特許 6393804 組成物および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）血清型５および８莢膜多糖コンジュゲート免疫原性組成物を調製するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6393804

(24)【登録日】2018年8月31日

(45)【発行日】2018年9月19日

(54)【発明の名称】組成物および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）血清型５および８莢膜多糖コンジュゲート免疫原性組成物を調製するための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/385 20060101AFI20180910BHJP

   A61K 39/085 20060101ALI20180910BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20180910BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20180910BHJP

   C08B 37/00 20060101ALI20180910BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/385

   A61K39/085

   A61K47/64

   A61P31/04

   C08B37/00 Z

【請求項の数】14

【全頁数】72

(21)【出願番号】特願2017-106213(P2017-106213)

(22)【出願日】2017年5月30日

(62)【分割の表示】特願2015-205977(P2015-205977)の分割

【原出願日】2010年6月22日

(65)【公開番号】特開2017-179378(P2017-179378A)

(43)【公開日】2017年10月5日

【審査請求日】2017年5月30日

(31)【優先権主張番号】61/219,143

(32)【優先日】2009年6月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/219,151

(32)【優先日】2009年6月22日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】309040701

【氏名又は名称】ワイス・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100137040

【弁理士】

【氏名又は名称】宮澤 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(72)【発明者】

【氏名】ステファン ジョン フリーズ

(72)【発明者】

【氏名】アンナリーサ アンダーソン

(72)【発明者】

【氏名】ヴィリアム パヴリアック

(72)【発明者】

【氏名】キャサリン ウテ ジャンセン

(72)【発明者】

【氏名】イングリッド リー ドッジ

(72)【発明者】

【氏名】トレイシー ディー スコット

(72)【発明者】

【氏名】ジャスディープ シング ナンラ

(72)【発明者】

【氏名】クリシュナ プラサド

(72)【発明者】

【氏名】ブルース アーサー グリーン

【審査官】 伊藤 基章

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／１１３２２３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５２６１５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１１４６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０８４４１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 INFECTION AND IMMUNITY，米国，１９９０年，５８（７），２３６７−２３７４

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ４７／００

Ｃ０８Ｂ ３７／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

担体タンパク質ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖を含む免疫原性の多糖タンパク質コンジュゲートであって、
ＣＲＭ１９７が、多糖と共有結合している５〜２３個または８〜１５個のリシン残基を含み、
多糖が、７０ｋＤａから３００ｋＤａの間または７０ｋＤａから１５０ｋＤａの間の分子量を有し、
莢膜多糖が血清型５型または血清型８型莢膜多糖であり、
コンジュゲートが６００ｋＤａから２８００ｋＤａの間、５００ｋＤａから２５００ｋＤａの間、５９５ｋＤａから１７０８ｋＤａの間、１６００ｋＤａから３０００ｋＤａの間、１５３３ｋＤａから２６５６ｋＤａの間、または１３００ｋＤａから２６００ｋＤａの間の分子量を有し、
コンジュゲートが多糖と担体タンパク質の間にカルバメート結合、アミド結合、または両方を含む、
免疫原性の多糖タンパク質コンジュゲート。

【請求項2】

多糖が、１０〜１００％の間、５０〜１００％の間、または７５〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する、請求項１に記載の免疫原性コンジュゲート。

【請求項3】

ＣＲＭ１９７が、カルバメート結合、アミド結合、または両方を通じて多糖と共有結合している、請求項１または２に記載の免疫原性コンジュゲート。

【請求項4】

ＣＲＭ１９７に対するコンジュゲートしているリシンのモル比が、１０：１〜２５：１である、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性コンジュゲート。

【請求項5】

ＣＲＭ１９７と多糖の間の少なくとも１つの共有結合が、多糖の５〜１０個の糖反復単位毎に存在する、または多糖の５個の糖反復単位毎に存在する、請求項４に記載の免疫原性コンジュゲート。

【請求項6】

ＣＲＭ１９７が、多糖と共有結合している５〜２３個、５〜１５個、または１８〜２２個のリシンを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の免疫原性コンジュゲート。

【請求項7】

請求項１から６のいずれかに記載の免疫原性コンジュゲートおよびアジュバント、希釈剤、または担体のうちの少なくとも１つを含む免疫原性組成物。

【請求項8】

アジュバントが、アルミニウムベースのアジュバントである、請求項７に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項８に記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

アジュバントが、リン酸アルミニウムである、請求項９に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

５型または８型多糖の総量と比較して３０％未満または２０％未満の遊離型５型または８型多糖を含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

対象において黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物の調製における、請求項１から６のいずれかに記載の免疫原性コンジュゲートの使用。

【請求項13】

対象においてブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）細菌に関係するブドウ球菌性の感染、疾患または状態を軽減または予防するための免疫原性組成物の調製における、請求項１から６のいずれかに記載の免疫原性コンジュゲートの使用。

【請求項14】

感染、疾患または状態が、侵襲性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａ
ｕｒｅｕｓ）疾患、敗血症および保菌からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２００９年６月２２日出願の米国仮特許出願第６１／２１９，１４３号および第６１／２１９，１５１号の優先権の利益を主張するものであり、それらの全開示は、それらの全体が参照により本明細書にそれぞれ組み込まれるものとする。

【0002】

本発明は、一般に、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）血清型５および８莢膜多糖コンジュゲート免疫原性組成物ならびにそれらを調製および使用するための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ヒトは、グラム陽性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の自然保有宿主である。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、疾患を引き起こすことなく永続的にまたは一時的に皮膚、鼻孔および咽喉にコロニーを形成することができる。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染は、軽度の皮膚感染から心内膜炎、骨髄炎、菌血症および敗血症までさまざまである。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）はまた、大多数の院内感染も引き起こし、市中発症感染におけるその罹患率は増加しつつある。さらに、２００５年には、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）感染は、１００，０００個体当たり３１．８個体と見積もられ、２００５年の米国における１６，６５０人の死亡を包含していた（Ｋｌｅｖｅｎｓら（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２９８：１７６３〜１７７１）。疾患は、個体が、手術中、留置カテーテルもしくは他の装置の設置、外傷または創傷など免疫バリアが破られることによって免疫無防備状態になるときに起こる。

【0004】

黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、多数の毒素および酵素を包含する多数の細胞外および細胞内抗原を産生する。本明細書において特に興味深いのは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の莢膜多糖血清型（ＷｅｉｎｓｔｅｉｎおよびＦｉｅｌｄｓ編、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．ＩＶ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｔｈｉｍｅ Ｓｔｒａｔｔｏｎ；１９８２．ｐｐ．２８５〜２９３）中のＫａｒａｋａｗａおよびＶａｎｎ、「Ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ」を参照）、特に、血清型５および８莢膜多糖である。個体から単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の多数の株に関する疫学的研究は、７０％〜８０％が、血清型５かまたは８莢膜多糖であることを示した（Ａｒｂｅｉｔら（１９８４）Ｄｉｇａｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２：８５〜９１）。残念ながら、莢膜多糖は、それら自体では不十分な免疫原である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ブドウ球菌性の感染および疾患は、血管内装置および侵襲的手順を使用するために、この２０年間で劇的に増加した。疾患発生率の上昇は、抗生物質抵抗性が並行して上昇しているため、より厄介であり、したがって、ブドウ球菌性の感染および疾患を予防するための免疫原性組成物の差し迫った必要性がある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲート、およびそのようなコンジュゲートを作製するための方法を対象とする。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖は、当業者に知られている単離手順を使用して細菌から直接得ることができ、合成プロトコルを使用して製造することができ、または当業者にも知られている遺伝子工学手順を使用して組換えにより製造することができる。さらに、本発明は、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）細菌に対する免疫応答を誘導するための方法、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）細菌により引き起こされる疾患を予防するための方法、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）細菌の感染により引き起こされる疾患の少なくとも１つの症状の重症度を軽減するための方法を提供する。

【0007】

一実施形態において、本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性の多糖タンパク質コンジュゲートを含み、多糖は、２０ｋＤａから１０００ｋＤａの間の分子量を有する。一部の実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、２００ｋＤａから５０００ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートの多糖部分は、７０ｋＤａから３００ｋＤａの間の分子量範囲を有する。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、５００ｋＤａから２５００ｋＤａの間の分子量範囲を有する。

【0008】

一実施形態において、血清型５または８莢膜多糖は、１０〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する。一実施形態において、Ｏ−アセチル化度は、５０〜１００％の間である。一実施形態において、Ｏ−アセチル化度は、７５〜１００％の間である。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食性致死アッセイのいずれかにおいて細菌を致死させることにより測定されて機能的である抗体を生成する。

【0009】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲート担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７を含む。一実施形態において、ＣＲＭ_１９７は、カルバメート結合、アミド結合、または両方を通じて多糖と共有結合している。一実施形態において、ＣＲＭ_１９７に対するコンジュゲートしているリシンのモル比は、約１０：１〜約２５：１であってよい。一実施形態において、コンジュゲートは、多糖の少なくとも５〜１０個の糖反復単位毎にＣＲＭ_１９７と多糖の間に１つの共有結合を含む。一実施形態において、担体タンパク質と多糖の間の結合は、多糖の５個の反復単位毎に１つ存在する。

【0010】

一実施形態において、ＣＲＭ_１９７を含む免疫原性コンジュゲートは、多糖と共有結合している５〜２２個のリシンまたは８〜１５個のリシンを含む。一実施形態において、ＣＲＭ_１９７を含む免疫原性コンジュゲートは、多糖と共有結合している５〜２３個のリシンまたは８〜１２個のリシンを含む。

【0011】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、１０〜１００％Ｏ−アセチル化されている５または８型多糖を含む。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、５０〜１００％Ｏ−アセチル化されている５または８型多糖を含む。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、７５〜１００％Ｏ−アセチル化されている５または８型多糖を含む。一部の実施形態において、免疫原性組成物を使用し、動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食性致死アッセイにおいて機能的である抗体を生成することができる。

【0012】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、５または８型多糖の総量と比較して約３０％未満の遊離５または８型多糖を含む。

【0013】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、５または８型多糖の総量と比較して約２０％未満の遊離５または８型多糖を含む。

【0014】

一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている免疫原性コンジュゲートおよびアジュバント、希釈剤、または担体のうちの少なくとも１つを含む免疫原性組成物を含む。

【0015】

アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムのうちの１つまたは複数などのアルミニウムベースのアジュバントであってよい。一実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムを含む。

【0016】

一実施形態において、免疫原性組成物は、５または８型多糖の総量と比較して約３０％未満の遊離５または８型多糖を含む。

【0017】

一実施形態において、免疫原性組成物は、５または８型多糖の総量と比較して約２０％未満の遊離５または８型多糖を含む。

【0018】

一実施形態において、本発明は、対象において黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を含む。

【0019】

一実施形態において、本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性の多糖タンパク質コンジュゲートを製造する方法であって、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を有機溶媒中で１，１−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）と反応させて、活性化された血清型５または８多糖を生じさせるステップと、活性化された血清型５または８多糖を有機溶媒中で担体タンパク質と反応させて、血清型５または８多糖：担体タンパク質コンジュゲートを生じさせるステップとを含む方法を含む。

【0020】

一実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を活性化する方法は、単離された血清型５または８多糖を凍結乾燥するステップと、凍結乾燥された多糖を有機溶媒に再懸濁するステップとをさらに含む。一実施形態において、再懸濁された多糖は、活性化され、次いで、担体タンパク質と直接反応する。一実施形態において、活性化された単離された血清型５または８多糖は、担体タンパク質と反応させる前に単離される。一実施形態において、単離された活性化された単離された血清型５または８多糖は、多糖を担体タンパク質と反応させる前に、凍結乾燥されて、凍結乾燥された活性化された単離された血清型５または８多糖を生じさせる。一実施形態において、単離された多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法は、担体タンパク質を多糖と反応させる前に、担体タンパク質を凍結乾燥して、凍結乾燥された担体タンパク質を生じさせるステップを含む。一実施形態において、単離された多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法は、活性化された単離された血清型５または８多糖の担体タンパク質との反応の一部として、凍結乾燥された活性化された単離された血清型５または８多糖および凍結乾燥された担体タンパク質を有機溶媒に再懸濁するステップを含む。

【0021】

一実施形態において、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５または８型莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法は、活性化された多糖と担体タンパク質の反応混合物を希釈し、約２０℃〜約２６℃にて少なくとも４時間にわたって約８．８〜約９．２のｐＨを維持するステップを含む。

【0022】

一実施形態において、活性化された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５または８型莢膜多糖と担体タンパク質の反応混合物は、約２３℃にて少なくとも４時間にわたって約９．０のｐＨにて維持される。

【0023】

一実施形態において、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５または８型莢膜多糖担体タンパク質を製造する方法は、製造された後に、単離された血清型５または８多糖タンパク質コンジュゲートを単離するステップを含む。

【0024】

一実施形態において、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５または８型莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法において使用される有機溶媒は、極性非プロトン性溶媒である。一実施形態において、極性非プロトン性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる群から選択される。一実施形態において、単離された多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法 有機溶媒は、ＤＭＳＯである。

【0025】

一実施形態において、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法は、有機溶媒中の５型莢膜多糖およびＣＤＴを含む反応混合物の水濃度を約０．１から０．３％の間に調整するステップを含む。一実施形態において、有機溶媒中の５型莢膜多糖およびＣＤＴを含む反応混合物の水濃度は、約０．２％に調整される。

【0026】

一実施形態において、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖を活性化するステップは、多糖を、有機溶媒中の５型莢膜多糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する多糖の量に対して約２０モル過剰である量のＣＤＴと反応させるステップを含む。

【0027】

一実施形態において、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法は、８型莢膜多糖を含む反応混合物の水濃度を決定するステップを含む。一実施形態において、多糖を活性化するために反応混合物に添加されるＣＤＴの量は、有機溶媒中の８型莢膜多糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する水の量とほぼ等モルである量のＣＤＴで提供される。

【0028】

一実施形態において、多糖を活性するために反応混合物に添加されるＣＤＴの量は、有機溶媒中の８型莢膜多糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する水の量と比較して約０．５：１のモル比である量のＣＤＴで提供される。一実施形態において、多糖を活性するために反応混合物に添加されるＣＤＴの量は、有機溶媒中の８型莢膜多糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する水の量と比較して約０．７５：１のモル比である量のＣＤＴで提供される。

【0029】

一実施形態において、活性化された多糖を単離するステップを含む方法は、透析濾過のステップを含む。

【0030】

一実施形態において、担体タンパク質の凍結乾燥を含む方法、凍結乾燥の前に、担体タンパク質は、ＮａＣｌに対して透析濾過され、ＮａＣｌ／タンパク質担体タンパク質のｗ／ｗ比は、約０．５〜約１．５に調整される。一実施形態において、担体タンパク質に対するＮａＣｌの比は、約１である。

【0031】

一実施形態において、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５または８型莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法において使用される担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７を含む。

【0032】

一実施形態において、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５または８型莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法において使用されるＣＲＭ_１９７は、約１：１の重量比にて活性化された血清型５または８多糖と反応する。

【0033】

一実施形態において、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５または８型莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法は、有機溶媒中でＣＤＴと混合する前に５または８型莢膜多糖をイミダゾールまたはトリアゾールと混合するステップを含む。

【0034】

一実施形態において、単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５または８型莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法は、血清型５または８多糖担体タンパク質コンジュゲートを加水分解して、未反応の活性化基を除去するステップを含む。

【0035】

一実施形態において、本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートを製造する方法であって、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を、有機溶媒中で３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）およびカルボジイミドと反応させて、ＰＤＰＨ結合型多糖を生じさせるステップと、ＰＤＰＨ結合型多糖を還元剤と反応させて、活性化された多糖を生じさせるステップと、活性化された血清型５または８多糖を単離して、単離された活性化された血清型５または８多糖を生じさせるステップと、活性化された担体タンパク質を提供するステップと、単離された活性化された血清型５または８多糖を活性化された担体タンパク質と反応させて、血清型５または８多糖担体タンパク質コンジュゲートを生じさせるステップとを含み、それによって、担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートが生じる方法を提供する。一実施形態において、活性化された担体タンパク質は、活性化された担体タンパク質を活性化された多糖と反応させる前に単離される。

【0036】

一実施形態において、活性化された担体タンパク質を単離するステップは、単離された活性化された血清型５または８多糖を凍結乾燥して、凍結乾燥された活性化された血清型５または８多糖を生じさせるステップをさらに含む。

【0037】

一実施形態において、ブロモ酢酸は、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）である。

【0038】

一実施形態において、ＰＤＰＨを利用する血清型８莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法は、極性非プロトン性溶媒である有機溶媒の使用を含む。一実施形態において、極性非プロトン性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、およびヘキサメチルリン酸アミド（ＨＭＰＡ）からなる群から選択される。一実施形態において、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。

【0039】

一実施形態において、ＰＤＰＨを利用する血清型５または８莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法において使用されるカルボジイミドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）である。

【0040】

一実施形態において、ＰＤＰＨおよびＥＤＡＣを利用する血清型５または８莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法は、血清型５または８莢膜多糖を、約１：５：３の多糖：ＰＤＰＨ：ＥＤＡＣ重量比にて有機中でＰＤＰＨおよびＥＤＡＣと反応させるステップを含む。

【0041】

一実施形態において、ＰＤＰＨおよびＥＤＡＣを利用する血清型５または８莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法において使用される還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。

【0042】

一実施形態において、ＰＤＰＨおよびＥＤＡＣを利用する血清型５または８莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法における担体タンパク質の活性化は、担体タンパク質をブロモ酢酸と反応させるステップを含む。

【0043】

一実施形態において、ＰＤＰＨおよびＥＤＡＣを利用する血清型５または８莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法において活性化された血清型５または８多糖を単離するステップは、透析濾過を含む。

【0044】

一実施形態において、ＰＤＰＨおよびＥＤＡＣを利用する血清型５または８莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法は、血清型５または８多糖担体タンパク質コンジュゲートを加水分解して、未反応の活性化基を除去するステップを含む。一実施形態において、血清型５または８多糖担体タンパク質コンジュゲートを加水分解するステップは、システアミン塩酸塩の添加を含む。

【0045】

一実施形態において、ＰＤＰＨおよびＥＤＡＣを利用する血清型５または８莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法は、担体タンパク質とコンジュゲートしている単離された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートを単離するステップをさらに含む。

【0046】

一実施形態において、血清型５または８多糖担体タンパク質コンジュゲートの単離は、透析濾過を含む。

【0047】

一実施形態において、ＰＤＰＨおよびＥＤＡＣを利用する血清型５または８莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法において使用される担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７を含む。

【0048】

一実施形態において、ＰＤＰＨおよびＥＤＡＣを利用する血清型５または８莢膜多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートを製造する方法におけるＣＲＭ_１９７は、約１：１ ＣＲＭ_１９７：莢膜多糖分子の重量比で添加される。

【0049】

一実施形態において、ＰＤＰＨおよびＥＤＡＣを利用する血清型５または８莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法において使用される活性化された５または８型莢膜多糖は、約５０ｋｄから約５００ｋｄの間のサイズを有する。

【0050】

一実施形態において、ＰＤＰＨおよびＥＤＡＣを利用する血清型５または８莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法において製造される免疫原性コンジュゲートは、約４００ｋｄから約５０００ｋｄの間のサイズを有する。

【0051】

一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにより製造される５または８型莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。

【0052】

一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにより製造される５または８型莢膜多糖担体タンパク質コンジュゲートおよびアジュバント、希釈剤または担体のうちの少なくとも１つを含む免疫原性組成物を提供する。一実施形態において、免疫原性組成物は、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択することができるアルミニウムベースのアジュバントを含む。一実施形態において、本明細書に記載されている免疫原性組成物は、アジュバントリン酸アルミニウムを含む。

【0053】

本明細書に記載されている免疫原性組成物は、５または８型多糖の総量と比較して３０％未満および２０％未満の遊離５または８型多糖を含むことができる。本明細書に記載されている免疫原性組成物は、水または低イオン強度中性ｐＨ緩衝液中で保存することができる。

【0054】

一実施形態において、本発明は、対象においてブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）細菌に関係するブドウ球菌性の感染、疾患または状態を軽減または予防する方法であって、対象に治療的または予防的な量の本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態において、感染、疾患または状態は、侵襲性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、敗血症および保菌からなる群から選択される。

【0055】

一実施形態において、本発明は、手術手順を受けている対象においてブドウ球菌性感染を軽減または予防する方法であって、手術手順の前に対象に予防的に有効な量の本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。

【0056】

一実施形態において、本発明の方法は、ＣＤＴの代わりにＣＤＩを用いることを含む。

【0057】

一実施形態において、本発明は、担体タンパク質と共有結合している５０ｋＤａから８００ｋＤａの間の分子量を有する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）５または８型莢膜多糖を提供し、担体タンパク質と共有結合している多糖の合わせた分子量は、約４００ｋＤａから５０００ｋＤａの間である。

【0058】

一実施形態において、担体タンパク質と共有結合している多糖は、７０ｋＤａから３００ｋＤａの間の分子量範囲を有する多糖部分を含む。一実施形態において、担体タンパク質と共有結合している多糖は、５００ｋＤａから２５００ｋＤａの間の分子量範囲を有する。

【0059】

一実施形態において、担体タンパク質と共有結合している多糖の担体タンパク質部分は、ＣＲＭ_１９７を含む。一実施形態において、ＣＲＭ_１９７は、カルバメート結合、アミド結合、または両方を通じて多糖と共有結合している。一部の実施形態において、ＣＲＭ_１９７に対するコンジュゲートしているリシンのモル比は、約１０：１〜約２５：１である。一部の実施形態において、担体タンパク質と共有結合している多糖は、多糖の少なくとも５〜１０個の糖反復単位毎にＣＲＭ_１９７間に少なくとも１つの共有結合を含む。一部の実施形態において、担体タンパク質と共有結合している多糖は、多糖の５個の反復単位毎に存在するＣＲＭ_１９７と多糖の間の少なくとも１つの結合を含む。一部の実施形態において、ＣＲＭ_１９７と共有結合している多糖のＣＲＭ_１９７部分は、多糖と共有結合している５〜２２個のリシンを含む。一部の実施形態において、ＣＲＭ_１９７と共有結合している多糖のＣＲＭ_１９７部分は、多糖と共有結合している５〜２３個のリシンを含む。一部の実施形態において、担体タンパク質と共有結合している多糖のＣＲＭ_１９７部分は、多糖と共有結合している８〜１５個のリシンを含む。一部の実施形態において、担体タンパク質と共有結合している多糖のＣＲＭ_１９７部分は、多糖と共有結合している８〜１２個のリシンを含む。

【0060】

一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている担体タンパク質と共有結合している黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５または８型多糖およびアジュバント、希釈剤、または担体のうちの少なくとも１つを含む免疫原性組成物を提供する。

【0061】

一実施形態において、本発明は、対象に本明細書に記載されている担体タンパク質と共有結合している黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５または８型多糖を含む免疫原性組成物を投与して、本明細書に記載されている免疫応答を生成する方法を提供する。

【0062】

一実施形態において、本発明は、分子量が２０ｋＤａから１０００ｋＤａの間の多糖を単離する方法を提供する。

【0063】

一実施形態において、本発明は、莢膜多糖、免疫原性コンジュゲート、または本発明の免疫原性組成物により生成される抗体を提供する。

【0064】

本発明は、その下記の詳細な説明について検討する場合、より良く理解され、上に示されているもの以外の特徴、態様および利点は、明らかになるはずである。そのような詳細な説明は、下記の図面に言及する：

【図面の簡単な説明】

【0065】

【図1】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖の反復多糖構造を示す図である（Ｎ−アセチルマンノサミヌロン酸は、ＭａｎＮＡｃａであり、Ｎ−アセチルＬ−フコサミンは、Ｌ−ＦｕｃＮＡｃであり、Ｎ−アセチルＤ−フコサミンは、Ｄ−ＦｕｃＮＡｃである）。

【図2A】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖（Ｏ−アセチルアッセイ）およびテイコ酸（ホスフェートアッセイ）についてのイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の画分の分析を示す図である。

【図2B】二重免疫拡散アッセイによる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖についてのイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の画分の分析を示す図である。

【図3A】熱処理における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖分子量の減少に対する９５℃におけるｐＨ（３．５、４または５）の効果を示す図である。

【図3B】熱処理における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖分子量の減少に対するｐＨ３．５における温度（５５℃、７５℃または９５℃）の効果を示す図である。

【図4】それぞれｐＨ３．５および４．５、ならびに９５℃における熱処理中の経時的な血清型５莢膜多糖と比較した精製された黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖の分子量を示す図である。

【図5】ＡｌＰＯ_４処置対照（円）と比較した血清型８莢膜多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートを受けたマウス（菱形）における生存増加を示す図である。

【図6】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５多糖の反復多糖構造を示す図である（Ｎ−アセチルマンノサミヌロン酸は、ＭａｎＮＡｃＡであり、Ｎ−アセチルＬ−フコサミンは、Ｌ−ＦｕｃＮＡｃであり、Ｎ−アセチルＤ−フコサミンは、Ｄ−ＦｕｃＮＡｃＡである）。

