特許 6397938 Ｂリンパ球のＣＤ２３と架橋するが肥満細胞を感作しないヒト化抗ＩｇＥ抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6397938

(24)【登録日】2018年9月7日

(45)【発行日】2018年9月26日

(54)【発明の名称】Ｂリンパ球のＣＤ２３と架橋するが肥満細胞を感作しないヒト化抗ＩｇＥ抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/42 20060101AFI20180913BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20180913BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20180913BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20180913BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20180913BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20180913BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20180913BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20180913BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/42ZNA

   C07K16/46

   A61K39/395 G

   A61K39/395 U

   A61P37/08

   A61P11/06

   A61P11/02

   A61P17/04

   !C12N15/13

【請求項の数】15

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2016-571309(P2016-571309)

(86)(22)【出願日】2015年6月16日

(65)【公表番号】特表2017-518320(P2017-518320A)

(43)【公表日】2017年7月6日

(86)【国際出願番号】US2015035981

(87)【国際公開番号】WO2015195631

(87)【国際公開日】20151223

【審査請求日】2016年12月2日

(31)【優先権主張番号】62/013,196

(32)【優先日】2014年6月17日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】596118493

【氏名又は名称】アカデミア シニカ

【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】チェン、ジュン−ボ

(72)【発明者】

【氏名】ション、ユ−ユ

(72)【発明者】

【氏名】チャン、チェ−ワン

【審査官】 上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】 特許第３２７６３６９（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 Immunobiology，２０１２年，Vol.217，p.676-683

【文献】 Respiratory Medicine，２００９年，Vol.103，p.1098-1113

【文献】 Medscape General Medicine，２００５年，Vo.7, No.1，No.27（p.1-23）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／４２

Ｃ０７Ｋ １６／４６

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

遊離IgE、Bリンパ球上の膜結合IgEまたはCD23に結合するIgEに結合するが、FcεRIに結合するIgEには結合しないヒト化抗体であって、
前記ヒト化抗体が重鎖可変領域（V_H）と、軽鎖可変領域（V_L）とを含み、
前記重鎖可変領域（V_H）が、SEQ ID NO: 5の配列を有するCDR-H1、SEQ ID NO: 6の配列を有するCDR-H2、及びSEQ ID NO: 7の配列を有するCDR-H3であり、
前記軽鎖可変領域（V_L）が、SEQ ID NO: 8の配列を有するCDR-L1、SEQ ID NO: 9の配列を有するCDR-L2、及びSEQ ID NO: 10の配列を有するCDR-L3である、ヒト化抗体。

【請求項2】

Bリンパ球上のIgE結合CD23と架橋する請求項１に記載のヒト化抗体。

【請求項3】

Bリンパ球による前記総IgEの産生量を減少させる請求項１に記載のヒト化抗体。

【請求項4】

抗原により活性化されたBリンパ球による抗原特異的前記IgE産生を減少させる請求項１に記載のヒト化抗体。

【請求項5】

前記ヒト化抗体で処置した患者においてIgE産生を減少させる請求項１に記載のヒト化抗体。

【請求項6】

前記抗体が抗原結合フラグメントである請求項１に記載のヒト化抗体。

【請求項7】

前記抗原結合フラグメントが、Fab、F（ab'）₂または一本鎖Fvである請求項６に記載のヒト化抗体。

【請求項8】

前記ヒト化抗体のV_H及びV_LがヒトBリンパ球に由来する請求項１に記載のヒト化抗体。

【請求項9】

マウス8D6抗体のIgE結合特性のセットを有する請求項１に記載のヒト化抗体。

【請求項10】

前記重鎖可変領域（V_H）が、SEQ ID NO:2と同一であるアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:2における１つ以上のフレームワーク領域における１つ以上の突然変異からなるSEQ ID NO:2と少なくとも90％が同一であるアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変領域（V_L）が、SEQ ID NO:4と同一であるアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:4の１つ以上のフレームワーク領域における１つ以上の突然変異からなるSEQ ID NO:4と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたヒト化抗体。

【請求項11】

請求項１〜１０の何れかに記載の治療有効量のヒト化抗体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項12】

請求項１〜１０の何れかに記載のヒト化抗体を用いて、IgE媒介疾患の治療に使用する薬剤の製造への用途。

【請求項13】

前記IgE媒介疾患が、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、慢性自発性（特発性）蕁麻疹、慢性鼻副鼻腔炎、全身性肥満細胞症、皮膚肥満細胞症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、再発性特発性血管性浮腫及び好酸球性関連胃腸障害である、請求項１２に記載の用途。

【請求項14】

有効量で患者に投与されるヒト化抗体は、IgE、膜結合IgE又はCD23結合IgEに結合することができるが、FcεRI結合IgEに結合できず且つ肥満細胞及び好塩基球の脱顆粒を誘導することができない、請求項１２に記載の用途。

【請求項15】

前記ヒト化抗体は、有効量で患者に投与され、患者のIgEとの免疫複合体を形成し、前記免疫複合体は、CD23に結合し、且つCD23に架橋することができるが、FcεRIに結合できず、肥満細胞及び好塩基球の脱顆粒を誘発することができない、請求項１２に記載の用途。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１４年６月１７日に出願された米国仮出願第62/013196号の優先権を主張し、その全体がここに参照文献として援用される。

【0002】

本発明はヒト化抗体の作成に関する。該ヒト化抗体は、遊離IgE、Bリンパ球の膜結合IgE、或いはCD23結合IgEと結合できるが、肥満細胞上の高親和性IgE.Fcレセプターに結合したIgEとは結合できない。本発明はまた、該抗体が、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、慢性自発性（特発性）蕁麻疹、慢性鼻副鼻腔炎、全身性肥満細胞症、皮膚肥満細胞症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、再発性特発性血管浮腫、及び好酸球性消化管疾患を含む、IgE媒介疾患の治療における治療用途等に関する。

【背景技術】

【0003】

アレルギーは、外来の無害な抗原に対する過剰な免疫応答により誘導される過敏状態である。即時過敏症（immediate hypersensitivity）は、免疫グロブリンE（IgE）と、肥満細胞及び好塩基球の表面に存在する高親和性IgE.Fc受容体（FcεRI）との相互作用により、アレルゲンの存在下で発生し、該アレルゲンはFcεRI結合IgEと反応することができ、炎症細胞の実行及び新規合成されるメディエイターの放出を引き起こす。多くのアレルギー性疾患はIgE媒介性である。幾つかの非アレルギー性疾患は外来抗原に対する免疫応答を伴わず、特に、炎症性皮膚疾患もIgE媒介性であることはよく知られている。

【0004】

IgEは、FcεRI及び低親和性IgE.Fc受容体FcεRII（CD23とも呼ばれる）の２つのメジャーな受容体がある。FcεRIは、主に人の肥満細胞および好塩基球の表面で発現され、一本のα鎖、一本のβ鎖及び２本のジスルフィド結合のγ鎖からなる四量体の複合体である。アレルゲンによる肥満細胞及び好塩基球上のFcεRIの活性化は脱顆粒（degranulation）を引き起こすが、樹状細胞上のFcεRIの活性化はIgE媒介のアレルゲン提示を引き起こす。

