特許 6395943 Ｏ−グリカンシアリル化組換え糖タンパク質及びそれを産生するための細胞株

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6395943

(24)【登録日】2018年9月7日

(45)【発行日】2018年9月26日

(54)【発明の名称】Ｏ−グリカンシアリル化組換え糖タンパク質及びそれを産生するための細胞株

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20180913BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20180913BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180913BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20180913BHJP

   C12N 15/85 20060101ALN20180913BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20180913BHJP

   C07K 14/475 20060101ALN20180913BHJP

   C07K 14/575 20060101ALN20180913BHJP

   C07K 14/60 20060101ALN20180913BHJP

   C07K 14/755 20060101ALN20180913BHJP

   C07K 14/745 20060101ALN20180913BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20180913BHJP

   C07K 14/81 20060101ALN20180913BHJP

   C07K 14/505 20060101ALN20180913BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10ZNA

   C12N9/10

   C12P21/02 C

   C12P21/02 H

   !C12N5/071

   !C12N15/85 Z

   !C12P21/08

   !C07K14/475

   !C07K14/575

   !C07K14/60

   !C07K14/755

   !C07K14/745

   !C07K16/00

   !C07K14/81

   !C07K14/505

【請求項の数】9

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2017-536883(P2017-536883)

(86)(22)【出願日】2015年12月15日

(65)【公表番号】特表2018-500922(P2018-500922A)

(43)【公表日】2018年1月18日

(86)【国際出願番号】EP2015002521

(87)【国際公開番号】WO2016110302

(87)【国際公開日】20160714

【審査請求日】2017年7月5日

(31)【優先権主張番号】15000016.4

(32)【優先日】2015年1月7日

(33)【優先権主張国】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】517238400

【氏名又は名称】ツェヴェック ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ヴィッシンク ジルケ

(72)【発明者】

【氏名】ヴェルフェル イェンス

(72)【発明者】

【氏名】ファウスト ニコル

【審査官】 野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５１９６３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 BLIXT, O. et al.，J. AM. CHEM. SOC.，２００２年 ５月２２日，Vol.124, No.20，pp.5739-5746，ISSN: 0002-7863

【文献】 SHANG, J. et al.，EUR. J. BIOCHEM.，１９９９年１０月，Vol.265, No.2，pp.580-588，ISSN: 0014-2956

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３Ｇａｌ１）を過剰発現するよう遺伝子操作された、哺乳動物の細胞株であって、
β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）を過剰発現するよう更に遺伝子操作された、哺乳動物の細胞株。

【請求項2】

β−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）を過剰発現するよう更に遺伝子操作された、請求項１に記載の、哺乳動物の細胞株。

【請求項3】

前記細胞株がＳＴ３Ｇａｌ１及びＳＴ３Ｇａｌ４をコードする内在性遺伝子並びに場合によりＳＴ６Ｇａｌ１をコードする内在性遺伝子を含み、ＳＴ３Ｇａｌ１及びＳＴ３Ｇａｌ４並びに場合によりＳＴ６Ｇａｌ１を過剰発現させるのに適した１つ又は複数の位置のゲノムに挿入された、プロモーター、増強エレメント、及び安定化エレメントからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝要素を更に有する、請求項１又は２に記載の、哺乳動物の細胞株。

【請求項4】

ＳＴ３Ｇａｌ１及びＳＴ３Ｇａｌ４をコードする外因性核酸並びに場合によりＳＴ６Ｇａｌ１をコードする外因性核酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、哺乳動物の細胞株。

【請求項5】

前記哺乳動物の細胞株がヒト細胞株である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項6】

前記哺乳動物の細胞株がＡＧＥ．ＣＲ（商標）細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＡＧＥ１．ＨＮ（商標）細胞、ＮＣ５Ｔ１１細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＨＭＣＬ細胞、ＭＭ．１細胞、Ｕ２６６細胞、ＲＰＭＩ１８２２６細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＮＭ細胞、ＮＭ−Ｆ９細胞、及びＣＡＰ細胞からなる群から選択される細胞株由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項7】

前記哺乳動物の細胞株がアデノウイルスのＥ１及びｐＩＸ領域の遺伝子産物をコードする少なくとも１つの核酸を含むヒト初代羊膜細胞由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項8】

少なくとも８０％の割合にシアリル化されたＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を発現させる方法であって、該組換え糖タンパク質とともにβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３Ｇａｌ１）及びβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）を哺乳動物の細胞において過剰発現させる工程を含む、方法。

【請求項9】

さらに、前記組換え糖タンパク質とともにβ−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）を前記細胞において過剰発現させる工程を含む、請求項８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高度に又は完全にシアリル化（sialylated：シアル酸化された）されたＯ−結合型ＧａｌＮＡｃグリカン（ＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカン）、好ましくはコア１のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンを有する組換え糖タンパク質の生成に使用することができるβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３Ｇａｌ１）、好ましくはヒトＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現するよう遺伝子操作した細胞株及び各組換え糖タンパク質に関する。さらに、本発明は、組換え糖タンパク質を発現させる各方法、組換え糖タンパク質のシアリル化の割合を増加させる方法、及びＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンの微変異性（micro-heterogeneity：微小不均一性）を低減させる方法に関する。最後に、本発明は、組換え糖タンパク質を生成するための、組換え糖タンパク質のシアリル化の割合を増加させるための、及び組換え糖タンパク質のＯ−結合型ＧａｌＮＡｃグリカンの微変異性を低減させるための上記の細胞株のそれぞれの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

治療用タンパク質の開発は、その臨床的重要性により、過去数年にわたってかなり加速している。しかし、治療用タンパク質の開発は、特に複合グリコシル化タンパク質において、好ましいグリコシル化パターンを有するタンパク質を得る難しさから遅れていることが多い。これは多くの場合、最適とはいえない薬理学的特性、例えば血清半減期の減少又は免疫原性の増大を導いている。

【0003】

別の欠点として、翻訳後修飾のばらつきによる治療用タンパク質、特に糖構造の不均一性がある。この不均一性により、異なる生産単位の間での生成物の品質に一貫性がなくなる恐れがある。それゆえ、治療用タンパク質の開発を進めるために、均一な翻訳後修飾を実現することが重要である。

【0004】

グリコシル化は最も一般的な翻訳後修飾である。最適な治療効果を示すために、生物製剤のほぼ全てにおいて、正確にグリコシル化することが求められる。一般に、グリコシル化は糖がタンパク質表面に共有結合することを指し、この場合、糖はアスパラギン残基に結合してＮ−結合型グリカン（Ｎ−グリカン）となるか、又はセリン残基若しくはトレオニン残基に結合してＯ−結合型グリカン（Ｏ−グリカン）となるかのいずれかとなる。Ｏ−結合型グリカンの最も一般的な基はＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンであり、このとき、セリン又はトレオニンがＮ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に結合し、すなわち更なる単糖に結合する。本明細書において使用される場合、「Ｏ−結合型グリカン」又は「Ｏ−グリカン」という用語は常に、ＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンに関する。上述のように、グリコシル化パターンは、分子間でかなり多様なものとなり得るが、その結合形態は単糖の順、分岐パターン、及び長さ（微変異性）において異なり得る。さらに、グリコシル化部位により全てが完全に占められるものではない（マクロ変異性）。

【0005】

グリコシル化はタンパク質の溶解性、タンパク質分解に対する抵抗性、及び他のタンパク質又はタンパク質受容体、例えばＡＳＧＰＲ（アシアロ糖タンパク質受容体）への結合挙動に影響を及ぼし、それゆえ血漿中の糖タンパク質の半減期に影響を及ぼす。

【0006】

約５０ｋＤａより小さいサイズのタンパク質において、クリアランスは主に腎クリアランスを介して行われる。タンパク質のサイズ以外に、タンパク質表面の電荷も腎クリアランスに影響を及ぼし、腎臓内の電荷の高いタンパク質の濾過は低下する。

【0007】

大きいサイズのタンパク質において、クリアランスは主に、肝臓における特異的及び／又は非特異的な肝臓による取込みによって行われる。特異的な取込みのメディエーターの例としては、非シアリル化Ｎ−結合型糖タンパク質と末端ガラクトースとを特異的に結合させるＡＳＧＰＲがある。この受容体の作用により、隣接する炭水化物であるガラクトースを包含する末端シアル酸を有する糖タンパク質は、Ｎ−結合型グリカンに末端ガラクトース残基を有する非シアリル化対応物に比べ半減期が最大１００倍増加している。他の受容体はマンノース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、又はフコースに特異的に結合し、系からこれらの末端糖を含む糖タンパク質を除去する。

【0008】

この観点から、末端シアリル化を高い割合で含む天然のＮ−グリコシル化パターンは、治療用タンパク質の薬物動態特性を決定することから、治療用タンパク質として重要である。さらに、糖タンパク質上で適切に結合した末端シアル酸は、糖タンパク質の免疫原性を減少させる。

【0009】

ほぼ天然の糖構造及び高い割合のシアリル化を得るための最初の方法は、哺乳動物様の糖構造をタンパク質に結合することができる細胞株、例えばＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞）内において組換えタンパク質を産生することである。しかし、ＣＨＯ細胞はシアル酸の２，６−結合を触媒するために必要な酵素がないため、２，３−結合を触媒することしかできない。さらに、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸；ＮｅｕＡｃ）に加え、ＣＨＯ細胞ではまた、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）をヒトでは合成されない糖であるグリカンに結合するため、ヒトに注射したときに免疫原性となる。それゆえ、より良い方法はヒト細胞様ＣＡＰ細胞（ヒト羊膜細胞由来）又はＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚腎細胞由来）から得られた細胞株から治療用タンパク質を産生する。しかし、発酵中の哺乳動物の細胞株から分泌される治療用タンパク質のシアリル化は多くの場合不完全である。

【0010】

タンパク質の薬物動態プロファイルにおいてシアリル化が重要であることから、シアリル化の割合を増加させるための多大な努力がなされてきた。Ｎ−結合型グリコシル化の完全なシアリル化における有益な作用は十分に理解されているが、Ｏ−グリコシル化の作用については比較的ほとんど知られていない。それゆえ、これまでシアリル化の改良に対する細胞工学での試みは全て、Ｎ−結合型糖構造に向けられている。

【0011】

Ｏ−結合型ＧａｌＮＡｃグリカンは常に、セリン又はトレオニンに結合したα−結合型Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有する。ＧａｌＮＡｃはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、フコース、又はシアル酸等の残基を用いて伸長することができる。Ｏ−結合型ＧａｌＮＡｃグリコシル化において、４つの主要なコア構造、コア１（ＧａｌＧａｌＮＡｃ）、コア２（ＧａｌＧｌｃＮＡｃＧａｌＮＡｃ）、コア３（ＧｌｃＮＡｃＧａｌＮＡｃ）、及びコア４（ＧｌｃＮＡｃ２ＧａｌＮＡｃ）を識別することができる（図１）。末端は、例えばリン酸塩、硫酸塩、カルボン酸、又はシアル酸を用いて更に修飾されることもある。Ｏ−結合型ＧａｌＮＡｃグリカンは、完全に折り畳まれたタンパク質の構造を維持する際に、プロテアーゼを安定させる役割を果たす。図２はコア１及びコア２のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンの生合成を示す。

【0012】

治療用タンパク質の半減期の増加に対するＮ−結合型グリカンの末端シアル酸の劇的な正の影響は十分に確立されたものであるが、Ｏ−結合型ＧａｌＮＡｃグリカンの末端シアル酸の考えられる作用及びＯ−結合型構造の正確な状態（appearance）については十分に理解されていない。

【0013】

ヒトインスリン様成長因子結合タンパク質−６（ＩＧＦＢＰ６）は、５つのＯ−結合型グリコシル化部位を有し、脱グリコシル化されたものに比べＯ−グリコシル化形態における血液からのクリアランスは低いことから、Ｏ−結合型グリカンの全般的な関与は示されるが、シアル酸の役割は依然として不明瞭なままである。Ｂ細胞活性化因子受容体３（ＢＲ３）−Ｆｃは、多数のＯ−結合型グリコシル化部位を有し、シアリル化レベルは製造過程において変化する。異なる形態を分離することで、ＢＲ３−Ｆｃの脱シアリル化されたＯ−結合型グリカンにおいて顕在化するガラクトースが、肝臓の取込み及び分解による、特に非実質性細胞を介在したクリアランスによる急速なクリアランスと関連があることを示すことができる。興味深いことに、シアリル化Ｇａｌの増加と関連があるクリアランス率の低下はまた、アシアロＧａｌＮＡｃの増加とともに観察され、末端アシアロＧａｌがクリアランスのシグナルである可能性が示されている。アディポネクチンは、脂肪細胞分泌型のインスリン感受性ホルモンであり、３つの推定Ｏ−結合型グリコシル化部位を有し、多量体形成に必要ではないが、シアリル化タンパク質のものに比べ、脱シアリル化タンパク質の血漿クリアランスを促進させる。これまで、糖タンパク質の組換え発現中のＯ−結合型ＧａｌＮＡｃグリカンのシアリル化又は構造に影響を与える方法は記載されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

