特許 6398313 熱安定性アシルＣｏＡオキシダーゼ及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6398313

(24)【登録日】2018年9月14日

(45)【発行日】2018年10月3日

(54)【発明の名称】熱安定性アシルＣｏＡオキシダーゼ及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/04 20060101AFI20180920BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20180920BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180920BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180920BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180920BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180920BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180920BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/04 Z

   C12N15/53ZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/02 C

【請求項の数】7

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2014-102890(P2014-102890)

(22)【出願日】2014年5月16日

(65)【公開番号】特開2015-216876(P2015-216876A)

(43)【公開日】2015年12月7日

【審査請求日】2017年2月14日

(73)【特許権者】

【識別番号】000135036

【氏名又は名称】ニプロ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100117101

【弁理士】

【氏名又は名称】西木 信夫

(74)【代理人】

【識別番号】100120318

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 朋浩

(72)【発明者】

【氏名】中村大祐

(72)【発明者】

【氏名】八尾 理文

(72)【発明者】

【氏名】木村 隆

【審査官】 布川 莉奈

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／００６７３３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００− ９／９９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

次の(1)〜(23)に示すアミノ酸置換の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列からなるポリペプチド：
(1)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目がアスパラギンに置換、２４４番目がシステインに置換、及び４５９番目がスレオニンに置換、
(2)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目がアスパラギンに置換、２４４番目がシステインに置換、及び３４９番目がスレオニンに置換、
(3)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目がアスパラギンに置換、２４４番目がシステインに置換、及び３２５番目がアルギニンに置換、
(4)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目がアスパラギンに置換、２４４番目がシステインに置換、及び３６０番目がリジンに置換、
(5)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目がアスパラギンに置換、及び２４４番目がシステインに置換、
(6)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び４５９番目がスレオニンに置換、
(7)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び３６０番目がリジンに置換、
(8)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び４２１番目がグルタミンに置換、
(9)配列番号１に示すアミノ酸配列における６１４番目がチロシンに置換、
(10)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び２５３番目がバリンに置換
(11)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び５５７番目がヒスチジンに置換、
(12)配列番号１に示すアミノ酸配列における４３９番目がフェニルアラニンに置換、
(13)配列番号１に示すアミノ酸配列における１２２番目がフェニルアラニンに置換、及び２４４番目がシステインに置換、
(14)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び３４９番目がスレオニンに置換、
(15)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び３９８番目がグリシンに置換。
(16)配列番号１に示すアミノ酸配列における１０３番目がバリンに置換、及び２４４番目がシステインに置換、
(17)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、
(18)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２１番目（アラニン）がグルタミンに置換、
(19)配列番号１に示すアミノ酸配列における３４９番目がスレオニンに置換、
(20)配列番号１に示すアミノ酸配列における５８８番目がプロリンに置換、
(21)配列番号１に示すアミノ酸配列における１２２番目がフェニルアラニンに置換、
(22)配列番号１に示すアミノ酸配列における１０３番目がバリンに置換、
(23)配列番号１に示すアミノ酸配列における２５３番目がバリンに置換。

【請求項2】

下記(A)又は(B)のいずれかに示す請求項１に記載のポリペプチド：
(A)前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアシルＣｏＡオキシダーゼと比較して熱安定性が向上しているポリペプチド、
(B)配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が９０％以上であり、且つ、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアシルＣｏＡオキシダーゼと比較して熱安定性が向上しているポリペプチド。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。

【請求項4】

配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡである、請求項３に記載のＤＮＡ。

【請求項5】

請求項３又は４に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。

【請求項6】

請求項５に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。

【請求項7】

請求項６に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチドの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は熱安定性が改良された改変型アシルＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯＤ）に関し、詳しくはアシルＣｏＡの酸化反応を触媒するＡＣＯＤの特定のアミノ酸を他のアミノ酸に変更することにより、熱安定性が改良された改変型ＡＣＯＤに関する。また、本発明は、該酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、及び該形質転換体を用いる改変型ＡＣＯＤの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＡＣＯＤは、以下の反応式で示されるように、アシルＣｏ−Ａを酸化してエノイルＣｏＡと過酸化水素に変換する触媒作用を有し、酵素番号Ｅ．Ｃ．１．３．３．６として知られている（非特許文献１参照）。

【化1】

【0003】

ＡＣＯＤは、例えば、遊離脂肪酸の測定、脂肪酸のβ酸化系を利用する化学変換等が求められる分野において産業上利用されている。特に、臨床診断の分野では、血清中の遊離脂肪酸が様々な疾患の指標となることから、遊離脂肪酸の測定が極めて重要なものとなっている。具体的には、遊離脂肪酸が増加する疾患には、糖尿病、甲状腺機能亢進症、心筋梗塞、Von Gierke病、末端肥大症、急性膵炎、褐色細胞腫、Cushing症候群、肝不全等が知られており、また遊離脂肪酸が減少する疾患には、甲状腺機能低下症、アジソン病、汎下垂体機能低下症、インスリノーマ等が知られており（非特許文献２）、これらの疾患の診断には、血清中の遊離脂肪酸の測定が有効とされている。

【0004】

血清中の遊離脂肪酸の測定において酵素を使用する方法は、いくつか知られているが、ＡＣＯＤを用いる方法は、特異性が高く、簡便であることから広く一般的に用いられている（非特許文献３、特許文献１参照）。
ＡＣＯＤを用いて血清中の遊離脂肪酸を測定する原理は以下の通りである。血清中に、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）及びアシルＣｏＡシンターゼ等を含有する第一試薬を添加し、血清中の遊離脂肪酸からアシルＣｏＡを生成させる（第１反応）。これにアシルＣｏＡオキシダーゼを含有する第二試薬を添加すると、アシルＣｏＡが酸化されて過酸化水素が発生する（第２反応）。第二試薬にペルオキシダーゼと発色試薬を共存させると、発生する過酸化水素により発色するので、これを測定することにより遊離脂肪酸を定量できる。以下に反応式を示す。