【0005】

CD23は、分子量が約45kDaのC型レクチン様ドメイン（C-type lectin-like domain）を含むII型膜貫通糖タンパク質であり、更に、ストーク領域（stalk region）、一つの膜貫通領域（membrane-spanning region）及び一つの短いN末端細胞質ドメイン（N-terminal cytoplasmic domain）を含み、ここで、ストーク領域は、推定ロイシンジッパーとしてコイルドコイル三量体（coiled-coil trimers）を形成するための複数の重複配列を有する。実際、単量体CD23のIgEに対する親和性（KD=10^-6〜10^-7M）は、FcεRIに対する親和性（KD=約10^-10M）より遥かに低いが、実質的三量体型に対する親和力よりは遥かに高い（KD=10^-8〜10^-9M）。CD23ポリペプチドをコードするFCER2遺伝子は、２種のmRNAを変異体の合成を駆動する２つの代替転写開始点を有し、２種のmRNA変異体は２種のCD23のアイソフォームの発生を引き起こし、該アイソフォームは、N末端細胞質尾部の前から７つ目(CD23a)及び６つ目(CD23b)のアミノ酸とは異なる。CD23aは、独占的且つ連続的にB細胞によって発現される一方、CD23bは、単球/マクロファージ、B細胞、T細胞、好酸球、樹状細胞及び上皮細胞の表面でIL-4によって誘導される。B細胞上のCD23は、IgEの産生および抗原提示の制御に寄与すると考えられるが、マクロファージ及び樹状細胞上のCD23は、食作用/エンドサイトーシス、抗原-IgE複合体のクリアランス及び抗原提示に関与する。上皮細胞上のCD23の追加機能として、IgEの輸送が含まれる。抗原-IgE複合体は、上皮を貫通して直接内腔空間（lumen space）に浸透し、逆の場合も同じである。また、CD23は、37、33、25及び16kDaの遊離の可溶性CD23（sCD23）タンパク質の形式で、細胞表面から放出されることもできる。体内でCD23脱落に関与する主な金属プロテアーゼはADAM10遺伝子であり、三量体型の37kDa或いは35kDaのsCD23種を生成する。また、天然に存在するsCD23として、チリダニ（dermatophagoides pteronyssinus）の糞で発見されたDer p1プロテアーゼの作用によって生成されたderCD23がある。Der P1によるCD23の分解により、16kDaの単量体derCD23が生成される。これは、三量体のsCD23のフラグメントは自発的IgE合成を促進する鍵分子であるが、比較的小さい単量体のsCD23はIL-4刺激によるIgE合成をダウンレギュレート（down-regulate）することを示している。

【0006】

IgEは、分泌型および膜結合型で存在し、スプライシング変異体（splicing variants）であると思われる。分泌型IgEのε鎖の定常領域にはC_H1-C_H2-C_H3-C_H4ドメインが存在するが、膜結合IgE（mIgE）を有する膜結合型IgEのε鎖では、二つのアイソフォームが選択的スプライシングの結果として人体で発見された。ヒトmIgEの２つのアイソフォームのε鎖はmigis-ε及び膜アンカーペプチド（membrane-anchoring peptide）を含む。一方のアイソフォームは、C_H4ドメインと膜アンカーペプチドとの間にmigis-εペプチド（１５アミノ酸長）（「ショート型」と呼ぶ）のみ含むが、他方のアイソフォームは、C_H4ドメインとmigis-εペプチドとの間にエキストラ５２アミノ酸長のドメイン（CεmXドメインと呼ぶ）（「ロング型」と呼ぶ）を更に含む。

【0007】

IgEは、ほとんどのアレルギー疾患の媒介において中心的な役割を果たしているため、現在、体内のIgEレベルの制御或いはIgE合成の規制のためのいくつかの戦略が提案され、例えば、抗IgE、抗IL-4/IL-13及び抗CD23等がある。オマリズマブ（Omalizumab）（XolairR）は組換えヒト化モノクローナル抗IgE抗体で、血清中で循環する遊離IgE及びB細胞上の膜結合IgEと結合することができるが、FcεRI結合およびCD23結合IgEは細胞の表面上に存在しない。オマリズマブは、アレルギー患者の血清中の遊離IgEを顕著に減少させ（最大９９％）、IgEがFcεRIへの結合を阻害し、続いて好塩基球および肥満細胞に対するFcεRIのダウンレギュレーションを誘導する。アレルギー性喘息、慢性蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎等のIgE媒介疾患における多数の臨床試験では、オマリズマブはこれらの疾患の治療に有効かつ安全であることを示している。オマリズマブは、多くの国で重度なアレルギー性喘息および慢性特発性蕁麻疹の治療用として承認されている。また、ルミリキシマブ（lumiliximab）は、霊長類（カニクイザル）可変領域およびヒト定常領域からなる抗CD23モノクローナル抗体であり、ルミリキシマブがC型レクチンドメインに結合し、IgEのCD23への結合を防止することにより、表面CD23を安定化させ且つCD23のタンパク質分解的切断を減少できることが見出された。ルミリキシマブは、生殖系列ε転写を阻害し、培養中のヒト末梢血単核細胞（PBMCs）のIgE産生を減少させ、アレルギー患者の血中IgEレベルを低下させることが報告されている。

【0008】

1990年の特許（米国特許第4940782号）において、ラットIgEに対し特異的であるマウス（murine）IgGモノクローナル抗体44.7bが開示され、該抗体はCD23結合IgEと結合することができるが、FcεRIに結合したIgEと結合することができないことが開示されている。このような抗体44.7bは、IgE媒介疾患を治療するための治療候補として用いられたことはなかった。2012年に発表された論文（Shiung et al., Immunobiology, 2012, 217:676-683）では、マウス抗ヒトIgEモノクローナル抗体8D6が発見されたことが発表され、該抗体はCD23結合IgEと結合することができるが、FcεRIに結合したIgEと結合することができないことが発表された。著者らは、この抗体は、肥満細胞および好塩基球の感作を伴わずIgEを中和するオマリズマブの重要な薬理学的特性を有するだけではなく、CD23結合IgEと架橋するルミリキシマブの特性も有する、ことを示唆した。しかし、マウス抗体は免疫原性を有する可能性があるため、IgE媒介疾患を治療するために用いることができない。ヒトにおける治療用途のためのマウス抗体は、患者がマウス抗体に対して作られた免疫応答によって制限されることがわかった。従って、マウス抗体のヒト化は、ヒトのレシピエントにおける免疫原性を低下させるために必要である。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、（１）分泌遊離型ヒトIgE、（２）Bリンパ球上の膜結合IgE、及び（３）B細胞上のCD23に結合するIgE及び溶液中の遊離CD23に結合するIgE、と結合するヒト化抗体に関するものである。このような抗IgE抗体は、肥満細胞および好塩基球上のFcεRI結合IgEには結合しないため、それらの炎症細胞を活性化しない。また、本発明はIgEの生合成においてのヒト化抗IgE抗体の生物学的特性、種々の細胞および分子成分へのIgEの結合、及びアレルゲンの潜在的なクリアリング効果に関する。更に、本発明はIgE媒介のアレルギー性および非アレルギー性疾患の治療への応用に関する。

