決定される。その際、この競合的結合アッセイにおいてトレーサーとして使用される標識されたビタミンＤ誘導体は、このアッセイで使用されるビタミンＤ結合タンパク質に高い親和性および特異性でもって結合しなければならない。

【0009】

ＤＥ６９７１３１３８（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．）には、イムノアッセイにおいてトレーサーとして使用することができる、Ｃ２０位で放射性変性された１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ誘導体が記載されている。

【0010】

ＵＳ５，１１６，５７３（呉羽化学工業株式会社）には、Ｃ１９位およびＣ６位で重水素またはトリチウムで標識されたビタミンＤ誘導体が記載されている。

【0011】

また、ビタミンＤ３およびビタミン誘導体の３β−ヒドロキシ基を非放射性標識基の導入に使用することもでき、その際、このヒドロキシ基は変性されてエステル架橋またはエーテル架橋となる。しかしながら、ハプテン標識されたエステル誘導体に基づくビタミンＤトレーサーの有用性は、例えばｐＨ７を上回るｐＨ値におけるエステル架橋の不安定性や、生物学的液体および組織内でしばしば生じるエステラーゼに対するその感受性により、非常に限定的である。この問題を解決するために、ヒドロキシ基を３β−アミノプロピルエーテル誘導体に転化するための方法が開発された（Ｒｏｙ， Ａ． ｕｎｄ Ｒａｙ， Ｒ．， Ｓｔｅｒｏｉｄｓ． １９９５， ６０： ５３０−５３３， ＵＳ６２９１６９３： Ｈｏｌｉｃｋ， Ｍ．Ｆ． ａｎｄ Ｒａｙ， ＵＳ６７８７６６０： Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ， Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， ＵＳ２００８０３１７７６４： Ｈｕｂｅｒ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， ＵＳ８００３４００： Ｋｏｂｏｌｄ， Ｕ．）。

【0012】

しかしながら、従来技術において記載されているビタミンＤ誘導体の製造方法および競合的結合アッセイにおけるトレーサーとしてのその使用は、多くの欠点を有している。放射性標識されたビタミンＤトレーサーは寿命が比較的短く、かつ安定性が低い。健康および環境に関する根本的な欠点に加えて、放射性試薬の場合には貯蔵、輸送および廃棄のためのコストが高まる。

【0013】

３β−ヒドロキシ基上で変性されたビタミンＤ誘導体は、合成法に非常に手間がかかるという欠点、そして、可燃性が高くかつ攻撃的な試薬を厳密に嫌気的な条件下に使用しなければならないという欠点を有する。その上、この化合物は生理的条件下では部分的に安定性が低く、このことによって生物学的起源のサンプルにおけるその使用は極めて制限される。

【0014】

ビタミンＤの測定に用いられるトレーサーは、合成により容易に入手でき、健康を害する可能性のある検出用の標識基を含まず、かつ自動化可能な試験法における使用に適していることが望ましい。

【0015】

従って本発明の課題は、標識されたビタミンＤ誘導体の合成における従来の問題を解決し、かつビタミンＤを定量的に測定するための自動化された方法におけるトレーサーとしての使用に適した、標識されたビタミンＤ化合物を提供することである。

【0016】

従来技術に記載された標識されたビタミンＤ化合物並びにその製造の制限および欠点が、本発明により少なくとも部分的に解消される。

【0017】

本発明は、ビタミンＤを測定するための試験方法におけるトレーサーとして適しており、かつ単純でかつ短い経路を経て合成により入手可能である、標識されたビタミンＤ化合物を提供する。

【0018】

驚くべきことに、Ｃ−３原子上のヒドロキシル基の求核置換によって、標識基をビタミンＤ基体に導入できることが見出された。この場合、Ｃ−３原子上で立体配置の反転が生じる。それにもかかわらず、得られるＣ−３原子上でα−立体配置の標識基を有する化合物は、競合的ビタミンＤ測定法におけるトレーサーとして、驚くべきことに抜群に適している。Ｃ３上での反転立体配置は、特にそれに付随して生じる、例えば血液のような生物学的液体中での例えばエステラーゼに対する安定性の向上に基づき、有利である。

【0019】

本発明は、新規のトレーサー、およびビタミンＤ、特に２５−ヒドロキシビタミンＤ₃または２５−ヒドロキシビタミンＤ₂の濃度を測定するための信頼性の高い自動化可能な方法を提供する。

【0020】

従って本発明の第１の態様は、式（Ｉ）

【化1】

［式中、
Ｒは、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルキル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルケニル基であり、
Ｌは、リンカーであり、かつ
Ｗは、ビタミンＤ化合物ではない標識基である］
による構造を有するビタミンＤ化合物に関する。

