特許 6400744 神経前駆細胞またはその分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6400744

(24)【登録日】2018年9月14日

(45)【発行日】2018年10月3日

(54)【発明の名称】神経前駆細胞またはその分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/30 20150101AFI20180920BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20180920BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20180920BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20180920BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180920BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20180920BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20180920BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20180920BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20180920BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20180920BHJP

   A61K 35/545 20150101ALN20180920BHJP

   A61K 35/54 20150101ALN20180920BHJP

   C12N 5/0797 20100101ALN20180920BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/30

   A61P9/10

   A61P25/00

   A61P29/00

   A61P43/00 111

   A61P9/10 103

   A61P25/28

   A61P25/16

   A61P25/14

   A61P25/08

   A61K38/00

   !A61K35/545

   !A61K35/54

   !C12N5/0797ZNA

【請求項の数】10

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2016-575413(P2016-575413)

(86)(22)【出願日】2015年6月26日

(65)【公表番号】特表2017-520578(P2017-520578A)

(43)【公表日】2017年7月27日

(86)【国際出願番号】KR2015006588

(87)【国際公開番号】WO2015199499

(87)【国際公開日】20151230

【審査請求日】2017年1月25日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0080009

(32)【優先日】2014年6月27日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】517119589

【氏名又は名称】エス−バイオメディックス

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(72)【発明者】

【氏名】ドンウク・キム

(72)【発明者】

【氏名】ハンス・キム

【審査官】 六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５０１２０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０９５６６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５０３２１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PLoS ONE，２０１２年，7(7)，e39715

【文献】 Stem Cell Research，２０１３年，10，p.133-146

【文献】 Abstract Viewer & Itinerary Planner，２０１１年，41，158.12/AA28

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／００−３５／７６８

ＷＰＩ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞を有効成分として含む虚血性疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、または脊髄損傷の治療用組成物であって、
前記ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞は、全能性幹細胞から分化された神経ロゼットから分離され、前記全能性幹細胞は、胚芽幹細胞、またはｉＰＳＣｓであり、
前記ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞は、初期神経外胚葉マーカーを発現する神経ロゼット段階の細胞である治療用組成物。

【請求項2】

前記組成物は、アンジオポエチン−１の発現を増加させることを特徴とする請求項１に記載の治療用組成物。

【請求項3】

前記組成物は、グリア細胞または星状細胞の活性化を抑制することを特徴とする請求項１に記載の治療用組成物。

【請求項4】

前記組成物は、ＣＤ６８またはＧＦＡＰの発現を減少させることを特徴とする請求項３に記載の治療用組成物。

【請求項5】

ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物であって、
前記ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞は、全能性幹細胞から分化された神経ロゼットから分離され、前記全能性幹細胞は、胚芽幹細胞、またはｉＰＳＣｓであり、
前記ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞は、初期神経外胚葉マーカーを発現する神経ロゼット段階の細胞であり、
前記ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞は、ＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン）とｂＦＧＦとが含有された無血清動物細胞培養培地で培養され、
その後、前記分泌タンパク質は、前記細胞を除去して収得したものであり、
前記分泌タンパク質は、前記ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞を前記無血清動物細胞培養培地で培養して得た細胞培養液に含有された形態である治療用組成物。

【請求項6】

前記分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含むことを特徴とする請求項５に記載の治療用組成物：
アグリン、アネキシンＡ５、ＢＳＧ、ビグリカン、カルポニン−３、コアクトシン−類似タンパク質、コフィリン−１、コラーゲンα−２、クリン−３、デストリン、ジストログリカン、エフリン−Ｂ２、エクスポーチン−２、エズリン、フィブロネクチン、ファイブリン−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄタンパク質、ゼラチン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ２、ホルネリン、インポーチン−９、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、大食細胞移動抑制因子、ミッドカイン、モエシン、ニューロピリン２、プレイオトロフィン、プロフィリン−１、タンパク質ＤＪ−１、ラディキシン、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セプチン−１１、タリン−１、テスティカン、チモポエチン、トランスゲリン−３、及びビメンチン。

【請求項7】

前記分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含むことを特徴とする請求項５に記載の治療用組成物：
アグリン、アネキシンＡ２、アトラクチン、ビグリカン、セルロプラスミン、コフィリン−１、コラーゲンα−１、コロニン−１Ｘ、ダームシジン、ＤＥＲＰ１２、エフリン−Ｂ３、エクソストシン−２、エズリン、ゼラチン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ２、ホルネリン、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、ミッドカイン、モエシン、マルチプル上皮成長因子−類似ドメインタンパク質８、ニドゲン−１、パラチモシン、プロフィリン−２、タンパク質ＤＪ−１、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セクレトグラニン、タリン−１、チモシンβ４、ＴＧＦＢＩ、トランスゲリン、及びビメンチン。

【請求項8】

前記虚血性疾患は、虚血性脳血管疾患、虚血性心臓疾患、心筋梗塞、狭心症、下肢動脈虚血性疾患、及び四肢末端部虚血性疾患で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１または５に記載の治療用組成物。

【請求項9】

前記虚血性脳血管疾患は、脳卒中であることを特徴とする請求項８に記載の治療用組成物。

【請求項10】

前記神経炎症疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ルーゲーリック病、クロイツフェルトヤコブ病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、白質脳炎、側頭葉てんかん、及び脊髄損傷で構成された群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の治療用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、神経前駆細胞またはその分泌タンパク質（Ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

幹細胞は、その多分化能によって、多様な疾患の有望な治療候補物質として見なされる。例えば、間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）は、容易に収得及び分離が可能であり、血管新生を促進し、炎症を抑制する多くの栄養因子を分泌する（非特許文献１）。ＭＳＣのこのような特性は、ヒト疾病の治療に適用するための研究から考慮された。最近の研究によれば、ＭＳＣは、多くの動物モデル及びヒト臨床治療（非特許文献２〜３）で組織回復に寄与すると明かになった。いくつかの報告が、インビトロでＭＳＣがニューロン（非特許文献４）及び星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）（非特許文献５）を含む神経系列への分化能を言及しているが、これら分化された細胞が、インビボで如何なる機能を行うか否かの明確な証拠はない。ＭＳＣの有益な効果は、細胞代替よりは傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）機作によって誘導されると見られ、これにより、ＭＳＣの移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）は、長期間持続する改善ではない、一時的であり、限定された効果を有すると見える（非特許文献６）。

【0003】

一方、胚芽幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＥＳＣｓ）は、３個の胚芽生殖葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）から由来するあらゆる特定細胞の形態で分化し、強力な自己再生能力を有すると知られた。注目すべきことは、ＥＳＣから由来する神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ、ＮＰＣｓ）は、優先的にニューロン、星状細胞及び希少突起グリア細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）を含む神経系の特定形態の細胞に分化するために、脳組織の回復のための細胞源（ｃｅｌｌ ｓｏｕｒｃｅ）と見なされるということである。これら細胞は、また内生神経前駆細胞の生存及び増殖を促進するいくつかの因子を分泌する（非特許文献７）。しかし、ＥＳＣから分化されたＮＰＣｓまたはＮＰＣｓの培養液が、如何に疾患モデルで移植後、機能の改善に寄与するかは依然として知られていない。

【0004】

本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｃａｐｌａｎ，Ａ．Ｉ．，＆ Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｅ．（２００６）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９８，１０７６−１０８４

【非特許文献2】Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｋａｔａｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７３，７７８−７８６

【非特許文献3】Ｋｏｐｅｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．，＆ Ｐｈｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．（１９９９）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９６，１０７１１−１０７１６

【非特許文献4】Ｂａｅ，Ｋ．Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｂ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｄ．Ｊ．，＆ Ｋａｎｇ，Ｓ．Ｊ．（２０１１）．Ｙｏｎｓｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，５２，４０１−４１２

【非特許文献5】Ｋｏｐｅｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．，＆ Ｐｈｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．（１９９９）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９６，１０７１１−１０７１６

【非特許文献6】Ｃｈｏ，Ｓ．Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｒ．，Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ，１８，１３５９−１３６８

【非特許文献7】Ｃａｐｏｎｅ，Ｃ．，Ｆｒｉｇｅｒｉｏ，Ｓ．，Ｆｕｍａｇａｌｌｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．ＰＬｏＳＯｎｅ，７，ｅ３７３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明者らは、虚血性疾患または神経炎症疾患の根本的な治療方法を開発するために鋭意研究した。その結果、表面で神経接着分子であるＰＳＡ−ＮＣＡＭを発現する神経前駆細胞を病変部位に注入する場合、血管の新生が促進され、炎症反応が抑制されることによって、血管損傷による虚血性疾患及び炎症による神経組織の損傷を、効率的に治療可能であることを見つけて、本発明の完成に至った。同時に、幹細胞移植とは異なる処理方式として、神経前駆細胞分泌タンパク質の病変部位への投与を通じて虚血性損傷部位を減少させ、神経機能を回復させることによって、虚血性疾患と炎症による神経損傷疾患のような退行性神経系疾患を効果的に治療することができるということを確認することによって、本発明を完成した。

【0007】

したがって、本発明の目的は、虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供することである。

【0008】

本発明の他の目的は、虚血性疾患または神経炎症疾患の治療方法を提供することである。

【0009】

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の一態様によれば、本発明は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（ｐｏｌｙ−ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−陽性神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供する。

【0011】

本発明の他の一態様によれば、本発明は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞を有効成分として含む組成物を、それを必要とする個体に投与する段階を含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療方法を提供する。