【0010】

抗M1'抗体MEMP1972A（Gauvreau et al., Science Translation Medicine, 2014, Vol. 6: 243ra85）の第Ib相及び第IIa相試験の最新結果によれば、新規IgEの合成を阻害することにより、IgE媒介による症状を減少できることが確認された。また、hu8D6:IgE複合体がCD23に結合することができ、及びCD23が複数種の細胞の表面で発現されるため（Acharya et al. Clin. Exp. Immunol., 2010, 162:12-23）、hu8D6：IgE複合体が細胞表面CD23への吸収は、体内で循環する総IgEレベル（遊離およびhu8D6結合IgE）を減少させることができると推測される。また、粘膜内層に沿った上皮細胞はCD23依存性トランスサイトーシスにより細胞結合物質をクリアリングすることができ（Tu et al. Gastroenterology, 2005, 129:928-940）、hu8D6：IgEの複合体が消化管及び気管支肺胞内腔の空間に輸送されたとき、hu8D6は進入したアレルゲン及び内因性IgE結合自己抗原（IgE-binding autoantigens）の処理及び除去を促進することができる。また、CD23結合IgEと結合したhu8D6は、Bリンパ球上のCD23と効果的に架橋することができ、その結果、特定の抗原により活性化される際にB細胞による抗原特異的IgEの産生を阻害することが確認された。
hu8D6のこれらの特性は、hu8D6及び同じIgE結合特異性を有する他のヒト化抗体の潜在的用途を支持し、IgE媒介疾患の患者における抗原特異的IgEの産生を阻害することにより、それらの疾患を改善することができる。マウス8D6抗体を使用した一例として、発明者らは、抗体のヒト化型を作成した。当該ヒト化抗体は、上記のすべての結合および生物学的特性を有する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Bonita J. Rup, Larry E. Kahn, "Monoclonal antibodies against IgE-associated determinants, hybrid cell lines producing these antibodies, and use therefore" US Patent 4,940,782 (1990).

【非特許文献2】Yu-Yu Shiung, Chen-Yi Chiang, Jiun-Bo Chen, Pheidias C. Wu, Alfur Fu-Hsin Hung, Donic Chien-Sheng Lu, Rong-Long Pan, Tse Wen Chang. "An anti-IgE monoclonal antibody that binds to IgE on CD23 but not on high-affinity IgE.Fc receptors, FcRn", Immunobiology., 217:676-683-9 (2012)

【非特許文献3】Gail M. Gauvreau, Jeffrey M. Harris, Louis-Philippe Boulet, Heleen Scheerens, J. Mark Fitzgerald, Wendy S. Putnam, Donald W. Cockcroft, Beth E. Davis, Richard Leigh, Yanan Zheng, Barbro Dahlen, Yehong Wang, Romeo Maciuca, Irvin Mayers, X. Charlene Liao, Lawren C. Wu, John G. Matthews, Paul M. O'Byrne1, "Targeting membrane-expressed IgE B cell receptor with an antibody to the M1 prime epitope reduces IgE production", Science Translation Medicine., Vol. 6: 243ra85 (2014)

【非特許文献4】M Acharya, G Borland, A L Edkins, L M MacLellan, J Matheson, B W Ozanne, and W Cushley, "CD23/FcεRII: molecular multi-tasking", Clin. Exp. Immunol., 162(1): 12-23 (2010)

【非特許文献5】Yahong Tu, Saad Salim, Jackie Bourgeois, Vincenza Di Leo, E. Jan Irvine, John K. Marshall, Mary H. Perdue, "CD23-Mediated IgE Transport Across Human Intestinal Epithelium: Inhibition by Blocking Sites of Translation or Binding", Gasgtroenterology, 129(3): p928-940(2005)

【非特許文献6】Jiun-Bo Chen, Pheidias C. Wu, Alfur Fu-Hsin Hung, Chia-Yu Chu, Tsen-Fang Tsai, Hui-Ming Yu, Hwan-You Chang, and Tse Wen Chang, "Unique epitopes on CεmX in IgE-B cell receptors are potentially applicable for targeting IgE-committed B cells", J. Immunol., 184: 1748-1756 (2010)

【非特許文献7】Wiegand TW, Williams PB, Dreskin SC, Jouvin MH, Kinet JP, Tasset D., "High-affinity oligonucleotide ligands to human IgE inhibit binding to Fc epsilon receptor I", J. Immunol., 157: p221-230 (1996)

【非特許文献8】Pathan NI, Chu P, Hariharan K, Cheney C, Molina A, Byrd J., "Mediation of apoptosis by and antitumor activity of lumiliximab in chronic lymphocytic leukemia cells and CD23+ lymphoma cell lines", Blood, 111(3):p1594-1602 (2008)

【非特許文献9】Wan T, Beavil RL, Fabiane SM, Beavil AJ, Sohi MK, Keown M, Young RJ, Henry AJ, Owens RJ, Gould HJ, Sutton BJ., "The crystal structure of IgE Fc reveals an asymmetrically bent conformation", Nature Immunol., 3(7):681-6 (2002)

【図面の簡単な説明】

【0012】

本発明をより理解しやすくするため、以下は、図面に基づいて本発明を詳細に説明する。

【図1】ヒト生殖細胞系V_H1-69及びJH4配列（V_H1-69/JH4）、マウス抗IgE抗体8D6（mu8D6）及び8D6グラフトヒト化8D6（hu8D6）を含む可変重鎖（variable heavy chain）のアミノ酸配列アラインメントを示す。相補性決定領域（CDR）には下線を引いた。hu8D6に保持されたマウスV_Hフレームワークのアミノ酸は星マークにより標識した。

【図2】ヒト生殖細胞系Vκ1-39及びJκ1配列（Vκ1-39/Jκ1）、マウス抗IgE抗体8D6（mu8D6）及び8D6グラフトヒト化8D6（hu8D6）を含む可変軽鎖（variable light chain）のアミノ酸配列アラインメントを示す。相補性決定領域（CDR）には下線を引いた。hu8D6に保持されたマウスVκフレームワークは星マークにより標識した。

【図3】ELISAで測定したhu8D6（実線）及び親c8D6抗体（点線）が、ヒトIgEに結合した滴定曲線を示す。

【図4】ELISAで測定したhu8D6（実線）及びキメラ8D6（c8D6、点線）が、HRP結合c8D6と競合してヒトIgEに結合する阻害曲線を示す。

【図5】分子間相互作用解析装置（BIAcore）を用いた分析によるhu8D6 Fabが、ヒトIgEに対する表面プラズモン共鳴（SPR）曲線を示す。RU：応答レゾナンスユニット（response unit）。

