特許 6396909 インビトロで組織及び器官の機能単位を再現するためのマイクロ流体システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6396909

(24)【登録日】2018年9月7日

(45)【発行日】2018年9月26日

(54)【発明の名称】インビトロで組織及び器官の機能単位を再現するためのマイクロ流体システム

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20180913BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20180913BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20180913BHJP

   A61P 33/06 20060101ALI20180913BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20180913BHJP

   C12N 5/07 20100101ALN20180913BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 A

   C12M3/00 A

   A61K45/00

   A61P33/06

   G01N37/00 101

   !C12N5/07

【請求項の数】33

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2015-534756(P2015-534756)

(86)(22)【出願日】2013年9月27日

(65)【公表番号】特表2015-533083(P2015-533083A)

(43)【公表日】2015年11月19日

(86)【国際出願番号】US2013062307

(87)【国際公開番号】WO2014052835

(87)【国際公開日】20140403

【審査請求日】2016年9月8日

(31)【優先権主張番号】61/707,907

(32)【優先日】2012年9月29日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/721,002

(32)【優先日】2012年10月31日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509121879

【氏名又は名称】ノーティス，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100094112

【弁理士】

【氏名又は名称】岡部 讓

(74)【代理人】

【識別番号】100096943

【弁理士】

【氏名又は名称】臼井 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100102808

【弁理士】

【氏名又は名称】高梨 憲通

(74)【代理人】

【識別番号】100128646

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 恒夫

(74)【代理人】

【識別番号】100128668

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 正巳

(74)【代理人】

【識別番号】100134393

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 克彦

(74)【代理人】

【識別番号】100136799

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 亜希

(72)【発明者】

【氏名】ノイマン，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】トウロヴスカイア，アンナ エー．

(72)【発明者】

【氏名】ファウヴァー，マーク イー．

(72)【発明者】

【氏名】クレイマー，グレッグ

(72)【発明者】

【氏名】アスプ，エリザベス

(72)【発明者】

【氏名】マン，ヘニング

【審査官】 山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５０１６３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５０３１６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Helge Zieler et al.，PNAS，２０００年，Vol.97, No.21，pp.11516-11521

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００−５／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

インビトロで組織及び臓器のコンパートメント化微小環境を作製するため並びにコンパートメントに独立して灌流させるためのマイクロ流体システムであって、
システムが第１の灌流路及び第２の別個の灌流路を少なくとも有するマイクロ流体デバイスを含み、
マイクロ流体デバイスが、マトリックスを含むチャンバーをさらに有し、
マトリックスが、少なくとも１つの空洞を取り囲み、その管腔が第１の灌流路のみと流体接続しており、
少なくとも１つの空洞は、少なくとも１つの細胞種がマトリックスと直接接触するように定着することに適合しており、
マトリックスが、第２の別個の灌流路のみと流体接続している、
システム。

【請求項2】

少なくとも１つの空洞に、栄養溶液、被験物質、血液、血液成分、代替血液及び溶液中の細胞からなる群から選択される材料が灌流される、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

マイクロ流体デバイスが、ポリマー有機ケイ素化合物、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、環状オレフィンコポリマー、ポリスチレン及びポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーから製作される、請求項１に記載のシステム。

【請求項4】

チャンバー及び経路が、ガラス板とポリカーボネート板又は透明硬質熱可塑性樹脂板との間に並置されて、基材中に埋め込まれている、請求項３に記載のシステム。

【請求項5】

マトリックスが、ヒドロゲル、ゲル化された合成又は天然ヒドロゲル、コラーゲンＩ、フィブリン；コラーゲンＩ、ＩＶ、ヒアルロナンの組合せ；キチン、キトサン、アルギネート、アガロース、ゼラチン、合成マトリックス、生物学的に導かれた（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｉｎｓｐｉｒｅｄ）合成（ハイブリッド）マトリックス、非生物学的なゲル、キトサン、アルギネート、アガロース及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。

【請求項6】

腸、肝臓、腎臓及び血液脳関門の組織からなる群に由来する複数の細胞が、少なくとも１つの前記空洞に定着している、請求項１に記載のシステム。

【請求項7】

マイクロ流体デバイスが、２つ以上の別個の空洞を含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項8】

出芽微小血管を形成する内皮細胞が、前記空洞の１つに定着している、請求項７に記載のシステム。

【請求項9】

栄養溶液による微小血管の灌流が、少なくとも第２の空洞に定着している細胞の成長を支持することができる、請求項８に記載のシステム。

【請求項10】

インビトロで組織及び臓器の機能単位を再現するためのマイクロ流体システムであって、
システムが、第１の灌流路及び第２の別個の灌流路を少なくとも有する複数のマイクロ流体デバイスを含み、
複数のマイクロ流体デバイスがそれぞれ、マトリックスを含むチャンバーをさらに有し、
マトリックスが、少なくとも１つの空洞を取り囲み、その管腔が第１の灌流路のみと流体接続しており、細胞がマトリックスと直接接触するように少なくとも１つの空洞に少なくとも１つの細胞種が定着しており、
マトリックスが、第２の別個の灌流路のみと流体接続しており、
複数のマイクロ流体デバイスが、プラットフォーム上に統合されており、
複数のマイクロ流体デバイスのそれぞれが少なくとも部分臓器モジュールを模倣している、
システム。

【請求項11】

臓器モジュールが、腸、肝臓、腎臓及び血液脳関門モジュールからなる群から選択される、請求項１０のシステム。

【請求項12】

各マイクロ流体デバイスが異なる臓器種に相当する複数のマイクロ流体デバイスが接続されて複合システムを形成している、請求項１０に記載のシステム。

【請求項13】

中央の２コンパートメント肝臓モジュールが、腎臓モジュール、腸モジュール及び少なくとも１つのＢＢＢモジュールに接続されている、請求項１１に記載のシステム。

【請求項14】

臓器モジュールが、血流に相当する共通の流体路を共有する、請求項１０に記載のシステム。

【請求項15】

酸素拡散のための少なくとも１つの経路に連結された入口と、
腸細胞チューブによって吸収されて血管細胞チューブに送られる栄養の注入のための少なくとも１つの経路に連結されたポートと、
分析のための流体を抜き取るための少なくとも１つの経路に連結されたポートと、
肝臓モジュールによって緩衝化／吸収される化合物の注入のための少なくとも１つの経路に連結されたポートと、
肝臓モジュールによって濾過された流体を抜き取るための少なくとも１つの経路に連結されたポートと、
肝臓モジュールから胆汁を抜き取るための少なくとも１つの経路に連結された少なくとも１つのポートと、
血液脳関門試験のための化合物の注入のための少なくとも１つの経路に連結されたポートと、
窒素含有物質の腎臓モジュールへの注入のための少なくとも１つの経路に連結されたポートと、
細胞の注入のための空洞に連結されたポートと
をさらに含む、請求項１１に記載のシステム。

【請求項16】

選択された臓器モジュールを流れる流体を制御するように配置された複数の遮断弁をさらに含む、請求項１１に記載のシステム。

【請求項17】

組織工学的微小環境としての無脊椎動物組織の機能単位をインビトロで再現するためのシステムであって、
システムが第１の灌流路及び第２の別個の灌流路を少なくとも有するマイクロ流体デバイスを含み、
マイクロ流体デバイスが、マトリックスを含むチャンバーをさらに有し、
マトリックスが、少なくとも１つの空洞を取り囲み、その管腔が第１の灌流路のみと流体接続しており、
少なくとも１つの空洞は、少なくとも１つの無脊椎動物細胞種がマトリックスと直接接触するように定着することに適合しており、
マトリックスが、第２の別個の灌流路のみと流体接続している、
システム。

【請求項18】

無脊椎動物の組織工学的微小環境が、寄生虫の培養に利用される、請求項１７に記載のシステム。

【請求項19】

無脊椎動物細胞が、蚊中腸細胞、蚊細胞、初代無脊椎動物細胞、培養無脊椎動物細胞、初代蚊中腸細胞、培養蚊中腸細胞、ハエ細胞、害虫（ｂｕｇ）細胞、マダニ細胞及びショウジョウバエ細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載のシステム。

【請求項20】

無脊椎動物細胞が蚊中腸細胞を含み、寄生虫の培養が、マラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫の昆虫段階、三日熱マラリア原虫又は齧歯類寄生虫種のプラスモディウム・ベルゲイ、熱帯熱マラリア原虫及びプラスモディウム・ヨエリを培養することを含む、請求項１８に記載のシステム。

【請求項21】

空洞に蚊中腸細胞が定着して、インビボ様臓器生理機能を有する蚊中腸構造が生成される、請求項１７に記載のシステム。

【請求項22】

潜在的なマラリアワクチン候補、伝染阻止ワクチン候補又は他の抗マラリア化合物の試験に試験微小環境を用いることをさらに含む、請求項１８に記載のシステム。

【請求項23】

少なくとも１つの空洞に定着している細胞が肝細胞であり、前赤血球段階のマラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、プラスモディウム・ベルゲイ、熱帯熱マラリア原虫、プラスモディウム・オバール・クルチシ、プラスモディウム・オバール・ワリケリ、四日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫及び／又はプラスモディウム・ヨエリの培養に微小環境が使用される、請求項１に記載のシステム。

【請求項24】

微小環境が、潜在的なマラリアワクチン候補、伝染阻止ワクチン候補又は抗マラリア化合物の試験に使用される、請求項２３に記載のシステム。

【請求項25】

空洞に、蚊唾液腺からの細胞が播種される、請求項１７に記載のシステム。

【請求項26】

少なくとも１つの空洞に、樹立昆虫細胞株からの細胞が播種される、請求項１７に記載のシステム。

【請求項27】

少なくとも１つの空洞に、細胞接着を増強するアミノ酸又はタンパク質が灌流され、したがって細胞接着を増強するアミノ酸又はタンパク質でコーティングされる、請求項１７に記載のシステム。

