特許 6392534 ロイシン酸生産活性を有するタンパク質及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6392534

(24)【登録日】2018年8月31日

(45)【発行日】2018年9月19日

(54)【発明の名称】ロイシン酸生産活性を有するタンパク質及びその利用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/53 20060101AFI20180910BHJP

   C12G 3/02 20060101ALI20180910BHJP

   C12F 3/00 20060101ALI20180910BHJP

   C12Q 1/32 20060101ALI20180910BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180910BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180910BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180910BHJP

   C12N 1/13 20060101ALI20180910BHJP

   C12P 7/42 20060101ALI20180910BHJP

   C12P 7/62 20060101ALI20180910BHJP

   C12P 7/06 20060101ALI20180910BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/53ZNA

   C12G3/02

   C12G3/02 119F

   C12F3/00

   C12Q1/32

   C12N1/15

   C12N1/21

   C12N1/19

   C12N1/13

   C12P7/42

   C12P7/62

   C12P7/06

【請求項の数】17

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2014-76212(P2014-76212)

(22)【出願日】2014年4月2日

(65)【公開番号】特開2015-195771(P2015-195771A)

(43)【公開日】2015年11月9日

【審査請求日】2016年12月26日

(73)【特許権者】

【識別番号】599002043

【氏名又は名称】学校法人 名城大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000110

【氏名又は名称】特許業務法人快友国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】志水 元亨

(72)【発明者】

【氏名】加藤 雅士

【審査官】 吉田 知美

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０７０１７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開昭５９−２２７２９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本農芸化学会中部支部第１６５回例会 講演要旨集，２０１２年，p.10，Ｐ１６

【文献】 日本生物工学会大会講演要旨集，２０１３年，Vol.65th，p.27，１Ｐ−０３９

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ ７／０６

Ｃ１２Ｐ ７／４２

Ｃ１２Ｐ ７／６２

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡによって形質転換されロイシン酸生産が増強された形質転換体を含む、ロイシン酸生産のための剤。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上３０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質

【請求項2】

前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質は、さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、配列番号２で表されるアミノ酸配列において第８６位に相当する部位がグリシン（Ｇ）であり、第１５９位〜第１６４位に相当する部位がＧＸＧＸＸＧ（各Ｘは、それぞれ独立して天然アミノ酸から選択される任意のアミノ酸である。）であり、第２４２位に相当する部位がアルギニン（Ｒ）であり、第２７１位に相当する部位がグルタミン酸（Ｅ）であり、第２８９位に相当する部位がヒスチジン（Ｈ）である、請求項１に記載の剤。

【請求項3】

前記形質転換体は、真核微生物である、請求項１又は２に記載の剤。

【請求項4】

以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡによって形質転換された麹菌の形質転換体。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上３０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質

【請求項5】

前記麹菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである、請求項４に記載の形質転換体。

【請求項6】

以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡによって形質転換された原核微生物の形質転換体。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上３０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質

【請求項7】

以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡを保持する、ロイシン酸生産が増強された形質転換体を作製するための組換えベクター。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上３０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質

【請求項8】

以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡを宿主に導入する工程、を備える、ロイシン酸生産が増強された形質転換体の生産方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上３０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質

【請求項9】

請求項１〜６のいずれかに記載の形質転換体を、４−メチル−２−オキソペンタン酸が存在しうる条件下で培養する工程を備える、ロイシン酸の生産方法。

【請求項10】

請求項１〜６のいずれかに記載の形質転換体を４−メチル−２−オキソペンタン酸が存在しうる条件下で培養してロイシン酸を生産する工程と、
前記ロイシン酸をロイシン酸エチルに変換する工程と、
を備える、ロイシン酸エチルの生産方法。

【請求項11】

請求項４又は５に記載の形質転換体である麹菌を培養する工程、を備える、麹含有材料の生産方法。

【請求項12】

請求項４又は５に記載の形質転換体である麹菌及び酵母を培養する工程、を備える、アルコールの生産方法。

【請求項13】

ロイシン酸高生産性変異体のスクリーニング方法であって、
被験変異体につき、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかで表されるタンパク質あるいは当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを指標として、ロイシン酸高生産性変異体をスクリーニングする工程、
を備える、方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上３０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質

【請求項14】

ロイシン酸高生産性変異体のスクリーニング方法であって、
以下の（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質を被験変異体とし、前記被験変異体の４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を評価する工程、
を備える、スクリーニング方法。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上３０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質

【請求項15】

ロイシン酸の生産方法であって、
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかで表されるタンパク質を用いて、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する工程、
を備える、生産方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上３０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質

【請求項16】

ロイシン酸エチルの生産方法であって、
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかで表されるタンパク質を用いて、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する工程と、
前記工程で得られたロイシン酸をロイシン酸エチルにエステル化する工程と、
を備える、生産方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上３０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質

【請求項17】

以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質を含有する、ロイシン酸を生産するための酵素製剤。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上３０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書は、ロイシン酸生産活性を有するタンパク質及びその利用に関する。

【背景技術】

【0002】

日本酒の香気増強に重要である吟醸香成分としてロイシン酸エチルが知られている。ロイシン酸エチルは、清酒原料である蒸し米中のロイシンを麹菌がロイシン酸（α−ヒドロキシ−イソカプロン酸）へと変換しさらに酵母が作用することで生成することが報告されている。吟醸香は、日本酒の品質に大きく影響する。

【0003】

ロイシン酸エチルの増強については、アスペルギルス属に属する酒造用麹菌をスクリーニングして、ロイシン酸を２０ｐｐｍ以上生産する菌株を求めたことが開示されている（特許文献１）。また、ロイシン酸エチル高生産性サッカロミセス属酵母が開示されている（特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開昭６３−５２８７５号公報

【特許文献2】特開平７−１４３８７１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、これまでは、ロイシン酸への生産経路は明らかではなく、関与する酵素についての知見はなかった。

【0006】

本明細書は、ロイシン酸の生産活性を有するタンパク質及びその利用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、麹菌アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae；A. oryzae）におけるロイシン酸の生産経路を以下のように推論した。すなわち、ロイシンから未知の麹菌由来のアミノトランスフェラーゼにより４−メチル−２−オキソペンタン酸（4-methyl-2-oxopentanoic acid；ＭＯＡ）が生成され、さらに未知のＭＯＡレダクターゼによりＭＯＡが還元されたロイシン酸に変換されると推論した。なお、こうして生成したロイシン酸に対して、その後酵母由来のリパーゼが作用してロイシン酸エチルに変換されるとも推論した。

【0008】

また、乳酸菌由来の２−ケト酸デヒドロゲナーゼファミリーに属する酵素がＭＯＡレダクターゼ活性を有することがわかっている。そこで、本発明者らは、乳酸菌由来の２−ケト酸デヒドロゲナーゼに着目し、２−ケト酸デヒドロゲナーゼファミリーに属するタンパク質についてスクリーニングを行い、ＭＯＡからロイシン酸を生産するデヒドロゲナーゼを特定した。本明細書の開示によれば、これらの知見に基づき、以下の手段が提供される。