【化2】

【0005】

また、ＡＣＯＤは、哺乳動物、植物、微生物等広く存在することが知られている。例えば、哺乳類由来のものとしては、マウス由来（非特許文献４参照）、ラット由来（非特許文献５参照）、ヒト由来（非特許文献６参照）等の報告がある。植物由来としては、カボチャ由来（非特許文献７参照）、大豆由来（非特許文献８参照）、シロイヌナズナ由来（非特許文献９参照）等が知られている。また微生物由来としては、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来（非特許文献１０参照）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来（非特許文献１１参照）、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ由来（非特許文献１２参照）、アルスロバクター属由来（非特許文献１３参照）等が知られている。これらのＡＣＯＤの中には既に遺伝子のクローニングに成功し、組み換え体によって生産されている例もある。特に、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来のＡＣＯＤは、血清中の遊離脂肪酸の測定において使用されるＳＨ試薬に対する安定性が優れた酵素として見出されている（特許文献１）。ＳＨ試薬は、血清中の遊離脂肪酸の測定において、過剰に加えられるＣｏＡが発色を妨害することを回避するために添加される試薬である。

【0006】

一方、近年、先進国では質量分析器による多項目同時臨床検査による診断が増加しているが、発展途上国では質量分析器による臨床検査は費用が高いことから酵素法や色素法のように安価な診断薬が用いられている。発展途上国においては、診断薬の輸送の条件も高温にさらされるなど劣悪な環境での輸送となるため、診断薬用途の酵素は熱安定性が非常に重要となっている。

【0007】

上記の従来のＡＣＯＤは、常温由来であるが故に安定性の点で欠点があり、そのため、精製時に失活し易く、更には遊離脂肪酸測定用試薬として用いる場合には保存安定性の低さが問題であった。多くの２液系測定試薬が溶液状態で供給されているのに対し、現在広く用いられている遊離脂肪酸測定試薬は、ＡＣＯＤの溶液安定性の低さから凍結乾燥状態のＡＣＯＤとバッファーが別々に供給されており、測定前にＡＣＯＤをバッファーに溶解する必要がある上に、溶解後は長時間の保存ができないという欠点がある。例えば、市販品のＡＣＯＤは、ｐＨ７．０のｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ中で５５℃、１０分の熱処理により活性が殆どなくなってしまう。一方、保存安定性に優れた酵素を得る方法として、従来から最適生育温度が常温より著しく高い（６５〜８０℃）高度好熱性細菌や古細菌から目的酵素を探索する方法が知られている。しかしながら、ＡＣＯＤは高度高熱性細菌や古細菌には見出されておらず、これらの細菌ではアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼがβ酸化の役割を担っていることが知られているため、この手法による熱安定化ＡＣＯＤの取得は不可能である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特許第４２５７７３０号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】酵素ハンドブック[第３版]、 朝倉書店、２０１２年

【非特許文献2】日本臨床 ５３−増−６１１〜６１４（１９９５）

【非特許文献3】Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., １３０（１）：１２８-１３３（１９８３）

【非特許文献4】Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２０００ Ｆｅｂ；２６７（４）：１２５４−６０.

【非特許文献5】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. １９８４ Ｆｅｂ ２５；２５９（４）：２０３１−４.

【非特許文献6】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ. １９８４ Ｄｅｃ １５；２２４（３）：７０９−２０.

【非特許文献7】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. １９９８ Ａｐｒ ３；２７３（１４）：８３０１−７.

【非特許文献8】Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ. ２００１ Ｎｏｖ；４７（４）：５１９−３１.

【非特許文献9】Ｐｌａｎｔ Ｊ. １９９９ Ｏｃｔ；２０（１）：１−１３.

【非特許文献10】Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８０ Ｎｏｖ；８８（５）：１４８１‐６．

【非特許文献11】Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ. １９８８ Ｊｕｎ １；１７４（２）：２９７−３０２.

【非特許文献12】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. １９８８ Ｊａｎ １１；１６（１）：３６５‐６.

【非特許文献13】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ. ２００７ Ｊａｎ；１７７４（１）：６５−７１.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の目的は、優れた安定性を備え、臨床検査において常用される温度(３０〜３７℃)でも十分活性が示されるＡＣＯＤを提供することである。更に、本発明の目的は、該ＡＣＯＤ生産に必要な遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、該形質転換体を用いるＡＣＯＤの製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、アルスロバクター・グロビフォルミス由来のＡＣＯＤのアミノ酸配列において特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、常温(３０〜３７℃程度)におけるＡＣＯＤ活性を備えつつ、熱安定性や溶液中での安定性を飛躍的に向上させ得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。