【請求項28】

蚊幼虫の細胞調製物に由来する不死化蚊細胞であって、公表され、ＡＴＣＣ／ＭＲ４に既に寄託されている細胞が、空洞に定着している、請求項１７に記載のシステム。

【請求項29】

細胞が４Ａ−３Ｂ細胞を含む、請求項２８に記載のシステム。

【請求項30】

少なくとも１つの空洞に、栄養溶液、被験物質、血液、血液成分及び代替血液からなる群から選択される材料が灌流される、請求項７又は１９に記載のシステム。

【請求項31】

マイクロ流体デバイスが、ポリマー有機ケイ素化合物、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、環状オレフィンコポリマー、ポリスチレン及びポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーから製作される、請求項１７に記載のシステム。

【請求項32】

チャンバー及び経路が、ガラス板とポリカーボネート板又は透明硬質熱可塑性樹脂板との間に並置されて、基材中に埋め込まれている、請求項１７に記載のシステム。

【請求項33】

マトリックスが、ヒドロゲル、ゲル化された合成又は天然ヒドロゲル、コラーゲンＩ、フィブリン；コラーゲンＩ、ＩＶ、ヒアルロナンの組合せ；キチン、キトサン、アルギネート、アガロース、ゼラチン、合成マトリックス、生物学的に導かれた合成（ハイブリッド）マトリックス、非生物学的なゲル、キトサン、アルギネート、アガロース及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、参照により開示が本明細書に組み込まれている、２０１２年９月２９日に出願した同時係属の米国仮出願第６１／７０７，９０７号（Ｎｅｕｍａｎｎら；発明の名称「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｔｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ」）に関連し、その優先権を主張するものであり、さらに、参照によりこれもまた開示が本明細書に組み込まれている、２０１２年１０月３１日に出願した同時係属のＮｅｕｍａｎｎらの米国仮出願第６１／７２１，００２号の優先権を主張するものである。

【0002】

本発明は、インビトロで組織及び器官の機能単位を再現するための方法に関し、より詳しくは、組織工学的微小環境をチップ上に含むシステムに関する。

【背景技術】

【0003】

医薬品研究開発への投資は指数関数的に増えているが、ＦＤＡによって認可されている新薬の数は、過去６０年間変わらないままである。新薬候補のほぼ９５％は、開発の前臨床段階と臨床段階の間で、主に薬物関連毒性のために脱落している。より良好な前臨床薬物−スクリーニングアッセイが明らかに必要とされている。現在、薬物候補の薬物動態及び毒性評価は、主に動物実験系に依拠しているが、動物実験系は、臨床的有効性及び毒性に関する非常に限定された予測値しか示さないことは明白である。加えて、動物モデルの維持は、薬物開発コストを劇的に上昇させる。また、多くのハイスループット二次元（２Ｄ）細胞株モデルが、薬物開発において一般に使用されている。それらの予測値は非常に限定され、それは生理的状況の消失に起因している。２Ｄ細胞培養の限界に対処でき且つ動物モデルを最小化でき又は完全に置き換えることさえでき得る、３Ｄ細胞培養物からオンチップ臓器（ｏｒｇａｎ−ｏｎ−ｔｉｐ）にいたるまでの、より精巧なヒト化細胞ベースアッセイが開発中である。３Ｄ細胞培養モデルにおいて、細胞は、インビボで見られる構造的、生化学的及び機械的側面を模している３Ｄ微小環境内で成長する。このような培養物は、インビボにおける対応する組織に特有の特定の生化学及び形態学的側面を復元することが知られている。従来の静的３Ｄ培養物の例としては、ヒドロゲル封入細胞と、「サンドイッチ」培養物と、多細胞スフェロイドと、マイクロキャリア及び微細構造担体上で成長する細胞とが挙げられる。これらのモデルは、有力ではあるが、薬物動態研究に必要とされる複雑性を依然として欠いており、以下のような多くの他の欠点を有する。１）栄養供給が限定され、薬物に対する細胞応答を混乱させるおそれがある代謝老廃物が蓄積する、２）インビボにおいて存在している時空間的生化学勾配を模することができない、３）機械的キュー、例えば、流れ、灌流、圧力、機械的ストレスが欠如している、４）探索が困難である、５）リアルタイムイメージングに問題がある、並びに６）反応−拡散現象のため、生細胞で生化学分析を行えない。さらにまた、複数の臓器／組織の模倣物を活性な血管導管（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｄｕｉｔ）及びバリア組織と統合するマイクロシステムを作製することは、まだ可能でない。

【0004】

結果として、薬物研究、ワクチン開発及び他の種類の医学研究のための、より費用のかからない、より精巧な、より制御されたシステムに対する必要性は、立証されているが、依然として満たされていない。本発明は、インビトロで組織及び臓器の機能単位を再現するための血管細胞及び臓器細胞を統合するシステムを含む、このような制御されたシステムへの新しい及び新規なアプローチを提供する。これら及び他の重要な新しい教示は、以下の明細書及び特許請求の範囲から明らかになる。

【0005】

寄生虫疾患に対するワクチンを開発するための医学研究には、寄生虫細胞の入手容易性及びインビトロでの利用しやすさだけでなく、寄生虫の宿主生物をモデル化できることが必要である。ヒトマラリア原虫は蚊も感染し、次に蚊が、ヒトへの疾患の伝染においてベクターとして作用する。マラリアに対する効果的なワクチンを開発及び同定するために、研究者は、マラリア原虫を、それが自然に生活する蚊の中腸との関連で研究できるモデルシステムを必要としている。しかし、発達上の昆虫段階のヒトマラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）をインビトロで培養するのに利用できるシステムは、現在のところ存在しない。さらにまた、感染段階のマラリア原虫、スポロゾイトに関する研究は、生きている感染した蚊を必要とする、不正確で制御が困難な方法に頼っている。このようなアプローチは、多くの望ましくない変数を分析に持ち込む。例えば、生きている蚊は、制御された血液摂取パラメーターの影響下になく、薬物有効性の分析は、切開された蚊腸の比較的主観的な手動的検査によって行わなければならない。

【0006】

結果として、例えば寄生虫蚊段階を含む全ての寄生虫昆虫段階を生じるインビトロ培養システムと、薬物及びワクチンの研究、ワクチン開発並びにマラリアなどの疾患に関する他の種類の医学研究のための試験プラットフォームの両方のための、より費用のかからない、より制御されたシステムに対する必要性は、立証されているが、依然として満たされていない。本発明は、蚊中腸系の機能単位を再現するモデル及びその中でのマラリア原虫段階の培養を含む、このような制御されたシステムのための新しい及び新規なアプローチを提供する。これら及び他の重要な新しい教示は、以下の明細書及び特許請求の範囲から明らかになる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｙｕａｎ，Ｗ．ら、２００９

【非特許文献2】Ｂｌａｓｉｇ，Ｉ．ら、２００１

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

この概要は、以下の「発明を実施するための形態」においてさらに説明する概念から選択したものを単純化した形態で紹介するために提供するものである。この概要は、特許請求の範囲に記載する主題の重要な特徴の特定を意図するものではなく、特許請求の範囲に記載する主題の範囲を確定する一助としての使用を意図するものでもない。

【0009】

インビトロで組織及び臓器のコンパートメント化微小環境を作製するため並びにコンパートメントに独立して灌流させるためのマイクロ流体システムを、本明細書中に開示する。マイクロ流体デバイスは、第１の灌流路及び第２の別個の灌流路を少なくとも含む。また、マイクロ流体デバイスは、マトリックスを含むチャンバーを有し、チャンバーにおいて、マトリックスは少なくとも１つの空洞を取り囲み、その管腔は第１の灌流路のみと流体接続しており、細胞がマトリックスと直接接触するように少なくとも１つの空洞に少なくとも１つの細胞種が定着することができ、マトリックスは第２の別個の灌流路のみと流体接続している。

【0010】

別の態様において、寄生虫の培養のための組織工学的微小環境として、インビトロで無脊椎動物の機能単位を再現する方法であって、第１の灌流路及び第２の別個の灌流路を少なくとも含むマイクロ流体デバイスであり、チャンバーをさらに有するマイクロ流体デバイスを提供することを含む、方法が開示される。チャンバーにはマトリックスが満たされ、マトリックスは、少なくとも１つの空洞を取り囲み、その管腔が第１の灌流路のみと流体接続しており、細胞がマトリックスと直接接触するように少なくとも１つの空洞に少なくとも１つの細胞種が定着することができ、マトリックスは、第２の別個の灌流路のみと流体接続している。少なくとも１つの空洞に、無脊椎動物細胞を播種し、無脊椎動物細胞を灌流させて増殖させ、無脊椎動物の臓器又は組織を作製する。寄生虫段階を、微小環境において培養して、試験微小環境を提供する。

【0011】

本発明の新規な特徴は、添付した特許請求の範囲において詳細に示すが、本発明は、構成及び内容の両方に関して、その他の目的及び特徴と共に、図面と併せて以下の詳細な説明からよりよく理解及び認識されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Ａは、２コンパートメント（単一細胞チューブ）ＴＥＭチップの例を示す図であり、Ｂは、ＴＥＭチップ型の技術的設計を示す図である。Ｃは、管腔の流体流のための単一流体導管を示す概略図であり、Ｄは、３コンパートメント（二重細胞チューブ）ＴＥＭチップの例を示す図であり、Ｅは、ＴＥＭチップ型の技術的設計を示す図であり、Ｆは、管腔の流体流のための二重流体導管を示す概略図である。

