特許 6403668 抗ミオシン調節軽鎖ポリペプチド抗体を含む炎症疾患治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6403668

(24)【登録日】2018年9月21日

(45)【発行日】2018年10月10日

(54)【発明の名称】抗ミオシン調節軽鎖ポリペプチド抗体を含む炎症疾患治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20181001BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20181001BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20181001BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20181001BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20181001BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20181001BHJP

   G01N 33/566 20060101ALI20181001BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20181001BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 DZNA

   A61K39/395 N

   A61P29/00

   A61P11/00

   A61P37/08

   G01N33/15 Z

   G01N33/50 Z

   G01N33/566

   !C07K16/18

【請求項の数】6

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2015-519959(P2015-519959)

(86)(22)【出願日】2014年5月30日

(86)【国際出願番号】JP2014064399

(87)【国際公開番号】WO2014192915

(87)【国際公開日】20141204

【審査請求日】2017年5月15日

(31)【優先権主張番号】特願2013-114388(P2013-114388)

(32)【優先日】2013年5月30日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】304021831

【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100152319

【弁理士】

【氏名又は名称】曽我 亜紀

(72)【発明者】

【氏名】中山 俊憲

(72)【発明者】

【氏名】細川 裕之

(72)【発明者】

【氏名】常世田 好司

(72)【発明者】

【氏名】林崎 浩史

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 茜

【審査官】 六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／１０５０５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５０８８１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 脳２１，２０００年，3(4)，p.453-456

【文献】 Nat. Immunol.，２００８年，9(8)，p.880-886

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＷＰＩ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ミオシン調節軽鎖ポリペプチド（以下、Ｍｙｌと略称する）を特異的に認識する抗体であって、ＭｙｌとＣＤ６９との結合を阻害する抗体を含み、Ｍｙｌが、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂからなる群より選ばれるいずれか１である、炎症疾患の治療用組成物。

【請求項2】

前記抗体が、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂの部分アミノ酸配列であって、配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなる部分アミノ酸配列を特異的に認識する抗体である、請求項１に記載の炎症疾患の治療用組成物。

【請求項3】

炎症疾患が気道炎症疾患である、請求項１または請求項２に記載の炎症疾患の治療用組成物。

【請求項4】

炎症疾患がアレルギー性気道炎症疾患である、請求項１または請求項２に記載の炎症疾患の治療用組成物。

【請求項5】

被検化合物の存在下で、ＭｙｌとＣＤ６９とを共存させ、次いで、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用を測定し、該作用の低下または消失が検出されたとき、被検化合物がＭｙｌとＣＤ６９との結合を阻害すると決定することを含み、Ｍｙｌが、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂからなる群より選ばれるいずれか１である、ＭｙｌとＣＤ６９との結合を阻害する化合物の同定方法。

【請求項6】

ＭｙｌとＣＤ６９との結合を阻害する化合物を選別することを特徴とし、Ｍｙｌが、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂからなる群より選ばれるいずれか１である、炎症疾患の治療用組成物の有効成分となる候補化合物の同定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ミオシン調節軽鎖ポリペプチド抗体（以下、ミオシン調節軽鎖ポリペプチドを、Ｍｙｌと略称する）であって、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する抗体を含む炎症疾患治療用組成物に関する。具体的には、抗Ｍｙｌ９抗体であってＭｙｌ９とＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する抗体、または抗Ｍｙｌ１２抗体であってＭｙｌ１２とＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する抗体を含む、気道炎症疾患などの炎症疾患の治療用組成物に関する。また本発明は、上記抗体を、炎症疾患を有すると診断されている対象に、炎症疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む炎症疾患治療方法に関する。さらに本発明は、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する炎症疾患治療用候補化合物の同定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ミオシン調節軽鎖は、マルチサブユニットタンパク質産物であるミオシンを構成するサブユニットの１つである。ミオシンは、２本の重鎖、２本の調節軽鎖、および２本の必須軽鎖から構成された六量体であり、アデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略称する）を加水分解し、得られるエネルギーを用いてアクチンフィラメントを動かすモータータンパク質であることが知られている。ミオシン軽鎖はいずれもカルモジュリンスーパーファミリーの一員であり、ミオシン調節軽鎖としてＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａおよびＭｙｌ１２ｂが知られており、またミオシン必須軽鎖としてＭｙｌ６が知られている。

