特許 6392762 女性対象において癌になるリスクの予測を補助するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6392762

(24)【登録日】2018年8月31日

(45)【発行日】2018年9月19日

(54)【発明の名称】女性対象において癌になるリスクの予測を補助するための方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20180910BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20180910BHJP

   C07K 14/665 20060101ALN20180910BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

   G01N33/53 D

   !C07K14/665ZNA

【請求項の数】19

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2015-534992(P2015-534992)

(86)(22)【出願日】2013年10月1日

(65)【公表番号】特表2015-532423(P2015-532423A)

(43)【公表日】2015年11月9日

(86)【国際出願番号】EP2013070471

(87)【国際公開番号】WO2014053502

(87)【国際公開日】20140410

【審査請求日】2016年8月17日

(31)【優先権主張番号】12187050.5

(32)【優先日】2012年10月2日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】514122524

【氏名又は名称】シュピーンゴテック ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100179039

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 洋介

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス ベルクマン

(72)【発明者】

【氏名】オレ メランデル

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０１６０５５７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０４４５６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５３７４３０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌に罹患していない女性対象において癌になるリスクの予測を補助するための方法であって、以下のステップ：
前記女性対象から得られた体液中のプロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）又はその断片のレベルを決定し；そして
前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと癌になるリスクとを相関させ、ここで低減したレベルは、増大した癌になるリスクを示す、
ことを含み、ここで前記プロ‐エンケファリン又はその断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む群から選択され、
ここで、前記癌が、乳癌又は肺癌である、方法。

【請求項2】

前記女性対象から体液サンプルが採取された時点で、前記女性対象が、癌の診断の履歴を有したことがない、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記女性対象が、癌の診断の履歴を有し、そして前記女性対象から体液サンプルが採取された時点で、治癒しており、そして乳癌を再発するリスクが、決定され又は癌の再発が示される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記女性対象から体液サンプルが採取された時点で、前記女性対象が、心血管疾患又は糖尿病を有すると診断されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

年齢、糖尿病の存在、現在の喫煙を含む群から選択される、少なくとも１つの臨床パラメーターがさらに決定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記プロ‐エンケファリンのレベルが、イムノアッセイで測定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記方法が、女性対象において乳癌になるリスクを監視するために、又は治療経過を監視するために、２回以上行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記監視が、採用される予防及び／又は治療手段に対する前記女性対象の応答を評価するために行われる、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記女性対象をリスク群に層別化するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

以下のステップ：
前記女性対象から採取した体液中のプロ‐ニューロテンシン１‐１１７（配列番号１７）のレベルを決定し；そして
前記プロ‐エンケファリン又はその断片及びニューロテンシン１‐１１７（配列番号１７）のレベルと癌になるリスクとを相関させ、ここで、低減したプロ‐エンケファリンのレベルは、癌になる増大したリスクを示し、そしてここで、プロ‐ニューロテンシンの増加したレベルは、癌になる増大したリスクを示す、
ことを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記プロ‐エンケファリン又はその断片の低減したレベルが、閾値未満のレベルであり、ここで前記閾値が、１００ｐｍｏｌ／ｌ未満である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記プロ‐ニューロテンシン又はその断片の増加したレベルが、閾値超のレベルであり、ここで前記閾値が、７８ｐｍｏｌ／ｌ超である、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

前記体液が、血液、血漿、又は血清である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

ＭＲ‐プロ‐エンケファリン（配列番号６）及び／又はプロ‐ニューロテンシン１‐１１７（配列番号１７）のレベルが決定される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

サンプル中の前記プロ‐エンケファリン及び前記プロ‐エンケファリン断片を決定するためのキットであって、アミノ酸１３３‐１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号２２）及びアミノ酸１５２‐１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号２３）である前記プロ‐エンケファリンの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含み、ここで、前記領域のそれぞれが、少なくとも４つ又は５つのアミノ酸を含む、キット。

【請求項16】

前記キットが、健康な対象のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を定量するために十分な感度であり、そして、１５ｐｍｏｌ／ｌ未満の分析アッセイ感度を有する、請求項１５に記載のキット。

【請求項17】

癌に罹患していない女性対象において癌になるリスクを予測し、及び／又は前記女性対象をリスク群に層別化するための、請求項１５又は１６に記載のキットの使用であって、ここで、前記癌が、乳癌又は肺癌である、使用。

【請求項18】

癌に罹患していない女性対象において癌になるリスクを予測し、及び／又は前記女性対象を、オピオイド成長因子（ＯＧＦ）治療を受けるべき群に層別化するための、請求項１５又は１６に記載のキットの使用であって、ここで、前記癌が、乳癌又は肺癌である、使用。

【請求項19】

前記プロ‐エンケファリン及びプロ‐エンケファリン断片のレベルが、癌に罹患していない女性対象において癌になるリスクを予測するために使用される、請求項１５又は１６に記載のキットであって、ここで、前記癌が、乳癌又は肺癌である、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願発明の主題は、癌に罹患していない女性対象において癌になるリスクを予測し、又は女性対象において癌を診断するための方法であって、以下のステップ：
前記女性対象から得られた体液中のプロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸のＬｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含む、その断片のレベルを決定し；そして
前記プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルと癌になるリスクとを相関させ、ここで低減したレベルは、増大した癌になるリスクを予測し、又は癌を診断する、ここで低減したレベルは、癌の診断と相関関係がある
ことを含む、方法である。

【背景技術】

【0002】

Ｍｅｔ‐エンケファリンは、エンケファリン前駆体（プレプロエンケファリン）由来の５つのアミノ酸ペプチドであり、また「オピオイド成長因子（ＯＧＦ）」とも呼ばれ、プロエンケファリン断片と共に放出される。成熟したペプチドは、さまざまなオピオイド受容体に結合する（Ｋｏｎｅｒｕら、２００９）。エンケファリン（ＯＧＦ）が、多くの生理的機能を有することを見出した。ＣＮＳにおいて、それは、サブスタンスＰ関連疼痛シグナル伝達を下方制御し、サイトカインとしての役割を果たす（Ｐｌｏｔｎｉｋｏｆｆら、１９９７）。プロエンケファリンは、抗菌作用を示すペプチドと関連する（Ｇｏｕｍｏｎら、１９９８）。プロエンケファリン及びエンケファリンは、抗腫瘍作用を示し、そしてプロアポトーシス剤として作用する（Ｔａｖｉｓｈら、２００７、Ｄｏｎａｈｕｅら、２０１１、Ｚａｇｏｎら、２００９）。