それに応じて、本発明の基礎となる技術的課題は、高度又は完全なシアリル化ＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンを有する組換え糖タンパク質及び上記タンパク質を組換えにより産生することができる細胞株を提供することである。さらに、組換え糖タンパク質を発現させる方法、組換え糖タンパク質のシアリル化の割合を増加させる方法、及びＧａｌＮＡｃ Ｏ−結合型グリカンの微変異性を低下させる方法それぞれ、並びに組換え糖タンパク質を産生するための、組換え糖タンパク質のシアリル化の割合を増加させるための、及びＧａｌＮＡｃ Ｏ−結合型グリカンの微変異性を低下させるための上記の細胞株の使用を提供するものとする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

上記の技術的課題に対する解決方法は、特許請求の範囲に特徴づけられる実施形態によって実現される。

【0016】

特に第１の態様において、本発明は、β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３Ｇａｌ１）を過剰発現するよう遺伝子操作した、動物の細胞株、好ましくは昆虫、鳥類、又は哺乳動物の細胞株、より好ましくは哺乳動物、特にヒトの細胞株に関する。

【0017】

本明細書において使用される場合「ＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現するよう遺伝子操作した細胞株」という用語はまた、下記の他のトランスフェラーゼにおいても、遺伝子操作時に、細胞株の個々の細胞において遺伝子操作の前よりもシアリルトランスフェラーゼ等のタンパク質が高い活性を示すことを表す。

【0018】

所与のタンパク質を過剰発現させる遺伝子操作は、特に限定されず、当該技術分野において知られている。特定の例において、例えばヒト細胞株等の細胞株はＳＴ３Ｇａｌ１をコードする内在性遺伝子を含む。このような場合、細胞をプロモーター、増強エレメント、及び／又は安定化エレメントを上記の核酸を過剰発現させるのに適した位置の細胞のゲノムに挿入することにより遺伝子操作することができる。これは、ＴＡＬＥＮＳ、Ｚｎフィンガータンパク質、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９を用いた相同組換え、又は当該技術分野において既知の他の方法により行うことができる。したがって、好ましい実施の形態において、細胞株がＳＴ３Ｇａｌ１をコードする内在性遺伝子及び場合によりＳＴ３Ｇａｌ４及び／又はＳＴ６Ｇａｌ１をコードする内在性遺伝子を含み、ＳＴ３Ｇａｌ１及び場合によりＳＴ３Ｇａｌ４及び／又はＳＴ６Ｇａｌ１を過剰発現させるのに適した１つ又は複数の位置のゲノムに挿入された、プロモーター、増強エレメント、及び安定化エレメントからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝要素を更に有する。好適なプロモーター、増強エレメント、及び安定化エレメントは特に限定されず、当該技術分野において知られている。例えば、プロモーターには、構成型プロモーター、例えばＣＭＶ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＵｂＣ、ＣＡＧ、ＢＯＳ、又はＰＧＫプロモーター及び誘導型プロモーター、例えばテトラサイクリン誘導型プロモーター又は当該技術分野において既知の他の誘導型プロモーターがある。さらに、増強エレメント（エンハンサー）には、ＣＭＶエンハンサー、βグロビンエンハンサー、免疫グロブリンエンハンサー、及びＰＧＫエンハンサーがある。さらに、安定化エレメント（クロマチンエレメント）には、マトリクス付着領域（ＭＡＲ）、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、及び遍在的作用性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）がある。

【0019】

代替法として、細胞がＳＴ３Ｇａｌ１をコードする内在性遺伝子を含まない場合、又はさらに、細胞がＳＴ３Ｇａｌ１をコードする内在性遺伝子を含む場合、細胞の遺伝子操作は、ＳＴ３Ｇａｌ１をコードする核酸を細胞に導入することにより実現することができる。核酸を細胞に導入する方法は特に限定されず、当該技術分野において知られている。例えば、上記の核酸を、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、顕微注入、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを介して、試薬ベースの方法、例えば脂質、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、又は当該技術分野において既知の他の方法により、環状形態又は直鎖形態において細胞に導入することができる。核酸を、エピソーム系により、又は核酸のゲノムへの安定した組込みにより細胞に一時的又は安定して導入することができる。上記核酸は、１つ又は複数の発現ベクター、例えばｐｃＤＮＡ、ｐＣＥＰ、ｐＬｅｎｔｉ、ｐＥｎｔｒ、ｐＤｅｓｔ、ｐＥＦ、ｐＥＡＫ、ｐＣＭＶ、ｐＳｔｂｌ、又は当該技術分野において既知の他の発現ベクターの形態において、細胞内に存在することができる。ＳＴ３Ｇａｌ１の発現は、構成型プロモーター、例えばＣＭＶ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＵｂＣ、ＣＡＧ、ＢＯＳ、若しくはＰＧＫプロモーター、内因性プロモーター、又は誘導型プロモーター、例えばテトラサイクリン誘導型プロモーター若しくは当該技術分野において既知の他の誘導型プロモーターの制御下にあってよい。さらに、ＳＴ３Ｇａｌ１をコードする核酸は、１つの連続した核酸として存在することができ、又は個別の核酸として、例えば個別の発現ベクターとして存在することができる。上記核酸は、コード領域及びプロモーターに加え、好適な制限部位、Ｋｏｚａｋ配列、リボゾーム結合部位、クロマチン調節エレメント、選択カセット、エピソーム複製系、例えば当該技術分野において既知の、エプスタイン−バー核抗原及びｏｒｉ Ｐ又はＳＶ４０ ｏｒｉ及びＳＶ４０Ｔラージ抗原、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライシングシグナル、及びポリアデニル化シグナルを含有することができる。したがって、好ましい実施の形態において、細胞株はβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３Ｇａｌ１）をコードする外因性核酸及び場合によりβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）及び／又はβ−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）をコードする外因性核酸を含む。

【0020】

細胞株のトランスフェクションに好適なＳＴ３Ｇａｌ１をコードする遺伝子は特に制限されず、ＳＴ３Ｇａｌ１活性を有するタンパク質、すなわちＴｈｒ又はＳｅｒに結合するＧａｌ−β−１，３−ＧａｌＮＡｃ構造へのシアル酸の結合を触媒するタンパク質をコードする任意の供給源由来の任意の遺伝子を含む。好ましくは、このような遺伝子は、そのアミノ酸配列、特にＣ末端アクセプター結合部位のモチーフ３に、保存コンセンサス配列（Ｈ／Ｃ／Ｒ）（Ｙ／Ｈ／Ｆ）（Ｗ／Ｙ／Ｆ）（Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｙ）（ＨＹＷＥ配列（配列番号５）が特に好ましい）を含む、ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質をコードするＳＴ３Ｇａｌ１遺伝子から選択される。図１４は触媒ドメインを含むヒトＳＴ３Ｇａｌ１のアミノ酸１９１〜３４０を含む、様々な種のＳＴ３Ｇａｌ１のアミノ酸配列のアライメントを示し、上記のコンセンサス配列を示す。より好ましくは、遺伝子を、ヒトＳＴ３Ｇａｌ１のアミノ酸２６３〜３２１に少なくとも５０％、好ましくは７５％及びより好ましくは９０％同一であるアミノ酸配列を含む、ＳＴ３Ｇａｌ１タンパク質をコードするＳＴ３Ｇａｌ１遺伝子から選択する。より好ましくは、遺伝子を、ホモ・サピエンス（Homo sapiens：ヒト）（配列番号１）、パン・トログロデュテス（Pan troglodytes：チンパンジー）（配列番号６）、マカカ・ムラッタ（Macaca mulatta：アカゲザル）（配列番号７）、サス・スクロファ（Sus scrofa：イノシシ）（配列番号８）、ラッタス・ノルベギクス（Rattus norvegicus：ドブネズミ）（配列番号９）、ムス・ムスクルス（Mus musculus：ハツカネズミ）（配列番号１０）、ナンノスパラックス・ガリ（Nannospalax galili：メクラデバネズミ）（配列番号１１）、モノデルフィス・ドメスティカ（Monodelphis domestica：ハイイロジネズミオポッサム）（配列番号１２）、オリクトラグス・クニクルス（Oryctolagus cuniculus：アナウサギ）（配列番号１３）、クリセツルス・グリセウス（Cricetulus griseus：モンゴルキヌゲネズミ）（配列番号１４）、カニス・ファミリアリス（Canis familiaris：イヌ）（配列番号１５）、フェリス・カツス（Felis catus：ネコ）（配列番号１６）、エクウス・カバッルス（Equus caballus：ウマ）（配列番号１７）、ガルス・ガルス（Gallus gallus：ニワトリ）（配列番号１８）、コルムバ・リビア（Columba livia：カワラバト）（配列番号１９）、アリゲーター・シネンシス（Alligator sinensis：ヨウスコウワニ）（配列番号２０）、ラティメリア・カルムナエ（Latimeria chalumnae：シーラカンス）（配列番号２１）、及びシオナ・インテスチナリス（Ciona intestinalis：ユウレイボヤ）（配列番号２２）からなる群から選択される種由来のＳＴ３Ｇａｌ１遺伝子からなる群から選択する。ここで、哺乳動物Ｓ３Ｇａｌ１遺伝子、特にヒトＳＴ３Ｇａｌ１遺伝子が特に好ましい。

【0021】

更に好ましい実施の形態において、細胞株を、β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）、好ましくはヒトＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現するよう更に遺伝子操作し、及び／又はβ−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）、好ましくはヒトＳＴ６Ｇａｌ１を過剰発現するよう更に遺伝子操作する。それぞれの遺伝子操作は、上記のＳＴ３Ｇａｌ１において定義された通りが好ましい。さらにＳＴ３Ｇａｌ４をコードする好適な遺伝子及びＳＴ６Ｇａｌ１をコードする好適な遺伝子は特に制限されず、それぞれの活性を有するタンパク質をコードする任意の供給源由来の任意の遺伝子を含む。繰り返すが、哺乳動物、特にヒト遺伝子が特に好ましい。

【0022】

本発明による細胞株は、当該技術分野において既知の細胞株、例えば哺乳動物の細胞株から得ることができる。好ましい実施の形態において、本発明の細胞株は、Ｍｕｓｃｏｖｙ Ｄｕｃｋ細胞（ＡＧＥ．ＣＲ（商標））、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）、Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト肝細胞癌の細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７）、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ヒト神経前駆体細胞（ＡＧＥ１．ＨＮ（商標）及びＮＣ５Ｔ１１）、ヒト胚網膜芽細胞腫（Ｐｅｒ．Ｃ６）、骨髄腫細胞株（ＨＭＣＬ、ＭＭ．１、Ｕ２６６、ＲＰＭＩ８２２６）、ＣＭＬ腫瘍細胞株（ＮＭ、ＮＭ−Ｆ９）、ハイブリッドＨＥＫ２９３及びリンパ腫細胞（ＨＫＢ１１）、又はヒト羊膜細胞（ＣＡＰ；欧州特許第１２３０３５４号を参照）から得ることができ、この場合ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、及びＣＡＰ細胞が好ましく、ＣＡＰ細胞が特に好ましい。

【0023】

これに関して、ＣＡＰ細胞がアデノウイルス、特にアデノウイルス５型（Ａｄ５）、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂの領域の遺伝子産物をコードする核酸を含む永久羊膜細胞株である。ＣＡＰ細胞は、Ａｄ５のＥ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする核酸を用いて形質転換する初代ヒト羊膜細胞由来である。

【0024】

それに応じて、好ましい実施の形態において、本発明による細胞株は、アデノウイルスのＥ１及びｐＩＸの領域、好ましくはｎｔ．５０５〜４０７９のアデノウイルス５型（Ａｄ５）のＥ１及びｐＩＸの領域をコードする少なくとも１つの核酸を含むヒト初代羊膜細胞から得ることができ、この場合Ｅ１Ａはマウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）プロモーターの制御下にあり、一方、Ｅ１Ｂ及びｐＩＸの発現は、天然のプロモーターから制御されている。Ｅ１Ｂ下流イントロン、スプライスアクセプター、及びポリＡシグナルをＳＶ４０由来の対応するモチーフで置き換える。

【0025】

哺乳動物の細胞株において記載した上記の好ましい及び／又は特定の実施の形態のいずれか又は全てを互いに任意の様式において組み合わせることができる。

【0026】

更なる態様において、本発明は、少なくとも８０％の割合にシアリル化されたＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンを有する組換え糖タンパク質に関する。

【0027】

本明細書において使用される場合、「組換え糖タンパク質」という用語はそれぞれの糖タンパク質が遺伝子操作した微生物又は細胞においてバイオ技術において産生されたことを示す。

【0028】

本発明による糖タンパク質は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％の割合にシアリル化されたＧａｌＮａｃ Ｏ−グリカンを有する。好ましくは本発明による糖タンパク質は、９５％以上の割合にシアリル化されたＧａｌＮａｃ Ｏ−グリカンを有する。これに関して、本明細書において使用される場合、「少なくともＸ％の割合にシアリル化されたＯ−グリカン」という用語は、所与の糖タンパク質製剤における全ての末端ＧａｌＮａｃ Ｏ−グリカンの単糖部分のＸ％がシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸；ＮｅｕＡｃ）であることを示す。

【0029】

好ましい実施の形態において、本発明の糖タンパク質のＧａｌＮａｃ Ｏ−グリカンの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、又は少なくとも９８％は、コア１のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカン、すなわち、
ＧＰ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−
（式中、ＧＰは糖タンパク質であり、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｏは糖タンパク質のアミノ酸側鎖のセリン又はトレオニンであり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンであり、Ｇａｌはガラクトースである（図１））のコア構造を有するＧａｌＮａｃ Ｏ−グリカンである。