【発明の効果】

【0012】

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供する。
（ｂ）本発明で用いられるＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞は、注入された組織での血管新生を促進し、炎症反応を抑制する。前記ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞は、抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体を用いて簡単に分離し、間葉幹細胞（ＭＳＣ）に比べても、優れた血管新生及び炎症抑制活性を示して、血管損傷による虚血性疾患及び炎症による神経損傷疾患に対する効率的な治療組成物として有用に用いられうる。
（ｃ）本発明の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、虚血性損傷部位を減少させるだけではなく、神経機能を回復させるので、虚血性疾患と炎症による神経損傷疾患のような退行性神経系疾患の治療剤として用いられうる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1a】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}及びＭＳＣを移植したラット虚血脳での梗塞部位の縮小を示す図である。図１ａは、実験計画図を示す模式図である。ｐＭＣＡｏ以後、１日目に、実験動物にランダムにＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}、ＭＳＣまたはＰＢＳを処理した（それぞれｎ＝１０）。移植後、２６日目に実験動物を犠牲させ、脳組織に対する免疫組織化学分析を進行した。

【図1b】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}及びＭＳＣを移植したラット虚血脳での梗塞部位の縮小を示す図である。図１ｂは、ラットｐＭＣＡｏモデルでＭＳＣｓ及びＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}移植が移植２６日目に梗塞サイズに及ぼす効果を示す図である。ＰＢＳ群と比較時に、それぞれ＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１である。

【図1c】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}及びＭＳＣを移植したラット虚血脳での梗塞部位の縮小を示す図である。図１ｃは、ＰＢＳ、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}またはＭＳＣを処理したラットで移植２６日目の代表的イメージを示す図である。

【図2a】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}を移植したラット脳卒中モデルで行動能力の向上を示す図である。体重変化の結果を示す。測定値は、±標準誤差で表示した。ＰＢＳ群と比較して、それぞれ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。

【図2b】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}を移植したラット脳卒中モデルで行動能力の向上を示す図である。フットフォールト検査の結果を示す。測定値は、±標準誤差で表示した。ＰＢＳ群と比較して、それぞれ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。

【図2c】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}を移植したラット脳卒中モデルで行動能力の向上を示す図である。非対称検査の結果を示す。測定値は、±標準誤差で表示した。ＰＢＳ群と比較して、それぞれ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。

【図2d】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}を移植したラット脳卒中モデルで行動能力の向上を示す図である。ビーム均衡検査の結果を示す。測定値は、±標準誤差で表示した。ＰＢＳ群と比較して、それぞれ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。

【図2e】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}を移植したラット脳卒中モデルで行動能力の向上を示す図である。捕捉可能牽引検査の結果を示す。測定値は、±標準誤差で表示した。ＰＢＳ群と比較して、それぞれ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。

【図2f】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}を移植したラット脳卒中モデルで行動能力の向上を示す図である。ｍＮＳＳの結果を示す。測定値は、±標準誤差で表示した。ＰＢＳ群と比較して、それぞれ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。

【図3a】生存したＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}のラット脳組織への編入及び分化を示す。図３ａは、梗塞部位を示す。移植されたＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の生存及び増殖を２６日目に試験した。Ｋｉ６７（緑色）またはＤＣＸ（赤色）陽性細胞がラット虚血脳で観察された。スケールバー：５００μｍ。

【図3b】生存したＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}のラット脳組織への編入及び分化を示す。図３ｂは、図３ａの高倍率写真である。スケールバー：２００μｍ。左側からＤＣＸ／ＤＡＰＩ、Ｋｉ６７／ＤＡＰＩ、ＤＣＸ／Ｋｉ６７／ＤＡＰＩ、Ｔｕｊ１／ＤＡＰＩ、Ｎｅｓｔｉｎ／Ｋｉ６７／ＤＡＰＩに関する写真である。

【図3c】生存したＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}のラット脳組織への編入及び分化を示す。図３ｃは、ｈＮｕ（緑色）及びＤＣＸ（赤色）を共に発現するＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}細胞の一例を示す図であって、多くの移植されたＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}細胞がｈＮｕ陽性を示して、優れた生存率と損傷された脳組織への生着率とを示すことが分かる。スケールバー：２０μｍ。左側から時計回り方向にＤＡＰＩ、ｈＮｕ、ｈＮＵ／ＤＣＸ、ＤＣＸに関する写真である。

【図3d】生存したＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}のラット脳組織への編入及び分化を示す。図３ｄは、ＭＳＣ−移植群のほとんどで針管（ｎｅｅｄｌｅ ｔｒａｃｔ）周囲にいくつかの増殖したＫｉ６７^＋ｈＮｕ⁻細胞が観察されることを示す図である。スケールバー：２００μｍ。左側からｈＮＵ／ＤＡＰＩ、Ｋｉ３７／ＤＡＰＩ、ｈＮＵ／Ｋｉ６７に関する写真である。

【図4a】ラット脳組織でＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の神経組織への寄与及びグリア細胞活性化の減少効果を示す図である。図４ａは、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植されたラット脳でｈＭｉｔｏ^＋（赤色）及びＭＡＰ２^＋（緑色）細胞が観察されることを示す図である。スケールバー：２０μｍ。

【図4b】ラット脳組織でＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の神経組織への寄与及びグリア細胞活性化の減少効果を示す図である。図４ｂは、移植された細胞の移植２６日目の共焦点イメージである。供与者由来細胞（緑色、ｈＮｕ^＋）は、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}移植部位でＭＡＰ２（赤色）と共に位置した。ＤＡＰＩ、青色。

【図4c】ラット脳組織でＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の神経組織への寄与及びグリア細胞活性化の減少効果を示す図である。図４ｃは、反対側線条体の宿主ニューロンにＭＡＰ２と共に位置するｈＭｉがないことを示す図である。線条体にＭＡＰ２^＋細胞が顕著に存在することが分かる。スケールバー：２０μｍ。

【図4d】ラット脳組織でＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の神経組織への寄与及びグリア細胞活性化の減少効果を示す図である。図４ｄは、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植されたラット脳にｈＭｉｔｏ^＋ＧＦＡＰ^＋細胞が検出されないことを示す図である。スケールバー：２０μｍ。

【図4e】ラット脳組織でＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の神経組織への寄与及びグリア細胞活性化の減少効果を示す図である。図４ｅは、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植グループで同側線条体のＥＤ−１陽性が有意に減少し、ＭＳＣ−移植グループでは、その程度が低いことを示す図である。ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−及びＭＳＣ−移植グループいずれもＰＢＳグループとは有意な差を示した。ＧＦＡＰの発現は、ＭＳＣ−またはＰＢＳ群に比べて、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植群で目立つように減少した。スケールバー：２００μｍ。

【図4f】ラット脳組織でＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の神経組織への寄与及びグリア細胞活性化の減少効果を示す図である。ＥＤ１またはＧＦＡＰ陽性細胞の数を少なくとも５個の別個の顕微鏡領域で測定した。測定値は、±標準誤差で表示した。各グループ間の多重比較時に、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。

【図5a】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}が移植されたラット虚血脳で血管新生が促進されることを示す図である。図５ａは、ＰＢＳ群、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−またはＭＳＣ−移植群の虚血性脳の免疫染色の結果をそれぞれ示した図である。スケールバー：２００μｍ。

【図5b】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}が移植されたラット虚血脳で血管新生が促進されることを示す図である。図５ｂは、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植部位の宿主起源α−ＳＭＡ−陽性血管上皮細胞（赤色）の代表的なイメージを示す図である。スケールバー：２０μｍ。

【図5c】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}が移植されたラット虚血脳で血管新生が促進されることを示す図である。図５ｃは、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−またはＭＳＣ−移植されたラットでα−ＳＭＡ−陽性微小血管の定量分析の結果を示す図である。測定値は、±標準誤差で表示した。＊ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}群をＭＳＣまたはＰＢＳ群と比較時に、それぞれＰ＜０．０５及びＰ＜０．０１。

【図5d】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}が移植されたラット虚血脳で血管新生が促進されることを示す図である。図５ｄは、虚血性脳でのラット−アンジオポエチン−１の発現量をＲＴ−ＰＣＲでＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}（ＮＰＣ）またはＭＳＣ移植７日及び２６日後に測定した結果を示す図である。アンジオポエチン−１のＲＴ−ＰＣＲ増幅（上）及びシャム対照群（基底値）に対してＧＡＰＤＨ−標準化したｍＲＮＡレベル（下）の定量化の結果を示す。測定値は、±標準誤差で表示した。＊ＰＢＳ群と比較時に、Ｐ＜０．０５。

【図6】ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}、ＭＳＣまたはＰＢＳを移植した虚血脳でのラット及びヒト神経栄養因子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲを用いて調査した結果を示した図である。神経栄養因子のＲＴ−ＰＣＲ増幅及びシャム対照群（基底値）（グループ当たりｎ＝３）に対してＧＡＰＤＨ−標準化したｍＲＮＡレベルの定量化の結果を示す。測定値は、±標準誤差で表示した。＊ＰＢＳ群と比較時に、Ｐ＜０．０５。

【図7】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の虚血性病変部位のサイズを示す。＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０１。

【図8】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の体重変化を示す。＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０１。

【図9a】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の行動分析の結果を示す。図９ａは、ビーム均衡検査の結果を示す。＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０１。

【図9b】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の行動分析の結果を示す。図９Ｂは、捕捉可能牽引検査の結果を示す。＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０１。

【図9c】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の行動分析の結果を示す。図９Ｃは、フットフォールト検査の結果を示す。＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０１。

【図9d】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の行動分析の結果を示す。図９Ｄは、単位時間当たり行動の活発さを示すラインクロス（ｌｉｎｅ ｃｒｏｓｓ）の結果を示す。＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０１。