【0003】

男性における癌のリスクの予測のための血管作動性ペプチドの使用は、Ｂｅｌｔｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｓ＆Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎによって報告されている。ＭＲ‐ｐｒｏ‐ＡＮＰ、ＭＲ‐ｐｒｏ‐ＡＤＭ及びコペプチンは、Ｍａｌｍｏ Ｄｉｅｔ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙの１９９１〜１９９４におけるベースライン試験の前に癌に罹患していない参加者（１７６８人の男性及び２２９３人の女性）由来の空腹時血漿において測定された。著者は、女性間では、バイオマーカーと癌発生率の間には関連性がなかったことを述べている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本願発明の主題は、癌発生率の予測及び癌の再発のリスクの予測のためのＰＥＮＫの予後予測及び診断能力を研究することであった。この問題に対処するために、空腹時血漿中のプロ‐エンケファリンの適切な断片（Ｅｒｎｓｔら、２００６）が、前記スウェーデンの前向きコホート研究（Ｍａｌｍｏ Ｄｉｅｔ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙ）において測定し、そして追跡の１５年の間の乳癌発生率に対するこのバイオマーカーのベースラインレベルを関連付けた。

【0005】

驚くべきことに、プロ‐エンケファリンが、癌に罹患していない女性対象において、癌になるリスクを予測し、又は女性対象において癌を診断するための女性のための有力なそして非常に重要なバイオマーカーであることが示された。

【0006】

従って、本願発明の主題は、癌に罹患していない女性対象において、癌になるリスクを予測し、又は女性対象において癌を診断するための方法であり、以下のステップ：
前記女性対象から得られた体液中のプロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルを決定し；そして
前記プロ‐エンケファリン又はその断片と癌になるリスクとを相関させ、ここで低減したレベルは、増大した癌になるリスクを予測し、又は癌を診断する、ここで低減したレベルは、癌の診断と相関関係がある
ことを含む、方法である。

【0007】

癌の例は、乳癌、肺癌、膵臓癌及び結腸癌からなる群から選択されてもよい。本願明細書全体を通じて、用語「プロ‐エンケファリンの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏ‐Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）」は、また、Ｌｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含むことが理解されるべきである。

【0008】

本願発明の特定の実施態様では、前記癌は、乳癌である。本願発明の他の特定の実施態様では、前記癌は、肺癌である。従って、本願発明の主題は、癌、例えば、乳癌、肺癌などに罹る女性の感受性の決定である。

【0009】

本研究で得られたデータは、また、男性対象において癌になるリスクと前記男性対象から得た体液中のプロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルとの間の相関を明らかにしたが、この相関関係は、男性においてまた、ＰＥＮＫの低減したレベルで、増大した癌のリスクについての明確な傾向があったが、しかしながら、本データセットについて、統計的に有意ではなかった。従って、男性対象のためにも、本願発明の方法の価値はあるが、本研究において、観察された効果は、男性対象について、女性対象と比較して同程度に強いものではなかった。これは、男性集団における癌事象が少ないことが、主な原因であるかもしれない。

【0010】

さらに、本研究で得られたデータは、女性対象において癌になるリスクと前記女性対象から得た体液中のプロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片との間の相関関係を、ここで、前記癌は、肺癌又は乳癌ではなかったが、また明らかにした。この特定の集団における少数の事象のために、この相関関係は、しかしながら、本データセットについて統計的に有意ではなかった。有意ではないが、明確な傾向があった。本データは、エンケファリン、ＰＥＮＫの断片の公知のプロアポトーシス作用により、他の癌においても、そのような相関関係を示唆することが、さらに信頼できる。先行技術を発端として、プロ‐エンケファリン又はその断片が、癌を予測し得ることは驚くべきことである。乳癌及び肺癌について統計的に非常に関連性のある本データを根幹として、同様に他の種類の癌について予後予測し得ることが期待され、そして信頼できる。

【0011】

本願明細書中で使用される場合、用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、生きているヒト又はヒト以外の生物を意味する。本明細書中で好ましくは、対象は、ヒト対象である。

【0012】

用語「低減したレベル（ｒｅｄｕｃｅｄ ｌｅｖｅｌ）」は、特定の閾値レベル未満のレベルを意味する。

【0013】

体液は、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ｃｓｆ）及び唾液を含む群から選択されてもよい。

【0014】

本願発明の１つの実施態様では、前記女性対象は、体液のサンプルが前記女性対象から採取された時点で、診断された癌を有したことがない。

【0015】

他の実施態様では、前記女性対象は、癌に罹患していると以前に診断されており、そして、体液のサンプルが前記女性対象から採取された時点で、治癒しており、そして癌の再発のリスクが決定され、又は癌の再発が予測される。

【0016】

プロ‐エンケファリンは、以下の配列を有する。

【0017】

配列番号１（プロ‐エンケファリン（１‐２４３））

【化1】

【0018】

体液中で測定し得るプロ‐エンケファリンの断片は、例えば、以下の断片の群から選択される。
配列番号２（シンエンケファリン（Ｓｙｎｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、プロ‐エンケファリン１‐７３）