【0009】

（１）以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡによって形質転換され、ロイシン酸生産能が増強された形質転換体。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２において１又は２以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（２）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質は、さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、配列番号２で表されるアミノ酸配列において第８６位に相当する部位がグリシン（Ｇ）であり、第１５９位〜第１６４位に相当する部位がＧＸＧＸＸＧ（各Ｘは、それぞれ独立して天然アミノ酸から選択される任意のアミノ酸である。）であり、第２４２位に相当する部位がアルギニン（Ｒ）であり、第２７１位に相当する部位がグルタミン酸（Ｅ）であり、第２８９位に相当する部位がヒスチジン（Ｈ）である、（１）に記載の形質転換体。
（３）前記形質転換体は、真核微生物である、（１）又は（２）に記載の形質転換体。
（４）前記真核微生物は、麹菌である、（３）に記載の形質転換体。
（５）前記麹菌は、Aspergillus oryzaeである、（４）に記載の形質転換体。
（６）前記形質転換体は、原核微生物である、（１）又は（２）に記載の形質転換体。
（７）以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡを保持する、ロイシン酸生産能を増強するための組換えベクター。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２において１又は２以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（８）以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡを宿主に導入する工程、を備える、ロイシン酸生産能が増強された形質転換体の生産方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２において１又は２以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（９）（１）〜（６）のいずれかに記載の形質転換体を、４−メチル−２−オキソペンタン酸が存在しうる条件下で培養する工程を備える、ロイシン酸の生産方法。
（１０）（１）〜（６）のいずれかに記載の形質転換体を、４−メチル−２−オキソペンタン酸が存在しうる条件下で培養してロイシン酸を生産する工程と、
前記ロイシン酸をロイシン酸エチルに変換する工程と、
を備える、ロイシン酸エチルの生産方法。
（１１）（１）〜（６）のいずれかに記載の形質転換体である麹菌を培養する工程、を備える、麹含有材料の生産方法。
（１２）（１）〜（６）のいずれかに記載の形質転換体である麹菌及び酵母を培養する工程、を備える、アルコールの生産方法。
（１３）ロイシン酸高生産性変異体のスクリーニング方法であって、被験変異体につき、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかで表されるタンパク質あるいは当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを指標として、ロイシン酸高生産性変異体をスクリーニングする工程、
を備える、方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２において１又は２以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（１４）ロイシン酸生産酵素のスクリーニング方法であって、２−ケト酸デヒドロゲナーゼ活性を有する被験タンパク質の４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を評価する工程、を備える、スクリーニング方法。
（１５）ロイシン酸の生産方法であって、
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかで表されるタンパク質を用いて、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する工程、を備える、生産方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２において１又は２以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（１６）ロイシン酸エチルの生産方法であって、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかで表されるタンパク質を用いて、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する工程と、前記工程で得られたロイシン酸をロイシン酸エチルにエステル化する工程と、
を備える、生産方法。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２において１又は２以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、４−メチル−２−オキソペンタン酸からロイシン酸を生産する活性を有するタンパク質

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】２−ケト酸デヒドロゲナーゼファミリーの分子系統樹を示す。

【図2】２−ＨＡＤＨ４についてのＳＤＳ―ＰＡＧＥの結果を示す。

【図3】２−ＨＡＤＨ４の各基質に対するミカエリス・メンテン定数：Ｋ_ｍ値、最大反応速度：Ｖ_ｍａｘ値、回転数：ｋ_ｃａｔ値の計算結果を示す。

【図4】２−ＨＡＤＨ４によるＭＯＡの反応生成物のＧＣクロマトグラム及び２−ＨＡＤＨ４によるＭＯＡの反応生成物のマスフラグメントパターンを示す。

【図5】野生株及び２−ＨＡＤＨ４遺伝子によって形質転換された形質転換株の電気泳動の結果を示す。

【図6】野生株及び２−ＨＡＤＨ４遺伝子によって形質転換された形質転換株のｍＲＮＡレベルでの２−ＨＡＤＨ４の発現量の比較を示す。

【図7】野生株及び２−ＨＡＤＨ４遺伝子によって形質転換された形質転換株のロイシン酸生産量の比較を示す。

【図8】ロイシン、ＭＯＡ又はロイシン酸を培地に添加したときの２−ＨＡＤＨ４の発現解析の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書は、ＭＯＡからロイシン酸を生産する活性（以下、単にロイシン酸生産活性ともいう。）を有するタンパク質及びその利用に関する。本明細書に開示されるロイシン酸生産活性を有するタンパク質（以下、単に本タンパク質ともいう。）によれば、吟醸香ロイシン酸エチルの原料でもあるロイシン酸ひいてはロイシン酸エチルを遺伝子工学的手法により効率的に生産できる。

【0012】

例えば、本タンパク質をコードするＤＮＡを利用することで、ロイシン酸生産能が増強された形質転換体を得ることができる。こうした形質転換体や本タンパク質を用いることで、吟醸香成分の原料等として有用なロイシン酸を生産できる。また、形質転換体や生産したロイシン酸自体を利用して、吟醸香成分としてのロイシン酸エチルを効率的に生産することができる。特に、麹菌である形質転換体を日本酒の製造工程に用いることで、吟醸香ロイシン酸エチルの増強された日本酒を製造することができるようになる。

【0013】

また、ロイシン酸は、生体内におけるロイシンの代謝物でもあり、運動後の筋肉疲労や萎縮を抑制することが報告されており（Am J Physiol Endocrinol Metab 305: E416-E428, 2013）、栄養補助成分としても有用である。

【0014】

以下、本明細書の開示に関し、本タンパク質、本タンパク質をコードするＤＮＡ、形質転換体とその生産方法、組換えベクター等について順次説明する。

【0015】

（本タンパク質）
本タンパク質は、ＭＯＡからロイシン酸を生産する活性（以下、ロイシン酸生産活性ともいう。）を有する。本タンパク質のロイシン酸生産活性は以下の反応を触媒する活性を意味している。
ＭＯＡ＋ＮＡＤＰＨ→ロイシン酸＋ＮＡＤＰ⁺

【0016】

本タンパク質の一態様として、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、A. oryzae由来の２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ（2-hydroxyacid dehydrogenase；２−ＨＡＤＨ）であり、２−ＨＡＤＡファミリーを広く探索した結果、ＧＲＨＰＲ（グリオキシレートレダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ（glyoxylate reductase/hydroxyl pyruvate reductase））に属するタンパク質から選択されたものである。

【0017】

配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、日本酒を始めとして各種の発酵食品に用いられるA. oryzaeに由来するものであるため、本タンパク質として特に有用である。

【0018】

本タンパク質の他の態様としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、ロイシン酸生産活性を有するタンパク質が挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異、すなわち、置換、欠失、挿入及び付加のうちいずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、好ましくは１個以上３０個以下であり、より好ましくは１個以上２０個以下であり、さらに好ましくは１個以上１５個以下であり、より一層好ましくは１個以上１０個以下程度である。最も好ましくは１個以上５個以下である。

【0019】

アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。

【0020】

ロイシン酸生産活性は、例えば、以下のように評価することができる。対象となるタンパク質に、基質としてＭＯＡ及び補酵素としてＮＡＤＰＨを添加して、還元反応によって生成するロイシン酸及び／又はＮＡＤＰ⁺を測定するか、あるいは、ＮＡＤＰＨの減少量を測定することによって、ロイシン酸生産活性を測定することができる。好ましくは、ＮＡＤＰＨの減少量を、可視吸光法によって測定する。ＮＡＤＰＨの減少量を測定し酵素活性を測定することは当業者において周知の手法である。

【0021】

なお、「ロイシン酸生産活性を有する」とは、ロイシン酸生産活性を有していれば足り、その程度は問わない。好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のロイシン酸生産活性の５０％以上であり、より好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、より一層好ましくは８０％以上であり、さらに一層好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは１００％以上である。