【0030】

好ましい実施の形態において、本発明による糖タンパク質は、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、少なくとも３７．５％、少なくとも４０％、少なくとも４２．５％、又は少なくとも４５％の割合にジシアリル化（disialylated）されたコア１のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンを有する。これに関して、本明細書において使用される場合、「少なくともＸ％の割合にジシアリル化されたコア１のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカン」という用語は、全てのコア１のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンのＸ％が２つの末端シアル酸部分を有することを示す。これに関して、図１１は、糖タンパク質のＣ１エステラーゼ阻害因子（Ｃ１ Ｉｎｈ）の種々の製剤における６つの主要なＯ−グリカン種の相対量を示す。

【0031】

それぞれの組換え糖タンパク質を本明細書に記載の通りに、例えば組換え糖タンパク質と合わせてβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３Ｇａｌ１）を過剰発現させることにより、場合により付加的にβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３Ｇａｌ４）及び／又はβ−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６Ｇａｌ１）を過剰発現させることにより産生することができる。好ましくは、上記の糖タンパク質を本明細書に記載の通りに本発明による細胞株において産生する。

【0032】

関連の実施の形態において、本発明の組換え糖タンパク質のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンは、微変異性が少なく、すなわち所与の糖タンパク質製剤中のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカン構造及び組成の多様性が少ないことを特徴とする。それぞれの組換え糖タンパク質を、本明細書に記載の通りに、例えば組換え糖タンパク質とともにＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現させることにより、場合により付加的にＳＴ３Ｇａｌ４及び／又はＳＴ６Ｇａｌ１を過剰発現させることにより産生することができる。好ましくは、上記の糖タンパク質を、本明細書に記載の通りに本発明による細胞株において産生する。

【0033】

本発明による特定の糖タンパク質は特に制限されないが、該糖タンパク質がＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンを有し、ＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンのシアリル化のそれぞれの要件を満たすものとする。好ましくは、該糖タンパク質は、哺乳動物、より好ましくはヒトの糖タンパク質である。糖タンパク質は、成長因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、抗体フラグメント、血液凝固因子、及びプロテアーゼ阻害因子からなる群から選択することができる。好ましくは、該糖タンパク質は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、及びＣ１エステラーゼ阻害因子（Ｃ１−阻害因子；Ｃ１ Ｉｎｈ）からなる群から選択される。Ｃ１ Ｉｎｈが特に好ましい。

【0034】

したがって、特に好ましい実施の形態において、本発明は、少なくとも８０％の割合にシアリル化されたＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンを有する、組換えＣ１エステラーゼ阻害因子（Ｃ１阻害因子；Ｃ１ Ｉｎｈ）、好ましくは組換えヒトＣ１ Ｉｎｈに関する。組換え糖タンパク質において記載された上記の好ましい及び／又は特定の実施の形態の全ては概ね、この組換え（ヒト）Ｃ１ Ｉｎｈの特定の実施の形態にも適用される。

【0035】

組換え糖タンパク質において記載された上記の好ましい及び／又は特定の実施の形態のいずれか又は全てを互いに任意の様式において組み合わせることができる。

【0036】

更なる態様において、本発明は、いずれも組換え糖タンパク質とともにβ−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ３Ｇａｌ１）を過剰発現させる工程を含む、少なくとも８０％の割合にシアリル化されたＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を発現させる方法、組換え糖タンパク質のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンのシアリル化の割合を増加させる方法、及び組換え糖タンパク質のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンの微変異性を低下させる方法に関する。

【0037】

特定の実施の形態において、上記の方法は、
（ａ）本発明による細胞株を準備する工程と、
（ｂ）上記細胞株に目的の糖タンパク質を発現させる工程と、
（ｃ）ＳＴ３Ｇａｌ１、場合によりＳＴ３Ｇａｌ４及びＳＴ６Ｇａｌ１からなる群から選択される１つ又は複数を目的の糖タンパク質と合わせて過剰発現させる工程と、
を含む。

【0038】

さらに、本発明の方法は、（ｄ）目的の糖タンパク質を単離する工程を含むことができる。

【0039】

これらの態様において、本発明の組換え糖タンパク質及び本発明の細胞株において記載された定義、並びに好ましい及び／又は特定の実施の形態は全て、適宜、同様に適用される。

【0040】

特に、上記方法において作製された組換え糖タンパク質又は上記方法においてシアリル化の割合が増加する組換え糖タンパク質又は上記方法においてＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンの微変異性が低下する組換え糖タンパク質は、上記に定義の本発明の任意の糖タンパク質であり得る。さらに、本発明の方法の工程（ａ）に挙げられた細胞株は、上記に定義の本発明の任意の細胞株であってよい。

【0041】

本発明の細胞株のタンパク質の発現における手段は特に限定されず、当該技術分野において知られている。これに関して、上記細胞株において目的の糖タンパク質を発現させる工程（ｂ）は、それぞれのコードする核酸を上記細胞株にトランスフェクションした後、糖タンパク質を実際に発現させることを包含する。さらに、細胞培養物から目的の糖タンパク質を単離する手段は特に制限されず、当該技術分野において知られている。

【0042】

関連の態様において、本発明は、少なくとも８０％の割合にシアリル化されたＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生するための、及び／又は組換え糖タンパク質のシアリル化の割合を増加させるための、及び／又は組換え糖タンパク質のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンの微変異性を低下させるための、本発明による細胞株の使用に関する。

【0043】

これらの態様において、本発明の組換え糖タンパク質及び本出願の細胞株において記載される定義、及び好ましい及び／又は特定の実施形態は全て、適宜、同様に適用される。

【0044】

特に、上記の使用において産生された組換え糖タンパク質又はシアリル化の割合が上記の使用において増加した組換え糖タンパク質又はＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンの微変異性が上記の使用において低下した組換え糖タンパク質は、上記に定義される本発明の任意の糖タンパク質であり得る。さらに、本発明で使用された細胞株は、上記で定義された本発明の任意の細胞株であり得る。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】主な４つのコアのＧａｌＮＡｃ Ｏ−結合型グリコシル化構造を識別することができる図である。ＧａｌＮＡｃ Ｏ−結合型グリカンは、セリン又はトレオニンに結合したα−結合型Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を含有する。ＧａｌＮＡｃを、ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、フコース、又はシアル酸等の残基を用いて伸長することができる。主要な４つのコア構造であるコア１（ＧａｌＧａｌＮＡｃ）、コア２（ＧａｌＧｌｃＮＡｃＧａｌＮＡｃ）、コア３（ＧｌｃＮＡｃＧａｌＮＡｃ）、及びコア４（ＧｌｃＮＡｃ２ＧａｌＮＡｃ）を識別することができる。これらのコア構造を、更に伸長し、分岐状にすることができる。

【図2】コア１及びコア２のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンの生合成を示す図である。生合成の第１の工程は、タンパク質骨格の特定のセリン又はトレオニン残基にＧａｌＮＡｃを結合させ、いわゆるＴｎ抗原を得る。次いで、酵素のＣ１ＧａｌＴ−１がガラクトースとＧａｌＮＡｃとの結合を触媒するため、Ｔ抗原とも呼ばれるコア１構造の基礎が形成される。コア１は、ＧｌｃＮＡｃ β１−６結合型分岐鎖の合成を触媒するＣ２Ｇｎｔのいずれかにおける基質として作用し、コア２構造が得られる。コア１構造をさらに、ＳＴ３Ｇａｌ１によりシアリル化することができ、モノシアリル化されたＧａｌ１−３（ＮｅｕＡｃ２−６）ＧａｌＮＡｃ又はジシアリル化されたＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−３（ＮｅｕＡｃ２−６）ＧａｌＮＡｃが得られる。

【図3】ラットにおける組換えＣ１ Ｉｎｈ（ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ、ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ４、ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ１／ＳＴ３ＧＡＬ４プールＡ及びプールＢ）又はベリナートの単回静脈内注射後のＣ１ Ｉｎｈの血清濃度を示す図である。ラットにおいて、ベリナート（ヒト血漿由来のＣ１ Ｉｎｈ）又はＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ、ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ４、又はＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ１／ＳＴ３ＧＡＬ４に発現する組換えＣ１ Ｉｎｈのいずれかを注射したラットにおける薬物動態試験を行った。雌のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ用量のｉ．ｖ．ボーラス注射後の残留ｈＣ１ Ｉｎｈ量を、様々な時間点：５分、１０分、１５分、２０分、３０分、６０分、２時間、４時間、６時間、及び２４時間にて決定した。残留Ｃ１ Ｉｎｈの割合をＥＬＩＳＡにより検出した。各動物において、Ｃ１ Ｉｎｈ濃度を、５分の濃度＝１００％に正規化した。値を当て嵌め、注射後の時間に対してプロットした。各群（ｎ＝４、ベリナートのｎ＝７を除く）において、代表的な動物の１例のグラフを示す。

【図4】ラットにおける、組換えＣ１ Ｉｎｈ（ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ、ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ４、ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ１／ＳＴ３ＧＡＬ４プールＡ及びプールＢ）又はベリナートの単回静脈内注射後のＣ１ Ｉｎｈの血清半減期を示すグラフである。ラットにおいて、ベリナート（ヒト血漿由来のＣ１ Ｉｎｈ）又はＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ、ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ４、又はＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ１／ＳＴ３ＧＡＬ４に発現する組換えＣ１ Ｉｎｈのいずれかを注射したラットにおける薬物動態試験を行った。雌のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ用量のｉ．ｖ．ボーラス注射後の残留ｈＣ１ Ｉｎｈを、様々な時間点：５分、１０分、１５分、２０分、３０分、６０分、２時間、４時間、６時間、及び２４時間にて決定した。残留Ｃ１ Ｉｎｈの割合をＥＬＩＳＡにより検出した。各動物において、Ｃ１ Ｉｎｈ濃度を、５分の濃度＝１００％に正規化した。値を当て嵌め、注射後の時間に対してプロットした。ｔ１／２の平均値（ｎ＝４、ベリナート ｎ＝７）、エラーバー＝±ＳＤを示す。

【図5】様々な組換えＣ１ Ｉｎｈ（ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ、ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ４、ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ１／ＳＴ３ＧＡＬ４プールＡ及びプールＢ）又はベリナートのＡＵＣ値の測定を示すグラフである。様々な組換え糖最適型（glyco-optimized）Ｃ１ Ｉｎｈサンプル間のバイオアベイラビリティの比較。ＡＵＣの平均値（ｎ＝４、ベリナート ｎ＝７）、エラーバー＝±ＳＤを示す。

【図6】ＳＴ３Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４を共役発現する、及び共役発現しないＣＡＰ細胞株から発現したＣ１ ＩｎｈのＮ−結合型グリコシル化分析及びアドオン方式（add-on）のウェスタンブロット分析を示す図である。ＣＡＰ細胞に発現した精製組換えＣ１ Ｉｎｈは、ベリナートに比べＳＤＳ ＰＡＧＥではゆっくり移動している。ＳＴ３Ｇａｌ１及びＳＴ３Ｇａｌ４の発現は、ＰＮＧａｓｅによりＮ−グリコシル化が取り外された後では、組換えＣ１ Ｉｎｈがベリナートに向かって移動し、残存するＯ−結合型−グリカンの質量の減少を示している。糖改良型（glyco-improved）Ｃ１発現細胞株に発現した１００ｎｇの精製組換えＣ１ Ｉｎｈを、５００ＵのＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ）を用いて３７℃にて１時間消化させた後、４％〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにて分離した。（分子量マーカー：ＭａｇｉｃＭａｒｋ（商標）ＸＰウェスタンタンパク質標準物質）。

【図7】シアリルトランスフェラーゼの存在下又は非存在下において、ＣＡＰ細胞に発現した組換えＣ１ ＩｎｈのＥＣＬレクチン免疫ブロットを示す図である。エリスリナ・クリスタ・ガリ（Erythrina crista galli：アメリカデイゴ）（ＥＣＬ）レクチンは、Ｎ−結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＥＣＬブロットにおけるシグナルの消失は、シアリル化された量の増加を意味する。ベリナートのＮ−結合型グリカンはまた、ほぼ完全にシアリル化され、ＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現するＣＡＰ細胞由来のＣ１ Ｉｎｈも、ほぼ完全にシアリル化されている。ＳＴ３Ｇａｌ１／４を過剰発現するＣＡＰ細胞由来のＣ１ Ｉｎｈは、アシアロＮ−グリカンの量がわずかに高いことを示している。比較すると、シアリルトランスフェラーゼを過剰発現しないＣＡＰ細胞から精製された非修飾型Ｃ１ Ｉｎｈは、ＥＣＬブロットにおけるシグナルが強く、或る特定の量のアシアロＮ−グリカンを示す。ローディング対照として、同じサンプルを、ノイラミニダーゼで処理し、グリカン構造からシアル酸含量全体を除去した。（分子量マーカー：ＭａｇｉｃＭａｒｋ（商標）ＸＰウェスタンタンパク質標準物質）。