【化2】

【0019】

配列番号３（Ｍｅｔ‐エンケファリン）

【化3】

【0020】

配列番号４（Ｌｅｕ‐エンケファリン）

【化4】

【0021】

配列番号５（プロ‐エンケファリン９０‐１０９）

【化5】

【0022】

配列番号６（プロ‐エンケファリン１１９‐１５９、中領域（Ｍｉｄ ｒｅｇｉｏｎａｌ）プロ‐エンケファリン、ＭＲＰＥＮＫ）

【化6】

【0023】

配列番号７（Ｍｅｔ‐エンケファリン‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ‐Ｌｅｕ）

【化7】

【0024】

配列番号８（プロ‐エンケファリン１７２‐１８３）

【化8】

【0025】

配列番号９（プロ‐エンケファリン１９３‐２０３）

【化9】

【0026】

配列番号１０（プロ‐エンケファリン２１３‐２３４）

【化10】

【0027】

配列番号１１（プロ‐エンケファリン２１３‐２４１）

【化11】

【0028】

配列番号１２（Ｍｅｔ‐エンケファリン‐Ａｒｇ‐Ｐｈｅ）

【化12】

【0029】

Ｌｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含むプロ‐エンケファリン又はその断片のレベルを決定は、プロ‐エンケファリン又はＬｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含む、その断片に向けての免疫反応性が決定されることを意味し得る。結合の領域に依存する、Ｌｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含むプロ‐エンケファリン又はその断片の決定のために使用される結合剤は、上に示した分子の１つ以上に結合してもよい。これは、当業者に明らかである。

【0030】

従って、本願発明によれば、任意の上記ペプチド及びペプチド断片のアミノ酸配列（すなわち、プロ‐エンケファリン（ＰＥＮＫ）及び任意の配列番号１〜１２による断片）内の領域に結合する少なくとも１つの結合剤を使用することによる免疫反応性分析物のレベルは、前記対象から得た体液において決定し；そして、臨床的関連の特定の実施態様と相関させる。

【0031】

本願発明による方法のより具体的な実施態様では、ＭＲＰＥＮＫのレベルが決定される（配列番号６：プロ‐エンケファリン１１９‐１５９、中領域プロ‐エンケファリン断片、ＭＲＰＥＮＫ、ＤＡＥＥＤＤＳＬＡＮＳＳＤＬＬＫＥＬＬＥＴＧＤＮＲＥＲＳＨＨＱＤＧＳＤＮＥＥＥＶＳ）。より具体的な実施態様では、ＭＲ‐ＰＥＮＫに結合する少なくとも１つの結合剤を使用することによる免疫反応性分析物のレベルが決定され、そして本願発明による臨床的関連の特定の実施態様と相関させる。

【0032】

プロ‐エンケファリン又はＬｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリン又はそれらの断片を含むその断片のレベルの決定は、プロ‐エンケファリン又はＬｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含む、その断片に向けての免疫反応性が決定されることを意味し得る。結合の領域に依存する、Ｌｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含むプロ‐エンケファリン又はその断片の決定のために使用される結合剤は、上に示した分子の１つ以上に結合してもよい。これは、当業者に明らかである。本願発明の他の実施態様では、断片は、Ｌｅｕ‐エンケファリン又はＭｅｔ‐エンケファリンでなく、本願発明の他の実施態様では、プロ‐エンケファリン又はＬｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンを含まない、その断片に向けての免疫反応性が決定される。

【0033】

あるいは、任意の上の分析物のレベルが、他の分析方法、例えば、質量分析法によって、決定されてもよい。

【0034】

特定の実施態様では、プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルは、プロ‐エンケファリン又はその断片に結合する抗体又は抗体の断片を使用するイムノアッセイで測定される。プロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片を決定するために有用であり得るイムノアッセイは、実施例２で概説されるステップを含んでもよい。すべての閾値及び値は、実施例２に従って使用される試験及びキャリブレーションに対する相関について理解されなければならない。当業者は、閾値の絶対値が、使用されるキャリブレーションによって影響されるかもしれないことを理解しているであろう。これは、本願明細書中で与えられたすべての値及び閾値が、本願明細書中で使用されるキャリブレーション（実施例２）の文脈において理解されるべきであることを意味する。本願発明によれば、プロ‐エンケファリンに対する診断結合剤は、抗体、例えば、ＩｇＧ、標準的な全長免疫グロブリン、又は、少なくとも重及び／又は軽鎖のＦ‐可変領域を有する抗体断片、例えば、化学結合した抗体（Ｆａｂ）、限定されないが、Ｆａｂミニボディを含むＦａｂ‐断片、単鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価のＦａｂ抗体、例えば、ＣＨ３領域で二量体化されたＦａｂ‐Ｖ５Ｓｘ２；二価Ｆａｂ（ミニ抗体）；二価Ｆａｂ又は多価Ｆａｂ、例えば、異種ドメインを用いて多量体化を介して形成される、例えば、ｄＨＬＸドメインの二量体化を介して、例えば、Ｆａｂ‐ｄＨＬＸ‐ＦＳｘ２；Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｘ‐断片、多量体化多価又は／及び多重特異性ｓｃＦｖ‐断片、二価及び／又は二重特異性ダイアボディ、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞誘導（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ・ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ））、三機能性（tｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）抗体、多価抗体、例えば、Ｇとは異なるクラス由来の；シングルドメイン抗体、例えば、ラクダ科の動物又はフィッシュ免疫グロブリン由来のナノボディからなる群から選択される。

【0035】

特定の実施態様では、プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルは、以下で詳細に記載されるような、プロ‐エンケファリン又はその断片に結合する、アプタマー、非‐Ｉｇスキャフォールドを含む群から選択される結合剤を使用するアッセイで測定される。

【0036】

プロ‐エンケファリン又はその断片のレベルを決定するために使用され得る結合剤は、少なくとも１０⁷Ｍ^-1、好ましくは、１０⁸Ｍ^-1のプロ‐エンケファリンに対する親和定数、好ましい親和定数は、１０⁹Ｍ^-1超、最も好ましくは、１０¹⁰Ｍ^-1超を示す。当業者は、化合物のより高い用量を適用することによってより低い親和性を補うと考えられ得、そしてこの測定が、本願発明の範囲外につながらないことを理解する。結合親和性は、分析サービス、例えば、Ｂｉａｆｆｉｎ Ｋａｓｓｅｌ Ｇｅｒｍａｎｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｆｆｉｎ．ｃｏｍ／ｄｅ／）として提供されるＢｉａｃｏｒｅを使用して決定されてもよい。