【0022】

本タンパク質のさらに他の態様は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、ロイシン酸生産活性を有するタンパク質が挙げられる。より好ましくは同一性は８５％以上であり、さらに９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに一層好ましくは９６％以上であり、一層好ましくは９７％以上であり、より一層好ましくは９８％以上であり、さらに一層好ましくは９９％以上である。

【0023】

本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術分野で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するBLASTの配列相同性検索結果においてSimilarityと称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。

【0024】

本タンパク質は、また、配列番号２で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたとき、配列番号２で表されるアミノ酸配列において第８６位に相当する部位がグリシン（Ｇ）であり、第１５９位〜第１６４位に相当する部位がＧＸＧＸＸＧ（各Ｘは、それぞれ独立して天然アミノ酸から選択される任意のアミノ酸である。）であり、第２４２位に相当する部位がアルギニン（Ｒ）であり、第２７１位に相当する部位がグルタミン酸（Ｅ）であり、第２８９位に相当する部位がヒスチジン（Ｈ）であることが好ましい。第１５９位〜１６４位に相当する部位は、ＮＡＤ結合モチーフとして知られ、２−ＨＡＤＨに広く保存されているモチーフである。また、他の特定部位のアミノ酸は、基質結合部位等として、２−ＨＡＤＨに広く保存されているアミノ酸である。これらのアミノ酸及びモチーフを備えることで、２−ＨＡＤＨとしての活性を有することができる。アラインメントについては既に説明したように実施することができる。

【0025】

本タンパク質は、また、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質でもある。配列番号１で表される塩基配列はA. oryzae由来の２−ＨＡＤＨをコードする。さらに本タンパク質の他の一態様として、配列番号１で表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、ロイシン酸生産活性を有するタンパク質が挙げられる。より好ましくは同一性は８５％以上であり、さらに９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに一層好ましくは９６％以上であり、一層好ましくは９７％以上であり、より一層好ましくは９８％以上であり、さらに一層好ましくは９９％以上である。

【0026】

配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号１で表される塩基配列と一定以上の同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質として、例えば、Aspergillus flavus由来のタンパク質（アクセッション番号：XP_001826015）、Aspergillus clavatus由来のタンパク質（アクセッション番号XP_001268820）、Aspergillus fumigattus 由来のタンパク質（アクセッション番号：XP_752810）Aspergillus terreus由来の（アクセッション番号：XP_001210726）、Aspergillus nidulans由来のタンパク質（アクセッション番号：XP_658379）が挙げられる。

【0027】

本タンパク質は、例えば、アミノ酸配列情報や後述する塩基配列情報に基づいて化学的にあるいは遺伝子工学的に合成することができる。当業者であれば、配列情報に基づいてタンパク質を取得することができる。

【0028】

また、上記各種態様のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本ＤＮＡという。）は、例えば、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、麹菌等から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリ又はゲノムＤＮＡライブラリ等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記ライブラリ等由来の核酸を鋳型とし、本ＤＮＡの一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは本ＤＮＡは、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。

【0029】

また、本ＤＮＡは、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１で表される塩基配列からなる）を、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法又はGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法が挙げられ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K（TAKARA社製）やMutant-G（TAKARA社製））などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて変異が導入される。

【0030】

そのほか、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、例えば、配列番号１又は２等の公知配列に基づいて、本ＤＮＡを取得することができる。

【0031】

なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と上記のように一定の関連性のあるアミノ酸配列をコードする塩基配列は、遺伝暗号の縮重に従い、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく所定のアミノ酸配列をコードする塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置換することができる。従って、本ＤＮＡは、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変換された塩基配列をコードするＤＮＡも包含する。

【0032】

（形質転換体）
本明細書で開示する形質転換体（以下、本形質転換体という。）の一態様は、本タンパク質をコードするＤＮＡによって形質転換された細胞である。本形質転換体は、本タンパク質を生産供給源として有用であるほか、ロイシン又はＭＯＡの存在下でのロイシン酸の生産体として有用である。さらに、ロイシン酸エチルの生産材料としても有用である。

【0033】

（宿主）
本形質転換体の宿主は、本タンパク質を発現可能な宿主細胞であればよく、その種類を限定しない。本形質転換体は、例えば、真核微生物であっても、原核微生物であってもよいが、好ましくは真核微生物である。原核微生物として、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）等の放線菌、ミクロシスティス（Microcystis aeruginosa）等のラン藻等が挙げられる。

【0034】

真核微生物としては、麹菌、酵母、菌類、藻類等が挙げられる。好ましくは酵母及び麹菌である。麹菌としては、A. oryzae、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus soya）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）等が挙げられる。

【0035】

真核微生物としては、日本酒等に生産等の発酵に汎用される麹菌、なかでも、A. oryzaeが好ましい。これらの宿主からは、本ＤＮＡを取得することができ、本ＤＮＡを本真核微生物に発現増強可能に導入することで、産業上より有用な麹菌を得ることができる。また、A. oryzaeなどの麹菌は、ロイシンからＭＯＡを生産する能力を備えるため、麹菌である本形質転換体は、それを米由来の原料を用いて培養することで、ロイシン酸を生産することができる。また、本タンパク質は、A. oryzae由来であるため、A. oryzaeに導入することでセルフクローニングとなり有意義である。

【0036】

酵母としては、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点から及び日本酒等の発酵に汎用される観点から、サッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。S. cerevisiae等の酵母は、ロイシン酸を吟醸香成分であるロイシン酸エチルに変換することができる。したがって、酵母にロイシン酸生産能を付与することで、少なくとも酵母は、ＭＯＡからロイシン酸を合成し、ひいてはロイシン酸エチルを合成できるようになる。

【0037】

本形質転換体は、本ＤＮＡを発現可能に保持していればよく、その保持形態は特に問わない。本ＤＮＡは、宿主ゲノム外に保持されていてもよいが、好ましくは宿主ゲノム上に保持されている。本ＤＮＡは、誘導発現可能に備えられていてもよいし、構成発現可能に備えられていてもよいが、本タンパク質の生産増強及びロイシン酸生産能の増強の観点からは、好ましくは構成発現可能に備えられている。

【0038】

本形質転換体は、ロイシン酸生産能が増強されていることが好ましい。ロイシン酸生産能が増強されているとは、新たにロイシン酸生産能が付与された場合のほか、本来的に備えていたロイシン酸生産能が増強された場合の双方を含んでいる。例えば、A. oryzae等の形質転換体においては、その野生株に比べて、例えば、１０倍以上、より好ましくは３０倍以上、さらに好ましくは５０倍以上、より好ましくは７０倍以上、さらに好ましくは９０倍以上、より好ましくは１００倍以上のロイシン酸生産能を有している。

【0039】

本形質転換体のロイシン酸生産能は、例えば、本形質転換体による本ＤＮＡの転写産物（ｍＲＮＡ）や翻訳産物（タンパク質）のほか、ロイシン酸生産量等に基づいて評価することができる。

【0040】

（組換えベクター）
本明細書で開示する組換えベクター（以下、本ベクターという。）は、本タンパク質をコードするＤＮＡを保持することができる。本組換えベクターは、本ＤＮＡを発現させてロイシン酸生産能を増強するための発現ベクターでもある。組換えベクター及びその構築方法は、当業者において周知であって、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に開示されている。なお、ベクターの形態は、使用形態に応じて様々な形態を採ることができる。例えば、ＤＮＡ断片の形態を採ることができるほか、プラスミドの形態を採ることもできる。

