特許 6398295 変異型グルコース−６−リン酸脱水素酵素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6398295

(24)【登録日】2018年9月14日

(45)【発行日】2018年10月3日

(54)【発明の名称】変異型グルコース−６−リン酸脱水素酵素

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/53 20060101AFI20180920BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20180920BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180920BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180920BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/53ZNA

   C12N9/04 D

   C12N1/21

   C12P21/02 C

【請求項の数】10

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2014-93809(P2014-93809)

(22)【出願日】2014年4月30日

(65)【公開番号】特開2015-208312(P2015-208312A)

(43)【公開日】2015年11月24日

【審査請求日】2017年2月14日

(73)【特許権者】

【識別番号】000135036

【氏名又は名称】ニプロ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100117101

【弁理士】

【氏名又は名称】西木 信夫

(74)【代理人】

【識別番号】100120318

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 朋浩

(72)【発明者】

【氏名】八尾 理文

【審査官】 布川 莉奈

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０４−２５８２８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−０３７４８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１３７４８９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Archives of Biochemistry and Biophysics，１９９６年，Vol. 326, No. 1，pp. 145-151

【文献】 Biochemistry，２０００年，Vol. 39，pp. 15012-15021

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００− ９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、４６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド、
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する４６番目のアミノ酸を除いた配列同一性が９０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド。

【請求項2】

下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列において、４６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド、
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する４６番目のアミノ酸を除いた配列同一性が９０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド。

【請求項3】

下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、４６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド、
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する４６番目のアミノ酸を除いた配列同一性が９０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド。

【請求項4】

下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列において、４６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド、
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する４６番目のアミノ酸を除いた配列同一性が９０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。

【請求項6】

配列番号７６、８０、６４、５２、５６、６２、６６、６８、７０、７２、又は８４に示す塩基配列からなるＤＮＡである、請求項５に記載のＤＮＡ。

【請求項7】

請求項５又は６に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。

【請求項8】

請求項７に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。

【請求項9】

宿主が大腸菌である、請求項８に記載の形質転換体。

【請求項10】

請求項８又は９に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、補酵素への親和性を改良した変異型グルコース−６−リン酸脱水素酵素、該変異型酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、及び該形質転換体を用いる変異型Ｇ６ＰＤＨの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

特定の基質に対して特異的に反応する酵素を用いた臨床検査薬は様々な体内分子の測定に利用されている。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４９、以下「Ｇ６ＰＤＨ」と表記することもある）は、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、「ＮＡＤ」と表記することもある）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を要求し、基質のＤ−グルコース−６−リン酸をＤ−グルコノ−１，５−ラクトン−６−リン酸へ触媒する酵素であり、非特許文献１に心筋梗塞マーカーであるクレアチンキナーゼの定量（非特許文献１）や、糖尿病マーカーであるグルコースの定量（非特許文献２）に利用できることが知られている。

【0003】

一方、生体内の触媒反応を模して、ブドウ糖等の特定の基質から電気を発生させる酵素燃料電池なる技術も開発され、従来用途に比べさらに高いレベルの触媒活性や安定性を要求される工業用途においても酵素が利用されつつある。例えば、非特許文献３には、Ｇ６ＰＤＨ等を電池の陰極に固定化し、ブドウ糖を燃料に０．３２２ｍＷｃｍ^-2の出力が得られることが紹介されている。

【0004】

上記に例示した用途において、従来、Ｇ６ＰＤＨとしては、ロイコノストック属細菌や酵母等の微生物から採取された酵素が主に用いられている。例えば、非特許文献４には、ロイコノストック属細菌のロイコノストック・メセンテロイデスのＧ６ＰＤＨ遺伝子配列、及び該遺伝子にコードされているアミノ酸配列が開示されている。また、特許文献１には、ロイコノストック属細菌のロイコノストック・メセンテロイドのＧ６ＰＤＨ遺伝子配列及び組換え大腸菌を用いた製造方法について開示されている。また、特許文献２には、ロイコノストック属細菌のロイコノストック・デキストラニクスのＧ６ＰＤＨ遺伝子配列及び組換え大腸菌を用いた製造方法について開示されている。

【0005】

しかしながら、従来のＧ６ＰＤＨでは、安定性が不十分であり、診断薬用途として実用する上でその改良が望まれていた。そこで、これまでに、安定性が向上したＧ６ＰＤＨの探索が種々行われている。例えば、バチルス（ジオバチルス属に再分類された）・ステアロサーモフィラス由来のＧ６ＰＤＨ（特許文献３）、ラクトバチルス属由来のＧ６ＰＤＨ（特許文献４）、ペディオコッカス属由来のＧ６ＰＤＨ（特許文献５及び６）、及びアクイフェックス・エオリカス由来のＧ６ＰＤＨ（非特許文献５）は、優れた耐熱性や熱安定性を備えていることが報告されている。

【0006】

更に、野生型のＧ６ＰＤＨに変異を導入することによって安定性を向上させることも検討されている。例えば、特許文献７には、ロイコノストック・メセンテロイデス由来のＧ６ＰＤＨのアミノ酸配列において、特定のアミノ酸置換を導入することにより、溶液状態における保存時の安定性を向上させ得ることが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特公平５−５０３２２１号公報

【特許文献2】特公平５−８７２３４号公報

【特許文献3】特公昭６３−４３０７９号公報

【特許文献4】特公平３−９９５号公報

【特許文献5】特開平９−３１３１７４号公報

【特許文献6】特開平１０−２２５２９３号公報

【特許文献7】特開２００１−３７４８０号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】臨床化学 第１９巻第２号、ｐ１８５−２０８、１９９０年、日本臨床化学会発行