【0037】

ヒトプロ‐エンケファリン対照サンプルは、ＩＣＩ‐Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｉ‐ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／から入手し得る。アッセイは、また、合成（本願発明者等の実験では、本願発明者等は、合成ＭＲＰＥＮＫ、配列番号６を使用）又は組み換えプロ‐エンケファリン又はその断片によってキャリブレーションしてもよい。

【0038】

本願発明の方法に従って、女性対象において乳癌になるリスクを決定し、又は女性対象における乳癌を診断するための閾値は、１００ｐｍｏｌ／ｌ ＰＥＮＫ未満、５０ｐｍｏｌ／ｌ未満、より好ましくは、４０．４ｐｍｏｌ／ｌ未満である。特定の実施態様では、前記閾値は、約４０．４ｐｍｏｌ／ｌである。これらの閾値は、上記のキャリブレーション法に関連する。前記閾値未満のＰＥＮＫ値は、対象が、癌にかかる増大したリスクを有し、又はすでに癌に罹患していることを意味する。

【0039】

本願発明の１つの実施態様では、前記方法は、女性対象において乳癌になるリスクを監視するために、又は処置の経過を監視するために、２回以上行われる。１つの特定の実施態様では、前記監視は、採用される予防及び／又は治療手段に対する前記女性対象の応答を評価するために行われる。

【0040】

本願発明の１つの実施態様では、方法は、前記女性対象をリスク群に層別化するために使用される。

【0041】

本願発明の主題は、また、女性において癌になるリスクを予測し、又は任意の従前の実施態様に従って、癌になる増大したリスクを有する女性対象を識別するための方法であり、ここで、前記女性対象から得た体液中のプロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルが、単独で又は他の予後予測に有用な実験室的又は臨床的パラメーターと組み合わせてのいずれかで、以下の選択肢：
「健康な」又は「見かけ上健康な」対象の集団において予め決定されたサンプルのアンサンブル中の前記女性対象から得た体液中のプロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のこの断片のレベルの中央値との比較、
「健康な」又は「見かけ上健康な」対象の集団において予め決定されたサンプルのアンサンブル中の前記女性対象から得た体液中のプロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のこの断片のレベルの変位値との比較、
Ｃｏｘ比例ハザード分析に基づく、又はリスク指標計算、例えば、ＮＲＩ（純再分類指標（Ｎｅｔ Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ））又はＩＤＩ（統合判別指標（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ））を使用することによる計算
から選択されてもよい方法による有害事象を得る対象のリスクの予測のために使用される。

【0042】

本願発明の主題の１つの実施態様は、また、女性において癌になるリスクを予測し、又は任意の従前の実施態様に従って、癌になる増大したリスクを有する女性対象を識別するための方法であり、ここで、前記女性対象から得た体液中のプロ‐エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルが、単独で又は他の予後予測に有用なバイオマーカーと組み合わせて使用される。

【0043】

本願発明による方法のより具体的な実施態様では、プロ‐ニューロテンシン１‐１１７のレベルが、プロ‐エンケファリン又はその断片の決定に加えて決定されてもよい。

【0044】

従って、本願発明の主題は、また、癌に罹患していない女性対象において癌になるリスクを予測し、又は女性対象において癌を診断するための方法であって、以下のステップ：
前記女性対象から得た体液中のプロ‐エンケファリン又はＬｅｕ‐エンケファリン及びＭｅｔ‐エンケファリンの少なくとも５つのアミノ酸を含む、その断片のレベルを決定し；
前記女性対象から得た体液中のプロ‐ニューロテンシン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルを決定し；そして
前記プロ‐エンケファリン又はその断片及びプロ‐ニューロテンシン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片と癌になるリスクとを相関させ、ここで、プロ‐エンケファリンの低減したレベルが、癌になる増大したリスクのための予測であり、又は癌を診断し、ここで、低減したレベルが癌の診断と相関関係があり、そしてここで、プロ‐ニューロテンシンの増加したレベルが、癌になる増大したリスクのための予測であり、又は癌を診断する、ここで、増加したレベルが、癌の診断と相関関係がある
ことを含む、方法である。

【0045】

配列番号１３（プロ‐ニューロテンシン１‐１４７）

【化13】

【0046】

配列番号１４（プロ‐ニューロテンシン１‐１２５（ラージニューロメディン（ｌａｒｇｅ ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ）Ｎ）

【化14】

【0047】

配列番号１５（ニューロメディンＮ）

【化15】

【0048】

配列番号１６（ニューロテンシン）

【化16】

【0049】

配列番号１７（プロ‐ニューロテンシン１‐１１７）

【化17】

【0050】

配列番号１８（プロ‐ニューロテンシン１‐１３２）

【化18】

【0051】

配列番号１９（プロ‐ニューロテンシン１２０‐１４０）

【化19】

【0052】

配列番号２０（プロ‐ニューロテンシン１２０‐１４７）

【化20】

【0053】

配列番号２１（プロ‐ニューロテンシン１２８‐１４７）

【化21】

【0054】

特定の実施態様では、プロ‐ニューロテンシンのレベルは、イムノアッセイで測定される。より具体的には、イムノアッセイは、Ｅｒｎｓｔら（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００６），（２７）１７８７‐１７９３）に記載されたように使用されてもよい。プロ‐ニューロテンシン又は少なくとも５つのアミノ酸のその断片のレベルを決定するために有用であり得るイムノアッセイは、実施例２に概説されるようなステップを含んでもよい。すべての閾値及び値は、実施例２に従って使用される試験及びキャリブレーションに対する相関について理解されなければならない。当業者は、閾値の絶対値が、使用されるキャリブレーションによって影響されるかもしれないことを理解しているであろう。これは、本願明細書中で与えられたすべての値及び閾値が、本願明細書中で使用されるキャリブレーション（実施例２）の文脈において理解されるべきであることを意味する。ヒトプロ‐ニューロテンシン‐キャリブレーターは、ＩＣＩ‐Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによって入手し得る。あるいは、アッセイは、また、合成又は組み換えＰ‐ＮＴ１−１１７又はその断片によってキャリブレーションされてもよい（Ｅｒｎｓｔら、２００６をまた参照）。