【図10】ＰＢＳ対照群、培地対照群及び分泌タンパク質処理群の総合的な行動神経改善効果（ｍＮＳＳ）の分析結果を示す。＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０５、＊＊Ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０１。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明によれば、本発明の組成物は、虚血性疾患または神経炎症疾患にかかった個体で虚血性組織の血管を復元するか、炎症反応を抑制することによって、その症状の発展を抑制するか、それを除去または軽減させる役割を果たす。したがって、本発明の組成物は、それ自体で虚血性疾患または神経炎症疾患の治療組成物にもなり、あるいは他の抗虚血／抗炎症組成物と共に投与されて、これら疾患に対する治療補助剤として適用されることもある。これにより、本明細書で、用語“治療”または“治療剤”は、“治療補助”または“治療補助剤”の意味を含む。

【0015】

本発明によれば、本発明の組成物は、血管新生誘発因子であるアンジオポエチン−１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）の発現を有意に増加させ、投与（または、移植）部位の血管数及び微小血管の濃度を大きく増加させる。したがって、本発明の組成物は、血管組織の消失、血管生成の欠乏または非正常な血管の形成などによって血流量が減少した個体で血管組織を回復するか、血管の数を増加させることによって、血流量を回復させる効率的な虚血性疾患の治療組成物として用いられうる。

【0016】

本発明によれば、本発明の組成物は、投与（または、移植）された神経組織での反応性微細グリア細胞及び星状細胞の活性化を抑制する。微細グリア細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）は、中枢神経系で一次的な免疫機能を行う細胞であって、活性化された微細グリア細胞は、正常状態の微細グリア細胞とは異なって、捕食作用を活発にし、細胞増殖を行い、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６のようなサイトカイン、ケモカイン、ｉＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＣＯＸ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）などの遺伝子を発現させて炎症媒介物質を生成する。活性化された星状細胞も、炎症性サイトカインであるＩＬ−６、ＴＧＦ−β、ＬＩＦ及びＩＬ−１を分泌し、該分泌されたこれらサイトカインは、再び微細グリア細胞及び星状細胞を活性化させることによって、組織内の環境を悪化させる。したがって、微細グリア細胞及び星状細胞の活性化を抑制する本発明の組成物は、炎症反応による神経組織の損傷を効果的に遮断することができる。

【0017】

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、アンジオポエチン−１の発現を増加させる。

【0018】

本明細書で使われた用語、“発現の増加”とは、正常人に比べて、遺伝子またはタンパク質の発現が測定可能な程度に有意に増加することを言い、より具体的には、対照群に比べて、発現量が１３０％以上になることを言う。

【0019】

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、グリア細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）または星状細胞の活性化を抑制する。

【0020】

本明細書で使われた用語、“活性化の抑制”は、グリア細胞または星状細胞の数、機能及び活性化の低下を引き起こす生体内の変形を意味し、例えば、これら細胞の特異的なマーカー（例えば、ＣＤ６８またはＧＦＡＰ）の発現が有意に減少するか、探知不可能になるか、または無意味なレベルで存在することを意味する。

【0021】

本発明の一具現例によれば、本発明で用いられるＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞は、全能性幹細胞から分化された神経ロゼットから分離される。

【0022】

本発明によれば、本発明で用いられるＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞は、全能性幹細胞から神経分化刺激を通じて分化された神経ロゼットで抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体を用いて分離される。

【0023】

本発明のさらに他の一態様によれば、本発明は、神経前駆細胞の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供する。

【0024】

本発明のさらに他の一態様によれば、本発明は、神経前駆細胞の分泌タンパク質を有効成分として含む組成物を、それを必要とする個体に投与する段階を含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療方法を提供する。

【0025】

本明細書で使われた用語、“神経前駆細胞の分泌タンパク質”は、神経前駆細胞の培養時に、神経前駆細胞から外部（培養培地）に分泌されたタンパク質の集合体を意味する。

【0026】

本発明の一具現例によれば、本発明の分泌タンパク質の製造に用いられる神経前駆細胞は、全能性幹細胞から分化されたものである。

【0027】

本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞は、全能性幹細胞（例えば、胚芽幹細胞または誘導万能幹細胞）を神経系列細胞に分化誘導して形成された神経ロゼット（ｎｅｕｒａｌ ｒｏｓｅｔｔｅ）段階の神経前駆細胞である。

【0028】

本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞である。

【0029】

本発明の他の一具現例によれば、前記神経前駆細胞は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陰性神経前駆細胞である。

【0030】

前記ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性あるいは陰性神経前駆細胞は、全能性幹細胞から神経分化刺激を通じて分化された神経ロゼットで抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体を用いて分離される。

【0031】

本発明の一具現例によれば、前記分泌タンパク質は、神経前駆細胞を動物細胞培養培地で培養して得た細胞培養液に含有された形態である。すなわち、本発明の組成物には、神経前駆細胞の分泌タンパク質が含有されている神経前駆細胞の培養液が含まれうるものである。

【0032】

本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞の細胞培養液は、神経前駆細胞をＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン）及びｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）が含有された無血清動物細胞培養培地で培養した後、細胞を除去して収得することができる。前記培養には、継代培養した神経前駆細胞、例えば、Ｎ２、Ｂ−２７及び／またはＧｅｍ２１が添加されたｂＦＧＦ−含有動物細胞培養培地で継代培養（例えば、４継代以上）して得た神経前駆細胞が用いられうる。

【0033】

前記培養培地での細胞の除去は、遠心分離、濾過のような通常の細胞分離方法を使って実施することができる。

【0034】

前記動物細胞培養培地としては、神経前駆細胞の培養時に用いられる通常の培地を制限なしに使い、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を使うことができる。

【0035】

本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞は、ヒト誘導万能幹細胞から分化されたものであり、この神経前駆細胞の分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含む：

【0036】

アグリン（Ａｇｒｉｎ）、アネキシンＡ５（Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ５）、ＢＳＧ（Ｂａｓｉｇｉｎ）、ビグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）、カルポニン−３（Ｃａｌｐｏｎｉｎ−３）、コアクトシン−類似タンパク質（Ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、コフィリン−１（Ｃｏｆｉｌｉｎ−１）、コラーゲンα−２、クリン−３（Ｃｕｌｌｉｎ−３）、デストリン（Ｄｅｓｔｒｉｎ）、ジストログリカン（Ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ）、エフリン−Ｂ２（Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２）、エクスポーチン−２（Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−２）、エズリン（Ｅｚｒｉｎ）、フィブロネクチン、ファイブリン−１（Ｆｉｂｕｌｉｎ−１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄタンパク質、ゼラチン−３結合タンパク質（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、グラニュリン（Ｇｒａｎｕｌｉｎｓ）、成長／分化因子１１（Ｇｒｏｗｈ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １１）、ハプトグロビン（Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ）、ヘモペキシン（Ｈｅｍｏｐｅｘｉｎ）、Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ２、ホルネリン（Ｈｏｒｎｅｒｉｎ）、インポーチン−９（Ｉｍｐｏｒｔｉｎ−９）、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｗｏｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、ループスＬａタンパク質（Ｌｕｐｕｓ Ｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ）、大食細胞移動抑制因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、ミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、モエシン（Ｍｏｅｓｉｎ）、ニューロピリン２（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ ２）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）、プロフィリン−１（Ｐｒｏｆｉｌｉｎ−１）、タンパク質ＤＪ−１（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤＪ−１）、ラディキシン（Ｒａｄｉｘｉｎ）、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セプチン−１１（Ｓｅｐｔｉｎ−１１）、タリン−１（Ｔａｌｉｎ−１）、テスティカン（Ｔｅｓｔｉｃａｎ）、チモポエチン（Ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ）、トランスゲリン−３（Ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ−３）、及びビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）。

【0037】

本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞は、ヒト胚芽幹細胞から分化されたものであり、この神経前駆細胞の分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含む：

【0038】

アグリン、アネキシンＡ２（Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２）、アトラクチン（Ａｔｔｒａｃｔｉｎ）、ビグリカン、セルロプラスミン（Ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ）、コフィリン−１、コラーゲンα−１、コロニン−１Ｘ（Ｃｏｒｏｎｉｎ−１Ｘ）、ダームシジン（Ｄｅｒｍｉｃｉｄｉｎ）、ＤＥＲＰ１２、エフリン−Ｂ３、エクソストシン−２（Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ−２）、エズリン、ゼラキン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ２、ホルネリン、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、ミッドカイン、モエシン、マルチプル上皮成長因子−類似ドメインタンパク質８（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ８）、ニドゲン−１（Ｎｉｄｏｇｅｎ−１）、パラチモシン（Ｐａｒａｔｈｙｍｏｓｉｎ）、プロフィリン−２（Ｐｒｏｆｉｌｉｎ−２）、タンパク質ＤＪ−１、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セクレトグラニン（Ｓｅｃｒｅｔｏｇｒａｎｉｎ）、タリン−１、チモシンβ４（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ ｂｅｔａ−４）、ＴＧＦＢＩ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｗｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｇ−ｈ３）、トランスゲリン（Ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ）、及びビメンチン。

【0039】

以下、前述した本発明の組成物及び治療方法に共通して適用される内容に関して記述する。

【0040】

本明細書で使われた用語、“幹細胞”は、組織を構成する各細胞に分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）される前の段階の未分化細胞を総称し、特定の分化刺激（環境）によって特定細胞に分化することができる能力を有している。幹細胞は、細胞分裂が止められた分化された細胞とは異なって、細胞分裂によって自身と同一の細胞を生産（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）し、分化刺激が加えられれば、特定細胞に分化され、このような分化は、他の環境または他の分化刺激によって多様な細胞にも分化されうる、分化の柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有していることが特徴である。