【非特許文献2】Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ．Ｌ．Ｂｏｎｄｅｒ ａｎｄ Ｄｏｎｎａ Ｃ． Ｍｅａｄ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ Ｓｅｒｕｍ．ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．５，１９７４，ｐ.５８６−９０．

【非特許文献3】Ｚｈｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｅｐ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｆｕｅｌ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｃａｓｃａｄｅ ｏｆ ｔｗｏ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ．Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．１，２０１２，ｐ.１１０−５．

【非特許文献4】Ｗ．Ｔｈｅｏｄｏｒｅ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｇｌｕｃｏｓｅ ６−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ．ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２６６，Ｎｏ．２０，１９９１，ｐ.１３０２８−３４．

【非特許文献5】Ｒａｍｅｓｈ Ｂ．Ｉｙｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｓｄＡ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ．Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，Ｖｏｌ．６，２００２，ｐ.２８３−８９．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

上記のように、従来、診断薬向け用途において比較的温和な条件で利用されてきたＧ６ＰＤＨであるが、非特許文献３に記載されている通り、酵素燃料電池のような工業用途への利用も模索されている。このような工業用途においては、高い耐熱性が要求される。

【0010】

特許文献７においては、ロイコノストック・メセンテロイデス由来Ｇ６ＰＤＨの部位特異的なアミノ酸置換による溶液安定化については紹介されているが、その耐熱性において、上記のような工業用途に適しているとは言い難い。

【0011】

また、非特許文献５が開示するＧ６ＰＤＨは、安定性については特筆すべき性能を有してはいるが、常温付近でのタンパク質重量あたりの触媒活性（以下、比活性ともいう）が数Ｕ／ｍｇと、極端に低く、ほとんど触媒として機能しないので実用に供することはできない。

【0012】

更に、特許文献３が開示するＧ６ＰＤＨは、６０℃の熱処理にも耐えうる耐熱性を有し、且つ３０℃における比活性が２００Ｕ／ｍｇ程度と比較的高く、これらの性質においては他の実用Ｇ６ＰＤＨに比べ工業用途に適するが、一方で、補酵素ＮＡＤに対する親和性が低い（親和性の指標であるＮＡＤに対するＫｍ値が高い）という欠点がある。補酵素ＮＡＤに対する親和性が低い場合、反応系に高価なＮＡＤをより多く使用することが必要になり、コスト増につながるため、実用上、好ましくない。

【0013】

そこで、本発明は、補酵素ＮＡＤへの親和性を向上させた耐熱性Ｇ６ＰＤＨを提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来の耐熱性Ｇ６ＰＤＨに変異を導入することにより補酵素ＮＡＤへの親和性を向上させた変異型Ｇ６ＰＤＨ、該変異型Ｇ６ＰＤＨをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、及び該形質転換体を用いる変異型Ｇ６ＰＤＨの製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来の耐熱性Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において４６番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、補酵素ＮＡＤへの親和性を格段に向上させ得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。

【0015】

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、４６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド、
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する４６番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド。
項２． 下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列において、４６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド、
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する４６番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド。
項３． 下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、４６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド、
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する４６番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド。
項４． 下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示すポリペプチド：
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列において、４６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド、
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する４６番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド。
項５． 項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
項６． 下記（i)又は（ii）に示すＤＮＡである、項５に記載のＤＮＡ。
（i）配列番号７６、８０、６４、５２、５６、６２、６６、６８、７０、７２、又は８
４に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ii）グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列か
らなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ、配列番号７６、８０、６４、５２、５６、６２、６６、６８、７０、７２、又は８４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
項７． 項５又は６に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
項８． 項７に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項９． 宿主が大腸菌である、項８に記載の形質転換体。
項１０． 項８又は９に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。

【発明の効果】

【0016】

本発明のポリペプチドは、Ｇ６ＰＤＨ活性を備えつつ、耐熱性に優れ、且つ補酵素ＮＡＤへの親和性が高いので、診断薬や燃料電池等の幅広い分野で利用することができる。特に、本発明のポリペプチドは、補酵素ＮＡＤへの親和性が高く、反応系において高価なＮＡＤの使用量を低減できるので、従来のＧ６ＰＤＨよりも低コストで酵素反応を行うことが可能になる。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現している。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。

【0018】

本明細書における「Ｒ４６Ｆ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば「Ｒ４６Ｆ」とは、ある特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から４６番目のアミノ酸Ｒを、アミノ酸Ｆに置換されていることを意味する。

【0019】

また、本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプチファンが含まれる。また、「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。また、「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。また、「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。

【0020】

本明細書において、グルコース−６−リン酸脱水素酵素を「Ｇ６ＰＤＨ」、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を「Ｇ６ＰＤＨ活性」と表記することもある。

【0021】

本明細書において、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素を「野生型Ｇ６ＰＤＨ」と表記することもある。

【0022】

本明細書において、Ｇ６ＰＤＨの活性１Ｕとは、８４ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で、４０ｍＭの塩化マグネシウム、２．６ｍＭのグルコース−６−リン酸水と４ｍＭのＮＡＤの存在下で１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生成できる酵素量を指す。

【0023】

１．ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であって、Ｇ６ＰＤＨ活性を有し、野生型Ｇ６ＰＤＨよりも補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチドである。