【0055】

プロ‐ニューロテンシン又はその断片のレベルを決定するために使用されてもよい結合剤は、少なくとも１０⁷Ｍ^-1、好ましくは、１０⁸Ｍ^-1のプロ‐ニューロテンシンに対する親和定数を示し、好ましい親和定数は１０⁹Ｍ^-1超であり、最も好ましくは、１０¹⁰Ｍ^-1である。当業者は、化合物のより高い用量を適用することによってより低い親和性を補うと考えられ得、そしてこの測定が、本願発明の範囲外につながらないことを理解する。結合親和性は、分析サービス、例えば、Ｂｉａｆｆｉｎ Ｋａｓｓｅｌ Ｇｅｒｍａｎｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｆｆｉｎ．ｃｏｍ／ｄｅ／）として提供されるＢｉａｃｏｒｅを使用して決定されてもよい。本願発明の方法による、女性対象において乳癌になるリスクを決定するための、又は女性対象において乳癌を診断するための閾値は、７８ｐｍｏｌ／ｌ ＰＮＴ超、好ましくは、１００ｐｍｏｌ／ｌ ＰＮＴ超、より好ましくは、１５０ｐｍｏｌ／ｌ ＰＮＴ超である。特定の実施態様では、前記閾値は、約１００ｐｍｏｌ／ｌ ＰＮＴ超である。これらの閾値は、上記キャリブレーション法に関連する。上記閾値超のＰ‐ＮＴ値は、対象が癌になる増大したリスクを有し、又は既に癌に罹患していることを意味する。

【0056】

本願発明の１つの実施態様では、前記方法は、女性対象において乳癌になるリスクを監視するために、又は処置の経過を監視するために、２回以上行われる。１つの特定の実施態様では、前記監視は、採用される予防及び／又は治療手段に対する前記女性対象の応答を評価するために行われる。

【0057】

本願発明の１つの実施態様では、方法は、前記女性対象をリスク群に層別化するために使用される。

【0058】

本願発明の１つの実施態様では、癌は、乳癌及び肺癌を含む群から選択される。

【0059】

本願発明の主題は、アミノ酸１１３‐１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号２２）及びアミノ酸１５２‐１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ，配列番号２３）であるプロ‐エンケファリンの領域内の２つの異なる領域に結合する２つの結合剤を含む、サンプル中のプロ‐エンケファリン及びプロ‐エンケファリン断片を決定するためのさらなるアッセイであり、ここで、それぞれの前記領域は、少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。

【0060】

本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、前記アッセイの分析感度は、健康な対象のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を定量することができ、そして、＜１５ｐｍｏｌ／ｌ、好ましくは、＜１０ｐｍｏｌ／ｌ、そして最も好ましくは、＜６ｐｍｏｌ／ｌである。

【0061】

本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、前記結合剤は、少なくとも１０⁷Ｍ^-1、好ましくは、１０⁸Ｍ^-1のその結合パートナーに対する結合親和性を示し、好ましい親和定数は１０⁹Ｍ^-1未満であり、最も好ましくは、１０¹⁰Ｍ^-1未満である。当業者は、化合物のより高い用量を適用することによってより低い親和性を補うと考えられ得、そしてこの測定が、結合親和性が上記のように決定されてもよい、本願発明の範囲外につながらないことを理解する。

【0062】

本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、そのようなアッセイは、サンドイッチアッセイ、好ましくは、完全に自動化されたアッセイである。ＥＬＩＳＡは完全に自動化又は手動であってもよい。いわゆる、ＰＯＣ‐試験（臨床現場即時（ｐｏｉｎｔ‐ｏｆ‐ｃａｒｅ）試験）であってもよい。自動又は完全に自動化されたアッセイの例は、以下のアッセイ：Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｃｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、Ｂｒａｈｍｓ Ｋｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ Ｖｉｄａｓ（登録商標）、Ａｌｅｒｅ Ｔｒｉａｇｅ（登録商標）の１つに使用されてもよいアッセイを含む。

【0063】

本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、前記２つの結合剤の少なくとも１つが、検出されるために、標識される。標識の種類は、上で提供される。

【0064】

本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、前記２つの結合剤の少なくとも１つが、固相に結合される。固相の例は、上で提供される。

【0065】

本願発明によるサンプル中のプロ‐エンケファリン又はプロ‐エンケファリン断片を決定するためのアッセイの１つの実施態様では、前記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨード標識を含む群から選択される。

【0066】

本願発明のさらなる主題は、本願発明に従ったアッセイを含むキットであり、ここで、前記キットの構成要素は、１つ以上の容器中に含まれてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0067】

【図1】図１は、典型的なプロ‐エンケファリン用量／シグナル曲線を示す。プロ‐エンケファリンの標準曲線である。

【図2】図２は、女性集団におけるプロ‐エンケファリンの度数分布を示す。

【図3】図３は、女性の累積癌診断の四分位数（Ｑ）１（４０．４ｐｍｏｌ／ｌ未満）、四分位数２（４０．４〜４７．１ｐｍｏｌ／ｌ）、四分位数３（４７．２〜５４．１ｐｍｏｌ／ｌ）、四分位数４（５４．１ｐｍｏｌ／ｌ超）を示す、カプランマイヤーグラフである。低減したＰＥＮＫは、乳癌発症の長期の増加したリスクを示す。ベースラインの日時点での癌病歴を有する任意の女性（血液サンプリング）を排除したので、プロ‐エンケファリンは、将来の乳癌発症について、非常に予測する。全体にわたって、Ｑ１の女性は、Ｑ４の女性よりも、乳癌発症の３．６倍高いリスクを有する。

【図4】図４は、乳癌予測のためのプロ‐エンケファリンの複合解析の図例を示す。

【実施例】

【0068】

実施例１
抗体の開発
ペプチド
ペプチドを合成した（ＪＰＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
ペプチド／免疫コンジュゲート
免疫のためのペプチドを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するペプチドのコンジュゲートのための追加のＮ‐末端システイン残基で合成した。ペプチドを、Ｓｕｌｆｏ‐ＳＭＣＣ（Ｐｅｒｂｉｏ‐ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによってＢＳＡと共有結合させた。共有結合の方法を、Ｐｅｒｂｉｏの取扱説明書に従って、行った。