【0041】

本ベクターは、宿主に応じ、また、ベクター媒体に応じた種々の要素のほか、本ＤＮＡを発現可能とするための公知の必要な要素を備えることができる。すなわち、プロモーター、ターミネーター等の各種調節領域のほか、宿主ゲノムに導入する場合には、相同組換え領域等を備えることができる。また、組換え体を選別するためマーカー遺伝子を備えることができる。

【0042】

本ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、特に限定されないで、宿主及びその発現形態に応じて適宜公知のプロモーターから選択して用いることができる。例えば、宿主が麹菌である場合では、ｔｅｆ１プロモーター、エノラーゼプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、α−アミラーゼプロモーター、グルコアミラーゼプロモーター、セルラーゼプロモーター、セロビオハイドラーゼプロモーター、アセトアミダーゼプロモーター等のプロモーター等を用いることができる。ロイシン酸生産能の増強のためには、好ましくは制御下の遺伝子を構成的に発現させることができるプロモーターを用いる。

【0043】

（本形質転換体の生産方法）
本形質転換体の生産方法は、本ＤＮＡを宿主に導入する工程を備えることができる。具体的には、本ベクターを宿主に導入して形質転換させるようにする。本形質転換体の生産方法においては、既に説明したベクター及び宿主の各種態様を適用できる。形質転換体の作製方法自体は、当業者において周知であり、当業者であれば、宿主の種類に応じて、上述の成書等を適宜参照することで当該工程を実施できる。典型的には、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることができる。

【0044】

（ロイシン酸の生産方法）
本明細書で開示するロイシン酸の生産方法は、ＭＯＡが基質として存在しうる条件下で本形質転換体を培養する工程を備えることができる。本生産方法によれば、本形質転換体のロイシン酸生産能によって、ロイシン酸の生産量を増加させることができる。ロイシン酸は、それ自体有用であるほか、ロイシン酸エチルの原料とすることができるため有用である。

【0045】

培養工程は、本形質転換体の宿主の種類に応じて適宜設定することができる。本形質転換体が麹菌である場合には、麹菌は、培地中のタンパク質等を原料してロイシンを生産し、さらにＭＯＡを経てロイシン酸を生産できると考えられるため、例えば、日本酒の製造工程に準じて米などタンパク質を含有する原料等を適宜用いて培養することでロイシン酸を生産させることができる。

【0046】

また、形質転換体が、酵母など麹菌以外の場合にあっては、麹菌あるいは麹菌と同様にロイシンからＭＯＡを生産することができる微生物と共培養することができる。また、形質転換体の培地として本タンパク質の基質となるＭＯＡを含むか、麹菌あるいはこれに類する微生物の培養上清を含むようにしてもよい。

【0047】

なお、本形質転換体が麹菌である場合やそうでない場合も含め、効率的なロイシン酸の生産には、必要に応じて、ロイシンをアミノ酸として含有するタンパク質（ポリペプチド）を含む発酵用原料や、培地にロイシン及び／又はＭＯＡを含めることが好ましい。

【0048】

培養工程は、宿主を考慮して適切な条件で行うことができる。培養は、静置培養、振盪培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。例えば、宿主が麹菌、産膜酵母等の好気性菌であれば、好気条件を選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃以上５５℃以下の範囲とすることができる。例えば、宿主が麹菌、酵母等であれば、２０℃以上４０℃以下、より好ましくは２５℃以上３５℃以下を選択することができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、６時間以上１５０時間以下程度とすることができる。例えば、宿主が麹菌であれば、培養時間を２４時間以上１２０時間以下とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。例えば、宿主が麹菌、酵母等であれば、４．０以上８．０以下とすることができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。なお、培養工程終了後、培養液から微生物を除去してロイシン酸含有画分を回収する工程、さらにこれを濃縮する工程を実施してもよい。

【0049】

本明細書で開示するロイシン酸の生産方法は、培養工程としてではなく、本タンパク質を用いて、ＭＯＡが基質として存在しうる条件下でＭＯＡからロイシン酸を生産する工程を備えるものであってもよい。この工程を、先に説明した本形質転換体を培養してロイシン酸を生産する工程と組み合わせて同時に行ってもよい。すなわち、本形質転換体でＭＯＡからロイシン酸を生産しつつ、培地中で本タンパク質を用いてＭＯＡからロイシン酸を生産してもよい。

【0050】

この生産工程では、任意の方法で取得した本タンパク質を基質であるＭＯＡに作用させることができる。本タンパク質は、野生型のA. oryzaeから抽出されてもよいし、本形質転換体から取得してもよい。基質としてのＭＯＡは、ＭＯＡとして添加されることが好ましい。本生産工程では、本タンパク質の至適条件下でロイシン酸を生産することが好ましい。こうした条件としては、例えば、ｐＨについては、例えば、４．０以上８．０以下とすることができる。温度については、例えば、２０℃以上４０℃以下、より好ましくは２５℃以上３５℃以下とすることができる。塩濃度については、０．６質量％以上０．９質量％以下とすることができる。

【0051】

（ロイシン酸エチルの生産方法）
本明細書で開示するロイシン酸エチルの生産方法は、ＭＯＡからロイシン酸を生産する工程と、ロイシン酸をロイシン酸エチルに変換する工程と、を備えることができる。本生産方法によれば、本形質転換体によってロイシン酸を効率的に変換してロイシン酸エチルを得ることができる。ロイシン酸エチルは、日本酒の吟醸香成分として有用である。

【0052】

ロイシン酸の生産工程は、既に説明したように、ＭＯＡが基質として存在しうる条件下で本形質転換体を培養する工程であってもよいし、また、微生物によらずにＭＯＡが基質として存在しうる条件下で本タンパク質を作用させる工程であってもよいし、これらの組合せであってもよい。なお、ロイシン酸エチルの生産を意図する場合であっても、効率的なロイシン酸エチルの生産には、必要に応じて培地にロイシン及び／又はＭＯＡを含めることが好ましい。

【0053】

ロイシン酸をロイシン酸エチルに変換する工程は、ロイシン酸生産工程で得られたロイシン酸の存在下で当該変換反応を触媒可能なエステラーゼやリパーゼを発現する酵母等の微生物を培養する工程であってもよいし、微生物によらずにこれら酵素が作用可能な条件下で接触させる工程でもよいし、これらの組合せであってもよい。また、微生物が発現するエステラーゼやリパーゼは、菌体内でロイシン酸に作用してもよいし、菌体外でロイシン酸に作用してもよい。

【0054】

こうしたリパーゼとしては、S. cerevisiae等の酵母由来のリパーゼが知られている。なお、当該反応を触媒するエステラーゼやリパーゼは、スクリーニング等によっても簡易に見出すことができる。例えば、アカルボキシルエステラーゼ、リールエステラーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼA2、リゾホスホリパーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、コリンエステラーゼ等が挙げられる。また、反応条件としては、特に限定しないで、これらの酵素に通常適用される条件を採用することができる。

【0055】

ロイシン酸生産工程と、ロイシン酸エチルへの変換工程とは、別個に行うこともできるが、効率性の観点からは、同時に、すなわち、１つの工程として行うことが好ましい。その場合、ロイシン酸生産工程としての本形質転換体によるロイシン酸生産工程及び本タンパク質によるロイシン酸生産工程のいずれか又は双方と、変換工程として、酵母等のリパーゼ発現微生物による変換工程及びリパーゼ等による変換工程のいずれか又は双方と、を適宜組み合わせることができる。ロイシン酸生産工程とロイシン酸エチルへの変換工程とを一工程で行うときには、培養条件や酵素反応条件等を適宜設定する。