【0021】

「Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルキル」という用語は、２〜１０個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状のアルキル基を表す。この概念には、例えばエチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、２−オクチル、３−オクチル、イソ−オクチル、ｎ−ノニル、２−ノニル、３−ノニル、４−ノニル、イソ−ノニル、ｎ−デシル、イソ−デシル、２−デシル、および３−デシルといった基が含まれる。各水素原子は重水素原子で置換されていてもよい。

【0022】

「Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル」という用語は、２〜１０個の炭素原子を有するアルケニル基を表す。これらは直鎖状であっても分岐状であってもよく、かつＺ型で存在していてもＥ型で存在していてもよい。そのような基には、ビニル、プロペニル、１−ブテニル、イソ−ブテニル、２−ブテニル、１−ペンテニル、（Ｚ）−２−ペンテニル、（Ｅ）−２−ペンテニル、（Ｚ）−４−メチル−２−ペンテニル、（Ｅ）−４−メチル−２−ペンテニル、ペンタジエニル、例えば１，３−または２，４−ペンタジエニル、（Ｅ）−５，６−ジメチルヘプト−３−エニル、および（Ｚ）−５，６−ジメチルヘプト−３−エニルが含まれる。各水素原子は重水素原子で置換されていてもよい。

【0023】

「標識基」という用語は、物理的、化学的および／または生化学的方法により検出可能であり、かつ標識される分子の使用との相容性を示し、かつ特に非放射性である基を表す。この場合、これは式（Ｉ）による構造を有するビタミンＤ化合物ではない。

【0024】

「リンカー」という用語は、式（Ｉ）によるビタミンＤ骨格と標識基とを結合する分子スペーサーを表す。

【0025】

一実施形態においては、前記リンカーは、Ｃ原子、および任意にヘテロ原子、例えばＮ、Ｏおよび／またはＳから選択される６〜１１０個の原子の鎖長を有することを特徴とする。前記鎖長は、好ましくは原子８〜８０個、１２〜６０個、または３０〜５０個の長さである。前記リンカー中に任意に含まれるヘテロ原子は、好ましくはＮおよび／またはＯである。

【0026】

一実施形態においては、前記リンカーは、式（ＩＩ）

【化2】

［式中、

【化3】

Ｙは、−Ｏ−、または−ＣＨ₂−であり、
Ｒ¹およびＲ²は、互いに独立して、Ｈ、またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルであり、かつ
ｍは、１〜３０であり、かつ
ｎは、１〜１２であり、
その際、Ｑ₁と前記基Ｗとが結合しており、かつＱ₂と式（Ｉ）によるビタミンＤ化合物の基体とが結合しており、かつ

【化4】

はそれぞれ、Ｑ₂と前記ビタミンＤ化合物の基体との結合箇所か、またはＱ₁と前記基Ｗとの結合箇所を示す］
により表される。各水素原子は重水素原子で置換されていてもよい。

【0027】

「Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子、特に１〜３個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状のアルキル基を表す。これらの基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシルおよびイソ−ヘキシルが含まれる。各水素原子は重水素原子で置換されていてもよい。

【0028】

好ましい実施形態は、以下のことを特徴とする：

【化5】

Ｙは、−Ｏ−、または−ＣＨ₂−であり、
Ｒ¹およびＲ²は、互いに独立して、Ｈ、またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルであり、かつ
ｍは、１〜３０であり、かつ
ｎは、１〜１２であるか、
または、

【化6】

Ｙは、−Ｏ−、または−ＣＨ₂−であり、
Ｒ¹およびＲ²は、互いに独立して、Ｈ、またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルであり、かつ
ｍは、１〜３０であり、かつ
ｎは、１〜１２である。

【0029】

もう１つの好ましい実施形態は、以下のことを特徴とする：

【化7】

Ｙは、−Ｏ−であり、
Ｒ¹およびＲ²は、互いに独立して、Ｈ、またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルであり、特にＨであり、
ｍは、１〜３０であり、かつ
ｎは、１〜１２である。

【0030】

式（ＩＩ）によるリンカーにおける基Ｙは、好ましくは−Ｏ−である。

【0031】

他の好ましい一実施形態においては、前記ビタミンＤ化合物は、式（Ｉａ）

【化8】

［式中、
Ｒは、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルキル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルケニル基であり、
ｍは、１〜３０であり、かつ
Ｗは、ビタミンＤ化合物ではない標識基である］
による構造を有する。

【0032】

もう１つの好ましい実施形態においては、前記ビタミンＤ化合物は、式（Ｉｂ）

【化9】

または式（Ｉｃ）

【化10】

による構造を有する。

【0033】

前記標識基Ｗは、一方では直接的に検出可能な基であることができ、また他方では間接的に検出可能な基であることができ、例えば相補的に検出可能な結合パートナーとの結合により検出可能な基であることができる。