【0041】

本発明で用いられる幹細胞は、インビトロで無制限増殖され、３種のあらゆる胚芽層（外胚葉、中胚葉と内胚葉）から由来の多様な細胞に分化されうる全能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）である。より具体的に、前記全能性幹細胞は、胚芽幹細胞、ｉＰＳＣｓ（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、胚芽生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ）、または胚芽腫瘍細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）である。

【0042】

胚芽幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から由来され、胚芽生殖細胞は、５〜１０週齢の生殖隆起（ｇｏｎａｄａｌ ｒｉｄｇｅ）の原始生殖細胞から由来される。

【0043】

誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣｓ）は、非全分化能細胞（例えば、体細胞）から全能性を付与する特定の遺伝子を挿入して人工的に由来の全分化能幹細胞の１つである。誘導万能幹細胞は、幹細胞遺伝子及びタンパク質発現、染色体メチル化、倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）、胚芽体形成、テラトーマ形成、生存性キメラ形成、交雑性及び分化性を有する面で全分化能幹細胞（例えば、胚芽幹細胞）と同一であると見なされる。

【0044】

前記用語、“神経ロゼット”は、ヒト胚芽幹細胞の神経分化過程の初期段階の神経幹細胞を言い、神経ロゼットは、円柱型の放射状の形態を有する。前記神経ロゼットは、Ｐａｘ６及びＳｏｘ１のような初期神経外胚葉（ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）マーカーを発現する細胞で構成され、多様なニューロン細胞及び神経膠細胞に分化することができる。前記神経分化刺激は、当業者に通常実施される方法、例えば、無血清培地（Ｔｒｏｐｅｐｅ Ｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．３０：６５７８（２００１））、ＦＧＦｓ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）、Ｗｎｔ、及びＲＡ（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）のようなモルフォゲン（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｓ）の処理（Ｙｉｎｇ ＱＬ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１８３１８６（２００３））によって分化することができるが、これらに限定されるものではない。

【0045】

前記抗体としては、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使うことができる。ＰＳＡ−ＮＣＡＭに対する抗体は、当業者に通常実施される方法、例えば、融合方法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：５１１−５１９（１９７６））、組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６号）またはファージ抗体ライブラリー方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８，１−５９７（１９９１））によって製造可能である。抗体製造に対する一般的な過程は、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｚｏｌａ，Ｈ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８４；及びＣｏｌｉｇａｎ，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ，１９９１に詳細に記載されており、前記文献は、本明細書に参考として組み込まれる。例えば、単一クローン抗体を生産するハイブリードマ細胞の製造は、不死滅化細胞株を抗体生産リンパ球と融合させてなされ、この過程に必要な技術は、当業者によく知られており、容易に実施することができる。ポリクローナル抗体は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗原を適した動物に注射し、この動物から抗血清を収集した後、公知の親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）技術を用いて抗血清から抗体を分離して得られる。

【0046】

本明細書で、ＰＳＡ−ＮＣＡＭを言及しながら使われる用語“抗体”は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭに対する特異抗体であって、ＰＳＡ−ＮＣＡＭタンパク質に対して特異的に結合し、完全な抗体の形態だけではなく、抗体分子の抗原結合断片を含む。完全な抗体は、２本の全体長さの軽鎖及び２本の全体長さの重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されており、抗体分子の抗原結合断片とは、抗原結合機能を保有している断片であって、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖを含む。

【0047】

抗体を用いたＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞の分離のために、蛍光−活性細胞分類機（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒｓ：ＦＡＣＳ）、磁性活性細胞分類機（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ：ＭＡＣＳ）、及び補体媒介性溶解（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ）方法を利用できる。

【0048】

本明細書で使われた用語、“治療”は、（ａ）疾患、疾病または症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病または症状の軽減；または（ｃ）疾患、疾病または症状を除去することを意味する。本発明の組成物は、虚血性疾患または神経炎症疾患の症状の発展を抑制するか、それを除去または軽減させる役割を果たす。したがって、本発明の組成物は、それ自体で虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物にもなり、あるいは他の抗虚血／抗炎症組成物と共に投与されて、これら疾患に対する治療補助剤として適用されることもある。これにより、本明細書で、用語“治療”または“治療剤”は、“治療補助”または“治療補助剤”の意味を含む。

【0049】

本明細書で使われた用語、“虚血性疾患”は、血管損傷による血液漏水（ｂｌｏｏｄ ｌｅａｋａｇｅ）、塞栓（ｅｍｂｏｌｉｓｍ）または梗塞（ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）などによって血流量が減少して、血液供給が遮断された組織が壊死に至る疾患を言う。

【0050】

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物として治療可能な虚血性疾患は、虚血性心臓疾患、心筋梗塞、狭心症、下肢動脈虚血性疾患、四肢末端部虚血性疾患、及び虚血性脳血管疾患で構成された群から選択される。

【0051】

本明細書で使われた用語、“虚血性心臓疾患”は、心臓に血液を供給する冠状動脈が損傷されるか、狭小または閉塞されて、心臓筋肉への血流が減少して招かれる疾患を意味する。より具体的には、本発明の組成物として治療可能な虚血性心臓疾患は、狭心症、心筋梗塞症及び心不全症で構成された群から選択される。

【0052】

本明細書で使われた用語、“虚血性脳血管疾患”は、脳血管が損傷されるか、狭小または閉塞されて、これにより血流を供給されていない脳組織が損傷される疾患を意味する。より具体的には、前記虚血性脳血管疾患は、虚血性脳卒中である。

【0053】

本明細書で使われた用語、“神経炎症疾患”は、炎症反応による神経組織の損傷で招かれる疾患を意味する。

【0054】

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物として治療可能な神経炎症疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ルーゲーリック病、クロイツフェルトヤコブ病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、白質脳炎、側頭葉てんかん、及び炎症性脊髄損傷で構成された群から選択される。

【0055】

本明細書で使われた用語、“投与”または“投与する”は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接に投与することによって、対象体の体内で同量を形成させることを言う。したがって、用語“投与する”は、本発明の有効成分（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞または神経前駆細胞の分泌タンパク質）を病変部位に注入することを含むので、用語“投与する”は、“注入する”のような意味として使われる。

【0056】

組成物の“治療的有効量”は、組成物を投与しようとする個体に治療的または予防的の効果を提供するのに十分な抽出物の含量を意味し、これにより、“予防的有効量”を含む意味である。本明細書で使われた用語、“個体”は、制限なしにヒト、マウス、ラット、ギニーピッグ、犬、猫、馬、牛、豚、猿、チンパンジー、ヒヒまたは赤毛猿を含む。具体的には、本発明の個体は、ヒトである。

【0057】

本発明の組成物が、薬剤学的組成物として製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、または培地などを含むが、これらに限定されるものではない。

【0058】

本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。

【0059】

本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与し、具体的には、非経口投与、より具体的には、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）投与、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）投与、髄腔内（Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）投与、または血管内（ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ）投与である。

【0060】

本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。本発明の薬剤学的組成物の一般的な投与量は、成人基準に１日当たり１０^２〜１０^１０細胞である。

【0061】

本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤、または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。

【0062】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。

【実施例】

【0063】

実施例
実施例１．ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞の虚血性疾患と神経炎症疾患とに対する治療効果
実験方法
ヒトＭＳＣ及びヒトＥＳＣ−由来のＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}細胞の培養及び分化
ヒト細胞の使用は、医学研究倫理審議委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ、ＩＲＢ Ｎｏ．４−２００８−０６４３）の承認を受けた。ヒト骨髄は、事前同意書を提出した健康な成人志願者の後部腸骨稜線で収得した。要約すれば、骨髄單核細胞を密度勾配遠心分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて分離し、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）が補充されたＤＭＥＭにプレーティングした後、３７℃で５％ ＣＯ_２を含む加湿大気下で培養した。２４時間後に、非吸着細胞を洗浄し、除去した。培養液を毎３日ごとに置き換え、９０％のコンフルエンシ（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に到逹した時、細胞を０．０５％ トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて継代培養した。

【0064】

３−５継代の吸着ＭＳＣを本実験で使った。神経誘導のために、ｂＦＧＦがないｈＥＳＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でｈＥＳＣから由来の胚芽体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｉｅｓ、ＥＢｓ）を５μＭ ＤＭ（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び５〜１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む懸濁液で４日間培養し、以後、２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦが補充された１ｘＮ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地でマトリゲルコーティングされたディッシュ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に５日間吸着させた（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．ＰＬｏＳＯｎｅ，７，ｅ３９７１５）。吸着されたＥＢコロニーの中心に表われた神経ロゼットをｐｕｌｌｅｄガラスピペットを用いて周辺の平らな細胞から気をつけて分離した。小さなロゼット塊をマトリゲルコーティングされたディッシュにシーディングし、１ｘＮ２、１ｘＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養した（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｌｅｅｍ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｒｅｐｏｒｔｓ，６，２７０−２８１）。

【0065】

ＭＡＣＳによるＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性ＮＰＣの分離
８０〜９０％のコンフルエンシの拡張された神経ロゼットを１０μＭ Ｙ２７６３２（Ｓｉｇｍａ）に１時間露出させて、ＭＡＣＳ段階に入る前の細胞死が起こることを防止した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分離した後に、細胞（〜１ｘ１０^８ｃｅｌｌｓ）を１％ ＢＳＡが含まれたＰＢＳでブロッキングし、マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）が接合された抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体と共に４℃で１５分間培養した。集中的に洗浄した後、細胞懸濁液をＭＡＳＣ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）に入れ、カラムに残っている陽性−標職された細胞をチューブに溶離させた。分離されたＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}をＮ２Ｂ２７培地または２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦが追加されたＮＢＧ培地（１ｘＮ２、０．５ｘＢ２７及び０．５ｘＧ２１補充）（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＷｅｓｔＳａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）に４−５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で再びプレーティングした。培養培地は、毎日取り替え、細胞は、２〜３日ごとに継代培養した。