【0056】

（麹含有材料の生産方法）
本明細書で開示する麹含有材料の生産方法は、麹菌である本形質転換体を培養する工程を備えることができる。本生産方法によれば、種麹や麹など、ロイシン酸エチルの生産能が増強された麹含有材料を得ることができる。

【0057】

麹菌としては、既に説明したものが挙げられる。また、用途等に応じて、黄麹菌、白麹菌、黒麹菌から適宜選択される。麹菌である本形質転換体を培養する工程に用いる原料としては、公知の麹や種麹の製造に用いられている材料を適宜選択することができる。例えば、適宜加熱処理等した米、麦、大豆等が挙げられる。麹含有材料の製造方法は、従来公知であり、当業者であれば、本形質転換体に公知の製造工程を適宜適用することで種麹や麹などの麹含有材料を得ることができる。

【0058】

培養工程は、酵母や乳酸菌なども同時に培養する工程であってもよい。なお、必要に応じて、培養原料にロイシン又はＭＯＡを含めることもできる。

【0059】

本明細書の開示によれば、こうした麹含有材料を用いて、さらに、味噌、醤油、日本酒（清酒）、みりんなどの醸造食品や麹調味料を製造することができる。また、化粧品やその原料を製造することもできる。特に、こうした麹含有材料は、日本酒の吟醸香であるロイシン酸エチルの生産に好適であるため、酒用の麹又は種麹として有用である。酒としては、米を主原料とする各種日本酒のほか焼酎、泡盛等の蒸留酒等が挙げられるが、好ましくは日本酒である。

【0060】

（アルコールの生産方法）
本明細書で開示するアルコールの生産方法は、麹菌である本形質転換体と酵母とを培養してアルコール発酵させる工程、を備えることができる。本生産方法によれば、吟醸香成分であるロイシン酸エチルの含有量が多いアルコールを生産することができる。本アルコールの生産方法は、いわゆる各種の酒に適用されるが、好ましくは米を主原料とする日本酒である。

【0061】

本生産方法における培養工程は、麹含有材料を用いては、培養工程の他に、アルコールの種類に応じた工程を備えていてもよい。例えば、日本酒の生産方法は、以下の工程を備えることができる。培養工程に先だって、精米工程、米蒸工程、既に説明した麹含有材料の製造工程等を備えることができる。また、培養工程の後に、培養により生じた固形物（もろみ）を絞って固形分離する工程と、低温殺菌を行う工程と、を備えていてもよい。生産方法の培養工程においては、ロイシン又はＭＯＡを原料に含めるようにしてもよい。

【0062】

本生産方法によって得られるロイシン酸エチルを含むアルコールは、それ自体アルコール類として飲用に適した酒類という用途を構成するほか、他の日本酒等などの醸造食品に吟醸香を付与する吟醸香原料として利用することもできる。

【0063】

なお、本形質転換体をＭＯＡが存在しうる条件下で培養することでロイシン酸が得られるが、こうした本形質転換体とアルコール発酵可能な酵母とを共培養することで日本酒以外の酒類も製造することができる。

【0064】

（ロイシン酸高生産性変異体のスクリーニング方法）
本明細書で開示するロイシン酸高生産性変異体のスクリーニング方法は、被験変異体につき、本タンパク質あるいは本タンパク質をコードするポリヌクレオチドを指標として、ロイシン酸高生産性変異体をスクリーニングする工程を備えることができる。

【0065】

被験変異体に導入されているＤＮＡは、２−ケト酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが好ましい。２−ケト酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質は、グリオキシレートレダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ（glyoxylate reductase/hydroxyl pyruvate reductase））活性を有するタンパク質、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ＬＤＨ（lactate dehydrogenase））活性を有するタンパク質、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ（formate dehydrogenase））活性を有するタンパク質、Ｄ−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ＭＤＨ（D-malate dehydrogenase））活性を有するタンパク質、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（３−ＰＧＤＨ（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase））活性を有するタンパク質を含む。被験変異体に導入されているＤＮＡは、ＧＲＨＰＲ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることがより好ましい。なお、本タンパク質はＧＲＨＰＲ活性を有するタンパク質である。被験変異体に導入されているＤＮＡは、ＧＲＨＰＲ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定以上の同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上等）を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡであることがさらに好ましい。また、既述のように所定の位置に特定アミノ酸残基やモチーフを備えるタンパク質であることが好ましい。また、麹菌に由来する本タンパク質を被験タンパク質とすることが好ましい。

【0066】

スクリーニング工程において、本タンパク質を指標とする場合、例えば、被験変異体によって生産されたロイシン酸生産能を実施例等において開示する方法で測定することにより行うこともできる。また、スクリーニング工程において、本タンパク質をコードするポリヌクレオチドを指標とする場合では、例えば、被験変異体からＲＮＡを含むＲＮＡ試料を調製し、この試料のうち、ｍＲＮＡについて、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲを実施するかあるいはｃＤＮＡを取得して発現レベルによって評価することができる。

【0067】

（ロイシン酸生産酵素のスクリーニング方法）
本明細書で開示するロイシン酸生産酵素のスクリーニング方法は、被験タンパク質のロイシン酸生産活性を評価する工程を備えることができる。

【0068】

被験タンパク質は、上記の変異体スクリーニング方法で説明したタンパク質とすることが好ましい。ロイシン酸生産活性を評価する工程についても、既に説明したように実施すればよい。

【実施例】

【0069】

以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

【実施例1】

【0070】

（麹菌由来ＭＯＡレダクターゼ（ＭＯＡＲ）候補を発現する形質転換体の作製）
（１）候補遺伝子の探索
乳酸菌由来の２−ケト酸デヒドロゲナーゼファミリーに属する酵素がＭＯＡＲ活性を有することが分かっている。そこで、ＭＯＡＲ活性を有する乳酸菌の２−ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（アクセッション番号：Ｍ２６９２９）と相同性が高い遺伝子を用いて麹菌Aspergillus oryzaeのゲノムデータベースに対して、ブラスト検索を行った。その結果をもとに表１に示した３種のＭＯＡＲ候補遺伝子を選抜した。

【0071】

【表1】

【0072】

（２）分子系統樹の作成
３種のＭＯＡＲ候補遺伝子（２−ＨＡＤＨ１、４、６）のアミノ酸配列を用いて、他の生物由来の相同性のあるタンパク質を検索し、そのアミノ酸配列を用いて、分子系統樹を作成した。図１に、作成した分子系統樹を示す。図１に示されるように、２−ＨＡＤＨ１は、Ｄ−ＬＤＨ活性を有するタンパク質のファミリーに属し、２−ＨＡＤＨ４は、ＧＲＨＰＲ活性を有するタンパク質のファミリーに属し、２−ＨＡＤＨ６は、Ｄ−ＭＤＨ活性を有するタンパク質のファミリーに属することが分かった。なお、図１において、ＳＥＲＡは、３−ＰＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を指す。

【0073】

（３）プラスミドの構築
坂口フラスコに作製した液体Ｍ培地（２％Malt Extract、０．１％ポリペプトン、２％グルコース）５０ｍｌにAspergillus oryzae KBN8243を植菌し、２８℃で２０時間振盪培養を行った。