【0069】

【表1】

【0070】

抗体を、以下の方法に従って生成した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日及び１４日で、１００μｇペプチド‐ＢＳＡ‐コンジュゲート（１００μｌ完全フロイントアジュバントにおいて乳化）、２１日及び２８日で、５０μｇ（１００μｌ不完全フロイントアジュバントにおいて）で免疫した。融合実験を行った３日前に、動物は、１つは腹腔内注射及び１つは静脈内注射として与えられる、１００μｌ生理食塩水中に溶解した５０μｇのコンジュゲートを受けた。

【0071】

免疫したマウス由来の脾細胞及び骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞を、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールで、３７℃で３０秒間、融合した。洗浄後、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種した。ハイブリッドクローンを、ＨＡＴ培地で生育することによって選択した（２０％ウシ胎児血清及びＨＡＴサプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）。２週間後、ＨＡＴ培地を、３回継代のために、ＨＴ培地で置換し、続いて、通常の細胞培養培地に戻した。

【0072】

細胞培養物上清を、融合後３週間、抗原特異的ＩｇＧ抗体について、一次スクリーニングした。試験陽性ミクロ培養を、増殖のために、２４ウェル中に移した。再試験後、選択された培養物を、限界希釈技術を使用して、クローン化しそして再クローン化し、そしてアイソタイプを決定した。

【0073】

（Ｌａｎａ，Ｒ．Ｄ．“Ａ ｓｈｏｒｔ‐ｄｕｒａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｆｕｓｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８１：２２３‐２２８；（１９８５）、Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｂ．ら、“Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＧＡＤ）ｉｓ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｒａｔ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＧＡＤ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２８：１１‐１５，（１９９６））。

【0074】

モノクローナル抗体生成
抗体を、標準の抗体生成法（Ｍａｒｘら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（１９９７），ＡＴＬＡ ２５，１２１）を介して生成し、そしてＰｒｏｔｅｉｎ Ａ‐ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを介して精製した。抗体の精製率は、ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づいて、＞９５％であった。

【0075】

抗体の標識及びコーティング
すべての抗体を、以下の方法に従って、アクリジニウムエステルで標識した。
標識化合物（トレーサー）：１００μｇ（１００μｌ）抗体（ＰＢＳにおいて、１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を、１０μｌアクリジニウムＮＨＳ‐エステル（アセトニトリルにおいて、１ｍｇ／ｍｌ、ＩｎＶｅｎｔ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（欧州特許第０３５３９７１号）と混合し、そして室温で、２０分間、インキュベートした。標識抗体を、Ｂｉｏ‐Ｓｉｌ ＳＥＣ ４００‐５でのゲルろ過ＨＰＬＣ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）によって精製した。精製した標識抗体を、（３００ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａｃｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ‐ＥＤＴＡ、５ｇ／ｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）において、希釈した。最終濃度は、標識化合物（２００μｌあたり）で、約８００．０００相対発光量（ＲＬＵ）であった。アクリジニウムエステル化学発光を、ＡｕｔｏＬｕｍａｔ ＬＢ ９５３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を使用することにより、測定した。

【0076】

固相抗体（コーティングされた抗体）
固相：ポリスチレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ‐Ｏｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧ，Ａｕｓｔｒｉａ）を、抗体（１．５μｇ抗体／０．３ｍｌ、１００ｍｍｏｌ／ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）で、コーティングした（室温で１８時間）。５％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、チューブをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、そして真空乾燥した。

【0077】

抗体特異性
さまざまな抗体の交差反応性を、表２に示す。

【0078】

【表2】

【0079】

抗体交差反応性を、以下のように決定した。
３００μｌ ＰＢＳ中の１μｇペプチド（ｐＨ７．４）を、ポリスチレンチューブに分注し、そして室温で、１時間、インキュベートした。インキュベーション後、チューブを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の５％ ＢＳＡを使用して、５回（それぞれ１ｍｌ）洗浄した。標識抗体のそれぞれを添加し（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３００μｌ、８００．０００ＲＬＵ／３００μｌ）、室温で２時間、インキュベートした。５回洗浄した後（それぞれ１ｍｌの洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／l ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）、残存発光（標識抗体）を、Ａｕｔｏ Ｌｕｍａｔ ＬＢ ９５３を使用して定量した。ＭＲＰＥＮＫ‐ペプチドを、参照物質として使用した（１００％）。

【0080】

【表3】

【0081】

すべての抗体は、免疫のために使用したペプチドに相当する、ＭＲＰＥＮＫペプチドを結合した。ＮＴ‐ＭＲＰＥＮＫ抗体（ＥＥＤＤＳＬＡＮＳＳＤＬＬＫと１０％交差反応）以外の抗体は、抗体の免疫のために使用されないＭＲ‐ＰＥＮＫペプチドと交差反応を示さなかった。

【0082】

プロ‐エンケファリンイムノアッセイ
５０μｌのサンプル（又はキャリブレーター）を、コーティングされたチューブに分注し、標識抗体（２００μｌ）を添加した後、チューブを、１８〜２５℃で２時間、インキュベートした。結合しなかったトレーサーを、洗浄液（２０ｍｍｏｌ／ｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００）で、５回洗浄することによって（それぞれ１ｍｌ）、除去した。チューブ結合標識抗体を、Ｌｕｍｉｎｕｍｅｔｅｒ ＬＢ ９５３及び１０００ｐｍｏｌ／ｌ ＭＲＰＥＮＫの固定された濃度を使用して、測定した。異なる抗体の組み合わせのノイズ（ＭＲＰＥＮＫなしのＲＬＵ）比に対するシグナル（１０００ｐｍｏｌ ＭＲＰＥＮＫ／ｌでのＲＬＵ）を、表４に示す。すべての抗体は、任意の他の抗体とのサンドイッチ複合体を生成することができた。驚くべきことに、ノイズ比に対する最も強いシグナル（最も良い感受性）を、ＭＲ‐ＭＲＰＥＮＫとＣＴ‐ＭＲＰＥＮＫ抗体とを組み合わせることで生成した。その後、本願発明者等は、この抗体の組み合わせを使用して、さらなる研究のためのＭＲＰＥＮＫ‐イムノアッセイを行った。ＭＲ‐ＭＲＰＥＮＫ抗体を、コーティングされたチューブ抗体として使用し、そしてＣＴ‐ＭＲＰＥＮＫ抗体を標識抗体として使用した。