【図2】Ａは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）からなる微小血管チューブの近くに埋め込まれたヒト脳星状細胞及び周皮細胞を含む微小血管様細胞チューブを取り囲むマトリックス中に埋め込まれた細胞の一例を示す図であり、Ｂは、周皮細胞及び星状細胞が微小血管チューブの壁に集められる微小血管様細胞チューブを取り囲むマトリックス中に埋め込まれた細胞の一例を示す図であり、Ｃは、ＨＵＶＥＣの刺激された増殖を示す図であり、Ｄは、ＨＵＶＥＣの刺激された増殖を示す図である。

【図3】ＨＥＫ２９３チューブ及びＨＵＶＥＣから作製された対応する血管細胞チューブを有する腎臓モジュールを示す３コンパートメントモデルの一例を４日間にわたって示す図である。

【図4】ＨＴ２９細胞株から作製された細胞チューブ及びＨＵＶＥＣから作製された対応する血管細胞チューブを含む腸モジュールを含む３コンパートメントセットアップの一例を示す図である。

【図5A】Ａは、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞から作製された肝細胞チューブ及びＨＵＶＥＣから作製された血管細胞チューブを含む肝臓モジュールを示す３コンパートメントモデルの一例を示す図であり、Ｂは、血管を取り囲むマトリックス中に埋め込まれた肝細胞を示す図である。

【図6】２コンパートメントデバイス中の血管細胞チューブ（初代ヒト微小血管内皮細胞から作製）の壁を横切る傍細胞透過性を特に図示している、血液脳関門モデルの一例を示す図である。

【図7】ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（ヒト脳微小血管細胞株）並びにＥＣＭ中に埋め込まれた周皮細胞及び星状細胞（初代ヒト脳細胞）からなるＢＢＢモデルにおける細胞の再編成を示す図である。

【図8】腫瘍−内皮相互作用の２コンパートメントモデルの一例を７日間にわたって一緒に示す図である。図８Ｄ、図８Ｅ及び図８Ｆは、がん細胞クラスターに向かって成長している複数の芽を図示する、同じ検体の異なる焦点面を示している。

【図9】腫瘍−内皮相互作用の３コンパートメントモデルの一例を一緒に示す図である。

【図10】がん細胞の血管外溢出の一例を一緒に示す図である。

【図11】各チップが異なる臓器に相当する複合システムを形成する４つの接続されたＴＥＭチップの一例を示す図である。

【図12】各チップが異なる臓器に相当する４つのＴＥＭチップを接続するための、複合システムの代替構造の一例を示す図である。

【図13】１つの回路に統合された複数のさらに多くの生理的モジュールを使用する代替構造の一例を示す図である。

【図14】蚊の４Ａ−３Ａ細胞コーティング細管が５日間にわたって発育している細胞チューブを示す２コンパートメント蚊中腸チップの一例を示す図である。

【図15】非常に予備的な培養環境における早期段階のオーシストの例を示す図である。

【図16】中腸チップの一例を示す概略図である。

【図17A】ＲＢＣの懸濁液中における受精の４８時間後における、強化されたＧＦＰ発現熱帯熱マラリア原虫オーキネートの一例を示す図である。

【図17B】ＲＢＣの懸濁液中における受精の４８時間後における、強化されたＧＦＰ発現熱帯熱マラリア原虫オーキネートの一例を示す図である。

【図17C】ＲＢＣの懸濁液中における受精の４８時間後における、強化されたＧＦＰ発現熱帯熱マラリア原虫オーキネートの一例を示す図である。

【図17D】ＲＢＣの懸濁液中における受精の４８時間後における、強化されたＧＦＰ発現熱帯熱マラリア原虫オーキネートの一例を示す図である。

【図17E】接合子並びに発育中及び成熟したオーキネートの段階における、注入ＧＦＰ発現寄生虫を含む４Ａ−３Ｂ細胞の細胞チューブを含む一例を示す図である。

【図17F】接合子並びに発育中及び成熟したオーキネートの段階における、注入ＧＦＰ発現寄生虫を含む４Ａ−３Ｂ細胞の細胞チューブを含む一例を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

図面中、同一参照数字は、類似の要素又は成分を特定する。図面中の要素の寸法及び相対的な位置は必ずしも原寸に比例して図示されていない。例えば、種々の要素の形状及び角度は、原寸に比例して図示されておらず、これらの要素の一部は、図面を判読しやすいように恣意的に拡大及び配置されている。さらに、図示されているエレメントの特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関するいかなる情報も伝達することを意図するものではなく、図面中で認識しやすいように選択しただけである。

【0014】

本明細書で提示する例は、本発明の理解を深めるためのものである。例は例示的なものであり、本発明は、例示的な実施形態に限定されるものではない。

【0015】

文脈上別段の解釈を要する場合を除き、明細書及び以下の特許請求の範囲の全体を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその変形体、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、オープンな、包括的な意味で、即ち、「包含するが、限定されない」として解釈すべきである。

【0016】

本明細書の全体を通じて、「一例」若しくは「例示的な一実施形態」、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「一実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又はこれらの用語の組合せ及び／若しくは変形体への言及は、その実施形態に関連して記載した特定の特徴、構造又は特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に包含されることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な箇所に出現する「一実施形態において（ｉｎ ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又は「一実施形態において（ｉｎ ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」という表現は、必ずしも全てが同一実施形態を指しているのではない。さらにまた、特定の特徴、構造又は特性は、１つ又は複数の実施形態において任意の好適な方法で組み合わせることができる。

【0017】

定義
一般に、本明細書中で使用する以下の用語は、文脈上別段の解釈が示唆される場合を除き、以下の意味を有する。

【0018】

本明細書中で使用する「ＢＢＢ」は、脳特異的血管内皮によって形成された血液脳関門を意味すると理解される。

【0019】

本明細書中で使用する「ＥＬＩＳＡ」は、一般に認められているその意味を有し、酵素結合免疫吸着測定を意味すると理解される。

【0020】

本明細書中で使用する「ＨＵＶＥＣ」は、一般に認められているその意味を有し、ヒト臍帯静脈内皮細胞を意味すると理解される。

【0021】

本明細書中で使用する「ＰＤＭＳ」は、一般に認められているその意味を有し、ポリジメチルシロキサンを意味すると理解される。

【0022】

本明細書中で使用する「複数」は、１より多いことを意味する。例えば、複数は、少なくとも３、４、５、７０、１，０００、１０，０００又はそれ以上を指す。

【0023】

本明細書中で使用する「ＴＥＭ」は、組織工学的微小環境を意味すると理解される。

【0024】

本明細書中で使用する「組織」は、１つ又は複数の特定の機能を果たすために特化された、細胞外マトリックス分泌物と一体化した、同一起源からの１種又は数種の同様な型の細胞の集合と定義する。

【0025】

本明細書中で使用する「臓器」は、複数の組織からなるより高レベルの組織化した構造を意味し、臓器の機能は、複数の組織の相互作用によってのみ可能である。

【0026】

例示的な実施形態
組織工学的微小環境（ＴＥＭ）の作製のためのマイクロ流体デバイスが、本発明者によって開発された。これらのデバイスは、三次元マトリックスが満たされたチャンバーを含む。マトリックスは、種々の細胞種が定着してチューブ状細胞構造を生じることができるチューブ状空洞を含む。これらの細胞チューブは、デバイスの流体チャネルに管腔状に接続しており、したがって、細胞チューブには栄養溶液、被験物質、細胞溶液又は他の流体を灌流させることができる。管腔灌流及びマトリックスを通る灌流又は拡散は、デバイス内における微小環境条件の厳格な制御を可能にする。流体の圧力及び剪断応力は、細胞の形状、増殖、分化及びタンパク質発現に影響を及ぼすことが知られている。

【0027】

流体デバイスは、ガラス板とポリカーボネート板との間に挟まれたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製の小型チップとして設計される。これらの組織工学的微小環境チップ（ＴＥＭチップ）は、種々の組織及び臓器のマイクロ構造及び機能パラメーターを再現するインビトロモデルを作製するために設計されている。このセットアップは、マトリックス（例えば、ゲル化コラーゲンＩ、フィブリン、又はコラーゲンＩ、ＩＶ、及び／若しくはヒアルロナンの組合せ）によって完全に取り囲まれたチューブ状細胞構造をもたらすので、細胞と非生物学的材料との直接接触が防がれる。組織由来タンパク質との接触は、インビトロで生理的挙動を支持することが示されている。他方、非生物学的材料との接触は、細胞応答に悪影響を与えるおそれがある。

【0028】

ＴＥＭチップの構造は、独立して灌流させることができ且つ例えば細胞バリア又は他のバリアによって互いに隔てることができる２つ又はそれ以上の組織コンパートメントの作製を可能にする。例えば、コラーゲンマトリックス内の単一チューブ状細胞構造は、細胞チューブ内の管腔コンパートメント及び取り囲んでいるマトリックスによって構成される管腔外コンパートメントからなる、２コンパートメントシステムを提示する。両コンパートメントは、「内部」と「外部」の間にバリアを形成する細胞の層によって隔てられる。このコンパートメント化されたセットアップは、多くの組織及び臓器、例えば、微小血管系、腎尿細管及び精細管（ｓｅｍｉｎｉｆｅｒｏｕｓ ｃｅｌｌ ｔｕｂｕｌｅ）のマイクロ構造を模倣している。重要なことに、このセットアップは細胞を分極させ、これはバリア機能を有する組織に特に重要である。