【0012】

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド：
(A)配列番号１に示すアミノ酸配列における、２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目、５５７番目、１０３番目、１２２番目、２５３番目、３２５番目、３４９番目、３９８番目及び５８８番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号１に示すアミノ酸配列における、２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目、５５７番目、１０３番目、１２２番目、２５３番目、３２５番目、３４９番目、３９８番目及び５８８番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアシルＣｏＡオキシダーゼと比較して安定性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号１に示すアミノ酸配列における、２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目、５５７番目、１０３番目、１２２番目、２５３番目、３２５番目、３４９番目、３９８番目及び５８８番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアシルＣｏＡオキシダーゼと比較して安定性が向上しているポリペプチド。
項２． 次の(1a)〜(15a)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１に記載のポリペプチド：
(1a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目が、非電荷アミノ酸、アスパラギン酸以外の酸性アミノ酸、非極性アミノ酸又は塩基性アミノ酸に置換、
(2a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目が、非電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸に置換、
(3a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４５９番目が、非電荷アミノ酸、アラニン以外の非極性アミノ酸又は塩基性アミノ酸に置換、
(4a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２１番目が、非電荷アミノ酸又はアラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(5a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３６０番目が、塩基性アミノ酸又は非極性アミノ酸に置換、
(6a)配列番号１に示すアミノ酸配列における６１４番目が、非電荷アミノ酸、アルギニン以外の塩基性アミノ酸又は非極性アミノ酸に置換、
(7a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４３９番目が、非極性アミノ酸、チロシン以外の非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸に置換、
(8a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５７番目が、塩基性アミノ酸、非電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸に置換
(9a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１０３番目が、非極性アミノ酸に置換、
(10a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１２２番目が、トリプトファン以外の非極性アミノ酸に置換、
(11a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２５３番目が、イソロイシン以外の非極性アミノ酸に置換、
(12a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３２５番目が、塩基性アミノ酸又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(13a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３４９番目が、非電荷アミノ酸又はアルギニン以外の塩基性アミノ酸に置換、
(14a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３９８番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(15a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５８８番目が、非極性アミノ酸に置換。
項３． 次の(1a)〜(23a)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１又は２に記載のポリペプチド：
(1a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目が、システインに置換、
(2a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目が、アスパラギンに置換、
(3a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４５９番目が、スレオニンに置換、
(4a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２１番目が、グルタミンに置換、
(5a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３６０番目が、リジンに置換、
(6a)配列番号１に示すアミノ酸配列における６１４番目が、チロシンに置換、
(7a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４３９番目が、フェニルアラニンに置換、
(8a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５７番目が、ヒスチジンに置換
(9a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１０３番目が、バリンに置換、
(10a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１２２番目が、フェニルアラニンに置換、
(11a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２５３番目が、バリンに置換、
(12a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３２５番目が、アルギニンに置換、
(13a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３４９番目が、スレオニンに置換、
(14a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３９８番目が、グリシンに置換、
(15a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５８８番目が、プロリンに置換。
項４． 次の(1b)〜(23b)に示すアミノ酸置換の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド：
(1b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、１６４番目、及び４５９番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(2b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、１６４番目、及び３４９番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、１６４番目、及び３２５番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、１６４番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、及び１６４番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(6b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、及び４５９番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(8b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、及び４２１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(9b)配列番号１に示すアミノ酸配列における６１４番目が、他のアミノ酸に置換、
(10b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、及び２５３番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(11b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、及び５５７番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(12b)配列番号１に示すアミノ酸配列における４３９番目が、他のアミノ酸に置換、
(13b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、及び１２２番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(14b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、及び３４９番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(15b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、及び３９８番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(16b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目、及び１０３番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(17b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目が、他のアミノ酸に置換、
(18b)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２１番目が、他のアミノ酸に置換、
(19b)配列番号１に示すアミノ酸配列における３４９番目が、他のアミノ酸に置換、
(20b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５８８番目が、他のアミノ酸に置換、
(21b)配列番号１に示すアミノ酸配列における１２２番目が、他のアミノ酸に置換、
(22b)配列番号１に示すアミノ酸配列における１０３番目が、他のアミノ酸に置換、
(23b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２５３番目が、他のアミノ酸に置換。
項５． 次の(1c)〜(14c)に示すアミノ酸置換の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド：
(1c)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目がアスパラギンに置換、２４４番目がシステインに置換、及び４５９番目がスレオニンに置換、
(2c)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目がアスパラギンに置換、２４４番目がシステインに置換、及び３４９番目がスレオニンに置換、
(3c)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目がアスパラギンに置換、２４４番目がシステインに置換、及び３２５番目がアルギニンに置換、
(4c)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目がアスパラギンに置換、２４４番目がシステインに置換、及び３６０番目がリジンに置換、
(5c)配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目がアスパラギンに置換、及び２４４番目がシステインに置換、
(6c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び４５９番目がスレオニンに置換、
(7c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び３６０番目がリジンに置換、
(8c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び４２１番目がグルタミンに置換、
(9c)配列番号１に示すアミノ酸配列における６１４番目がチロシンに置換、
(10c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び２５３番目がバリンに置換
(11c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び５５７番目がヒスチジンに置換、
(12c)配列番号１に示すアミノ酸配列における４３９番目がフェニルアラニンに置換、
(13c)配列番号１に示すアミノ酸配列における１２２番目がフェニルアラニンに置換、及び２４４番目がシステインに置換、
(14c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び３４９番目がスレオニンに置換、
(15c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、及び３９８番目がグリシンに置換。
(16c)配列番号１に示すアミノ酸配列における１０３番目がバリンに置換、及び２４４番目がシステインに置換、
(17c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目がシステインに置換、
(18c)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２１番目（アラニン）がグルタミンに置換、
(19c)配列番号１に示すアミノ酸配列における３４９番目がスレオニンに置換、
(20c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５８８番目がプロリンに置換、
(21c)配列番号１に示すアミノ酸配列における１２２番目がフェニルアラニンに置換、
(22c)配列番号１に示すアミノ酸配列における１０３番目がバリンに置換、
(23c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２５３番目がバリンに置換。
項６． 項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
項７． 下記(i)又は(ii)に示すＤＮＡである、項６に記載のＤＮＡ。
(i) 配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
(ii) アシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＯＤと比較して安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
項８． 項６又は７に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
項９． 項８に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項１０． 項９に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明のポリペプチドは、常温(３０〜３７℃程度)における高いＡＣＯＤ活性を備えつつ、熱安定性や溶液中での保存安定性を備えており、臨床検査や食品分析等の分野において遊離脂肪酸の測定キットやセンサー等に利用できる。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現している。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。

【0015】

本明細書における「Ｇ１０３Ｖ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば、「Ｇ１０３Ｒ」とは、特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から１０３番目のアミノ酸Ｇが、アミノ酸Ｒに置換されていることを意味する。また、本明細書における「Ｗ１２２Ｆ／Ｄ２４４Ｃ」等の表現は、多重変異を意味している。例えば、「Ｗ１２２Ｆ／Ｄ２４４Ｃ」とは、Ｗ１２２Ｆ及びＤ２４４Ｃのアミノ酸置換を同時に導入していることを意味する。