【0083】

【表4】

【0084】

キャリブレーション
アッセイを、２０ｍＭ Ｋ₂ＰＯ₄、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＢＡＳ、５０μＭ アマスタチン、１００μＭ ロイペプチン、ｐＨ８．０で希釈された、合成ＭＲＰＥＮＫの希釈液を使用して、キャリブレーションを行った。プロ‐エンケファリン対照血漿は、ＩＣＩ‐ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手し得る。図１は、典型的なプロ‐エンケファリン用量／シグナル曲線を示す。標準曲線プロ‐エンケファリンである。アッセイの感受性は、０‐キャリブレーター（（ＭＲＰＥＮＫの添加）＋２ＳＤ）の２０決定、５．５ｐｍｏｌ／Ｌであった。

【0085】

集団研究
方法
本願発明者等は、１９９１〜１９９４のＭａｌｍｏ Ｄｉｅｔ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙベースライン試験（年齢５８±６歳及び５９％の女性）に基づく集団の２５５９人の女性参加者から空腹時血漿中のプロ‐エンケファリンを測定した。本願発明者等は、多変量補正（すべての従来の心血管リスク因子、糖尿病リスク因子及び癌についてのまた癌の遺伝の分析における）コックス比例ハザードモデルを使用して、ベースラインＰＥＮＫ（それぞれの対数変換ＰＥＮＫの標準偏差増加あたりのハザード比）を１２年超の追跡期間の中央値の間のそれぞれの研究されたエンドポイントの最初の事象の時と関連付けた。エンドポイントを、スウェーデン国立病院の退院登録、スウェーデンの心筋梗塞登録、Ｍａｌｍｏ登録における脳卒中及びスウェーデンの癌登録を介して、検索した。これらの登録を介してのエンドポイントの検索は、正確であることが検証されそして理解されている（Ｂｅｌｔｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ；１‐１０．２０１２ ＡＡＣＲをまた参照）。

【0086】

研究における女性の臨床特性

【表5】

【0087】

図２は、女性集団のおけるプロ‐エンケファリンの度数分布を示す。
平均値は、４７．２ｐｍｏｌ／ｌ、標準偏差＝１．２ｐｍｏｌ／ｌであった。Ｘ軸は、ＰＥＮＫ濃度の自然対数（ＬＮ）である。すべての結果は、アッセイの測定の範囲内であり、最も低いＰＥＮＫ濃度は、９ｐｍｏｌ／ｌであった。これらの結果は、使用したアッセイの適合性を示す（アッセイの感度５．５ｐｍｏｌ／ｌ）。

【0088】

乳癌のＰＥＮＫ及び予測
プロ‐エンケファリンと乳癌との関連性を評価した（表６）。女性において、プロ‐エンケファリンと乳癌との間に強い関連性があった。完全補正モデルにおいて、プロ‐エンケファリンのそれぞれのＳＤ増加は、将来の乳癌の２８．６％のリスク低減と関連し、又はプロ‐エンケファリンのＳＤの低減（ｒｅｖＰＥＮＫ）は、将来の乳癌の４０％増加したリスクと関連し（表５）、そしてプロ‐エンケファリンの四分位数の最上位対最下位は、乳癌のリスクにおいて、３倍超の差を確認した（表７及び図３を参照）。

【0089】

【表6】

【0090】

【表7】

【0091】

図３は、女性の累積癌診断の四分位数（Ｑ）１（４０．４ｐｍｏｌ／ｌ未満）、四分位数２（４０．４〜４７．１ｐｍｏｌ／ｌ）、四分位数３（４７．２〜５４．１ｐｍｏｌ／ｌ）、四分位数４（５４．１ｐｍｏｌ／ｌ超）を示す、カプランマイヤーグラフである。低減したＰＥＮＫは、乳癌発生の長期の増加したリスクを示す。ベースラインの日時点での癌病歴を有する任意の女性（血液サンプリング）を排除したので、プロ‐エンケファリンは、将来の乳癌発生について、非常に予測する。全体にわたって、Ｑ１の女性は、Ｑ４の女性よりも、乳癌発症の３．６倍高いリスクを有する。

【0092】

プロ‐エンケファリンとプロ‐ニューロテンシンとの組み合わせ
最近、増加するプロ‐ニューロテンシンが、乳癌について、非常に予測することを示したので、本願発明者等は、乳癌予測のための両バイオマーカーを組み合わせた。

【0093】

実施例
プロ‐ニューロテンシンアッセイ
抗体を上記のように生成した。標識した抗体（ＬＡ）を、Ｐ‐ＮＴ１‐１９（Ｈ‐ＣＳＤＳＥＥＥＭＫＡＬＥＡＤＦＬＴＮＭＨ（配列番号２４）に対して生成し、そして固相抗体（ＳＰＡ）を、ペプチドＰ‐ＮＴ４４‐６２（ＣＮＬＮＳＰＡＥＥＴＧＥＶＨＥＥＥＬＶＡ（配列番号２５））に対して、生成した。

【0094】

ヒトプロ‐ニューロテンシンの定量のためのイムノアッセイ
使用した技術は、アクリジニウムエステル標識に基づく、サンドイッチコーティングされたチューブ発光イムノアッセイであった。