【0024】

Ｇ６ＰＤＨは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤともいう）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素として使用するグルコース−６−リン酸脱水素酵素である。Ｇ６ＰＤＨは、補酵素に水素を添加する反応と共役してＤ−グルコース−６−リン酸の脱水素反応を触媒する酵素であり、ＥＣ１．１．４９に分類される酵素である。

【0025】

本発明のポリペプチドの一態様として、（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。

【0026】

配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目のアミノ酸が置換される「他のアミノ酸」とは、野生型Ｇ６ＰＤＨよりも補酵素ＮＡＤに対する親和性を向上させ得ることを限度として特に制限されないが、具体的には、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンが挙げられる。これらの中でも、補酵素ＮＡＤに対する親和性をより一層向上させるという観点から、好ましくは、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、及びイソロイシン；更に好ましくはスレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、及びリジン；より好ましくはスレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びセリン；特に好ましくはスレオニン、システイン、及びアスパラギン；最も好ましくはスレオニンが挙げられる。

【0027】

前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列の具体例を、配列番号５３、５７、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７７、８１及び８５に示す。配列番号５３に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において、アミノ酸置換Ｒ４６Ｉを導入したアミノ酸配列である。配列番号５７に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において、アミノ酸置換Ｒ４６Ｖを導入したアミノ酸配列である。配列番号６３に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において、アミノ酸置換Ｒ４６Ｑを導入したアミノ酸配列である。配列番号６５に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において、アミノ酸置換Ｒ４６Ｎを導入したアミノ酸配列である。配列番号６７に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において、アミノ酸置換Ｒ４６Ｋを導入したアミノ酸配列である。配列番号６９に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において、アミノ酸置換Ｒ４６Ｄを導入したアミノ酸配列である。配列番号７１に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において、アミノ酸置換Ｒ４６Ｅを導入したアミノ酸配列である。配列番号７３に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において、アミノ酸置換Ｒ４６Ｓを導入したアミノ酸配列である。配列番号７７に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において、アミノ酸置換Ｒ４６Ｔを導入したアミノ酸配列である。配列番号８１に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において、アミノ酸置換Ｒ４６Ｃを導入したアミノ酸配列である。配列番号８５に示すアミノ酸配列は、野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）において、アミノ酸置換Ｒ４６Ｇを導入したアミノ酸配列である。

【0028】

また、本発明のポリペプチドの他の様態として、下記（Ｂ）及び（Ｃ）に示すポリペプチドが挙げられる。
（Ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列における、４６番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、４６番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列における、４６番目のアミノ酸が、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、グルタミン、リジン、バリン、イソロイシン、及びグリシンよりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する４６番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチド。

【0029】

以下、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目以外のアミノ酸部位を「任意改変部位」と表記することもある。

【0030】

前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列における４６番目に導入されるアミノ酸置換の態様及び好適な具体例は、前記（Ａ）のポリペプチドの場合と同様である。

【0031】

前記（Ｂ）のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、任意改変部位に置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。

【0032】

前記（Ｃ）のポリペプチドにおける「配列番号４に示すアミノ酸配列における、４６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、具体的には配列番号５３、５７、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７７、８１及び８５に示すアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性」は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。

【0033】

ここで、前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて「配列番号４に示すアミノ酸配列に対する４６番目のアミノ酸を除いた配列同一性」とは、配列番号４に示すアミノ酸配列から前記任意改変部位のみ（即ち、４６番目のアミノ酸以外）を抜き出して、当該任意改変部位のみを比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７−２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値が例示される。パラメーターは、Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。

【0034】

また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸置換は、保存的置換であることが好ましい。即ち、前記任意改変部位における置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。

【0035】

前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、活性に関与している任意改変部位（例えば、活性中心）は、改変されずに保持されていることが好ましい。

【0036】

前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドにおいて、「配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上している」とは、下記[Ｋｍ値の測定方法]において得られるＮＡＤに対するＫｍ値が、野生型Ｇ６ＰＤＨのＮＡＤに対するＫｍに対して低いことを意味する。前記Ｋｍとは、酵素の反応速度に関する以下の式（ミカエリス・メンテン式）で表される値である。

【数1】

【0037】

ここで、Ｖは反応速度、[Ｓ]は基質濃度、Ｖｍａｘは基質濃度が無限大のときの反応速度である。Ｋｍは、一般にミカエリス・メンテン定数とも呼ばれ、ＶがＶｍａｘの半分になるときの基質濃度と定義される。前記定義は、補酵素ＮＡＤに対するＫｍにも採用される。即ち、前記式において、[Ｓ]をＮＡＤ濃度、ＶｍａｘをＮＡＤ濃度が無限大のときの反応速度として算出することにより、ＮＡＤに対するＫｍが求められる。変異型Ｇ６ＰＤＨのＮＡＤに対するＫｍ値が、野生型Ｇ６ＰＤＨのＫｍに比べて低ければ、より低濃度のＮＡＤに対して高い反応速度が得られる。本明細書において、ＮＡＤに対するＫｍ値が、野生型Ｇ６ＰＤＨに比べて低い場合を「補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上している」とする。

【0038】

[Ｋｍ値の測定方法]
下記Ｋｍ測定試薬を調製し、該測定試薬０．８７ｍｌを分光光度計用セルに入れ、３０℃で５分間以上プレインキュベートする。下記酵素希釈液でＧ６ＰＤＨを希釈した酵素活性測定溶液０．０３ｍＬを分光光度計用セルに添加してよく混合し、３０℃で予めインキュベートされた分光光度計で、３４０ｎｍの吸光度変化を６０秒間記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を測定する。ブランクは、酵素活性測定溶液の代わりに酵素希釈液を酵素活性測定試薬に混合して上記のように吸光度変化（ΔＯＤ_blank／分）を測定する。前記反応速度ＶをΔＯＤ／分からΔＯＤ_blank／分を差し引いた値として算出し、各ＮＡＤ濃度におけるＶを記録する。
（Ｋｍ測定試薬）
８４ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、２．６ｍＭグルコース−６−リン酸、及び０．７８ｍＭ〜８．０ｍＭのＮＡＤを含有する水溶液。
（酵素希釈液）
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）

