【図1A】ＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸アライメントの図である。ＢＣ及びＦＧループは、配列番号１８の残基２２〜２８及び７５〜８６で四角内に表示されている。変異型のいくつかとして、熱安定性が向上しているＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ及びＥ８６Ｉの置換（残基部分のナンバリングは、Ｔｅｎｃｏｎ配列番号１による）が挙げられる。Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）パラトープ残基には、下線が付いている（配列番号２７のＤ２３、Ｆ２７、Ｙ２８，Ｖ７７、Ｇ８５）。

【図1B】ＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸アライメントの図である。ＢＣ及びＦＧループは、配列番号１８の残基２２〜２８及び７５〜８６で四角内に表示されている。変異型のいくつかとして、熱安定性が向上しているＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ及びＥ８６Ｉの置換（残基部分のナンバリングは、Ｔｅｎｃｏｎ配列番号１による）が挙げられる。Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）パラトープ残基には、下線が付いている（配列番号２７のＤ２３、Ｆ２７、Ｙ２８，Ｖ７７、Ｇ８５）。

【図2】Ｔｅｎｃｏｎ２７スカフォールド（配列番号９９）及びランダム化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ代替表面を有するＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号１００）の配列アラインメントを示す図である。ループ残基は、四角内に表示される。ループ及びストランドは、配列の上に示す。

【図3-1】ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アラインメントを示す図である。Ｃループ及びＣＤストランド並びにＦループ及びＦＧストランドは、四角内に表示され、スパン残基２９〜４３及び６５〜８１である。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号４１）パラトープ残基には、下線が付いている（Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓ）。

【図3-2】ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アラインメントを示す図である。Ｃループ及びＣＤストランド並びにＦループ及びＦＧストランドは、四角内に表示され、スパン残基２９〜４３及び６５〜８１である。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号４１）パラトープ残基には、下線が付いている（Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓ）。

【図4】単一特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子により前処理し、ＨＧＦにより刺激を与えたＨ２９２細胞中におけるｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害を示す図である。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ１）の効力は、単一特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５、図中、Ａ５として示す）単独の場合、又は、単一特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインをＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２、図中、８３ｖ２として示す）と組み合わせた場合と比較すると、顕著に上昇した。

【図5】単一特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子により前処理した細胞における、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害を示す図である。ＥＧＦＲ、ＮＣＩ−Ｈ２９２（図５Ａ）及びＨ５９６図５（Ｂ）が高レベルで発現している細胞株中では、抗−ＥＧＦＲ単一特異性及び二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲリン酸化が低下する時点で、ほぼ同じ効力を示す。ｃ−Ｍｅｔに対して低いレベルのＥＧＦＲが発現する細胞株である、Ｈ４４１では（図５Ｃ）、単一特異性ＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメイン単独の場合と比較して、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、ＥＧＦＲリン酸化の阻害の効力を向上させる。ＥＧＦＲに対して、低いレベルのｃ−Ｍｅｔを有する細胞株である、Ｈ２９２（図５Ｄ）及びＨ５９６（図５Ｅ）では、単一特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン単独の場合と比較して、ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害が、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子により大幅に増強される。本試験において、次の分子を使用した：二重特異性ＥＣＢ５（図中、１７−Ａ３として示す）、単一特異性ＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインＰ５３Ａ１Ｒ５−１７（図中、「１７」として示す）、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子ＥＣＢ３（図中、８３−Ｈ９として示す）、及び単一特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＰ１１４ＡＲ７Ｐ９３−Ｈ９（図中、Ｈ９として示す）。

【図6】二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を投与したマウスから単離された腫瘍内における薬力学的シグナル伝達を示す、６時間又は７２時間の場合の図である。６時間及び７２時間のいずれにおいても、いずれの分子も、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫのリン酸化を大幅に減少させた。その程度は、阻害がＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔへの親和性に依存していた。高い（図中の「８３」は、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２である）又は中程度（図中の「１７ｖ２」は、Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２である）の親和性を有するＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインを、高い（図中「Ａ３」は、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３である）又は中程度（図中の「Ａ５」は、Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５）の親和性を有するｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに対して連結することによって、二重特異性分子を調製した。

【図7】アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）に連結された様々な（variable）親和性の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔ分子の、ＩＰ投与後６時間（左）及び７２時間（右）の、血漿集積（上）及び腫瘍集積（下）を示す。投与後６時間では、中程度の親和性のＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメイン（１７ｖ２）又は高親和性のＥＧＦＲ結合ドメイン（８３ｖ２）を内部に有する二重特異性分子を投与されたマウスで、腫瘍集積は、最大である。高い又は中程度の親和性のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを組み込んだ二重特異性分子は、以下の通りである；８３ｖ２−Ａ５−ＡＢＤ（ＥＣＢ１８；ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔに対して高い／中程度）、８３ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８；高い／高い）、１７ｖ２−Ａ５（ＥＣＢ２８；中程度／中程度）、１７ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３９；中程度／高い）。図中では、８３ｖ２は、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２を指し、１７ｖ２は、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２を指し、Ａ３は、ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３を指し、また、Ａ５は、ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５を指す。

【図8】Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤベージュマウスに埋め込んだ。腫瘍の平均体積が、約８０ｍｍ³に到達すると、マウスは、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（２５ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢＳビヒクルの投与を３回／週受けた。二重特異性分子はいずれも腫瘍増殖を減少させ、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲについては、その分子の親和性に依存する。（高ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３８）を指し、高ＥＧＦＲ−中ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ１８）を指し、中ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３９）を指し、中ＥＧＦＲ−中−ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ２８）を指す）。

【図9】Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片は、ＳＣＩＤベージュマウスに埋め込み、異なる治療法で処置した。本治療法の抗腫瘍活性を示す（二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８）を指し、その他の治療法は、クリゾチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ及びクリゾチニブエルロチニブとの併用である）。