【0029】

ＩＩＩ．ＴＥＭチップの設計
この例中で使用及び企図するＴＥＭチップは、光学的に透明であり、蛍光イメージング、共焦点、明視野及び位相差顕微鏡イメージングとの両立を可能にするように構築されている。インプット又はアウトプット流体ポートのいずれかから収集された流体試料は、オフライン技術、例えば、液体クロマトグラフィー、質量分析、ＥＬＩＳＡ又はゲル電気泳動を用いて分析できる。マルチコンパートメントＴＥＭチップにおいて、細胞チューブには、細胞接種、栄養及び培養物維持のための最適な培地を独立して灌流させることができる。これらの培地には、生物活性剤（例えば、抗体、薬物、毒素又はワクチン）を補充することができる。特定の研究に関しては、灌流液は、血液、血液成分又は代替血液である可能性もある。管腔流体路はまた、マイクロ粒子、ナノ粒子、単一細胞若しくは細胞集合体（例えば、血液細胞、がん細胞、細胞スフェロイド）、又は微生物（ウイルス、細菌又は寄生虫）の投与に役立つ可能性もある。全ての灌流液は、さらなる分析のために流体サンプリング用ポートを使用して収集できる。加えて、細胞をデバイスから抜き取って、遺伝子又はタンパク質発現を評価することもできる。

【0030】

ここで図１Ａ〜図１Ｆを一緒に参照すると、それぞれ、２コンパートメント及び３コンパートメント（単一細胞チューブ及び二重細胞チューブ）ＴＥＭチップの例が示されている。図１Ａ〜図１Ｃは、２コンパートメントチップを示し、図１Ｄ〜図１Ｆは、３コンパートメントチップを示している。

【0031】

ここで特に図１Ｂ及び図１Ｅを参照すると、２つのＴＥＭチップ型の技術設計が示されている。Ｌ１−Ｌ２は、管腔で臓器細胞チューブに灌流させる流体接続を表す。Ｌ３−Ｌ４は、血管細胞チューブの灌流のための接続を表す。Ｔ１は、臓器細胞によって形成された細胞チューブを表し、Ｔ２は、血管細胞によって形成された細胞チューブを表す。Ｂ１〜Ｂ４は、バブルトラップを表す。Ｎ１〜Ｎ４は、流体注入又はサンプリングのためにノンコアリングセプタムニードルを挿入できる、セプタムを位置付けることができる領域を表す。Ｎ１及びＮ４はまた、特に細胞注入ポートを表し、細胞を注入して生物学的マトリックス中の空洞に流入させ、したがって、細胞チューブ又は中実細胞塊（Ｔ１、Ｔ２）を形成する。Ｍ１−Ｍ２は、細胞外生物学的マトリックスとの流体接続を表し、注入化合物の流体流又は拡散が起こる。図示したデバイスにおいて、生物学的マトリックス中に空洞を形成するための好ましい方法は、マンドレルを使用し、それをデバイスにＬ２でＮ１に達するまで（又はＬ４でＮ４に達するまで）挿入してから、Ｍ１又はＭ２を介して生物学的マトリックスを注入することである。マトリックスのゲル化後、このマンドレルを除去し、Ｌ１−Ｌ２又はＬ３−Ｌ４と流体接続する空洞をマトリックス中に残す。

【0032】

図１Ｃに示す単一チップ内には、２つの別個の、独立して灌流可能なコンパートメントがあり、１つは管腔コンパートメント、１つはマトリックスコンパートメントである。これらのコンパートメントは、細胞チューブによって形成された細胞バリアによって隔てられている。図１Ｆは、３コンパートメントチップの概略図を示し、２つの細胞チューブのそれぞれが、マトリックスコンパートメントに加えて、隔てられた独立した流体接続を有する。

【0033】

特定の用途で用いられる際には、マルチコンパートメントＴＥＭチップを使用して、インビトロで臓器又は組織の構造及び／又は機能単位の組合せを作製することができる。例えば、３コンパートメントＴＥＭチップは、血管細胞から作られたチューブを、組織／臓器特異的細胞から作られたチューブと一緒に統合することができる。管腔で灌流される血管構造をシステムに組み込むことによって、栄養を組織／臓器特異的細胞に供給し、代謝産物を除去して、インビボの血管機能を模することができる。血管を含む又は含まない、種々の細胞源からのチューブの他の組合せも可能である。

【0034】

マトリックスコンパートメントは、細胞、組織及び全身レベルで重要で複雑な役割を果たす、インビボの細胞間隙を模している。チューブ状空洞内に播種された細胞に加えて、マトリックスコンパートメントには、微小環境構造の設計にさらなる柔軟性を加える細胞種が定着することができ、例えば、星状細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、肝細胞を、細胞外マトリックスへの統合のために選択できる。種々の供給源からの多くの他の細胞種が、単独又は組合せで、細胞外マトリックス中に埋め込まれる潜在的候補である。細胞は、マトリックス全体に均一に分散させることもできるし、又はマトリックスに関して特異的な位置に沈着させることもできる。それらは、特定の配列でグループ化し、他の細胞種と組合せ、又はあらかじめ形成された構造（例えば、スフェロイド）として埋め込むこともできる。ＴＥＭチップを用いた予備的研究において示されるように、特定の細胞種を細胞外マトリックスコンパートメントに加えると、細胞チューブを構成する細胞からの細胞応答が影響される。

【0035】

ここで図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄを参照すると、ＨＵＶＥＣで作製された血管細胞チューブを取り囲むマトリックス中への細胞の埋め込みの例が示されている。図２Ａは、血管細胞チューブの近くに埋め込まれたヒト脳星状細胞及び周皮細胞を示している。図２Ｂは、血管細胞チューブの壁に集められて、ＨＵＶＥＣの出芽（図２Ｃ及び図２Ｄに最も良く示されている）を刺激する周皮細胞及び星状細胞を示している。これらの図を一緒に検討すると、細胞応答が他の細胞種の存在によってどのように影響を受けるかがわかる。さらに、非細胞成分（例えば、マイクロ粒子及びナノ粒子、メッシュ又は持続放出材料）も、マトリックスに同様に加えることができる。

【0036】

ＩＶ．組織／臓器特異的モデルの例
ＴＥＭチップシステムの重点は、ヒトの生理機能、病態又は生物活性化合物、例えば、医薬、ワクチン、化粧品若しくは毒性化合物への応答を研究するために、ヒト細胞（初代の又は培養された）と共に使用することに置かれる。しかし、ＴＥＭチップはまた、例えば、動物の生理機能及び病態を研究するための、薬物応答を実験動物から得られたデータと比較するための並びに動物からヒトに伝染する疾患を研究するための動物細胞の使用に適用できる。

【0037】

原理証明を確立するために、多くのＴＥＭチップシステムを開発した。これらには以下が含まれる。
− 「単一臓器」機能サブユニットのインビトロ血管化臓器模倣物としての腎臓、腸及び肝臓３Ｄ組織微小環境、
− 多細胞バリア型システムの機能性を実証する血液脳関門モデル、
− 腫瘍生物学におけるアッセイの適合性を実証する及び腫瘍−内皮相互作用に関する研究のための血管化腫瘍モデル、並びに
− 循環腫瘍細胞が血管を通って移動して転移を形成する能力を研究するための血管外溢出モデル。

【0038】

機能性臓器サブユニットの例示的モデルに関する研究のためのシステムは、細胞チューブのうちの１つが血管に相当する２コンパートメント又は３コンパートメントＴＥＭチップ上に構築できる。３コンパートメントＴＥＭチップにおいて、血管細胞チューブと臓器細胞チューブとの間の距離は、血管細胞チューブから組織／臓器様細胞チューブへの又はその逆の化合物の拡散を促進するために、並びに必要があれば、血管芽と臓器細胞との直接的な細胞間接触を作るために、０．５ｍｍ未満に保つ。しかし、この距離は、必要に応じて容易に調整できる。

【0039】

腎臓モデル
ここで図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃ参照すると、ＨＥＫ２９３チューブ及びＨＵＶＥＣから作製された対応する血管細胞チューブを含む腎臓モデルを示す３コンパートメントモデルの一例が４日間にわたって示されている。示した図に関して、スケールバー＝１５０μｍ。薬物及び他の物質の腎クリアランスの予測のために、ヒト腎臓の多細胞の複雑さ及び３Ｄ構造を捕らえるインビトロモデルが非常に望ましい。腎臓ＴＥＭチップは、コラーゲンＩ内の２つのチューブ状空洞のうちの１つにヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３）を播種することによって作製した。次に、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を第２の空洞に播種し、細胞培養培地を用いて連続的に灌流しながら培養した。

【0040】

さらに図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃを参照すると、示した実験において、腎臓構造には、意図的に灌流させず、栄養及び代謝最終産物の交換は、血管細胞チューブのみによって行った。血管細胞チューブへの及び血管細胞チューブからの栄養の拡散は、少なくとも１週間にわたって腎臓細胞の培養を持続するのに十分であった。機能評価に関しては、管腔灌流を用いて、管腔から細胞への頂端部吸収及び細胞から管腔への排泄を調べることができると同時に、マトリックス灌流を用いて、基底側トランスポーター機能を評価することができる。

【0041】

腸モデル
ここで図４Ａ〜図４Ｃを参照すると、ＨＴ２９細胞株から作製された細胞チューブ及びＨＵＶＥＣから作製された対応する血管細胞チューブを含む腸モデルを含む３コンパートメントセットアップの一例が示されている。示した図に関して、スケールバー＝１５０μｍ。