【0039】

各ＮＡＤ濃度におけるＶのデータから、ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェア及びそのＥｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｗｉｚａｒｄプログラム（株式会社ヒューリンクス）を用いて、下記計算モードによりミカエリス・メンテン定数（Ｋｍ値）を算出する。
（測定モード）
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ：１
Ｔｙｐｅ ｏｆ ｓｔｕｄｙ：Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
Ｍａｘｉｍｕｍ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ Ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ：２
Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｆｉｔ ｔｏ Ｍｏｄｅｌ
Ｅｑｕａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ
Ｅｑｕａｔｉｏｎ Ｃｏｄｅ：Ｖｍａｘ＊Ｓ／（Ｋｍ＋Ｓ）

【0040】

本明細書において、野生型Ｇ６ＰＤＨのＮＡＤに対するＫｍ値の値を１００としたときの変異型Ｇ６ＰＤＨのＮＡＤに対するＫｍ値の相対値を算出し、該相対値が１００よりも小さい値をとる変異型Ｇ６ＰＤＨは「補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上している」ことになる。即ち、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドにおいて、「配列番号４に示すアミノ酸配列からなるグルコース−６−リン酸脱水素酵素と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上している」ポリペプチドの好適な具体例として、前記相対値が９９以下のポリペプチド、更に好ましくは、８０以下のポリペプチド、より好ましくは、６５以下のポリペプチド、特に好ましくは、５０以下のポリペプチド、最も好ましくは、３５以下のポリペプチドが挙げられる。

【0041】

また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、野生型Ｇ６ＰＤＨと同等以上の耐熱性を維持していることが望ましい。具体的には、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した状態にして６０℃で６０分間加熱処理した後に、Ｇ６ＰＤＨ活性の残存率が５０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９６％以上であることが望ましい。ここで、Ｇ６ＰＤＨ活性の残存率は、以下の式に従って算出される値である。

【数2】

【0042】

また、Ｇ６ＰＤＨ活性は、下記試薬を用いて、下記測定条件で測定する。
（試薬）
１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）
２２．５ｍＭ ＮＡＤＰ⁺水溶液
３３．０ｍＭ グルコース−６−リン酸水溶液
１Ｍ 塩化マグネシウム水溶液
酵素活性測定試薬：上記トリス−塩酸緩衝液を２５．２０ｍＬ、ＮＡＤＰ⁺水溶液を１．２０ｍＬ、グルコース−６−リン酸水溶液を２．４０ｍＬ、および塩化マグネシウム水溶液を１．２０ｍＬ混合して酵素活性測定試薬とする。
酵素活性測定溶液：ペプチド（Ｇ６ＰＤＨ）を所望の濃度に希釈するための溶液（以下、「酵素希釈液」と表記することもある）として、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を使用し、以下の活性値が５〜１０Ｕ／ｍＬとなるように酵素の原液（以下、「酵素原液」ともいう）を希釈して酵素活性測定溶液とする。

【0043】

（測定条件）
酵素活性測定試薬３．００ｍＬを分光光度計用セルに入れ、３０℃で３分間以上プレインキュベートする。酵素活性測定溶液０．０１ｍＬを分光光度計用セルに添加してよく混合し、３０℃で予めインキュベートされた分光光度計で、３４０ｎｍの吸光度変化を６０秒間記録し、１分間当たりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を測定する。ブランクは、酵素活性測定溶液の代わりに酵素希釈液を酵素活性測定試薬に混合して上記のように吸光度変化（ΔＯＤ_blank／分）を測定する。これらの値から、以下の式に従って１ｍＬ当たりのＧ６ＰＤＨ活性を求める。

【数3】

【0044】

なお、前記式中、３．０１は酵素活性測定試薬と酵素活性測定溶液の液量（ｍＬ）、６．２２は本測定条件におけるＮＡＤＰ⁺の分子吸光係数（ｃｍ²／マイクロモル）、０．０１は酵素活性測定溶液の液量(ｍＬ)、１．０は酵素活性測定に使用する分光光度計用セルの光路長（ｃｍ）を示す。

【0045】

２．ＤＮＡ
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、例えば、野生型Ｇ６ＰＤＨをコードしているＤＮＡに前記アミノ酸置換が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。

【0046】

ここで、野生型Ｇ６ＰＤＨをコードしているＤＮＡは、例えば、配列番号３に示される塩基配列を有する微生物、好ましくはジオバチルス属の菌株、更に好ましくはジオバチルス・ステアロサーモフィラス、特に好ましくはジオバチルス・ステアロサーモフィラスＵＫ−５６３株からＰＣＲを用いた定法により単離することができる。

【0047】

塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ：東洋紡製など）の利用等が挙げられる。

【0048】

このようにして得られたＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。得られた塩基配列については、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトエンジニアリング社製）又はＧＥＮＥＴＩＸ（ソフトウェア開発社製）等の塩基配列解析ソフトによる解析を行うことにより、ＤＮＡ中のＧ６ＰＤＨ遺伝子のコード領域を特定することができる。