【図7A】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５多糖（Ｏ−アセチルアッセイ）およびテイコ酸（ホスフェートアッセイ）についてのイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の画分の分析を示す図である。

【図7B】二重免疫拡散アッセイによる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５多糖についてのイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の画分の分析を示す図である。

【図8A】熱処理における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖分子量の減少に対する９５℃におけるｐＨ（３．５、４または５）の効果を示す図である。

【図8B】熱処理における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖分子量の減少に対するｐＨ３．５における温度（５５℃、７５℃または９５℃）の効果を示す図である。

【図9】ＰＢＳ処置対照と比較した血清型５多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートを受けたマウス（網掛け部分は、処置マウスである）における腎盂腎炎減少を示す図である。

【図10】高分子量（ＨＭＷ）ＣＰ５−ＣＲＭ、低分子量（ＬＭＷ）ＣＰ５−ＣＲＭまたはＰＰ５−ＣＲＭ対照をワクチン接種されたマウスにおける黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６によるチャレンジ後の腎臓において回収されたコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す図である。

【図11】多糖コンジュゲートの異なる製剤（高分子量（ＨＭＷ）ＣＰ５−ＣＲＭ、低分子量（ＬＭＷ）ＣＰ５−ＣＲＭ）をワクチン接種されたマウスから得られた血清のＯＰＡ力価（幾何平均）の比較を示す図である。群は、５〜９匹のマウスからなった。

【発明を実施するための形態】

【0066】

概要
本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５および８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートならびにそれらを調製および使用するための方法に関する。本発明の免疫原性コンジュゲートの新規な特徴は、多糖および得られたコンジュゲートの分子量プロファイル、ＣＲＭ_１９７担体タンパク質当たりのコンジュゲートしているリシンと多糖と共有結合しているリシンの数の比、多糖の反復単位の関数としての担体タンパク質と多糖の間の共有結合の数、および総多糖と比較した遊離多糖の相対量を包含する。本明細書で使用されている「遊離多糖」という用語は、担体タンパク質とコンジュゲートしていないが、それにも関わらずコンジュゲート組成物中に存在する多糖を意味する。

【0067】

本発明の免疫原性コンジュゲートを作製するための方法には、ＣＤＩ（１，１−カルボニルジイミダゾール）、ＣＤＴ（１，１−カルボイル−ジ−１，２，４−トリアゾール）またはＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド）を伴うコンジュゲーション化学反応を使用する莢膜多糖の担体タンパク質との共有結合コンジュゲーションを伴う。ＣＤＩは、ＣＰ８コンジュゲーションのみに対して特異的である。ＣＤＩ／ＣＤＴの使用は、莢膜多糖と担体タンパク質の間の１炭素または０炭素リンカーをもたらすが、ＰＤＰＨの使用は、莢膜多糖と担体タンパク質の間の共有チオエーテル結合をもたらす。

【0068】

−ＳＨ（チオール化されたＣＰ）〜−ＮＨ_２結合のための追加のクロスリンカーは、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ；スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート））；スルホ−ＫＭＵＳ（Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）；チオールにより開裂するスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート）；スルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート）；スルホ−ＳＩＡＢ（Ｎ−スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）；スルホ−ＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）；ＥＭＣＡ（Ｎ−ｅ−マレイミドカプロン酸）；スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）；スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）；スルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）；ＢＭＰＡ（Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸）；２−イムノチオラン塩酸塩；３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル；４−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル；ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−ａ−［２−ピリジルジチオ］トルエン）；ＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］）；ＫＭＵＡ（Ｎ−ｋ−マレイミドウンデカン酸）；ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート）；ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）；ＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート）；ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）；ＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル）；ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）；ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）；ＳＢＡＰ（スクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート）；ＢＭＰＳ（Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル）；ＡＭＡＳ Ｎ−（ａ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル）；ＳＩＡ（Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート）；およびＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエートを包含するが、それらに限定されるものではない。

【0069】

薬剤は、−ＳＨから−ＯＨ基のためのクロスリンカーを使用して架橋することもできる。そのようなクロスリンカーは、ＰＭＰＩ（Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート）を包含するが、それに限定されるものではない。

【0070】

本明細書に記載されている組成物および方法は、様々な応用において有用である。例えば、コンジュゲートは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染からレシピエントを防御するためのコンジュゲート免疫原性組成物の製造において使用することができる。代替方法として、様々なコンジュゲートは、細菌の莢膜多糖に対する抗体の製造において使用することができ、その後に、細菌検出および血清型決定などの研究および臨床検査アッセイにおいて使用することができる。そのような抗体は、対象に受動免疫を与えるために使用することもできる。一部の実施形態において、細菌性多糖に対して産生される抗体は、動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食性致死アッセイのいずれかにおいて機能的である。

【0071】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されているすべての技術的および科学的用語は、本発明が関係する当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似しているか同等であるいずれの方法および材料も本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載されている。実施形態について記載することおよび本発明を主張することに際して、ある種の用語法は、下に記されている定義に従って使用されるものとする。

【0072】

本明細書で使用されている、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確にそうでないことを示していない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「その方法」への言及は、本明細書に記載されておりかつ／または本開示を読めば当業者に明らかになるであろうタイプの１つまたは複数の方法、および／またはステップを包含し、以下同様である。

【0073】

本明細書で使用されている、「約」とは、述べられている濃度範囲、時間枠、分子量、温度またはｐＨなどの値の統計的に意味のある範囲内を意味する。そのような範囲は、所与の値または範囲の一桁以内、典型的には、２０％以内、より典型的には、１０％以内、さらにより典型的には、５％以内であってよい。「約」という用語により包含される許容できる変動は、研究中の特定のシステムによって決まるはずであり、当業者により容易に理解することができる。ある範囲が、本出願内で引用される場合はいつでも、その範囲内のあらゆる整数も本発明の実施形態として企図される。

【0074】

本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰属される意味を有することがあり、例えば、それらは、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「包含される（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することがある。そのような用語は、いずれの他の要素も除外することなく特定の要素または一組の要素の包含を指す。「から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰属される意味を有し、例えば、それらは、本発明の新規または基礎的な特徴を損なわない追加の要素またはステップの包含を可能にし、すなわち、それらは、本発明の新規なまたは基礎的な特徴を損なう追加の引用されていない要素またはステップを除外し、それらは、本明細書に引用されているか参照により本明細書に組み込まれている文書などの従来技術の要素またはステップを除外するのは、特に、例えば、本明細書に引用されているか参照により本明細書に組み込まれている文書を超える、特許性のある、例えば、従来技術を越えて新規な、非自明の、独創的である文書を定義することが本文書の目的であるためである。また、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」および「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、米国特許法においてそれらに帰属される意味を有し、すなわち、これらの用語は、クローズエンド型である。したがって、これらの用語は、特定の要素または一組の要素の包含およびすべての他の要素の除外を指す。

【0075】

免疫原性コンジュゲート
上に記載されているように、本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートに関する。本発明の一実施形態は、下記の特徴のうちの１つまたは複数を有する担体分子またはタンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートを提供し：多糖は、５０ｋＤａから７００ｋＤａの間の分子量を有し；免疫原性コンジュゲートは、５００ｋＤａから２５００ｋＤａの間の分子量を有し；コンジュゲートは、総多糖に対して約３０％未満の遊離多糖を含む。一部の実施形態において、多糖は、２０ｋＤａから１０００ｋＤａの間の分子量を有する。一部の実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、２００ｋＤａから５０００ｋＤａの間の分子量を有する。他の実施形態において、コンジュゲートは、総多糖に対して約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％未満の遊離多糖を含む。

【0076】

本明細書で使用されているような「コンジュゲート」は、通常は望ましい範囲の分子量の莢膜多糖および担体タンパク質を含み、莢膜多糖は、担体タンパク質とコンジュゲートしている。コンジュゲートは、若干量の遊離莢膜多糖を含有していても含有していなくてもよい。本明細書で使用されている、「遊離莢膜多糖」とは、コンジュゲートしている莢膜多糖担体タンパク質と非共有結合的に会合している（すなわち、非共有結合している、吸着されているまたは中にもしくは共に取り込まれている）莢膜多糖を指す。「遊離莢膜多糖」、「遊離多糖」および「遊離糖」という用語は、互換的に使用されることがあり、同じ意味を伝えることが意図されている。

【0077】

担体タンパク質の性質に関わらず、担体タンパク質は、直接かまたはリンカーを通じて莢膜多糖とコンジュゲートさせることができる。本明細書で使用されている、「コンジュゲートさせること（ｔｏ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」、「コンジュゲートした（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」および「コンジュゲートしている（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）」とは、それによって細菌の莢膜多糖が担体分子と共有結合的に接続しているプロセスを指す。コンジュゲーションは、細菌の莢膜多糖の免疫原性を高める。コンジュゲーションは、下に記載されている方法に従うか当技術分野において知られている他のプロセスにより行うことができる。

【0078】

黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖の分子量は、免疫原性組成物における使用について考慮すべき事柄である。高分子量莢膜多糖は、抗原表面上に存在するエピトープのより高い結合価によってある種の抗体免疫応答を誘導することができる。「高分子量莢膜多糖」の単離は、本発明の組成物および方法における使用のために企図されている。本発明の一実施形態において、高分子量血清型５または８莢膜多糖は、分子量で２０ｋＤａから１０００ｋＤａまでの範囲で単離および精製することができる。本発明の一実施形態において、高分子量血清型５または８莢膜多糖は、分子量で５０ｋＤａから７００ｋＤａまでの範囲で単離および精製することができる。本発明の一実施形態において、高分子量血清型５または８莢膜多糖は、分子量で５０ｋＤａから３００ｋＤａまでの範囲で単離および精製することができる。一実施形態において、高分子量血清型５または８莢膜多糖は、分子量で７０ｋＤａから３００ｋＤａまでの範囲で単離および精製することができる。一実施形態において、高分子量血清型５または８莢膜多糖は、分子量で９０ｋＤａから２５０ｋＤａまでの範囲で単離および精製することができる。一実施形態において、高分子量血清型５または８莢膜多糖は、分子量で９０ｋＤａから１５０ｋＤａまでの範囲で単離および精製することができる。一実施形態において、高分子量血清型５または８莢膜多糖は、分子量で９０ｋＤａから１２０ｋＤａまでの範囲で単離および精製することができる。一実施形態において、高分子量血清型５または８莢膜多糖は、分子量で８０ｋＤａから１２０ｋＤａまでの範囲で単離および精製することができる。本発明の方法により単離および精製することができる高分子量血清型５または８莢膜多糖の他の範囲は、分子量で７０ｋＤａ〜１００ｋＤａ；分子量で７０ｋＤａ〜１１０ｋＤａ；分子量で７０ｋＤａ〜１２０ｋＤａ；分子量で７０ｋＤａ〜１３０ｋＤａ；分子量で７０ｋＤａ〜１４０ｋＤａ；分子量で７０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ；分子量で７０ｋＤａ〜１６０ｋＤａ；分子量で８０ｋＤａ〜１１０ｋＤａ；分子量で８０ｋＤａ〜１２０ｋＤａ；分子量で８０ｋＤａ〜１３０ｋＤａ；分子量で８０ｋＤａ〜１４０ｋＤａ；分子量で８０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ；分子量で８０ｋＤａ〜１６０ｋＤａ；分子量で９０ｋＤａ〜１１０ｋＤａ；分子量で９０ｋＤａ〜１２０ｋＤａ；分子量で９０ｋＤａ〜１３０ｋＤａ；分子量で９０ｋＤａ〜１４０ｋＤａ；分子量で９０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ；分子量で９０ｋＤａ〜１６０ｋＤａ；分子量で１００ｋＤａ〜１２０ｋＤａ；分子量で１００ｋＤａ〜１３０ｋＤａ；分子量で１００ｋＤａ〜１４０ｋＤａ；分子量で１００ｋＤａ〜１５０ｋＤａ；分子量で１００ｋＤａ〜１６０ｋＤａ；および類似の望ましい分子量範囲を包含する。上の範囲のうちの任意の範囲内にあるすべての全数整数（ｗｈｏｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎｔｅｇｅｒ）が、本明細書の実施形態として企図されている。

【0079】

一実施形態において、コンジュゲートは、分子量で約５０ｋＤａから約５０００ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態において、コンジュゲートは、分子量で約２００ｋＤａから約５０００ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、約５００ｋＤａから約２５００ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、約５００ｋＤａから約２５００ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、約６００ｋＤａから約２８００ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、約７００ｋＤａから約２７００ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートは、約１０００ｋＤａと約２０００ｋＤａの間；約１８００ｋＤａと約２５００ｋＤａの間；約１１００ｋＤａと約２２００ｋＤａの間；約１９００ｋＤａと約２７００ｋＤａの間；約１２００ｋＤａと約２４００ｋＤａの間；約１７００ｋＤａと約２６００ｋＤａの間；約１３００ｋＤａと約２６００ｋＤａの間；約１６００ｋＤａから約３０００ｋＤａの間の分子量を有する。上の範囲のうちの任意の範囲内にあるすべての全数整数が、本発明の実施形態として企図されている。

【0080】

本明細書で使用されている、「免疫原性の」とは、細菌の莢膜多糖または抗原を含むコンジュゲート免疫原性組成物などの抗原（または、抗原のエピトープ）が、体液性かもしくは細胞性に、または両方で哺乳動物などの宿主において免疫応答を誘発する能力を意味する。したがって、本明細書で使用されているような「免疫原性コンジュゲート」または「コンジュゲート」とは、免疫応答を誘発するために使用することができる担体分子とコンジュゲートしている細菌の莢膜多糖の抗原または抗原決定基（すなわち、エピトープ）を含有するいずれの免疫原性コンジュゲートも意味する。免疫原性コンジュゲートは、細胞表面におけるＭＨＣ分子と会合している抗原の提示により宿主を感作するのに役立つことがある。さらに、抗原特異的なＴ細胞または抗体を生成させ、免疫化された宿主の将来の防御を可能にすることができる。このようにして、免疫原性コンジュゲートは、細菌による感染に関係する１つまたは複数の症状から宿主を防御することができ、または莢膜多糖に関係する細菌による感染に起因する死から宿主を防御することがある。免疫原性コンジュゲートは、対象に受動免疫を与えるために使用することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するために使用することもできる。免疫原性コンジュゲートは、動物有効性モデルにおいてかまたはオプソニン化貪食性致死アッセイを介して細菌を致死させることにより測定されて機能的である抗体を生成するために使用することもできる。

【0081】

「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通じて炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的と特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用されている、文脈により別段の指示がない限り、この用語は、無傷のポリクローナルまたはモノクローナル抗体ばかりでなく、人工的に作り出された抗体（例えば、キメラ、ヒト化および／またはエフェクター機能、安定性および他の生物学的活性を変えるための誘導体化）およびそれらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、サメおよびラクダ抗体を包含する単鎖（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体）、および抗体部分、多価抗体、多重特異性抗体を含む融合タンパク質（例えば、それらが望ましい生物学的活性を示すかぎり二重特異性抗体）および本明細書に記載されている抗体断片、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のいずれの他の改変された立体配置も包含することが意図されている。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（または、それらのサブクラス）などのいずれのクラスの抗体も包含し、抗体は、いずれの特定のクラスである必要もない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ヒトにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられることがある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）と呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は、よく知られている。

【0082】

「抗体断片」は、無傷の抗体の一部のみを含み、その部分は、無傷の抗体中に存在する場合にその部分に通常関係する機能の少なくとも１つ、好ましくは、大部分またはすべてを保持することが好ましい。

【0083】

「抗原」という用語は、一般的に、生物学的分子、通常は、免疫原性組成物中のタンパク質、ペプチド、多糖もしくはコンジュゲート、または動物中に注入されるか吸収される組成物を包含する動物において抗体もしくはＴ細胞応答、または両方の産生を刺激することができる免疫原性物質を指す。免疫応答は、全分子に対してか、分子の様々な部分（例えば、エピトープまたはハプテン）に対して生成されることがある。この用語は、個々の分子または抗原分子の均一もしくは不均一な集団を指すために使用されることがある。抗原は、抗体、Ｔ細胞受容体または特異的な体液性および／または細胞性免疫の他の要素により認識される。「抗原」は、すべての関連する抗原エピトープも包含する。所与の抗原のエピトープは、当技術分野においてよく知られているいずれの数のエピトープマッピング技法を使用しても同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ、編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．を参照されたい。例えば、直線状エピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド、タンパク質分子の部分に相当するペプチドを同時に合成し、ペプチドが支持体に依然として接続している間にペプチドを抗体と反応させることにより決定することができる。そのような技法は、当技術分野において知られており、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８〜４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５に記載されており、それらの各々は、その全体が記述されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれるものとする。同様に、立体構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴などにより、アミノ酸の空間立体構造を決定することにより同定することができる。例えば、エピトープマッピングプロトコル、前掲書を参照されたい。さらに、本発明のために、「抗原」は、タンパク質が、免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加および置換（一般的に、保存的性質であるが、それらは、非保存的であってよい）などの改変を包含するタンパク質を指すためにも使用することができる。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発を通じて、または特定の合成手順を通じて、または遺伝子工学アプローチを通じてなどの意図的であってよいか、抗原を産生する宿主の突然変異を通じてなどの偶発的であってよい。さらに、抗原は、微生物、例えば、細菌から誘導、入手、または単離するか、全有機体であってよい。同様に、核酸免疫化応用におけるなどの抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、この定義に包含される。合成抗原、例えば、ポリエピトープ、フランキングエピトープ、および他の組換えまたは合成的に誘導された抗原も包含される（Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７ ２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４２〜３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：４０２ ４０８；Ｇａｒｄｎｅｒら（１９９８）１２ｔｈ Ｗｏｒｌｄ ＡＩＤＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｊｕｎ．２８〜Ｊｕｌ．３、１９９８）。

【0084】

「防御」免疫応答とは、免疫原性組成物が、体液性かもしくは細胞性、または両方の免疫応答を誘発する能力を指し、感染から対象を防御するのに役立つ。提供される防御は、絶対的である必要はなく、すなわち、対象の対照集団、例えば、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与されていない感染動物と比較して統計的に有意な改善があれば、感染は、完全に予防され根絶される必要はない。防御は、感染の症状の重症度または発症速度を緩和することに限定されることがある。一般に、「防御免疫応答」は、各抗原に対するあるレベルの測定可能な機能的抗体応答を包含する、対象の少なくとも５０％における特定の抗原に対して特異的な抗体レベルの増加の誘導を包含するであろう。特定の状況において、「防御免疫応答」は、各抗原に対するあるレベルの測定可能な機能的抗体応答を包含する、対象の少なくとも５０％における特定の抗原に対して特異的な抗体レベルの２倍の増加または抗体レベルの４倍の増加の誘導を包含するかもしれない。ある種の実施形態において、オプソニン化した抗体は、防御免疫応答と相関している。したがって、防御免疫応答は、オプソニン化貪食作用アッセイ、例えば、下に記載されるものにおいて細菌数の減少率を測定することによりアッセイすることができる。少なくとも１０％、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の細菌数の減少のあることが好ましい。ある組成物中の特定のコンジュゲートの「免疫原性量」は、一般的に、そのコンジュゲートについてコンジュゲートしているおよびコンジュゲートしていない総多糖に基づいて投与される。例えば、遊離多糖が２０％の血清型５または８莢膜多糖コンジュゲートは、１００ｍｃｇ投与量中にコンジュゲートしている多糖約８０ｍｃｇおよびコンジュゲートしていない多糖２０ｍｃｇを有するであろう。コンジュゲートに対するタンパク質寄与は、通常、コンジュゲートの投与量を算出する場合に考慮されない。コンジュゲートの量は、ブドウ球菌の血清型に応じて変わることがある。一般的に、各投与量は、多糖０．１〜１００ｍｃｇ、詳細には、０．１〜１０ｍｃｇ、より詳細には、１〜１０ｍｃｇを含むであろう。

【0085】

「対象」という用語は、哺乳動物、鳥、魚、は虫類、またはいずれの他の動物も指す。「対象」という用語は、ヒトも包含する。「対象」という用語は、家庭のペットも包含する。家庭のペットの非限定的な例は、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、モルモット、フェレット、鳥、蛇、トカゲ、魚、カメ、およびカエルを包含する。「対象」という用語は、家畜動物も包含する。家畜動物の非限定的な例は、アルパカ、バイソン、ラクダ、ウシ、シカ、ブタ、ウマ、ラマ、ラバ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トナカイ、ヤク、ニワトリ、ガチョウおよび七面鳥を包含する。

【0086】

図６および１にそれぞれ示されているように、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５および８莢膜多糖は、下記の構造を有する：血清型５
［→４）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−（１→４）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（３−Ｏ−Ａｃ）−（１→３）−β−Ｄ ＦｕｃＮＡｃ−（１→］_ｎ
および血清型８
［→３）−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ（４−Ｏ−Ａｃ）−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→３）−α−Ｄ ＦｕｃＮＡｃ−（１→］_ｎ
Ｊｏｎｅｓ（２００５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４０：１０９７〜１１０６を参照されたい。血清型８莢膜多糖は、血清型５莢膜多糖と類似した三糖反復単位を有し、しかしながら、それらは、糖結合およびＯ−アセチル化部位の点で異なり、免疫反応性の血清学的に相異なるパターンを生み出す（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら（１９８４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：８７〜９３；およびＭｏｒｅａｕら（１９９０）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２０１：２８５〜２９７）。したがって、血清型８および５莢膜多糖は、水に可溶で、通常は酸性である比較的複雑な炭水化物であり、おおよそ２５ｋＤａの分子量を有するとこれまで考えられていた（Ｆａｔｔｏｍ（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８、２３６７〜２３７４）。

【0087】

一部の実施形態において、本発明の血清型５および／または８莢膜多糖は、Ｏ−アセチル化されている。一部の実施形態において、５型莢膜多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％である。一部の実施形態において、８型莢膜多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％である。一部の実施形態において、５型および８型莢膜多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％である。

【0088】

多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化度は、当技術分野において知られている任意の方法により、例えば、プロトンＮＭＲにより決定することができる（ＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒおよびＪｏｎｅｓ １９９６、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９６；８３〜９６、ＪｏｎｅｓおよびＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ ２００２、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ３０；１２３３〜１２４７、ＷＯ０５／０３３１４８またはＷＯ００／５６３５７）。別の一般に使用される方法は、Ｈｅｓｔｒｉｎ（１９４９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０；２４９〜２６１により記載されている。

【0089】

一部の実施形態において、本発明の血清型５および／または８莢膜多糖は、抗体が細菌を致死させることを示す動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食性致死アッセイにおける細菌の致死により測定されて機能的である抗体を生成するために使用される。機能的致死は、抗体単独の生成をモニターするアッセイを使用して示されることはなく、有効性におけるＯ−アセチル化の重要性を示さない。

【0090】

血清型５または８などの莢膜多糖は、当業者に知られている単離手順を使用して細菌から直接得ることができる。例えば、Ｆｏｕｒｎｉｅｒら（１９８４）、前掲書；Ｆｏｕｒｎｉｅｒら（１９８７）Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：５６１〜５６７；米国特許出願公開第２００７／０１４１０７７号；および国際特許出願公開第ＷＯ００／５６３５７号を参照されたい。それらの各々は、その全体が記述されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれるものとする。さらに、それらは、合成的プロトコルを使用して製造することができる。さらに、血清型５または８莢膜多糖は、当業者にも知られている遺伝子工学手順を使用して組換えにより製造することができる（Ｓａｕら（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３：２３９５〜２４０５；および米国特許第６，０２７，９２５号を参照。それらの各々は、その全体が記述されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれるものとする）。

【0091】

単離された血清型８莢膜多糖を得るために使用することができる１つの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｒ２ ＰＦＥＳＡ０２８６である。この株は、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆｒａｎｔｚ Ｂｒｏｔｈ中の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２８６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ；ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．４９５２５；）の培養後にウサギ抗血清型８多糖抗体によるフローサイトメトリーにより選択された。２つの集団、Ｒ１およびＲ２がフローサイトメトリー中に観察された。Ｒ１およびＲ２を精製して再培養した。Ｒ２は、血清型８莢膜多糖を与えた。フローサイトメトリー分析は、均一な蛍光強度を示した。こうして、血清型８莢膜多糖製造のためにＲ２が選択された。

【0092】

単離された血清型５莢膜多糖を得るために使用することができる１つの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６である。この株は、成長中に血清型５莢膜多糖を産生し、産生は、細胞が静止期にある時に頂点に達する。確立した培養株保存施設かまたは臨床標本から得られる他の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型または８型株を使用し、それぞれの多糖を作製することができる。