【0016】

また、本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。また、「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。また、「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。また、「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。

【0017】

本明細書において、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性を「ＡＣＯＤ活性」と表記することもある。また、本明細書において、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＯＤを「野生型ＡＣＯＤ」と表記することもある。

【0018】

１．ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（アルスロバクター・グロビフォルミス由来のＡＣＯＤ、野生型ＡＣＯＤ）の変異体であって、ＡＣＯＤ活性を有し、野生型ＡＣＯＤよりも熱安定性が向上しているポリペプチドである。

【0019】

本発明のポリペプチドの一態様として、下記(A)に示すポリペプチドが挙げられる。
(A) 配列番号１に示すアミノ酸配列における、２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目、５５７番目、１０３番目、１２２番目、２５３番目、３２５番目、３４９番目、３９８番目及び５８８番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【0020】

前記(A)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目及び５５７番目において置換するアミノ酸の種類については、特に制限されないが、好適な具体例として、下記の(1a)〜(8a)に示すアミノ酸置換の内、１つ又は複数が導入されているポリペプチドが挙げられる。
(1a)２４４番目（アスパラギン酸）が、非電荷アミノ酸、アスパラギン酸以外の酸性アミノ酸、非極性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；好ましくはセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、スレオニン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はプロリン；更に好ましくはセリン、システイン、又はイソロイシン；特に好ましくはシステインへの置換、
(2a)１６４番目（アスパラギン酸）が、非電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸；好ましくはアスパラギン、スレオニン又はトリプトファン；更に好ましくはアスパラギンへの置換、
(3a)４５９番目（アラニン）が、非電荷アミノ酸、アラニン以外の非極性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸；好ましくはセリン、スレオニン、バリン、フェニルアラニン、リジン又はヒスチジン；更に好ましくはスレオニンへの置換、
(4a)４２１番目（アラニン）が、非電荷アミノ酸又はアラニン以外の非極性アミノ酸；好ましくはアスパラギン、チロシン又はグルタミン；更に好ましくはグルタミンへの置換、
(5a)３６０番目（スレオニン）が、塩基性アミノ酸又は非極性アミノ酸；好ましくはリジン、アルギニン、ロイシン又はイソロイシン；更に好ましくはリジンへの置換、
(6a)６１４番目（アルギニン）が、非電荷アミノ酸、アルギニン以外の塩基性アミノ酸又は非極性アミノ酸；好ましくはグリシン、システイン、チロシン、リジン、アラニン又はトリプトファン；更に好ましくはチロシンへの置換、
(7a)４３９番目（チロシン）が、非極性アミノ酸、チロシン以外の非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；好ましくはロイシン、フェニルアラニン、スレオニン、リジン、又はアスパラギン酸；更に好ましくはフェニルアラニンへの置換、
(8a)５５７番目（グルタミン酸）が、塩基性アミノ酸、非電荷アミノ酸又は非極性アミノ酸；好ましくはアルギニン、ヒスチジン、セリン、又はアラニン；更に好ましくはヒスチジンへの置換、
(9a)１０３番目（グリシン）が、非極性アミノ酸；好ましくはバリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニン；更に好ましくはバリンへの置換
(10a)１２２番目（トリプトファン）が、トリプトファン以外の非極性アミノ酸；好ましくはフェニルアラニン、ロイシン又はイソロイシン；更に好ましくはフェニルアラニンへの置換、
(11a)２５３番目（イソロイシン）が、イソロイシン以外の非極性アミノ酸；好ましくはバリンへの置換、
(12a)３２５番目（スレオニン）が、塩基性アミノ酸又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸；好ましくはアルギニン、ヒスチジン又はグリシン；更に好ましくはアルギニンへの置換、
(13a)３４９番目（アルギニン）が、非電荷アミノ酸又はアルギニン以外の塩基性アミノ酸；好ましくはセリン、スレオニン、チロシン又はリジン；更に好ましくはスレオニンへの置換、
(14a)３９８番目（アラニン）が、非電荷アミノ酸；好ましくはグリシンへの置換、
(15a)５８８番目（スレオニン）が、非極性アミノ酸；好ましくはバリン、ロイシン、イソロイシン又はプロリン；更に好ましくはプロリンへの置換。

【0021】

前記(A)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目、５５７番目、１０３番目、１２２番目、２５３番目、３２５番目、３４９番目、３９８番目及び５８８番目の中の少なくとも１つが置換されていればよいが、安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目及び５５７番目の中の少なくとも１つ置換されているものが挙げられる。また、前記(A)のポリペプチドの好適な一態様として、配列番号１に示すアミノ酸配列の２４４番目が少なくとも他のアミノ酸に置換されているもの、より好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配列の(i)２４４番目と、(ii)１０３番目、１２２番目、１６４番目、２５３番目、３２５番目、３４９番目、３６０番目、３９８番目、４２１番目、４５９番目、及び５５７番目よりなる群から選択される少なくとも１種とが、他のアミノ酸に置換されているもの；更に好ましくは、少なくとも２４４番目と１６４番目が他のアミノ酸置換されているものが挙げられる。