【0034】

直接的に検出可能な基とは、例えば色素、酵素、電気化学的に検出可能な基、または例えば光学的方法により検出可能な発光基、例えば蛍光基、燐光基若しくは化学発光基である。

【0035】

電気化学的に検出可能な基とは、反応パートナーと電子移動反応を生じうる基と理解されるべきであり、その際、電子は一方の反応パートナーから他方の反応パートナーへと移動する。前記検出可能な基が還元されかつ前記反応パートナーが酸化されるか、または前記検出可能な基が酸化されかつ前記反応パートナーが還元されるかのいずれかである。

【0036】

蛍光基とは、励起後に、予め吸収されたエネルギーよりも低いエネルギーの光を自発的に発する蛍光色素であると理解されるべきである。好ましくは、前記蛍光基は、色素、例えばフルオレセイン、ローダミン、スチルベン、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、クマリン、キニーネ、アロフィコシアニン、合成蛍光ラベル、または合成蛍光マーカー、例えばＡＴＴＯ染料（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ、Ｓｉｅｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（分子プローブ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ）およびシアニン、例えばＣｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７、並びにその誘導体である。

【0037】

燐光基とは、励起後に比較的長期間にわたって発光し、それにより１秒未満ないし数時間の残光が生じる化学基であると理解されるべきである。

【0038】

化学発光基とは、化学反応によって可視光領域または赤外領域の電磁放射線を放出する化学基である。化学発光標識には、ルミノール、アクリジニウムエステルおよびポリヒスチジン標識が含まれる。

【0039】

間接的に検出可能な基は、例えば、標識されたアビジンまたはストレプトアビジンにより検出可能なビオチン、標識された特異的抗体により検出可能な抗原およびハプテン、レクチンにより検出可能な炭水化物構造、または親和性タグである。

【0040】

ビオチニルという用語には、ビオチニル誘導体がストレプトアビジンまたはアビジンに結合する限り、このビオチニル誘導体も含まれる。

【0041】

好ましい一実施形態においては、Ｗは、ビオチニル、蛍光基または化学発光基である。

【0042】

他の好ましい一実施形態においては、Ｗは、ビオチニルである。

【0043】

前記基Ｒは、好ましくはビタミンＤ側鎖であり、特にＯＨ基を有するビタミンＤ側鎖であり、例えば式（ＩＩＩ）

【化11】

による構造、または式（ＩＶ）

【化12】

による構造である。

【0044】

特に好ましくは、Ｒは式（ＩＩＩ）による構造を有する。

【0045】

第２の態様には、式（Ｉ）による構造を有するビタミンＤ化合物の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）式（Ｖ）

【化13】

［式中、
Ｒは、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルキル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルケニル基である］
による構造を有する化合物のＣ−３原子のヒドロキシ基上で求核置換反応を行い、その際、前記ヒドロキシ基をＣ−３立体中心上での立体配置の反転下に基Ｘで置換することにより、式（ＶＩ）

【化14】

［式中、
Ｒは、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルキル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルケニル基であり、かつ、Ｘは、保護されていてもよいヒドロキシ基、保護されていてもよいチオール基、保護されていてもよい１級アミノ基、または保護されていてもよい２級アミノ基である］
による構造を有する化合物を取得するステップ、
（ｂ）ビタミンＤ化合物ではない標識基Ｗを、リンカーを介して前記式（ＶＩ）による構造を有する化合物の基Ｘに結合させることにより、式（Ｉ）による構造を有する化合物を取得するステップ
を有する、前記方法が含まれる。

【0046】

ステップ（ａ）において実施される求核置換反応には、好ましくは、アルコール（Ｖ）と、アルキルホスフィン、例えばトリ−ｎ−ブチルホスフィンまたはアリールホスフィン、例えばトリフェニルホスフィンまたはジフェニル（２−ピリジル）ホスフィン、アルキルアゾジカルボキシレート、例えばジエチルアゾジカルボキシレートまたはジイソプロピルアゾジカルボキシレートと、求核性基Ｘ、好ましくは弱酸性の求核性基とを、適した溶媒中で、例えばテトラヒドロフランまたはジエチルエーテル中で反応させることが含まれる。

【0047】

前記求核性基Ｘは、保護された形態で導入されてもよいし、遊離形態で導入されてもよい。好ましくは、前記基Ｘ基は保護された形態で導入される。

【0048】

「保護された」形態とは、当業者によく知られている、例えば官能基に応じて適した保護基を有する前駆体基を意味し、その際、この保護された形態を、従来技術において知られている方法により、相応する保護されていない基に変換することができる。