【図8】シアリルトランスフェラーゼの存在下又は非存在下におけるＣＡＰ細胞に発現した組換えＣ１ ＩｎｈのＰＮＡレクチン免疫ブロットを示す図である。ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時のＣＡＰ細胞の組換えＣ１ ＩｎｈのＯ−結合型グリカンのシアリル化の量をＰＮＡレクチン免疫ブロットで試験した。ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）は、Ｏ−結合型グリカンのβ１−３結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＰＮＡレクチンブロットにおけるシグナルの低下は、Ｏ−グリカンのガラクトース残基のシアリル化のレベルの増加を示唆している。ＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現するＣＡＰ細胞の細胞培養上清から精製されたＣ１ Ｉｎｈは、Ｏ−グリカンの完全なシアリル化を示すシグナルを示していない。血漿由来のＣ１ Ｉｎｈであるベリナートにおいても同じことが当てはまる。（分子量マーカー：ＭａｇｉｃＭａｒｋ（商標）ＸＰウェスタンタンパク質標準物質）。

【図9】ＩＥＦ分析によるｒｈＣ１ Ｉｎｈアイソフォームパターンの比較を示す図である。様々なＣ１ Ｉｎｈの骨格が同一であるとき、ＩＥＦの変化は、シアル酸含量における変化による可能性が最も高い。付加的にＳＴ３Ｇａｌ４を発現するＣＡＰに発現したＣ１ Ｉｎｈは修飾型Ｃ１ Ｉｎｈとなり、非修飾型Ｃ１ Ｉｎｈに比べ、わずかだがアノードに向かって移動し、１分子当たりのシアル酸の総量がわずかに増加したことを示す。対照的に、付加的にＳＴ３Ｇａｌ１を発現すると、Ｃ１ Ｉｎｈはアノードに向かって大きく移動し、１分子当たりのシアル酸の総量の顕著な増加を示す。

【図10】ベリナートと比較した、付加的にＳＴ３Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３ＧＡＬ４を過剰発現し、又は過剰発現することなく発現するタンパク質のＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ Ｏ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析を示す図である。（Ａ）ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈサンプルの分析により、コア２構造及び末端ガラクトースを有するモノシアリル化Ｏ−グリカンがかなり多量であることが明らかとなっている。（Ｂ）ＳＴ３Ｇａｌ４の過剰発現と組み合わせたＣ１ Ｉｎｈの発現により、多量の、コア２構造及び末端ガラクトースを有するモノシアリル化Ｏ−グリカンが得られている。（Ｃ）ＳＴ３Ｇａｌ４及びＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現を組み合わせたＣ１ Ｉｎｈの発現により、モノ又はジシアリル化であるが、いずれの末端ガラクトース残基も含まないコア１のＯ−グリカン構造に向かっての移動を生じている。コア２構造は、わずかに検出可能である。（Ｄ）ベリナートのＯ−糖鎖分析は、末端ガラクトース残基を含まない、ほとんどがモノシアリル化であるコア１のＯ−グリカンの存在のみを示している。

【図11】ベリナートに比べ、ＳＴ３Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３ＧＡＬ４を過剰発現し、又は過剰発現することなくＣＡＰ細胞に発現したＣ１ ＩｎｈのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルの結果のサマリーを示す図である。同じグリカンの合計量に対する６つの主なグリカン種の量を示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより生じたグリカンフラグメント又は微量のシグナルはこの分析では使用されなかった。付加的にＳＴ３Ｇａｌ１又はＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現しないＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈサンプル、すなわちＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈにおいて、大部分のコア２構造を有するＯ−グリカンが検出可能である（Ｇａｌ１−３（Ｇａｌ１−ＧｌｃＮＡｃ１−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ＿コア２）（ｍ／ｚ ９８３）、又はＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−３（Ｇａｌ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（ｍ／ｚ １３４４）、Ｇａｌ１−３（ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（ｍ／ｚ １３４４）、及びＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−３（ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（ｍ／ｚ １７０６））。コア１構造は、ほとんど検出できていない。付加的にＳＴ３Ｇａｌ４を発現することにより、コア１構造に向かってわずかに移動した（ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−３ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ＿コア１）。興味深いことに、ＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現するＣＡＰ細胞におけるＣ１ Ｉｎｈの発現では、ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−３ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（コア１）のそれぞれＧａｌ１−３（ＮｅｕＡｃ２−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（ｍ／ｚ ８９５）及びＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−３（ＮｅｕＡｃ２−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（ｍ／ｚ １２５６）の発現のみを生じている。この図の「Ｈｅｘ」はヘキソースを示す。

【図12】様々なコア１及びコア２のＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカン構造を示す図である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析により、コア１又はコア２のＯ−グリカン構造のいずれかの２つの異なるクラスターにおいて、異なるサンプルのグループが明らかとなった。

【図13】シアリルトランスフェラーゼの存在下又は非存在下におけるＣＡＰ細胞に発現した組換えＨＧＦのＥＣＬ及びＰＮＡのレクチン免疫ブロットを示す図である。（Ａ）エリスリナ・クリスタ・ガリ（ＥＣＬ）レクチンは、Ｎ−結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＥＣＬブロットにおけるシグナルの消失は、シアリル化の量の増加を意味する。ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ３Ｇａｌ１／４の過剰発現により、Ｎ−結合型グリカンのシアリル化の増加が生じている一方で、ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現は、非修飾型Ｃ１ Ｉｎｈに比べ効果はない。（Ｂ）ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時のＣＡＰ細胞の組換えＨＧＦのシアリル化の量を、ＰＮＡレクチン免疫ブロットにより試験した。ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）は、Ｏ−結合型グリカンのβ１−３結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＰＮＡレクチンブロットにおけるシグナルの低下は、Ｏ−グリカンのガラクトース残基のシアリル化のレベルの増加を示唆する。ＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現するＣＡＰ細胞由来の細胞培養上清により、シグナルが顕著に低下する結果となり、Ｏ−グリカンのシアリル化の増加を示している。（分子量マーカー：ＭａｇｉｃＭａｒｋ（商標）ＸＰウェスタンタンパク質標準物質）。

【図14】ＳＴ３Ｇａｌ１のドメイン構造及び配列アライメントを示す図である。Ａ）ＳＴ３Ｇａｌ１のシアリルトランスフェラーゼのドメイン構造。ＴＭ、膜貫通ドメイン；Ｓｔｅｍ、ステム領域；Ｌ、シアリルモチーフＬ（長鎖）；シアリルモチーフＳ（短鎖）；３、シアリルモチーフＩＩＩ；ＶＳ、シアリルモチーフＶＳ（非常に短鎖）。ＬモチーフはＣＭＰ−Ｓｉａの結合に関与し、モチーフＳはＣＭＰ−Ｓｉａ及びアクセプターの結合に関与し、モチーフ３及びＶＳは触媒コンセンサス配列（catalytic consensus sequence）を含有し、またアクセプターの結合に関与する。Ｂ）ヒト、哺乳動物、鳥類、爬虫類、魚類、及びホヤ類由来のＳＴ３Ｇａｌ１のＣ末端配列のアライメント。全ての種に同一のアミノ酸残基は影付きの明灰色であり、ほとんどの種に同一のアミノ酸は暗灰色及び同様のアミノ酸のブロックは中間の灰色である。モチーフ３の触媒により活性したアミノ酸のコンセンサス配列は（Ｈ／Ｃ／Ｒ）（Ｙ／Ｈ／Ｆ）（Ｗ／Ｙ／Ｆ）（Ｅ／Ｄ／Ｈ／Ｙ）と読み取られる（下線部の対応する位置のアミノ酸が好ましい）。

【図15】シアリルトランスフェラーゼの存在下又は非存在下における２９３Ｆ細胞に発現した組換えＣ１ ＩｎｈのＥＣＬ及びＰＮＡのレクチンの免疫ブロットを示す図である。（Ａ）エリスリナ・クリスタ・ガリ（ＥＣＬ）レクチンは、Ｎ−結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出する。ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ３Ｇａｌ１／４の過剰発現により、Ｎ−結合型グリカンのシアリル化の増加を生じる一方で、ＳＴ３Ｇａｌ１のみの過剰発現は、非修飾型Ｃ１ Ｉｎｈに比べ効果はない。ノイラミニダーゼは、オリゴ糖由来のＮ−アセチル−ノイラミン酸残基の加水分解を触媒するため、ノイラミニダーゼ処理したサンプルは陽性対照として作用する。（Ｂ）ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時の２９３Ｆ細胞における組換えＣ１ Ｉｎｈのシアリル化の量を、ＰＮＡレクチン免疫ブロットにより試験した。ＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現する２９３Ｆ細胞由来の細胞培養上清では、シグナルの顕著な低下を生じ、Ｏ−グリカンのシアリル化の増加を示している。ノイラミニダーゼ処理したサンプルは陽性対照として使用する。（分子量マーカー：ＭａｇｉｃＭａｒｋ（商標）ＸＰウェスタンタンパク質標準物質）。

【図16】シアリルトランスフェラーゼの存在下又は非存在下におけるＣＨＯ−Ｋ１細胞において発現した組換えＣ１ ＩｎｈのＰＮＡレクチン免疫ブロットを示す図である。ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時のＣＨＯ−Ｋ１細胞における組換えＣ１ Ｉｎｈのシアリル化の量を、ＰＮＡレクチン免疫ブロットにより試験した。ＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞由来の細胞培養上清では、シグナルの顕著な低下を示し、ＣＨＯ−Ｋ１ Ｃ１ Ｉｎｈ対照細胞から精製したＣ１ Ｉｎｈに比べ、Ｏ−グリカンのシアリル化の増加を示している。同じタンパク質サンプルのウェスタンブロット分析をローディング対照として使用した。（分子量マーカー：ＭａｇｉｃＭａｒｋ（商標）ＸＰウェスタンタンパク質標準物質）。

【図17】シアリルトランスフェラーゼの存在下又は非存在下におけるＭＤＣＫ．１細胞に発現した組換えＣ１ ＩｎｈのＥＣＬ及びＰＮＡのレクチンの免疫ブロットを示す図である。（Ａ）エリスリナ・クリスタ・ガリ（ＥＣＬ）レクチンは、Ｎ−結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出する。ＭＤＣＫ．１細胞のＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現は、Ｎ−結合型グリカンのシアリル化の量において効果はない。（Ｂ）ＭＤＣＫ．１細胞におけるＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時の組換えＣ１ Ｉｎｈのシアリル化の量を、ＰＮＡレクチン免疫ブロットにより試験した。ＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現するＭＤＣＫ．１細胞由来の細胞培養上清では、シグナルの顕著な低下を示し、Ｏ−グリカンのシアリル化の増加を示している。（分子量マーカー：ＭａｇｉｃＭａｒｋ（商標）ＸＰウェスタンタンパク質標準物質）。

【発明を実施するための形態】

【0046】

本発明を更に以下の実施例において説明するが、それらに限定されない。

【実施例】

【0047】

実験手法：
細胞培養及び発酵
永久ヒト羊膜細胞の細胞株ＣＡＰ １Ｄ５を、既知組成の、６ｍＭの安定したグルタミン（biochrom、ドイツ）を補充した動物成分非含有のＣＡＰ−ＣＤＭ培地（CEVEC Pharmaceuticals、ドイツ）において、又は４ｍＭの安定したグルタミン（biochrom、ドイツ）を補充した血清非含有ＰＥＭ培地（Life Technologies）においてのいずれかの懸濁液において培養した。

【0048】

Life Technologies製の２９３Ｆ細胞を４ｍＭの安定したグルタミン（biochrom、ドイツ）を補充したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Life Technologies）の懸濁液において培養した。

【0049】

接着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ATCC、ＣＣＬ−６１）を１０％ＦＢＳ及び２ｍＭの安定したグルタミン（biochrom、ドイツ）を補充したＦ１２−Ｋ培地（Life Technologies）において培養した。

【0050】

接着性ＭＤＣＫ．１細胞（ATCC、ＣＲＬ−２９３５）を１０％ＦＢＳ及び２ｍＭの安定したグルタミン（biochrom、ドイツ）を補充した、ＥＭＥＭ培地（ATCC）又はＤＭＥＭ Ｆ−１２（ATCC）のいずれかにおいて培養した。

【0051】

ＣＡＰ細胞及び２９３Ｆ細胞を、振とうフラスコ（Corning、１２５ｍＬ（２５ｍＬ ｗｖ）又は３０００ｍＬ（１０００ｍＬ ｗｖ））において３７℃、５％ＣＯ_２、及び１８５ｒｐｍにて培養した。発酵の間、ＣＡＰ細胞に３日目、５日目、及び７日目に１０％ＣＡＰ−ＣＤＭフィード液（CEVEC Pharmaceuticals、ドイツ）及び４ｍＭの安定したグルタミン（biochrom、ドイツ）を与えた。接着性ＣＨＯ−Ｋ１及びＭＤＣＫ．１細胞を、６ｃｍ又は１０ｃｍの細胞培養皿（TPP）又は２２５ｃｍ^２の細胞培養皿（BD）において３７℃、５％ＣＯ_２にて培養した。

【0052】

クローニング
本発明において使用される細胞株の世代において、細胞を、糖構造修飾酵素であるＳＴ３Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４をコードする核酸構築物並びに特定の組換えタンパク質を用いて連続してヌクレオフェクトした。安定した細胞株のみを利用した。表１には、作製した全ての細胞株を挙げている。