【図6】6a及び6bは、フローサイトメトリーを用いた分析によるhu8D6及びc8D6がmIgE.Fc-発現Ramos細胞株に対する結合を示す。mIgE.Fc_L Ramos：ヒト膜結合IgE.Fcのロング型を発現するRamos細胞（図6a）、mIgE.Fc_S Ramos：ヒト膜結合IgE.Fcのショート型を発現するRamos細胞（図6b）。

【図7】hu8D6のヒトFcεRIのIgE飽和組替えα鎖への結合を示す。

【図8】8aから8eは、hu8D6のヒトIgEがプレロード（pre-loaded）されたヒトFcεRI-発現RBL SX-38細胞への結合を示す。

【図9】ELISAで測定したhu8D6及びオマリズマブと、組換えFcεRIa-Fcタンパク質とが、競合してヒトIgEに結合する阻害曲線を示す。

【図10】フローサイトメトリーを用いた分析によるhu8D6及びオマリズマブと、RBL SX-38細胞上の天然FcεRIレセプターとが、競合してヒトIgEに結合する阻害曲線を示す。

【図11】hu8D6は、IgE-感作RBL SX-38細胞の脱顆粒を活性化及び誘発できないことを示す。

【図12】hu8D6がIgE-飽和組換え三量体ヒトCD23に対する結合を示す。

【図13】13aから13dは、hu8D6がヒトCD23-発現SKW6.4細胞に対する結合を示す。

【図14】14aから14eは、hu8D6:IgE免疫複合体がヒトFcεRI-発現RBL SX-38細胞に結合できないことを示す。

【図15】hu8D6:IgE免疫複合体がIgE感作RBL SX-38細胞の脱顆粒を活性化及び誘導できないことを示す。

【図16】16aから16dは、hu8D6:IgE免疫複合体がヒトCD23-発現SKW6.4細胞に対する結合を示す。

【図17】17a及び17bは、体外でのデノボIgE合成に対するオマリズマブ（図17a）またはhu8D6（図17b）の阻害効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明は、（１）分泌遊離型ヒトIgE、（２）Bリンパ球上の膜結合IgE、（３）B細胞上のCD23と結合するIgE、及び（４）溶液中の遊離CD23と結合するIgE、と結合するヒト化抗体に関する。このような抗IgE抗体は、肥満細胞および好塩基球上のFcεRIに結合しないため、それらの炎症細胞を活性化しない。広義では、ヒト化抗体の重鎖および軽鎖の定常ドメイン、並びにV_H及びV_Lドメインのフレームワーク領域はヒト由来のものである。

【0014】

ファージ、酵母またはリボソームを用いた、ヒトBリンパ球のV_H及びV_Lセグメントを含む一本鎖抗体ライブラリを表示する様々な方法は、ヒト細胞表面抗原または細胞因子をスクリーニングするためにうまく使用されてきた。このような方法は、本発明の独特のIgE結合特異性のヒト抗体をスクリーニングするために使用することもできる。また、本発明の抗体は、ヒト免疫グロブリンV_H及びV_L遺伝子プールのを有するトランスジェニックマウスから得ることができる。

【0015】

一つの実施例において、本発明では、上述した結合特異性を有するヒト化型マウス抗IgEモノクローナル抗体8D6の調製を詳細に説明する。本発明によれば、重鎖可変領域（SEQ ID NO: 2）及び軽鎖可変領域（SEQ ID NO: 4）を含むヒト化抗ヒトIgE抗体hu8D6を提供する。hu8D6の超可変領域のアミノ酸配列は以下のとおりである。CDR-H1はGYTFNGYWMH（SEQ ID NO: 5）を含み、CDR-H2はYINPTTGHTEYNQKFKD（SEQ ID NO: 6）を含み、CDR-H3はARQEYRHSWFAY（SEQ ID NO: 7）を含み、CDR-L1はQSVDYDGDTY（SEQ ID NO: 8）を含み、CDR-L2はAASNLDS（SEQ ID NO: 9）を含み、CDR-L3はQQTNEDPWT（SEQ ID NO: 10）を含む。

【0016】

本発明は、ヒト化抗ヒトIgE抗体hu8D6を提供し、該抗体の二価型でのヒトIgEへの結合活性がEC₅₀=〜10^-10Mである。該抗体の単価Fab型でのヒトIgEとの親和性はKD=〜10^-11Mである。

【0017】

以下の実施例において、本発明は、ヒト化抗IgE抗体hu8D6を提供し、該抗体は遊離ヒトIgE（その2つのレセプターによって結合されない）、Bリンパ球上の膜結合IgE（ロング型及びショート型）及びCD23結合IgEと結合することができるが、FcεRI結合IgEに結合できず、肥満細胞や好塩基球からβ-ヘキソサミニダーゼを放出することができない。また、hu8D6はIgEのFcεRIへの結合を効果的に抑制することができる。hu8D6及びヒトIgEの免疫複合体は、CD23に結合することができるが、FcεRIに結合できず、肥満細胞や好塩基球からβ-ヘキソサミニダーゼを放出することができない。更に、hu8D6は膜結合IgE及びB細胞上の架橋CD23結合IgEの両方に結合することができ、これにより、インビトロ培養系におけるヒト末梢血単核細胞（human peripheral mononuclear cells）からのIgEを産生するデノボ合成を抑制することができる。

【0018】

本発明の一つの態様として、ヒト化抗IgE抗体hu8D6は、全長抗体（例えば、IgG分子）、抗原結合性フラグメント（例えば、FabまたはF（ab'）₂）または一本鎖抗体Fvであることができる。

【0019】

本発明の他の態様として、本願のヒト化抗IgE抗体hu8D6は治療特性を示し、必要とする患者に有効量のヒト化抗IgE抗体を投与することを含むIgE媒介疾患を治療する方法を提供し、ここで、ヒト化抗IgE抗体は、抗体或いはその抗原結合フラグメントである。IgE媒介疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、慢性自発性（特発性）蕁麻疹、慢性鼻副鼻腔炎、全身性肥満細胞症、皮膚肥満細胞症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、再発性特発性血管浮腫及び好酸球に関連する胃腸障害を含む。その中で、慢性自発性蕁麻疹、全身性肥満細胞症および再発性の特発性血管性浮腫のような疾患は、アレルギー疾患ではなく、外部のアレルゲンを含まない。

【実施例】

【0020】

実施例１ ヒト化抗IgE抗体の作成
CDRグラフティング（CDR grafting）
8D6由来のV_H（SEQ ID NO：1）及びVκ（SEQ ID NO：3）ドメインのアミノ酸配列と、それらのヒト生殖系列V_H1-69/JH4及びVκ1-39/Jκ1対立遺伝子とを整列させる。CDRグラフトを作成するために、4箇所のM48I、R66K、V67A及びS76Nのヒト生殖系列V_H1-69対立遺伝子とは異なるアクセプターV_Hフレームワークを使用した。8D6のアミノ酸配列第26-35番目（CDR-H1、SEQ ID NO：5）、第50-56番目（CDR-H2、SEQ ID NO：6）及び第93-104番目（CDR-H3、SEQ ID NO：7）のCDRをアクセプターV_Hフレームワークに操作して、図１に示す8D6 V_Hの直接CDR移植片を作製した。Vκドメインでは、アミノ酸配列第27-34番目（CDR-L1、SEQ ID NO：8）、第50-56番目（CDR-L2、SEQ ID NO：9）及び第89-97番目（CDR-L3、配列番号NO：10）のCDRをアクセプターVκフレームワークに移植した。これは、位置M4Lのヒト生殖系列Vκ1-39対立遺伝子とは異なる（図2）。8D6 V_Lの直接CDRｇグラフトをhu8D6 V_L（SEQ ID NO：4）と言う。