【0049】

前記基Ｘを導入するための化合物は、好ましくは、イミド、アミン、アジ化水素酸、カルボン酸、アルコール、チオール、チオカルボン酸またはその塩を含む群から選択される。前記化合物は、好ましくはイミド、アミンまたはアジ化水素酸であり、より好ましくはイミドまたはアジ化水素酸であり、最も好ましくはフタルイミドまたはその塩である。これらの基を、必要に応じて、当業者に知られている相応する方法によって脱保護し、相応するヒドロキシ基、チオール基、第１級アミノ基または第２級アミノ基にすることができる。例えば、フタルイミドを、適当な溶媒中の第１級アミン、例えばメチルアミンまたはヒドラジンにより、相応する第１級アミンに変換することができる。

【0050】

前記基Ｒは、好ましくはビタミンＤ側鎖であり、好ましくはＯＨ基を有するビタミンＤ側鎖であり、例えば式（ＩＩＩ）による構造、または式（ＩＶ）による構造である。

【0051】

式（ＶＩ）による構造を有する化合物中の基Ｘへの上記で定義されたリンカーを介した上記で定義された標識基Ｗのステップ（ｂ）における結合は、当業者に知られている方法により行われる。好ましくは、すでに標識基Ｗと結合しているリンカーが前記基Ｘに結合される。この場合、好ましくは、前記リンカーは、Ｘと反応する基、例えば脱離基、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルを有し、この基は前記基Ｘで置換されることができ、それにより前記基Ｘは前記リンカーと結合され、それにより式（Ｉ）による構造を有する化合物が生成される。

【0052】

本発明の第３の態様は、トレーサーとしての式（Ｉ）による構造を有する化合物を用いた、サンプル中のビタミンＤを定量的に測定するためのインビトロ法に関する。

【0053】

「トレーサー」という用語は、直接的に検出可能であるかまたは間接的に検出可能である基を有する化合物を表し、例えば相補的に検出可能な結合パートナーとの結合により検出可能な基を有する化合物を表す。好ましくは、前記検出は化学的、物理的または生化学的方法を用いて行われ、好ましくは物理的方法および生化学的方法を用いて、例えば分光法または免疫学的アッセイを用いて行われる。

【0054】

別段の記載がない限り、「ビタミンＤ」という用語には、ビタミンＤ２骨格、またはビタミンＤ３骨格、または構造式（ＶＩＩ）若しくは（ＶＩＩＩ）によるビタミンＤ３骨格を有する、全ての天然に存在する化合物が含まれる。

【0055】

【化15】

【0056】

構造式（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）中の炭素原子の番号付けは、ステロイド命名法に従って示されている。２５−ヒドロキシビタミンＤは、構造式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）の２５位でヒドロキシル化されているビタミンＤ代謝物、すなわち２５−ヒドロキシビタミンＤ₂および２５−ヒドロキシビタミンＤ₃を表す。他のヒドロキシビタミンＤ化合物は、例えば１，２５−ジヒドロキシビタミンＤまたは２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤである。

【0057】

１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、構造式（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）の１位および２５位でヒドロキシル化されているビタミンＤの活性形態（いわゆるＤホルモン）を表す。

【0058】

他のよく知られたビタミンＤ化合物は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、およびＣ３−エピ−２５−ヒドロキシビタミンＤである。

【0059】

一実施形態においては、前記インビトロ法は以下のステップを含む：
（ａ）ビタミンＤを含むサンプルをトレーサーと接触させるステップ、
（ｂ）前記トレーサーの検出量から前記サンプル中のビタミンＤの総濃度を推定することができる条件下で、前記トレーサーを定量的に測定するステップ。

【0060】

ステップ（ａ）におけるビタミンＤは遊離形態で存在することができる。他の一実施形態においては、ビタミンＤは結合された形態で存在し、かつステップ（ａ）はさらに、結合されたビタミンＤの遊離を含む。

【0061】

「結合されたビタミンＤの遊離」という用語は、タンパク質、特にＤＢＰ（生物学的サンプル中でビタミンＤはこのタンパク質に結合していることができる）との複合体からのビタミンＤの完全なまたは部分的な分離を意味する。好ましくは、実質的に、サンプル中に存在する全てのビタミンＤが遊離される。本明細書において、「実質的に」とは、ビタミンＤの少なくとも９０％、９５％、９８％、好ましくは少なくとも９９％が遊離されることを意味する。

【0062】

適した遊離剤は当業者によく知られており、有機物質、例えばパモ酸、または８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（８−ＡＮＳ）、無機物質、例えばアルカリ塩基を、還元剤または生化学的物質、例えばセリンプロテイナーゼＫと組み合わせたものが含まれる。

【0063】

特に適しているのは、少なくとも１種のハイドロトロープ物質、例えばトルエンスルホン酸、少なくとも１種の遷移金属塩、例えば鉄（ＩＩＩ）塩、例えば塩化鉄（ＩＩＩ）またはクエン酸鉄（ＩＩＩ）、および場合により錯化剤、例えばクエン酸塩、ＥＤＴＡおよび／またはその塩を含む遊離試薬であり、例えばＤＥ１０２０１３２０５０５５．０に記載されているものである。