【0053】

【表1】

【0054】

ＳＴ３Ｇａｌ１のｃＤＮＡを設計するため、前駆体タンパク質及び成熟タンパク質の配列情報は、データベースエントリーＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１１２０１（配列番号１）に基づいたものであった。クローニングにおいて、ＣｌａＩ制限部位及びＫｏｚａｋ配列をヒトＳＴ３Ｇａｌ１ ｃＤＮＡの開始コドンの５’末端側に付加し、ＥｃｏＲＶ制限部位を終止コドンの３’末端側に付加して、ｐＳｔｂｌ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶ−ＭＣＳ（−）ベクターのＣｌａＩ制限部位とＥｃｏＲＶ制限部位との間に挿入し、発現プラスミドｐＳｔｂｌ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶ−ＳＴ３Ｇａｌ１を得た。このベクターは、目的の遺伝子の発現を誘導するＣＭＶプロモーターに続き、改良型のスプライシング介在性ｍＲＮＡ輸送のためのＳＶ４０イントロン、及び目的の遺伝子を挿入するためのマルチクローニング部位を含有する。選択マーカー（ピューロマイシン）は、ヒトユビキチン（ＵｂＣ）プロモーターにより誘導される。ｃＤＮＡ合成はＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、Life Technologies）にて行われた。

【0055】

ＳＴ３Ｇａｌ４ ｃＤＮＡを設計するため、前駆体タンパク質及び成熟タンパク質の配列情報は、データベースエントリーＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１１２０６（配列番号２）に基づいたものであった。クローニング用に、ＣｌａＩ制限部位及びＫｏｚａｋ配列をヒトＳＴ３Ｇａｌ４ ｃＤＮＡの開始コドンの５’末端側に付加し、ＥｃｏＲＶ制限部位を終止コドンの３’末端側に付加して、ｐＳｔｂｌ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶ−ＭＣＳ（−）ベクターのＣｌａＩ制限部位とＥｃｏＲＶ制限部位との間に挿入し、発現プラスミドｐＳｔｂｌ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶ−ＳＴ３Ｇａｌ４を得た。ｃＤＮＡ合成はＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、Life Technologies）にて行われた。

【0056】

ヌクレオフェクション及びプール作製
ヌクレオフェクションを、製造業者のプロトコルに従い、ヌクレオフェクター（LONZA）を使用し、適切なヌクレオフェクターキット（ＫｉｔＶ；ＣＡＰ細胞、２９３Ｆ及びＣＨＯ又はＫｉｔＴ；ＭＤＣＫ．１細胞）を用いて行った。つまり、培養物の対数増殖期の間に、１×１０^７個の細胞を遠心分離（１５０ｇ、５分間）により回収し、１００μｌの完全ヌクレオフェクター溶液に再懸濁し、合計５μｇのプラスミドと混合した。ヌクレオフェクションを、Ｘ００１プログラム（ＣＡＰ細胞及び２９３Ｆ細胞）、Ｕ０２４プログラム（ＣＨＯ−Ｋ１）、又はＰ０２９プログラム（ＭＤＣＫ．１）を用いて行った。パルス処理後、細胞を完全細胞培養培地に戻した。細胞は前述同様に培養した。

【0057】

安定したプールを作製するため、７２時間〜９６時間のヌクレオフェクション後の細胞を、５μｇ／ｍｌのブラストサイジン（治療用タンパク質）及び／又は２００μｇ／ｍｌのネオマイシン（ｐＳｔｂｌ−ｎｅｏ−ＣＭＶ−ＳＴ３Ｇａｌ４）及び／又は２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ｐＳｔｂｌ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶ−ＳＴ３Ｇａｌ１）を用いて選抜した。

【0058】

ラットにおける組換えＣ１ Ｉｎｈの薬物動態試験
ベリナート（ヒト血漿由来のＣ１ Ｉｎｈ）又はＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ、ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ４若しくはＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ ＳＴ３Ｇａｌ１／ＳＴ３ＧＡＬ４に発現した精製組換えＣ１ Ｉｎｈのいずれかをラットに注射して比較薬物動態試験を行った。

【0059】

雌のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに１０ｍｇ／ｋｇ用量のｉ．ｖ．ボーラス注射後のｈＣ１ Ｉｎｈの残留濃度を、様々な時間点：５分、１０分、１５分、２０分、３０分、６０分、２時間、４時間、６時間、及び２４時間にて決定した。

【0060】

図３において、組換えＣ１ Ｉｎｈ又はベリナートの単回静脈内注射後のＣ１ Ｉｎｈの血清濃度を示す。残留Ｃ１ Ｉｎｈの割合をＥＬＩＳＡにより検出した。各動物において、Ｃ１ Ｉｎｈ濃度を５分＝１００％の濃度に正規化した。値を当て嵌め、注射後の時間に対してプロットした。各群（ｎ＝４、ベリナートのｎ＝７を除く）において、代表的な動物の１例のグラフを示す。図５において、Ｃ１ Ｉｎｈの様々な形態に対する曲線下面積（ＡＵＣ）の計算結果を示す。

【0061】

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量スペクトル分析
サンプルを脱塩するため、１００μｇのタンパク質を、クロロホルム−メタノールを用いて２回析出し、真空回転により乾燥させた。グリカンを５０℃にて一晩インキュベーションすることによりアルゴン下の５０μＬのＮａＢＨ_４（５０ｍＭのＮａＯＨ中１Ｍ）にβ脱離した。Ｄｏｗｅｘ５０×８（Ｈ^＋）を用いて脱塩し、酸性メタノールからメチルエステルを共蒸留することによりホウ酸塩を除去した後、乾燥させた残基を当該技術分野において知られている通りにメチル化した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳをＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ装置（Bruker Daltonics）で行った。マトリクス（５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ中α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を用いて１：１に混合することによってメチル化したグリカンアルジトールをステンレス鋼の標的に塗布した。分析は、ＭＳ１及びＭＳ２（Ｐｏｓｔ−Ｓｏｕｒｃｅ−Ｄｅｃａｙ−Ｍｏｄｕｓ）の陽イオン検出により行われた。様々なグリカン種の同定は、ｉ）単糖組成物に関する情報が得られる分子イオン、及びｉｉ）ＭＳ２分析のフラグメント化（Ｂ、Ｃ、Ｙ、及びＺイオン）に基づいたものであった。

【0062】

ＰＮＧａｓｅＦ消化
ＰＮＧａｓｅＦは、Ｎ−結合型糖タンパク質の最深部のＧｌｃＮＡｃとアスパラギン残基との間を切断するアミダーゼである。それゆえ、Ｃ１ Ｉｎｈタンパク質をＰＮＧａｓｅＦで処理した後、タンパク質の骨格及びＯ−結合型グリカンは残存する。血漿由来のヒトＣ１ ＩｎｈとＣＡＰ細胞に発現したＣ１ Ｉｎｈとの間のタンパク質骨格が等しいものであるとして、ＰＮＧａｓｅＦの処理がＯ−グリカンの構造に関する間接的な情報を担っている。

【0063】

ＰＮＧａｓｅＦ消化は、製造業者の説明書に記載の通りに行われた。つまり、１００ｎｇの精製タンパク質を５００ＵのＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ）と１時間、３７℃にてインキュベーションした。続いて、サンプルを、製造業者の説明書に従い、還元条件下においてＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４％〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分離した。分離したタンパク質をブロットモジュール（Invitrogen）（３０Ｖ、６０分間、室温）を介してＡｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬ膜（１００Ｖ、６０分間、室温）に移した。膜をＰＢＳＴＢ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＢＳＡを補充）を用いて１時間、室温にてブロッキングした。その後、膜をＰＢＳＴＢで１：１００００に希釈したマウスモノクローナルＣ１ Ｉｎｈ特異的ＨＲＰ標識抗体とともにインキュベーションした。膜をＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充）を用いて洗浄後、タンパク質をＰｉｅｒｃｅ ＥＣＬ ＷＢ基質キットを用いて化学発光検出器（INTAS）により検出した。

【0064】

レクチン免疫ブロット法
レクチンは、特定の炭水化物構造に結合するタンパク質である。それゆえ、ビオチン結合レクチンを使用して、Ｎ−結合型及びＯ−結合型グリカンを分析することができる。エリスリナ・クリスタ・ガリ（ＥＣＬ）レクチンは、Ｎ−結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出し、ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）はＯ−結合型グリカンのβ１−３結合型末端ガラクトースを検出し、サンブカス・ニグラ（Sambucus nigra：西洋ニワトコ）凝集素（ＳＮＡ）は２，６結合型シアル酸に優先的に結合し、一方マキア・アムレンシス（Maackia amurensis：イヌエンジュ）レクチン（ＭＡＬ）は２，３結合型シアル酸に優先的に結合する。

【0065】

ＳＴ３Ｇａｌ１及び／又はＳＴ３Ｇａｌ４を共発現し、又は共発現することなく、精製タンパク質又は細胞培養上清を上記のように分離し、Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬニトロセルロース膜（GE healthcare）にブロッティングした。膜をＰＢＳＴＢ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＢＳＡを補充）を用いて１時間、室温にてブロッキングした。その後、膜をＰＢＳＴＢで１：２０００（ＭＡＬ １：４００）に希釈したレクチンとともにインキュベーションした。ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充）を用いて膜を洗浄後、膜を、ストレプトアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼを用いて１時間、室温にて染色した（ＰＢＳＴＢで１：１０００に希釈）。ＨＲＰシグナルを抗ストレプトアビジンＩｇＧ及び抗ＩｇＧ−ＨＲＰを用いて増幅させた。タンパク質をＰｉｅｒｃｅ ＥＣＬ ＷＢ基質キットを用いて化学発光検出器（INTAS）により検出した。

【0066】

ＩＥＦ分析
等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行い、ＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ細胞又はＳＴ３Ｇａｌ４及び／又はＳＴ３Ｇａｌ１を用いてトランスフェクトしたＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ細胞それぞれから精製したＣ１ Ｉｎｈの等電点（ｐＩ）を分析した。シアリル化の割合は、所与のタンパク質酸性度と、それゆえそのｐＩと相関する。ＩＥＦ分析は、製造業者のプロトコル（Invitrogen）に従い行われた。つまり、５μｇの精製タンパク質をｐＨ３〜ｐＨ７のゲルに充填し、電気泳動（１時間１００Ｖ、１時間２００Ｖ、３０分間５００Ｖ）を行った。タンパク質を製造業者のプロトコル（Invitrogen）に従い、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。

【0067】

実施例１：
プロテアーゼ阻害因子であるＣ１エステラーゼ阻害因子（Ｃ１ Ｉｎｈ）は、セルピンスーパーファミリーに属する。その主な機能は、補体系を阻害して自然に活性化するのを阻止する。５００ａａのタンパク質は、７つの予測Ｎ−グリカン及び８つの予測Ｏ−結合型グリカンと高度にグリコシル化される。

【0068】

構築物のゲノムへの安定した組込みを促進させるため、ヒト組換えＣ１阻害因子（ｒｈＣ１ Ｉｎｈ、配列番号３）（ＣＡＰ−Ｃ１ Ｉｎｈ）を発現するよう予め安定してトランスフェクトしたヒト羊膜細胞の細胞株ＣＡＰ １Ｄ５の細胞を、ＳｃａＩで直鎖状にしたＳＴ３Ｇａｌ４をコードするベクターでヌクレオフェクトした。ベクターは、直鎖状の構築物のゲノムへの安定した組込みを選択するための薬剤発現カセットを含有する。プール作製後、得られた安定したＣＡＰ−Ｃ１ Ｉｎｈ−ＳＴ３Ｇａｌ４プールに、限界希釈によるシングルセルクローニングを行った。選抜したクローンを分析し、ＳＴ３Ｇａｌ４の発現を証明した。次いで、ＳＴ３Ｇａｌ４を発現するＣＡＰシングルセルクローンを、ＳＴ３Ｇａｌ１遺伝子をコードする遺伝子を用いて更にヌクレオフェクトした。細胞を、抗生物質を用いて選抜し、安定してｒｈＣ１ Ｉｎｈ、ヒトＳＴ３Ｇａｌ４、及びＳＴ３Ｇａｌ１（ＣＡＰ−Ｃ１ Ｉｎｈ−ＳＴ３Ｇａｌ１／４）を共発現する細胞のプールを得た。

【0069】

十分な量の組換えＣ１ Ｉｎｈを作製するため、ヒトＣ１ Ｉｎｈを過剰発現する作製済みのＣＡＰ−Ｃ１ Ｉｎｈ細胞株を実験手法に記載の通りに培養した。続いて、Ｃ１ Ｉｎｈを以下の細胞株の細胞培養上清から以下に記載の通りに精製した：ＣＡＰ−Ｃ１ Ｉｎｈ、ＣＡＰ−Ｃ１ Ｉｎｈ−ＳＴ３Ｇａｌ４、及びＣＡＰ−Ｃ１ Ｉｎｈ−ＳＴ３Ｇａｌ１／４（プールＡ及びＢ）。

【0070】

細胞培養上清又は精製組換えＣ１ Ｉｎｈ及びベリナートを分析し、糖構造を決定した。

【0071】

Ｃ１ Ｉｎｈ特異的抗体を用いた免疫ブロット法（図６）により、血漿から精製したＣ１ Ｉｎｈ（ベリナート）は電気泳動中の移動が速く、ＣＡＰ細胞由来の組換えＣ１ Ｉｎｈに比べ質量が消失していることを示すことが明らかとなった。ＳＴ３Ｇａｌ４と組み合わせたシアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現も同様に移動速度が上昇している。この作用は、ＰＮＧａｓｅ消化によってタンパク質の骨格からＮ−結合型グリカンを切断した後に更により明らかとなり、移動が速いことは、実際には残存するＯ−結合型グリカンのサイズの違いによることを示している。