【0003】

ＣＤ６９は、Ｃタイプレクチンファミリーに属するＩＩ型の膜貫通型タンパク質である。ＣＤ６９は、Ｔ細胞やＢ細胞を刺激すると数時間以内に発現が上昇するため、早期活性化マーカー分子としてリンパ球の活性化の指標として広く用いられている（非特許文献１）。また、胸腺内で分化途中の選択を受けているＴ細胞にも発現が認められている（非特許文献２、３）。さらに、骨髄に維持されている記憶（Ｍｅｍｏｒｙ）ＣＤ４ Ｔ細胞にもＣＤ６９が発現しており、活性化ＣＤ４ Ｔ細胞の骨髄への移行およびそれに続く記憶ＣＤ４ Ｔ細胞の維持にもＣＤ６９が重要であることが報告されている（非特許文献４）。ＣＤ６９には、コレセプターとして抗原受容体からのシグナル伝達を増強する機能が推測されているが、詳細は不明である。そのリガンドもこれまでのところ同定されていない。血小板には恒常的に発現しており、活性化した好中球や好酸球などにも発現がみられることから、血小板の機能発現や局所の炎症反応における役割が推測されている。また、関節炎の発症において好中球上のＣＤ６９が重要な役割を果たしていることが明らかになっている（非特許文献５）。さらに、ＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ６９がアレルギー性気道炎症を制御しており、ＣＤ６９に対する抗体はアレルギー性気道炎症を抑制することが報告されている（非特許文献６）。また、ＣＤ６９欠損マウスにおいて、タバコの煙により誘発されるＣＯＰＤやブレオマイシンにより誘導される肺の繊維化が減弱することが報告されている（非特許文献７、８）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Testi, R. et al. The CD69 receptor: a multipurpose cll-surface trigger for hematopoietic cells. Immunol. Today 15: 479-483, 1994

【非特許文献2】Yamashita, I. et al. CD69 cell surface expression identifies developing thymocytes which audition for T cell antigen recetor-mediated positive selection. Int. Immunol. 5: 1139-1150, 1993

【非特許文献3】Nakayama, T et al. The generation of mature, single-positive thymocytes in vivo is dysregulated by CD69 blockade or overexpression. J. Immunol. 168: 87-94, 2002

【非特許文献4】Shinoda, K. et al.:Thype II membrane protein CD69 regulates the formation of resting T-helper memory. Proc. Natl. Acad. Sci. 109; 7409-7414, 2012

【非特許文献5】Murata, K. et al.: CD69-null mice protected from arthritis induced with anti-type II collagen antibodies. Int. Immunol. 15: 987-992, 2003

【非特許文献6】Miki-Hosokawa, T. et al.: CD69 controls the pathogenesis of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183; 8203-8215, 2009

【非特許文献7】Yamauchi, K. et al. Attenuation of lung inflammation and fibrosis in CD69-deficient mice after intratracheal bleomycin. Respir Res. 12; 131, 2011

【非特許文献8】Tsuyusaki, J. et al. Cigarette smoke-induced pulmonary inflammation is attenuated in CD69-dificient mice. J. Recept Signal Transduct Res. 31; 434-439, 2011

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ＣＤ６９の炎症反応への関与を示す多数の報告があることから、ＣＤ６９の機能を阻害することにより、炎症反応の抑制が可能であり、ひいては炎症疾患の予防または治療が可能になると考えられる。一方、ＣＤ６９を標的としたアレルギー性炎症の治療法は、ＣＤ６９を発現する多様な細胞に影響を及ぼす恐れがあり、副作用を考慮する必要がある。