【0064】

ステップ（ｂ）による前記ビタミンＤの測定は、時間的にステップ（ａ）の後に、またはステップ（ａ）と一緒に行うことができる。好ましくは、ステップ（ｂ）はステップ（ａ）と同時に行われ、それにより、サンプル中のビタミンＤを測定するためのワンステップ法が提供される。

【0065】

ステップ（ｂ）におけるビタミンＤの総濃度の測定は、好ましくは免疫学的方法におけるトレーサーの測定により行われ、その際、前記トレーサーが免疫学的パートナーに結合し、それにより免疫複合体が形成される。「免疫学的結合パートナー」という用語には抗体が含まれる。

【0066】

特に好ましくは、ステップ（ｂ）においてビタミンＤの濃度を測定するために、競合的免疫学的方法が使用される。

【0067】

適した競合試験形式は、当業者によく知られている。典型的な競合的結合アッセイにおいては、トレーサー、すなわちビタミンＤの標識された形態を有する受容体または抗体と、試験されるべきサンプルとが接触される。その場合、受容体または抗体に結合された状態で検出されるトレーサーの量が、サンプル中の未標識のビタミンＤの含分の指標となる。あるいは、競合的結合アッセイは、トレーサーに結合された受容体または抗体と試験されるべきサンプルとを接触させ、排除されたトレーサーの量を測定し、これがサンプル中のビタミンＤの量の指標となることを含む。前記トレーサーは上記で定義された標識基を有し、これは特にビオチニル、上記で定義されている通りの蛍光基または化学発光基から選択される。

【0068】

最も好ましい実施形態においては、ビオチン標識トレーサーが使用され、かつ検出は、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンによって行われる。

【0069】

特に、ステップ（ｂ）においてトレーサーを測定するために抗体が使用され、この抗体は、式（Ｉ）による構造を有する化合物の側鎖Ｒを特異的に認識し、かつ、Ｃ−２５原子上にヒドロキシ基を有するビタミンＤ３側鎖またはビタミンＤ２側鎖を特異的に認識する。

【0070】

前記トレーサーは、サンプルに好ましくは以下の量で添加され、すなわち、前記トレーサーが０．２〜１００ｎｇ／ｍｌ、特に５〜５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度となるように調節されるような量で添加される。

【0071】

試験されるべきサンプルは、好ましくは生物学的流体であり、例えば血液、血清、血漿または乳汁から選択される。サンプルは、通常は、生物、好ましくは哺乳動物、例えばヒトに由来する。

【0072】

本発明による方法により測定されるべきビタミンＤは、Ｃ−２５原子上にヒドロキシ基を有し、かつ例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、およびそれらの混合物を含む。特に好ましくは、前記ビタミンＤ化合物は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３および／または２５−ヒドロキシビタミンＤ２である。

【0073】

本発明の第４の態様は、式（Ｉ）による化合物を含むビタミンＤ測定用試薬に関する。

【0074】

好ましくは、前記試薬は、結合されたビタミンＤを遊離させるための試薬、および任意に希釈剤、担体、溶媒、補助剤、安定剤、保存剤および／または分散剤をさらに含む。

【0075】

前記試薬は、好ましくは乾燥試薬または湿潤試薬として存在する。

【0076】

本発明の第５の態様は、ビタミンＤを特に上記の本発明によるインビトロ法で測定するための上記の試薬の使用である。

【0077】

本発明の第６の態様は、トレーサー化合物を製造するための、すなわち式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）または式（Ｉｃ）による構造を有する化合物を製造するための、特に式（Ｉ）、式（Ｉｂ）または式（Ｉｃ）による構造を有する化合物を製造するための、式（ＶＩ）：

【化16】

［式中、
Ｒは、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルキル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ₂〜Ｃ₁₀アルケニル基であり、
Ｘは、ＮＨＲ³、ＯＨ、またはＳＨであり、かつ
Ｒ³は、ＨまたはＣ₁〜Ｃ₆アルキルである］
による構造を有する化合物の使用である。

【0078】

各水素原子は重水素原子で置換されていてもよい。

【0079】

前記基Ｒは、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）による構造と同様に、好ましくはビタミンＤ側鎖であり、好ましくはＯＨ基を有するビタミンＤ側鎖である。

【0080】

さらに、本発明を以下の図面および実施例により詳説する。

【図面の簡単な説明】

【0081】

【図1】２５−ヒドロキシビタミンＤ３（１）からエピマー３α Ｎ−フタルイミド誘導体（２）への変換、アミノ誘導体（３）への脱保護、およびＮＨＳ−ＰＥＧ₁₂−ビオチンとの反応による３α−［α−ビオチンアミド−ω−ドデカ（エチレングリコール）−アミド］−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ３（４）への変換による、ビオチン２５−ＯＨビタミンＤ３トレーサー試薬の合成を示す図。