【0072】

Ｎ−結合型グリカンのシアリル化の割合を決定するため、ＥＣＬレクチン免疫ブロットが行われた。エリスリナ・クリスタ・ガリ（ＥＣＬ）レクチンはＮ−結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＥＣＬブロットにおけるシグナルの消失は、シアリル化の量の増加を意味する。図７に示されるように、ベリナートのＮ−結合型グリカンはほぼ完全にシアリル化されている。ＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現するＣＡＰ細胞由来のＣ１ ＩｎｈのＮ−グリカンも同様にシアリル化され、ＳＴ３Ｇａｌ１／４を過剰発現するＣＡＰ細胞由来のＣ１ Ｉｎｈでは、アシアロＮ−グリカンの量がわずかに高いことを示す。比較すると、シアリルトランスフェラーゼを過剰発現しないＣＡＰ細胞から精製したＣ１ ＩｎｈではＥＣＬブロットにおいて強いシグナルが得られ、アシアロＮ−グリカンの量が多いことを示す。

【0073】

ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時のＣＡＰ細胞の組換えＣ１ ＩｎｈのＯ−結合型グリカンのシアリル化の割合を最初にＰＮＡレクチン免疫ブロットにより試験した。ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）はＯ−結合型グリカンのβ１−３結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＰＮＡレクチンブロットにおけるシグナルの消失は、Ｏ−グリカンのガラクトース残基のシアリル化のレベルの増加を示唆している。図８に示されるように、ＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現するＣＡＰ細胞の細胞培養上清から精製されたＣ１ Ｉｎｈでは、Ｏ−グリカンの完全なシアリル化を示すシグナルは示されていない。血漿由来のＣ１ Ｉｎｈであるベリナートにおいても同じことが当てはまる。

【0074】

レクチンブロットからの結果は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）により確定することができた。様々なＣ１ Ｉｎｈの骨格が同一であるとして、ＩＥＦの変化は、シアル酸含量における変化による可能性が最も高い。図９に示されるように、付加的にＳＴ３Ｇａｌ４を発現することにより、得られた修飾型Ｃ１ Ｉｎｈは、アノードに向かって非常にわずかであるが移動し、１分子当たりのシアル酸の総量においてわずかに増加したことを示す。対照的に、付加的にＳＴ３Ｇａｌ１を発現することにより、Ｃ１ Ｉｎｈがアノードに向かう著しい移動を生じ、シアル酸の総量の顕著な増加を示す。

【0075】

図１０において、Ｏ−結合型グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量スペクトルの詳細を示す。図１１において、これらのデータをまとめ、様々なＯ−グリカン構造のピーク強度を説明する。図１２は得られたデータの説明を示す。付加的にＳＴ３Ｇａｌ１又はＳＴ３Ｇａｌ４を過剰発現しないＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈサンプル、すなわちＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈにおいて、検出可能なＯ−グリカンの７５％はコア２構造であり、末端ガラクトース残基（Ｇａｌ１−３（Ｇａｌ１−ＧｌｃＮＡｃ１−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ＿コア２）（ｍ／ｚ ９８３）、又はＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−３（Ｇａｌ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（ｍ／ｚ １３４４）、Ｇａｌ１−３（ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（ｍ／ｚ １３４４）、及びＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−３（ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（ｍ／ｚ １７０６））を伴わないシアリル化Ｏ−グリカンは３５％に過ぎなかった。コア１構造はほとんど検出できていない。付加的にＳＴ３Ｇａｌ４を発現することにより、コア１構造に向かう移動を生じる（６８．７％）（ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−３ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ＿コア１）。興味深いことに、ＳＴ３Ｇａｌ１を過剰発現するＣＡＰ細胞のＣ１ Ｉｎｈの発現は、コア１のＯ−グリカンの排他的な発現を生じ（９９．１％）、任意の末端ガラクトース残基、特に（ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−３ＧａｌＮＡｃ−ｏｌのそれぞれＧａｌ１−３（ＮｅｕＡｃ２−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（ｍ／ｚ ８９５）及びＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌ１−３（ＮｅｕＡｃ２−６）ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ（ｍ／ｚ １２５６）を伴わずにほぼ完全にシアリル化される（９８．５％）。

【0076】

様々な糖鎖改良型組換えＣ１ Ｉｎｈ、ＣＡＰ−Ｃ１ Ｉｎｈ−ＳＴ３Ｇａｌ４、及びＣＡＰ−Ｃ１ Ｉｎｈ−ＳＴ３Ｇａｌ１／４対ＣＡＰ細胞由来の組換えＣ１ Ｉｎｈ（野生型）、又は血漿由来のＣ１ Ｉｎｈ（ベリナート）の血清半減期を決定するため、薬物動態試験を行った。

【0077】

様々なサンプルの濃度時間曲線を正規化した後、様々なサンプルクラスターが形状及び曲線の伸び（progression）がほぼ同じである２つのグループに分けられることが明らかとなっている：一方は、ＣＡＰ−Ｃ１ Ｉｎｈ−ＳＴ３Ｇａｌ４と合わせて、付加的に任意のシアリルトランスフェラーゼを発現しないＣＡＰ Ｃ１ Ｉｎｈ及びもう一方は、血漿由来のヒトＣ１ Ｉｎｈであるベリナートと合わせたＣＡＰ−Ｃ１ Ｉｎｈ−ＳＴ３Ｇａｌ１／４（図３）。各グループ内の物質は、同じ薬物動態に従って同様に血流から排除されている。

【0078】

ＳＴ３Ｇａｌ４の過剰発現のみでは、組換えにより発現したＣ１ Ｉｎｈの血清半減期に有益な作用がない一方で、付加的にＳＴ３Ｇａｌ１が共発現することにより、血清半減期が約６倍高まった（図４）。ＡＵＣ、ひいてはバイオアベイラビリティは非修飾型Ｃ１ Ｉｎｈに比べおよそ６倍増大し、ベリナートにおいて測定されたＡＵＣ値と同等である（図５）。つまり、これらの結果により、糖タンパク質を示すＮ−グリカン及びＯ−グリカンにおいて、Ｏ−グリカンの広範囲のシアリル化はＮ−グリカンにおけるものと同様に重要であることが指摘される。

【0079】

実施例２：
肝細胞成長因子は、成熟した実質性肝細胞における強力な分裂促進因子であり、肝再生因子であると考えられ、組織及び細胞型の広域の成長因子として作用する。７２８ａａの大きさのタンパク質は、４つの予測Ｎ−グリカン及び１つの予測Ｏ−結合型グリカンを含有する。

【0080】

構築物のゲノムへの安定した組込みを促進するため、ヒト組換え肝細胞の成長因子（配列番号４）を安定して発現するＣＡＰ １Ｄ５細胞を、ＳｃａＩで直鎖状にした、ＳＴ３Ｇａｌ４、ＳＴ３Ｇａｌ１、又はＳＴ３Ｇａｌ４及びＳＴ３Ｇａｌ１をコードするベクターのいずれかを用いてヌクレオフェクトした。ベクターは、細胞の選抜を促進し、直鎖状の構築物をゲノムに安定して組み込ませる薬剤発現カセットを含有する。プール作製後に得られた、安定したＣＡＰ細胞のプールであるＣＡＰ−ＨＧＦ、ＣＡＰ−ＨＧＦ−ＳＴ３Ｇａｌ１、ＣＡＰ−ＨＧＦ−ＳＴ３Ｇａｌ４、及びＣＡＰ−ＨＧＦ−ＳＴ３Ｇａｌ１／４を実験手法に記載の通りに培養した。組換えヒトＨＧＦを含有する細胞培養上清を、ＥＣＬ及びＰＮＡのレクチンブロットにより試験し、既存のＮ−結合型糖構造及びＯ−結合型糖構造を決定した。

【0081】

エリスリナ・クリスタ・ガリ（ＥＣＬ）レクチンは、Ｎ−結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＥＣＬブロットにおけるシグナルの消失は、シアリル化の量の増加を意味する。図１３に示されるように、ＳＴ３Ｇａｌ４又はＳＴ３Ｇａｌ１／４の過剰発現により、Ｎ−結合型グリカンのシアリル化の増加を生じたが、ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現効果はなかった。

【0082】

ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時のＣＡＰ細胞の組換えＨＧＦのシアリル化の量を、ＰＮＡレクチン免疫ブロットにより試験した。ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）は、Ｏ−結合型グリカンのβ１−３結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＰＮＡレクチンブロットにおけるシグナルの低下は、Ｏ−グリカンのガラクトース残基のシアリル化のレベルの増加を示唆する。図１３に示されるように、ＳＴ３Ｇａｌ１のみ又はＳＴ３Ｇａｌ４を組み合わせての過剰発現は、組換えＨＧＦのＯ−グリカンのシアリル化の顕著な増加を生じた。

【0083】

実施例３：
以下の実験は、シアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時の糖タンパク質のＯ−グリカンのシアリル化において観察された増加が、組換えタンパク質の製造に利用される多様な細胞株又は製剤の製造及び／又はバイオメディカル研究のためのウイルスにより共有される一般的な特徴であるかどうかを検討するために行われた。

【0084】

不死化ヒト胚腎臓細胞である２９３Ｆ細胞（Life Technologies、Ｒ−９７０−０７）を、構築物のゲノムへの安定した組込みを促進するため、ＳｃａＩで直鎖状にした、ＳＴ３Ｇａｌ１、又はＳＴ３Ｇａｌ１及びＳＴ３Ｇａｌ４をコードするベクターのいずれかを用いてヌクレオフェクトした。ベクターは、細胞の選抜を促進し、直鎖状の構築物をゲノムに安定して組み込ませる薬剤発現カセットを含有する。プール作製後に得られた、安定した２９３Ｆ細胞のプールである２９３Ｆ−ＳＴ３Ｇａｌ１及び２９３Ｆ−ＳＴ３Ｇａｌ１／４、及び野生型２９３Ｆ細胞を、ｈＣ１ Ｉｎｈをコードする遺伝子を用いて更にヌクレオフェクトした。細胞を、抗生物質を用いて選抜し、ｉ）ｒｈＣ１ Ｉｎｈ、ｉｉ）ｒｈＣ１ Ｉｎｈ及びヒトＳＴ３Ｇａｌ１、ｉｉｉ）ｒｈＣ１ Ｉｎｈ、ヒトＳＴ３Ｇａｌ１、及びヒトＳＴ３Ｇａｌ４を安定して発現する細胞のプールを得た。Ｃ１ Ｉｎｈを、方法の章で記載の細胞培養上清を含有するＣ１ Ｉｎｈから精製し、ＥＣＬ及びＰＮＡのレクチンブロットにより試験し、既存のＮ−結合型糖構造及びＯ−結合型糖構造を決定した。

【0085】

エリスリナ・クリスタ・ガリ（ＥＣＬ）レクチンは、Ｎ−結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＥＣＬブロットにおけるシグナルの消失は、シアリル化の量の増加を意味する。図１５に示されるように、ＳＴ３Ｇａｌ１／４の過剰発現により、Ｎ−結合型グリカンのシアリル化の増加を生じたが、ＳＴ３Ｇａｌ１のみの過剰発現効果はなかった。

【0086】

ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時の２９３Ｆ細胞の組換えＣ１ Ｉｎｈのシアリル化の量を、ＰＮＡレクチン免疫ブロットにより試験した。ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）は、Ｏ−結合型グリカンのβ１−３結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＰＮＡレクチンブロットにおけるシグナルの低下は、Ｏ−グリカンのガラクトース残基のシアリル化のレベルの増加を示唆する。図１５に示されるように、ＳＴ３Ｇａｌ１のみ又はＳＴ３Ｇａｌ４を組み合わせての過剰発現は、組換えヒトＣ１ＩｎｈのＯ−グリカンのシアリル化の顕著な増加を生じた。

【0087】

実施例４：
ＣＨＯ−Ｋ１（ATCC、ＣＣＬ−６１）細胞株を、成体のチャイニーズハムスターの卵巣の生検試料から出発した親ＣＨＯ細胞株からの部分クローンとして得た。

【0088】

ヒトシアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時のＯ−結合型グリカンのシアリル化において観察された増加が、非ヒト哺乳動物の細胞株においても生じるかについて検討するため、ヒトＣ１ Ｉｎｈを、シアリルトランスフェラーゼＳＴ３Ｇａｌ１の存在下又は非存在下において上記の細胞に発現させた。

【0089】

構築物のゲノムへの安定した組込みを促進するためＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＳｃａＩで直鎖状にしたＳＴ３Ｇａｌ１をコードするベクターを用いてヌクレオフェクトした。ベクターは、細胞の選抜を促進し、直鎖状の構築物をゲノムに安定して組み込ませる薬剤発現カセットを含有する。プール作製後に得られた、安定したＣＨＯ−Ｋ１細胞プール、ＣＨＯ−ＳＴ３Ｇａｌ１、及び野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ｈＣ１ Ｉｎｈをコードする遺伝子を用いて更にヌクレオフェクトした。細胞を、抗生物質を用いて選抜し、ｉ）ｒｈＣ１ Ｉｎｈ、ｉｉ）ｒｈＣ１ Ｉｎｈ、及びヒトＳＴ３Ｇａｌ１を安定して発現する細胞のプールを得た。