【0022】

前記(A)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目、５５７番目、１０３番目、１２２番目、２５３番目、３２５番目、３４９番目、３９８番目及び５８８番目の中のアミノ酸残基の１つが置換された変異体であればよいが、これらのアミノ酸残基の２つ以上が置換された多重変異体であってもよい。前記(A)のポリペプチドとして、安定性をより一層効果的に向上させるという観点から、好ましくは下記の(1b)〜(23b)に示す単変異又は多重変異を有するポリペプチドが挙げられる。
(1b)２４４番目（アスパラギン酸）、１６４番目（アスパラギン酸）及び４５９番目（アラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(2b)２４４番目（アスパラギン酸）、１６４番目（アスパラギン酸）及び３４９番目（アルギニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3b)２４４番目（アスパラギン酸）、１６４番目（アスパラギン酸）及び３２５番目（スレオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4b)２４４番目（アスパラギン酸）、１６４番目（アスパラギン酸）及び３６０番目（スレオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5b)２４４番目（アスパラギン酸）及び１６４番目（アスパラギン酸）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(6b)２４４番目（アスパラギン酸）及び４５９番目（アラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7b)２４４番目（アスパラギン酸）及び３６０番目（スレオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(8b)２４４番目（アスパラギン酸）及び４２１番目（アラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(9b)６１４番目（アルギニン）が、他のアミノ酸に置換、
(10b)２４４番目（アスパラギン酸）及び２５３番目（イソロイシン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(11b)２４４番目（アスパラギン酸）及び５５７番目（グルタミン酸）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(12b)４３９番目（チロシン）が、他のアミノ酸に置換、
(13b)２４４番目（アスパラギン酸）及び１２２番目（トリプトファン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(14b)２４４番目（アスパラギン酸）及び３４９番目（アルギニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(15b)２４４番目（アスパラギン酸）及び３９８番目（アラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(16b)２４４番目（アスパラギン酸）及び１０３番目（グリシン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(17b)２４４番目（アスパラギン酸）が、他のアミノ酸に置換、
(17b)４２１番目（アラニン）が、他のアミノ酸に置換、
(18b)３４９番目（アルギニン）が、他のアミノ酸に置換、
(20b)５８８番目（スレオニン）が、他のアミノ酸に置換、
(21b)１２２番目（トリプトファン）が、他のアミノ酸に置換、
(22b)１０３番目（グリシン）が、他のアミノ酸に置換、
(23b)２５３番目（イソロイシン）が、他のアミノ酸に置換。

【0023】

前記(1b)〜(23b)に示す各アミノ酸置換において、置換される他のアミノ酸の種類の具体例については、前記(1a)〜(15a)に示す通りである。

【0024】

前記(1b)〜(23b)の中でも、安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは(1b)〜(16b)の変異、より好ましくは(1b)〜(12b)の変異、更に好ましくは(1b)〜(9b)の変異、特に好ましくは(1b)〜(4b)の変異、最も好ましくは(1b)の変異が挙げられる。

【0025】

前記(A)のポリペプチドの好適な具体例として、以下の(1c)〜(23c)に示す変異のいずれかを有するポリペプチドが挙げられる：(1c)Ｄ１６４Ｎ／Ｄ２４４Ｃ／Ａ４５９Ｔ、(2c)Ｄ１６４Ｎ／Ｄ２４４Ｃ／Ｒ３４９Ｔ、(3c)Ｄ１６４Ｎ／Ｄ２４４Ｃ／Ｔ３２５Ｒ、(4c)Ｄ１６４Ｎ／Ｄ２４４Ｃ／Ｔ３６０Ｋ、(5c)Ｄ１６４Ｎ／Ｄ２４４Ｃ、(6c)Ｄ２４４Ｃ／Ａ４５９Ｔ、(7c)Ｄ２４４Ｃ／Ｔ３６０Ｋ、(8c)Ｄ２４４Ｃ／Ａ４２１Ｑ、(9c)Ｒ６１４Ｙ、(10c)Ｄ２４４Ｃ／Ｉ２５３Ｖ、(11c)Ｄ２４４Ｃ／Ｅ５５７Ｈ、(12c)Ｙ４３９Ｆ、(13c)Ｗ１２２Ｆ／Ｄ２４４Ｃ、(14c)Ｄ２４４Ｃ／Ｒ３４９Ｔ、(15c)Ｄ２４４Ｃ／Ａ３９８Ｇ、(16c)Ｇ１０３Ｖ／Ｄ２４４Ｃ、(17c)Ｄ２４４Ｃ、(18c)Ａ４２１Ｑ、(19c)Ｒ３４９Ｔ、(20c)Ｔ５８８Ｐ、(21c)Ｗ１２２Ｆ、(22c)Ｇ１０３Ｖ、(23c)Ｉ２５３Ｖ。

【0026】

前記(1c)〜(23c)に示す変異の中でも、格段に優れた安定性の向上を実現するという観点から、好ましくは(1c)〜(16c)の変異、より好ましくは(1c)〜(12c)の変異、更に好ましくは(1c)〜(9c)の変異、特に好ましくは(1c)〜(4c)の変異、最も好ましくは(1c)の変異が挙げられる。

【0027】

また、本発明のポリペプチドの他の態様として、下記(B)及び(C)に示すポリペプチドが挙げられる。
(B) 配列番号１に示すアミノ酸配列における、２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目、５５７番目、１０３番目、１２２番目、２５３番目、３２５番目、３４９番目、３９８番目及び５８８番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、ＡＣＯＤ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＯＤと比較して安定性が向上しているポリペプチド。
(C) 配列番号１に示すアミノ酸配列における、２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目、５５７番目、１０３番目、１２２番目、２５３番目、３２５番目、３４９番目、３９８番目及び５８８番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、ＡＣＯＤ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＯＤと比較して安定性が向上しているポリペプチド。

【0028】

以下、前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における、２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目、５５７番目、１０３番目、１２２番目、２５３番目、３２５番目、３４９番目、３９８番目及び５８８番目以外のアミノ酸部位を「任意改変部位」と表記することもある。

【0029】

前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における、２４４番目、１６４番目、４５９番目、４２１番目、３６０番目、６１４番目、４３９番目、５５７番目、１０３番目、１２２番目、２５３番目、３２５番目、３４９番目、３９８番目及び５８８番目の中の少なくとも１つのアミノ酸に導入されるアミノ酸置換の態様、好ましいアミノ酸置換部位等は、前記(A)のポリペプチドの場合と同様である。

【0030】

前記(B)のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(B)のポリペプチドにおいて、任意改変部位に置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。