【0021】

IgGの作成
ヒト化8D6（hu8D6）及びキメラ8D6（c8D6）抗体を得るために、Expi293^TM発現系（Invitrogen）を一過性発現のために使用した。ExpiFectamine^TM293試薬（Invitrogen）を125mLのフラスコに加え、30mLの培養物でランスフェクションを行った。トランスフェクションの前日、Expi293F^TM細胞をExppi293^TM発現培地（Invitrogen）で2×10⁶細胞/mLの密度に希釈した。トランスフェクションの当日に、培養物を計数し、遠心分離し、2.5×10⁶細胞/mLまで濃縮し、古い培地を除去し、新鮮な培地を追加した。80μLのExpiFectamine 293を1.5mLのOPTI-MEM（Invitrogen）で希釈してトランスフェクション複合体を得て、５分後に希釈したExpiFectamine 293^TM溶液を30μgのプラスミドDNA中に加える。続いて、3mLのDNAトランスフェクション試薬複合体溶液を、20分間室温でインキュベートし、フラスコを旋回しながら懸濁培養液中にゆっくり添加した。トランスフェクトされた細胞は、37℃のインキュベーター中でオービタルシェーカーに戻し、16時間インキュベートした。インキュベーション後、150μLのExpiFectamine 293^TMトランスフェクションエンハンサー１及び1.5mLのExpiFectamine 293^TMのトランスフェクションエンハンサー２を培養物に加えた。トランスフェクション後7日目にインキュベーションを終了し、抗体精製のために回収した。抗体は、rプロテインAセファロース^TMアフィニティークロマトグラフィー（GE Healthcare）を用いて上清から精製した。サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（size exclusion fast protein liquid chromatography）で測定したように、最終生成物は、＞99％のタンパク質が相対分子量（Mr）が約150,000の単一ピークとして溶出し、均質であった。

【0022】

結合分析（EC₅₀）
ヒトIgEのFc領域（ε.Fc2-4）をExpi293F^TM細胞に発現させ、オマリズマブ結合NHS活性化セファロース^TM樹脂（GE Healthcare）を用いた抗IgE免疫親和性クロマトグラフィーにより精製した。ここで、ヒトIgEのFc領域（ε.Fc2-4）は、以前Wanら(Nature Immunol., 2002,3:681-686)により記載されたナンバリングシステム（numbering system）に従うSer²²⁶からGly⁵⁹⁹までであり、２つの変異N265Q及びN371Qを含む。hu8D6のEC₅₀測定において、ε.Fc2-4タンパク質をコーティング緩衝液（15mMのNa₂CO₃、35mMのNaHCO₃、pH9.6）中に50ng/ウェルで96ウェルプレート上に固定化し、4℃で一晩インキュベートした。200μL/ウェルのアッセイ希釈剤（0.5％BSA、0.05％のTween-20、0.01％チメロサール含有PBS）を用い、コーティングされたウェルを室温で1時間ブロックした。200μL/ウェルの洗浄緩衝液（0.05％ Tween-20を含むPBS）でプレートを3回洗浄した。100μLの抗体希釈剤（１：３のステップで0.1mg/mlから順次希釈）をコーティングされたウェルに加えた。室温で2時間インキュベーションを行った。全てのウェルを200μL/ウェルの洗浄緩衝液で6回吸引し、洗浄した。プレートを1：10,000で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（horse radish peroxidase、HRP）結合ヤギ抗マウスIgG-Fc抗体（Jason ImmunoResearch）とともにインキュベートした（100μL/ウェル）。 次いで、すべてのウェルを200μL/ウェルの洗浄緩衝液で6回洗浄した。最後に、50μL/ウェルのNEA-Blue TMB基質（臨床研究製品）によってウェルを発色させ、反応を50μL/ウェルの1N HClを添加して停止させた。ELISAリーダーを用いOD₄₅₀の吸光度を測定した。Prismソフトウェア（GraphPad）を用いてEC₅₀を計算した。図３に示すように、hu8D6及びc8D6のEC₅₀は、1.48×10^-10及び1.16×10^-10Mであった。この結果は、CDRグラフティング工程後にhu8D6の結合活性がほぼ完全に維持されたことを示す。

【0023】

競合分析（IC₅₀）
hu8D6の結合特性を測定するために、hu8D6及びc8D6が、ヒトIgEとの結合においてHRP結合c8D6に競合して結合する効率を比較し、競合ELISA試験を行った。50ngのε.Fc2-4タンパク質を用い、コーティング緩衝液中でELISAプレートのウェルを4℃で一晩コーティングし、アッセイ希釈剤でインキュベートすることによりブロックした。また、HRP-c8D6原液をアッセイ希釈剤1：1000まで希釈し、アリコートを1：3のステップで0.1mg/mlから段階的に希釈した未結合c8D6又はhu8D6と混合した。２つの混合物をELISAウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。その後、ウェルをPBSTで洗浄し、TMBでインキュベートし、OD₄₅₀を測定した。Prismソフトウェアを用いてIC₅₀を計算した。図４に示すように、未結合hu8D6及びc8D6のIC₅₀は、1.79x10^-9及び2.28×10^-9Mであった。この結果は、hu8D6及び8D6は同一のエピトープに結合することを示す。

【0024】

表面プラズモン共鳴（SPR）分析によるKD測定
hu8D6 Fabを生成するために、hu8D6抗体のV_H及びV_kのDNAセグメントのcDNAを、それぞれFab発現ベクターのヒトCγ1-CH1ドメイン及びヒトCｋ領域に接合した。該Fab発現ベクターは、全体のCγ1定常領域をCγ1-CH1ドメインで置換することにより、pIgG1（ｋ）ベクターから変更して得られる（Chen et al. J Immunol. 184:1748-1756）。Expi293^TM発現系（Invitrogen）を一過性発現のために用いた。Hu8D6 FabはKappaSelectセファロース^TM親和性クロマトグラフィー（GE Healthcare）を用いて上清から精製した。サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（size exclusion fast protein liquid chromatography）で測定したように、最終生成物は、＞99％のタンパク質が相対分子量（Mr）が約150,000の単一ピークとして溶出し、均質であった。