【0090】

細胞を方法の章に記載の通りに増殖させた。細胞の作製において、ヒトＣ１ Ｉｎｈ細胞を含有する培養上清を１０ｃｍの細胞培養皿に播種し、細胞を播種後の３日目に１×ＰＢＳで広範囲に洗浄し、ウシ胎児血清を除去した後、新鮮な血清非含有培地を添加した。４日後に、細胞培養上清を回収し、細胞及び細胞片を遠心分離により取り出し、０．２２μｍのフィルターにより濾過した。Ｃ１ Ｉｎｈを方法の章に記載の通りに精製した。

【0091】

ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時のＣＨＯ−Ｋ１細胞の組換えＣ１ ＩｎｈのＯ−グリカンのシアリル化の量を、ＰＮＡレクチン免疫ブロットにより試験した。ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）は、Ｏ−結合型グリカンのβ１−３結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＰＮＡレクチンブロットにおけるシグナルの低下は、Ｏ−グリカンのガラクトース残基のシアリル化のレベルの増加を示唆する。図１６に示されるように、ＳＴ３Ｇａｌ１のみの過剰発現により、組換えヒトＣ１ ＩｎｈのＯ−グリカンのシアリル化の顕著な増加を生じた。

【0092】

実施例５：
イヌＭＤＣＫ．１細胞（ATCC、ＣＲＬ−２９３５）を安定してトランスフェクトした。得られた安定したＭＤＣＫ．１細胞プール、ＭＤＣＫ．１−ＳＴ３Ｇａｌ１、及び野生型ＭＤＣＫ．１細胞を更に安定してトランスフェクトし、ｉ）ｒｈＣ１ Ｉｎｈ、ｉｉ）ｒｈＣ１ Ｉｎｈ、及びヒトＳＴ３Ｇａｌ１を安定して発現する細胞のプールを得た。

【0093】

ＭＤＣＫ．１細胞を方法の章に記載の通りに増殖させた。細胞の作製において、ヒトＣ１ Ｉｎｈ細胞を含有する培養上清を、２２５ｃｍ^２の細胞培養皿に播種し、細胞を播種後の２日目に、１ｘＰＢＳで広範囲に洗浄し、ウシ胎児血清を除去した後、新鮮な血清非含有培地を添加した。５日後に細胞培養上清を回収し、細胞及び細胞片を遠心分離により取り出し、０．２２μｍのフィルターにより濾過した。Ｃ１ Ｉｎｈを方法の章に記載の通りに精製し、ＥＣＬ及びＰＮＡのレクチンブロットにより試験し、既存のＮ−結合型糖構造及びＯ−結合型糖構造を決定した。

【0094】

エリスリナ・クリスタ・ガリ（ＥＣＬ）レクチンは、Ｎ−結合型グリカンのβ１−４結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＥＣＬブロットにおけるシグナルの消失は、シアリル化の量の増加を意味する。図１７に示されるように、ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現は、Ｎ−結合型グリカンのシアリル化の増加を生じなかった。

【0095】

ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現時のＭＤＣＫ．１細胞の組換えＣ１ ＩｎｈのＯ−グリカンのシアリル化の量を、ＰＮＡレクチン免疫ブロットにより試験した。ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）は、Ｏ−結合型グリカンのβ１−３結合型末端ガラクトースを検出する。それゆえ、ＰＮＡレクチンブロットにおけるシグナルの低下は、Ｏ−グリカンのガラクトース残基のシアリル化のレベルの増加を示唆する。図１７に示されるように、ＳＴ３Ｇａｌ１のみの過剰発現により、組換えヒトＣ１ ＩｎｈのＯ−グリカンのシアリル化の顕著な増加を生じた。

【0096】

考察：
上記に示す実験において、ＣＭＰ−シアル酸からガラクトース含有基質までのシアル酸の移動を触媒するＳＴ３Ｇａｌ１を、単独又はＳＴ３Ｇａｌ４と組み合わせたいずれかにおいて、哺乳動物の細胞に過剰発現させた。

【0097】

ＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現は、共発現したＯ−グリコシル化組換えタンパク質のほぼ完全なシアリル化を生じた。さらに、ＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンの不均一性は顕著に減少した。

【0098】

驚くべきことに、ＳＴ３Ｇａｌ４のみの過剰発現は、試験した糖タンパク質の薬物動態プロファイルに効果はなく、一方で付加的なＳＴ３Ｇａｌ１の過剰発現及びＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンのシアリル化の割合において得られた増加が、血清半減期を約６倍増大させた。

【0099】

薬物動態プロファイルを改良するために治療用タンパク質のグリカン構造を修飾することは、非常に強力な手段の１つである。本発明の場合、治療用タンパク質の特に２つの共通する弱点、１つ目は血清半減期の限定、及び２つ目は糖鎖構造の不均一性に対処している。これは、ＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリカンのほぼ完全なシアリル化を示す糖タンパク質の分泌を生じるＳＴ３Ｇａｌ１酵素の強制的な発現により実現することができる。

【0100】

本発明は、一宿主由来の特定の一細胞株に限定されず、動物細胞株の広範囲に適用可能である。さらに、本発明は糖タンパク質の特定の一グループに制約されず、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ Ｏ−結合型グリカンを含有する広範囲の糖タンパク質、例えば成長因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、抗体フラグメント、血液凝固因子、又はプロテアーゼ阻害因子に適用可能である。

【0101】

本発明は以下のアミノ酸及びヌクレオチド配列に関する。

【0102】

配列番号：１
ヒトＳＴ３Ｇａｌ１
MVTLRKRTLK VLTFLVLFIF LTSFFLNYSH TMVATTWFPK QMVLELSENL KRLIKHRPCT 60
CTHCIGQRKL SAWFDERFNQ TMQPLLTAQN ALLEDDTYRW WLRLQREKKP NNLNDTIKEL 120
FRVVPGNVDP MLEKRSVGCR RCAVVGNSGN LRESSYGPEI DSHDFVLRMN KAPTAGFEAD 180
VGTKTTHHLV YPESFRELGD NVSMILVPFK TIDLEWVVSA ITTGTISHTY IPVPAKIRVK 240
QDKILIYHPA FIKYVFDNWL QGHGRYPSTG ILSVIFSMHV CDEVDLYGFG ADSKGNWHHY 300
WENNPSAGAF RKTGVHDADF ESNVTATLAS INKIRIFKGR 340

【0103】

配列番号：２
ヒトＳＴ３Ｇａｌ４
MVSKSRWKLL AMLALVLVVM VWYSISREDR YIELFYFPIP EKKEPCLQGE AESKASKLFG 60
NYSRDQPIFL RLEDYFWVKT PSAYELPYGT KGSEDLLLRV LAITSSSIPK NIQSLRCRRC 120
VVVGNGHRLR NSSLGDAINK YDVVIRLNNA PVAGYEGDVG SKTTMRLFYP ESAHFDPKVE 180
NNPDTLLVLV AFKAMDFHWI ETILSDKKRV RKGFWKQPPL IWDVNPKQIR ILNPFFMEIA 240
ADKLLSLPMQ QPRKIKQKPT TGLLAITLAL HLCDLVHIAG FGYPDAYNKK QTIHYYEQIT 300
LKSMAGSGHN VSQEALAIKR MLEMGAIKNL TSF 333

【0104】

配列番号：３
ヒトＣ１ Ｉｎｈ
MASRLTLLTL LLLLLAGDRA SSNPNATSSS SQDPESLQDR GEGKVATTVI SKMLFVEPIL 60
EVSSLPTTNS TTNSATKITA NTTDEPTTQP TTEPTTQPTI QPTQPTTQLP TDSPTQPTTG 120
SFCPGPVTLC SDLESHSTEA VLGDALVDFS LKLYHAFSAM KKVETNMAFS PFSIASLLTQ 180
VLLGAGENTK TNLESILSYP KDFTCVHQAL KGFTTKGVTS VSQIFHSPDL AIRDTFVNAS 240
RTLYSSSPRV LSNNSDANLE LINTWVAKNT NNKISRLLDS LPSDTRLVLL NAIYLSAKWK 300
TTFDPKKTRM EPFHFKNSVI KVPMMNSKKY PVAHFIDQTL KAKVGQLQLS HNLSLVILVP 360
QNLKHRLEDM EQALSPSVFK AIMEKLEMSK FQPTLLTLPR IKVTTSQDML SIMEKLEFFD 420
FSYDLNLCGL TEDPDLQVSA MQHQTVLELT ETGVEAAAAS AISVARTLLV FEVQQPFLFV 480
LWDQQHKFPV FMGRVYDPRA 500

【0105】

配列番号：４
ヒトＨＧＦ
MWVTKLLPAL LLQHVLLHLL LLPIAIPYAE GQRKRRNTIH EFKKSAKTTL IKIDPALKIK 60
TKKVNTADQC ANRCTRNKGL PFTCKAFVFD KARKQCLWFP FNSMSSGVKK EFGHEFDLYE 120
NKDYIRNCII GKGRSYKGTV SITKSGIKCQ PWSSMIPHEH SFLPSSYRGK DLQENYCRNP 180
RGEEGGPWCF TSNPEVRYEV CDIPQCSEVE CMTCNGESYR GLMDHTESGK ICQRWDHQTP 240
HRHKFLPERY PDKGFDDNYC RNPDGQPRPW CYTLDPHTRW EYCAIKTCAD NTMNDTDVPL 300
ETTECIQGQG EGYRGTVNTI WNGIPCQRWD SQYPHEHDMT PENFKCKDLR ENYCRNPDGS 360
ESPWCFTTDP NIRVGYCSQI PNCDMSHGQD CYRGNGKNYM GNLSQTRSGL TCSMWDKNME 420
DLHRHIFWEP DASKLNENYC RNPDDDAHGP WCYTGNPLIP WDYCPISRCE GDTTPTIVNL 480
DHPVISCAKT KQLRVVNGIP TRTNIGWMVS LRYRNKHICG GSLIKESWVL TARQCFPSRD 540
LKDYEAWLGI HDVHGRGDEK CKQVLNVSQL VYGPEGSDLV LMKLARPAVL DDFVSTIDLP 600
NYGCTIPEKT SCSVYGWGYT GLINYDGLLR VAHLYIMGNE KCSQHHRGKV TLNESEICAG 660
AEKIGSGPCE GDYGGPLVCE QHKMRMVLGV IVPGRGCAIP NRPGIFVRVA YYAKWIHKII 720
LTYKVPQS 728

【0106】

配列番号：５
ＳＴ３Ｇａｌ１モチーフ３コンセンサス配列
HYWE 4

【0107】

配列番号：６
パン・トログロデュテスＳＴ３Ｇａｌ１
MVTLRKRTLK VLTFLVLFIF LTSFFLNYSH TMVATTWFPK QMVLELSENL KRLIKHRPCT 60
CTHCIGQRKL SAWFDERFNQ TVQPLLTAQN ALLEDDTYRW WLRLQREKKP NNLNDTIKEL 120
FRVVPGNVDP MLEKRSVGCR RCAVVGNSGN LRESSYGPEI DSHDFVLRMN KAPTAGFEAD 180
VGTKTTHHLV YPESFRELGD NVSMILVPFK TIDLEWVVSA ITTGTISHTY VPVPAKIRVK 240
QDKILIYHPA FIKYVFDNWL QGHGRYPSTG ILSVIFSMHV CDEVDLYGFG ADSKGNWHHY 300
WENNPSAGAF RKTGVHDADF ESNVTATLAS INKIRIFKGR 340

【0108】

配列番号：７
マカカ・ムラッタＳＴ３Ｇａｌ１
MVTLRKRTLK VLTFLVLFIF LTSFFLNYSH TMVTTTWFPK QMVLELSENL KRLIKHRPCT 60
CTHCIGQRKL SVWFDERFNQ TVQPLLTAQN ALLEDDTYRW WLRLQREKKP NNLNDTIKEL 120
FRVVPGNVDP MLEKRSVGCR RCAVVGNSGN LRESSYGPEI DRHDFVLRMN KAPTAGFEAD 180
VGTKTTHHLV YPESFRELGD NVSMILVPFK TIDLEWVVSA TTTGTISHTY VPVPAKIRVK 240
QDKILIYHPA FIKYVFDNWL QGHGRYPSTG ILSVIFSMHV CDEVDLYGFG ADSKGNWHHY 300
WENNPSAGAF RKTGVHDADF ESNVTATLAS INKIRIFKGR 340

【0109】

配列番号：８
サス・スクロファＳＴ３Ｇａｌ１
MAPMRKKSTL KLLTLLVLFI FLTSFFLNYS HTVVTTAWFP KQMVIELSEN FKKLMKYPYR 60
PCTCTRCIEE QRVSAWFDER FNRSMQPLLT AKNAHLEEDT YKWWLRLQRE KQPNNLNDTI 120
RELFQVVPGN VDPLLEKRLV SCRRCAVVGN SGNLKESYYG PQIDSHDFVL RMNKAPTEGF 180
EADVGSKTTH HFVYPESFRE LAQEVSMILV PFKTTDLEWV ISATTTGRIS HTYVPVPAKI 240
KVKKEKILIY HPAFIKYVFD RWLQGHGRYP STGILSVIFS LHICDEVDLY GFGADSKGNW 300
HHYWENNPSA GAFRKTGVHD GDFESNVTTI LASINKIRIF KGR 343