【0066】

脳卒中モデルの確立及びＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の定位注入（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）
２週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重約２５０〜３００ｇ）をＮ_２Ｏ対Ｏ_２の比率７０％〜３０％下で３％ イソフルラン（Ｈａｎａ Ｐｈａｒｍ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）で麻酔した。左側総頚動脈及び外頚動脈を分離し、４−０手術用縫合糸で連結した。ナイロン糸を左側内頚動脈に挿入してウィリス環まで移動させ（永久的中大脳動脈閉塞：ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ、ｐＭＣＡｏ）、ラットを犠牲させるまで糸を残しておいた。

【0067】

ｐＭＣＡｏ以後、２日後にＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}、ＭＳＣｓまたはＰＢＳの定位注入を行った。ラットをゾレチル（ＶｉｒｂａｃＳ．Ａ．，Ｆｒａｎｃｅ、２５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、定位外科手術ツール（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ）に位置させた。Ａ２６−ケージ針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｓｙｒｉｎｇｅ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）を左側線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）（ブレグマからの座標：前後側（ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）＋０．７ｍｍ、内外側（ｍｅｄｉｏｌａｔｅｒａｌ）−２ｍｍ及び背腹側（ｄｏｒｓｏｖｅｎｔｒａｌ）−５．５ｍｍ、髄膜（ｍｅｎｉｎｇｅｓ）から−２．５ｍｍ）に挿入した；５μｌのＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}、ＭＳＣｓ（それぞれ１ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／μｌ）またはＰＢＳを５．５ｍｍ及び−２．５ｍｍ部位に注入した。あらゆる細胞を持続的な撹拌を通じて細胞凝集を防ぎながら、左側線条体に１μｌ／ｍｉｎの速度で注入した。９匹の実験動物が、ｐＭＣＡｏ手術及び細胞移植途中で死亡した。

【0068】

あらゆる動物をＡＡＡＬＡＣ（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）が承認した施設で１２時間明暗サイクル下で育てた。動物実験は、医学研究倫理審議委員会（ＩＲＢ Ｎｏ．４−２０１１−００８７）の承認を受けた。

【0069】

行動検査
フットフォールト検査（Ｆｏｏｔ ｆａｕｌｔ ｔｅｓｔ）：フットフォールト検査は、２分間の試験の間に、等距離格子板（ｅｑｕｉ−ｄｉｓｔａｎｔ ｇｒｉｄ、６０ｘ６０ｃｍ、６ｃｍ距離）上で前足を正確に位置させる程度を測定する。前記試験は、従来の研究に基づいて変形された手続きによって行った［１２、１３］。

【0070】

非対称行動検査（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｔｅｓｔ）：従来に報告された変形されたＥＢＳＴ（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｂｏｄｙ ｓｗｉｎｇ ｔｅｓｔ）を用いた。ラットのしっぽを実験区域表面の１０ｃｍまで持ち上げた後、側面運動を検査した。右側または左側へのスイング（ｓｗｉｎｇ）頻度を１分間測定した。非対称点数値は、次のように計算した；０点−胴体をねじる、左側または右側にスイング、１点−＜３０°に非対称的にねじる、２点−＞３０°に非対称的にねじる。胴体をねじる方向によって、点数は、同側にねじる（同側ｔｗｉｓｔ、梗塞部位と同じ側）または反対側にねじる（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ ｔｗｉｓｔ、梗塞部位と反対側）で計算した。

【0071】

ビーム均衡検査（Ｂｅａｍ ｂａｌａｎｃｅ ｔｅｓｔ）：ビーム歩行器具は、ビーム（１００ｘ５ｘ２ｃｍ）で構成される。運動能力は、従来の研究で使われた６点単位で評価した；１点−ビーム上で安定した姿勢及び足で均衡を成す、２点−ビームの側面を握って搖れる動作を行う、３点−１つ以上の足が滑る、４点−均衡を取ろうとする試みをするが落ちる、５点−ビームにわたっているが落ちる、点６−均衡を取ろうとする試みなしに落ちる。

【0072】

捕捉可能牽引検査（Ｐｒｅｈｅｎｓｉｌｅ ｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）：検査のうち、捕捉可能如何は、ラットが前足で水平方向のロープにぶら下げることができる能力を通じて測定する。捕捉可能牽引検査は、ラットの筋肉強度を評価するために行われた。この検査は、従来に報告された方法で実施した。鉄棒（直径２ｃｍ、長さ１００ｃｍ）を水平にスポンジゴムパッド（厚さ７．５ｃｍ）の７０ｃｍ上に位置させた。ラットの前足を鉄棒に位置させた後、放した。ラットを５秒間鉄棒にぶら下げられるようにした。落ちるのにかかる時間と後足を鉄棒上に乗せるか否かを通じて、次のように点数を計算した；０点−ラットが５秒間ぶら下げられ、後足を乗せる、１点−ラットが５秒間ぶら下げられ、後足を乗せることができない；２点−ラットが３〜４秒間ぶら下げられる、３点−ラットが０〜２秒間ぶら下げられる。

【0073】

ｍＮＳＳ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）：神経障害点数は、運動、感覚及び反射神経の検査を複合して導出され、従来に報告された方法で実施した。客観的な定量化は、非対称行動検査、ビーム均衡検査、捕捉可能牽引検査、オープンフィールド検査（回転頻度）、及びフットフォールト検査に基づいてなされ、次のように点数を計算した；０点−欠陥がない、２点−反対側の前足を完全に伸ばすのに困難がある（３≦ｆｒｏｎｔ ｆｏｏｔ ｆａｕｌｔ＜１０）、４点−反対側の前足を伸ばすことができない（ｆｒｏｎｔ ｆｏｏｔ ｆａｕｌｔ≧１０）、６点−反対側に多少旋回する（１≦回転または非対称にねじれる＜５）、８点−激しく旋回する（回転または非対称にねじれる≧５）、１０点−反対側に落ちる（捕捉可能牽引≦２）。

【0074】

免疫組織化学的分析及び定量化
脳組織を２４時間４％ ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄した。パラフィン断面の製作のために、累進エタノールで組織を脱水させ、パラフィンに包埋させた。パラフィン包埋された脳をミクロトーム上で５ｍｍ厚さ層に切断し、キシレンで１０分間脱パラピン化した後、累進アルコールで再水和した。断面に１０ｍＭ クエン酸を１時間処理した後、ＰＢＳ及び０．５％ トリトンＸ−１００を含有する５％ ＢＳＡ溶液を添加した。以後、脳切片をＤＣＸ（Ａｂｃａｍ）、Ｔｕｊ１（Ｃｏｖａｎｃｅ）、ｈＮｕ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｃｌｏｎｅ ２３５−１）、ＧＦＡＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｋｉ６７（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ｈＭｉｔｏ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＭＡＰ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ヒトＮｅｓｔｉｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， ｃｌｏｎｅ １０Ｃ２）、またはＥＤ−１（Ａｂｃａｍ）（１：１００）に対する１次抗体と共に１０〜１２時間４℃で培養した。１次抗体と共に一晩中培養した後に、切片をＰＢＳで洗浄し、切片を蛍光標職された２次抗体である抗ラビットＩｇＧと３１時間培養した。切片をもう一度ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６’−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を用いてマウンティングした。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１）を用いて切片の蛍光イメージを得た。脳組織内で特定抗体と反応する神経細胞の数を正確に測定するために、ブラインドテストを用いた。実験に対してあらかじめ分からない３人の実験者にスライド内の５個の５０ｍｍ^２四角形内でのＥＤ−１^＋細胞及びα−ＳＭＡ^＋血管（直径５０ｍｍ以下）の数を数えるようにした。以後、調査者は、３人の実験者の結果を総合して検出されたニューロンの数を正確に決定した。

【0075】

移植後、２６日目に、ラット（グループ当たり１０匹）をゾレチル（Ｖｉｒｂａｃ Ｓ．Ａ．，Ｆｒａｎｃｅ、２５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、ＰＢＳ及びＰＢＳに含有された４％ パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．５）で灌流した。

【0076】

梗塞部位の測定のために、脳切片をヘマトキシリンで染色し、顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮影した。反対側半球の梗塞面積で同側半球の梗塞面積を差引いた間接的な損傷部位を計算した。相対的な梗塞面積をＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊプログラム（１．４７バージョン）で分析した。反対側半球と比較した間接的損傷の平均百分率を表示した１４。

【0077】

逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて総ＲＮＡを分離した。標準逆転写（ＲＴ）をＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてまず行った後、次のようなプライマーセットでＲＴ−ＰＣＲを行った：アンジオポエチン１正方向プライマー：ＴＧＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＴＧＣ（配列番号１）、逆方向プライマー：ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＡＴＡＧＧ（配列番号２）（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）。ＰＣＲ産物を１．２％ アガロースゲルに回した後、臭化エチジウムで染色してＵＶ光下でバンド（約４００ｂｐ）を検出した。最後に、検出されたバンドをＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊプログラム（バージョン１．４７）で定量化した。

【0078】

統計的分析
データは、平均±標準誤差で表わした。行動検査及び梗塞面積のデータは、ＳＰＳＳ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ Ｓｏｃｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、バージョン２０．０）を用いてＡＮＯＶＡ及び独立ｔ検定で分析した。Ｐ−ｖａｌｕｅｓ＜０．０５である場合、統計的有意性があると見なした。