【0049】

一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。

【0050】

更に、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ペプチドをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。

【0051】

本発明のＤＮＡの塩基配列としては、前記ポリペプチドをコードしていることを限度として特に制限されないが、具体的には、配列番号５２、５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７６、８０及び８４に示す塩基配列が挙げられる。

【0052】

配列番号５２は、配列番号５３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号５６は、配列番号５７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号６２は、配列番号６３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号６４は、配列番号６５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号６６は、配列番号６７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号６８は、配列番号６９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号７０は、配列番号７１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号７２は、配列番号７３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号７６は、配列番号７７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号８０は、配列番号８１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。配列番号８４は、配列番号８５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列である。

【0053】

また、本発明のＤＮＡの中でも、配列番号６４、７６及び８０に示す塩基配列からなるＤＮＡ、とりわけ配列番号７６に示す塩基配列からなるＤＮＡは、補酵素ＮＡＤに対する親和性が格段顕著に向上したＧ６ＰＤＨをコードしており、好適なＤＮＡとして挙げられる。

【0054】

また、本発明のＤＮＡには、Ｇ６ＰＤＨ活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるＧ６ＰＤＨ（野生型Ｇ６ＰＤＨ）と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ、配列番号５２、５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７６、８０又は８４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが包含される。

【0055】

ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。

【0056】

ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、３２Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。

【0057】

更に、本発明のＤＮＡは、Ｇ６ＰＤＨ活性を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるＧ６ＰＤＨ（野生型Ｇ６ＰＤＨ）と比較して補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号５２、５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７６、８０又は８４に示す塩基配列からなるＤＮＡに８０％以上の相同性を有するＤＮＡも包含される。該相同性として、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上が挙げられる。

【0058】

ここで、ＤＮＡの「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる相同性の値を示す。パラメーターは、デフォルト設定で行う。

【0059】

本発明のＤＮＡは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。その際、該ＤＮＡの塩基配列におけるコドン利用頻度を、使用する宿主のコドン利用頻度に最適化するよう設計したＤＮＡを人工合成することもできる。

【0060】

コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌のコドン利用頻度の一例として以下のものが挙げられる。
Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。

【0061】

３．組換えベクター
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、本発明の組換えベクターと表記することもある）は、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。

【0062】

本発明の組換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。

【0063】

発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。

【0064】

ファージとしては、例えば、後述する大腸菌を宿主とする場合には、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１等が挙げられる。

【0065】

プラスミドとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びコスミドであるＳｕｐｅｒ Ｃｏｓ Ｉが挙げられる。

【0066】

宿主としてシュードモナスを用いる場合には、グラム陰性菌用広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０、ｐＢＢＲ１２２、及びｐＣＮ５１等が挙げられる。更に、レトロウイルス及びワクシニアウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。

【0067】

４．形質転換体
本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。

【0068】

形質転換体の製造に使用される宿主としては、組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；酵母；ＣＯＳ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９等の昆虫細胞；アブラナ科等に属する植物体全体、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、根及び種子等）、植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部および維管束等）、植物培養細胞等が挙げられる。これらの中でも大腸菌が好ましく、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＢＬ２１および大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲがより好ましい。

【0069】

本発明の形質転換体は、宿主に本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができ、宿主に組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセル用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。

【0070】

本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法およびノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。

【0071】

ＰＣＲ法よって本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体から組換えベクターを分離・精製すればよい。

【0072】

組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。

【0073】

更に、凍結融解及びフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。

【0074】

ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いる。ＤＮＡと発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。

【0075】

その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。

【0076】

また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。

【0077】

４．ポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を培養することによって製造することができる。

【0078】

本発明の形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。

【0079】

培地の栄養源としては、形質転換体の生育に必要とされるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。

【0080】

窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。

【0081】

炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。

【0082】

培養温度は、本発明の形質転換体が生育可能であり、且つ本発明の形質転換体が本発明のポリぺプチドを産生する範囲で適宜設定し得るが、好ましくは１５〜３７℃程度である。培養は、本発明のポリペプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２〜４８時間程度である。

【0083】

培地のｐＨは、宿主が発育し、宿主が変異型Ｇ６ＰＤＨを産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度の範囲である。

【0084】

本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離などの方法により培養上清または菌体を回収し、菌体は超音波およびフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。

【0085】

また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。

【0086】

上記のようにして得られた本発明のポリペプチドを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。

【0087】

濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。

【0088】

本発明のポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。

【0089】

前記精製処理は既に公知であり、適当な文献、雑誌及び教科書等を参照することで進めることができる。このようにして精製された本発明のポリペプチは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化して市場に流通させることができる。

【実施例】

【0090】

次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、以下、参考例及び実施例において、特に言及しない限り、Ｇ６ＰＤＨ活性の測定、ＮＡＤに対するＫｍ値の測定等は、前述する条件にて行った。

【0091】

参考例１：野生型Ｇ６ＰＤＨ遺伝子の取得および発現用組換えベクターの取得
（１−１）野生型Ｇ６ＰＤＨ遺伝子の単離と配列解読
ジオバチルス・ステアロサーモフィラスＵＫ−５６３株の水懸濁液、配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（オペロンバイオテクノロジー株式会社製）を準備した。表１に示すＰＣＲ反応溶液を調製し、９８℃：１０秒、５４℃：３０秒、６８℃：９０秒のＰＣＲ反応を３０サイクル実施した。

【0092】

【表1】

【0093】

アガロースゲル電気泳動の結果、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。０．５μｌの該ＰＣＲ反応液、及びＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）に添付の試薬、及び取扱説明書の方法に従って、表２の反応溶液を調整した。