【0110】

配列番号：９
ラッタス・ノルベギクスＳＴ３Ｇａｌ１
MVNMRKRTLK YLTFFLLFIF LTSFVLNYSN SGVPSAWFPK QMVLEFSENF RKFIKSQPCT 60
CRHCISQGKV SYWFDQRFNK TMQPLLTAHN ALMEEDTYRW WLRLQRERKP NNLSDTVKEL 120
FRLVPGNVDP MLNKRLVGCR RCAVVGNSGN LKDSSYGPEI DSHDFVLRMN RAPTVGFEAD 180
VGSRTTHHLV YPESFRELGE NVNMVLVPFK ITDLQWVISA TTTGTITHTY VPVPPKIKVK 240
QEKILIYHPA FIKYVFDNWL QGHGRYPSTG ILSVIFSIHI CDEVDLYGFG ADSKGNWHHY 300
WENNPSAGAF RKTGVHDGDF EYNVTTTLAA INKIRIFKGR 340

【0111】

配列番号：１０
ムス・ムスクルスＳＴ３Ｇａｌ１
MRRKTLKYLT FFLLFIFLTS FVLNYSNTGV PSAWFPKQML LELSENFRRF IKSQPCTCRH 60
CISQDKVSYW FDQRFNKTMQ PLLTVHNALM EEDTYRWWLR LQRERKPNNL SDTVKELFRL 120
VPGNVDPMLN KRLVGCRRCA VVGNSGNLKD SSYGPEIDSH DFVLRMNKAP TVGFEADVGS 180
RTTHHLVYPE SFRELGENVN MVLVPFKTTD LQWVISATTT GTITHTYVPV PPKIKVKQEK 240
ILIYHPAFIK YVFDNWLQGH GRYPSTGILS IIFSIHICDE VDLYGFGADS KGNWHHYWEN 300
NPSAGAFRKT GVHDGDFEYN ITTTLAAINK IRIFKGR 337

【0112】

配列番号：１１
ナンノスパラックス・ガリＳＴ３Ｇａｌ１
MVNLRKKIVK WLTFLLLFVF LTSCFLNYSN SGVPITWFPK QMVLELSENF QKLIKQRPCT 60
CTHCISQSKV SSWFDQRFNQ TMQPLLTASN AMMEEDTYQW WLRLQRERKP NNLSDIVKEL 120
FSLVPGNVDP VLDKRSVGCR RCAVVGNSGN LRASSYGSDI DSHDFVLRMN RAPTVGFEAD 180
VGSRTTHHLV YPESFRELGE NVNMVLVPFK TTDLQWVISA TTTGTITHTY VPVPPKIKVK 240
QEKILIYHPA FIKYVFDNWL QGHGRYPSTG ILSVIFSMHV CDEVDLYGFG ADSKGNWHHY 300
WENNPSAGAF RKTGVHDGDF ESNVTTTLAS INKIRIFKGR 340

【0113】

配列番号：１２
モノデルフィス・ドメスティカＳＴ３Ｇａｌ１
MAAIKKKRLK VFTFVLLLVS LTSFFLNYAH TTATYTWFPK QMVMHFSEHF KRFMKYPQRP 60
CSCSQCISET GFAPWFDERF NHTMQPLLNR QNAFLENDTY TWWMKLQRER TPKRLNETFM 120
DLFSIIPGDV DPLLQKGPLI CRRCAVVGNS GNLKESHYGK DIDSHDFVLR MNRAPTAGFE 180
VDVGRKTTHH LVYPESFREL AGNVSMILVP FKTMDLQWLI SALTKGTINF TYVPVPRKIH 240
VNREKILIYH PAFIKYVFDS WLQAHGRYPS TGILSVILSL HICDKVDLYG FGADSKGNWH 300
HYWENNPSAG AFRKTGVHDG DFESNVTSTL ASLNKIRIFK GR 342

【0114】

配列番号：１３
オリクトラグス・クニクルスＳＴ３Ｇａｌ１
MVTPRKRTLK ALAFLMLFIF LTSFLLNYSH TMVATTWFPK QMVLEFSENL RKLIKTRPCT 60
CAHCVGQRKL SAWFDERFNQ TMQPLLTAHN ALMEEDTYRW WLKLQREKKP NNLNDTIKEL 120
FSVVPGDVDP VLEKRSVGCR RCAVVGNSGN LRESSYGPDI DSHDFVLRMN KAPTVGFEGD 180
VGSKTTHHLV YPESFRELGE NVSMVLVPFK TIDLQWVVSA TTTGTISHTY VPVPAKIKVK 240
QDKILIYHPA FIKYVFDNWL QGHGRYPSTG ILSVIFSMHI CDEVDLYGFG ADSKGNWHHY 300
WENNPSAGAF RKTGVHDADF ESNVTATLAA INKIRIFKGR 340

【0115】

配列番号：１４
クリセツルス・グリセウスＳＴ３Ｇａｌ１
MMTTQKKVLK VLTFLVLLIF LTSFVLNFAH TTVPAAWFPK QMVLELSQNL RKLIKPPPCT 60
CTHCISQRKV SAWFDKRFNQ TVQPLLTAHN AVLEEDTYQW WLRLQREKKP SNLSDTIREL 120
FSVVPGNVDP VLEKKSGSCR RCAVVGNSGN LRESSYGPEI DSHDFVLRMN RAPTVGFEAD 180
VGSKTTHHLV YPESFRELGE DVSMILVPFK TIDLQWVVSA TTTGTISHTY VPVPKKIKVK 240
QDKILIYHPA FIKYVFDNWL QGHGRYPSTG ILSVIFSLHV CDEVDLYGFG ADSKGNWHHY 300
WENNPSAGAF RKTGVHDGDF ESNVTATLAA INKIRIFTGR 340

【0116】

配列番号：１５
カニス・ファミリアリスＳＴ３Ｇａｌ１
MVTMRKRTLK VLTLLVLFIF LTSFFLNYSH TMVTTTWFPK QMVVELSENF KKFMKYTHRP 60
CTCARCIGQQ RVSAWFDERF NRSMQPLLTA QNALLEEDTY SWWLRLQREK QPNNLNDTIR 120
ELFQVVPGNV DPLLEKRSVG CRRCAVVGNS GNLRESWYGP QIDSHDFVLR MNKAPTAGFE 180
MDVGSKTTHH LVYPESFREL AENVSMVLVP FKTTDLEWVV SATTTGTISH TYVPVPAKIK 240
VKKDKILIYH PAFIKYVFDS WLQGHGRYPS TGILSVIFSL HICDEVDLYG FGADSKGNWH 300
HYWENNPSAG AFRKTGVHDG DFESNVTATL ASINKIRIFK GR 342

【0117】

配列番号：１６
フェリス・カツスＳＴ３Ｇａｌ１
MVTVRKRTLK VLTLLVLFIF LTSFFLNYSH TMVATTWFPK QMVVELSENF KKFMKYAHRP 60
CTCARCIGQQ RVSPWFDERF NRSMQPLLTA QNALLEEDTY SWWLRLQREK QPNNLNDTIK 120
ELFQVVPGNV DPLLEKKSGG CRRCAVVGNS GNLRESWYGP QIDGHDFVLR MNKAPTAGFE 180
ADVGSKTTHH LVYPESFREL GENVSMVLVP FKTTDLEWVV SATTTGTISH TYVPVPAKIK 240
VKKNKILIYH PAFIKYVFDN WLQGHGRYPS TGILSVIFSL HICDEVDLYG FGADSKGNWH 300
HYWENNPSAG AFRKTGVHDG DFESNVTATL ASINKIRIFK GR 342

【0118】

配列番号：１７
エクウス・カバッルスＳＴ３Ｇａｌ１
MATHRRRILK VLTLLILFIF LTSFFLNYSH TVVTTAWFPK QMVLELSENF KKLVQYSHRP 60
CSCARCIGQQ KVSSWFDERF NRSMQPLLTV QNAFLEEDAY NWWLRLQREK EPSNLNDTIK 120
ELFRVVPGNV DPLLGKRSVG CRRCAVVGNS GNLKESSYGP QIDSHDFVLR MNKAPTAGFE 180
AYVGSKTTHH LVYPESFREL GENVSMVLVP FKTTDLEWVV SATTTGTISH TYVPVPAKIK 240
VKQDKILIYH PAFIKYVFDN WLQGHGRYPS TGILSVIFSL HICDEVDLYG FGADSRGNWH 300
HYWENNPSAG AFRKTGVHDG DFESNVTATL ASIDKIRIFK GR 342

【0119】

配列番号：１８
ガルス（Gallus：ニワトリ）ＳＴ３Ｇａｌ１
MVTVRKRNVK VFTFAFVLIT VTSFLLNYKH QVTMTTWDPK HIISQFSEQV RKLIKFPRRP 60
CSCSTCISEL GHSLWFDQRF NSTMQPFLTS QNALIPEDSY RWWLKLQGEK SPKNINDTLK 120
ELFGIIPGDR DPLQERGTFS CRRCAVVGNS GNLRQSQYGQ DIDSHDFVLR MNRAPTIGYE 180
SDVGSKTTHH FVYPESYKEL AENVSMIVIP FKTLDLRWIV TALTTGTINF TYVPVPRKIK 240
VRKEKVLIYN PSFIKYVYEN WLQNHGRYPS TGLLSVIFAL HVCDEVNVYG FGADSKGHWH 300
HYWENNASAG AFRQTGVHDG DFEFNVTLTL ASIEKIKFFK GR 342

【0120】

配列番号：１９
コルムバ・リビアＳＴ３Ｇａｌ１
MVVVRRRNVK VFTFAFLLIT VTSFLLNYTH QVTTTTWDPR HLVMQFSEQV QKLFKYPRRP 60
CSCRSCISEL GHSLWFDQRF NSTMQPFLTS QNALIPEDSY RWWLKLQGEK TPKNINATLK 120
ELFEFIPGDG DPLQERGTST CRRCAVVGNS GNLLQSQYGQ DIDSHDFVLR MNRAPTTGYE 180
SDVGSKTTHH FVYPESYKEL AENVSMILIP FKTLDLRWIV TALTTGTINF TYVPVPRKIK 240
VKKEKILIYN PTFMKYVYEN WLQHHGRYPS TGLLSLIFAL HVCDEVNVYG FGADSRGHWH 300
HYWENNGSAG AFRKTGVHDG DFEFNVTLTL ASIEKINFFK GR 342

【0121】

配列番号：２０
アリゲーター・シネンシスＳＴ３Ｇａｌ１
MRRRHLKMFS FLFVFIAAMS FFLNYNHYEA MVTWAPQQIV MQFSEQFKKL MKHPRRPCSC 60
KACVSELGLS LWFDERFNQT MQPLLTTQNA LISQDSYRWW LKLQGEKNPK NINETIKELF 120
ETISGDGSQL QERSSSMCRR CAVVGNSGNL RQSHYGQDID SHDFVLRMNR APTVGFESDV 180
GSKTTHHFVY PESFKELPEN VSMIVIPFKT LDLRWIVSAL TTGTINHTYV PVPRKIKVKK 240
EKILVYHPDF LKYVFDHWLQ RHGRYPSTGI LSVVFALHVC DEVNLYGFGA NSKGHWHHYW 300
ENNPSAGAFR QTGVHDGDFE SNITSTLAAV NKIHLFKGR 339

【0122】

配列番号：２１
ラティメリア・カルムナエＳＴ３Ｇａｌ１
MARHNHRIMW LLTIILLLCV YMVIYDMGED KQKLIKIPSI RRLSGRTIVL DKKLCSCEKC 60
VSEKEESAWF DERFDPNFQP ILMTEVQDIP SHALQWWLSL QAGNKNYNLS ESIAKLFTVV 120
PRTNHSGIRD PAHCRKCAVV GNSGNLKGSN HGKEIDAHHF VIRMNRARTA GFEPDVGIKT 180
THHLMYPESS QDLQPGVHLV LLPFKIMDFE WIRSALTTGE ITRTYFRVQQ FIKADKDKVL 240
IINPTFFKYV CDHWTEHHGR YPSTGMTALV FALHICDEVS VFGYGADSNG NWHHYWENNR 300
NGGAFRRTGV HSGDFESQII KKLADEGKII FYK 333

【0123】

配列番号：２２
シオナ・インテスチナリスＳＴ３Ｇａｌ１
MLINFKLSRV IAMLLVVAIF LTYSWLLLWS TKTALQTNRK NKAGQDEVPV INVIKEDSYV 60
QQKTQNLNKG KRFDLGRVNH SHPREEIQQN NKCGHQLDAS QTRWFRARFN PEIEPVWTQS 120
ALEIDYLVYD WWLSLQSSEA ENLDKTFEAL YKEGVPRKDP FARLTHDREA GCRSCAVVGN 180
SGNILNSNYG NVIDGHDFVI RMNKGPTYNY ENDVGSKTTH RFMYPTTAAS SLPQGVSLVL 240
VPFQPLDIKW LLSALTTGEI TRTYQPLVRR VTCDKSKITI ISPTFIRYVH DRWTQHHGRY 300
PSTGLLALIY ALHECDEVDV YGFGANRAGN WHHYWEDLPP HVAGAFRKTG VHDSAQENEI 360
IDQLHIHGLL RVHRSEQSS 379

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]