【0093】

本発明の免疫原性コンジュゲートの別の構成成分は、細菌の莢膜多糖がコンジュゲートしている担体分子またはタンパク質である。「タンパク質担体」または「担体タンパク質」という用語は、それに対する免疫応答が望まれる抗原（莢膜多糖など）とコンジュゲートさせることができるいずれのタンパク質分子も指す。担体とのコンジュゲーションは、抗原の免疫原性を高めることができる。コンジュゲーションは、標準的な手順により行うことができる。抗原にとって好ましいタンパク質担体は、毒素、類毒素または破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）および連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の毒素のいずれかの突然変異交差反応性物質（ＣＲＭ）である。一実施形態において、特に好ましい担体は、ＣＲＭ_１９７タンパク質を産生するジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）Ｃ７株（β１９７）に由来するジフテリア類毒素ＣＲＭ_１９７である。この株は、ＡＴＣＣアクセッション番号５３２８１を有する。ＣＲＭ_１９７を製造するための方法は、その全体が記述されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，６１４，３８２号に記載されている。代替方法として、タンパク質担体の断片もしくはエピトープまたは他の免疫原性タンパク質を使用することができる。例えば、ハプテン性抗原は、細菌の毒素、類毒素またはＣＲＭのＴ細胞エピトープとカップリングさせることができる。その全体が記述されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれている「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ａ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ ａｓ ａ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｆｏｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」と題された１９８８年２月１日出願の米国特許出願第１５０，６８８号を参照されたい。他の適当な担体タンパク質は、コレラ類毒素（例えば、国際特許出願第ＷＯ２００４／０８３２５１号に記載されている）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴなどの不活化細菌毒素、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の外毒素Ａを包含する。外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌の表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌の接着タンパク質（ＰｓａＡ）またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄなどの細菌の外膜タンパク質も使用することができる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も担体タンパク質として使用することができる。

【0094】

したがって、一実施形態において、本発明の免疫原性コンジュゲート内の担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７であり、ＣＲＭ_１９７は、カルバメート結合、アミド結合、または両方を介して多糖と共有結合している。一部の実施形態において、本発明の免疫原性コンジュゲート内の担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７であり、ＣＲＭ_１９７は、チオエーテル結合を介して多糖と共有結合している。莢膜多糖とコンジュゲートさせることになる担体タンパク質中のリシン残基数は、コンジュゲートしているリシンの範囲として特徴付けることができる。例えば、所与の免疫原性組成物において、ＣＲＭ_１９７は、莢膜多糖と共有結合している３９個のうちの５〜１５個のリシンを含むことがある。このパラメーターを表す別の方法は、ＣＲＭ_１９７リシンの１２％〜４０％が莢膜多糖と共有結合していることである。例えば、所与の免疫原性組成物において、ＣＲＭ_１９７は、莢膜多糖と共有結合している３９個のうちの１８〜２２個のリシンを含むことがある。このパラメーターを表す別の方法は、ＣＲＭ_１９７リシンの４０％〜６０％が莢膜多糖と共有結合していることである。一部の実施形態において、ＣＲＭ_１９７は、ＣＰ８と共有結合している３９個のうちの５〜１５個のリシンを含む。このパラメーターを表す別の方法は、ＣＲＭ_１９７リシンの１２％〜４０％がＣＰ８と共有結合していることである。一部の実施形態において、ＣＲＭ_１９７は、ＣＰ５と共有結合している３９個のうちの１８〜２２個のリシンを含む。このパラメーターを表す別の方法は、ＣＲＭ_１９７リシンの４０％〜６０％がＣＰ５と共有結合していることである。

【0095】

上で論じられているように、莢膜多糖とコンジュゲートしている担体タンパク質中のリシン残基数は、コンジュゲートしているリシンの範囲として特徴付けることができ、モル比として表すことができる。例えば、ＣＰ８免疫原性コンジュゲートにおけるＣＲＭ_１９７対するコンジュゲートしているリシンのモル比は、約１８：１から約２２：１の間であってよい。一実施形態において、ＣＰ８免疫原性コンジュゲートにおけるＣＲＭ_１９７対するコンジュゲートしているリシンのモル比の範囲は、約１５：１から約２５：１の間であってよい。一実施形態において、ＣＰ８免疫原性コンジュゲートにおけるＣＲＭ_１９７対するコンジュゲートしているリシンのモル比の範囲は、約１４：１〜約２０：１；約１２：１〜約１８：１；約１０：１〜約１６：１；約８：１〜約１４：１；約６：１〜約１２：１；約４：１〜約１０：１；約２０：１〜約２６：１；約２２：１〜約２８：１；約２４：１〜約３０：１；約２６：１〜約３２：１；約２８：１〜約３４：１；約３０：１〜約３６：１；約５：１〜約１０：１；約５：１〜約２０：１；約１０：１〜約２０：１；または約１０：１〜約３０：１の間であってよい。また、ＣＰ５免疫原性コンジュゲートにおけるＣＲＭ１９７に対するコンジュゲートしているリシンのモル比は、約３：１から２５：１の間であってよい。一実施形態において、ＣＰ５免疫原性コンジュゲートにおけるＣＲＭ１９７に対するコンジュゲートしているリシンのモル比の範囲は、約５：１から２０：１の間であってよい。一実施形態において、ＣＰ５免疫原性コンジュゲートにおけるＣＲＭ１９７に対するコンジュゲートしているリシンのモル比の範囲は、約４：１〜約２０：１；約６：１〜約２０：１；約７：１〜約２０：１；約８：１〜約２０：１；約１０：１〜約２０：１；約１１：１〜約２０：１；約１２：１〜約２０：１；約１３：１〜約２０：１；約１４：１〜約２０：１；約１５：１〜約２０：１；約１６：１〜約２０：１；約１７：１〜約２０：１；約１８：１〜約２０：１；約５：１〜約１８：１；約７：１〜約１６：１；または約９：１〜約１４：１の間であってよい。

【0096】

莢膜多糖とコンジュゲートしている担体タンパク質中のリシン残基数を表す別の方法は、コンジュゲートしているリシンの範囲としてであってよい。例えば、所与のＣＰ８免疫原性コンジュゲートにおいて、ＣＲＭ_１９７は、莢膜多糖と共有結合している３９個のうちの５〜１５個のリシン残基を含むことがある。代替方法として、このパラメーターは、百分率として表すことができる。例えば、所与のＣＰ８免疫原性コンジュゲートにおいて、コンジュゲートしているリシンの百分率は、１０％〜５０％の間であってよい。一部の実施形態において、リシンの２０％〜５０％は、ＣＰ８と共有結合していてよい。代替方法として、さらに、ＣＲＭ_１９７リシンの３０％〜５０％は、ＣＰ８と共有結合していてよく；ＣＲＭ_１９７リシンの１０％〜４０％；ＣＲＭ_１９７リシンの１０％〜３０％；ＣＲＭ_１９７リシンの２０％〜４０％；ＣＲＭ_１９７リシンの２５％〜４０％；ＣＲＭ_１９７リシンの３０％〜４０％；ＣＲＭ_１９７リシンの１０％〜３０％；ＣＲＭ_１９７リシンの１５％〜３０％；ＣＲＭ_１９７リシンの２０％〜３０％；ＣＲＭ_１９７リシンの２５％〜３０％；ＣＲＭ_１９７リシンの１０％〜１５％；またはＣＲＭ_１９７リシンの１０％〜１２％は、ＣＰ８と共有結合している。また、所与のＣＰ５免疫原性コンジュゲートにおいて、ＣＲＭ_１９７は、莢膜多糖と共有結合している３９個のうちの１８〜２２個のリシン残基を含むことがある。代替方法として、このパラメーターは、百分率として表すことができる。例えば、所与のＣＰ５免疫原性コンジュゲートにおいて、コンジュゲートしているリシンの百分率は、４０％〜６０％の間であってよい。一部の実施形態において、リシンの４０％〜６０％は、ＣＰ５と共有結合していてよい。代替方法として、さらに、ＣＲＭ_１９７リシンの３０％〜５０％は、ＣＰ５と共有結合していてよく；ＣＲＭ_１９７リシンの２０％〜４０％；ＣＲＭ_１９７リシンの１０％〜３０％；ＣＲＭ_１９７リシンの５０％〜７０％；ＣＲＭ_１９７リシンの３５％〜６５％；ＣＲＭ_１９７リシンの３０％〜６０％；ＣＲＭ_１９７リシンの２５％〜５５％；ＣＲＭ_１９７リシンの２０％〜５０％；ＣＲＭ_１９７リシンの１５％〜４５％；ＣＲＭ_１９７リシンの１０％〜４０％；ＣＲＭ_１９７リシンの４０％〜７０％；またはＣＲＭ_１９７リシンの４５％〜７５％は、ＣＰ５と共有結合している。

【0097】

担体タンパク質上のリシンとの莢膜多糖鎖の接続の頻度は、莢膜多糖のコンジュゲートを特徴付けるための別のパラメーターである。例えば、一実施形態において、ＣＲＭ_１９７と多糖の間の少なくとも１つの共有結合は、莢膜多糖の少なくとも５〜１０個の糖反復単位毎に存在する。別の実施形態において、莢膜多糖の５〜１０個の糖反復単位毎、２〜７個の糖反復単位毎、３〜８個の糖反復単位毎；４〜９個の糖反復単位毎；６〜１１個の糖反復単位毎；７〜１２個の糖反復単位毎；８〜１３個の糖反復単位毎；９〜１４個の糖反復単位毎；１０〜１５個の糖反復単位毎；２〜６個の糖反復単位毎、３〜７個の糖反復単位毎；４〜８個の糖反復単位毎；６〜１０個の糖反復単位毎；７〜１１個の糖反復単位毎；８〜１２個の糖反復単位毎；９〜１３個の糖反復単位毎；１０〜１４個の糖反復単位毎；１０〜２０個の糖反復単位毎；または５〜１０個の糖反復単位毎にＣＲＭ_１９７と莢膜多糖の間に少なくとも１つの共有結合がある。別の実施形態において、ＣＲＭ_１９７と莢膜多糖の間の少なくとも１つの結合は、莢膜多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の糖反復単位毎に存在する。

【0098】

本発明の一実施形態は、上に記載されている担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートのうちのいずれかを含む免疫原性組成物を提供する。

【0099】

「免疫原性組成物」という用語は、抗原、例えば、微生物またはその構成成分を含有するいずれの医薬組成物にも関し、その組成物を使用し、対象において免疫応答を誘発することができる。本発明の免疫原性組成物は、全身、皮膚または粘膜経路を介して免疫原性組成物を投与することによって黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を受けやすいヒトを防御または治療するために使用することができ、または別の対象に対して受動免疫を与えるために使用することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成するために使用することができる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路を介する注射；または口道／消化管、呼吸管または泌尿生殖管への粘膜投与を介するものを包含することができる。一実施形態において、鼻腔内投与は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の鼻咽頭保菌を治療または予防し、その最初期段階において感染を軽減するために使用される。免疫原性組成物は、動物有効性モデルにおけるかまたはオプソニン化貪食性致死アッセイを介する細菌の致死により測定されて機能的である抗体を生成するために使用されてもよい。

【0100】

特定の免疫原性組成物についての構成成分の最適量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的研究により確定することができる。最初のワクチン接種に続き、対象は、十分に間隔をあけた１回または数回のブースター免疫化を受けることができる。

【0101】

本発明の免疫原性組成物は、下記の抗原のうちの１つまたは複数を包含することもある：ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ ＭｎｔＣ／ＳｉｔＣ／Ｓａｌｉｖａ結合タンパク質、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＡ、Ｏｐｐ３ａ、ＤｌｔＡ、ＨｔｓＡ、ＬｔａＳ、ＳｄｒＨ、ＳｒｔＡ、ＳｐＡ、ＳＢＩ、α−ヘモリシン（ｈｌａ）、β−ヘモリシン、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｆｎｂＡ）、コアグラーゼ、マップ（ｍａｐ）、Ｐａｎｔｏｎ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅロイコシジン（ｐｖｌ）、γ−毒素（ｈｌｇ）、アイカ（ｉｃａ）、免疫優性ＡＢＣトランスポーター、ＲＡＰ、オートリシン、ラミニン受容体、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＩｓａＢ／ＰｉｓＢ、ＳＰＯＩＩＩＥ、ＳｓａＡ、ＥｂｐＳ、ＳａｓＦ、ＳａｓＨ、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＦｎｂＢ、Ｎｐａｓｅ、ＥＢＰ、骨シアロ結合タンパク質ＩＩ、オーレオリシン（ａｕｒｅｏｌｙｓｉｎ）前駆体（ＡＵＲ）／Ｓｅｐｐ１、Ｃｎａ、ＴＳＳＴ−１、ｍｅｃＡ、ｄＰＮＡＧ、ＧｅｈＤ、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２ ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、ＨａｒＡ、エンテロトキシンＡ、エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ１、および新規オートリシン。

【0102】

一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、アジュバント、緩衝液、凍結防止剤、塩、二価陽イオン、非イオン性界面活性剤、遊離ラジカル酸化の阻害剤、希釈剤または担体のうちの少なくとも１つをさらに含む。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物内のアジュバントは、アルミニウムベースのアジュバントである。一実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである。一実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。

【0103】

アジュバントは、免疫原または抗原と一緒に投与される場合に免疫応答を高める物質である。インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号を参照）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（および、その突然変異型）；インターフェロン−α、βおよびγ；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（例えば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ３９９００を参照）；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；ならびに腫瘍壊死因子αおよびβを包含するがそれらに限定されない多くのサイトカインまたはリンホカインは、免疫調節活性を有することが明らかにされており、したがって、アジュバントと同じか同様に有用であることがある。本明細書に記載されている免疫原性組成物とで有用であるさらに他のアジュバントは、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳを包含するがそれらに限定されないケモカイン；セレクチン、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンなどの接着分子；ムチン様分子、例えば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１；ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５などの多くのインテグリンファミリー；ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２およびＬＦＡ−３などの多くの免疫グロブリンスーパーファミリー；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌなどの共刺激分子；血管成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、および血管内皮成長因子を包含する成長因子；Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６を包含する受容体分子；ならびにＩＣＥを包含するカスパーゼを包含する。

【0104】

免疫応答を高めるために使用される適当なアジュバントは、米国特許第４，９１２，０９４号に記載されているＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アセチル化モノホスホリル脂質Ａ、Ｃｏｒｉｘａ；Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）をさらに包含することがあるが、それに限定されるものではない。Ｃｏｒｉｘａから入手可能である合成脂質Ａ類似体もしくはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはそれらの誘導体もしくは類似体、および米国特許第６，１１３，９１８号に記載されているものも、アジュバントして使用するのに適している。１つのそのようなＡＧＰは、５２９（以前は、ＲＣ５２９として知られている）としても知られている２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル ２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドである。この５２９アジュバントは、水性形態（ＡＦ）として、または安定エマルジョン（ＳＥ）として製剤化される。

【0105】

さらに他のアジュバントは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などのムラミルペプチド；モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化されたＭＦ５９（米国特許第６，２９９，８８４号）（５％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を含有する（場合により、様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有する））、およびサブミクロンエマルジョンにマイクロ流動化されるかまたはより大きい粒径のエマルジョンを作製するためにボルテックスされたＳＡＦ（１０％スクアレン、０．４％ポリソルベート８０、５％プルロニック−ブロックドポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有する）などの水中油型エマルジョン剤；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）；Ａｍｐｈｉｇｅｎ；Ａｖｒｉｄｉｎｅ；Ｌ１２１／スクアレン；Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド；プルロニックポリオール；死菌ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）；米国特許第５，０５７，５４０号に記載されているＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）、米国特許第５，２５４，３３９号に記載されているＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などのサポニン；結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（例えば、米国特許第６，２０７，６４６号）；ＥＰ特許第１，２９６，７１３号および第１，３２６，６３４号に記載されているＩＣ−３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）；百日咳毒素（ＰＴ）もしくはその突然変異体、コレラ毒素もしくはその突然変異体（例えば、米国特許第７，２８５，２８１号、第７，３３２，１７４号、第７，３６１，３５５号および第７，３８４，６４０号）；または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）もしくはその突然変異体、特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２（例えば、米国特許第６，１４９，９１９号、第７，１１５，７３０号および第７，２９１，５８８号）を包含する。

【0106】

免疫原性組成物は、場合により、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」という用語は、連邦、州政府の規制機関、または他の規制機関により認可されているか、ヒトならびに非ヒト哺乳動物を包含する動物で使用するために米国薬局方または他の一般的に認められた薬局方に列挙されている担体を意味する。「担体」という用語は、医薬組成物と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。水、食塩溶液および水性のデキストロースおよびグリセロール溶液は、液体担体として、特に、注射用溶液剤のために用いることができる。適当な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。製剤は、投与様式に合わせるべきである。

【0107】

本発明の免疫原性組成物は、体液性および／または細胞性の免疫の上方制御かまたは下方制御が観察されるように、免疫系をかき乱すまたは変化させる薬剤である１つまたは複数の追加の「免疫調節薬」をさらに含むことができる。一実施形態において、免疫系の体液性および／または細胞性アームの上方制御が提供される。ある種の免疫調節薬の例は、とりわけ、例えば、アジュバントもしくはサイトカイン、または米国特許第５，２５４，３３９号に記載されているＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ；Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を包含する。本発明の免疫原性組成物において使用することができるアジュバントの非限定的な例は、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．；Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルなどの鉱物ゲル、水中油型エマルジョン剤、例えば、フロイント完全および不完全アジュバントなどの油中水型エマルジョン剤、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ；Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａまたは他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、およびＡｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバントを包含する。本発明の免疫原性組成物において有用な水中油型エマルジョン剤の非限定的な例は、改変ＳＥＡＭ６２およびＳＥＡＭ１／２製剤を包含する。改変ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）Ｓｐａｎ（登録商標）８５Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７％（ｖ／ｖ）ポリソルベート８０界面活性剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、２００ｍｃｇ／ｍｌ Ｑｕｉｌ Ａ、１００ｍｃｇ／ｍｌコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）レシチンを含有する水中油型エマルジョンである。改変ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン、１％（ｖ／ｖ）Ｓｐａｎ（登録商標）８５界面活性剤、０．７％（ｖ／ｖ）ポリソルベート８０界面活性剤、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、１００ｍｃｇ／ｍｌ Ｑｕｉｌ Ａ、および５０ｍｃｇ／ｍｌコレステロールを含む水中油型エマルジョンである。免疫原性組成物に包含することができる他の「免疫調節薬」は、例えば、１つまたは複数のインターロイキン、インターフェロン、または他の知られているサイトカインもしくはケモカインを包含する。一実施形態において、アジュバントは、それぞれ米国特許第６，１６５，９９５号および第６，６１０，３１０号に記載されているものなどのシクロデキストリン誘導体またはポリアニオン系ポリマーであってよい。使用されることになる免疫調節薬および／またはアジュバントが、免疫原性組成物が投与されるであろう対象、注射経路および与えられることになる注射の数によって異なることは理解されるべきである。

【0108】

本発明の免疫原性組成物は、複数のブドウ球菌莢膜多糖タンパク質コンジュゲートに加えて、１つまたは複数の保存剤をさらに含むことがある。ＦＤＡは、ごくわずかな例外はあるものの、複数回投与量（マルチドーズ）バイアル中の生物学的製品が、保存剤を含有することを要求している。保存剤を含有するワクチン製品は、塩化ベンゼトニウム（炭疽菌）、２−フェノキシエタノール（ＤＴａＰ、ＨｅｐＡ、Ｌｙｍｅ、Ｐｏｌｉｏ（非経口））、フェノール（Ｐｎｅｕｍｏ、Ｔｙｐｈｏｉｄ（非経口）、Ｖａｃｃｉｎｉａ）およびチメロサール（ＤＴａＰ、ＤＴ、Ｔｄ、ＨｅｐＢ、Ｈｉｂ、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、ＪＥ、Ｍｅｎｉｎｇ、Ｐｎｅｕｍｏ、Ｒａｂｉｅｓ）を含有するワクチンを包含する。注射用薬物における使用が認可されている保存剤は、例えば、クロロブタノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、２−フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、フェノール、チメロサールおよび硝酸フェニル水銀を包含する。

【0109】

本発明の製剤は、緩衝液、塩、二価陽イオン、非イオン界面活性剤、糖などの凍結防止剤、およびフリーラジカル捕捉剤またはキレート化剤などの抗酸化剤、またはそれらのいずれの複数組合せのうちの１つまたは複数もさらに含むことができる。いずれか１つの構成成分、例えば、キレート剤の選択は、別の構成成分（例えば、捕捉剤）が望ましいかどうかを決定することがある。投与のために製剤化された最終組成物は、無菌および／またはパイロジェンフリーであるべきである。当業者は、必要とされる特定の保存および投与条件などの様々な要因に応じて、これらおよび他の構成成分のどの組合せが、本発明の保存剤含有免疫原性組成物への包含に最適であるかを経験的に決定することができる。

【0110】

ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、Ｔｒｉｓ（トリメタミン）、リン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジンおよびコハク酸塩から選択されるがそれらに限定されない１つまたは複数の生理学的に許容できる緩衝液を含む。ある種の実施形態において、製剤は、約６．０〜約９．０、好ましくは、約６．４から約７．４までのｐＨ範囲内に緩衝される。

【0111】

ある種の実施形態において、本発明の免疫原性組成物または製剤のｐＨを調整することが望ましいことがある。本発明の製剤のｐＨは、当技術分野における標準的な技法を使用して調整することができる。製剤のｐＨは、３．０から８．０の間であるように調整することができる。ある種の実施形態において、製剤のｐＨは、３．０から６．０、４．０から６．０、または５．０から８．０の間であってよく、または３．０から６．０、４．０から６．０、または５．０から８．０の間であるように調整することができる。他の実施形態において、製剤のｐＨは、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約５．８、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、または約８．０であってよいか、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約５．８、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、または約８．０であるように調整することができる。ある種の実施形態において、ｐＨは、４．５から７．５まで、または４．５から６．５まで、５．０から５．４まで、５．４から５．５まで、５．５から５．６まで、５．６から５．７まで、５．７から５．８まで、５．８から５．９まで、５．９から６．０まで、６．０から６．１まで、６．１から６．２まで、６．２から６．３まで、６．３から６．５まで、６．５から７．０まで、７．０から７．５までまたは７．０から８．０までの範囲であってよいか、４．５から７．５まで、または４．５から６．５まで、５．０から５．４まで、５．４から５．５まで、５．５から５．６まで、５．６から５．７まで、５．７から５．８まで、５．８から５．９まで、５．９から６．０まで、６．０から６．１まで、６．１から６．２まで、６．２から６．３まで、６．３から６．５まで、６．５から７．０まで、７．０から７．５までまたは７．０から８．０までの範囲であるように調整することができる。具体的実施形態において、製剤のｐＨは、約５．８である。

【0112】

ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、約０．１ｍＭから約１０ｍＭまでの範囲であり、最高で約５ｍＭまでが好ましい濃度で、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２およびＭｎＣｌ_２を包含するがそれらに限定されない１つまたは複数の二価陽イオンを含む。

【0113】

ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、非経口投与の際には対象に対して生理学的に許容できるイオン強度で存在し、最終製剤において選択されるイオン強度または容積モル浸透圧濃度を生じる最終濃度で包含される、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸カリウムを包含するがそれらに限定されない１つまたは複数の塩を含む。製剤の最終イオン強度または重量モル浸透圧濃度は、複数の構成成分（例えば、１つまたは複数の緩衝化合物および他の非緩衝塩由来のイオンにより決定されるであろう。好ましい塩、ＮａＣｌは、最高で約２５０ｍＭまでの範囲から存在し、塩濃度は、製剤の最終総容積モル浸透圧濃度が、非経口投与（例えば、筋肉内または皮下注射）に適合しており、様々な温度範囲にわたって免疫原性組成物製剤の免疫原性構成成分の長期安定性を促進するように、他の構成成分（例えば、糖）を補完するように選択される。無塩製剤は、望ましい最終容積モル浸透圧濃度レベルを維持するために増加した範囲の１つまたは複数の選択された凍結防止剤を容認するであろう。

【0114】

ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、二糖（例えば、ラクトース、マルトース、スクロースまたはトレハロース）およびポリヒドロキシ炭化水素（例えば、ズルシトール、グリセロール、マンニトールおよびソルビトール）から選択されるがそれらに限定されない１つまたは複数の凍結防止剤を含む。

【0115】

ある種の実施形態において、製剤の容積モル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓ／Ｌから約８００ｍＯｓ／Ｌまでの範囲であり、好ましい範囲は、約２５０ｍＯｓ／Ｌから約５００ｍＯｓ／Ｌまで、または約３００ｍＯｓ／Ｌ〜約４００ｍＯｓ／Ｌである。無塩製剤は、例えば、スクロース約５％から約２５％まで、好ましくは、スクロース約７％から約１５％まで、または約１０％〜約１２％を含有することができる。代替方法として、無塩製剤は、例えば、ソルビトール約３％から約１２％まで、好ましくは、ソルビトール約４％から約７％まで、または約５％〜約６％を含有することができる。塩化ナトリウムなどの塩が添加される場合、スクロースまたはソルビトールの有効範囲は相対的に減少する。これらおよび他のそのような重量モル浸透圧濃度および容積モル浸透圧濃度に対する配慮は、当業者の技術範囲内に十分ある。