【0042】

肝臓と共に、腸は、薬物又は毒素の初回通過除去に関与し、経口投与された薬物の吸着を調節する重要なバリア組織である。腸バリアは、タイトジャンクションによって細胞が互いに結合している上皮細胞単層からなる。物質は、主に膜拡散によってこのバリアを横切る。腸から消化管に投与された化合物の循環系への移動を予測することは、薬物候補の評価に極めて重要である。しかし、利用できる、腸バリアのインビトロモデルはいずれも、血管成分を含まない。腸ＴＥＭチップは、薬物及び毒素の吸着に関する研究のために、腸上皮と並列に機能的血管成分を含む。

【0043】

ここで図４Ａと図４Ｂをより具体的に参照すると、ヒト結腸癌由来のＨＴ−２９及びＣａｃｏ−２細胞を利用して、腸様ＴＥＭを作製する細胞チューブを形成した。腎臓モデルと同様に、腸細胞を、チューブ状空洞の１つに播種し、広げた。ＨＵＶＥＣ細胞を第２の空洞に播種し、培養培地を絶えず流しながら培養した。腸細胞を含む細胞チューブは、灌流させず、血管細胞チューブへの及び血管細胞チューブからの代謝物の拡散によって維持した（図４Ｃでもわかる通り）。

【0044】

肝臓モデル
ここで図５Ａに参照すると、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞から作製された肝細胞チューブ及びＨＵＶＥＣで作製された血管細胞チューブを含み、両チューブが第３のコンパートメントによって隔てられている肝臓モデルを示す３コンパートメントモデルの一例が示されている。図５Ｂは、血管を取り囲むマトリックス中に埋め込まれた肝細胞を示す。示した図に関して、スケールバー＝１５０μｍ。

【0045】

肝臓は、血中グルコース恒常性、血漿タンパク質合成、解毒作用、胆汁生成及び輸送などの重要プロセスを調節する。肝臓は複雑であるため、インビトロモデル、例えば、肝臓の細胞成分ホモジネート、並びに薬物の生体内変換を評価するために一般的に使用される初代肝細胞培養物は、肝細胞特異的機能をインビトロで維持することができない。肝細胞の極性及び他の非実質肝細胞との相互作用を含む、３Ｄ微小環境を模した細胞生理機能のインビトロモデルを開発するという重大な必要性がある。さらにまた、肝臓モデルを他の臓器モデルと、特に胃腸バリアモデル及び／又は腎臓のモデルと統合化できるシステムに特別な関心が集まっている。肝臓と共に、これらの臓器は、薬物及び他の化合物を排出する。

【0046】

肝臓ＴＥＭチップにおいては、ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ−Ｇ２）、ＨＵＶＥＣ細胞及びコラーゲンIマトリックスを、主要な成分として使用した。肝類洞を模するために、ＨＵＶＥＣをコラーゲン空洞のうちの一方に播種した。Ｈｅｐ−Ｇ２細胞を、コラーゲン空洞の他方に播種し、増殖させ、広げた（図５Ａに示す通り）。インビボで肝細胞プレートと類似する構造を作製するために、肝細胞も細胞チューブを囲むマトリックス中に埋め込んだ（図５Ｂに示す通り）。培養物は、血管細胞チューブの灌流によって維持した。このようなモデルは、マラリアの前赤血球段階の研究に適合させることができる。初感染後、マラリア原虫は、肝臓に移動し、そこで発育し、第１段階の複製を起こす。この段階の寄生虫の発育は、マラリアワクチン開発のための最も有望な標的に相当するので、研究者にとって極めて興味深い。適合された肝臓チップにおいて、空洞に、初代ヒト肝細胞又は樹立肝細胞癌細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２及びＨＣ−０４を播種することができる。播種後、これらの細胞を、増殖させ、広げて、細胞チューブを形成する。インビボ様類洞肝組織により類似した構造を作製するために、肝細胞を、細胞チューブを取り囲むマリックス中に埋め込むこともできる。細胞チューブ自体に、他の肝臓類洞細胞、例えば、樹立肝細胞共培養細胞株に由来するＫｕｐｆｆｅｒ細胞を補充することができる。次いで、寄生虫を、樹立肝臓組織チップに注入することができる。寄生虫は、肝細胞に侵入して肝臓段階を形成し、肝細胞チューブ又は周囲のマトリックスの灌流によって維持されながら、成熟した及びメロゾイト産生肝臓段階（シゾント）に発育することができる。

【0047】

肝細胞を用いる一例において、微小環境は、前赤血球段階のマラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモディウム・オバール・クルチシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ ｃｕｒｔｉｓｉ）、プラスモディウム・オバール・ワリケリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ ｗａｌｌｉｋｅｒｉ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）及び／又はプラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）の培養に使用できる。

【0048】

血液脳関門モデル
ここで図６Ａ〜図６Ｆを一緒に参照すると、２コンパートメントデバイス中の血管細胞チューブ（初代ヒト微小血管内皮細胞から作製）の壁を横切る傍細胞透過性を特に示す血液脳関門モデルの一例が図示されている。

【0049】

図６Ａは、傾斜照明顕微鏡画像を示す。図６Ｂ〜図６Ｄは、５分間灌流後の血管細胞チューブの広視野蛍光画像である。図６Ｂは、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（ＭＷ３６８）を用いた灌流を示す。図６Ｃは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−デキストラン（ＭＷ４ｋＤａ）を用いた灌流を示す。図６Ｄは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４−デキストラン（ＭＷ１０ｋＤａ）を用いた灌流を示す。この例で、試験した血管細胞チューブ２８個のうち１４個は、ＢＳＡに対して非透過性であることがわかったが、血管細胞チューブ壁の平均透過性は１×１０^−６ｃｍ／ｓ（Ｎ＝２８）と算出され、これは、単離哺乳動物細静脈の透過性（約２×１０^−６ｃｍ／ｓ；Ｙｕａｎ，Ｗ．ら、２００９）に匹敵した。Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎに対する血管細胞チューブの透過性（２．５×１０^−５ｃｍ／ｓ、Ｎ＝２２）は、ラット脳内皮細胞−星状細胞共培養物に関して報告された値（１．１ｘ１０^−５ｃｍ／ｓ；Ｂｌａｓｉｇ，Ｉ．ら、，２００１）に匹敵する。１０Ｋデキストランに対する透過性は、インビボの場合と同様であり、２．７×１０^−７ｃｍ／ｓ（Ｎ＝６）であることがわかった。血管細胞チューブ壁の完全被覆が、内皮マーカーＶＥ−カドヘリン（図６Ｅに示す通り）及びＰＥＣＡＭ（図６Ｆに示す通り）の発現によって実証される。

【0050】

血液脳関門モデルを、２コンパートメントＴＥＭチップとして設計する。血液脳関門モデルは、微小血管内皮細胞、周皮細胞及び星状細胞を含むヒト脳神経血管単位を構成する細胞種から作製した。この組織様環境は、血管細胞チューブを支持する３Ｄ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に埋め込まれたヒト脳周皮細胞及び星状細胞を含み、インビボ構造を模して、異なる細胞種間の物理的接触を可能にする。この血管細胞チューブは、管腔流に曝露される。被験薬物は、血管を通る流体路に加えることができる。血管からの薬物透過は、血管外で収集された流体（ＥＣＭウォッシュアウト）を分析することによって、又は蛍光トレーサーで薬物を可視化することによって、測定できる。

【0051】

ここで図７Ａ及び図７Ｂを参照すると、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（ヒト脳微小血管細胞株）並びにＥＣＭに埋め込まれた周皮細胞及び星状細胞（初代ヒト脳細胞）からなるＢＢＢモデルにおける細胞の再編成が示されている。特に、図７Ａは、マトリックスに埋め込まれた星状細胞及び周皮細胞が、これらの細胞種とＥＣとの綿密な関連をもたらすことを示しており、図７Ｂにおいてみられる血管直径の緩徐な減少を引き起こす。

【0052】

結果は、血管細胞チューブがインビボにおける微小血管内皮の形態的及び機能的特性を示すことを実証している。血管細胞チューブ内の細胞は、内皮の形態を有し、内皮マーカーの典型的な細胞周囲局在を示す（図６Ａ〜図６Ｆに最も良く示される通り）。細胞は、コンタクトインヒビションの形態を有する密集した層を形成する。マトリックスに埋め込まれた星状細胞及び周皮細胞はいずれも、血管細胞チューブに集められ、その形態に対して重大な影響を及ぼす（図７Ａ及び図７Ｂに最も良く示される通り）。ＢＢＢモデルを用いて得られるバリア機能は、他のインビトロＢＢＢモデルに関して発表されたデータと類似しているか、又はそれより優れている。

【0053】

がんモデル
がんＴＥＭチップは、がん細胞と微小血管内皮の細胞との相互作用、例えば、血管内異物侵入及び血管外溢出時のホーミングシグナル（ｈｏｍｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）、腫瘍血管新生並びに新生血管系によって発現されるマーカーに関する研究を可能にするために開発した。重要なことに、このモデルは抗がん薬のスクリーニング並びに他の治療法、例えば、がん細胞及び腫瘍血管系に対する放射線の効果の評価を可能にする。３コンパートメントチップにおいて、細胞チューブの１つには、がん細胞が細胞チューブ又は細胞シリンダーの形態で定着することができ（図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃに関して前記で示した通り）、他の細胞チューブには内皮細胞を播種して、がん細胞チューブに向かって出芽する能力を有する血管細胞チューブを作製することができる（以下でより詳細に論じる図８Ａ〜図８Ｆ及び９Ａ〜図９Ｄを参照のこと）。