【0074】

培養液を吸引濾過後、液体窒素を用いて菌体を凍結させ、乳鉢・乳棒により破砕し、１．５ｍｌ微小遠心チューブに菌体を回収した。

【0075】

RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社)により、菌体からＲＮＡを抽出し、PrimeScript(登録商標)1st cDNA Synthesis Kit (TaKaRa社)によりＲＮＡを逆転写することでｃＤＮＡを得た。合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりそれぞれの遺伝子断片（２−ＨＡＤＨ１，４，６）を増幅した。使用したプライマーは表２、ＰＣＲ反応溶液の組成は表３、ＰＣＲの反応条件は表４に示した。アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を泳動後、目的遺伝子断片を切り出し、UltraClean（商標） 15 DNA Purification Kit（MO BIO社）により、アガロースゲルからＤＮＡを抽出、精製した。

【0076】

【表2】

【0077】

【表3】

【0078】

【表4】

【0079】

Mighty TA-cloning Kit (TaKaRa社) により、ＰＣＲ産物をクローニングした。添付のプロトコールに従い、ライゲーションを１６℃、２時間行った後、コンピテントセル（クローニング用大腸菌ＤＨ１０Ｂ）５０μｌにライゲーション溶液２μｌを加え、氷上１０分、４２℃、４０秒、氷上２分で形質転換した。制限酵素処理用サンプル溶液の組成は表５、ライゲーション用サンプル溶液の組成は表６に示した。ＳＯＣ培地５００μｌを加えた後、３７℃、３０分振盪培養を行った。これ以降の形質転換は全てこの条件で行った。その後、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．２％Ｘ−Ｇａｌ、０．１％ＩＰＴＧを含んだＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩静置培養した。

【0080】

【表5】

【0081】

【表6】

【0082】

一晩生育させた大腸菌コロニーから、GoTaq（商標）DNA Polymerase (Promega) を使用し、コロニーＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動により、目的遺伝子断片が確認できたコロニーを、試験管に作製した液体ＬＢ培地５ｍｌに植菌し、３７℃、１２時間振盪培養をした。その後、アルカリ抽出法により、プラスミドを精製した。DNAシークエンスを行うことによりアガロースゲル電気泳動によりプラスミドが正しく構築されたか確認した。

【0083】

次に、精製したプラスミドの制限酵素処理を行い、アガロースゲル電気泳動により、目的遺伝子断片を確認し、アガロースゲルから切り出し後、UltraClean（商標）15 DNA Purification Kit (MO BIO社) を用いて、ＤＮＡを精製した。タンパク質発現用のプラスミドベクターも同様に処理した。

【0084】

T4 DNA Ligase (TaKaRa社) を使用して、１６℃、２時間でライゲーションを行い、遺伝子断片をプラスミドベクターに挿入した。クローニング用大腸菌ＤＨ１０Ｂに形質転換した。その後、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含んだ、ＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩静置培養した。生育させた大腸菌コロニーから、コロニーＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動により、目的遺伝子断片の増幅が確認できたら、試験管に作製した液体ＬＢ培地５ｍｌに大腸菌を植菌し、３７℃、１２時間振盪培養を行い、アルカリ抽出法によりプラスミドを精製した。ＰＣＲ（GoTaq（商標）DNA Polymerase使用）と制限酵素処理を行い、アガロースゲル電気泳動によりプラスミドが正しく構築されたか確認したプラスミドをタンパク質発現用大腸菌であるE.coli BL21-CodonPlusに形質転換した。

【実施例2】

【0085】

（１）ＭＯＡＲ候補の発現
実施例１で作製した形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含んだＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩静置培養行い、生育した大腸菌を用いて組換え酵素を発現させた。

【0086】

作製した大腸菌を液体ＬＢ培地５ｍｌに植菌し、３７℃、１２時間振盪培養した。菌液２ｍｌを、５００ｍｌ三角フラスコに作製した液体のＬＢ培地２００ｍｌに植菌し、３７℃、２〜３時間振盪培養した（前培養）。分光光度計を用いて、６００ｎｍにおける培養液の吸光度を測定し、吸光度が０．５〜０．７まで達したら、最終濃度０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、２０℃で８時間振盪培養した（本培養）。８時間後、培養液は５０ｍｌプラスチック遠心管１本に移し、８０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し上清を取り除いた。５０ｍｌプラスチック遠心管に入ったサンプルは冷凍庫（−８０℃）に保存した。なお、ＩＰＴＧを添加した場合と同様に、ＩＰＴＧを添加する前に、培養液の一部を取り出し、９５℃で５分間インキュベートすることで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとし、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動終了後、ＣＢＢ染色を行った。

【0087】

保存した５０ｍｌ遠心管を取り出し、そこに５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７．２、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む、以下、リン酸バッファという。）を１５ｍｌと少量のリゾチームを添加してピペッティングし、菌体を溶解させ、超音波ホモジナイザーを用いて破砕した。

【0088】

破砕した溶液およびタンパク質サンプルは９５℃で５分間インキュベートすることで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとし、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動終了後、ＣＢＢ染色を行った。図２に、２−ＨＡＤＨ４についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。

【0089】

図２に示すように、（３）本培養後の可溶性画分及び（６）精製画分では、約３５ｋＤａの位置に明確なバンドが現れたことから、２−ＨＡＤＨ４が発現していることが確認された。（６）では、当該バンド以外のバンドがほとんど現れていないことから、２−ＨＡＤＨ４が精製されていることが確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、２−ＨＡＤＨ１、６についても発現が確認された（図示省略）。

【0090】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、組換え酵素の発現が確認された２−ＨＡＤＨ１、４、６を２’，５’−ＡＤＰセファロース４Ｂにて精製した。２’，５’−ＡＤＰセファロース４Ｂにリン酸バッファ１を３０ｍｌ以上滴下することでカラムを平衡化後、サンプルを滴下した。カラムを洗浄後、２ｍＭ ＮＡＤＰＨを含んだリン酸バッファ８ｍｌを滴下することで、２−ＨＡＤＨを精製した。２’，５’−ＡＤＰセファロース４Ｂに吸着しなかった非吸着画分と、精製後の精製画分と、のそれぞれを９５℃で５分間インキュベートすることで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとし、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

【0091】

次いで、２０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７．２）２５ｍｌを脱塩カラムＰＤ−１０（GE Healthcare）に滴下することで、カラムを平衡化後、精製したサンプル溶液２．５ｍｌを滴下した。続いて、ＮａＣｌを含まないリン酸バッファ３ｍｌを滴下することで溶出させた。

【0092】

１．５ｍｌ微小遠心チューブに、Quick Start Bradford 1x Dye Reagent (Bio-Rad社) ４９０μｌと脱塩処理したサンプル１０μｌとを加え混合した。測定用プレートに１５０μｌ添加し、プレートリーダーにより、波長５９５ｎｍにおける吸光度値を測定し、タンパク質濃度を計算した。

【0093】

（２）ＭＯＡＲ活性測定
活性測定のバッファとして、２０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７．２）を使用した。吸光度値測定用ガラスキュベット（１ｍｌ容）に、リン酸バッファ（全量５００μｌになるように調製），精製した各２−ＨＡＤＨ１，４，６と、１００ｍＭ ＮＡＤＰＨ（終濃度１２５μＭ）と、を加え撹拌させた。そこに基質として１００ｍＭ ＭＯＡ（終濃度２ｍＭ）を加えピペッティングを行い、可視分光光度計を使用して、波長３４０ｎｍにおける反応５分間の吸光度値を測定した。吸光度値を用いて酵素の比活性及び、Ｋ_ｍ値、Ｖ_ｍａｘ値、ｋ_ｃａｔ値を計算した。なお、ＭＯＡに代えて、フェニルピルビン酸、ピルビン酸、グリオキシル酸、β-ヒドロキシピルビン酸、３-メチルオキソ吉草酸でも同様に実験を行った。