【0116】

ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、１つまたは複数のフリーラジカル酸化阻害剤および／またはキレート化剤を含む。様々なフリーラジカル捕捉剤およびキレート剤が当技術分野において知られており、本明細書に記載されている製剤および使用方法に当てはまる。例は、エタノール、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノール組合せ、トリエタノールアミン、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトール六リン酸、トリポリリン酸塩、アスコルビン酸／アスコルビン酸塩、コハク酸／コハク酸塩、リンゴ酸／リンゴ酸塩、デスフェラール、ＥＤＤＨＡおよびＤＴＰＡ、ならびに上のうちの２つ以上の様々な組合せを包含するが、それらに限定されるものではない。ある種の実施形態において、少なくとも１つの非還元性フリーラジカル捕捉剤は、製剤の長期安定性を有効に高める濃度で添加することができる。１つまたは複数のフリーラジカル酸化阻害剤／キレート剤も、捕捉剤と二価陽イオンなどの様々な組合せで添加することができる。キレート剤の選択は、捕捉剤の添加が必要とされるかどうかを決定するであろう。

【0117】

ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ ４０）およびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）、Ｂｒｉｊ ５８、Ｂｒｉｊ ３５を包含するがそれらに限定されないポリオキシエチレンアルキルエーテル、ならびにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ ４０、Ｓｐａｎ ８５およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１）などの他のものを包含するがそれらに限定されない１つまたは複数の非イオン界面活性剤を含み、好ましい構成成分は、約０．００１％から約２％までの濃度（最高で約０．２５％までが好ましい）のポリソルベート−８０または約０．００１％から１％までの濃度（最高で約０．５％までが好ましい）のポリソルベート−４０である。

【0118】

ある種の実施形態において、本発明の製剤は、非経口投与に適している１つまたは複数の追加安定化剤、例えば、少なくとも１つのチオール（−ＳＨ）基を含む還元剤（例えば、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、還元グルタチオン、チオグリコール酸ナトリウム、チオ硫酸塩、モノチオグリセロール、またはそれらの混合物）を含む。代替方法としてまたは場合により、本発明の保存剤含有免疫原性組成物製剤は、保存容器から酸素を除去すること、光から製剤を守ること（例えば、琥珀色のガラス容器を使用すること）によりさらに安定化することができる。

【0119】

本発明の保存剤含有免疫原性組成物製剤は、それ自体が免疫応答を誘導しない任意の賦形剤を包含する１つまたは複数の薬学的に許容できる担体または賦形剤を含むことができる。適当な賦形剤は、タンパク質、糖質、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、スクロース（Ｐａｏｌｅｔｔｉら、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２１１８）、トレハロース、ラクトースおよび脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）を包含するが、それらに限定されるものではない。そのような担体は、当業者によく知られている。薬学的に許容できる賦形剤は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ、２０００、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２で論じられている。

【0120】

本発明の組成物は、凍結乾燥されるか、水性形態、すなわち、溶液剤または懸濁剤であってよい。液体製剤は、それらの包装された形態から直接、有利に投与することができるため、さもなければ本発明の凍結乾燥組成物にとって必要とされるような水性媒体における再構成を必要とすることなく注射にとって理想的である。

【0121】

対象への本発明の免疫原性組成物の直接送達は、非経口投与により（筋肉内に、腹腔内に、皮内に、皮下に、静脈内に、または組織の間質空間へ）；または直腸、経口、膣、局所、経皮、鼻腔内、眼、耳、肺または他の粘膜投与により行うことができる。好ましい実施形態において、非経口投与は、例えば、対象の大腿または上腕への筋肉内注射による。注射は、注射針（例えば、皮下注射針）を介してよいが、代替方法として、無針注射を使用することができる。典型的な筋肉内投与量は、０．５ｍＬである。本発明の組成物は、例えば、液体の溶液剤かまたは懸濁剤としての注射のため、様々な形態で調製することができる。ある種の実施形態において、組成物は、例えば、吸入器における肺投与のための粉末またはスプレーとして調製することができる。他の実施形態において、組成物は、坐剤もしくは膣坐剤として、鼻、耳もしくは眼投与のために、例えば、スプレー、点滴剤、ゲルもしくは粉末として調製することができる。

【0122】

各免疫原性組成物投与量におけるコンジュゲートの量は、著しい有害作用なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は、ブドウ球菌血清型に応じて変わることがある。一般的に、各投与量は、多糖０．１〜１００μｇ、詳細には、０．１〜１０μｇ、より詳細には、１〜５μｇを含むであろう。

【0123】

特定の免疫原性組成物についての構成成分の最適量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な試験により確定することができる。初回ワクチン接種の後に、対象は、十分に間隔をおいた１回または数回のブースター免疫化を受けることができる。

【0124】

包装および剤形
本発明の免疫原性組成物は、単位投与量または複数回投与形態（例えば、２投与量、４投与量、またはそれ以上）で包装することができる。複数回投与形態については、バイアルが典型的であるが、必ずしも充填済み注射器より好ましいわけではない。適当な複数回投与フォーマットは、１投与量当たり０．１〜２ｍＬにて１容器当たり２〜１０投与量を包含するが、それらに限定されるものではない。ある種の実施形態において、投与量は、０．５ｍＬ投与量である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている国際特許出願ＷＯ２００７／１２７６６８を参照されたい。

【0125】

組成物は、バイアルもしくは他の適当な保存容器で提供することができ、または充填済み送達装置、例えば、注射針の有無に関わらず供給することができる単一または複数構成成分注射器で提供することができる。必ずしも要しないが、注射器は、典型的には、本発明の保存剤含有免疫原性組成物の単回投与量を含有するが、複数回投与充填済み注射器も想定されている。同様に、バイアルは、単回投与量を包含するが、代替方法として、複数回投与量を包含することができる。

【0126】

有効用量体積は、常法通りに定めることができるが、注射のための組成物の典型的な投与量は、０．５ｍＬの体積を有する。ある種の実施形態において、投与量は、ヒト対象への投与のために製剤化される。ある種の実施形態において、投与量は、成人、十代、青年、幼児または乳児（すなわち、１歳程度）のヒト対象への投与のために製剤化され、好ましい実施形態において、注射により投与することができる。

【0127】

本発明の液体免疫原性組成物は、凍結乾燥形態で提供される他の免疫原性組成物を再構成するのにも適している。免疫原性組成物が、そのような即時再構成のために使用されることになる場合、本発明は、２つ以上のバイアル、２つ以上の充填済み注射器、または各々のうちの１つもしくは複数を含むキットを提供し、注射器の内容物を使用し、注射の前にバイアルの内容物を再構成するか、その逆をする。

【0128】

代替方法として、本発明の免疫原性組成物は、例えば、それらを調製するのに使用される厳密な方法を変えることにより選択および制御することができる平均直径サイズなどの粒子特性を有するミクロペレットまたはミクロスフェアなどの乾燥した規則正しい形状の（例えば、球状の）粒子を形成するための当技術分野においてよく知られている凍結乾燥のための数多くの方法のうちの１つを使用し、凍結乾燥および再構成することができる。免疫原性組成物は、場合により、ミクロペレットまたはミクロスフェアなどの別々の乾燥した規則正しい形状（例えば、球状の）粒子と共に調製するか、それらの中に含有することができるアジュバントをさらに含むことができる。そのような実施形態において、本発明は、場合により本発明の１つまたは複数の保存剤をさらに含む安定化された乾燥免疫原性組成物を包含する第一構成成分、および第一構成成分の再構成のための無菌水溶液を含む第二構成成分を含む免疫原性組成物キットをさらに提供する。ある種の実施形態において、水溶液は、１つまたは複数の保存剤を含み、少なくとも１つのアジュバントを場合により含むことができる（例えば、ＷＯ２００９／１０９５５０を参照（参照により本明細書に組み込まれている）。

【0129】

さらに別の実施形態において、複数回投与フォーマットの容器は、一般的な実験室のガラス器具、フラスコ、ビーカー、メスシリンダー、発酵槽、バイオリアクター、管類、パイプ、袋、広口瓶、バイアル、バイアルクロージャー（例えば、ゴムストッパー、ねじ式キャップ）、アンプル、注射器、二室または多室の注射器、注射器ストッパー、注射器プランジャー、ラバークロージャー、プラスチッククロージャー、ガラスクロージャー、カートリッジおよび使い捨てペンからなるがそれらに限定されない群のうちの１つまたは複数から選択される。本発明の容器は、製造の材料により限定されず、ガラス、金属（例えば、スチール、ステンレススチール、アルミニウムなど）およびポリマー（例えば、熱可塑性プラスチック、エラストマー、熱可塑性プラスチック−エラストマー）などの材料を包含する。特定の実施形態において、このフォーマットの容器は、ブチルストッパー付きの５ｍＬ Ｓｃｈｏｔｔ１型ガラスバイアルである。当業者は、上に示されているフォーマットが、決して網羅的リストではなく、単に、本発明に使用可能である様々なフォーマットに関する当業者への指導の役割を果たすことを理解しているであろう。本発明における使用が企図されている追加フォーマットは、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｃｏｒｐ．（Ｌｉｍａ、ＯＨ）、ＶＷＲなどの実験装置の販売者および製造者の公表されたカタログ中に見いだすことができる。

【0130】

免疫原性コンジュゲートを作製するための方法
本発明は、本明細書に記載されている免疫原性コンジュゲートを作製する方法も包含する。本発明の免疫原性コンジュゲートを作製するための方法には、ＣＤＩ（１，１−カルボニルジイミダゾール）、ＣＤＴ（１，１−カルボイル−ジ−１，２，４−トリアゾール）またはＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド）を伴うコンジュゲーション化学反応を使用する莢膜多糖の担体タンパク質との共有結合コンジュゲーションを伴う。

【0131】

したがって、本発明の一実施形態は、担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートを作製するＣＤＴベースの方法であって、ａ）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖をイミダゾールまたはトリアゾールと混ぜ合わせて、混ぜ合わせられた多糖を生じさせるステップと；ｂ）混ぜ合わせられた多糖を有機溶媒および約０．１％〜約０．３％ｗ／ｖの水の中でＣＤＴと反応させて、活性化された血清型５または８莢膜多糖を生じさせるステップと；ｃ）活性化された血清型５または８莢膜多糖を精製して、精製された活性化された血清型５または８莢膜多糖を生じさせるステップと；ｄ）精製された活性化された血清型５または８莢膜多糖を有機溶媒中で担体タンパク質と反応させて、血清型５または８莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートを生じさせるステップと、ｅ）血清型５または８莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートを加水分解して、未反応の活性化基を除去するステップとを含み、それによって、担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートが生じる方法を提供する。一実施形態において、ステップ（ｄ）の前に、精製された活性化された血清型５または８莢膜多糖は、担体タンパク質と混ぜ合わせられる。

【0132】

本発明の一実施形態において、担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートを作製する別のＣＤＴベースの方法であって、ａ）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖をイミダゾールまたはトリアゾールと混ぜ合わせて、混ぜ合わせられた多糖を生じさせるステップと；ｂ）混ぜ合わせられた多糖を有機溶媒および約０．１％〜約０．３％ｗ／ｖの水の中でＣＤＴと反応させて、活性化された血清型５または８莢膜多糖を生じさせるステップと；ｃ）活性化された血清型５または８莢膜多糖を有機溶媒中で担体タンパク質と反応させて、血清型５または８莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートを生じさせるステップと、ｄ）血清型５または８莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートを加水分解して、未反応の活性化基を除去するステップとを含み、それによって、担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートが生じる方法が提供される。

【0133】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＣＤＴベースの方法における有機溶媒は、極性非プロトン性溶媒である。一実施形態において、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、およびヘキサメチルリン酸アミド（ＨＭＰＡ）からなる群から選択される極性非プロトン性溶媒である。一実施形態において、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。

【0134】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＣＤＴベースの方法における混ぜ合わせられた多糖をＣＤＴと反応させるステップは、多糖と比較して約２０倍モル過剰のＣＤＴを提供するステップを含む。

【0135】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＣＤＴベースの方法における活性化された血清型５または８莢膜多糖を精製するステップは、透析濾過を含む。

【0136】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＣＤＴベースの方法における担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製する方法における活性化された血清型５または８莢膜多糖は、約１：１の重量比でＣＲＭ_１９７と反応する。

【0137】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＣＤＴベースの方法における血清型５または８多糖：担体タンパク質コンジュゲートを加水分解して、未反応の活性化基を除去するステップは、緩衝液中へ希釈し、約２０℃〜約２６℃にて少なくとも４時間にわたって約８．８〜約９．２のｐＨを維持するステップを含む。一実施形態において、血清型５または８莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートを加水分解するステップは、緩衝液中へ希釈し、約２３℃にて少なくとも４時間にわたって約９．０のｐＨを維持するステップを含む。

【0138】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＣＤＴベースの方法に従って製造される血清型５または８莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートは、精製される。一実施形態において、血清型５または８莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートの精製は、透析濾過を含む。

【0139】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＣＤＴベースの方法において混ぜ合わせられた多糖をＣＤＴと反応させる前に、混ぜ合わせられた血清型５または８多糖は、凍結乾燥および再懸濁される。一実施形態において、混ぜ合わせられた多糖と担体タンパク質は共に、混ぜ合わせられた多糖をＣＤＴと反応させる前に、別々に凍結乾燥および再懸濁される。一実施形態において、凍結乾燥された混ぜ合わせられた多糖および／または凍結乾燥された担体タンパク質は、有機溶媒に再懸濁される。一実施形態において、有機溶媒は、ＤＭＳＯである。

【0140】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＣＤＴベースの方法において混ぜ合わせられた活性化された血清型５または８莢膜多糖を担体タンパク質と反応させる前に、精製された活性化された血清型５または８莢膜多糖および担体タンパク質は、別々に凍結乾燥および再懸濁される。一実施形態において、担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７であり、凍結乾燥の前に、ＣＲＭ_１９７は、ＮａＣｌに対して透析濾過される。一実施形態において、凍結乾燥の前に、ＣＲＭ_１９７は、ＮａＣｌに対して透析濾過され、ＮａＣｌ／ＣＲＭのｗ／ｗ比は、約０．５〜約１．５に調整される。

【0141】

本発明の一実施形態は、担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートを作製するＰＤＰＨベースの方法であって、ａ）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を有機溶媒中でＰＤＰＨおよびカルボジイミドと反応させて、ＰＤＰＨ結合型多糖を生じさせるステップと；ｂ）ＰＤＰＨ結合型多糖を還元剤と反応させて、活性化された多糖を生じさせるステップと；ｃ）活性化された血清型５または８莢膜多糖を精製して、精製された活性化された血清型５または８莢膜多糖を生じさせるステップと；ｄ）担体タンパク質を有機溶媒中でブロモ酢酸と反応させて、活性化された担体タンパク質を生じさせるステップと；ｅ）活性化された担体タンパク質を精製して、精製された活性化された担体タンパク質を生じさせるステップと；ｆ）精製された活性化された血清型５または８莢膜多糖を精製された活性化された担体タンパク質と反応させて、血清型５または８莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートを生じさせるステップと；ｇ）血清型５または８莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートを加水分解して、未反応の活性化基を除去するステップとを含み、それによって、担体タンパク質とコンジュゲートしている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートが生じる方法を提供する。

【0142】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＰＤＰＨベースの方法において使用されるブロモ酢酸は、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）である。一実施形態において、本発明のＰＤＰＨベースの方法において使用される担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７であり、ＢＡＡＮＳは、約１：０．１〜約１：０．５のＣＲＭ_１９７：ＢＡＡＮＳ重量比で添加される。

【0143】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＰＤＰＨベースの方法における有機溶媒は、極性非プロトン性溶媒である。一実施形態において、有機溶媒は、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、およびＨＭＰＡからなる群から選択される極性非プロトン性溶媒である。一実施形態において、有機溶媒は、ＤＭＳＯである。

【0144】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＰＤＰＨベースの方法において使用されるカルボジイミドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）である。一実施形態において、血清型５または８莢膜多糖を有機溶媒中でＰＤＰＨおよびＥＤＡＣと反応させるステップは、約１：５：３の多糖：ＰＤＰＨ：ＥＤＡＣ重量比を維持することを含む。

【0145】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＰＤＰＨベースの方法において使用される還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。

【0146】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＰＤＰＨベースの方法において活性化された血清型５または８莢膜多糖を精製するステップと担体タンパク質を精製するステップは、各々透析濾過を含む。

【0147】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＰＤＰＨベースの方法における担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製する方法における活性化された血清型５または８多糖は、約１：１の重量比でＣＲＭ_１９７と反応する。

【0148】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＰＤＰＨベースの方法において血清型５または８多糖：担体タンパク質コンジュゲートを加水分解して、未反応の活性化基を除去するステップは、システアミン塩酸塩の添加を含む。

【0149】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＰＤＰＨベースの方法に従って製造される血清型５または８莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートは、精製される。一実施形態において、血清型５または８莢膜多糖：担体タンパク質コンジュゲートの精製は、透析濾過を含む。

【0150】

一実施形態において、免疫原性コンジュゲートを作製するＰＤＰＨベースの方法において精製された活性化された血清型５または８莢膜多糖を精製された活性化された担体タンパク質と反応させる前に、精製された活性化された多糖と精製された活性化された担体タンパク質は、別々に凍結乾燥および再懸濁される。一実施形態において、凍結乾燥された活性化された多糖および／または凍結乾燥された活性化された担体タンパク質は、有機溶媒に再懸濁される。一実施形態において、有機溶媒は、ＤＭＳＯである

【0151】

本明細書で使用されている、「凍結乾燥」とは、周囲の圧力が、凍結水が固相から気相に直接昇華することを可能にするのに十分な熱の存在下で低下する間に、細菌の莢膜多糖が凍結される脱水プロセスを意味する。多糖を凍結乾燥するための当技術分野において知られているいずれの方法も使用することができる。例えば、ＫｅｎｎｅｄｙおよびＣａｂｒａｌ、編、「Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；１９９３）中のＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ（１９８９）「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」；米国特許第４，１３４，２１４号；および国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０８６４７１号を参照されたい；それらの各々は、その全体が記述されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれるものとする。場合により、例えば、スクロース、グルコース、ラクトース、トレハロース、アラビノース、キシロース、ガラクトース、ソルビトールまたはマンニトールなどの凍結防止剤が凍結乾燥中に包含されることがある。

【0152】

本明細書で使用されている、「活性化する」および「活性化」とは、細菌の莢膜多糖または担体タンパク質が、コンジュゲーションを受けやすくなるように改変されることを意味する（すなわち、少なくとも１つの部分は担体分子と共有結合することができるようにしなければならない）。例えば、本発明のＣＤＴベースのコンジュゲーション方法に関して、多糖は、低水分環境中で（例えば、ＤＭＳＯ中で）活性化され、利用可能なヒドロキシルとトリアゾールカルバメート部分およびカルボン酸とアシルトリアゾール部分を形成する。次いで、活性化された多糖をＣＲＭ_１９７タンパク質と反応させることができ、ＣＲＭ_１９７内のリシン残基によるトリアゾールの求核置換ならびにカルバメート結合（活性化されたヒドロキシルの場合）およびアミド結合（活性化されたカルボン酸の場合）の形成をもたらす。対照的に、本発明のＰＤＰＨベースのコンジュゲーション方法に関して、担体タンパク質と多糖は共に、コンジュゲーションの前に活性化され：１）ＣＲＭ_１９７の活性化には、アミン基のブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によりＣＲＭ_１９７タンパク質中にブロモアセチル基を導入するステップを伴い；２）多糖の活性化には、多糖中のＮ−アセチルマンノサミノウロン酸のカルボジイミドで活性化されたカルボキシレート基をスルフヒドリル反応性ヒドラジドヘテロ二官能性リンカーＰＤＰＨのヒドラジド基とカップリングするステップと、続く、ＤＴＴによる還元を伴う。次いで、活性化された多糖を、ＰＤＰＨチオール化多糖のチオールが活性化された担体タンパク質のブロモアセチル基と反応し、臭化物置換により形成される共有チオエーテル結合をもたらすように、活性化された担体タンパク質と反応させることができる。

【0153】

本発明の方法に従い、莢膜多糖、担体タンパク質、および／または多糖タンパク質コンジュゲートを精製することができる。濃縮／透析濾過、沈殿／溶離、カラムクロマトグラフィーおよびデプス濾過などの多糖またはタンパク質を精製するための当技術分野において知られているいずれの方法も使用することができる。例えば、Ｆａｒｒｅｓら（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｅｃｈ．１０：３７５〜３８０；Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｎｇ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｔｏｐｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｎｔｏｎｉｏ Ｍｅｎｄｅｚ Ｖｉｌａｓ、編、第１版 Ｂａｄａｊｏｚ、Ｅｓｐａｎｈａ：Ｆｏｒｍａｔｅｘ；２００７、ｐｐ．４５０〜４５７）中のＧｏｎｃａｌｖｅｓら；Ｔａｎｉｚａｋｉら（１９９６）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７：１９〜２３；および米国特許第６，１４６，９０２号；および米国特許出願公開第２００８／０２８６８３８号を参照されたい；それらの各々は、その全体が記述されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【0154】

本明細書で使用されている、「単離された」または「精製された」という用語は、材料が、その元の環境から（例えば、天然に存在する場合には自然環境または組換え物である場合には宿主有機体から）取り出されるか、１つの環境から異なる環境に運ばれることを意味する。例えば、単離された多糖、ペプチドまたはタンパク質は、タンパク質が由来する細胞または組織源の細胞材料も他の夾雑タンパク質も実質的に含まず、または科学的に合成された場合か、さもなければ化学反応の一部として混合物中に存在する化学的前駆体も他の化学物質も実質的に含まない。本発明において、タンパク質または多糖は、それらが免疫原性組成物の製造において有用な形態で提供されるように、細菌の細胞からまたは細菌の残骸から単離することができる。「単離された」または「単離している」という用語は、例えば、本明細書に記載されているように、莢膜多糖の精製方法を包含する精製すること、または精製を包含することがある。「細胞材料を実質的に含まない」という言語は、多糖／ポリペプチド／タンパク質が、単離されるか組換えにより製造される細胞の細胞構成成分から分離される多糖／ポリペプチド／タンパク質の調製物を包含する。したがって、細胞材料も他の化合物も実質的に含まないポリペプチド／タンパク質、多糖、またはコンジュゲートは、夾雑しているタンパク質、多糖、または他の化合物約３０％、２０％、１０％、５％、２．５％または１％（乾燥重量で）未満を有するポリペプチド／タンパク質、多糖、またはコンジュゲートの調製物を包含する。ポリペプチド／タンパク質が、組換えにより製造される場合、培養培地を実質的に含まないことも好ましく、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満に相当する。ポリペプチド／タンパク質または多糖が、化学合成により製造される場合、化学的前駆体も他の化学物質も実質的に含まないことが好ましく、すなわち、タンパク質または多糖の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離される。したがって、ポリペプチド／タンパク質または多糖のそのような調製物は、関心のあるポリペプチド／タンパク質または多糖断片以外の化学的前駆体または化合物約３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％（乾燥重量で）未満を有する。

【0155】

本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにより製造される免疫原性コンジュゲートは、水または低イオン強度中性ｐＨ緩衝液の中に保存するか乾燥粉末に凍結乾燥することができる。

【0156】

免疫応答を誘導し黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）感染を防御するための方法
本発明は、本明細書に記載されている免疫原性組成物についての使用方法も包含する。例えば、本発明の一実施形態は、免疫原性量の本明細書に記載されている免疫原性組成物のうちのいずれかを対象に投与することを含む黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。本発明の一実施形態は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による感染から対象を防御する方法、または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による感染を予防する方法、または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により引き起こされる感染に関係する少なくとも１つの症状の重症度を軽減するかその発症を遅らせる方法であって、免疫原性量の本明細書に記載されている免疫原性組成物のうちのいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。本発明の一実施形態は、対象においてブドウ球菌性の感染、ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）に関係する疾患または状態を治療または予防する方法であって、対象に治療的または予防的に有効な量の本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ブドウ球菌性の感染、疾患または状態を治療または予防する方法は、ヒトの、家畜の、動物の、または農業の処置を含む。別の実施形態は、対象においてブドウ球菌性の感染、ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）に関係する疾患または状態を治療または予防する方法であって、本明細書に記載されている免疫原性組成物からポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成させ、前記抗体調製物を使用し、対象に受動免疫を与えるステップを含む方法を提供する。本発明の一実施形態は、手術手順を受けている対象においてブドウ球菌性感染を予防する方法であって、手術手順の前に対象に予防的に有効な量の本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。