【0094】

【表2】

【0095】

該反応溶液を室温で５分間インキュベートし、ＰＣＲ反応により増幅された約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、クローニングベクターのｐＣＲＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標）に結合させた。１μｌの該反応溶液を１０μｌの大腸菌ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセルに添加し、４２℃のヒートショックにより形質転換させ、ＬＢ寒天培地（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、１．５％寒天、０．１ｇ／ｍｌアンピシリン）上で、３７℃、１８時間培養して形質転換体のコロニーを出現させた。単一コロニーをＬＢ液体培地に植菌し、一晩培養した後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを精製した。該プラスミドＤＮＡ、Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（−２０）Ｐｒｉｍｅｒ、及びＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒを材料にＤＮＡシーケンスを実施し、上記１．５ｋｂｐのＤＮＡの塩基配列を解読したところ、配列番号３の塩基配列であることが判明し、該ＤＮＡがコードするポリペプチドは配列番号４に示すアミノ酸配列からなることが確認された。

【0096】

配列番号４に示すアミノ酸配列をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースに照会したところ、完全に一致する配列データは存在しなかったものの、既に同定されているジオバチルス・ステアロサーモフィラス１０株由来Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列と６アミノ酸残基を除くすべてが一致しており、相同性が極めて高いことから、新規のＧ６ＰＤＨであることが推定された。

【0097】

以下、塩基配列の解読に使用したプラスミドをｐＴＯＰＯＧ６ＰＤＨともいう。

【0098】

（１−２）発現用ベクター
発現用ベクターにはｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を選択した。ｐＴｒｃ９９Ａはマルチクローニング部位（ＭＣＳ）の上流にｔｒｃプロモーター配列、ＭＣＳの下流に転写終了シグナル配列を含有する。ＭＣＳ内には制限酵素ＮｃｏＩ認識配列、及び制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列が含まれ、ＮｃｏＩ認識配列はｔｒｃプロモーター配列に並列しているため、翻訳開始コドンのＡＴＧをもつＤＮＡ断片を結合させることにより、直接発現させることができる。ｐＴｒｃ９９Ａのサイズは約４．２ｋｂｐである。

【0099】

（１−３）発現ベクターの前処理
以下の手順により、発現用組換えベクターを得るためのｐＴｒｃ９９Ａの前処理を行なった。表３に示す反応溶液を調製し、３７℃で３時間インキュベートすることにより、約２μｇのｐＴｒｃ９９Ａを制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ株式会社製）により切断した。

【0100】

【表3】

【0101】

該反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供して約４．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社製）を使用して該ＤＮＡ断片を精製した。精製された該ＤＮＡ断片の末端をＢｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いて平滑化し、該ＤＮＡ断片を精製した。表４に示す反応溶液を調整し、３０℃で３時間インキュベートすることにより、約１μｇの平滑化処理した該ＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ株式会社製）により切断した。

【0102】

【表4】

【0103】

該反応溶液を、上記の電気泳動及びゲル抽出の手順により精製し、以下の発現用組換えベクターの合成に使用した。

【0104】

（１−４）Ｇ６ＰＤＨ遺伝子の前処理
以下の手順により、発現用組換えベクターを得るための前処理を行なった。配列番号５、配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドＤＮＡを準備した。表５に示すＰＣＲ反応溶液を調整し、９８℃：１０秒、５２℃：３０秒、６８℃：９０秒のＰＣＲ反応を１８サイクル実施した。

【0105】

【表5】

【0106】

該ＰＣＲ反応溶液の一部をアガロースゲル電気泳動に供して約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認し、該ＰＣＲ反応溶液をエタノール沈殿に供し、該ＤＮＡ断片を精製した。精製された該ＤＮＡ断片を、ベクターと同様に制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、上記のアガロースゲル電気泳動ならびにゲル抽出の手順により精製し、以下の発現用組換えベクターの合成に使用した。

【0107】

（１−５）発現用組換えベクターの合成
上記のように前処理したｐＴｒｃ９９ＡのＤＮＡ断片とＧ６ＰＤＨのＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いてＴ４リガーゼの作用により結合させた。１μｌの該反応溶液を１０μｌの大腸菌ＤＨ５αケミカルコンピテントセル（タカラバイオ株式会社製）に添加し、４２℃のヒートショックにより形質転換させ、ＬＢ寒天培地上で、３７℃、１８時間培養して形質転換体のコロニーを出現させた。表５の鋳型ＤＮＡ以外を混合したＰＣＲ反応溶液を使用したコロニーＰＣＲにより、Ｇ６ＰＤＨ断片を含む形質転換体のコロニーを選抜し、該コロニーをＬＢ液体培地に植菌し、一晩培養した後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを精製した。

【0108】

該プラスミドＤＮＡ、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９に示すオリゴヌクレオチドを材料にＤＮＡシーケンスした結果、配列番号３に示す配列からなるＤＮＡ断片が、ｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列の間に結合されていることを確認した。以下、該プラスミドをｐＴｒｃＧ６ＰＤＨともいう。

【0109】

参考例２：野生型Ｇ６ＰＤＨの組換え発現、耐熱性評価、及び精製
（２−１）形質転換体の作製と培養
ｐＴｒｃＧ６ＰＤＨにより大腸菌ＢＬ２１（タカラバイオ株式会社製）を形質転換した形質転換体のコロニーを用意した。比較用に、ｐＴｒｃ９９Ａにより大腸菌ＢＬ２１を形質転換した形質転換体のコロニーも用意した。