【0006】

本発明の課題は、ＣＤ６９の機能を阻害する手段を提供し、さらにそれにより炎症反応を抑制することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは上記課題を達成すべく鋭意研究を行い、ＣＤ６９に作用するタンパク質としてＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａおよびＭｙｌ１２ｂを見出した。そして、抗Ｔ細胞受容体抗体による刺激で活性化してＣＤ６９を発現させたＣＤ４ Ｔ細胞をマウスに尾静脈より移入すると、当該活性化ＣＤ４ Ｔ細胞胞が骨髄に移行したこと、および当該活性化ＣＤ４ Ｔ細胞の骨髄への移行がＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａおよびＭｙｌ１２ｂをいずれも認識する抗体（以下、抗Ｍｙｌ９／１２抗体と称することがある）の予備投与により阻害されたことを明らかにした。さらに、気道炎症を誘発したマウスにおいて、抗Ｍｙｌ９／１２抗体を投与することにより、コントロール抗体を投与したものと比較して、肺胞洗浄液中の好酸球数が減少し、また、メサコリン誘導性の気道抵抗の上昇が抑制されたことを明らかにした。本発明はこれら知見を基に完成されたものである。

【0008】

すなわち、本発明は、ミオシン調節軽鎖ポリペプチド（以下、Ｍｙｌと略称する）を特異的に認識する抗体であって、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する抗体を含む、炎症疾患の治療用組成物に関する。

【0009】

本発明はまた、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用が、ＭｙｌとＣＤ６９との結合である、前記治療用組成物に関する。

【0010】

本発明はさらに、Ｍｙｌが、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂからなる群より選ばれるいずれか１以上である、前記いずれかの治療用組成物に関する。

【0011】

本発明はさらにまた、前記抗体が、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂの部分アミノ酸配列であって、配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなる部分アミノ酸配列を特異的に認識する抗体である、前記いずれかの治療用組成物治療用組成物に関する。

【0012】

本発明はまた、前炎症疾患が気道炎症疾患である、前記いずれかの治療用組成物に関する。

【0013】

本発明はさらに、炎症疾患がアレルギー性気道炎症疾患である、前記いずれかの治療用組成物に関する。

【0014】

本発明はさらにまた、被検化合物の存在下で、ＭｙｌとＣＤ６９とを共存させ、次いで、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用を測定し、該作用の低下または消失が検出されたとき、被検化合物がＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害すると決定することを含む、ＭｙｌとＣＤ６９と共存下での作用の効果を阻害する化合物の同定方法に関する。

【0015】

本発明はまた、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用が、ＭｙｌとＣＤ６９との結合である、前記化合物の同定方法に関する。

【0016】

本発明はさらに、Ｍｙｌが、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂからなる群より選ばれるいずれか１である、前記いずれかの化合物の同定方法に関する。

【0017】

本発明はさらにまた、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する化合物を選別することを特徴とする、炎症疾患の治療用組成物の有効成分となる候補化合物の同定方法に関する。

【0018】

本発明はまた、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用が、ＭｙｌとＣＤ６９との結合である、前記候補化合物の同定方法に関する。

【0019】

本発明はさらに、Ｍｙｌが、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂからなる群より選ばれるいずれか１である、前記いずれかの候補化合物の同定方法に関する。

【0020】

本発明はさらにまた、Ｍｙｌを特異的に認識する抗体であって、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する抗体を、炎症疾患を有すると診断されている対象に、炎症疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む、炎症疾患の治療方法に関する。

【0021】

本発明はまた、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用が、ＭｙｌとＣＤ６９との結合である、前記療方法に関する。

【0022】

本発明はさらに、Ｍｙｌが、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂからなる群より選ばれるいずれか１以上である、前記いずれかの治療方法に関する。