【図2】ビオチン−２５ＯＨＤ３トレーサー試薬による、所定の２５ＯＨＤ３の濃度の競合的排除の特性決定を示す図。特異的２５ＯＨＤ競合のＥＬＩＳＡ検出のために、ビタミンＤフリー血清マトリックス（ＳｅｒＣｏｎ，Ｓｅｒａｃａｒｅ Ｉｎｃ．）中の２５ＯＨＤ３の、濃度０、５、１０、２０、２０、５０、１００、２００、３００ｎｇ／ｍｌの希釈系列を、７．５ｎｇ／ｍｌのビオチン−２５ＯＨＤトレーサー試薬の存在下に、８０μｌのビタミンＤ遊離試薬と混合し、これを、抗２５ＯＨＤ抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートウェルに施与した。トレーサーの結合を、競合する２５ＯＨＤの濃度の関数として、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンおよびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）呈色反応を用いて、ＯＤ ４５０ｎｍの測定により求めた。

【図3】所定の２５ＯＨＤ３および２５ＯＨＤ２の濃度を有する血清（６ＰＬＵＳ１マルチレベル血清キャリブレーターセット ２５−ＯＨビタミンＤ３／Ｄ２、Ｃｈｒｏｍｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ）およびビタミンＤフリー血清マトリックス（ＳｅｒＣｏｎ，Ｓｅｒａｃａｒｅ Ｉｎｃ．）中のその希釈物の比較分析を示す図。ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳで定められた２５−ＯＨＤ３／Ｄ２濃度と、自動Ａｌｅｒｉａ（登録商標）システム（ＯＲＧ２７０，ＯＲＧＥＮＴＥＣ）における直接的な２５−ＯＨビタミンＤ３／Ｄ２測定法とが高度に一致することが判明した。

【図4】２５−ＯＨビタミンＤ誘導体の希釈物の回収率の比較測定を示す図。３７℃で２４時間のインキュベーション後の、ビタミンＤフリー血清マトリックス中の３α−［α−ビオチンアミド−ω−ドデカ（エチレングリコール）−アミド］−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ₃（ＶＤ１）および３β−３’［α−ビオチンアミド−ω−ドデカ（エチレングリコール）−アミド］アミドプロピルエーテル−２５−ヒドロキシビタミンＤ₃（ＶＤ２）は、Ｃ３原子上で（Ｓ）−立体配置で存在するＶＤ２に対する、Ｃ原子上で（Ｒ）−立体配置で存在する誘導体ＶＤ１の高い血清安定性を示す。

【0082】

実施例１：３α−［α−ビオチンアミド−ω−ドデカ（エチレングリコール）−アミド］−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ３の合成（図１）
¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）スペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ３００（Ｂｒｕｋｅｒ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｂｒｕｋｅｒ）で、溶媒ＣＤＣｌ₃を用いて記録した。評価を、内部標準物質としてテトラメチルシランを用いてｐｐｍで行った。質量スペクトルを、Ｖａｒｉａｎ ＭＡＴ ３１１分光計（７０ｅＶ、ＥＩ）で測定した。分析用薄膜クロマトグラフィーのために、Ｆ．２５６シリカゲルプレート（Ｍｅｒｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）を使用した。クロマトグラフィーによる精製を、シリカゲルカラム２３０−４００メッシュＡＳＴＭ中で行った。全ての試薬をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。

【0083】

１．１：３α−フタルイミド−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ３の合成
テトラヒドロフラン（２．０ｍｌ）中の２５−ヒドロキシビタミンＤ３（１０．０ｍｇ、２５μｍｏｌ）、フタルイミド（４．５ｍｇ、３１．２５μｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（８．２ｍｇ、３１．２５μｍｏｌ）およびジエチルアゾジカルボキシレート（５．４ｍｇ、３１．２５μｍｏｌ）の溶液を、室温で２４時間撹拌した。ヘキサン（２．０ｍｌ）の添加後、この混合物をシリカゲルフィルターによりろ過した。溶媒の除去後、固体を５ｍｌの１０％Ｎａ₂ＣＯ₃中に取り込み、かつジエチルエーテル各１０ｍｌで２回抽出した。合一したエーテル相をＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、かつ真空下に濃縮して無色の油にした。この生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。３α−フタルイミド−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ３（図１、式２）を、無色の油の形態で単離した（７．３ｍｇ）。