【0079】

実験結果
ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の移植は、宿主脳の梗塞部位を減少させる。
本発明の全体的な実験設計は、図１ａに示した。神経組織の損傷程度は、移植２６日後、ヘマトキシリンを通じて正常に染色されていない脳部位（ａｒｅａ）を通じて評価した。梗塞部位は、大脳皮質及び線条体で主に表われた。梗塞部位は、ＭＳＣｓまたはＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}を移植した場合よりもＰＢＳを処理した虚血性脳で明確にさらに広かった（図１ｂ）。反対側に対する梗塞面積の百分率は、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}（７．１±２．５％）またはＭＳＣ（１４．９±１．９％）が移植された群でＰＢＳ群（２５．１±２．４％）に比べて、有意に減少した（Ｆ＝１３．６４、Ｐ＜０．０１）。ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−及びＭＳＣ−移植群間の梗塞が統計的に異ならないが、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植群の梗塞面積は、ＭＳＣ−移植群に比べて、明白にさらに狭かった（図１ｃ）。

【0080】

ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の移植は、ラット脳卒中モデルで行動能力を向上させる。
ラットの体重は、ｐＭＣＡｏ後、初日に測定した基底値に比べて、４０ｇが減少した。体重減少は、ＰＢＳ−処理ラットで７日後、頂点に至った。ＭＳＣ−移植群で、体重は、移植１７日後、基底段階まで回復された。しかし、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植群では、ＰＢＳ群と比較して、移植３日後から有意な体重回復が観察された（Ｐ＜０．０５）（図２ａ）。ｐＭＣＡｏ以後、３日（Ｐ＜０．０５）から１３日（Ｐ＜０．０１）の間までフットフォールト／ラインクロス頻度は、ＰＢＳ群に比べて、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}及びＭＳＣ移植群で有意に減少した（図２ｂ）。それだけではなく、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}移植群は、１３日目にフットフォールト／ラインクロスがＭＳＣ移植群と比べても、有意に減少した。しかし、このような差は、以後（移植後、１７及び２４日）体重増加による活動性の減少によって不十分に顕著になった。

【0081】

あらゆるラットが、ｐＭＣＡｏ前には、ＥＢＴＳで相対的に低い非対称性を示した一方、ｐＭＣＡｏ後には、あらゆる実験動物の非対称性が明確に観察された。移植３日後、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−及びＭＳＣ−移植群で同側ねじり行動を示し始めた。ＭＳＣ−移植群が、移植１３日後まで緩やかな向上を示した一方（Ｐ＜０．０５）、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植群の非対称行動点数は、移植後、７日目に有意に減少し始めて２４日目まで持続した（Ｐ＜０．０１）（図２ｃ）。

【0082】

ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}移植は、ＭＳＣ−移植群及びＰＢＳ群に比べて、３日から２４日の間のビーム均衡検査での機能回復も改善させた（Ｐ＜０．０１）（図２ｄ）。ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}移植は、運動調整能力を反映するビーム上で保持する時間を有意に増加させたが、ＭＳＣ−及びＰＢＳ−処理群では、統計的な差異点を示していない。

【0083】

前足の筋肉強度と負の相関関係を有する捕捉可能牽引点数は、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}移植群で３〜２４日の間に次第に減少した（Ｐ＜０．０１）（図２ｅ）。ＭＳＣ−移植群も、移植７〜２４日後に類似した改善パターンを示した。

【0084】

神経回復効果の定量化を標準化するために、本発明者らは、最後に非対称行動点数、ビーム均衡試験、捕捉可能牽引検査、オープンフィールド検査（回転頻度、データ未公開）、及びフットフォールト検査に基づいたｍＮＳＳ基準を評価した。ｍＮＳＳは、漸進的な神経機能回復がＰＢＳ−処理群に比べて、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−及びＭＳＣ−移植群で３日後から顕著に始めること示す（Ｐ＜０．０５）（図２ｆ）。それだけではなく、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植群は、７日以後から２４日までＭＳＣ−移植群に比べても、実質的な改善を示した（Ｐ＜０．０１）。ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植群の効果は、特に３日から７日の間に明確になったが、それを通じて移植初期強力な傍分泌効果があるということが分かる。

【0085】

移植されたＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}は、宿主脳で生存して神経系に分化する。
移植された細胞の密度を追跡するために、本発明者らは、２６日目にｈＮｕ（ヒト−特異的核）、Ｋｉ６７（増殖細胞マーカー）、ＤＣＸ（神経母細胞マーカー）、ネスチン（神経幹細胞マーカー）、及びＴｕｊ１（神経マーカー）に対する抗体を用いて組織学的分析を行った。ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の移植後に、ほとんどの細胞は、最初移植部位（例えば、線条体）で見つけられた。移植されたＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の生存、増殖及び分化は、損傷された脳でのＫｉ６７^＋、ＤＣＸ^＋、Ｔｕｊ１^＋、及びネスチン^＋の存在を通じて確認した（図３ａ及び図３ｂ）。移植されたＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}細胞の多数は、ＤＣＸまたはＴｕｊ１を発現した一方、一部は、ネスチンに対して陽性であった。移植された細胞の擬似分裂段階は、Ｋｉ６７−免疫反応性を通じて調査した。ｈＮｕ^＋細胞（９１８４個）の一部は、移植２６日目にＫｉ６７に対しても陽性であった（４３２個、４．７％）。ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}細胞でのＴｕｊ−１免疫反応性は、ＤＣＸ免疫反応性と広範囲に重畳された（図３ｂ）。これらＤＣＸ免疫反応性細胞は、ラット由来ではないヒト由来の細胞であり（図３ｃ）、それを通じて脳梗塞部位の減少は、移植された細胞の融合に部分的に起因することが分かる。

【0086】

多くの移植されたＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}細胞が優れた生存率を見せながら、損傷された組織に編入されたが、ｈＮｕを発現するＭＳＣは、移植２６日後にいくつかの細胞のみが検出された（図３ｄ）。ほとんどの移植されたＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}細胞は、未成熟神経細胞（例えば、ＤＣＸ陽性であり、一部Ｋｉ６７陽性細胞）である（図３ｂ）。一方、移植されたＭＳＣｓ（ｈＮｕ^＋細胞）は、損傷部位でＤＣＸ陽性を示せず、ほとんどのＭＳＣ移植群で少数の増殖中であるｈＮｕ⁻Ｋｉ６７^＋細胞が針管内及び周囲に存在した（図３ｄ）。

【0087】

ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}が移植されたラットでｈＭｉｔｏ^＋ＭＡＰ２^＋及びｈＮｕ^＋ＭＡＰ２^＋二重標識細胞が検出されたが（図４ａ及び図４ｂ）、ｈＭｉｔｏ^＋ＧＦＡＰ^＋（図４ｄ）またはｈＭｉｔｏ^＋ＧａｌＣ^＋（データ未公開）空染色細胞はほとんど検出されないことによって、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}細胞は、神経系に主に寄与する前駆細胞であることが分かった。反対側線条体でｈＭｉｔｏ^＋細胞は、ほとんど観察されていない（図４ｃ）。

【0088】

ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}の移植は、宿主脳で反応性グリア細胞の活性を抑制する。
いくつかのＧＦＡＰ（星状細胞マーカー）−陽性細胞が針と周辺で見つけられたが、ＧＦＡＰの発現は、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}移植群で目立つように低かった（図４ｅ）。事実、ＧＦＡＰ−陽性細胞の数は、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}移植群で大きく減少し（Ｐ＜０．００１）、ＭＳＣ−移植群では、その減少程度がより低かった（図４ｅ及び図４ｆ）。これは、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}移植が反応性星状細胞の活性化を強く抑制し、これにより、組織再生に有利な環境を造成することを示すものである（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｆ．，ＭｃＱｕｉｌｌｅｎ，Ｐ．，Ｍｕ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２９，３２１−３３０）。

【0089】

虚血性脳卒中は、組織損傷による微細グリア細胞の反対反応を誘導する。これにより、本発明者らは、移植２６日目にＣＤ６８（活性微細グリア細胞マーカー）を認識するＥＤ１抗体を用いて虚血脳組織での微細グリア細胞の活性化を調査した（図４ｅ）。注目すべきことは、ＥＤ１−陽性細胞が、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}群で有意に減少し（Ｐ＜０．００１）、ＭＳＣ−移植群は、より不十分に減少したということである（Ｐ＜０．０５）（図４ｆ）。たとえ、線条体内のＮｕ＋細胞が６ヶ月後に検出されたが、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}が移植された脳の移植部位または他の部位でテラトーマの跡は全くなかった。

【0090】

ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}移植は、宿主脳での血管新生を促進する。
平滑筋アクチンマーカーであるα−ＳＭＡの抗体を用いて虚血性脳での内生的血管新生を調査した。その結果、ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植ラットでＭＳＣ−及びＰＢＳ−処理群に比べて、α−ＳＭＡ反応性血管の数が移植部位周辺で増加したことを観察した（図５ａ、図５ｂ）。微小血管の定量的分析を通じてＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植ラットのα−ＳＭＡ＋血管がＭＳＣ−及びＰＢＳ−処理群のそれに比べて、梗塞部位で増加したことを明確に確認した（図５ｃ）。

【0091】

移植後、７日及び２６日にＲＴ−ＰＣＲを用いて脳組織での血管新生誘発因子であるアンジオポエチン−１の発現レベルを調査した結果、２６日目のＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}移植ラットでの発現レベルは、他の群に比べて有意に高く（Ｐ＜０．０５）（図５ｄ）、それを通じて長期間生存したＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}によって血管新生が誘導されたということが分かった。ＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}−移植されたラットは、２６日目に７日目よりも増加したアンジオポエチン−１パターンを示した一方、ＭＳＣｓ−処理ラットのアンジオポエチン−１は、７日目のそれと比較して変化がないか、少し減少した。しかし、ＭＳＣｓ−処理ラットは、７日目のＰＢＳ−処理群に比べて増加したパターンを示した（Ｐ＜０．０５）。