【0157】

抗原または免疫原性組成物に対する「免疫応答」は、関心のある抗原またはワクチン組成物中に存在する分子に対する体液性および／または細胞性免疫応答の対象における発生である。本発明のために、「体液性免疫応答」は、抗体仲介性免疫応答であり、本発明の免疫原性組成物中の抗原に対して一部の親和性を持って認識および結合する抗体の誘導および生成を伴うが、「細胞性免疫応答」は、Ｔ細胞および／または他の白血球により仲介されるものである。「細胞性免疫応答」は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のクラスＩまたはクラスＩＩ分子、ＣＤ１または他の非古典的ＭＨＣ様分子と関係する抗原エピトープの提示により誘発される。これは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞（「ＣＴＬ」）を活性化する。ＣＴＬは、古典的または非古典的ＭＨＣによりコードされるタンパク質と関係して提示され細胞の表面上で発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはそのような微生物が感染している細胞の溶解を誘導および促進する一助となる。細胞性免疫の別の態様には、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、機能を刺激し、それらの表面上の古典的または非古典的ＭＨＣ分子と関係するペプチドまたは他の抗原を示す細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性に焦点を置く。「細胞性免疫応答」は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞由来のものを包含する活性化されたＴ細胞および／または他の白血球により産生されるサイトカイン、ケモカインおよび他のそのような分子の産生も指す。特定の抗原または組成物が細胞性免疫学的応答を刺激する能力は、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイなどによる多くのアッセイにより、感作された対象において抗原に対して特異的なＴリンパ球についてアッセイすることにより、または抗原による再刺激に応答したＴ細胞によるサイトカイン産生の測定により決定することができる。そのようなアッセイは、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４１８９〜４１９９；およびＤｏｅら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２３６９〜２３７６を参照されたい。

【0158】

本明細書で使用されている、「治療」（その変形、例えば、「治療する」または「治療された」を包含する）とは、下記のうちのいずれか１つまたは複数を意味する：（ｉ）伝統的なワクチンにおけるように、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の重症度の軽減、または症状の除去、および（ｉｉｉ）問題の病原菌または障害の実質的または完全な除去。したがって、治療は、予防的に（感染前に）または治療的に（感染後に）行うことができる。本発明において、予防的治療は、好ましい様式である。本発明の特定の実施形態によれば、微生物感染（例えば、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）などの細菌）に対して宿主動物を予防的および／または治療的に免疫化することを包含する、治療する組成物および方法が提供される。本発明の方法は、対象に予防的および／または治療的免疫を与えるのに有用である。本発明の方法は、生物医学的研究応用のために対象に対して実施することもできる。

【0159】

本明細書で使用されている、「哺乳動物」とは、ヒトまたは非ヒト動物を意味する。より詳細には、哺乳動物は、ヒト、家庭および農業用動物を包含する哺乳動物、ならびに家庭のペットおよびウシ、ヒツジ、フェレット、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコなどを包含するがそれらに限定されない他の家畜化された動物などの動物園、スポーツおよびペットのコンパニオン動物として分類されるいずれの動物も指す。好ましいコンパニオン動物は、イヌおよびネコである。哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。

【0160】

「免疫原性量」、および「免疫学的に有効な量」は、それらが共に本明細書において互換的に使用され、当業者に知られている標準的アッセイにより測定されるように、細胞性（Ｔ細胞）応答かもしくは体液性（Ｂ細胞または抗体）応答、または両方の免疫応答を誘発するのに十分な抗原または免疫原性組成物の量を指す。

【0161】

組成物中の特定のコンジュゲートの量は、一般的に、そのコンジュゲートについてのコンジュゲートしているおよびコンジュゲートしていない総多糖に基づいて算出される。例えば、２０％遊離多糖のＣＰ５コンジュゲートは、１００ｍｃｇＣＰ５多糖投与量中にコンジュゲートしているＣＰ多糖約８０ｍｃｇおよびコンジュゲートしていないＣＰ５多糖約２０ｍｃｇを有するであろう。コンジュゲートに対するタンパク質寄与は、コンジュゲートの投与量を算出する場合に通常は考慮されない。コンジュゲートの量は、ブドウ球菌の血清型に応じて変わることがある。一般的に、各投与量は、多糖０．１〜１００ｍｃｇ、詳細には、０．１〜１０ｍｃｇ、より詳細には、１〜１０ｍｃｇを含むであろう。免疫原性組成物中の異なる多糖構成成分の「免疫原性量」は、異なることがあり、各々は、任意の特定多糖抗原１ｍｃｇ、２ｍｃｇ、３ｍｃｇ、４ｍｃｇ、５ｍｃｇ、６ｍｃｇ、７ｍｃｇ、８ｍｃｇ、９ｍｃｇ、１０ｍｃｇ、１５ｍｃｇ、２０ｍｃｇ、３０ｍｃｇ、４０ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、６０ｍｃｇ、７０ｍｃｇ、８０ｍｃｇ、９０ｍｃｇ、または約１００ｍｃｇを含み得る。

【0162】

黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）「侵襲性疾患」は、疾患の関係する臨床的な徴候／症状のある通常は無菌の部位からの細菌の単離である。通常は無菌の身体部位は、血液、ＣＳＦ、胸膜液、心嚢液、腹水、関節／滑膜液、骨、体内部位（リンパ節、脳、心臓、肝臓、脾臓、硝子体液、腎臓、膵臓、卵巣）または他の通常は無菌の部位を包含する。侵襲性疾患を特徴付ける臨床状態は、菌血症、肺炎、蜂窩織炎、骨髄炎、心内膜炎、敗血症性ショックおよびそれ以上のものを包含する。

【0163】

免疫原としての抗原の有効性は、増殖アッセイにより、Ｔ細胞がその具体的標的細胞を溶解する能力を測定するためのクロム遊離アッセイなどの細胞溶解アッセイにより、または血清中の抗原に対して特異的な循環する抗体のレベルを測定することによりＢ細胞活性のレベルを測定することにより測定することができる。免疫応答は、抗原の投与に続いて誘導される抗原特異的抗体の血清レベルを測定することにより、より具体的には、本明細書に記載されているように、そのように誘導された抗体が特定の白血球のオプソニン化貪食性能力を高める能力を測定することにより検出することもできる。免疫応答の防御のレベルは、投与された抗原で免疫化された宿主にチャレンジすることにより測定することができる。例えば、免疫応答が望まれる抗原が細菌である場合、免疫原性量の抗原により誘導される防御のレベルは、細菌細胞による動物のチャレンジ後の生存率または死亡率を検出することにより測定される。一実施形態において、防御の量は、細菌感染に関係する少なくとも１つの症状、例えば、感染に関係する発熱を測定することにより測定することができる。多重抗原もしくは多重成分ワクチンまたは免疫原性組成物中の抗原の各々の量は、他の構成成分の各々に対して変わるはずであり、当業者に知られている方法により決定することができる。そのような方法は、免疫原性および／またはインビボ有効性を測定するための手順を包含するであろう。

【0164】

ある種の実施形態において、「約」という用語は、２０％以内、好ましくは、１０％以内、より好ましくは、５％以内を意味する。

【0165】

本発明は、本発明の血清型５もしくは８莢膜多糖または免疫原性コンジュゲートと特異的および選択的に結合する抗体および抗体組成物をさらに提供する。一部の実施形態において、抗体は、本発明の血清型５または８莢膜多糖または免疫原性コンジュゲートの対象への投与で生成される。一部の実施形態において、本発明は、本発明の血清型５または８莢膜多糖または免疫原性コンジュゲートのうちの１つまたは複数を対象とする精製または単離された抗体を提供する。一部の実施形態において、本発明の抗体は、動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食性致死アッセイのいずれかにおいて細菌を致死させることにより測定されて機能的である。一部の実施形態において、本発明の抗体は、対象に受動免疫を与える。本発明は、当業者によく知られている技法を使用し、本発明の抗体もしくは抗体断片をコードするポリヌクレオチド分子、および細胞、細胞系（ハイブリドーマ細胞または抗体の組換え産生のための他の人工的に作り出された細胞系）または本発明の抗体もしくは抗体組成物を産生するトランスジェニック動物をさらに提供する。

【0166】

本発明の抗体または抗体組成物は、対象においてブドウ球菌性の感染、ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）に関係する疾患または状態を治療または予防する方法であって、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成させ、前記抗体または抗体調製物を使用して対象に受動免疫を与えるステップを含む方法において使用することができる。本発明の抗体は、診断方法、例えば、ＣＰ５、ＣＰ８、またはそれらのコンジュゲートの存在を検出するか、ＣＰ５、ＣＰ８、またはそれらのコンジュゲートのレベルを定量化するためにも有用であることがある。

【0167】

当技術分野において知られているいくつかの動物モデルを使用し、本明細書に記載されている免疫原性組成物のうちのいずれか１つの有効性を評価することができる。例えば：

【0168】

受動的マウス敗血症モデル：マウスを、免疫ＩｇＧまたはモノクローナル抗体により腹腔内で（ｉ．ｐ．）受動的に免疫化する。マウスに、致死投与量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を２４時間後にチャレンジする。細菌チャレンジは、静脈内（ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．）に投与し、生存が、抗体の細菌との特異的インビボ相互作用に起因することを保証する。細菌のチャレンジ投与量は、免疫化されていない対照マウスのおおよそ２０％の致死性敗血症を達成するのに必要とされる投与量であるように決定される。生存研究の統計的評価は、カプラン−マイヤー解析により行うことができる。

【0169】

能動免疫化およびチャレンジモデル：このモデルでは、マウスを、０、３および６週目に（または、当業者に知られている類似スケジュール）標的抗原により皮下で（ｓ．ｃ．）で能動的に免疫化し、静脈内または腹腔内経路により８週目に（または、当業者に知られている他の類似スケジュール）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をチャレンジする。細菌のチャレンジ投与量は、１４日間にわたって対照群におけるおおよそ２０％の生存を達成するように較正される。生存研究の統計的評価は、カプラン−マイヤー解析により行うことができる。

【0170】

受動的感染性心内膜炎モデル：黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により引き起こされる感染性心内膜炎（ＩＥ）のための受動免疫化モデルは、ＣｌｆＡが防御免疫を誘導することができることを示すためにこれまで使用されてきた。Ｖｅｒｎａｃｈｉｏら（２００６）Ａｎｔｍｉｃｒｏ．Ａｇｅｎｔｓ ＆ Ｃｈｅｍｏ．５０：５１１〜５１８を参照されたい。ＩＥのこのモデルでは、ウサギまたはラットを使用し、中心静脈カテーテル、菌血症、および遠位器官への血行性播種を包含する臨床感染をシミュレートする。無菌の大動脈弁疣腫のあるカテーテル処置されたウサギまたはラットに、標的抗原に対して特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体の単回静脈内注射を投与する。２４時間後、動物に、異種のブドウ球菌株またはＭＲＳＡ株をｉ．ｖ．チャレンジする。チャレンジの４８時間後、心臓疣腫、腎臓および血液を収集して培養する。次いで、心臓弁疣腫、腎臓、および血液におけるブドウ球菌感染の頻度を測定する。一研究において、動物にＭＲＳＥ ＡＴＣＣ３５９８４かまたはＭＲＳＡ ＰＦＥＳＡ０００３をチャレンジした場合、感染ラットの有意な減少は、ポリクローナル抗体調製物かまたはＣ１ｆＡに対するモノクローナル抗体を使用して示された。Ｖｅｎａｃｈｉｏら、前掲書を参照されたい。

【0171】

受動的感染性心内膜炎モデル：感染性心内膜炎モデルは、能動免疫化研究にも適合された。ウサギまたはラットを、標的抗原により筋肉内（ｉ．ｍ．）で免疫化し、ｉ．ｖ．経路を介して２週後に黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をチャレンジする。

【0172】

腎盂腎炎モデル：腎盂腎炎モデルでは、マウスを、標的抗原により０、３および６週目に（または、当業者に知られている同様のスケジュール）免疫化する。８週目に、動物に、例えば、１．７×１０^８ｃｆｕ黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６をｉ．ｐ．注射によりチャレンジする。４８時間後、腎臓および／または他の組織を収集して培養する。最後に、チャレンジ細菌のコロニー形成単位を、腎臓および／または他の組織において数え上げる。このモデルは、動物における全身性播種を評価する。

【0173】

オプソニン化貪食性致死アッセイを使用した機能的抗体のモニタリング
細胞系（例えば、ＨＬ６０）の分化したエフェクター細胞または製造者のプロトコル通りにＬＹＭＰＨＯＬＹＴＥ（登録商標）−ポリ溶液（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用してドナーヒト血液から単離された多形核細胞（ＰＭＮ）をこのアッセイのために使用することができる。エフェクター細胞を、おおよそ２×１０^７細胞／ｍｌの濃度にてアッセイ緩衝液（１％ウシ血清アルブミンを含有する変法イーグル培地）に再懸濁し、使用する準備ができるまで３７℃のインキュベーターに入れる。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６株を、トリプチックソイ寒天プレート上で一夜にわたって生育させた。細菌細胞をすくい取り、２回洗浄し、おおよそ５×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの濃度と等しいＯＤ_６００＝１まで５％グリセロールを含有するアッセイ緩衝液に再懸濁した。細菌懸濁液の１ｍｌアリコートを凍結させ、使用する準備ができるまで−４０℃にて保存した。凍結した細菌懸濁液を解凍し、アッセイ緩衝液中で１０^６ｃｆｕ／ｍｌの濃度に調整し、氷上に置いた。アッセイは、無菌の９６ディープウェル１ｍｌポリプロピレンプレートを使用して行った。抗体試料の２倍段階希釈液（５０μｌ）を調製し、続いて、抗体ミックスにアッセイ緩衝液３００μｌを添加した。細菌をプレートに添加し（５０μｌ）、３０分にわたって４℃にて回転振盪機上に置いた。オプソニン化ステップに続いて、ヒト補体５０μｌを添加した（１％最終濃度）。最後に、エフェクター細胞５０μｌ（１０^７細胞／ｍｌの濃度）をプレートに添加し、懸濁液を、ピペッティングを繰り返すことにより十分に混合した。懸濁液の５０μｌアリコートを、無菌の１％サポニン溶液中で１０倍段階希釈し、細菌の凝集を最小限に抑えるためにボルテックスにかけ、二つ組でトリプチックソイ寒天上にプレートした。アッセイプレートを、ロティセリー（ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）スタイルの振盪機を使用して連続して混合しながら１時間にわたって３７℃にてインキュベートした。インキュベーションが終わったら、懸濁液の５０μｌアリコートを、無菌の１％サポニン溶液中で１０倍段階希釈し、細菌の凝集を最小限に抑えるためにボルテックスすることにより混合し、二つ組でトリプチックソイ寒天上にプレートした。致死率は、抗体を欠くが細菌、補体およびエフェクター細胞を含有する管の中で生存しているｃｆｕ数に対する、細菌、抗体、補体およびエフェクター細胞を含むウェル中で６０分に生存しているｃｆｕ数の比を決定することにより算出した。細菌、補体、および血清を含有する対照を、凝集に起因するｃｆｕの低下について調整するために包含させた。

【0174】

補体吸着
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６株、ＰＦＥＳＡ０２８６およびＰＦＥＳＡ０２７０に対して吸着されたヒトドナーの血清は、アッセイにおける補体源として使用することができる。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株を、３７℃にてＴＳＡプレート上で生育させた。細胞を、プレートからすくい取り、無菌のＰＢＳに再懸濁した。細菌細胞を、４℃にて１０分にわたって１０，０００ｒｐｍにて遠心分離し、細胞ペレットを、吸着のためにヒト血清に再懸濁した。血清を、３０分にわたって４℃にてヌテイター（ｎｕｔａｔｏｒ）上で細菌と共にインキュベートした。細胞を遠心分離し、血清を、細菌を含有する別の管に移し、吸着ステップを、３０分にわたって再び繰り返した。最後に、細胞を遠心分離し、血清を、０．２ミクロンのフィルターに通した後、０．５ｍｌアリコートを、液体窒素中で凍結させた。

【0175】

方法ＩＩ−ＨＬ−６０細胞を使用するＯＰＡ
ＨＬ−６０細胞を、Ｓ．Ｒｏｍｅｒｏ−Ｓｔｅｉｎｅｒ、ら、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４（４）（１９９７）、ｐｐ．４１５〜４２２に従って分化させた。収集されたＨＬ−６０細胞を、おおよそ１０^８細胞／ｍｌにてアッセイ緩衝液（１％ウシ血清アルブミンを含有する変法イーグル培地）に再懸濁し、使用する準備ができるまで３７℃のインキュベーターに入れた。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を、トリプチックソイ寒天プレート上で一夜にわたって生育させた。細菌細胞をすくい取り、２回洗浄し、おおよそ５×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの濃度と等しいＯＤ_６００＝１まで５％グリセロールを含有するアッセイ緩衝液に再懸濁した。細菌懸濁液の１ｍｌアリコートを凍結させ、使用する準備ができるまで−４０℃にて保存した。凍結した細菌懸濁液を解凍し、アッセイ緩衝液中で１０^６ｃｆｕ／ｍｌの濃度に調整し、氷上に置いた。アッセイは、無菌の９６ディープウェル１ｍｌポリプロピレンプレートを使用して行った。モノクローナル抗体試料の２倍段階希釈液（２５μｌ）を調製し、続いて、抗体懸濁液にアッセイ緩衝液１５０μｌを添加した。細菌をプレートに添加し（２５μｌ）、３０分にわたって４℃にて回転振盪機上に置き、続いて、ヒト補体２５μｌを添加した（１％最終濃度）。最後に、ＨＬ−６０細胞２５μｌ（１０^７細胞／ｍｌ）をプレートに添加し、懸濁液を、ピペッティングを繰り返すことにより十分に混合した。懸濁液の２５μｌアリコートを、無菌の１％サポニン溶液中で１０倍段階希釈し、細菌の凝集を最小限に抑えるためにボルテックスすることにより混合し、二つ組でトリプチックソイ寒天上にプレートした。アッセイプレートを、ロティセリースタイルの振盪機を使用して連続して混合しながら１時間にわたって３７℃にてインキュベートした。インキュベーションが終わったら、懸濁液の２５μｌアリコートを、無菌の１％サポニン溶液中で１０倍段階希釈し、ボルテックスすることにより混合し、二つ組でトリプチックソイ寒天上にプレートした。致死率は、抗体を欠くが細菌、補体およびＨＬ−６０細胞を含有する管の中で生存しているｃｆｕ数に対する、細菌、抗体、補体およびＨＬ−６０細胞を含むウェル中で６０分に生存しているｃｆｕ数の比を決定することにより算出した。細菌、補体、およびｍＡｂを含有する対照を、凝集に起因するｃｆｕの低下について調整するために包含させた。

【0176】

下記の実施例は、限定のためではなく例示のために提供される。

【実施例】

【0177】

（実施例１）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖の調製。
この実施例には、様々なサイズ範囲の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖の製造が記載されている。構造黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖反復単位は、図１に示されている。本明細書に記載されている方法は、分子量が約２０ｋＤａから７００ｋＤａまでの範囲である血清型８莢膜多糖を製造するのに有効である。条件の適切な選択により、高分子量血清型８莢膜多糖を、分子量で５０ｋＤａから７００ｋＤａまでの範囲で単離および精製することができる。免疫原性組成物において使用するため、血清型８莢膜多糖を、分子量で７０ｋＤａから３００ｋＤａまでの範囲および多くの望ましい範囲で単離および精製することができる。生育特性および産生される莢膜の量に基づき、ＰＦＥＳＡ０００５株またはＰＦＥＳＡ０２８６株を、血清型８莢膜多糖を製造するために使用した。ＰＦＥＳＡ０００５株またはＰＦＥＳＡ０２８６株から単離された莢膜は、同一であることが分かった。

【0178】

血清型８莢膜多糖を製造するため、菌株を、主として炭素源（ラクトースかまたはスクロース）、窒素源としての加水分解された大豆粉、および微量金属からなる複合培地中で生育させた。菌株を、２〜５日にわたってバイオリアクター中で生育させた。

【0179】

高圧蒸気殺菌法の前に、試料を取り出し、培養液中のブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）のレベルをテストした。０．０５％ポリソルベート８０の存在下で、発酵におけるＳＥＢの濃度は、１５〜２０ｎｇ／ｍｌであった。以前の実験は、１時間にわたって培養液を高圧蒸気殺菌することが、ＴＥＣＲＡキットについての検出限界未満である０．１ｎｇ／ｍｌまでＳＥＢのレベルを下げることを示した。

【0180】

透析濾過され、エタノール分画された多糖を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＡＥＣカラム上にロードし、上に記載されているＮａＣｌの直線グラジエントで溶離させた。画分を、血清型５多糖の存在についてはＯ−アセチルアッセイおよび二重免疫拡散テストならびにテイコ酸（ＴＡ）の存在についてはホスフェートアッセイにより分析した。血清型８多糖の存在は、画分３５〜９５において検出された（図２Ａ〜Ｂ）。

【0181】

テイコ酸による夾雑を軽減するため、画分３５〜７５をプールし、残留テイコ酸をメタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、ｄｉＨ_２Ｏに対する３Ｋ透析濾過によるその除去を可能にした。

【0182】

コンジュゲートの調製のために使用される血清型８莢膜多糖の精製は、細胞からの莢膜の遊離に影響を及ぼす高温および低ｐＨに依存し多糖の分子量を下げる２つの異なる方法により行った。得られた分子量は、加水分解ステップの時間、温度およびｐＨに依存していた。

【0183】

血清型８莢膜多糖の特徴付けは、表１に明記されている技法を使用して行った。

【0184】

【表1】

【0185】

下に記載されている方法により製造される莢膜多糖は、タンパク質、核酸、ペプチドグリカンおよびテイコ酸夾雑物が低レベルの純粋な十分に特徴付けられた多糖をもたらす。

【0186】

第一の方法では、細胞からの莢膜多糖の遊離および分子量の低減に続いて、調製物を、酵素（例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リゾチームおよびプロテアーゼ）のカクテルで処理し、不純物を消化した。インキュベーション後、残留不純物を、エタノールの添加（最終濃度約２５％）により沈殿させた。残留エタノールの除去後、莢膜多糖を含有する溶液を、陰イオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）上にロードし、直線塩グラジエントで溶離した。莢膜多糖を含有する画分をプールし、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理した。この処理は、残留テイコ酸夾雑物の酸化的加水分解をもたらしたが、血清型８莢膜多糖には影響を及ぼさなかった。反応物を、エチレングリコールの添加によりクエンチした。材料を濃縮し、ｄＨ_２Ｏに対して透析濾過し、残留試薬および副成物を除去した。

【0187】

第二の方法を使用し、様々な細胞由来の不純物を消化するために酵素を使用することなく莢膜多糖を製造した。この方法では、細胞からの莢膜多糖の遊離および分子量の低減に続いて、加水分解された発酵ブロスを、精密濾過と、続く、限外濾過および透析濾過により清澄化した。溶液を、活性炭で処理し、不純物を除去した。炭素処理後、材料を、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理して残留テイコ酸を酸化し、続いて、プロピレングリコールでクエンチした。材料を濃縮し、ｄＨ_２Ｏに対して透析濾過し、残留試薬および副成物を除去した。

【0188】

いずれかの方法を使用して製造された調製物は、タンパク質、核酸およびテイコ酸夾雑物が低レベルである純粋な莢膜多糖をもたらした。記載されている方法を使用し、加水分解の条件を変えることにより具体的範囲の望ましい高分子量多糖を製造することができる。本明細書に記載されている方法により得ることができる莢膜多糖の例は、下の表２に示されている。精製された血清型８莢膜多糖のバッチは、テイコ酸（ＴＡ）、ペプチドグリカンが無いことおよび低い残留タンパク質により示されるように高い純度を有していた。表２を参照されたい。より低い分子量の範囲は、２０．４ｋＤａ〜６５．１ｋＤａに及び、精製された多糖は、高度にＯ−アセチル化されていた（約１００％）。核酸夾雑のレベルは、低かった（０．１２〜２．４５％）。

【0189】

【表2】

【0190】

莢膜多糖の分子量選択：速度論的解析は、広範囲の分子量の莢膜多糖を本明細書に記載されている方法により生成することができることを示した。初めに、より大きな多糖が細菌細胞により産生され、続いて、望ましい分子量範囲が選択され、次いで、熱および加水分解ステップのｐＨおよび熱条件の操作により精製された。

【0191】

黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）発酵ブロスの熱処理は、発酵と莢膜多糖回収の間のプロセスステップである。このプロセスステップは、熱を使用して特定の期間にわたってｐＨ調整されたブロスを処理する。低いｐＨにおける熱処理の目的は、細胞を死滅させ、エンテロトキシンを不活性化し、細胞に結合している多糖を遊離し、望ましいサイズに分子量を下げることであった。これらの目的の中で、分子量の低減は、このステップにおいて必要とされる処理時間という点で最も遅かった。したがって、他の目的は、考慮された処理時間内で必然的に達成された。

【0192】

熱処理：様々な分子量範囲の莢膜多糖を選択するためのｐＨおよび温度条件を決定した。１５ＬのＢｉｏｌａｆｉｔｔｅ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒをこれらの研究のために使用した。発酵ブロスを、蠕動ポンプにより発酵槽に移した。約２００ｒｐｍの撹拌速度を使用し、ブロスｐＨを濃硫酸で調整した。次いで、ブロス温度を、設定レベルまで上げた。熱処理時間は、温度が設定ポイントに達すると直ぐに開始した。望ましい処理時間に達したら、ブロスを、室温まで冷却した。インプロセス試料を採取し、それぞれＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＭＡＬＬＳシステムにより多糖濃度および分子量を決定した。分子量（ＭＷ）データを、速度論的解析で使用した。ＭＷプロファイルを、ｐＨ３．５、４．０および５．０にて経時的に決定した。図３Ａを参照されたい。