【0054】

ここで図８Ａ〜図８Ｆを参照すると、７日間にわたる腫瘍−内皮相互作用の２コンパートメントモデルの一例のインビトロ画像。特に図８Ａを参照すると、チューブ状空洞を作製するために使用されたマンドレルの近くのコラーゲン中に埋め込まれたＢＴ−４７４細胞（乳がん細胞株）のがん細胞クラスターが示されている。次に、図８Ｂで示すように、ＨＵＶＥＣを空洞に播種した。図８Ｃ〜図８Ｆは、「親の」ＨＵＶＥＣチューブからがん細胞に向かって成長した芽の拡大図である。示した図に関して、スケールバー＝１５０μｍ。

【0055】

ここで図９Ａ〜図９Ｄを参照すると、それらは、腫瘍−内皮相互作用の３コンパートメントモデルの一例を１６日間にわたって一緒に示す。図９Ａは、ＨＵＶＥＣチューブ（上部チューブ）の形成後に、１つのコラーゲン空洞（底部チューブ）中に沈着させたＣａｃｏ−２（ヒト結腸直腸腺癌）細胞を示す。図９Ｂは、播種の４日後に親のＨＵＶＥＣ血管から形成された芽を示す。図９Ｃ及び図９Ｄは、底部コラーゲンチャネル中に沈着したヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ−Ｇ２細胞株）、及びＨＵＶＥＣが上部チャネルに播種されたことを示す。示した図に関して、スケールバー＝１５０μｍ。

【0056】

実験のために、ヒト乳がん細胞（ＢＴ−４７４）、結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）及び肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ−Ｇ２）を使用した。２つのチュープ状空洞のうちの一方にがん細胞を、他方にＨＵＶＥＣを播種した。培養物は、血管細胞チューブ（ＨＵＶＥＣチューブ）を通る灌流のみによって維持し、がん細胞が定着した細胞チューブには、灌流させなかった。例えば、図８Ｃ及び図９Ｄに示される通り、血管細胞チューブは、がん細胞構造に向かう芽を発育させた。

【0057】

がん細胞血管外溢出モデル
ここで図１０Ａ及び図１０Ｂを一緒に参照すると、がん細胞血管外溢出の一例が示されている。特に図１０Ａを参照すると、蛍光タグ付き前立腺癌（ＰＣ３）細胞は、ＨＵＶＥＣチューブの管腔に投与され、ＨＵＶＥＣチューブにおいて細胞は、矢印１０によって示されるように、内皮芽の内壁に接着する。

【0058】

ここで図１０Ｂを参照すると、血管外溢出の進行を連続的にモニターできる。播種の２０時間後、矢印１０’によって示されるように、ＰＣ３細胞は内皮を通って周囲のＥＣＭ右画像に移動した。

【0059】

血管外溢出は、循環腫瘍細胞が血管を通って移動して転移を形成する能力である。腫瘍細胞が内皮細胞間結合を透過するメカニズムは、一つには適切なモデルがないことにより、依然として、がん進行において最も理解されていないものの１つである。腫瘍細胞が内皮細胞層を透過するメカニズムに影響を与える因子の研究は、新しいがん治療法につながると期待される。血管外溢出の研究のために現在商業的に入手可能なのは、インビトロモデルの１つの型のみである：１９６０年代にＢｏｙｄｅｎによって走化性に関する研究のために開発された、Ｂｏｙｄｅｎ−Ｃｈａｍｂｅｒ／Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ｌｎｖａｓｉｏｎ−Ａｓｓａｙ。このアッセイは、安価で実施しやすいが、腫瘍細胞及び内皮のリアルタイム観察を可能にしない。加えて、内皮と循環腫瘍細胞との相互作用及び腫瘍細胞変形に対する剪断応力の役割が重要であるにもかかわらず、このアッセイは、静止状態下での腫瘍細胞移動を扱う。ＴＥＭチップは、管腔流の存在下において組織様マトリックス内で出芽微小血管系を用いる腫瘍細胞血管外溢出のリアルタイム研究を可能にする。さらにまた、このモデルは、重要なエレメント、例えば、追加の細胞、細胞外マトリックス、成長因子、並びに灌流パラメーター及び他の物理的条件を加え、変更することができる。例えば、マトリックスに、種々の間質細胞（正常細胞、反応細胞又は老化細胞）、様々ながん細胞種又は患者特異的な細胞（個別化薬物の試験のための）が定着することができる。

【0060】

がん細胞血管外溢出ＴＥＭチップは、２コンパートメント及び３コンパートメントセットアップの両方を用いて設計した。２コンパートメントデバイスにおいては、単一の「親」血管細胞チューブを作製し、その後にそれを血管新生出芽に誘導する。このシステムにおいてそれらの血管外溢出可能性を試験するために、蛍光タグ付き（即ち、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ染料を含む）高転移性ＰＣ−３前立腺癌細胞（図１０Ａにおいて最もよく見える）の懸濁液を、管腔流体流に加えて、血管芽に沈着させた。特定の時間枠内で内皮芽中を通ってマトリックスに移動したがん細胞の割合を、芽内に捕捉されたままであるがん細胞の割合に対して決定することによって、血管外溢出能を測定する。

【0061】

３コンパートメントデバイスにおいては、２つの「親」血管細胞チューブを作製する。その後にその芽が吻合し、毛細血管網を形成する。流体流は、１つの「親」細胞チューブから毛細血管網を経て、動脈及び静脈末端を有する血管床に類似する第２の「親」細胞チューブに送ることができる。がん細胞は、その転移能を評価するために、この血管床を循環させることができる。その後に、内皮細管壁を経たそれらの進行を、連続的に又は時間間隔をあけてモニターすることができる。

【0062】

種々の組織／臓器モデルの統合
ＴＥＭチップ設計は、他と統合してより大きなプラットフォームにすることができる単一モジュールとして個々のチップを使用し、それによって、生理的及び病理学的意義を有する多臓器セットアップ、例えば、腸モジュール、肝臓モジュール及び腎臓モジュールの組合せを作製することを可能にする。それぞれが同一の又は異なる種々の組織／臓器種に相当する２個、３個及び最大で１０個までのＴＥＭチップを有するプラットフォームを、開発のために提示する。

【0063】

これらの統合した多臓器プラットフォームは、薬物候補及び他の物質の毒性効果を、個々の臓器培養物だけでなく、対応する順序での複数の臓器モデルの複合臓器システム（例えば腸、肝臓及び腎臓）に対して検討するための新規方法を提示する。このようなセットアップは、同じ臓器の構造／機能サブユニット（例えば、遠位腎尿細管に関して近位の）の組合せ又は異なる臓器（例えば、腸バリアと肝臓及び血液脳関門）の組合せを含み得る。一方向循環流システムを設計した。図１１〜図１３は、後述のように４〜１０個のＴＥＭチップを統合する流体セットアップを示す。

【0064】

ここで図１１を参照すると、各チップが異なる臓器に相当する複合システムを形成する４つの接続されたＴＥＭチップの一例が図示されている。腎臓、腸及びＢＢＢ ＴＥＭチップに接続された中央の２コンパートメント肝臓ＴＥＭチップ。他の臓器種のＴＥＭも、研究者の所望に応じて加えることができる。全てのモジュールは、血管（「血液」）流に相当する共通の流体路を共有する。酸素を流れに拡散させて、存在しない生理的システム（例えば、肺）に代えることができる。Ｉ１は、腸細胞チューブによって吸収されて血管細胞チューブに移される栄養の注入用ポートを表す。Ｅ１は、分析、例えば、グルコースモニタリングのために流体を抜き取るためのポートを表す。測定（例：酸素、ｐＨ）のためにこれらの点でセンサーを直接挿入できることに留意されたい。Ｉ２は、肝臓によって緩衝化及び吸収される化合物の注入用ポートを表し、Ｅ２は、肝臓チップによって濾過される流体を抜き取るためのポートを表し、前記化合物の濃度及びその動態の変化の研究から、予備的肝臓機能が示される。Ｉ３−Ｅ３は、肝臓モジュールから胆汁を抜き取るためのポートを表す。Ｉ４は、血液脳関門試験のための化合物の注入用ポートを表し、ポートＥ４及びＥ５から、バリア機能の測定のための試料を抜き取る。Ｉ５は、腎臓チップへの、例えば窒素含有物質の、注入用ポートを表す。ポートＥ７から、この腎臓モジュールの近位腎尿細管からの試料を抜き取り、窒素含有物質について分析する。ポートＩ６においてグルコース溶液を注入し、ポートＥ６を大気に開放したままにしておき、グルコース溶液がマトリックスコンパートメント中に集まるかどうかチェックすることによって、他の腎機能を実証できる。

【0065】

ここで図１２を参照すると、各チップが異なる臓器に相当する４つのＴＥＭチップを接続するための、複合システムの代替構造の一例が図示されている。中央の３コンパートメント肝臓チップは、腎臓、腸及びＢＢＢ ＴＥＭチップに接続されている。

【0066】

ここで図１３を参照すると、代替構造の一例は、１つの回路に統合された複数のさらに多くの生理的モジュールを使用する代替構造の一例を示している。３つの遮断弁対５０Ａ、５０Ｂ及び５０Ｃのうちの１つが、所定の任意の時間に機能している。遮断部のための再循環ポンプ（図示せず）が、必要とされることもある。

【0067】

ここまで、インビトロで組織及び臓器の複数のコンパートメント化微小環境を作製するためのマイクロ流体システムについて記載した。前記で開示したシステムは、別個のコンパートメントの独立した灌流を可能にする。このシステムは、インビボ機能を模した組織及び臓器のインビトロモデルを作製するために設計されている。