【0092】

実施例２．神経前駆細胞分泌タンパク質の虚血性疾患と神経炎症疾患とに対する治療効果
実験材料及び実験方法
ヒトＥＳＣ−由来のＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}細胞の収得
ヒト細胞の使用は、医学研究倫理審議委員会（ＩＲＢ Ｎｏ．４−２００８−０６４３）の承認を受けた。神経誘導のために、ｂＦＧＦがないｈＥＳＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でｈＥＳＣとｉＰＳＣとから由来の各胚芽体（ＥＢｓ）を５μＭ ＤＭ（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び５〜１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む懸濁液で４日間培養し、以後、２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦが補充された１ｘＮ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地でマトリゲルコーティングされたディッシュ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に５日間吸着させた（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳＣ ａｎｄ ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｒｏｓｅｔｔｅｓ．ＰＬｏＳＯｎｅ，７，ｅ３９７１５）。吸着されたＥＢコロニーの中心に表われた神経ロゼットをガラスピペットを用いて周辺の平らな細胞から気をつけて分離した。小さなロゼット塊をマトリゲルコーティングされたディッシュにシーディングし、１ｘＮ２、１ｘＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養した（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｌｅｅｍ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｒｏｂｕｓｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳ ａｎｄ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇａｒｄｌｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｉｎｎａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｒｅｐｏｒｔｓ，６，２７０−２８１）。

【0093】

８０〜９０％のコンフルエンシの拡張された神経ロゼットを１０μＭ Ｙ２７６３２（Ｓｉｇｍａ）に１時間露出させて、ＭＡＣＳ段階に入る前の細胞死が起こることを防止した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分離した後に、細胞（〜１ｘ１０８細胞）を１％ ＢＳＡが含まれたＰＢＳでブロッキングし、マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）が接合された抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体と共に４℃で１５分間培養した。集中的に洗浄した後、細胞懸濁液をＭＡＳＣ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）に入れ、カラムに残っている陽性−標職された細胞をチューブに溶離させた。分離されたＮＰＣ^{ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋}をＮ２Ｂ２７培地または２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦが追加されたＮＢＧ培地（１ｘＮ２、０．５ｘＢ２７及び０．５ｘＧ２１補充）（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＷｅｓｔＳａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）に４−５ｘ１０^５細胞／ｃｍ^２の濃度で再びプレーティングした。培養培地は、毎日取り替え、細胞は、２〜３日ごとに継代培養した。

【0094】

ヒト全分化能幹細胞由来−神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）で分泌タンパク質の分離
前記で収得したヒト万能幹細胞由来の神経前駆細胞（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−陽性神経前駆細胞）を基本培養液（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）にＮ２（１００Ｘ−最終濃度１Ｘ）、Ｂ−２７（５０Ｘ−最終濃度０．５Ｘ）及びＧｅｍ２１（５０Ｘ−最終濃度０．５Ｘ）の血清除去補充剤を入れ、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加してマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）コーティングされた６０ｍｍディッシュに４継代以上繰り返し培養して増幅した後、８〜１０個のディッシュに約９０％まで細胞が満ちるように培養した。培養液を除去した後、リン酸緩衝溶液で３回洗浄し、無血清基本培養液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）にＩＴＳ（１００Ｘ−最終濃度１Ｘ）とｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）のみを添加して２４時間培養した。対照群は、細胞がないディッシュに同量の同じ組成の培養液（基本培養液にＩＴＳとｂＦＧＦとを同量で添加）を入れ、培養器で２４時間培養した後、回収したものを対照群として使った。培養液をいずれも集めて遠心分離して（８００ｇで３０分）細胞の破片などを除去した後、−７０℃の冷凍庫に直ちに氷らせた後、必要時に解凍して使った。

【0095】

脳卒中モデルの製作
局所脳虚血による神経細胞の損傷に対して神経細胞の保護効果を測定するために応用された血管内縫合糸挿入法（ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ ｓｕｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ）を使った。Ｚｉａ Ｌｏｎｇａ（Ｚｅａ Ｌｏｎｇａ，ｅｔ ａｌ，Ｓｔｒｏｋｅ．，１９８９，２０，８４−９１）が開発した方法である局所脳虚血モデルであって、他のモデルとは異なって、臨床的に類似しているという長所がある。このような理由で虚血再灌流（ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）に対する機転研究やさまざまな薬物の効果をスクリーニングするのに適したモデルである。

【0096】

一週間の順化後、呼吸麻酔器を使って実験動物（雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ、体重２５０〜３００ｇ）を麻酔させ、麻酔剤としてイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を使った。まず、白ラットを８０％ Ｎ_２Ｏと２０％ Ｏ_２とが混ぜられた混合ガスに５％のイソフルランで全身麻酔を誘導した後、２〜２．５％で麻酔を保持した。脳卒中モデルの製作のために、白ラットの左側首の皮膚を切開した後、内側に総頚動脈（ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ）、外頚動脈（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ）及び内頚動脈（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ）を剥離して導出した後、それぞれの血管をブラックシルク糸で少し縛って血流を遮断した。総頚動脈を半分程度切断し、切断面を通じてナイロン縫合糸の端部を焼灼してラウンディングして、０．４０ｍｍになるように製作した２５ｍｍの４−０ナイロンプローブ（ｐｒｏｂｅ）を挿入した。外頚動脈を通じて挿入したナイロンプローブを内頚動脈を経て中大脳動脈部位に入れて固定して、総頚動脈盆地で約１８〜２０ｍｍ程度挿入した後、中大脳動脈の起始部を塞いだ後、糸で固定して中大脳動脈を永久に閉鎖した後、皮膚切開部位を再び縫合した後、麻酔から自然回復させた。

【0097】

脳卒中モデルに脳動脈を通じる分泌タンパク質の注入及び行動実験
脳卒中誘発一日後に、行動実験に対する基準点（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を確立した後、脳卒中モデルの製作と同じ方式で右側外頚動脈を通じて内頚動脈部位にインスリン注射器針を挿入した後、それを通じて分泌タンパク質を０．２ｍｇ／ｋｇ（体積５０μｌ）ほど動脈注射し、対照群には同じ体積の培養液あるいはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を投与した。分泌タンパク質液を注入した後、１４日間動物の状態を観察し、注入前１回、注入後４回にわたって体重を測定し、行動分析を実施した。

【0098】

（１）上体姿勢（ｔｏｒｓｏ ｔｗｉｓｔｉｎｇ）検査：実験動物の大脳皮質と線条体感覚と見なされる上体姿勢を試験するために、非対称運動行動を測定した。

【0099】

（２）ビーム均衡（ｂｅａｍ ｂａｌａｎｃｅ）検査：実験動物が狭いビーム上で安定して均衡を取ることを通じて総前庭運動機能（ｇｒｏｓｓ ｖｅｓｔｉｂｕｌｏｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を評価した。

【0100】

（３）フットフォールト検査：運動において、運動動き（ｍｏｔｏｒ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）の調整（協同）と統合（総合）とを検査する時に使う実験方法であって、フットフォールト（Ｆｏｏｔ−ｆａｕｌｔ）は、動物が前足や後足を元の場所に置かないか（ｍｉｓｐｌａｃｅ）、足が格子板バー（ｇｒｉｄ ｂａｒ）の間に落ちる場合と定義し、フットフォールトは、正常な動物においては特に対称的である。

【0101】

（４）捕捉可能牽引検査：検査のうち、捕捉可能如何は、実験動物が前足で水平方向のロープにぶら下げることができる能力を通じて測定した。捕捉可能牽引検査は、実験動物の筋肉強度を評価するために行われた。この検査は、従来に報告された方法で実施した。鉄棒（直径２ｃｍ、長さ１００ｃｍ）を水平にスポンジゴムパッド（厚さ７．５ｃｍ）の７０ｃｍ上に位置させた。実験動物の前足を鉄棒に位置させた後、放した。実験動物を５秒間鉄棒にぶら下げられるようにした。落ちるのにかかる時間と後足を鉄棒上に乗せるか否かを通じて、次のように点数を計算した：０点−実験動物が５秒間ぶら下げられ、後足を乗せる、１点−実験動物が５秒間ぶら下げられ、後足を乗せることができない、２点−実験動物が３〜４秒間ぶら下げられる、３点−実験動物が０〜２秒間ぶら下げられる。

【0102】

（５）オープンフィールド検査（ｏｐｅｎ−ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔ）：一般的な歩行活動レベルを調べるのに使われる検査であって、動物の行動態様と特性とを直接観察して動物の活動性、情緒性及び行動パターンなどを測定した。

【0103】

（６）ｍＮＳＳ：前記の多様な検査を通じて得られた運動、感覚、均衡、反応及び情緒の検査値の総合成績で、点数を下記の基準によって計算した（一個体当たり点数を合算してｍＮＳＳを測定）。

【0104】

−オープンフィールド検査（動物の情緒性、活動性、行動パターンなどを測定）
動きない：３
１〜２０回：２
２１〜３０回：１
３０回以上：０

【0105】

−捕捉可能牽引検査（筋力測定）
０〜５秒：３
６〜１０秒：２
１１〜２０秒：１
２１秒以上：０

【0106】

−ビーム均衡検査（均衡感覚測定）
０点：１＝安定的姿勢
２＝ビームの側面を握って多少搖れる程度
１点：３＝１本以上の足がビームから脱落する場合
４＝均衡を取ろうと努力するが、落ちる場合
２点：５＝均衡を取ることができず、ビームに逆にぶら下げられてから落ちる場合
６＝ビーム上で全く均衡を取ることができず、落ちる場合