【0193】

多糖の穏和な酸加水分解の速度論を、プロセスから得られた精製された血清型８莢膜多糖を使用して行った。精製された多糖溶液を、硫酸で実験にとって望ましいｐＨに調整した。溶液約１．５ｍＬを、１５ｍＬの遠心分離管の各々に移した。管を、精密な温度制御システムを備えた油浴に入れた。管を、所定の時間間隔で取り出し、アイスバケット中でクエンチした。実験が終わったら、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）のアリコートを試料に加え、ｐＨをもとの約７に調整した。試料を、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳシステムにより分析した。ＭＷデータを、速度論的解析で使用した。ｐＨ３．５におけるＣＰ８のＭＷプロファイルに対する温度の効果を、経時的に決定した。図３Ｂを参照されたい。

【0194】

結果
図３Ａに示されているように、より低いｐＨは、多糖の分子量を下げるのにより有効であった。３００ｋＤａから６００ｋＤａの間の分子量は、１５分から１２０分の間にわたって９５℃にて５のｐＨを使用して生成させることができる。同様に、２５０ｋＤａから４５０ｋＤａの間の分子量は、１５分から１２０分の間にわたって９５℃にて４のｐＨを使用して生成させることができる。さらに、１２０ｋＤａから４５０ｋＤａの間の分子量は、１５分から１２０分の間にわたって９５℃にて３．５のｐＨを使用して生成させることができる。

【0195】

図３Ｂに示されているように、温度が高いほど、加水分解速度は速くなり、時間と共に製造される多糖の分子量の範囲は広がる。より低い温度の使用は、同じｐＨにて５５℃対９５℃で、より狭い範囲の多糖分子量を生じる。

【0196】

さらに、図４は、穏和な酸（９５℃にてｐＨ３．５）加水分解についての精製されたＣＰ８の分子量と処理時間との相関を示している。精製された多糖は、これまでに詳述された回収プロセスから得られる最終製品である。図４にも示されているように、ｐＨ３．５における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０００５株の熱処理時間の増加は、より小分子量のＣＰ８をもたらし、一方、ｐＨ３．５におけるより短い処理時間は、より高分子量のＣＰ８をもたらした。血清型８莢膜多糖のサイズは、ｐＨ３．５における熱処理の時間の長さに応じて約８０ｋＤａから約２２０ｋＤａまで範囲であった。低いｐＨにおける熱処理の時間と精製されたＣＰ８のサイズの間の相関は、図４に示されているように、特定の範囲の分子量を持つ精製された多糖を製造するのに必要とされる処理時間の推定を可能にした。

【0197】

上に示されているように、２０ｋＤａから５００ｋＤａ超までの全範囲の分子量の血清型８莢膜多糖を製造、遊離および精製することができることに留意することは重要である。したがって、方法を使用し、表３に示されているように具体的範囲の望ましい高分子量莢膜多糖を製造することができる。ピーク分子量が８７ｋＤａから１０８ｋＤａまでの範囲である比較的狭い範囲の分子量の製造された多糖は、本明細書に記載されている方法により得ることができる十分に特徴付けられた範囲の分子量に相当する。７０ｋＤａから３００ｋＤａまで、または７０ｋＤａから１５０ｋＤａまでの範囲である特に有利な範囲の高分子量多糖は、莢膜多糖を担体分子またはタンパク質とコンジュゲートさせることにより免疫原性組成物を作製するのに有用である（表３を参照）。約８０から１２０ｋＤａまでの分子量範囲を有するＣＰ８莢膜多糖を生成するのに使用される条件は、下記の通りである：３００分にわたって９５℃、ｐＨ３．５。

【0198】

【表3】

【0199】

（実施例２）血清型８莢膜多糖のＣＲＭ_１９７とのコンジュゲーション。
この実施例は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの製造において使用されるプロセスおよび特徴付けアッセイについて記載している。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖をこの担体タンパク質とコンジュゲートさせるための異なるコンジュゲーション化学反応を開発した。例えば、ＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド）を使用するコンジュゲーションは、ＣＰと担体タンパク質の間に共有チオエーテル結合をもたらす。代替方法として、ＣＤＩ／ＣＤＴ（１，１−カルボニルジイミダゾール／１，１−カルボイル−ジ−１，２，４−トリアゾール）を使用するコンジュゲーションは、ＣＰと担体タンパク質の間に１炭素または０炭素リンカーをもたらす。

【0200】

ＰＤＰＨコンジュゲーション化学反応による血清型８莢膜多糖のＣＲＭ_１９７とのコンジュゲーション。
ＰＤＰＨコンジュゲーション化学反応は、多糖の活性化、チオール保護基の除去、活性化された多糖中間体の精製、ＣＲＭ_１９７タンパク質の活性化および精製、ならびに活性化された構成成分のコンジュゲーションと、続く、精製を伴う多段階プロセスである。多糖へのリンカーを含有するチオール基およびＣＲＭ_１９７タンパク質担体へのハロアセチル基の導入後、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖を、チオエーテル結合を通じてタンパク質担体と結合させた。ブロモアセチル基は、アミノ基のブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によりＣＲＭ_１９７タンパク質中に導入した。チオール化された多糖を生成するため、多糖中のＮ−アセチルマンノサミノウロン酸のカルボジイミドで活性化されたカルボキシレート基を、スルフヒドリル反応性ヒドラジドヘテロ二官能性リンカー３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）のヒドラジド基とカップリングさせた。ＰＤＰＨチオール化多糖のチオールを、ＤＴＴによる還元により生成させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上のＳＥＣにより精製し、活性化されたタンパク質のブロモアセチル基と反応させると、多糖と担体タンパク質の間の臭素置換により形成される共有チオエーテル結合が得られた。未反応のブロモアセチル基は、システアミン塩酸塩（２−アミノエタンチオール塩酸塩）で「キャップ」した。次いで、反応混合物を濃縮し、透析濾過した。残ったコンジュゲートしていないブロモアセチル基をシステアミン塩酸塩でキャップし、反応性ブロモアセチル基がコンジュゲーション後に残っていないことを保証した。これは、臭素の置換後にシステアミンのチオール末端とリシン残基上のアセチル基との間で共有結合を形成した。

【0201】

１．ＰＤＰＨによる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖のチオール化：多糖を、まず、ＰＤＰＨによるチオール化により活性化した。多糖を、血清型８莢膜多糖については１：０．６：１．２５の多糖：ＰＤＰＨ：ＥＤＡＣ重量比を維持しながら、新たに調製したＰＤＰＨストック溶液（ＤＭＳＯ中２５０ｍｇ／ｍＬ）、ＥＤＡＣストック溶液（ｄｉＨ_２Ｏ中９０ｍｇ／ｍＬ）、およびＭＥＳ緩衝液ストック溶液（０．５Ｍ、ｐＨ４．８５）と混合し、最終溶液０．１Ｍ ＭＥＳ、ならびに２および４ｍｇ多糖／ｍＬを作製した。この混合物を、室温にて１時間にわたってインキュベートし、次いで、４℃と８℃の間にて３５００ ＭＷＣＯ透析装置を使用して４回、１０００×体積の蒸留Ｈ_２Ｏに対して透析し、未反応のＰＤＰＨを除去した。ＰＤＰＨ結合型多糖は、０．２Ｍ ＤＴＴを使用して作製し、４℃と８℃の間にて３時間または一夜にわたって室温にてインキュベートした。過剰のＤＴＴならびに反応の副成物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂および移動相としての蒸留水を使用するＳＥＣにより活性化された糖から分離した。画分を、チオール基についてＤＴＤＰアッセイにより分析し、カラムの空隙体積近くで溶離されるチオール陽性画分をプールした。画分のプールを、ＰＡＨＢＡＨおよびＯ−アセチルアッセイにより分析し、チオール基を含有する反復単位のモルパーセント（チオールのモル濃度／反復単位のモル濃度）として表される活性化度を決定した。活性化された多糖を凍結乾燥し、コンジュゲーションに必要とされるまで−２５℃にて保存した。

【0202】

ＰＤＰＨによる血清型８多糖チオール化の再現性の結果は、表４に示されている。血清型８多糖の活性化度は、１０個の莢膜多糖反復単位当たり接続しているおおよそ１個のリンカー分子〜５個の反復単位当たり１個のリンカー分子に相当する１２％〜１６％の範囲であった。

【0203】

【表4】

【0204】

２．担体タンパク質活性化：別に、担体タンパク質を、ブロモアセチル化により活性化した。ＣＲＭ_１９７を、１０ｍＭのリン酸緩衝された０．９％ＮａＣｌ ｐＨ７（ＰＢＳ）で５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、次いで、１Ｍストック溶液を使用して０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３ ｐＨ７．０を作製した。ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）を、２０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯのＢＡＡＮＳストック溶液を使用してＣＲＭ_１９７：ＢＡＡＮＳ比１：０．２５（ｗ：ｗ）にて添加した。反応混合物を、１時間にわたって４と８℃の間にてインキュベートし、次いで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５上のＳＥＣを使用して精製した。精製された活性化されたＣＲＭ_１９７を、ローリーアッセイにより分析してタンパク質濃度を決定し、次いで、５ｍｇ／ｍＬまでＰＢＳで希釈した。スクロースを、凍結防止剤として５％ｗｔ／ｖｏｌまで添加し、活性化されたタンパク質を凍結し、コンジュゲーションに必要とされるまで−２５℃にて保存した。

【0205】

ＣＲＭ_１９７のリシン残基のブロモアセチル化は、極めて一貫性があり、利用可能な３９個のリシンから１９〜２５個のリシンの活性化をもたらした（表５を参照）。反応は、高収率の活性化されたタンパク質を生じた。

【0206】

【表5】

【0207】

３．カップリング反応：活性化された莢膜多糖および活性化された担体タンパク質を調製したら直ぐに、２つを、コンジュゲーション反応で混ぜ合わせた。凍結乾燥およびチオール化された多糖を、０．１６ＭボレートｐＨ８．９５に溶かし、解凍したブロモアセチル化されたＣＲＭ_１９７および蒸留水と混合して最終溶液０．１Ｍボレート、ＣＲＭ_１９７：多糖の１：１ｗｔ／ｗｔ比、および１ｍｇ／ｍＬ多糖を作製した。この混合物を、１６から２４時間の間にわたって室温にてインキュベートした。タンパク質上の未反応のブロモアセチル基を、０．１ＭボレートｐＨ８．９５に溶かしたシステアミンの１３５ｍｇ／ｍＬストック溶液を使用して１：２（ｗｔ／ｗｔ）のＣＲＭ_１９７：システアミンの比にてシステアミン塩酸塩を添加することによりキャップし、室温にて4時間インキュベートした。莢膜多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート（コンジュゲート）を、１００Ｋポリエーテルスルホンウルトラフィルターを使用して０．９％ＮａＣｌに対して５０倍に透析濾過することにより精製した。

【0208】

ＰＤＰＨによる血清型８莢膜多糖チオール化研究の再現性の結果は、多糖の活性化度が、１０個の多糖反復単位当たり接続しているおおよそ１個のリンカー分子〜５個の反復単位当たり１個のリンカー分子に相当する１２％〜１６％の範囲であることを示した。

【0209】

ＣＤＩ／ＣＤＴコンジュゲーション化学反応による血清型８莢膜多糖のＣＲＭ_１９７とのコンジュゲーション。
ＣＤＩおよびＣＤＴは、多糖を、無水環境（ＤＭＳＯ）中で活性化し、利用可能なヒドロキシルとイミダゾールまたはトリアゾールカルバメート部分およびカルボン酸とアシルイミダゾールまたはアシルトリアゾール部分を形成する１段階コンジュゲーションプロセスを提供する。タンパク質担体の添加（ＤＭＳＯ中）は、リシンによるイミダゾールまたはトリアゾールの求核置換ならびにカルバメート結合（活性化されたヒドロキシルの場合）およびアミド結合（活性化されたカルボン酸の場合）の形成をもたらす。

【0210】

ＣＤＩとＣＤＴコンジュゲーション化学反応は共に、サイズ排除クロマトグラフィーの画分における糖とタンパク質の存在、およびグリコアルデヒドでキャップされたまたはシステアミン塩酸塩でキャップされたコンジュゲートのアミノ酸分析により示される担体タンパク質と共有結合している血清型８莢膜多糖を生じた。

【0211】

多糖サイズが２０ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲である莢膜血清型８についてのＰＤＰＨとＣＤＩ／ＣＤＴの両方の化学反応により調製されるコンジュゲートのいくつかのロットの調製の結果の要約は、下の表６に示されている。これらの２つのコンジュゲーション方法により生成されるコンジュゲートの遊離莢膜多糖、多糖タンパク質の比および収率に有意差はなかった。コンジュゲートしている血清型８莢膜多糖の抗原性は、コンジュゲートと天然多糖の間の同一性沈降素ラインにより示されるように、コンジュゲーションにより変わることはなかった。

【0212】

【表6】

【0213】

上に示されているように、本明細書に記載されている方法を使用し、具体的範囲の望ましい高分子量莢膜多糖を製造することができる。我々は、免疫原性組成物における使用のために濾過および精製することができる予め選択された範囲の高分子量血清型８莢膜多糖からコンジュゲートを調製することを目指した。表７は、血清型８莢膜多糖が約８０ｋＤａから１２０ｋＤａまでの分子量の範囲であり、イミダゾールコンジュゲーション化学反応を利用した血清型８莢膜多糖コンジュゲートの分析を要約している。得られたコンジュゲートの分子量は、５９５ｋＤａから１７０８ｋＤａまでの範囲であった。ＣＲＭ_１９７当たりのコンジュゲートしているリシン数は、最高で９個から最低で３個までの範囲であった。遊離莢膜多糖は、最高で６％から最低で２％までの範囲であった。

【0214】

【表7】

【0215】

両方のコンジュゲーション化学反応は、担体タンパク質と共有結合している血清型８莢膜多糖を生じる。これらの２つの方法により生成されるコンジュゲートの遊離莢膜多糖、血清型８莢膜多糖：タンパク質の比および収率に有意差はなかった。

【0216】

（実施例３）ワンポット対複合ＣＤＩ／ＣＤＴプロセス。
上に記載されているように、本発明の免疫原性コンジュゲートを作製するための方法には、ＣＤＩ（１，１−カルボニルジイミダゾール）、ＣＤＴ（１，１−カルボイル−ジ−１，２，４−トリアゾール）またはＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド）を伴うコンジュゲーション化学反応を使用する莢膜多糖の担体タンパク質との共有結合コンジュゲーションを伴う。ＣＤＩ／ＣＤＴの使用は、莢膜多糖と担体タンパク質の間の１炭素または０炭素リンカーをもたらすが、ＰＤＰＨの使用は、莢膜多糖と担体タンパク質の間の共有チオエーテル結合をもたらす。

【0217】

ＰＤＰＨベースの方法は、多糖の活性化、多糖上のチオール保護基の除去、活性化された多糖中間体の精製、タンパク質単体の活性化および精製、ならびに活性化された構成成分のコンジュゲーションと、続く、精製を伴う多段階プロセスであった。この方法では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖を、０．１Ｍ ＭＥＳなどの水溶液中でＰＤＰＨおよびカルボジイミドと反応させて、ＰＤＰＨ結合型多糖を生じさせた。ＰＤＰＨ結合型多糖を還元剤と反応させて、活性化された多糖を生じさせ、次いで、精製した。担体タンパク質を、水溶液中でブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させて、活性化された担体タンパク質を生じさせ、次いで、精製した。次いで、精製された活性化された血清型８多糖を、精製された活性化された担体タンパク質と反応させて、血清型８多糖：担体タンパク質コンジュゲートを生じさせた。

【0218】

対照的に、ＣＤＩベースおよびＣＤＴベースの方法は、莢膜多糖を、無水環境（すなわち、ＤＭＳＯ）中で活性化し、利用可能なヒドロキシルとイミダゾールまたはトリアゾールカルバメート部分およびカルボン酸とアシルイミダゾールまたはアシルトリアゾール部分を形成する１または２段階コンジュゲーションプロセスであった。タンパク質担体の添加（ＤＭＳＯ中）は、リシンによるイミダゾールまたはトリアゾールの求核置換ならびにカルバメート結合（活性化されたヒドロキシルの場合）およびアミド結合（活性化されたカルボン酸の場合）の形成をもたらす。したがって、２つのＣＤＩベースのおよびＣＤＴベースの方法：より複雑なプロセスおよびより簡単なワンポットプロセスを開発した。より複雑なプロセスでは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖を、イミダゾールまたはトリアゾールと混ぜ合わせ、凍結乾燥し、次いで、有機溶媒（ＤＭＳＯなど）中でＣＤＩまたはＣＤＴと反応させて、活性化された血清型８多糖を生じさせた。活性化された血清型８多糖を精製し、次いで、有機溶媒中で担体タンパク質と反応させて、血清型８多糖−担体タンパク質コンジュゲートを生じさせた。ワンポットプロセスは、活性化された血清型８多糖を、担体タンパク質との反応に先立って精製しないことを除いては複合プロセスと同様であった。

【0219】

ＣＤＩ／ＣＤＴ複合プロセス。
多糖の活性化：血清型８多糖を、血清型８ １ｇ当たり１０ｇのトリアゾールと混合し、凍結乾燥した。得られたケーキを、２．０ｍｇ血清型８多糖／ｍＬにてＤＭＳＯに溶かした。含水量を決定した。ＤＭＳＯ中で１００ｍｇ／ｍＬにて新たに調製したＣＤＴのストック溶液を添加し、水と等しいモル量のＣＤＴを達成した。代替方法として、添加されるＣＤＴの量を調整し、より高いかより低い活性化度を達成した。これを、２３℃にて３０分保持した。

【0220】

活性化された血清型８多糖の精製：活性化された血清型８（ＡＣＰ８）の溶液を、２５体積の水の中に注ぎ、過剰のＣＤＴを破壊した。これを、おおよそ１ｍｇ／ｃｍ^２にて１０ｋＤａ ＰＥＳ膜上でその元の体積まで濃縮し、少なくとも１０体積の水に対して透析濾過した。このステップは、４時間未満で終了した。透析濾過された材料を、元の血清型８多糖１ｇ当たり１０ｇのトリアゾールと混合し、凍結乾燥した。

【0221】

凍結乾燥されたＣＲＭの調製：ＣＲＭを、少なくとも１０体積の１０ｋＤａ ＰＥＳ膜上で一定体積にて０．４％ＮａＣｌ／５％スクロースに対して透析濾過した。タンパク質濃度を決定し、十分な透析濾過緩衝液を添加し、タンパク質濃度を５．０ｇ／Ｌにすると、ＮａＣｌ／ＣＲＭのｗ／ｗ比＝０．８が得られた。ＣＲＭを凍結乾燥した。

【0222】

コンジュゲーション：活性化された、透析濾過された血清型８多糖を、１ｍｇ／ｍＬにてＤＭＳＯに溶かした。１００ｍＭにてボレート溶液を添加し、２％ｖ／ｖを達成した。

【0223】

ＣＲＭを、２ｍｇ／ｍＬにて再懸濁し、溶解が終了したら、ＡＣＰ８溶液と混ぜ合わせた。これを、２０時間にわたって２３℃にて反応させた。

【0224】

コンジュゲート反応物を、２４体積の５ｍＭボレートｐＨ９．０の中に注ぎ、１時間にわたって室温にて撹拌させた。次いで、０．５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５でｐＨ７．５に調整した。これを、５ミクロンフィルターに通して濾過し、約１ｍｇ／ｃｍ^２の負荷にて３００ｋＤａ ＰＥＳ膜上で元の体積まで濃縮し、少なくとも１０体積の水に対して透析濾過した。得られた濃縮物を、０．２２ミクロンフィルターに通して濾過し、２℃〜８℃にて保存した。

【0225】

ＣＤＩ／ＣＤＴワンポットプロセス。
ＣＲＭ_１９７マトリックス交換：ＣＲＭ_１９７を透析濾過し、おおよそ１０ｍＭホスフェート／８０ｍＭ ＮａＣｌ／１５％スクロース、ｐＨ７のバルクマトリックスから５ｍＭイミダゾール／０．７２％ＮａＣｌ／１５ｍＭオクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｐＨ７へ交換した。交換は、コンジュゲーションに有害であり、コンジュゲーション中に運ばれる塩化ナトリウム含量を規定するホスフェートおよびスクロースの除去を可能にした。オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドは、無菌濾過後の粒子形成を防ぐために添加される。

【0226】

ＣＲＭ_１９７のマトリックスを、おおよそ４ｍｇ／ｍＬの保持液濃度にて１０Ｋ ＭＷＣＯ ＰＥＳ膜を使用する１０ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）を通じての５ｍＭイミダゾール／０．７２％／１５ｍＭオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドｐＨ７に対する平行流濾過により交換した。典型的な膜チャレンジは、２グラム／ｆｔ^２とし、マトリックス中の標的最終ＣＲＭ_１９７濃度は、６ｍｇ／ｍＬとした。ＣＲＭ_１９７は、２℃〜８℃にて保存した。

【0227】

活性化／コンジュゲーション：黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８莢膜多糖についての活性化／コンジュゲーションプロセスは、下記のステップからなった：１）ＣＲＭ１９７のマトリックス交換；２）多糖の混ぜ合わせ；３）ＣＲＭ_１９７および混ぜ合わせられた多糖のシェル凍結および凍結乾燥；４）凍結乾燥された多糖およびＣＲＭ_１９７の溶解；５）多糖の活性化；６）活性化された多糖のＣＲＭ_１９７とのコンジュゲーション；および７）コンジュゲートの精製（希釈、透析濾過、無菌濾過）。

【0228】

多糖を、多糖１ｇ当たり１０グラムの１，２，４−トリアゾール賦形剤と混ぜ合わせた。賦形剤を、多糖への動力として添加すると、周囲温度にて１５分未満の混合の後に溶液が得られた。

【0229】

混ぜ合わせられた多糖およびＣＲＭ_１９７を、−７５℃のエタノール浴を使用して別々にシェル凍結した。１Ｌのボトル当たりの体積は、おおよそ５００ｍＬとした。

【0230】

多糖溶解については、ＤＭＳＯを、多糖の個々の凍結乾燥ボトルに添加すると懸濁液が得られ、次いで、加熱のための活性化／コンジュゲーション反応容器に移した。ＤＭＳＯを添加して２ｇ／Ｌ濃度を得た。懸濁液が、混合しながらおおよそ４５℃に達すると、澄明な溶液が得られた。次いで、溶液を、２３℃±２℃まで冷却した。

【0231】

ＣＲＭ_１９７溶解については、ＤＭＳＯを、ＣＲＭ_１９７を含有する個々の凍結乾燥ボトルに添加すると懸濁液が得られ、次いで、混合のための第二の容器に移した。ＤＭＳＯを添加して２ｇ／Ｌ濃度を得た。澄明な溶液は、典型的には、１５分未満で得られた。

【0232】

多糖／ＤＭＳＯ溶液を、カールフィッシャー分析のためにサンプリングし、水分含量を決定した。ＣＤＴを、ＤＭＳＯ中で１００ｍｇ／ｍＬ溶液として調製し、決定された水分含量に基づいて添加した。ＣＤＴ溶液の連続添加は、混合しながら２３℃±２℃にて約５分かけて行った。反応を、２３℃±２℃にて最低限３０分にわたって進行させた。反応物をサンプリングし、活性化レベルを決定し（ＵＶ２２０／２０５ｎｍ）、次いで、１００ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ９を添加すると、１．５％水溶液が得られた。次いで、反応溶液を、２３℃±２℃にて最低限３０分にわたって撹拌した。

【0233】

活性化された多糖のＣＲＭ_１９７とのコンジュゲーションについては、ＤＭＳＯを、０．８ｍｇ／ｍＬ反応濃度を標的にして添加した。次いで、ＤＭＳＯに溶かされたＣＲＭ_１９７を、混合しながら、活性化された多糖溶液に添加した。反応物を、２３℃±２℃にて最低限４時間にわたって撹拌した。

【0234】

反応溶液を、混合しながら５ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９の中にそれを添加することにより１０×希釈し、残留活性化基を加水分解した。希釈された溶液を、５μｍフィルターに通し、２ｇ／Ｌの標的保持液濃度まで濃縮した。平行流濾過は、５ｍＭスクシネート、ｐＨ７による２０ダイアボリュームを通じて３００Ｋ再生セルロース膜を使用して行った。典型的な膜チャレンジは、１グラム／ｆｔ^２とした。精製されたコンジュゲートを、０．２２ミクロンフィルターに通し、２℃〜８℃にて保存した。

【0235】

（実施例４）ワンポットおよび複合コンジュゲーションプロセスを使用する血清型８莢膜多糖のコンジュゲーション。
この実施例は、予め選択された範囲の分子量の莢膜多糖を、ワンポットプロセスかまたは複合プロセスにおけるコンジュゲーションのために使用することができることを示している。初めに、より大きな多糖が細菌細胞により産生され、得られる精製された分子量範囲は、実施例１における加水分解プロセスのｐＨおよび熱により制御することができる（表３に示されている通り）。