【0068】

簡潔に要約すると、マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの空洞を取り囲むマトリックスで満たされたチャンバーを含む。デバイスの流体チャネルの、チャンバーへの接続は、空洞中を流れる流体がマトリックスと接続せず且つマトリックス中を流れる流体が空洞と接続しないように行う。複数の細胞種を空洞に播種することができ、空洞で、細胞は機能的な組織又は臓器単位を形成することができる。空洞内の細胞は、バリアを形成する細胞膜によってマトリックスと隔てられている。したがって、細胞付着又は足場材料のために人工材料は必要ない。このシステムの重要な特徴としては、コンパートメント化されたセットアップ、人工材料がないこと及び独立した灌流能が挙げられる。

【0069】

これらの特徴は一緒になって、システムがインビボ環境を厳密に模することができるようにし、組織生物学の複数の側面を研究する柔軟性を使用者に与える。特に、細胞膜によって隔てられたコンパートメントに独立して灌流する能力により、これまでは実行不可能であった実験を行うことが可能となる。これらには、細胞バリアに関連した実験、例えば、種々の刺激に応答する特異的な細胞のバリア能力の検討、及び細胞バリアを横切る種々の化合物の輸送の検討が含まれる。さらに、研究者は、サイトカイン又は薬物代謝産物のような種々の細胞アウトプットを単離するために、複数のコンパートメントから独立して試料を抜き取ることができる。勾配は１つの空洞から作製でき、細胞の影響は、第２の空洞に定着している別個の組織又は細胞において研究できる。最後に、このシステムにより、使用者は複数の組織間の相互作用を研究できる。これは、種々の組織及び刺激がどのように相互作用するかを理解するために複数のマイクロ流体デバイスを接続する場合に特に重要である。このシステムを使用する場合、モジュールは血管（「血液」）流に相当する共通の流体路を共有し、研究者は、どのように化合物が代謝され且つ種々の刺激に応答して組織機能が影響され得るかを正確に予測できるようになる。

【0070】

寄生虫の培養環境として無脊椎動物組織及び臓器の機能単位を再現するための用途に関する説明
上記で基本的なマイクロ流体デバイスについて記載したが、次にこれらのデバイスのより具体的な用途を、特にワクチン研究用途に関して扱う。ここでの例は蚊中腸チップ及び細胞を扱うが、本発明はそのように限定するものではない。他の無脊椎動物の細胞を種々の他の用途に使用できることは、この開示の利益を有する当業者には理解されるであろう。例えば、ダニ媒介疾患、例えば、ライム病及び他の関連状態などに関連した潜在的薬物を分析するためにダニ細胞をダニ細胞チップに使用できることが企図される。同様に、マラリアなどを含む寄生虫疾患のための試験チップを作るために、ショウジョウバエからの細胞を使用できる。ここでの例は蚊中腸環境の要約を扱うが、それは、他の無脊椎動物組織、例えば、プラスモディウム属スポロゾイトの培養のための蚊唾液腺微小環境を作製するためにも使用できる。

【0071】

再び図１Ａ〜図１Ｃを同時に参照すると、ＴＥＭチップ設計の一例が示されており、図１Ａは、容易に組み立てられるＴＥＭチップの写真を示し、図１Ｂは、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡのＮｏｒｔｉｓ，Ｉｎｃ．によって構築された２コンパートメントシステムの詳細な概略図を示している。図１Ｃに示されている単一チップ内には、２つの別個の、独立して灌流可能なコンパートメントがあり、１つは管腔コンパートメントであり、１つはマトリックスコンパートメントである。これらのコンパートメントは、細胞チューブによって形成された細胞バリアによって隔てられている。Ｎｏｒｔｉｓチップにおいて、マトリックスコンパートメントは細胞外マトリックスを含み、細胞外マトリックスは、結合組織又は間隙の形態で組織及び血管を自然に取り囲んでいる。両コンパートメントは一緒になって、培養デバイスの独特な構造を生じ、新規で且つシステムに特有である実質的な有益をもたらす。必要に応じて、中腸組織を構成する細胞チューブへの栄養の供給は、作製された細胞チューブを経て適用されるのではなく、側部の灌流ポートからの及び細胞チューブの周囲の培地流を経て行い得る。組織特異的細胞及び細胞チューブ管腔からの流れのこの空間的分離は、培地流から剪断応力による損傷及び撹乱から両者を保護すると同時に、拡散による最適な栄養補助も可能にする。

【0072】

チューブ状空洞内に播種された細胞に加えて、細胞外マトリックスコンパートメントには、個々の実験計画に望ましい細胞が定着することができる。このコンパートメントは、細胞チューブと独立して灌流させることができ、細胞分析又は生化学分析のために試料を取り出すことができる。初代蚊中腸細胞又は樹立蚊細胞株からの細胞を選択して、統合し、細胞外マトリックスに埋め込むことができる。種々の供給源（例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））からの他の細胞種も、単独又は組合せで、同様に細胞外マトリックスに埋め込まれる潜在的候補である。

【0073】

追加の細胞及び細胞種がマトリックスコンパートメントに定着するための選択肢によって、細胞増殖、成長及び組織化の操作につながる実験条件のさらなる変数、例えば、細胞培養培地及び環境の状態調節の刺激が可能になる。他の組織微小環境を用いた予備的研究において示されるように、特定の細胞種を細胞外マトリックスコンパートメントに加える（典型的には、生物学的マトリックスに細胞を混ぜることによって行う）と、細胞チューブを構成する細胞からの細胞応答が影響を受ける。

【実施例1】

【0074】

蚊中腸微小環境
ここに開示するＴＥＭチップシステムの重点は、蚊中腸様生理機能を発生させ且つ熱帯熱マラリア原虫の昆虫段階の培養を成功させることができる微小環境を作製するために、蚊中腸細胞（初代の又は培養された）を使用することに置かれる。しかし、ここに記載するＴＥＭチップは、他のプラスモディウム属種、例えば、三日熱マラリア原虫又はマウス寄生虫種のプラスモディウム・ベルゲイ、熱帯熱マラリア原虫及びプラスモディウム・ヨエリを培養するのに同様に使用できる。このシステムは、潜在的なマラリアワクチン候補、伝染阻止ワクチン候補又は他の抗マラリア化合物の試験のために最適化されたプラットフォームを提供し、インビトロマラリア原虫培養物に対する及び古典的な膜フィーディングアッセイの現在の「ゴールドスタンダード」の実質的な改善を可能にする。

【0075】

蚊細胞の培養環境としてのＴＥＭチップの適性のための原理証明を確立するために、樹立蚊細胞株からＴＥＭチップに細胞を播種してコンフルエンスまで培養する予備的なシステムを開発した。このシステムは、蚊中腸様構造に相当する細胞チューブを含む２コンパートメントチップ上に構築する。

【0076】

細胞外マトリックスコンパートメントは、コラーゲンＩから構成し、内側の、空洞表面は、細胞播種の前にポリ−Ｌ−リシンでコーティングした。コラーゲンＩ表面のコーティングは、室温においてコラーゲン空洞に１０μｇ／ｍｌポリ−Ｌリシン溶液を流量０．２５〜５μｌ／分で１時間にわたって管腔灌流させることによって行った。

【0077】

細胞チューブは、蚊幼虫の細胞調製物に由来する培養された不死化蚊細胞（４Ａ−３Ｂ細胞）であって、公表され、ＡＴＣＣ／ＭＲ４に既に寄託されている細胞（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋ． Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｏｄｅｓ、Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、２００２）によって形成した。細胞を、緩和なトリプシン処理後に細胞培養血管から採取し、細胞１００万個／ｍｌの濃度でＮ１セプタムから注入し、室温で流量５ｍｌ／分で約１５分間循環させた。４Ａ−３Ｂ細胞の培養物を、最初の培養血管中及びＴＥＭチップの内部の両方において、１０％不活性化ウシ胎仔血清を補充したＳｃｈｎｅｉｄｅｒｓ昆虫培養培地で維持した。播種後、新鮮な培地の流量を終夜維持し、コラーゲン空洞の管腔壁に細胞を付着させた。その後、チップ内における生存能力、持続的な細胞接着及び細胞維持を確実にするために新鮮な培地を０．２５〜５μｌ／分で絶えず流しながら、細胞を最高でさらに５日間にわたってチップ内で培養した。

【0078】

その結果、それらの蚊細胞から作製した組織は、環状の単細胞単層コーティングとして細胞チューブ管腔の内側面を形成し、したがって、まさに期待通りに所望の細胞チューブを形成する。細胞には、細胞チューブ管腔を経て灌流によって栄養を供給した。

【0079】

既にかなり有望である不死化蚊胚細胞を用いた予備的な実験によれば、他の蚊由来細胞種がチップにおいて等しく機能できると考えられる。したがって、新たに切開した蚊中腸から直接単離した初代細胞又は樹立細胞の使用は、将来の実験への使用に対して、作製された蚊中腸環境がネイティブ組織に最もよく類似することを確実にするために計画される。

【0080】

ここで図１４Ａ〜図１４Ｃを同時に参照すると、蚊の４Ａ−３Ａ細胞コーティング細管が５日間にわたって発育している細胞チューブを示す２コンパートメント蚊中腸チップの一例が示されている。画像は、蚊細胞が播種された蚊細胞チップ及びＴＥＭチップ内に形成された蚊細胞チューブを示す。図１４Ａは、１日目の、播種された細胞を含むコラーゲン空洞を示す。図１４Ｂは、２日後の、図１４Ａと同一の細胞チューブを示し、蚊細胞が付着して、広がっている。図１４Ｃは、５日目の、同一細胞チューブを示し、細胞は依然として付着しており、コンフルエンスまで成長している。