【0025】

u8D6のKD測定は、SPRアッセイはBiacore X機器（GE Healthcare）を用いて行った。アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用い、Hu8D6 FabをCM5チップ（GEヘルスケア）に固定化した。カップリング密度は、＜500共鳴単位に制限した。30μl/分の流速で、HBS-P緩衝液（GEヘルスケア）中の濃度が25、12.5、6.25及び3.125nMのε.Fc2-4タンパク質をセンサーチップに注入した。全てのサンプルを120秒間フローセルに注入し、25℃での解離時間は720秒である。センサー表面の再生は、10mMグリシン-HCl（pH2.5）の30秒間の注入を２回行うことによりに実施した。ε.Fc2-4が異なる濃度において、固定化されたhu8D6 Fabに結合する超音波画像を図５に示す。親和性および速度定数は、BIAevalutionソフトウェア（GE Healthcare）を用いて計算し、ε.Fc2-4に対するhu8D6 FabのK_ON及びk_offは、1.23±0.17x10⁶ M^-1 S^-1及び5.79±0.03x10^-5 S^-1であり、その結果、hu8D6のKDは4.8±0.7x10^-11Mであった。

【0026】

FACS分析
hu8D6の結合活性の測定には、Chenらによって作成された、mIgE.FcL（膜ε鎖のロング型CH2-細胞質尾部）またはmIgE.FcS（膜ε鎖のショート型CH2-細胞質尾部）でコード化された組換えDNAを導入したRamos細胞株（Chen et al. J Immunol. 184:1748-1756）を用いた。mIgE.FcLまたはmIgE.FcSを発現するRamos細胞を、2×10⁶細胞/mLの細胞密度で、FACS緩衝液（1％FBS及び0.1％アジ化ナトリウムを含む1×PBS）に再懸濁した。100μLのFACS緩衝液中の2×10⁵細胞を、10、1、0.1、0.01及び0.001μg/mLのhu8D6及びc8D6とともに氷上で30分間インキュベートし、FACS緩衝液で洗浄した。結合抗体を、ヒトIgG-Fcに対し特異性を有するFITC標識ヤギIgG（Caltag Laboratories）を用いて検出した。染色された細胞を、FACS Canto IIフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いて分析した。ラモス細胞株に対する抗体結合の蛍光強度の幾何平均（geometric mean）を、FCSExpressソフトウェア（DeNono software）を用いて分析した。EC₅₀を、Prismソフトウェアを用いて計算した。図6a及び図6bに示すように、hu8D6及びc8D6がmIgE.FcL発現Ramos細胞に結合するEC₅₀は、2.21x10^-10及び2.0x10^-10であり、hu8D6及びc8D6がmIgE.FcS発現Ramos細胞に結合するEC₅₀は、3.86x10^-10及び3.0x10^-10であった。その結果は、hu8D6及びc8D6が2つのmIgEアイソフォームにに対する結合活性はほぼ同等であることを示す。

【0027】

実施例２ hu8D6はヒトFCεRI結合IgEに結合することができない。
Hu8D6はIgE-飽和組換えヒトFCεRIのα鎖に結合することができない。
ELISAを用いて、hu8D6が固相組換えFcεRIα融合タンパク質（huFcεRIα-huFcγ1、FcεRIα-Fcと言う）への結合を測定し、該タンパク質は、ヒトFcεRIαの細胞外領域（Val²⁶からLeu²⁰⁴まで）及びヒトγ1のヒンジ-C_H2-C_H3部分から構成される(Shiung et al., Immunobiology, 2012, 217:676-683)。FcεRIα-Fcタンパク質はFreeStyl^TM 393F系（Invitrogen）で発現させ、プロテインAクロマトグラフィーによって精製した。ELISAプレートのウェルは、2μg/mLのFcεRIα-Fcによりコーティング緩衝液中において4℃で一晩コーティングし、アッセイ希釈剤（0.5％BSA、0.05％ Tween-20、0.01％ チメロサール含有PBS）を用いて室温で1時間処理した。次に、抗IgEクロマトグラフィーによってU266細胞の培地から精製した1μg/mlのIgEを用いて、コーティングされたFcεRIα-Fcタンパク質を飽和させた。その後、ウェルを洗浄緩衝液で6回洗浄した後、捕捉されたIgEは、10、1、0.1及び0.01mg/mlのヒトIgE（Sigma）、hu8D6、c8D6、オマリズマブ及びマウス抗ヒトIgEモノクローナル抗体5H2（AbD Serotec）とともにインキュベートした。結合したヒトIgE及びマウスIgGをHRP結合ヤギ抗ヒトκ軽鎖（GeneTex）及びHRP結合ヤギ抗マウスIgG.Fc（Jackson ImmunoResearch）を用いて検出した。図７に示すとおり、ヒト化8D6、c8D6及びオマリズマブは、IgE-飽和組換えFcεRIα融合タンパク質に結合しないが、5H2は全ての濃度において結合していることが確認された。

【0028】

hu8D6は好塩基球上のIgEに結合できない。
RBL SX38細胞を細胞表面FcεRIのプールとして用い、該細胞は、ヒトFcεRIのα、β及びγ鎖をコードする遺伝子により転写されるラット好塩基球性白血病細胞である（Wiegand et al., J. Immunol., 1996, 157:221-230）。1mlのFACS緩衝液中の2×10⁶のRBL SX-38細胞を3μg/mlのIgEとともに、氷上で30分間インキュベートした。FACS緩衝液で細胞を洗浄して未結合のIgEを除去し、次いで、100mLのFACS緩衝液中の2×10⁵細胞を、10μg/mlのhu8D6、c8D6、オマリズマブ及び5H2抗体とともに、氷上で30分間インキュベートし、続いて、FACS緩衝液で洗浄した。結合した抗体を、ヒトIgG-Fcに対し特異性を有するFITC標識ヤギIgG或いはFITC標識F(ab)'2ウサギ抗マウスIgG（AbD Serotec）により検出した。染色した細胞は、FACSカントII（FACS Canto II）で分析した。図8a〜8eに示すように、ヒト化8D6、c8D6及びオマリズマブは、IgE-飽和RBL SX-38細胞に結合することができないが、5H2はRBL SX-38細胞に結合できた。

【0029】

FcεRIα-Fcタンパク質に対する競合分析
競合ELISA試験は、hu8D6及びオマリズマブが、FcεRIα-Fcタンパク質への結合においてHRP結合IgEに競合して結合する効率を比較することにより行った（Shiungら）。ELISAプレートのウェルをコーティング緩衝液中において、100ngのU266 IgEタンパク質でコーティングし、アッセイ希釈剤（0.5％ BSA、0.05％ Tween-20、0.01％ チメロサールを含むPBS）でインキュベートすることによりブロックした。また、HRP-IgEの原液をアッセイ希釈剤により1：6000に希釈し、1：3ステップで、アリコートを0.1mg/mlから順次希釈した未結合のhu8D6或いはオマリズマブと混合した。該2つの混合物をELISAウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。次いで、ウェルをPBSTでウェルを洗浄し、TMBでインキュベートし、それらのOD₄₅₀を測定した。IC₅₀は、Prismソフトウェアを用いて計算した。ネガティブコントロールとして用いたヒトHER2タンパク質を標的とするトラスツズマブ（Trastuzumab）（Herceptin^TM）は、IgEのFcεRIα-Fcへの結合を阻害しなかった。図9に示すように、FcεRIα-Fcに対するIgE結合を阻害するhu8D6及びオマリズマブのIC₅₀は9.4及び25.9×10^-10Mであり、これは、hu8D6がオマリズマブに比べ、IgEがその受容体への結合を阻害する上で、より優れていることを示す。