【0084】

【化17】

【0085】

１．２：３α−アミノ−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ３の合成
３α−フタルイミド−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ３（２）（７．２ｍｇ、１３．５ｍｍｏｌ）を、エタノール中の８Ｍのメチルアミン０．５ｍｌ中に窒素下に溶解させた。この混合物をまず室温で２時間撹拌し、次いで４℃で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下に蒸発させ、残留物を５ｍｌの１０％Ｎａ₂ＣＯ₃中に取り込み、かつジエチルエーテル各１０ｍｌで３回抽出した。合一したエーテル相をＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、かつ真空下に濃縮して無色の油にした。この生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。３α−アミノ−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ３を、無色の油として単離した（４）（５．２ｍｇ）。

【0086】

【化18】

【0087】

１．３：３α−［α−ビオチンアミド−ω−ドデカ（エチレングリコール）−アミド］−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ３の合成
３α−アミノ−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ３（３）（５．２ｍｇ、１２．９μｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０２μＬ）、ＮＨＳ−ＰＥＧ₁₂−ビオチン（９．４ｍｇ、１０．０μｍｏｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｒｏｄ．Ｎｏ．２１３１２）を、ジメチルホルムアミド０．２ｍｌ中に溶解させ、かつ室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下に蒸発させ、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。その際、３α−［α−ビオチンアミド−ω−ドデカ（エチレングリコール）−アミド］−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ３（４）５．９ｍｇが無色のロウの形態で得られた。

【0088】

【化19】

【0089】

実施例２：ビタミンＤ遊離試薬の製造
トルエンスルホン酸ナトリウムを水中に溶解させ、かつ１Ｍのクエン酸ナトリウムおよび１Ｍの塩化鉄（ＩＩＩ）のストック溶液を用いて、１Ｍのトルエンスルホン酸ナトリウム、１００ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび５０ｍＭの塩化鉄（ＩＩＩ）の最終濃度に調整した。

【0090】

実施例３：固相への２５−ＯＨＤ抗体の結合
２５−ＯＨ−ビタミンＤ３または２５−ＯＨ−ビタミンＤ２に対する抗体を、トリス生理食塩水緩衝液中でｐＨ８．０で１μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，Ｎｕｎｃ）のウェルにこの抗体の前希釈物１００μｌをコーティングし、３７℃で乾燥させ、かつ試験を実施するまで４℃で貯蔵した。

【0091】

実施例４：競合的結合分析
ビタミンＤフリー血清マトリックス（Ｓｅｒａｃｏｎ，Ｓｅｒａｃａｒｅ Ｉｎｃ．）に所定の濃度の２５−ＯＨＤ３を混合した。濃度系列各８０μｌを、トレーサーとしての実施例１からの３α−［α−ビオチンアミド−ω−ドデカ（エチレングリコール）−アミド］−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ−ビオチン−トレーサー試薬）をプレコートしたマイクロタイターウェル中に充填し、かつこのトレーサー試薬の可溶化のために室温（２０〜２７℃）で５分間インキュベートした。次いで、サンプルのビタミンＤをＤＢＰとの複合体から解離する実施例２からの遊離試薬８０μｌをサンプルバッチに添加し、混合した。このビタミンＤ遊離試薬で希釈されたサンプル１００μｌを、２５ＯＨＤ−抗体がコーティングされたウェル中に移し、室温で３０分間インキュベートした。ここで、サンプル中に含まれる２５ＯＨＤは、２５ＯＨＤ抗体上の結合部位に関して２５ＯＨＤビオチントレーサーと競合する。次いで、サンプルバッチを除去し、ウェルを洗浄緩衝液各２００μｌで３回すすいだ。抗体に結合したビオチン−２５ＯＨＤトレーサーの検出を、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンおよびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）呈色反応を用いて行った。５０ｍＭのリン酸１００μｌを添加することによって基質反応を停止した後、４５０ｎｍでの光学密度の測定を行った。これに関して、図２に示す通り、すでに５ｎｇ／ｍｌの２５ＯＨＤ３の濃度で、ビオチン−２５ＯＨＤトレーサーの特異的競合が検出された。

【0092】

実施例５：自動化試験システムＡｌｅｇｒｉａ（登録商標）２５−ＯＨビタミンＤ３／Ｄ２試験システムにおける血清または血漿中の２５−ヒドロキシビタミンＤの測定
ＨＰＬＣ＋ＬＣ−ＭＳ／ＭＳをベースとする２５ＯＨＤ３／Ｄ２測定法と、自動化Ａｌｅｇｒｉａ（登録商標）２５−ＯＨビタミンＤ３／Ｄ２試験システム（ＯＲＧ２７０，Ｏｒｇｅｎｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ）との相関関係を調べるために、血清サンプルまたは血漿サンプルを、その２５ＯＨＤ３／Ｄ２濃度について、ＨＰＬＣ＋ＬＣ−ＭＳ／ＭＳをベースとする方法により特性決定し、（６ＰＬＵＳ１マルチレベル血清キャリブレーターセット２５−ＯＨビタミンＤ３／Ｄ２、Ｃｈｒｏｍｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ）、かつこれらからの希釈系列を測定まで分割して−２０℃で貯蔵した。