【0023】

本発明はさらにまた、前記抗体が、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂの部分アミノ酸配列であって、配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなる部分アミノ酸配列を特異的に認識する抗体である、前記いずれかの治療方法に関する。

【0024】

本発明はまた、炎症疾患が気道炎症疾患である、前記いずれかの治療方法に関する。

【0025】

本発明はさらに、炎症疾患がアレルギー性気道炎症疾患である、前記いずれかの治療方法に関する。

【発明の効果】

【0026】

本発明により、抗ミオシン調節軽鎖ポリペプチド抗体を含む、アレルギー性気道炎症疾患などの炎症疾患の治療用組成物を提供することができる。また、本発明により、抗ミオシン調節軽鎖ポリペプチド抗体を対象に投与することを特徴とする、アレルギー性気道炎症疾患などの炎症疾患の治療方法を提供できる。

【0027】

また本発明により、ミオシン調節軽鎖ポリペプチドとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する化合物の同定方法、および、ミオシン調節軽鎖ポリペプチドとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する化合物を選択することを特徴とする炎症疾患の治療用組成物の有効成分となる候補化合物の同定方法を提供することができる。

【0028】

抗ミオシン調節軽鎖ポリペプチド抗体は、ミオシン調節軽鎖ポリペプチドとＣＤ６９との共存下で、ＣＤ６９の機能を調節するミオシン調節軽鎖ポリペプチドの作用を阻害することにより、ＣＤ６９の当該機能を阻害すると考えることができる。本発明に係る抗ミオシン調節軽鎖ポリペプチド抗体を含む組成物は、炎症誘導時に特異的に発現するミオシン調節軽鎖ポリペプチドを標的にしていることから副作用が少なく、また、骨髄に移行して維持されるＣＤ６９発現メモリーＣＤ４ Ｔ細胞も制御する可能性が高いことから、それらが関与する慢性炎症など幅広い炎症に対する抑制効果が期待できる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1A】マウスＣＤ６９細胞外領域タンパク質とグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質（ＧＳＴ−ｍＣＤ６９ＥＣ）を骨髄抽出液と混合し、次いで抗ＧＳＴ抗体を用いてプルダウンアッセイを行った結果、ＧＳＴ−ｍＣＤ６９ＥＣと共沈するタンパク質を示す特異的なバンド（矢頭）が検出されたことを説明する図である。図中、ＩＰは免疫沈降を、Ａｎｔｉ−ＧＳＴは抗ＧＳＴ抗体を、ＧＳＴ−ｍｏｃｋはＧＳＴタンパク質のみを、ＢＭ ｔｏｔａｌ ｌｙｓａｔｅは骨髄抽出液を意味する。（実施例１）

【図1B】図１Ａで検出されたバンドに含まれるタンパク質、すなわちマウスＭｙｌ９のアミノ酸配列、並びにＭｙｌ９と相同性のあるマウスＭｙｌ１２ａおよびＭｙｌ１２ｂのアミノ酸配列を説明する図である。タンパク質の同定はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により実施した。図中、太線はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により得られたアミノ酸配列を意味する。（実施例１）

【図1C】３ｘＦｌａｇタグを付加したマウスＣＤ６９細胞外領域タンパク質（３ｘＦｌａｇ ｍＣＤ６９ＥＣ）を骨髄抽出液と反応させた結果、抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体による免疫沈降および抗Ｍｙｌ９／１２抗体によるイムノブロッティングにより、３ｘＦｌａｇ ｍＣＤ６９ＥＣとＭｙｌ９／１２との相互作用を示すバンドが検出されたことを説明する図である。。一方、３ｘＦｌａｇペプチド（３ｘＦｌａｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）とＭｙｌ９／１２との相互作用を示すバンドは認められなかった。また、３ｘＦｌａｇ ｍＣＤ６９ＥＣとＭｙｌ９／１２との相互作用は、糖鎖修飾切断酵素ＰＮＧａｓｅＦで処理した場合に増強した。図中、ＢＭ ｌｙｓａｔｅは骨髄抽出液を、ＩＰ：Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇは抗Ｆｌａｇペプチド抗体による免疫沈降を、ＩＢ：Ｍｙｌ９／１２は抗Ｍｙｌ９／１２抗体によるイムノブロッティングを意味する。ｗｈｏｌｅは骨髄抽出液を抗Ｍｙｌ９／１２抗体によりイムノブロッティングを示す。（実施例１）