【0110】

それぞれのコロニーを２ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して３７℃で１６時間振とう培養し、得られたＬＢ培養液を予めオートクレーブ滅菌した１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．２ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（和光純薬工業株式会社製）を含む１００ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ培養液（１．２％トリプトン、２．４％酵母エキス、０．４％グリセロール、０．２３％リン酸二水素カリウム、１．２５％リン酸水素二カリウム）へ植菌した。該培養液はそれぞれ３７℃で２２時間培養した。

【0111】

（２−２）活性測定と耐熱性評価
培養後の形質転換体を６，０００×ｇで１０分間、遠心分離して回収し、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を４０ｍｌ添加して菌体を懸濁し、超音波破砕により破砕した。該破砕液を１０，０００×ｇで２０分間、遠心分離して上清を回収した。該上清を、粗酵素液として活性測定に使用した。

【0112】

同時に、該粗酵素液を６０℃で６０分間、熱処理し、熱処理後のサンプルの活性も測定した。比較例として、ロイコノストック・メセンテロイデス由来Ｇ６ＰＤＨ（ＳＩＧＭＡ製）の熱処理前後の酵素活性も測定した。活性測定の結果と耐熱性評価の結果を表６に示す。

【0113】

【表6】

【0114】

ｐＴｒｃ９９Ａを形質転換した形質転換体から調整した粗酵素液の酵素活性は０．１Ｕ／ｍＬであった。一方でｐＴｒｃＧ６ＰＤＨを形質転換した形質転換体から調整した粗酵素液の酵素活性は２８．９Ｕ／ｍＬであり、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来Ｇ６ＰＤＨ遺伝子に特異的なＧ６ＰＤＨ活性が確認された。熱処理後の、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来Ｇ６ＰＤＨ粗酵素液の酵素活性は２８．０Ｕ／ｍＬであり、活性を９６．９％保持していた。一方で、比較例として使用したロイコノストック・メセンテロイデス由来Ｇ６ＰＤＨは完全失活した。

【0115】

以上の結果より、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来Ｇ６ＰＤＨ（配列番号４）は、任意のベクターと宿主の組合せによる形質転換体を培養することにより製造でき、かつ上記製造法により製造されるＧ６ＰＤＨは６０℃で６０分間の熱処理にも９５％以上の活性を保持する耐熱性Ｇ６ＰＤＨであることが明らかになった。この性質は、形質転換体からの酵素精製において、Ｇ６ＰＤＨ活性を維持したまま熱処理による宿主タンパク質の変性と除去が可能であるので、精製工程の短縮に有利である。

【0116】

（２−３）精製
前記粗酵素液を用いてＧ６ＰＤＨを精製した。該粗酵素液を６０℃で６０分間、熱処理した後、急冷した。１０，０００×ｇ、４０分間の遠心分離により変性したタンパク質を含む宿主由来の共雑物を沈殿させ、上清を回収した。２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑカラム（ＧＥヘルスケア製）に吸着させた。０Ｍ〜１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配によりＧ６ＰＤＨ活性画分が溶出された。該Ｇ６ＰＤＨ活性画分に４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、４０％飽和硫安を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥカラム（ＧＥヘルスケア製）に吸着させた。４０％〜０％飽和硫安の濃度勾配により、Ｇ６ＰＤＨ活性画分が溶出された。該画分を回収してＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５（ミリポア社製）により濃縮し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にバッファー交換した。得られたＧ６ＰＤＨ活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、約５５ｋＤａの単一のバンドのみが観察されたので、精製Ｇ６ＰＤＨとした。以下、本酵素を単に野生型Ｇ６ＰＤＨと表記することもある。

【0117】

実施例１：野生型Ｇ６ＰＤＨ遺伝子への部位特異的変異導入、組換え発現、及び変異型Ｇ６ＰＤＨの精製
（３−１）部位特異的変異導入
野生型Ｇ６ＰＤＨのアミノ酸配列（配列番号４に示すアミノ酸配列）の４６番目のアルギニン（Ｒ）を別のアミノ酸残基に変更するように設計した表７に示すオリゴヌクレオチドを材料に、ＰＣＲによる部位特異的変異導入を行なった。オリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列の１２４番目から１５０番目の間において、アルギニンのコドン（ＣＧＣ）を置換するように設計し、その相補鎖も設計した。例えば、Ｒ４６Ｆ変異体の作成には、前記コドン（ＣＧＣ）をフェニルアラニンのコドン（ＴＴＣ）に置換した配列番号１０に示すオリゴヌクレオチドと、その相補鎖の配列番号１１に示すオリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲの鋳型には前記ｐＴｒｃＧ６ＰＤＨを用い、試薬には市販のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アジレントテクノロジー社製）を使用し、方法はキットに添付の取扱説明書に従った。