【0236】

この実施例では、血清型８莢膜多糖が、約８０ｋＤａから約１２０ｋＤａまでの分子量範囲である８個のバッチを選択し、コンジュゲーションは、血清型８莢膜多糖のための１，１−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）による活性化を使用して行った。表８を参照されたい。得られたコンジュゲートの分子量は、５９５ｋＤａから１７０８ｋＤａまでの範囲であった。ＣＲＭ当たりのコンジュゲートしているリシン数は、最高で１３個から最低で３個までの範囲であった。遊離糖は、最高で１１％から最低で１％までの範囲であった。

【0237】

【表8】

【0238】

（実施例５）マウス菌血症モデルにおけるコンジュゲートしている天然および塩基処理血清型８莢膜多糖の評価。
機能的抗体応答の誘導についてのコンジュゲーション前の天然血清型８莢膜多糖上に存在するＯ−アセチル基の重要性を、莢膜多糖コンジュゲートについて評価した。血清型８莢膜多糖を、穏和な塩基性条件下で脱Ｏ−アセチル化すると、ＮＭＲとイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）は共に、血清型８莢膜多糖脱Ｏ−Ａｃ−ＣＲＭ中にＯ−アセチル化がないことを裏付けた。ＣＰ８脱Ｏ−Ａｃ−ＣＲＭコンジュゲートを、実施例２に記載されているＰＤＰＨ化学反応による脱Ｏ−Ａｃ ＣＰ８多糖のＣＲＭとのコンジュゲーションにより調製した。

【0239】

血清型８莢膜多糖コンジュゲートは、予想外に、ＩＣ方法により測定できるアセチル基を示さなかった。このことは、コンジュゲーション中に血清型８莢膜多糖中のアセチル基の除去または改変を引き起こす他の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖と比較して構造の差、Ｏ−アセチル化の部位に起因すると思われる。

【0240】

マウス菌血症モデルを使用し、ＣＲＭ_１９７とコンジュゲートしている天然対塩基処理血清型８莢膜多糖の有効性を評価した。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（１５／群）に、１ｍｃｇ血清型８莢膜多糖脱Ｏ−Ａｃ−ＣＲＭまたは１μｇ血清型８莢膜多糖Ｏ−Ａｃ−ＣＲＭを０、３および６週目にワクチン接種した。ワクチンは、２２ｍｃｇ ＡｌＰＯ_４と共に製剤化した。動物に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０００３をチャレンジし、細菌を、３時間後に血液から数え上げた。データは、スチューデントｔ検定により決定されるように未処置の天然血清型８莢膜多糖で免疫化された動物の血液から回収された細菌ｃｆｕに統計的に有意な（ｐ＝０．０３６２）減少があることを示した（表９）。塩基処理血清型８莢膜多糖コンジュゲートで免疫化された動物では、血液から回収された細菌ｃｆｕは、生理食塩水対照群と同様であった。

【0241】

【表9】

【0242】

（実施例６）マウス菌血症モデルにおけるコンジュゲートしている天然および塩基処理血清型８莢膜多糖の評価。
血清型８莢膜多糖コンジュゲートを、腎盂腎炎モデルにおいてマウスを防御するそれらの能力について評価した。ｉ．ｐ．黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）チャレンジを受けたマウスの血液における細菌数は、ＰＢＳで免疫化された対照と比較して有意に減少した。

【0243】

２つの研究を行い、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６８（８型）によるチャレンジ後の、前に記載されているマウス菌血症モデルにおけるＣＰ８−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの有効性を評価した。第一の研究（図５）は、菌血症の有意な減少を示した（ｐ＝０．０３０８）。研究のため、６〜８週齢Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群（ｎ＝３０）を、０、２および４週目に両方とも１００μｇ ＡｌＰＯ_４と共に製剤化された１μｇ血清型８莢膜多糖−ＣＲＭ_１９７および生理食塩水による皮下注射により能動的に免疫化し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６８（８型）を静脈内経路により６週目にチャレンジした。事前のチャレンジ実験を行い、３回のワクチン接種後に達するマウスの年齢におけるチャレンジ株の投与量を最適化した。生存研究の統計学的評価は、カプラン−マイヤー解析により行った。

【0244】

（実施例７）天然および化学的に改変された血清型８莢膜多糖コンジュゲートで免疫化されたマウスからの血清のオプソニン活性。
ワクチン接種研究からの血清型８莢膜多糖力価が高い選択されたマウス血清（ｎ＝５）を、ＰＦＥＳＡ０００５株を使用してオプソニン活性について比較した。ＯＰＡ結果（表１０）は、天然の血清型８莢膜多糖のコンジュゲーションにより調製されたコンジュゲートのみが、マウスにおいてオプソニン抗体を誘発したことを示している。脱ＯＡｃ血清型８莢膜多糖コンジュゲートは、マウスにおいて免疫原性であったが、誘発された抗体は、このアッセイにおいてオプソニン性でなかったことは注目に値する。ＯＰＡ力価は、４０％致死が観察された希釈度の逆数として報告される。

【0245】

【表10】

【0246】

（実施例８）血清型８コンジュゲート抗血清による黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株の致死は、天然血清型８莢膜多糖の添加により阻害されることがある。
致死の特異性を確認するため、オプソニン化貪食性アッセイを、本質的に上に記載されているように、天然血清型８莢膜多糖または関係のない肺炎球菌多糖（Ｐｎ１４ｐｏｌｙ）の存在下で行った。

【0247】

結果（表１１）は、反応混合物中の天然血清型８莢膜多糖の存在が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２８６（８型）のオプソニン化貪食性致死を阻害することを示した。これらの結果は、免疫血清によるオプソニン化貪食性致死が、莢膜特異的抗体により仲介されることを裏付けている。

【0248】

【表11】

【0249】

要約
すべてのコンジュゲーション化学反応は、担体タンパク質ＣＲＭ_１９７と共有結合している血清型８莢膜多糖を生じた。これらの方法により生成されるコンジュゲートの遊離糖、血清型８莢膜多糖：タンパク質の比および収率に有意差はなかった。

【0250】

（実施例９）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖の調製。
この実施例には、様々なサイズ範囲の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖の製造が記載されている。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖反復単位の構造は、図６に示されている。本明細書に記載されている方法は、分子量が約２０ｋＤａから８００ｋＤａの範囲である血清型５莢膜多糖を製造するのに有効である。条件の適切な選択により、高分子量血清型５莢膜多糖を、分子量で５０ｋＤａから８００ｋＤａまでの範囲で単離および精製することができる。免疫原性組成物において使用するため、血清型５莢膜多糖を、分子量で７０ｋＤａから３００ｋＤａまで、７０ｋＤａから１５０ｋＤａまでの範囲および多くの望ましい範囲で単離および精製することができる。生育特性および産生される莢膜の量に基づき、ＰＦＥＳＡ０２６６株を、血清型５莢膜多糖製造のために選択した。

【0251】

血清型５莢膜多糖を製造するため、ＰＦＥＳＡ０２６６株を、主として炭素源（ラクトースかまたはスクロース）、窒素源としての加水分解された大豆粉、および微量金属からなる複合培地中で生育させた。菌株を、２〜５日にわたってバイオリアクター中で生育させた。

【0252】

ＰＦＥＳＡ０２６６株の発酵は、上に詳述されているように行った。収集時に、培養液のＯＤ_６００は、７．３８であった。培養液を、１時間にわたって高圧蒸気殺菌し、冷却した後、培養液を、上に記載されているように処理し、上清材料から細胞を分離した。濾過および濃縮された上清および細胞の各々おおよそ１Ｌを回収した。

【0253】

高圧蒸気殺菌法の前に、試料を取り出し、培養液中のブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）のレベルをテストした。０．０５％ポリソルベート８０の存在下で、発酵におけるＳＥＢの濃度は、１５〜２０ｎｇ／ｍｌであった。以前の実験は、１時間にわたって培養液を高圧蒸気殺菌することが、ＴＥＣＲＡキットについての検出限界未満である０．１ｎｇ／ｍｌまでＳＥＢのレベルを下げることを示した。

【0254】

透析濾過され、エタノール分画された多糖を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＡＥＣカラム上にロードし、上に記載されているＮａＣｌの直線グラジエントで溶離させた。画分を、血清型５多糖の存在についてはＯ−アセチルアッセイおよび二重免疫拡散テストならびにテイコ酸の存在についてはホスフェートアッセイにより分析した。血清型５多糖の存在は、画分６０〜１０５において検出された（図７Ａ〜Ｂ）。テイコ酸による夾雑を軽減するため、画分６０〜８５をプールし、残留テイコ酸をメタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、ｄｉＨ_２Ｏに対する３Ｋ透析濾過によるその除去を可能にした。

【0255】

コンジュゲートの調製のために使用される血清型５莢膜多糖の精製は、細胞からの莢膜の遊離に影響を及ぼす高温および低ｐＨに依存し多糖の分子量を下げる２つの異なる方法により行った。得られた分子量は、加水分解ステップの時間、温度およびｐＨに依存していた。

【0256】

血清型５莢膜多糖の特徴付けは、表１、前掲書に明記されている技法を使用して行った。

【0257】

下に記載されている方法により製造される莢膜多糖は、タンパク質、核酸、ペプチドグリカンおよびテイコ酸夾雑物が低レベルの純粋な多糖をもたらす。

【0258】

第一の方法では、細胞からの莢膜多糖の遊離および分子量の低減に続いて、調製物を、酵素（例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リゾチームおよびプロテアーゼ）のカクテルで処理し、不純物を消化した。インキュベーション後、残留不純物を、エタノールの添加（最終濃度約２５％）により沈殿させた。残留エタノールの除去後、莢膜多糖を含有する溶液を、陰イオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）上にロードし、直線塩グラジエントで溶離した。莢膜多糖を含有する画分をプールし、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理した。この処理は、残留テイコ酸夾雑物の酸化的加水分解をもたらしたが、血清型５莢膜多糖には影響を及ぼさなかった。反応物を、エチレングリコールの添加によりクエンチした。材料を濃縮し、蒸留水（ｄＨ_２Ｏ）に対して透析濾過し、残留試薬および副成物を除去した。

【0259】

第二の方法を使用し、様々な細胞由来の不純物を消化するために酵素を使用することなく莢膜多糖を製造した。この方法では、細胞からの莢膜多糖の遊離および分子量の低減に続いて、加水分解された発酵ブロスを、精密濾過と、続く、限外濾過および透析濾過により清澄化した。溶液を、活性炭で処理し、不純物を除去した。炭素処理後、材料を、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理して残留テイコ酸を酸化し、続いて、プロピレングリコールでクエンチした。材料を濃縮し、ｄＨ_２Ｏに対して透析濾過し、残留試薬および副成物を除去した。

【0260】

いずれかの方法を使用して製造された調製物は、タンパク質、核酸およびテイコ酸夾雑物が低レベルである純粋な莢膜多糖をもたらした。記載されている方法を使用し、加水分解の条件を操作することにより具体的範囲の望ましい高分子量多糖を製造することができる。

【0261】

本明細書に記載されている方法により得ることができる莢膜多糖の例は、下の表１２に示されている。精製された血清型５莢膜多糖のバッチは、テイコ酸（ＴＡ）、ペプチドグリカンが無いことおよび低い残留タンパク質により示されるように高い純度を有していた。表１２および１３を参照されたい。分子量の範囲は、１３２．７ｋＤａ〜８００ｋＤａに及び、精製された多糖は、９０％〜１００％の範囲で高度にＯ−アセチル化されており、１００％Ｎ−アセチル化されていた。血清型５莢膜多糖精製の収率は、３９％〜６３％であり、精製された血清型５莢膜多糖のサイズは、３５ｋＤａから６５ｋＤａまで変化した（表１２を参照）。テイコ酸（ＴＡ）夾雑のレベルは、許容可能であり、残留タンパク質および核酸のレベルも、許容できる範囲であった。血清型５多糖のＮＭＲスペクトルは、文献に報告されているものと一致した。

【0262】

【表12】

【0263】

【表13】

【0264】

莢膜多糖の分子量選択：速度論的解析は、広範囲の分子量の莢膜多糖を本明細書に記載されている方法により生成することができることを示した。初めに、より大きな多糖が細菌細胞により産生され、続いて、望ましい分子量範囲が選択され、次いで、熱および加水分解ステップのｐＨおよび熱条件の操作により精製された。

【0265】

黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）発酵ブロスの熱処理は、発酵と莢膜多糖回収の間のプロセスステップである。このプロセスステップは、熱を使用して特定の期間にわたってｐＨ調整されたブロスを処理する。低いｐＨにおける熱処理の目的は、細胞を致死させ、エンテロトキシンを不活性化し、細胞に結合している多糖を遊離し、望ましいサイズに分子量を下げることであった。これらの目的の中で、分子量の低減は、このステップにおいて必要とされる処理時間という点で最も遅かった。したがって、他の目的は、考慮された処理時間内で必然的に達成された。

【0266】

熱処理：様々な分子量範囲の莢膜多糖を選択するためのｐＨおよび温度条件を決定した。１５ＬのＢｉｏｌａｆｉｔｔｅ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒをこれらの研究のために使用した。発酵ブロスを、蠕動ポンプにより発酵槽に移した。約２００ｒｐｍの撹拌速度を使用し、ブロスｐＨを濃硫酸で調整した。次いで、ブロス温度を、設定レベルまで上げた。熱処理時間は、温度が設定ポイントに達すると直ぐに開始した。望ましい処理時間に達したら、ブロスを、室温まで冷却した。インプロセス試料を採取し、それぞれＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＭＡＬＬＳシステムにより多糖濃度および分子量を決定した。分子量（ＭＷ）データを、速度論的解析で使用した。ＭＷプロファイルを、ｐＨ３．５、４．０および５．０にて経時的に決定した。図８Ａを参照されたい。

【0267】

多糖の穏和な酸加水分解の速度論を、プロセスから得られた精製された血清型８莢膜多糖を使用して行った。精製された多糖溶液を、硫酸で実験にとって望ましいｐＨに調整した。溶液約１．５ｍＬを、１５ｍＬの遠心分離管の各々に移した。管を、精密な温度制御システムを備えた油浴に入れた。管を、所定の時間間隔で取り出し、アイスバケット中でクエンチした。実験が終わったら、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）のアリコートを試料に加え、ｐＨをもとの約７に調整した。試料を、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳシステムにより分析した。ＭＷデータを、速度論的解析で使用した。ｐＨ４．５におけるＣＰ５のＭＷプロファイルに対する温度の効果を、経時的に決定した。図８Ｂを参照されたい。

【0268】

結果
図８Ａに示されているように、より低いｐＨは、多糖の分子量を下げるのにより有効であった。この実施例では、約３００ｋＤａから約６００ｋＤａの間の分子量の範囲は、１５分から１２０分の間にわたって９５℃にて５のｐＨを使用して生成することができる。図８Ａを参照されたい。同様に、１５分から１２０分の間にわたって９５℃にて４．５のｐＨを選択すると、２００ｋＤａから４００ｋＤａの間の多糖分子量範囲を得ることができる。さらに、１５分から１２０分の間にわたって９５℃にて４．０のｐＨを選択すると、１２０ｋＤａから３００ｋＤａの間の多糖分子量範囲を得ることができる。

【0269】

図８Ｂに示されているように、温度が高いほど、加水分解速度は速くなり、時間と共に製造される多糖の分子量は広がる。別の方法で表すと、より低い温度の使用は、同じｐＨにて５５℃対９５℃で、より狭い範囲の多糖分子量を生じる。

【0270】

さらに、図４は、穏和な酸（９５℃にてｐＨ４．５）加水分解についての精製された血清型５莢膜多糖の分子量と処理時間との相関を示している。精製された多糖は、これまでに詳述された回収プロセスから得られる最終製品である。図４にも示されているように、ｐＨ４．５における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６株の熱処理時間の増加は、より小分子量の血清型８莢膜多糖をもたらし、一方、ｐＨ４．５におけるより短い熱処理時間は、より高分子量の血清型５莢膜多糖をもたらした。血清型５莢膜多糖のサイズは、ｐＨ４．５における熱処理の時間の長さに応じて約９０ｋＤａから約２２０ｋＤａまでの範囲であった。低いｐＨにおける熱処理の時間と精製された血清型５莢膜多糖のサイズの間の相関は、図４に示されているように、特定の範囲の分子量を持つ精製された多糖を製造するのに必要とされる処理時間の推定を可能にする。

【0271】

上に示されているように、２０ｋＤａから５００ｋＤａ超までの全範囲の分子量の血清型５莢膜多糖を製造、遊離および精製することができる。記載されている方法を使用し、表１４に示されているように具体的範囲の望ましい高分子量莢膜多糖を製造することができる。ピーク分子量が６３ｋＤａから１４２ｋＤａまでの範囲である比較的狭い範囲の分子量の製造された多糖は、本明細書に記載されている方法により得ることができる十分に特徴付けられた範囲の分子量に相当する。７０ｋＤａから３００ｋＤａまで、または７０ｋＤａから１５０ｋＤａまでの範囲である特に有利な範囲の高分子量多糖は、莢膜多糖を担体分子またはタンパク質とコンジュゲートさせることにより免疫原性組成物を作製するのに有用である。約１００から１４０ｋＤａまでの分子量範囲を有するＣＰ５莢膜多糖を生成するのに使用される条件は、下記の通りである：１３５分にわたって９５℃、ｐＨ４．５。しかしながら、ｐＨ、温度、および時間の異なる組合せも、分子量範囲が約１００〜１４０ｋＤａのＣＰ５分子を生成するであろう。

【0272】

【表14】

【0273】

（実施例１０）血清型５莢膜多糖のＣＲＭ_１９７とのコンジュゲーション。
この実施例は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの製造において使用されるプロセスおよび特徴付けアッセイについて記載している。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖をこの担体タンパク質とコンジュゲートさせるための異なるコンジュゲーション化学反応を開発した。例えば、ＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド）を使用するコンジュゲーションは、ＣＰと担体タンパク質の間に共有チオエーテル結合をもたらし；一方、ＣＤＴ（１，１−カルボイル−ジ−１，２，４−トリアゾール）を使用するコンジュゲーションは、莢膜多糖と担体タンパク質の間に１炭素または０炭素リンカーをもたらす。

【0274】

ＰＤＰＨコンジュゲーション化学反応による血清型５莢膜多糖のＣＲＭ_１９７とのコンジュゲーション。
ＰＤＰＨコンジュゲーション化学反応は、多糖の活性化、チオール保護基の除去、活性化された多糖中間体の精製、ＣＲＭ_１９７タンパク質の活性化および精製、ならびに活性化された構成成分のコンジュゲーションと、続く、精製を伴う多段階プロセスである。多糖へのリンカーを含有するチオール基およびＣＲＭ_１９７タンパク質担体へのハロアセチル基の導入後、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖を、チオエーテル結合を通じてタンパク質担体と結合させた。ブロモアセチル基は、アミノ基のブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によりＣＲＭ_１９７タンパク質中に導入した。チオール化された多糖を生成するため、多糖中のＮ−アセチルマンノサミノウロン酸のカルボジイミドで活性化されたカルボキシレート基を、スルフヒドリル反応性ヒドラジドヘテロ二官能性リンカー３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）のヒドラジド基とカップリングさせた。ＰＤＰＨチオール化多糖のチオールを、ＤＴＴによる還元により生成させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上のＳＥＣにより精製し、活性化されたタンパク質のブロモアセチル基と反応させると、多糖と担体タンパク質の間の臭素置換により形成される共有チオエーテル結合が得られた。未反応のブロモアセチル基は、システアミン塩酸塩（２−アミノエタンチオール塩酸塩）で「キャップ」した。次いで、反応混合物を濃縮し、透析濾過した。残ったコンジュゲートされていないブロモアセチル基をシステアミン塩酸塩でキャップし、反応性ブロモアセチル基がコンジュゲーション後に残っていないことを保証した。これは、臭素の置換後にシステアミンのチオール末端とリシン残基上のアセチル基との間に共有結合を形成した。

【0275】

１．ＰＤＰＨによる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖のチオール化：多糖を、まず、ＰＤＰＨによるチオール化により活性化した。多糖を、血清型５莢膜多糖については１：５：３の莢膜多糖：ＰＤＰＨ：ＥＤＡＣ重量比を維持しながら、新たに調製したＰＤＰＨストック溶液（ＤＭＳＯ中２５０ｍｇ／ｍＬ）、ＥＤＡＣストック溶液（ｄｉＨ_２Ｏ中９０ｍｇ／ｍＬ）、およびＭＥＳ緩衝液ストック溶液（０．５Ｍ、ｐＨ４．８５）と混合し、最終溶液０．１Ｍ ＭＥＳ、ならびに２ｍｇおよび４ｍｇ多糖／ｍＬを作製した。この混合物を、室温にて１時間にわたってインキュベートし、次いで、４℃と８℃の間にて３５００ ＭＷＣＯ透析装置を使用して４回、１０００×体積の蒸留Ｈ_２Ｏに対して透析し、未反応のＰＤＰＨを除去した。ＰＤＰＨ結合型多糖は、０．２Ｍ ＤＴＴを使用して作製し、４℃と８℃の間にて３時間または一夜にわたって室温にてインキュベートした。過剰のＤＴＴならびに反応の副成物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂および移動相としての蒸留水を使用するＳＥＣにより活性化された糖から分離した。画分を、チオール基についてＤＴＤＰアッセイにより分析し、カラムの空隙体積近くで溶離されるチオール陽性画分をプールした。画分のプールを、ＰＡＨＢＡＨおよびＯ−アセチルアッセイにより分析し、チオール基を含有する反復単位のモルパーセント（チオールのモル濃度／反復単位のモル濃度）として表される活性化度を決定した。活性化された多糖を凍結乾燥し、コンジュゲーションに必要とされるまで−２５℃にて保存した。

【0276】

ＰＤＰＨによる血清型５多糖チオール化の再現性の結果は、表１５に示されている。血清型５多糖の活性化度は、１０個の莢膜多糖反復単位当たり接続しているおおよそ１個のリンカー分子〜５個の反復単位当たり１個のリンカー分子に相当する１１％〜１９％の範囲であった。

【0277】

【表15】

【0278】

２．担体タンパク質活性化：別に、担体タンパク質を、ブロモアセチル化により活性化した。ＣＲＭ_１９７を、１０ｍＭのリン酸緩衝された０．９％ＮａＣｌ ｐＨ７（ＰＢＳ）で５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、次いで、１Ｍストック溶液を使用して０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３ ｐＨ７．０を作製した。ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）を、２０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯのＢＡＡＮＳストック溶液を使用してＣＲＭ_１９７：ＢＡＡＮＳ比１：０．２５（ｗ：ｗ）にて添加した。この反応混合物を、１時間にわたって４℃と８℃の間にてインキュベートし、次いで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５上のＳＥＣを使用して精製した。精製された活性化されたＣＲＭ_１９７を、ローリーアッセイにより分析してタンパク質濃度を決定し、次いで、５ｍｇ／ｍＬまでＰＢＳで希釈した。スクロースを、凍結防止剤として５％ｗｔ／ｖｏｌまで添加し、活性化されたタンパク質を凍結し、コンジュゲーションに必要とされるまで−２５℃にて保存した。

【0279】

ＣＲＭ_１９７のリシン残基のブロモアセチル化は、極めて一貫性があり、利用可能な３９個のリシンから１９〜２５個のリシンの活性化をもたらした（表１６を参照）。反応は、高収率の活性化されたタンパク質を生じた。

【0280】

【表16】

【0281】

３．カップリング反応：活性化された莢膜多糖および活性化された担体タンパク質を調製したら直ぐに、２つを、コンジュゲーション反応で混ぜ合わせた。凍結乾燥およびチオール化された多糖を、０．１６ＭボレートｐＨ８．９５に溶かし、解凍したブロモアセチル化されたＣＲＭ_１９７および蒸留水と混合し、最終溶液０．１Ｍボレート、ＣＲＭ_１９７：多糖の１：１ｗｔ／ｗｔ比、および２ｍｇ／ｍＬ血清型５莢膜多糖を作製した。この混合物を、１６から２４時間の間にわたって室温にてインキュベートした。タンパク質上の未反応のブロモアセチル基を、０．１ＭボレートｐＨ８．９５に溶かされたシステアミンの１３５ｍｇ／ｍＬストック溶液を使用して１：２（ｗｔ／ｗｔ）のＣＲＭ_１９７：システアミンの比にてシステアミン塩酸塩を添加することによりキャップし、室温にて４時間にわたってインキュベートした。莢膜多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート（コンジュゲート）を、１００Ｋポリエーテルスルホンウルトラフィルターを使用して０．９％ＮａＣｌに対して５０倍の透析濾過をすることにより精製した。

【0282】

ＰＤＰＨによる血清型５莢膜多糖チオール化研究の再現性の結果は、活性化度が、１０個のＣＰ反復単位当たり接続しているおおよそ１個のリンカー分子〜５個の反復単位当たり１個のリンカー分子に相当する１１％〜１９％の範囲であることを示した。