【0031】

また、前記(C)のポリペプチドにおける「配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性」は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。

【0032】

ここで、前記(C)のポリペプチドにおいて「配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列から前記任意改変部位のみを抜き出して、当該任意改変部位のみを比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７−２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。

【0033】

また、前記(B)及び(C)のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸置換は、保存的置換であることが好ましい。即ち、前記任意改変部位における置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。

【0034】

前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、「配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＯＤと比較して安定性が向上している」とは、下記加熱処理条件１又は２にて加熱処理を行った場合、或いは下記保存条件３にて保存した場合に、ＡＣＯＤ活性の残存率が、同条件で加熱処理或いは保存を行った野生型ＡＣＯＤのＡＣＯＤ活性の残存率よりも高いことを意味する。より具体的には、下記加熱処理条件１にて加熱処理した後のＡＣＯＤ活性の残存率が、好ましくは１５％以上、更に好ましくは２０％以上、特に好ましくは３０％以上であること；又は下記加熱処理条件２にて加熱処理した後のＡＣＯＤ活性の残存率が、好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上であること；或いは保存条件３にて保存した後のＡＣＯＤ活性の残存率が、好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることを意味する。

【0035】

〔加熱処理条件１〕
測定対象となるポリペプチドを１０μＭ ＦＡＤを含む２０ ｍＭ ＫＰ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）に添加して、５５℃に設定したウォーターバスで５分間インキュベートすることにより加熱処理を行った後に、急冷する。

【0036】

〔加熱処理条件２〕
測定対象となるポリペプチドを１０μＭ ＦＡＤを含む２０ ｍＭ ＫＰ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）に添加して、５５℃に設定したウォーターバスで１０分間インキュベートすることにより加熱処理を行った後に、急冷する。

【0037】

〔保存条件３〕
測定対象となるポリペプチドを３ｍＭ ＡＴＰ、１０μＭ ＦＡＤを含む５０ｍＭ ＢＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）に、２Ｕ／ｍｌになるように希釈して３７℃のインキュベーター内で３１日間保存する。

【0038】

〔ＡＣＯＤの活性の測定〕
本発明において、ＡＣＯＤ活性の測定は、パルミトイル‐ＣｏＡの存在下、ＡＣＯＤの作用により生成する過酸化水素を酵素的に測定することにより求められる。即ち、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）９０μｌ、１５ｍＭ ４−アミノアンチピリン４５μｌ、６ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン４５μｌ、５０Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ４５μｌ、１％（重量％，以下全て同様）トリトンＸ−１００溶液４５μｌ、５ｍＭパルミトイル‐ＣｏＡ溶液４５μｌ、水１３５μｌよりなる反応液を３７℃に５分置いた後に、測定対象となるポリペプチドを所定濃度に希釈した溶液１０μｌを加えて３７℃で５分間反応させ、０．５％ＳＤＳ１５０μｌにより反応を停止させた後、５５５ｎｍの吸光度を測定する。上記条件で、１分間に１μmoleのＨ₂Ｏ₂を生成する酵素量を１Ｕとする。

【0039】

上記で得られた吸光度の値から、下記の計算式に従ってＡＣＯＤ活性を求める。

【数1】

【0040】

次いで、上記で算出したＡＣＯＤ活性の値から、下記の計算式に従って、ＡＣＯＤ活性値の残存率（％）を求める。

【数2】

【0041】

２．ＤＮＡ
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、例えば、変異前の野生型ＡＣＯＤ（配列番号１）をコードしているＤＮＡに前記アミノ酸置換が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。また、本発明のＤＮＡは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。その際、該ＤＮＡの塩基配列におけるコドン利用頻度を、使用する宿主のコドン利用頻度に最適化したＤＮＡを人工合成することもできる。

【0042】

ここで、野生型ＡＣＯＤをコードしているＤＮＡは、例えば、配列番号２に示す塩基配列として知られており（ｇｉ３５９７７６９９６：７５１２５−７７２０３）アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｌｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）菌体からＰＣＲを用いた定法により単離することができる。また、野生型ＡＣＯＤをコードしているＤＮＡは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。

【0043】

また、野生型ＡＣＯＤをコードしているＤＮＡは、配列番号２に示される野生型ＡＣＯＤをコードしている塩基配列から、コドン利用頻度を使用する宿主のコドン利用頻度に最適化したＤＮＡを設計して合成することもできる。例えば、配列番号２に示される野生型ＡＣＯＤをコードしている塩基配列から、コドン利用頻度を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のコドン利用頻度に最適化した塩基配列として、配列番号３に示される塩基配列が挙げられる。

【0044】

塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ？Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ？Ｐｌｕｓ？Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ：東洋紡製等）の利用等が挙げられる。

【0045】

このようにして塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。得られた塩基配列については、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトエンジニアリング社製）又はＧＥＮＥＴＩＸ（ソフトウェア開発社製）等の塩基配列解析ソフトによる解析を行うことにより、ＤＮＡ中のＡＣＯＤ遺伝子のコード領域を特定することができる。

【0046】

一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。

【0047】

更に、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ペプチドをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。

【0048】

本発明のＤＮＡの一例として、配列番号４に示す塩基配列が挙げられる。配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号１に示すアミノ酸配列における１６４番目がアスパラギン、２４４番目がシステイン、及び４５９番目がスレオニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡである。

【0049】

また、本発明のＤＮＡには、ＡＣＯＤ酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＯＤと比較して安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ、配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが包含される。

【0050】

ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。

【0051】

ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、³²Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。

【0052】

更に、本発明のＤＮＡには、ＡＣＯＤ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＯＤと比較して安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番４に示す塩基配列からなるＤＮＡに８０％以上の相同性を有するＤＮＡも包含される。該相同性として、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上が挙げられる。

【0053】

ここで、ＤＮＡの「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。

【0054】

本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましく、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡがより好ましい。

【0055】

コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌のコドン利用頻度の一例として以下のものが挙げられる。
Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。