【0093】

測定のために、サンプル各８０μｌをＡｌｅｇｒｉａ（登録商標）試験片のウェルＡに装入した。その際、試験片の８個のウェルは、実施例２からのビタミンＤ遊離試薬、ストレプトアビジン−ＨＲＰ共役体、ＴＭＢ基質、２５ＯＨＤキャリブレーター溶液および２５−ＯＨＤの抗体がコーティングされたウェルをそれぞれ１回のサンプル測定のために含んでいた。試験処理をＡｌｅｇｒｉａ（登録商標）自動装置で自動的に行った。その際、１つの試験片内で、それぞれサンプルおよび試験片内部キャリブレーターを、２５ＯＨＤビオチントレーサーおよびビタミンＤ遊離試薬と混合して、これを２５ＯＨＤ抗体でコーティングされたウェルに移し、３０分間インキュベートした後に洗浄した。抗体に結合されたビオチン−２５ＯＨＤトレーサーの検出を、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンおよびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）呈色反応を用いて、６５０ｎｍでの光学密度を測定することにより行った。

【0094】

図３に示すように、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定された血清サンプル中の２５−ＯＨＤ３／Ｄ２濃度と、自動化Ａｌｅｇｒｉａ（登録商標）システムにおける直接的な２５−ＯＨビタミンＤ３／Ｄ２測定法とは高度に一致していることが認められた。

【0095】

実施例６：２５−ＯＨビタミンＤ誘導体の血清安定性の測定
ビオチン−２５−ＯΗビタミンＤ誘導体の血清安定性の比較試験のために、試験化合物をビタミンＤフリー血清マトリックス（Ｓｅｒａｃｏｎ、Ｓｅｒａｃａｒｅ Ｉｎｃ．）中に取り込んだ。第１のバッチ（ＶＤ１）において、Ｃ３原子上で非天然の（Ｒ）−立体配置で存在する２５−ＯＨビタミンＤ誘導体である、実施例１による３α−［α−ビオチンアミド−ω−ドデカ（エチレングリコール）−アミド］−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ₃を、ビタミンＤフリー血清マトリックス中で３ｎｇ／ｍｌの濃度に調整した。第２のバッチ（ＶＤ２）において、Ｃ３原子上で天然の（Ｓ）−立体配置で存在する２５−ＯＨビタミンＤ誘導体である、ＵＳ２００８０３１７７６４による３β−３’［α−ビオチンアミド−ω−ドデカ（エチレングリコール）−アミド］アミドプロピルエーテル−２５−ヒドロキシビタミンＤ₃を、ビタミンＤフリー血清マトリックス中で３ｎｇ／ｍｌの濃度に調整した。

【0096】

それぞれ１ｍｌのバッチＶＤ１およびＶＤ２のアリコートを、−２０℃で貯蔵するかあるいは３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、サンプルを室温（２２℃）で１時間平衡化した。−２０℃で貯蔵された参照サンプルと３７℃で２４時間インキュベートされたサンプル各５００μｌを、実施例２による遊離試薬各５００μｌと混合した。ビタミンＤ遊離試薬で希釈されたサンプル１００μｌを、実施例３による２５ＯＨＤ抗体でコーティングされたウェルに移し、室温で３０分間インキュベートし、それによって、サンプル中に存在するビオチン２５−ＯＨビタミンＤ誘導体が２５ＯＨＤ抗体に結合する。

【0097】

次いで、サンプルバッチを除去し、ウェルを洗浄緩衝液各２００μｌで３回すすいだ。抗体に結合されたビオチン−２５−ＯΗビタミンＤ誘導体の検出を、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンおよびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）呈色反応を用いて行った。５０ｍＭのリン酸１００μｌを添加することによって基質反応を停止した後、４５０ｎｍでの光学密度の測定を行った。

【0098】

その際、図４に示す通り、３７℃で２４時間インキュベートした後のバッチＶＤ１中の３α−［α−ビオチンアミド−ω−ドデカ（エチレングリコール）−アミド］−２５−ヒドロキシ−デオキシビタミンＤ₃誘導体によって、−２０℃で貯蔵された参照サンプルに対して回収率が９５．２％であることが判明した。バッチＶＤ２中に存在する３β−３’［α−ビオチンアミド−ω−ドデカ（エチレングリコール）−アミド］アミドプロピルエーテル−２５−ヒドロキシビタミンＤ₃誘導体は、明らかにより低い血清安定性を示す。この場合、３７℃で２４時間インキュベートした後に、−２０℃で貯蔵された参照サンプルに対してわずか７１．５％の回収率しか検出されなかった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】