【0283】

ＣＤＴコンジュゲーション化学反応による血清型５莢膜多糖のＣＲＭ_１９７とのコンジュゲーション。
ＣＤＴは、多糖を、無水環境（ＤＭＳＯ）中で活性化し、利用可能なヒドロキシルとトリアゾールカルバメート部分およびカルボン酸とアシルイミダゾールまたはアシルトリアゾール部分を形成する１段階コンジュゲーションプロセスを提供する。タンパク質担体の添加（ＤＭＳＯ中）は、リシンによるトリアゾールの求核置換ならびにカルバメート結合（活性化されたヒドロキシルの場合）およびアミド結合（活性化されたカルボン酸の場合）の形成をもたらす。反応溶液は、平行流濾過による精製のために調製中に水溶液中に１０倍希釈される。

【0284】

ＣＤＴコンジュゲーション化学反応は、サイズ排除クロマトグラフィーの画分における糖とタンパク質の存在により、およびグリコアルデヒドでキャップされたまたはシステアミン塩酸塩でキャップされたコンジュゲートのアミノ酸分析により示される担体タンパク質と共有結合している血清型５莢膜多糖を生じた。

【0285】

２０ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲である血清型５莢膜多糖サイズについてのＰＤＰＨとＣＤＴの両方の化学反応により調製されるコンジュゲートのいくつかのロットの調製の結果の要約は、下の表１７に示されている。これらのコンジュゲーション化学反応により生成されるコンジュゲートの遊離莢膜多糖、多糖タンパク質の比および収率に有意差はなかった。コンジュゲートしている血清型５莢膜多糖の抗原性は、コンジュゲートと天然多糖の間の同一性沈降素ラインにより示されるように、コンジュゲーションにより変わることはなかった。

【0286】

【表17】

【0287】

上に示されているように、本明細書に記載されている方法を使用し、具体的範囲の望ましい高分子量莢膜多糖を製造することができる。我々は、免疫原性組成物における使用のために濾過および精製することができる予め選択された範囲の高分子量血清型５莢膜多糖からコンジュゲートを調製することを目指した。表１８は、血清型５莢膜多糖が約９２ｋＤａから１１９ｋＤａの分子量範囲であり、トリアゾール（ＣＤＴ）で活性化された血清型５莢膜多糖コンジュゲートの分析を要約している。得られたコンジュゲートの分子量は、１５３３ｋＤａから２６５６までの範囲であった。ＣＲＭ_１９７当たりのコンジュゲートしているリシン数は、最高で２２個から最低で１５個までの範囲であった。遊離莢膜多糖は、最高で１８％から最低で１１％までの範囲であった。

【0288】

【表18】

【0289】

両方のコンジュゲーション化学反応は、担体タンパク質と共有結合している血清型５莢膜多糖を生じる。これらの２つの方法により生成されるコンジュゲートの遊離莢膜多糖、血清型５莢膜多糖：タンパク質の比および収率に有意差はなかった。

【0290】

（実施例１１）複合対ワンポットＣＤＴプロセス。
上に記載されているように、本発明の免疫原性コンジュゲートを作製するための方法には、ＣＤＴ（１，１−カルボイル−ジ−１，２，４−トリアゾール）またはＰＤＰＨ（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド）を伴うコンジュゲーション化学反応を使用する莢膜多糖の担体タンパク質との共有結合コンジュゲーションを伴う。ＣＤＴの使用は、莢膜多糖と担体タンパク質の間の１炭素または０炭素リンカーをもたらすが、ＰＤＰＨの使用は、莢膜多糖と担体タンパク質の間に共有チオエーテル結合を含有する５炭素リンカーをもたらす。

【0291】

ＰＤＰＨベースの方法は、多糖の活性化、多糖上のチオール保護基の除去、活性化された多糖中間体の精製、タンパク質単体の活性化および精製、ならびに活性化された構成成分のコンジュゲーションと、続く、精製を伴う多段階プロセスであった。この方法では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖を、ＤＭＳＯなどの有機溶媒中でＰＤＰＨおよびカルボジイミドと反応させて、ＰＤＰＨ結合型多糖を生じさせた。ＰＤＰＨ結合型多糖を還元剤と反応させて、活性化された多糖を生じさせ、次いで、精製した。担体タンパク質を、有機溶媒中でブロモ酢酸と反応させて、活性化された担体タンパク質を生じさせ、次いで、精製した。次いで、精製された活性化された血清型５多糖を、精製された活性化された担体タンパク質と反応させて、血清型５多糖：担体タンパク質コンジュゲートを生じさせた。

【0292】

対照的に、ＣＤＴベースの方法は、莢膜多糖を、無水環境（すなわち、ＤＭＳＯ）中で活性化し、利用可能なヒドロキシルとトリアゾールカルバメート部分およびカルボン酸とアシルイミダゾールまたはアシルトリアゾール部分を形成する１段階コンジュゲーションプロセスであった。タンパク質担体の添加（ＤＭＳＯ中）は、リシンによるイミダゾールまたはトリアゾールの求核置換ならびにカルバメート結合（活性化されたヒドロキシルの場合）およびアミド結合（活性化されたカルボン酸の場合）の形成につながり、それによって、コンジュゲーションが「ワンポット」で進行することを可能にする。したがって、２つのＣＤＴベースの方法：より複雑なプロセスおよびより簡単なワンポットプロセスを開発した。より複雑なプロセスでは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖を、イミダゾールまたはトリアゾールと混ぜ合わせ、次いで、有機溶媒（ＤＭＳＯなど）および約０．２％ｗ／ｖの水の中でＣＤＴと反応させて、活性化された血清型５多糖を生じさせた。活性化された血清型５多糖を精製し、次いで、有機溶媒中で担体タンパク質と反応させて、血清型５多糖：担体タンパク質コンジュゲートを生じさせた。ワンポットプロセスは、活性化された血清型５多糖を、担体タンパク質との反応の前に精製しないことを除いては複合プロセスと同様であった。

【0293】

ＣＤＴ複合プロセス。
血清型５莢膜多糖の活性化：血清型５莢膜多糖を、血清型５莢膜多糖１ｇ当たり１０ｇのトリアゾールと混合し、凍結乾燥した。得られたケーキを、２．０ｍｇ血清型５莢膜多糖／ｍＬにてＤＭＳＯに溶かした。含水量を決定し、０．２％に調整した。ＤＭＳＯ中で１００ｍｇ／ｍＬにて新たに調製したＣＤＴのストック溶液を添加し、ＣＰ５の量と比較して２０倍モル過剰量のＣＤＴを達成した。代替方法として、添加されるＣＤＴの量を調整し、より高いかより低い活性化度を達成した。これを、２３℃にて３０分保持した。

【0294】

活性化された血清型５莢膜多糖の精製：活性化された血清型５莢膜多糖（ＡＣＰ５）の溶液を、２５体積の水の中に注ぎ、過剰のＣＤＴを破壊した。これを、おおよそ１ｍｇ／ｃｍ２にて１０ｋＤａ ＰＥＳ膜上でその元の体積まで濃縮し、少なくとも１０体積に対して水に対して透析濾過した。このステップは、４時間未満で終了した。透析濾過された材料を、元の血清型５多糖１ｇ当たり１０ｇのトリアゾールと混合し、凍結乾燥した。

【0295】

凍結乾燥されたＣＲＭの調製：ＣＲＭを、少なくとも１０体積に対して１０ｋＤａ ＰＥＳ膜上で一定体積にて０．４％ＮａＣｌ／５％スクロースに対して透析濾過した。タンパク質濃度を決定し、十分な透析濾過緩衝液を添加し、タンパク質濃度を５．０ｇ／Ｌにすると、ＮａＣｌ／ＣＲＭのｗ／ｗ比＝０．８が得られた。ＣＲＭを凍結乾燥した。

【0296】

コンジュゲーション：活性化された、透析濾過された血清型５莢膜多糖を、１ｍｇ／ｍＬにてＤＭＳＯに溶かした。１００ｍＭにてボレート溶液を添加し、２％ｖ／ｖを達成した。

【0297】

ＣＲＭを、２ｍｇ／ｍＬにて再懸濁し、溶解が終了したら、ＡＣＰ５溶液と混ぜ合わせた。これを、２０時間にわたって４℃にて反応させた。

【0298】

コンジュゲート反応物を、２４体積の５ｍＭボレートｐＨ９．０の中に注ぎ、１時間にわたって室温にて撹拌させた。次いで、０．５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５でｐＨ７．５に調整した。これを、５ミクロンフィルターに通して濾過し、約１ｍｇ／ｃｍ^２の負荷にて３００ｋＤａ ＰＥＳ膜上で元の体積まで濃縮し、少なくとも１０体積の水に対して透析濾過した。得られた濃縮物を、０．２２ミクロンフィルターに通して濾過し、２℃〜８℃にて保存した。

【0299】

ＣＤＴワンポットプロセス。
ＣＲＭ_１９７マトリックス交換：ＣＲＭ_１９７を透析濾過し、おおよそ１０ｍＭホスフェート／８０ｍＭ ＮａＣｌ／１５％スクロース、ｐＨ７から５ｍＭイミダゾール／０．７２％ＮａＣｌ／１５ｍＭオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｐＨ７へ交換した。交換は、コンジュゲーションに有害であり、コンジュゲーション中に運ばれる塩化ナトリウム含量を規定するホスフェートおよびスクロースの除去を可能にした。オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドは、無菌濾過後の粒子形成を防ぐために添加される。

【0300】

ＣＲＭ_１９７のマトリックスを、おおよそ４ｍｇ／ｍＬの保持液濃度にて１０Ｋ ＭＷＣＯ ＰＥＳ膜を使用する１０ダイアボリュームを通じての５ｍＭイミダゾール／０．７２％ＮａＣｌ／１５ｍＭオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｐＨ７に対する平行流濾過により交換した。典型的な膜チャレンジは、２グラム／ｆｔ２とし、マトリックス中の標的最終ＣＲＭ_１９７濃度は、６ｍｇ／ｍＬとした。ＣＲＭ_１９７は、２℃〜８℃にて保存した。

【0301】

活性化／コンジュゲーション：黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５莢膜多糖についての活性化／コンジュゲーションプロセスは、下記のステップからなった：１）多糖の混ぜ合わせ；２）ＣＲＭ_１９７および混ぜ合わせられた多糖のシェル凍結および凍結乾燥；３）凍結乾燥された多糖およびＣＲＭ_１９７の溶解；４）多糖の活性化；５）活性化された多糖のＣＲＭ_１９７とのコンジュゲーション；および６）コンジュゲートの精製（希釈、透析濾過、無菌濾過）。

【0302】

多糖を、多糖１ｇ当たり１０グラムの１，２，４−トリアゾール賦形剤と混ぜ合わせた。賦形剤を、多糖へ粉末として添加すると、周囲温度にて１５分未満の混合の後に溶液が得られた。

【0303】

混ぜ合わせられた多糖およびＣＲＭ_１９７を、−７５℃のエタノール浴を使用して別々にシェル凍結した。１Ｌのボトル当たりの体積は、おおよそ５００ｍＬとした。

【0304】

多糖溶解については、ＤＭＳＯを、多糖の個々の凍結乾燥ボトルに添加すると懸濁液が得られ、次いで、加熱のための活性化／コンジュゲーション反応容器に移した。ＤＭＳＯを添加して２ｇ／Ｌ濃度を得た。澄明な溶液は、５〜１０分の混合後に得られた。

【0305】

ＣＲＭ_１９７溶解については、ＤＭＳＯを、ＣＲＭ_１９７を含有する個々の凍結乾燥ボトルに添加すると懸濁液が得られ、次いで、混合のための第二の容器に移した。ＤＭＳＯを添加して２ｇ／Ｌ濃度を得た。澄明な溶液は、典型的には、１５分未満の間に得られた。

【0306】

多糖／ＤＭＳＯ溶液を、カールフィッシャー分析のためにサンプリングし、水分含量を決定した。ＣＤＴを、ＤＭＳＯ中で１００ｍｇ／ｍＬ溶液として調製し、５型多糖に５モル過剰にて添加した（複合プロセスは、２０モル当量ＣＤＴを使用し、一方、ワンポットプロセスは、５モル当量のＣＤＴ：ＣＰ５を使用した）。ＣＤＴ溶液の連続添加は、混合しながら２３℃±２℃にて約５分かけて行った。反応を、２３℃±２℃にて最低限３０分にわたって進行させた。反応物をサンプリングし、活性化レベルを決定し（ＵＶ２２０／２０５ｎｍ）、次いで、１００ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ９を添加すると、１．５％水溶液が得られた。次いで、反応溶液を、２３℃±２℃にて最低限３０分にわたって撹拌した。

【0307】

活性化された多糖のＣＲＭ_１９７とのコンジュゲーションについては、ＤＭＳＯを、０．５５ｍｇ／ｍＬ反応濃度を標的にして添加した。次いで、ＤＭＳＯに溶かされたＣＲＭ_１９７を、混合しながら、活性化された多糖溶液に添加した。反応物を、２３℃±２℃にて最低限１６時間にわたって撹拌した。

【0308】

反応溶液を、５ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．６で１０×希釈し、９±０．２の最終希釈ｐＨを得た。溶液を、最低限４時間にわたって２３℃±３℃にて撹拌した。希釈された溶液を、５μｍフィルターに通し、２ｇ／Ｌの標的保持液濃度まで濃縮した。平行流濾過は、５ｍＭスクシネート、ｐＨ７による２０ダイアボリュームを通じて３００Ｋ再生セルロース膜を使用しておこなった。典型的な膜チャレンジは、１グラム／ｆｔ２とした。精製されたコンジュゲートを、０．２２ミクロンフィルターに通し、２℃〜８℃にて保存した。

【0309】

（実施例１２）ワンポットおよび複合コンジュゲーションプロセスを使用する血清型５莢膜多糖のコンジュゲーション。
この実施例は、予め選択された範囲の分子量の莢膜多糖を、ワンポットプロセスかまたは複合プロセスのコンジュゲーションに使用することができることを示している。初めに、より大きな多糖が細菌細胞により産生され、得られる精製された分子量範囲は、実施例９における加水分解プロセスのｐＨおよび熱により制御することができる。この実施例では、血清型５莢膜多糖が、約９０ｋＤａから約１４０ｋＤａまでの分子量範囲である８個のバッチを選択し、コンジュゲーションは、上に記載されているワンポットプロセスかまたは複合プロセスでトリアゾール（ＣＤＴ）による活性化を使用して行った。表１９を参照されたい。得られたコンジュゲートの分子量は、１１２５ｋＤａから２６５６ｋＤａまでの範囲であった。ＣＲＭ当たりのコンジュゲートしているリシン数は、最高で２２個から最低で１５個までの範囲であった。遊離糖は、最高で２３％から最低で１１％までの範囲であった。

【0310】

【表19】

【0311】

（実施例１３）血清型５莢膜多糖コンジュゲートは、マウス腎盂腎炎モデルにおいて一貫して防御を示す。
血清型５莢膜多糖コンジュゲートを、それらが腎盂腎炎モデルにおいてマウスを防御する能力について評価した。ｉ．ｐ．黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）チャレンジを受けているマウスの血液における細菌数は、ＰＢＳで免疫化された対照と比較して有意に減少した。

【0312】

すべての６つの個別研究は、免疫化された動物においてｃｆｕ／ｍｌ腎臓の有意な減少を示した（図９）。これらの研究をメタ分析についてプールした場合、研究についての全有意性は、全体として０．０００１未満まで増加した。データは、莢膜多糖コンジュゲートによる能動的ワクチン接種後に腎臓コロニー形成の一貫した減少を示した。

【0313】

（実施例１４）異なるコンジュゲーション化学反応により調製される血清型５莢膜多糖コンジュゲートは、実験感染からマウスを防御する。
マウス腎盂腎炎モデルにおける能動的免疫化研究を、ＰＤＰＨ化学反応かまたはＣＤＴ化学反応により調製された血清型５莢膜多糖コンジュゲートで行った。莢膜多糖をＣＲＭ_１９７とコンジュゲートさせるための方法は、上に記載されている。結果は、両コンジュゲートが、偽免疫化された動物と比較してマウスにおけるコロニー形成を低減することを示した（表２０）。

【0314】

【表20】

【0315】

（実施例１５）血清型５莢膜多糖コンジュゲートの能動的免疫化は、ラット心内膜炎モデルにおいてラットを防御する。
４つの研究を、ＣＰ５−ＣＲＭ_１９７ＰＤＰＨコンジュゲートで行った。血清型５莢膜多糖コンジュゲートは、３つのうちの２つの実験において心臓と腎臓の両方で黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６によるチャレンジ後に回収されたＣＦＵを有意に減少させた（表２１）。第三の研究では、幾何平均力価（ＧＭＴ）抗ＣＰ５力価は、３つの実験のうちで最も低かったが、前の実験よりわずかに低いに過ぎなかった。

【0316】

【表21】

【0317】

（実施例１６）ＬＭＷ ＣＰ５コンジュゲートワクチンと比較したマウスにおけるＨＭＷ ＣＰ５コンジュゲートワクチンの増強された免疫原性
マウス腎盂腎炎研究を行い、異なるＣＰ５コンジュゲート製剤の免疫原性および有効性を評価した。２つの製剤を試験した：第一の製剤は、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている高分子量（ＨＭＷ）ＣＰ５（おおよそ３００ｋＤａ）からなった。第二の製剤は、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている低分子量（ＨＭＷ）ＣＰ５（おおよそ２５ｋＤａ）からなった。３つの投与量レベルをＨＭＷワクチンについて試験した（１、０．１および０．０１ｍｃｇ）。ＬＭＷワクチンは、１ｍｃｇにて試験した。ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の多糖コンジュゲートワクチン（ＰＰ５）からなる陰性対照群も包含した。多糖を、０、３、６週目に２２ｍｃｇ ＡｌＰＯ４と共に製剤化し、８週目に黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６をチャレンジした。腎臓を収集し、細菌コロニーを、チャレンジの４８時間後に数えた。両ワクチンは、免疫応答を生成するのに有効であり、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６のＣＦＵの減少は、ＨＭＷワクチンとＬＭＷワクチンの両方の１μｇ群をワクチン接種されたマウスの腎臓から観察された。これは、より低いワクチン用量の有効性低下により示されるように用量依存的であった（図１０）。ＣＦＵ読み出しは、ＨＭＷおよびＬＭＷワクチンについての有効性の差を検出するのに十分敏感ではなかった。したがって、マウスの血清を、ＯＰＡにより試験した。ＯＰＡ力価は、ＯＰＡアッセイにおいて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６株の４０％を致死させるのに必要とされる血清の希釈度として定義した。増強されたＯＰＡ力価は、ＬＭＷ製剤と比較してＨＭＷワクチンについて見られた（図１１）。

【0318】

（実施例１７）高分子量多糖を含む莢膜多糖コンジュゲートは、低分子量多糖を含むコンジュゲートと比較して増強された免疫原性を示す。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究を行い、異なる莢膜コンジュゲート製剤の免疫原性を評価した。２つの製剤を、２つの異なる用量レベル（２および２０μｇ）にて試験した。第一の製剤は、ＣＲＭ_１９７とコンジュゲートしている高分子量（ＨＭＷ）多糖（おおよそ１３０ｋＤａ）を含有した。第二の製剤は、ＣＲＭ_１９７とコンジュゲートしている低分子量（ＬＭＷ）多糖（おおよそ２５ｋＤａ）を含有した。５匹の霊長類の群に、単回のいずれかのワクチンをワクチン接種し、免疫力価を、ワクチン接種の前におよびワクチン接種の２週後にモニターした。ＯＰＡ力価は、ＯＰＡアッセイにおいて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６株の４０％を致死させるのに必要とされる血清の希釈度として定義した。抗体力価も、ＥＬＩＳＡによりモニターした。増強された活性は、ＬＭＷワクチンと比較してＨＭＷワクチンについての抗体力価の１０倍上昇により示されるように、ＬＭＷ製剤と比較してＨＭＷワクチンについて見られた（表２２）。ＨＭＷワクチンを受けたＮＨＰについてのＯＰＡレスポンダー率もより高かった（４０％と比較して８０％）。

【0319】

【表22】

【0320】

（実施例１８）多糖Ｏ−アセチル化は、血清型５莢膜多糖コンジュゲートに対する防御抗体応答の誘導にとって重要である。
血清型５莢膜多糖のＯ−アセチル化の重要性を評価するため、天然の莢膜多糖を脱Ｏ−アセチル化（ｄＯＡｃ）し、上で論じられているように、ＰＤＰＨコンジュゲーション化学反応を使用してＣＲＭ_１９７（ｄＯＡｃ−ＣＲＭ_１９７）とコンジュゲートさせた。ｄＯＡｃＣＰ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの有効性を、マウス腎盂腎炎モデルにおいてＣＰ５−ＣＲＭ_１９７と並行して比較した。

【0321】

Ｏ−アセチル基を欠くコンジュゲート（ｄＯＡｃ ＣＰ５−ＣＲＭ）による免疫化は、腎臓における回収された細菌ＣＦＵを下げることができなかった。これらのデータ（表２３）は、Ｏ−アセチル化が、ＣＰ５に対する機能的抗体の誘発にとって重要であることを示している。

【0322】

【表23】

【0323】

（実施例１９）特異性が知られているモノクローナル抗体を使用するＯＰＡによる血清型５莢膜多糖の機能的エピトープとしてのＯ−アセチル化の重要性の確認。
ＯＡｃ＋（ＣＰ５−７−１）、ＯＡｃ＋／−（ＣＰ５−５−１）およびＯＡｃ−（ＣＰ５−６−１）に対する特異性をもつ血清型５莢膜多糖モノクローナル抗体を、５型ＰＦＥＳＡ０２６６株に対するＯＰ致死活性について評価した（表２４）。血清型８莢膜多糖（ＣＰ８ ＯＡｃ＋に対して特異的なＣＰ８−３−１）に対するモノクローナル抗体を、陰性対照として使用した。

【0324】

ＯＡｃ特異的抗ＣＰ５ ｍＡｂ ＣＰ５−７−１は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６の致死を仲介した（表２４）。また、モノクローナル抗体ＣＰ５−５−１は、ＣＰ５ ＯＡｃ＋とＣＰ５ ＯＡｃ−の両方により共有されるエピトープを認識し、ＰＦＥＳＡ０２６６株の致死を仲介した。血清型５Ｏ−Ａｃ莢膜多糖上に存在するエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体は、ＰＦＥＳＡ０２６６株の致死を仲介しなかった。これらの結果は、血清型５莢膜多糖上のＯ−アセチルエピトープが、血清型５特異的抗体の機能的活性を誘発するのに必要であることを示している。

【0325】

抗体は、抗体が細菌を致死させることを示す動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食性致死アッセイにおいて細菌を致死させることにより測定されて機能的であることを必要とする。機能的致死は、抗体単独の生成をモニターするが、有効性におけるＯ−アセチル化の重要性を示すことがないアッセイを使用して示されないことがある。

【0326】

【表24】

【0327】

（実施例２０）増強された免疫原性は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において低分子量多糖と比較して高分子量多糖からなるＣＰ５コンジュゲートについて観察される。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究を行い、異なる莢膜コンジュゲート製剤の免疫原性を評価した。２つの製剤を、２つの異なる用量レベル（２および２０μｇ）にて試験した。第一の製剤は、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている高分子量（ＨＭＷ）多糖（おおよそ１３０ｋＤａ）からなった。第二の製剤は、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている低分子量（ＬＭＷ）多糖（おおよそ２５ｋＤａ）を含有した。５匹の霊長類の群に、単回投与のいずれかのワクチンをワクチン接種し、免疫力価を、ワクチン接種の前におよびワクチン接種の２週後にモニターした。ＯＰＡ力価は、ＯＰＡアッセイにおいて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６株の４０％を致死させるのに必要とされる血清の希釈度として定義した。抗体力価も、ＥＬＩＳＡによりモニターした。増強された活性は、ＬＭＷ製剤と比較してＨＭＷワクチンについて見られた（表２５）。ＬＭＷワクチンと比較してＨＭＷワクチンについては抗体力価の３〜１０倍の上昇があった。ＨＭＷワクチンを受けたＮＨＰについてのＯＰＡレスポンダー率もより高かった（４０％と比較して８０％）。

【0328】

【表25】

【0329】

要約
本明細書に記載されている両コンジュゲーション化学反応は、担体タンパク質ＣＲＭ１９７と共有結合している血清型５莢膜多糖を生じた。これらの２つの方法により生成されるコンジュゲートの遊離多糖、血清型５多糖：タンパク質の比および収率に有意差はなかった。

【0330】

本明細書に述べられているすべての刊行物および特許出願は、本発明が関連している当業者の技術水準を示す。すべての刊行物および特許出願は、あたかも各々の個別の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることを具体的および個別に示されているのと同程度に参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【0331】

上述の発明について、理解の明確さのために例示および実施例によってある程度詳細に記載してきたが、ある種の変更および改変を、添付の特許請求の範囲内で実施することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】