【0030】

細胞表面のFcεRIに対する競合分析
0.1mLのFACS緩衝液中の2×10⁵個のRBL SX-38細胞を、45、30、13.3、8.9、5.93、3.95、2.63、1.76、1.17、0.78、0.52及び0.35μg/mLの異なる濃度のhu8D6、オマリズマブ又はトラスツズマブを、FITC標識IgE（4.5μg/mL）とともに氷上で30分間インキュベートした。上記細胞をFACS緩衝液で洗浄し、未結合のIgEを除去した。染色された細胞を、FACS Canto IIで分析した。IC₅₀を、Prismソフトウェアを用いて計算した。トラスツズマブは、SX-38細胞に対するIgEの結合に影響しなかった。図10に示すように、SX-38細胞へのIgE結合を阻害するhu8D6及びオマリズマブのIC₅₀は18.8x10^-9及び24.7x10^-9Mであった。これは、hu8D6がオマリズマブに比べ、FcεRI発現細胞に対するIgEの結合を阻害する上で、より優れていることを示している。

【0031】

実施例３ hu8D6はRBL SX-38細胞を感作できない。
脱顆粒の程度を、β-ヘキソサミニダーゼ（顆粒中に貯蔵されたリソソーム酵素）の培地への放出を測定することにより評価した。RBL SX-38細胞を、24ウェルプレートに3×10⁵細胞/ウェルで0.5mLの培地にて37℃で一晩播種した。翌日、培地を除去し、1μg/mLのヒトIgEを含む予熱された培地0.25mLを各ウェルに添加した。37℃のインキュベーター中で2時間インキュベートした後、各ウェルを0.5mLのTyrode's緩衝液（135mM NaCl、5mM KCl、5.6mMグルコース、1.8mM CaCl₂、1mM MgCl₂、20mM HEPES及び0.5mg/mL BSAを含む、pH 7.3)により二回洗浄した後、10、1、0.1又は0.01μg/mLの抗体または1％ Triton X-100を含む0.25mLの予熱されたTyrode's緩衝液を添加した。37℃のインキュベーターで30分間インキュベートした後、上清を集め、室温で5分間300xgで遠心分離し、各ウェルから50μLの透明な上清を新しい96ウェルのブラックOptiPlate^TM（Perkin-Elmer）に移した。0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.5）中の50mLの基質溶液（80μMの4-MUG（4-メチルウンベリフェリル-N-アセチル-d-グルコサミニド）、Sigma）を各ウェルに加え、プレートを37℃で１時間インキュベートした。100μLのグリシン緩衝液（0.2Mグリシン、0.2M NaCl、pH10.7）を加えることによって反応を停止した。得られた蛍光（励起355nm;発光460nm）をVictor^TM 3蛍光リーダー（Perkin-Elmer）により各ウェルの上部から測定した。測定値は、1％ Triton X-100で細胞を溶解することによって得られた放出値（100％）に対するパーセンテージとして表した。ヒト化8D6、c8D6及びオマリズマブは、IgE感作RBL SX-38細胞の脱顆粒を誘導しなかったが、5H2は誘導した（図11）。

【0032】

実施例４ hu8D6はヒトCD23結合IgEに結合できる。
hu8D6はIgE飽和組換え三量体ヒトCD23に結合できる。
hu8D6の固相組換えヒトCD23融合タンパク質（ILZ-CD23）への結合をELISAにより測定した。該固相組換えヒトCD23融合タンパク質は、ヒトCD23のN末端イソロイシンジッパー（ILZ）及び細胞外領域（Asp⁴⁸〜Ser³²¹）を含み、ILZモチーフ（ILZ motif）を通じて非共有結合三量体を形成する（Shiungら、Immunobiology、2012,217：676-683）。ポリヒスチジン標識（polyhistidine-tagged）ILZ-CD23は、FreeStyle^TM 293Fシステムにより発現し、NiSepharose^TM クロマトグラフィー（GE Healthcare）を用いてトランスフェクション培地から精製し、その後、2mM CaCl₂を含む1×HBSS緩衝液中に保存した。5μg/mLの精製ILZ-CD23をELISAプレートにコーティングした後、ブロックを行い、コーティングされたILZ-CD23を、Ca²⁺/Mg²⁺アッセイ希釈液（1mM CaCl₂, 0.5mM MgCl₂、0.5％ BSA、0.05％ Tween-20及び0.01％ チメロサールを含むPBS）中の3μg/mLの精製ヒトIgEで飽和した。次に、ウェルを洗浄緩衝液で6回洗浄した後、Ca²⁺/Mg²⁺アッセイ希釈液中で、捕捉したIgEを10、1、0.1及び0.01μg/mLのhu8D6、c8D6、オマリズマブ及び5H2とともにインキュベートした。HRP結合ヤギ抗ヒトIgG.Fc及びHRP結合ヤギ抗マウスIgG.Fcを用いて、結合したヒトIgG及びネズミIgGを検出した。図12に示すとおり、アイソタイプ・コントロール（isotype-control）ヒトIgG抗体に比べ、ヒト化8D6、c8D6及び5H2抗体は、固体表面上にコーティングされたヒトIgE飽和組換えCD23に結合することができるが、オマリズマブは、結合活性がなかった。

【0033】

hu8D6はIgEパルス（IgE-pulsed）SKW6.4 B細胞に結合できる。
高レベルのCD23を発現するヒトB細胞株（Pathanら、Blood,2008,111：1594-1602）を用いてIgEと共にインキュベートすることによりCD23をパルスした。1mLのCa²⁺/Mg²⁺ FACS緩衝液（1mM CaCl²、0.5mM MgCl²、1％ FBS及び0.1％ アジ化ナトリウムを含む1X PBS）中の2×10⁶個のSKW6.4細胞を、濃度が3μg/mLのIgEとともに、30分間氷上でインキュベートした。Ca²⁺/Mg²⁺ FACS緩衝液で細胞を洗浄し、10μg/mLのhu8D6、c8D6、オマリズマブ及び抗CD23抗体（クローン：EBVCS2、eBioscience）を氷上で30分間インキュベートし、続いて、Ca²⁺/Mg²⁺ FACS緩衝液で細胞を洗浄する。ヒトIgG-FcまたはFITC標識F（ab）'₂ウサギ抗マウスIgGに特異的なFITC標識ヤギIgGにより、結合した抗体を検出した。染色した細胞をFACSCanto^TM IIフローサイトメーターで分析した。抗CD23が、陽性対照としてskw6.4B細胞に良好に結合できることが分かった。図13a〜13dに示すように、オマリズマブは、CD23に結合したIgEへの結合を抑えたが、hu8D6及びc8D6はSKW6.4細胞上のIgEに効果的に結合することができた。