【0056】

３．組換えベクター
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」と表記することもある）は、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。

【0057】

本発明の組換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。

【0058】

発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。

【0059】

ファージとしては、例えば、後述する大腸菌を宿主とする場合には、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１等が挙げられる。

【0060】

プラスミドとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びコスミドであるＳｕｐｅｒ Ｃｏｓ Ｉ等が挙げられる。

【0061】

宿主としてシュードモナスを用いる場合には、グラム陰性菌用広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０、ｐＢＢＲ１２２、及びｐＣＮ５１等が挙げられる。更に、レトロウイルス及びワクシニアウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。

【0062】

４．形質転換体
本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。

【0063】

形質転換体の製造に使用される宿主としては、組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；酵母；ＣＯＳ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９等の昆虫細胞；アブラナ科等に属する植物体全体、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、根及び種子等）、植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部および維管束等）、植物培養細胞等が挙げられる。これらの中でも大腸菌が好ましく、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＢＬ２１及び大腸菌ＪＭ１０９がより好ましい。

【0064】

本発明の形質転換体は、宿主に本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができ、宿主に組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセル用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。

【0065】

本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法およびノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。

【0066】

ＰＣＲ法よって本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体から組換えベクターを分離・精製すればよい。

【0067】

組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。

【0068】

更に、凍結融解及びフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理、及び市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。

【0069】

ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いる。ＤＮＡと発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。

【0070】

その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。

【0071】

また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。

【0072】

４．ポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、前記形質転換体を培養することによって製造することができる。

【0073】

形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。

【0074】

培地の栄養源としては、形質転換体の生育に必要とされるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。

【0075】

窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。

【0076】

培地には、炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。

【0077】

培養温度は、本発明の形質転換体が生育可能であり、且つ本発明の形質転換体が本発明のポリペプチドを産生する範囲で適宜設定し得るが、好ましくは１５〜３７℃程度である。培養は、本発明のポリペプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２〜４８時間程度である。

【0078】

培地のｐＨは、宿主が発育し、宿主が変異型ＡＣＯＤを産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度の範囲である。

【0079】

本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離等の方法により培養上清又は菌体を回収し、菌体は超音波及びフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。

【0080】

また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。

【0081】

上記のようにして得られた本発明のポリペプチドを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。

【0082】

濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。

【0083】

本発明のポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。

【0084】

前記精製処理は既に公知であり、適当な文献、雑誌および教科書等を参照することで進めることができる。このようにして精製された本発明のポリペプチは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化して市場に流通させることができる。

【実施例】

【0085】

次に、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。

【0086】

参考例１：組換えベクターの作製及び形質転換体の調製
公知のアルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｌｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ ＮＢＲＣ １２１３７）由来ＡＣＯＤ遺伝子配列（配列番号２）を、ゲノムＤＮＡを元に、5'末端にＸｂａＩ認識配列を付加したフォワードプライマー（配列番号５）及び3'末端にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加したリバースプライマー（配列番号６）を用いてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。精製したＡＣＯＤ遺伝子及びプラスミドベクターｐＴｒｃ９９ａを制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）にてそれぞれ切断し、両者をアガロースゲル電気泳動により分離して目的のＤＮＡ断片をＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を用いて回収した。次いでこれらのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈキット（東洋紡績製）にて１６℃で１５分間反応させて連結し、アルスロバクター・グロビフォルミス由来のＡＣＯＤ遺伝子を含む組換えベクターを得た。

【0087】

その後、組換えベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡績製）に導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で終夜培養して形質転換体を取得した。この形質転換体からプラスミド抽出を行い、精製し、組換えベクターを取得した。得られた組換ベクターは、ＡＣＯＤ遺伝子本来の開始コドンの前に開始コドンを有するため、得られた組換ベクターを鋳型にインバースＰＣＲを行うことで余分な配列を除去した。ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列は、配列番号７（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号８（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）である。ＰＣＲ反応は、熱変性９８℃で１０秒、アニール５３℃で１５秒、伸長反応７２℃で４分を１８サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩで制限酵素処理することにより鋳型ＤＮＡを切断し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡績製）に導入し、前記と同様の方法により形質転換体を取得した。この形質転換体からプラスミド抽出を行い、精製することにより、組換えベクターを取得した。取得した組換えベクターが設計通りに作製できているかをシーケンシングにより確認した。これにより得られた組換えベクターをｐＴｒｃ−ＡＣＯＤと命名した。

【0088】

実施例１：変異型ＡＣＯＤの発現用組換えベクターの作製
野生型ＡＣＯＤをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＴｒｃ−ＡＣＯＤ、表１に示す合成オリゴヌクレオチド（変位導入プライマー）、当該合成オリゴヌクレオチドと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｔ Ｍ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行った。以上の操作を繰り返し、複数の変異を有する変異型ＡＣＯＤ酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＴｒｃ−ＡＣＯＤ１〜２３）を取得した。表２に、作成した変異体ＡＣＯＤ−１〜２３と変異部位の詳細を示す。

【0089】

【表1】

【0090】

【表2】

【0091】

ｐＴｒｃ−ＡＣＯＤ及びｐＴｒｃ−ＡＣＯＤ１〜２３を大腸菌ＤＨ５αに導入した形質転換体を用いて、以下の方法で野生型ＡＣＯＤ及びＡＣＯＤ変異体を発現させ、野生型ＡＣＯＤ及びＡＣＯＤ変異体を得た。

【0092】

先ず、前記３５種の形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート培地で培養してコロニーを形成させた。それぞれの形質転換体の単一コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地２ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。その後、終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を加え、３７℃で５時間振とう培養し、菌液を回収した。回収した菌液を遠心分離し、それぞれの変異体酵素を発現させた大腸菌を回収した。