【0118】

【表7】

【0119】

前記１９種類の部位特異的変異導入反応溶液１μｌを夫々１０μｌの大腸菌ＤＨ５αケミカルコンピテントセルに添加し、４２℃のヒートショックにより形質転換させ、ＬＢ寒天培地上で、３７℃、１８時間培養して形質転換体のコロニーを出現させた。該コロニーをＬＢ液体培地に植菌し、一晩培養した後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを精製した。該プラスミドＤＮＡ、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９に示すオリゴヌクレオチドを材料にＤＮＡシーケンスした結果、１９種類の変異が夫々導入され、ＰＣＲによる予期しない突然変異が含まれない塩基配列であることを確認した。すなわち、変異体Ｒ４６Ｆ遺伝子は配列番号４８に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号４９に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｌ遺伝子は配列番号５０に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号５１に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｉ遺伝子は配列番号５２に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号５３に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｍ遺伝子は配列番号５４に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号５５に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｖ遺伝子は配列番号５６に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号５７に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｙ遺伝子は配列番号５８に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号５９に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｈ遺伝子は配列番号６０に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号６１に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｑ遺伝子は配列番号６２に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号６３に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｎ遺伝子は配列番号６４に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号６５に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｋ遺伝子は配列番号６６に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号６７に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｄ遺伝子は配列番号６８に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号６９に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｅ遺伝子は配列番号７０に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号７１に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｓ遺伝子は配列番号７２に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号７３に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｐ遺伝子は配列番号７４に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号７５に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｔ遺伝子は配列番号７６に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号７７に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ａ遺伝子は配列番号７８に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号７９に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｃ遺伝子は配列番号８０に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号８１に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｗ遺伝子は配列番号８２に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号８３に示すアミノ酸配列をコードしていた。変異体Ｒ４６Ｇ遺伝子は配列番号８４に示す塩基配列であって、該塩基配列は配列番号８５に示すアミノ酸配列をコードしていた。

【0120】

（３−２）変異型Ｇ６ＰＤＨの組換え発現と精製
前記１９種類の変異体遺伝子を含む組換えベクターを夫々用いて、参考例２に記載した方法に従って形質転換体を取得し、培養することにより変異型Ｇ６ＰＤＨを発現させた。培養液を一部回収して遠心分離により形質転換体を回収し、１ｍｌの２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）に懸濁して超音波破砕し、遠心分離した上清を粗酵素液として活性測定に供した。いずれの変異体もＧ６ＰＤＨ活性が検出されたので、参考例２に記載した方法に従って精製した。

【0121】

実施例２：変異型Ｇ６ＰＤＨの補酵素ＮＡＤへの親和性、及び耐熱性の比較
（４−１）補酵素ＮＡＤへの親和性の比較
参考例２で精製された野生型Ｇ６ＰＤＨ、及び実施例１で精製された１９種類の変異体Ｇ６ＰＤＨを用いて、補酵素ＮＡＤへの親和性の指標である「ＮＡＤに対するＫｍ値」を求めた。

【0122】

Ｋｍ値測定用試薬は８４ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、２．６ｍＭグルコース−６−リン酸、及び０．７８ｍＭ〜８．０ｍＭのＮＡＤとなるように夫々調整した。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈した夫々の精製酵素を用いて、各ＮＡＤ濃度に調整したＫｍ値測定用試薬により酵素活性を測定した。縦軸に酵素活性、横軸にＮＡＤ濃度をプロットしたミカエリス−メンテンプロットを作成し、縦軸のＶｍａｘが半分になるときのＮＡＤ濃度をＮＡＤに対するＫｍ値として、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（ヒューリンクス社製）を用いてＮＡＤに対するＫｍ値を求めた。野生型Ｇ６ＰＤＨのＮＡＤに対するＫｍ値を１００％としたときの変異体の相対値（Ｋｍ^NAD相対値）を表８に示す。

【0123】

【表8】

【0124】

表８より、変異体Ｒ４６Ｉ、変異体Ｒ４６Ｖ、変異体Ｒ４６Ｑ、変異体Ｒ４６Ｎ、変異体Ｒ４６Ｋ、変異体Ｒ４６Ｄ、変異体Ｒ４６Ｅ、変異体Ｒ４６Ｓ、変異体Ｒ４６Ｔ、変異体Ｒ４６Ｃ、及びＲ４６ＧのＫｍ値は、野生型Ｇ６ＰＤＨに対して低下しており、補酵素ＮＡＤに対する親和性が向上したことが判明した。特に、Ｒ４６Ｎ、Ｒ４６Ｔ、及びＲ４６Ｃの効果が顕著であった。

【0125】

（４−２）耐熱性の比較
前記野生型Ｇ６ＰＤＨ及び１９種類の変異型Ｇ６ＰＤＨを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）でタンパク質濃度が１．０ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。希釈した酵素液を６０℃で６０分間、加熱熱処理した。加熱処理後のＧ６ＰＤＨ活性の残存率（％）を表９に示す。比較例として、ロイコノストック・メセンテロイデス由来Ｇ６ＰＤＨ（ＳＩＧＭＡ製）の測定結果も示す。

【0126】

【表9】

【0127】

表９に示すように、精製した野生型Ｇ６ＰＤＨの残存率は９６％であり、１９種の変異型Ｇ６ＰＤＨの残存率は野生型Ｇ６ＰＤＨと殆ど同じであった。これにより、４６番目のアルギニンを変異させることが耐熱性に影響しないことが示された。また、比較例に使用したロイコノストック・メセンテロイデス由来Ｇ６ＰＤＨは同様の熱処理により完全に失活したことから、相対的に、本発明の野生型Ｇ６ＰＤＨ、及び変異型Ｇ６ＰＤＨは耐熱性が高いことが示された。

【産業上の利用可能性】

【0128】

本発明により、工業用途を含む広範な用途における利用可能な、耐熱性が高く、且つ補酵素ＮＡＤへの親和性が高い変異型Ｇ６ＰＤＨを遺伝子工学的手法により提供することができる。更に、本発明によって、変異型Ｇ６ＰＤＨの大量生産に必要な遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、該形質転換体を用いる変異型Ｇ６ＰＤＨの製造方法も提供される。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]