【実施例2】

【0081】

熱帯熱マラリア原虫の培養環境
有用な一実施形態において、前記の蚊中腸チップ内におけるプラスモディウム属の昆虫段階のための培養環境を作製するためのチップモデルを設計した。目標とするエンドポイント段階は、スポロゾイト産生オーシストである。これは、いくつかの、生存可能なより早期の段階の完了を必要とし、したがって最適培養環境内で行われる必要がある寄生虫生活環の後期段階である。プラスモディウム属の寄生虫は、宿主血流中の赤血球（ＲＢＣ）においてみられる無性生活環で反復複製される。

【0082】

時間が経つにつれて、発育中の寄生虫の一部は、さらなる複製無性段階へと発育する代わりに、有性段階へと発育し、休止する。血粉後に蚊中腸に移行すると、成熟した有性段階（生殖母細胞）はＲＢＣから出て、互いに受精し、運動性のオーキネートに変わる。これらの細胞は、中腸上皮の通過によって中腸環境から能動的に出て行き、上皮と周囲の基底膜との間の外側境界面にとどまり、それが次に蚊血リンパによって取り囲まれる。そこで、オーキネートはオーシストに変わって、成長し始め、次いで、感染段階のスポロゾイトを産生して、最終的に放出する。これは次に、蚊によって次のホストに移され、周期を永続させる。したがって、オーシストの発育を支持する培養環境を作製するためには、受精及びオーキネート形成を可能にする環境を提供しなければならない。別の研究所によって以前のプロジェクトにおいて適合され且つ最適化された以前の研究を利用でき、これがそれらの条件の特定につながった。これにより、我々は、非常に予備な培養環境において早期段階のオーシストを産生させることができる（以下に記載する図１５Ａ〜図１５Ｆを参照のこと）。

【0083】

ここで図１５Ａ〜図１５Ｆを同時に参照すると、非常に予備的な培養環境における早期段階のオーシストの例が示されている。

【0084】

ここで特に図１５Ａを参照すると、図１に示したセットアップによって作製されたＧＦＰ発現オーシストの例示的な画像が示されている。

【0085】

ここで特に図１５Ｂを参照すると、インビトロで産生されたオーシストの例示的な画像が示されている。これは、膜フィーディングアッセイによって、それらのサイズ及び形状が、インビボで産生されたオーシストと同一であることを示している。

【0086】

ここで特に図１５Ｃ〜図１５Ｆを参照すると、正常な発育の指標であるスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）を発現する、インビトロで産生されたオーシストの一例が示されている。（図１５Ｃ）位相コントラスト、（図１５Ｄ）ＤＡＰＩ、（図１５Ｆ）ＣＳＰ標識、（図１５Ｅ）オーバレイ。ここで、図１５Ｃに示される通り、スケールバー＝１０ミクロン。

【0087】

本発明の方法及びシステムに対する理解をさらに深めるため、あらかじめ決定した培養条件を蚊中腸チップに適用することによる、はるかに精巧なアプローチを、以下に初めて開示する。

【0088】

予備的な研究は、いくつかの因子、中でも、赤血球及び蚊蛹からの抽出物によって強化された培養培地を用いて寄生虫と共培養された蚊細胞の有益な効果を示している。Ｎｏｒｔｉｓ ＴＥＭチップを用いることによって、それらの要求の実質的に全てに対応することができ、別の重要な特徴によってさらに最適化される培養環境を提供できる。これまで公表されている全ての他のアプローチとは異なり、蚊中腸ＴＥＭチップ中の共培養された細胞は、「内側」及び「外側」細胞表面アセンブリーにそれらの細胞構造を分極化させる能力を有し、したがって、いかなる先行研究において達成されたものよりはるかにネイティブ環境に近い細胞表面受容体のレパートリーを移動性のオーキネートに提供する。

【0089】

培養された寄生虫を容易に可視化できるようにするために、ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を構成的に発現する、別の研究所であらかじめ生成された、トランスフェクトされている寄生虫を使用する。作製された中腸の管腔を、高密度に充填されたＲＢＣが完全に満たす状態に達するまで、赤血球の懸濁液を、強化された、高濃度の成熟した寄生虫生殖母細胞又は強化された寄生虫オーキネートと共に（図１７Ａ〜１７Ｆを参照のこと）、蚊中腸チップの管腔に注入する。生殖母細胞は、あらかじめ開発されたプロトコールを用いて産生させる。性的に決定された寄生虫の１６日培養物を、３７℃において成熟するまで培養する。その後、注入前に、寄生虫を強化して、より高い鞭毛発生率、受精効率及びオーキネート収率を可能にする。強化は、ＭＡＣカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上で寄生虫を磁気的に濃縮することによって達成する。この簡便なアプローチは、寄生虫の鉄−ヘモゾイン含有量のために可能である。この技術は、寄生虫含有赤血球の比率を最大で５０％とする。温度を２６℃に低下させると、寄生虫の鞭毛発生が誘発され、条件が最適である場合には、ＲＢＣが充填された中腸管腔内で受精及びオーキネート形成が引き起こされる。

【0090】

接種後の次の最初の２４時間において、公表されたプロトコールに基づいて開発された「オーキネート培地」を灌流させることによって、培養物を維持する。培養培地の灌流は、細胞チューブを経て又は側部の灌流ポートを経て維持される。２４〜２６℃において２４時間後には、オーキネートは、十分に発育しており、運動性で且つ中腸管腔から出て行こうとしているはずである。これは、ＴＥＭチップの材料が透明であるために、培養を中断することなく、顕微鏡によってリアルタイムにモニターできると我々が予測するプロセスである。

【0091】

オーキネート発育の完了後、培地を、既に前記グループによって開発された「オーシスト培地」に置き換え、側部のポート及びチューブ周囲のマトリックスを通して灌流させる。前述と同様に、このプロセスにおいて、細胞チューブ内の発育中の培養物を連続的にモニターする。中腸壁の反管腔側に固着すると、寄生虫は、オーシストに変わると予想される。しかし、培養条件及び蚊細胞との共培養は、例えば、培養培地をさらに状態調整するためにチューブ周囲のマトリックスの内部に追加の蚊細胞を播種することによって、最適結果を達成するように調整しなければならない可能性がある。ＧＦＰを発現する寄生虫は、自動顕微鏡及びカメラソフトウェアによって容易に検出可能な強力な蛍光を発するので、１０〜１２日間の連続培養後に、蚊中腸チップ当たりの発育オーシストの数を手動で又は自動的にカウントすることができる。システムが１２日目にどのように発育するはずであるかという予測を示す概略イメージに関しては、以下に記載する図１６を参照のこと。

【0092】

ここで特に図１６を参照すると、中腸チップの一例が概略的に示されている。蚊中腸上皮細胞１６２から作製された細胞チューブの管腔１６０には、マラリア感染赤血球の懸濁液が装填されている。寄生虫１６４は、有性生殖を受け、中腸上皮を通って周囲のマトリックス１７０に移動し、そこでオーシスト（ＯＣ）１７２に変わる。ＯＣは、明るい蛍光を発する球（直径約２０ミクロン）のように見える。アッセイの読み出し情報は、中腸の反管腔側のＯＣの数である。ＯＣカウントが少ないほど、被験化合物の伝染阻止活性は高い。微小環境は、成長培地の灌流によって維持される。

【0093】

実現可能性が確実に立証されたら、中腸チップ及び培養条件を最適化して、中腸微小環境当たりのオーシストの収率を増大し、したがってチップ当たりの可能な実験の統計的妥当性を高めることができる。培養条件を最適化する他に、Ｎｏｒｔｉｓ ＴＥＭチップの特性及びその製作法により、１つのチップ内でより長い中腸チューブ又は複数の中腸チューブのより長い配列を作製することが可能である。これにより、オーシストをとどまらせ、発育する全体的な培養体積及び表面を増加させることができる。したがって、チップ当たりの数百個のオーシストが達成可能であり得る。

【0094】

確立されたオーシスト培養プロトコールを用いれば、マラリアワクチン又は伝染阻止ワクチンのための潜在的化合物に関する研究にこのシステムを適用できる。しかし、成熟の状態まで発育しているオーシストを用いると、このシステムは、インビトロで多数の熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトを生じる、これまでに記載された第１の選択肢−非常に必要とされているマラリアワクチンを生成するのに不可欠なステップ−を提供する。

【0095】

ここで図１７Ａ〜図１７Ｄを参照すると、ＲＢＣの懸濁液中における受精の４８時間後における、強化されたＧＦＰ発現熱帯熱マラリア原虫オーキネートの一例が示されている。図１７Ａ及び図１７Ｃは、ＧＦＰ蛍光下で撮影された。図１７Ｂ及び図１７Ｄは、透射光を使用して撮影された。

【0096】

ここで図１７Ｅ〜図１７Ｆを参照すると、接合子並びに発育中及び成熟したオーキネートの段階における、注入ＧＦＰ発現寄生虫を含む４Ａ−３Ｂ細胞の細胞チューブを含む一例が示されている。図１７Ｅは、ＧＦＰ蛍光下で撮影された。図１７Ｆは、透射光を使用して撮影された。

【0097】

本発明は、特許法に従うように及び本発明の新規原理を適用するのに必要な情報を当業者に提供するために、並びに必要とされるこのような例示的な及び特殊な成分を構築及び使用するために、本明細書中でかなり詳細に説明した。しかし、本発明は明確に異なる装置並びにデバイス及び再構成アルゴリズムによって実施できること、並びに装置の詳細及び操作手順の両方に関する種々の変更形態を、本発明の真の意図及び範囲から逸脱することなく達成できることを理解すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【図17F】