【0095】

標識化合物（トレーサー）：１００μｇ（１００μｌ）ＬＡ（ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を、１０μｌアクリジニウムＮＨＳ‐エステル（アセトニトリル中の１ｍｇ／ｍｌ、ＩｎＶｅｎｔ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（欧州特許第０３５３９７１号）と混合し、そして室温で２０分間、インキュベートした。標識ＬＡを、Ｂｉｏ‐Ｓｉｌ ＳＥＣ ４００‐５ゲルろ過ＨＰＬＣ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で精製した。精製したＬＡを、希釈した（３００ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ‐ＥＤＴＡ、５ｇ／ｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０で）。最終濃度は、標識化合物２００μｌあたり（約２０ｎｇ標識抗体）、約８００．０００相対発光量（ＲＬＵ）であった。アクリジニウムエステル化学発光を、ＡｕｔｏＬｕｍａｔ Ｌ ９５３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を使用することで測定した。

【0096】

固相：ポリスチレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ‐Ｏｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧ，Ａｕｓｔｒｉａ）を、ＳＰＡ（１．５μｇ ＳＰＡ／０．３ｍｌ １００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）で、コーティングした（室温で１８時間）。５％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、チューブをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、そして真空乾燥した。

【0097】

キャリブレーション
アッセイを、プロ‐ニューロテンシンコーティングヒト血清の希釈液を使用して、キャリブレーションした。高いプロ‐ニューロテンシン免疫反応性を有するヒト血清のプールを（ＩｎＶｅｎｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ウマ血清で希釈した（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）（アッセイスタンダード）。

【0098】

スタンダードを、ヒトプロ‐ニューロテンシン‐キャリブレーター（ＩＣＩ‐Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用により、キャリブレーションした。あるいは、アッセイを、合成又は組み換えＰ‐ＮＴ１‐１１７又はその断片によってキャリブレーションしてもよい（Ｅｒｎｓｔら、２００６をまた参照）。

【0099】

プロＮＴイムノアッセイ
５０μｌのサンプル（又はキャリブレーター）を、ＳＰＡコーティングチューブ中に分注し、標識ＬＡ（２００μｌ）を添加後、チューブを、１８〜２５℃で１６〜２２時間、インキュベートした。結合しなかったトレーサーを、洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００）で、５回（それぞれ１ｍｌ）洗浄により除去した。チューブ結合ＬＡを、Ｌｕｍｉｎｕｍｅｔｅｒ ＬＢ９５３を使用して測定した。結果を、キャリブレーション曲線から計算した。

【0100】

女性集団におけるプロ‐エンケファリン及びＰＮＴの複合解析
プロ‐エンケファリンとプロ‐ニューロテンシンとの間に、有意な相関はなかった（ｐ＝０．５６）。両バイオマーカーを使用する複合モデルにおいて、本願発明者等は、乳癌予測において、それらが両方とも独立していることが分かった。

【0101】

完全に補正されたモデルにおいて、ＰＮＴのそれぞれのＳＤ増加は、将来の乳癌の４９．９％リスク増加と関連していた。驚くべきことに、方程式にＰＮＴを追加した後、ＰＥＮＫは、ＰＮＴなしよりもはるかに強く、そしてプロ‐エンケファリンのそれぞれのＳＤ増加について、３０．８％リスク低減を示し、又はプロ‐エンケファリンのそれぞれのＳＤ低減は、将来の乳癌の４４．５％増加したリスクと関連していた（表８）。

【0102】

表８：乳癌予測のためのＰＮＴ及びＰＥＮＫの複合アッセイ

【表8】

【0103】

最上位対最下位の四分位ＰＮＴは、乳癌発症について、２．５６倍のリスクを示し、そしてＰＮＴ最下位対最上位四分位数の上のプロ‐エンケファリン（ｒｅｖ＝反転四分位数 Ｑ１＝Ｑ４、Ｑ２＝Ｑ３、Ｑ３＝Ｑ２、Ｑ４＝Ｑ１）は、独立した３．６倍のリスクを示す（表９）。

【0104】

ＰＮＴの最上位の四分位数と最下位のプロ‐エンケファリンの四分位数対最下位のＰＮＴ及び最高位のプロ‐エンケファリンの四分位数の組み合わせは、６．１７の複合リスクを示す（図３参照）。

【0105】

表９：乳癌予測のためのＰＮＴ及びＰＥＮＫの複合解析

【表9】

【0106】

図４は、乳癌予測のためのプロ‐エンケファリンの複合解析の図例を示す。
本願発明者等は、最下位プロ‐エンケファリン（１^ST）四分位数及び最高位（４^th）プロ‐ニューロテンシン四分位数を有する女性を組み合わせた（群３）。その高リスク群内で、約１９．０２％の女性が、１５年後以内に、乳癌を発症した。

【0107】

群２は、プロ‐ニューロテンシンの３^nd四分位数及びプロ‐エンケファリンの２^nd四分位数＋プロ‐ニューロテンシンの２^nd四分位数及びプロ‐エンケファリンの３^th四分位数を有する女性の組み合わせである。その中リスク群内で、約７．４８％の女性が、１５年後内に、乳癌を発症した。

【0108】

群１は、プロ‐ニューロテンシンの１^st四分位数及びプロ‐エンケファリンの４^th四分位数を有する女性の組み合わせである。その低リスク群内で、３．０８％の女性が、１５年後以内に、乳癌を発症した。群１及び群３の間のハザードリスクは、約６．１７である。

【0109】

肺癌
女性において、プロ‐エンケファリンはまた、肺癌を予測する。
４０人の女性が、観察期間中に肺癌を発症した。プロ‐エンケファリンは、喫煙及び非喫煙女性で異ならない（ｐ＝０．４４）。予想されるように、喫煙は、肺癌のための強いリスク予測マーカーである（Ｐ＜０．０００１）。驚くべきことに、喫煙は、方程式の一部であるが、低いプロ‐エンケファリンは、肺癌を発症する３．２倍のリスクを示した（表１０ａ及び１０ｂ）。

【0110】

表１０ａ及び１０ｂは、女性における肺癌の予測でのＰＥＮＫを示す。女性を、三分位に群分けし（表１０ａ）、そしてその後、肺癌発症について解析した（表１０ｂを参照）。ｒｅｖ＝最高位三分位（三分位３）、ｒｅｖ（１）＝三分位２、及びｒｅｖ（２）＝最下位三分位（三分位１）である。

【0111】

【表10】

【0112】

【表11】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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