【0107】

−フットフォールト検査（運動協応能力）
０〜５回：０
６〜１０秒：１
１１〜２０秒：２
２１秒以上：３

【0108】

−上体姿勢検査（非対称運動行動）
０回：２
１〜４回：１
５回以上：０

【0109】

脳虚血誘発１４日後に、白ラットをゾレチルで麻酔した後、開胸した後、右心耳を切開して針を左心室に注入した後、ポンプを用いてリン酸緩衝溶液を心臓に灌流させて血液を除去した後、脳組織を摘出した。標本製作のための組織切片をブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）を基準にパラフィンに包埋し、損傷された脳組織を確認するために、脳組織切片をヘマトキシリンに染色し、脱水し、固定し、スライドをデジタルカメラで撮影した後、コンピュータに移した。イメージ分析プログラム（ｉｍａｇｅ Ｊ）を使って脳梗塞の比率（％）を下記の数式１で計算した。
脳梗塞の比率（％）＝（正常左半球の面積−脳梗塞部位の正常組織の面積）／正常左半球の面積×１００ ・・・ 数式１

【0110】

分泌タンパク質の分析（Ｓｅｃｒｅｔｏｍｉｃｓ）
ｈＥＳＣ由来の神経前駆細胞の分泌タンパク質とヒトｉＰＳＣ由来の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、それぞれ４〜１２％の勾配ノベックスビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥして分離した後、ゲルコードブルー染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）でタンパク質バンドが見えるようにゲルを染色した。該染色されたゲルは、同じサイズの１０バンドで切って、リン−ゲルトリプシン分解を公知の方法で行った。

【0111】

リン−ゲル分解によって製造されたペプチドをＮａｎｏ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ液体クロマトグラフィー（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と結合したＬｉｎｅａｒＴｒａｐ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ（ＬＴＱ）質量分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ）とを使って分析した。具体的に、トリプシン処理したペプチドをＣ１８レギュラー５マイクロンサイズレジンがパッキングされた分析カラム（７５μｍｘ１１ｃｍ）に適用した。９７％ 溶液Ａ（蒸留水に０．１％ ギ酸）から６０％ 溶液Ｂ（アセトニトリルに０．１％ ギ酸）に流速０．３μｌ／時間の条件で分線型４５分勾配を実施した。分離されたペプチドイオンをナノＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）ソースで電気噴霧した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、全体ＭＳスキャンを断片で選別して最も多い５種のスペクトルを結果−依存スキャンで求めた。動的排除に対する繰り返し係数を１に、繰り返し期間を３０秒に、動的排除期間を１８０秒に、排除質量幅を１．５Ｄａに、動作排除リストを５０に設定した。

【0112】

ペプチド及びタンパク質の確認は、ｉｐｉ．ＨＵＭＡＮ ｖ３．７６データベース（８９ ３７８エントリー）でターボ−ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ）を使って検索した。データベース検索後、スカーフフォルド２（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて確認されたペプチド及びタンパク質を確認した。ＳＥＱＵＥＳＴ検索で得たペプチドのうち、０．９５以上のペプチドプロフェット（ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔ）蓋然性を有する１セットのペプチドを選別した。また、０．９９以上のプロテインプロフェット（ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｐｈｅｔ）蓋然性及び２個以上の固有ペプチドを有するタンパク質リストを求めた。

【0113】

統計分析
グループ間の統計学的有意度は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎが適用されたｏｎｅ−ｗａｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）を用いて求め、ｐ ｖａｌｕｅ＜０．０５を統計学的に有意なものと判定した。

【0114】

実験結果
脳卒中モデルで神経前駆細胞の分泌タンパク質による疾患の改善を見るために、次の３個の群で２週間実験を行った。脳卒中誘発２４時間後、行動実験で疾患の誘導が確認された白ラットを３個群に任意に割り当てた後、右側外頚動脈に分泌タンパク質（０．２ｍｇ／ｋｇ、体積５０μｌ）、培地またはＰＢＳを同量（５０μｌ）で注射した。各物質を注入した後、３、７、１０及び１４日に動物の状態と体重とを確認し、行動分析を実施した。

【0115】

【表1】

【0116】

虚血病変部位の分析結果
白ラットで永久ＭＣＡＯを通じる脳卒中の誘導は、幅広い脳病変の損傷を誘導した。脳卒中誘発１４日経過後、脳を摘出した後、ＴＴＣ（２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）染色で脳の損傷有無と損傷部位とを確認した。ＴＴＣ染色は、細胞内の正常ミトコンドリア酸化酵素システム（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ）と反応して染色されるが、脳虚血損傷を受けてミトコンドリアが損傷されれば、酸化システムが撹乱されて染色にならず、白色を表わすので、脳の損傷部位を区別することができる。

【0117】

図７に示されたように、中脳動脈結紮によって誘発された損傷は、主に右側脳の皮質部位と線条体部位とに発生した（図７）。また、神経前駆細胞の分泌タンパク質の注入が虚血性病変部位（ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ）を減少させた。ＰＢＳ対照群は、右脳の６０％近く損傷され、培地対照群は、４６％程度が損傷されたが、分泌タンパク質処理群は、損傷部位が２９％程度で対照群に比べて損傷部位が著しく減少した。

【0118】

体重分析の結果
脳卒中誘発が白ラットの運動能力を減少させて、直ちに体重の減少が７日まで進行し、多様な治療剤は、運動能力の回復を通じて体重の増加を誘導する。分泌タンパク質の注入も、細胞移植と類似に体重増加を誘導した（図８）。神経損傷の回復で最も目立つ現象は、体重の回復である。分泌タンパク質処理群は、ＰＢＳ対照群に比べて有意な改善を示した。

【0119】

行動分析の結果
分泌タンパク質処理群は、ビーム均衡検査で２つの対照群に比べて、統計的に有意な行動改善効果を示し、この効果は、治療３日目から表われるなど即刻な効果が表われた（図９ａ）。

【0120】

また、捕捉可能牽引検査（ｐｒｅｈｅｎｓｉｌｅ ｔｒａｃｔｉｏｎ）でも、治療（注入）７日目に２つの対照群に比べて、統計的に有意な効果を示した（図９ｂ）。

【0121】

さらに、分泌タンパク質の注入は、網での失足（ｆｏｏｔ ｆａｕｌｔ）頻度を減少させる効果を示した（図９ｃ）。単位時間当たり行動の活発さを測定するラインクロスも、改善される趨勢を示した（図９ｄ）。

【0122】

総合的な行動神経改善効果（ｍＮＳＳ）の分析結果
ｍＮＳＳ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ ｔｅｓｔ）は、神経学的機能を測定するための構成表である。運動（筋肉状態）とｍｅｎｓｏｒｙ（時刻、触覚及び自己収容（ｐｒｏｐｒｉｏｃｅｐｔｉｖｅ））の項目で評価した。正常は、０点であり、点数が高いほど機能異常の程度が激しいと判断する。図１０に示されたように、ｍＮＳＳの分析で分泌タンパク質処理群は、治療序盤からＰＢＳ対照群と培地対照群よりも遥かに高い治療効果（行動改善）を示した（図１０）。

【0123】

ｍＮＳＳ検査でＰＢＳ対照群は、脳虚血を誘発させた１日後、平均５．４点で、１４日後、平均５．５点で、脳卒中による神経行動学的障害が保持されることが見られた。培地対照群の場合には、一時的な行動改善効果が治療３日に見えたが、追加的な改善効果は発揮することができなかった。一方、分泌タンパク質処理群の場合には、治療３日（ｍＮＳＳ ４．５点）から１０日（ｍＮＳＳ ３点）まで持続的な行動改善効果を示した。

【0124】

分泌タンパク質の分析結果
ｉＰＳＣｓ由来の神経前駆細胞から得た分泌タンパク質は、次のタンパク質を含んでいた：アグリン、アネキシンＡ５、ＢＳＧ、ビグリカン、カルポニン−３、コアクトシン−類似タンパク質、コフィリン−１、コラーゲンα−２、クリン−３、デストリン、ジストログリカン、エフリン−Ｂ２、エクスポーチン−２、エズリン、フィブロネクチン、ファイブリン−１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄタンパク質、ゼラチン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ２、ホルネリン、インポーチン−９、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、大食細胞移動抑制因子、ミッドカイン、モエシン、ニューロピリン２、プレイオトロフィン、プロフィリン−１、タンパク質ＤＪ−１、ラディキシン、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セプチン−１１、タリン−１、テスティカン、チモポエチン、トランスゲリン−３、ビメンチン。

【0125】

ヒト胚芽幹細胞の神経前駆細胞から得た分泌タンパク質は、次のタンパク質を含んでいた：アグリン、アネキシンＡ２、アトラクチン、ビグリカン、セルロプラスミン、コフィリン−１、コラーゲンα−１、コロニン−１Ｘ、ダームシジン、ＤＥＲＰ１２、エフリン−Ｂ３、エクソストシン−２、エズリン、ゼラキン−３結合タンパク質、グラニュリン、成長／分化因子１１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ２、ホルネリン、インスリン−類似成長因子結合タンパク質２、ループスＬａタンパク質、ミッドカイン、モエシン、マルチプル上皮成長因子−類似ドメインタンパク質８、ニドゲン−１、パラチモシン、プロフィリン−２、タンパク質ＤＪ−１、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−２、セクレトグラニン、タリン−１、チモシンβ４、ＴＧＦＢＩ、トランスゲリン、ビメンチン。

【0126】

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図2f】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図4e】

【図4f】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図9d】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]