【0094】

２−ＨＡＤＨ４のＭＯＡＲ活性測定の結果について、反応後では、反応前に比べて波長３４０ｎｍにおける吸光度値が減少した。このことから、ＮＡＤＰＨが減少したこと、即ち、ＭＯＡからロイシン酸が産生されたことが確認された。図３に、吸光度値に基づいた２−ＨＡＤＨ４の各基質に対するＫ_ｍ値、Ｖ_ｍａｘ値、ｋ_ｃａｔ値の計算結果を示す。図３に示すように、２−ＨＡＤＨ４は、ＭＯＡのみならず、フェニルピルビン酸、ピルビン酸及びグリオキシル酸を基質として、還元反応を促進する活性も有することが分かった。また、２−ＨＡＤＨ４は、β-ヒドロキシピルビン酸、３-メチルオキソ吉草酸を基質としないことが分かった。２−ＨＡＤＨ１、６については、反応の前後で３４０ｎｍにおける吸光度値がほとんど減少しなかったことから、ＭＯＡＲ活性を有さないことが分かった（図示省略）。

【実施例3】

【0095】

２−ＨＡＤＨ４によるＭＯＡの反応生成物を明らかにするために、ＧＣ−ＭＳ分析を行った。具体的には、上記の反応後、反応生成物にＨＣＬを添加することで反応を停止させた。そして、酢酸エチルにて反応生成物を抽出しトリメチルシリル化後、ＧＣ−ＭＳ分析に供した。図４にＧＣクロマトグラム及び反応生成物のマスマスフラグメントパターンを示す。

【0096】

図４に示すように、２−ＨＡＤＨ４の添加によって基質であるＭＯＡが減少し、反応生成物が増加し、その反応生成物がロイシン酸であることがわかった。即ち、２−ＨＡＤＨ４がＭＯＡＲとして機能し、基質であるＭＯＡをロイシン酸に還元していることが分かった。以下では、ＭＯＡＲ活性を有する２−ＨＡＤＨ４をＭＯＡＲ１と呼ぶ。

【実施例4】

【0097】

（ロイシン酸高生産麹菌の作製）
（１）ＭＯＡＲ１遺伝子の増幅
ＭＯＡＲ１遺伝子が高発現したロイシン酸高生産麹菌の作製するために、表７に示す菌株及びプラスミド（Yoshino-Yasuda S. et al. Food Sci Technol, Res. 18 , 59-65, 2012）並びにプライマーを使用した。

【0098】

【表7】

【0099】

プラスミドpTAaphAには、pyrG、tefIプロモーター、acid phosphatase 配列が連結している箇所が存在する（Yoshino-Yasuda S. et al. Food Sci Technol, Res. 18 , 59-65, 2012）。ここから、pyrGとtefIプロモーターが連結したＤＮＡ配列をプライマーにfupyrGNとtefPrvを用いてPCRで増幅した。また、麹菌由来新規ＭＯＡＲ１遺伝子のＯＲＦとターミネーター部分をプライマーにtefmoa368とmoa368downSphIを用いて増幅した。

【0100】

（２）培地等の準備
E.coli用培地として、ＬＢ培地（Tryptone１．０ｇ、Yeast extract０．５ｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ／１００ｍｌ）を使用した。終濃度５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した。また、固体培地の場合には１．５％となるようにａｇａｒを添加した。青白選択を行う際には、０．４％Ｘ−ｇａｌ(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside)、０．１％ＩＰＴＧ( Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) を添加した。

【0101】

A. oryzae 用培地として、Czapek-Dox培地（pH6.0 with 1N HCl, NaNO₃0.3g, KH₂PO₄ 0.1 g, MgSO₄・7H₂O 0.05g, KCl 0.05g, FeSO4・7H₂O 0.01g, Sucrose 3.0g, Agar 1.5g /100ml）を使用した。

【0102】

プロトプラスト再生用Czapek-Dox選択培地として、以下の下層培地及び上層培地を使用した。下層培地では、Czapek-Dox培地に終濃度がそれぞれ0.2 M sucrose、1.5% agarとなるように添加した。さらに、Trace elements solution（FeSO4・7H₂O 1.0g, ZnSO₄・7H₂O 8.8g, CuSO₄・5H₂O 0.4 g, Na₂B₄O₇・10H₂O 0.1 g, (NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O 0.05 g /1L）を終濃度０．１％となるように加えた。上層培地では、Czapek-Dox培地に終濃度がそれぞれ1 M sucrose、0.5% agarとなるように添加した。Trace elements solutionは終濃度０．１％となるように加えた。

【0103】

完全培地として、培地（pH6.5 with 1N KOH, Malt extract 2.0 g, Bacto pepton 0.1 g, Glucose 2.0g/100 ml）を使用した。

【0104】

プロトプラスト化溶液（10 mM-Na phosphate 0.8 M-NaCl buffer (pH6.0) 30 ml, YatalaseTM (TaKaRa社) 90 mg, Lysing enzymes l2265 (SIGMA社) 9.0 g, BSA 0.3 g /30 ml）は、形質転換当日に調製し、フィルター（Millex（登録商標）Syringe Filter Units, Non-Sterile）で滅菌した。

【0105】

溶液１（0.8 M NaCl、10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl (pH7.5)）をオートクレーブで滅菌した。溶液２（40%(w/v) PEG4000、50 mM CaCl2、50 mM Tris-HCl (pH7.5)）をフィルターで滅菌した。胞子懸濁溶液として、0.1% Tween80、 0.9% NaCl溶液を使用した。

【0106】

添加物として、Pyrimidine (uridine, uracil)（Uridine 1.2 g, Uracil 1.12 g/1L）と、5-FOA（pH6.5 with 1N KOH, 5-FOA 0.1 g/100 ml）を使用した。5-FOA (5- Fluoroorotic Acid) を使用する際には、目的の培地の1/4量の滅菌水で溶かし、フィルター滅菌した。この溶液を、滅菌水の量のみ３／４量で調製した目的の培地と混合し、5-FOA添加培地とした。

【0107】

（３）プラスミドの構築
エレクトロポレーション法を利用してE.coliの形質転換を行った。

【0108】

ＤＮＡの電気泳動には0.8% agarose gel、ＴＡＥ緩衝液を使用し、１００Ｖで泳動した。泳動終了後、１０ｍｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液で２０分染色し、暗所下で紫外線を照射してＤＮＡを可視化した。ゲルから目的のＤＮＡを抽出する際は、UltraClean 15 DNA Purification Kitを使用した。方法は付属の説明書に従った。

【0109】

表８のＰＣＲ反応液を調製後、アニール温度を５２、５６、６０、６４、６８℃に設定して、表８に併せて示す反応条件でＰＣＲした。伸長時間Ｘは、目的の配列の長さ（１ｋｂ＝１ｍｉｎ）によって設定した。

【0110】

【表8】

【0111】

連結したＤＮＡをベクターにライゲーションした。pGEM（登録商標）-T Easy Vector Systemを用いて、方法は付属の説明書に従った。滅菌済みの爪楊枝でいくつかのコロニーをとりＬＢ培地で３０℃、１２時間振盪培養後プラスミドを抽出した。