【0093】

次いで、回収した菌体を１０μＭ ＦＡＤを含む２０ ｍＭ ＫＰ Ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波により破砕した。後述する実施例３では、該破砕液を用いて安定性の評価を行った。

【0094】

実施例２：野生型ＡＣＯＤ及びＡＣＯＤ変異体の調製
（２−１）野生型ＡＣＯＤ及びＡＣＯＤ変異体の大量発現
前記ｐＴｒｃ−ＡＣＯＤ及びｐＴｒｃ−ＡＣＯＤ１〜２３を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した形質転換体を培養することにより、野生型ＡＣＯＤ及びＡＣＯＤ変異体を大量発現させた。

【0095】

即ち、それぞれの形質転換体の単一コロニーを２ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地に植菌して３７℃で１６時間振とう培養し、該２×ＹＴ培養液をあらかじめオートクレーブ滅菌して調整した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび０．１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（和光純薬工業株式会社製）を含む１００ｍＬの培地へ植菌した。該培養液はそれぞれ３７℃で１６時間培養した。

【0096】

該培養液を１５，０００×ｇで２０分間、遠心し、培養上清を除去して組換え大腸菌の菌体をそれぞれ得た。それぞれの菌体は以下の精製時まで−３０℃のフリーザー内に保存した。

【0097】

（２−２）野生型ＡＣＯＤおよびＡＣＯＤ変異体の精製
前記で得られた組換え大腸菌の菌体に、３０ｍＬの２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して菌体を懸濁し、超音波破砕機により菌体を破砕した。破砕液を１５，０００×ｇで３０分間、遠心して破砕液上清を得た。

【0098】

該破砕液上清に含まれるタンパク質を、予め２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した２０ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＱＡＥ−５５０Ｃ（東ソー株式会社製）に吸着させ、０．０Ｍから０．４Ｍの塩化カリウムの濃度勾配によりＡＣＯＤ活性画分を溶出させた。

【0099】

得られたＡＣＯＤ活性画分を２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析後、２０ｍＭ リン酸緩衝液(ｐＨ６．０)で予め平衡化した１０ｍＬのＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^TM Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）に吸着させ、０．０Ｍから０．４Ｍの塩化カリウムの濃度勾配によりＡＣＯＤ活性画分を溶出させた。

【0100】

該ＡＣＯＤ活性画分を２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析し、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋ（メルク株式会社製）を用いて濃縮した。以下、透析・濃縮されたＡＣＯＤ活性画分を精製酵素とした。

【0101】

実施例３：野生型ＡＣＯＤ及びＡＣＯＤ変異体の安定性評価
（３−１）ＡＣＯＤ変異体の耐熱性の評価１
実施例１で得られた破砕液（野生型ＡＣＯＤ又はＡＣＯＤ変異体含有）を０．２ｍＬのプラスチックチューブに５０μＬずつ分注し、該プラスチックチューブを５５℃に調節したウォーターバスに投入し、５分間、熱処理した。熱処理終了後、該プラスチックチューブを氷水に投入して急冷した。熱処理前後の活性を上述の方法により求め、熱処理前の活性値を１００としたときの熱処理後のＡＣＯＤ活性の残存率（％）を算出し、安定性の指標とした。

【0102】

得られた結果を表３に示す。この結果から、変異体１〜９のＡＣＯＤは、野生型ＡＣＯＤに比べて安定性が向上していることが確認された。特に、単変異を導入した変異体では、Ｄ２４４Ｃ、Ｒ３４９Ｔ、Ａ４２１Ｑ、Ｙ４３９Ｆ及びＲ６１４Ｙで特に安定性の向上が認められた。

【0103】

【表3】

【0104】

（３−２）ＡＣＯＤ変異体の耐熱性の評価２
実施例１で得られた破砕液（ＡＣＳ変異体含有）を０．２ｍＬのプラスチックチューブに５０μＬずつ分注し、該プラスチックチューブを５５℃に調節したウォーターバスに投入し、１０分間、熱処理した。熱処理前後の活性を上述の方法により求め、熱処理前の活性値を１００としたときの熱処理後のＡＣＯＤ活性の残存率（％）を算出し、安定性の指標とした。

【0105】

得られた結果を表４に示す。この結果から、多重変異を導入した変異体１０〜１９のＡＣＯＤは、単変異を導入した変異体３（Ｄ２４４Ｃ）に比べて安定性が向上していることが確認された。また、変異体１０〜１９のＡＣＯＤは、いずれも、配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目のアミノ酸変異と組み合わせることで安定性がより安定化していることから、該アミノ酸の置換が安定性の向上に重要であることも明らかになった。

【0106】

【表4】

【0107】

実施例４：野生型ＡＣＯＤ及びＡＣＯＤ変異体の保存安定性の評価
実施例２で得られた精製酵素（野生型ＡＣＯＤ又はＡＣＯＤ変異体）を３ｍＭ ＡＴＰ、１０μＭ ＦＡＤを含む５０ｍＭ ＢＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）に、２Ｕ／ｍｌになるように希釈した。この酵素溶液を３７℃で保存し、保存開始時の活性値を１００とした時のＡＣＯＤ活性の残存率（％）を算出し、安定性の指標とした。

【0108】

得られた結果を表５に示す。この結果から、Ｄ２４４Ｃの単変異でも野生型ＡＣＯＤと比較すると格段に溶液中での保存安定性が向上していることが確認された。変異体２０〜２３のＡＣＯＤは、単変異を導入した変異体３や二重変異を導入した変異体１２よりも更に安定性が向上しており、特に変異体２０、２１、及び２３は３７℃における３１日の保存においても９０％以上の残存活性を有していた。また、変異体３、１２、及び２０〜２３のＡＣＯＤは、いずれも、配列番号１に示すアミノ酸配列における２４４番目のアミノ酸が置換を有していることから、２４４番目のアミノ酸置換を少なくとも含む多重変異が、ＡＣＯＤの安定性の向上の上で、特に有効であることが明らかになった。

【0109】

【表5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]