【0034】

実施例５ hu8D6及びIgEの免疫複合体はヒトFcεRIに結合できない。
hu8D6及びIgEの免疫複合体の調製
精製ヒトIgE（約190kDa）、hu8D6、c8D6、オマリズマブ及び5H2（約150kDa）を1X PBSで1mg/mLまで希釈した。95μLの1mg/mLのヒトIgE及び75μLの1mg/mLの抗IgE mAbを混合することにより、抗IgE：IgE免疫複合体を含む混合物を調製した。混合物を室温で2時間インキュベートし、さらなる使用に用いた。

【0035】

hu8D6及びIgEの免疫複合体がRBL SX-38細胞に結合できない。
100μLのFACS緩衝液中の2×10⁵個のRBL SX-38細胞を、10μg/mLのhu8D6：IgE、c8D6：IgE、オマリズマブ：IgE及び5H2：IgE免疫複合体とともに、30分間氷上でインキュベートし、続いて、FACS緩衝液で洗浄した。ヒトIgG-FcまたはFITC標識F（ab）'₂ウサギ抗マウスIgGに特異的なFITC標識ヤギIgGにより、結合した抗体を検出した。染色した細胞をFACSCanto^TM IIフローサイトメーターで分析した。図14a〜14eに示すように、hu8D6：IgE、c8D6：IgE及びオマリズマブ：IgE免疫複合体はRBL SX-38細胞には結合しなかったが、抗FcεRI及び5H2：IgEはRBL SX-38細胞に結合した。

【0036】

hu8D6及びIgEの免疫複合体はRBL SX-38細胞に結合できない。
0.5mLの培地中の3×10⁵個のRBL SX-38細胞を24ウェルプレートに播種し、37℃のインキュベーター中で一晩インキュベートした。翌日、各ウェルを0.5mLのTyrode緩衝液で2回洗浄し、次いで、10μg/mLの抗IgE：IgE免疫複合体または1％ Triton X-100を含む0.25mLの予熱されたTyrode緩衝液を添加した。37℃で30分間インキュベートした後、上清を回収し、室温で5分間300xgで遠心分離し、各ウェルから50μLの透明な上清を新しい96ウェルブラックOptiPlate^TM（Perkin-Elmer）のウェルに移した。50μLの4-MUG基質溶液を各ウェルに添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。100μLのグリシン緩衝液を添加して反応を停止した。図15に示すように、hu8D6：IgE、c8D6：IgE及びオマリズマブ：IgE免疫複合体はRBL SX-38細胞の脱顆粒を誘導しなかったが、5H2：IgEは誘導した。

【0037】

実施例６ hu8D6及びIgEの免疫複合体はヒトCD2に結合できる。
100μLのCa²⁺/Mg²⁺ FACS緩衝液中の2×10⁵個のSKW6.4細胞を、hu8D6：IgE、c8D6：IgE、オマリズマブ：IgE免疫複合体及び抗CD23と共に、10μg/mLの濃度で氷上で30分間インキュベートし、続いてCa²⁺/Mg²⁺ FACS緩衝液で洗浄した。ヒトIgG-FcまたはFITC標識F（ab）'₂ウサギ抗マウスIgGに特異的なFITC標識ヤギIgGにより、結合した抗IgE：IgE免疫複合体を検出した。染色された細胞を、FACS Canto^TM IIフローサイトメーターで分析した。図16a〜16dに示すように、オマリズマブ：IgE免疫複合体は表面CD23に結合することができなかったが、hu8D6：IgE、c8D6：IgE免疫複合体及び抗CD23はSKW6.4細胞に効果的に結合した。

【0038】

実施例７ hu8D6がPBMCsのIgE産生を阻害する。
Ficoll-Paque^TM PLUS（GE Healthcare）密度勾配による遠心分離により、健常ドナーまたはアトピー患者からの血液サンプルから末梢血単核細胞（PBMCs）を精製した。単離したPBMCsを、100ng/mLのヒトIL-4（R＆Dシステム）及び100ng/mLのマウス抗CD40モノクローナル抗体（BioLegend、クローン：G28-5）を含む完全IMDM培地（Invitrogen）中で、10⁶細胞/mLの量で懸濁させた。ヒト化8D6、オマリズマブ及びトラスツズマブを10μg/mlの濃度の培地に添加した。7日間、11日間及び14日間培養した後、無細胞の上清を採取し、-20℃で保存した。捕捉抗体としての抗ヒトIgE、HP6061（Abcam）、及び検出抗体としてのビオチン標識抗ヒトIgE及びHP6029（Abcam）を用い、ELISAにより上清に放出されたIgEを測定した。簡単に述べると、HP6061をコーティング緩衝液（15mM Na₂CO₃、35mM NaHCO₃、pH 9.6）中100ng/ウェルで96ウェルプレート上に固定し、4℃で一晩インキュベートした。コーティングされたウェルを200μL/ウェルのアッセイ希釈液（0.5％ BSA、0.05％ Tween-20、0.02％ ProClin 300を含むPBS）によって室温で1時間ブロックした。プレートを200μL/ウェルの洗浄緩衝液（0.05％ Tween-20を含むPBS）で3回洗浄した。精製したU266 IgEを用いて標準曲線（2倍連続希釈により800〜3.125ng/mlの範囲）を作成した。IgE資格の精度を向上させるために、IgE標準を完全IMDM培地で調製し、10μg/mlのhu8D6、オマリズマブ及びトラスツズマブに混合した。100μLの透明な上清および標準液をコーティングしたウェルに添加した。インキュベーションは室温で1時間行った。全てのウェルを吸引し、200μL/ウェルの洗浄緩衝液で6回洗浄した。捕捉したIgEを、100μLの検出抗体溶液（50ng/mlのビオチン標識HP6029を含むアッセイ希釈液）と共に、室温で1時間インキュベートした。次に、ストレプトアビジンポリ-HRP（1：10,000希釈、Thermo Pierce）を用いて1時間（100μL/ウェル）にかけて、結合ビオチン-HP6029を検出した。全てのウェルを吸引し、200μL/ウェルの洗浄緩衝液で6回洗浄した。最後に、ウェルを100μL/ウェルのNeA-Blue TMB基質（Clinical Science Products）で展開し、100μL/ウェルの1M H₂SO₄を加えて反応を停止させた。SoftMax Proソフトウェア（Molecular Devices）を用いて作成された4パラメータロジスティック曲線フィット（four parameter logistic curve-fit）により標準曲線を作成し、すべての試験サンプル中のIgE濃度を計算するために使用した。Prismソフトウェアを用い、スチューデントt検定（Student t test）によりデータを比較した。図17a及び17bに示すように、7日、11日及び14日間のインキュベーションで、培養開始時の10mg/ml hu8D6は、培養IgEレベルをそれぞれ88.1％、93.4％及び88.6％まで減少させたが、オマリズマブはIgEレベルをそれぞれ21.3％、26.4及び30％まで減少させた。この結果から分かるように、デノボIgE合成を阻害する観点から、hu8D6が膜結合IgE及びB細胞上でCD23結合IgEに結合する能力は、オマリズマブより優れていることを示し、該オマリズマブは、既にCD23に結合したIgEとは結合しない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17a】

【図17b】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]