【0112】

形質転換を行った大腸菌のコロニーから、滅菌済みの爪楊枝で少量の菌体を取り、アンピシリンの入ったＬＢ液体培地５ｍｌに植菌した。１２〜１６時間振とう培養後、１．５ｍｌの菌液を微小遠心チューブに移した。１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を取り除いて集菌した。QIAprep Spin Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出した。方法は付属の説明書に従った。

【0113】

（４）A. oryzae KBN8243の形質転換
栄養要求性を満たしたCzapek-Dox平面培地にA. oryzae KBN8243を３０℃、４〜７日培養し、そこに滅菌済みの胞子懸濁調製液を１０ｍｌ加え、コンラージ棒を用いて胞子をかき取った。この懸濁液をピペットで集めて胞子懸濁液とした。

【0114】

懸濁した胞子を完全培地５０ｍｌに植菌し、好気的に３０℃、２０時間振盪培養した。培養後、３０００ｒｐｍ、５分遠心して集菌し、デカンテーションで上清を取り除いた後、プロトプラスト化溶液を３０ｍｌ加えて３０℃、３時間穏やかに振盪した。この溶液を滅菌済みのミラクロスでろ過し、ろ液を３０００ｒｐｍ、５分間遠心することでプロトプラストを沈殿させた。上清を取り除いた後、溶液１を１０ｍｌ加えて懸濁させ、再度遠心し上清を捨てることで、プロトプラストを洗浄した。プロトプラストを２×１０⁸／ｍｌとなるように溶液１で懸濁し、その１／４量の溶液２を加えて混合した。０．２ｍｌのプロトプラスト懸濁液に２０μｌ以下の各種プラスミドＤＮＡ溶液を加えて穏やかに懸濁し、氷中で３０分静置した。さらに１ｍｌの溶液２を加えて室温で１５分静置した。この溶液全量を５０℃で保温していた上層培地５ｍｌに混合し、あらかじめシャーレに固化しておいた下層培地の上に均一に広げた。培地が固化したら、３０℃で４〜７日培養した。

【0115】

形質転換株を培養後、胞子を微量かきとり５０μｌのバッファ（100mM Tris-HCl pH9.5, 1M KCl, 10mM EDTA）に懸濁した。この溶液を９５℃で１０分間インキュベートした後、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで強く撹拌した。遠心後、上清１μｌを表９に示すＰＣＲ反応液に加えて、表９に併せて示す反応条件でＰＣＲした。電気泳動後バンドの大きさを確認した。

【0116】

【表9】

【0117】

図５に、形質転換株から抽出したＤＮＡの電気泳動結果を示す。プライマー tef 150 check Fw、Moa 350 check Rv を用いてＰＣＲを行った場合、ＭＯＡＲ１高発現株のゲノムＤＮＡでは１０００ｂｐの位置にバンドが検出されると予想された。形質転換株では１０００ｂｐの位置にバンドが検出されたことから、ＭＯＡＲ１高発現用プラスミドがゲノムＤＮＡに組み込まれていることが示された。

【0118】

（５）リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡレベルでのＭＯＡＲ１の発現量の比較
A.oryzae KBN8243の培養液を吸引濾過後、液体窒素にて回収した菌体を凍結させ、乳鉢・乳棒を用いて破砕した。RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社) により、菌体からＲＮＡを抽出し、PrimeScript（登録商標） 1st cDNA Synthesis Kit (TaKaRa社) によりRNAを逆転写することでcDNAを得た。GeneAce SYBR（登録商標）qPCR Mix plus ROX Tube を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。

【0119】

ＰＣＲチューブにOligo dT primer 溶液１μｌ、dNTP mixture１μｌ、抽出したＲＮＡ溶液８μｌ入れ６５℃で５分間インキュベートした。氷上で冷却後、5×Prime Script II buffer４μｌ、RNase Inhibitor０．５μｌ、PrimeScript II RTase１μｌ、RNase Free dH₂O４．５μｌ、上記で６５℃で５分間インキュベートしたＲＮＡを含む溶液１０μｌを加えて逆転写反応を行った。反応サイクルは、表１０のように行った。これをｃＤＮＡ溶液とした。

【0120】

【表10】

【0121】

SYBR Premix Ex Taq II （１２．５μｌ）、プライマーAO0368 417Fw溶液１．０μｌ、プライマーAO0368 607Rv溶液１．０μｌ、滅菌水８．５μｌ、ｃＤＮＡ溶液２μｌを入れて全量２５μｌとし混合し、リアルタイムＰＣＲにかけた。図６に、野生株と形質転換株とのｍＲＮＡレベルでのＭＯＡＲ１の発現量の比較を示す。

【0122】

図６に示すように、形質転換株は、野生株に比べてＭＯＡＲ１の発現量が９倍高かった。このことから、形質転換株は、ＭＯＡＲ１高発現株であるといえることがわかった。

【0123】

（６）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる細胞内のロイシン酸の定量
Ｃｚａｐｅｋ液体培地５００ｍｌに野生株（ＫＢＮ８２４３）とＭＯＡＲ１高発現株を植菌し、３０℃で３日間振とう培養した。培養液を吸引濾過後、菌体３．０ｇを回収した。液体窒素にて凍結破砕後、５０％メタノール溶液にて細胞内の代謝物を抽出した。これを凍結乾燥し、５０％エタノール溶液３００μｌにて再溶解させたサンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて分析した。図７に、野生株と形質転換株とロイシン酸産生量の比較を示す。

【0124】

図７に示すように、野生株のロイシン酸生産量は３．０ pmol/g wet weightで、形質転換株では２９０ pmol/g wet weightであった。このことから、野生株に比べ形質転換株の方が９７倍ロイシン酸を多く生産していることがわかった

【0125】

（７）リアルタイムＰＣＲによる基質添加時のＭＯＡＲ１の発現解析
Ｃｚａｐｅｋ液体培地５ｍｌのみと、２ｍＭのロイシン、２ｍＭのＭＯＡ、２ｍＭのロイシン酸をそれぞれ添加した培地に野生株を植菌し、２８℃、１００ｒｐｍで３日間振とう培養した。上記と同様、培養液を吸引濾過し、菌体を破砕後、RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN社)を用いて、ＲＮＡを抽出し、PrimeScript（登録商標）1st cDNA Synthesis Kit (TaKaRa社)によりｃＤＮＡに逆転写した。AO0368 417FwおよびAO0368 607RVプライマーを用いて、 GeneAce SYBR（登録商標）qPCR Mix plus ROXによりリアルタイムＰＣＲを行った。図９に、基質添加時のＭＯＡＲ１の発現解析の結果を示す。

【0126】

図９に示すように、ロイシン、ＭＯＡを添加した場合は非添加の時よりＭＯＡＲ１発現量が多かったが、ロイシン酸を添加した時は非添加に比べ発現量が低かった。ＭＯＡＲ１は、ロイシン、ＭＯＡによって誘導され、ロイシン酸にて抑制されることがわかった。以上のことから、ロイシン酸を取得するためには、ロイシン又はＭＯＡの添加が有効であり、一方、生成物（ロイシン酸）によるフィードバック阻害が引き起こされるため、ロイシン酸エチルへの変換が有効であることがわかった。

【配列表フリーテキスト】

【0127】

配列番号３〜１８：プライマー

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]