【図2A】Ｆｌａｇタグを付加したマウス全長ＣＤ６９タンパク質（Ｆｌａｇ−ｍＣＤ６９ＦＬ）を発現させた２９３Ｔ細胞を糖鎖修飾阻害剤ツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）で処理したところ、該細胞の抽出液に含まれるＦｌａｇ−ｍＣＤ６９ＦＬの分子量が未処理のものに比べて減少したことを説明する図である。図中、ＩＢ：Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇは抗Ｆｌａｇペプチド抗体によるイムノブロッティングを意味する。（実施例２）

【図2B】マウス ＣＤ４ Ｔ細胞から分化誘導し、かつＦｌａｇ−ｍＣＤ６９ＦＬを導入したＴｈ２細胞で、抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β抗体を用いて２４時間刺激すると、糖鎖修飾がないと推定される分子量の小さいＦｌａｇ−ｍＣＤ６９ＦＬ分子の一部が検出された（矢印）ことを説明する図である。図中、ＩＰ：Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇは抗Ｆｌａｇペプチド抗体による免疫沈降を、ＩＢ：Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇは抗Ｆｌａｇペプチド抗体によるイムノブロッティングを意味する。また、Ｒｅｓｔｉｎｇは未刺激の細胞を、ＭはＦｌａｇペプチドを導入した細胞を、６９はＦｌａｇ−ｍＣＤ６９ＦＬを導入した細胞を意味する。（実施例２）

【図2C】マウス ＣＤ４ Ｔ細胞を抗ＣＤ３ε抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて刺激すると、刺激２４時間後の細胞を移入したマウスで該細胞の骨髄への移行が認められ、４８時間後には骨髄への移行がさらに亢進したことを説明する図である。縦軸は、骨髄における移入細胞数を脾臓における移入細胞数で割った割合を示す。（実施例２）

【図2D】マウス Ｔｈｙ１．１^＋ＣＤ４ Ｔ細胞を抗ＣＤ３ε抗体で刺激し、刺激８時間後の細胞を移入したマウスにおいて、抗Ｍｙｌ９／１２抗体の前投与により、移入細胞であるＴｈｙ１．１^＋ＣＤ４ Ｔ細胞の骨髄移行が、コントロール ウサギＩｇＧ抗体を投与したマウスと比較して低下したことを説明する図である。右パネルの縦軸は、骨髄における移入細胞数を末梢血における移入細胞数で割った割合を示す。図中、ＢＭは骨髄抽出液を、ｂｌｏｏｄは末梢血を、ＣｏｎｔｒｏｌはウサギＩｇＧ抗体を、ＩＢ：Ａｎｔｉ−Ｍｙｌ９／１２は抗Ｍｙｌ９／１２抗体によるイムノブロッティングを意味する。（実施例２）

【図3A】Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂを発現する細胞が骨髄に多く認められ、また、脾臓でもわずかながら認められたことを説明する図である。発現細胞の解析は、マウスの各臓器、すなわち大腿骨の骨髄（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）、および腸管膜リンパ節（Ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）の組織切片を対象として、抗Ｍｙｌ９／１２抗体を用いた免疫染色により実施した。（実施例３）

【図3B】Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂの発現量が骨髄で多いことを説明する図である。タンパク質発現量の解析は、マウスの各臓器、すなわち大腿骨の骨髄（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）、および腸管膜リンパ節（Ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）それぞれから組織抽出液を調製し、抗Ｍｙｌ９／１２抗体を用いたイムノブロッティングにより検討した。コントロールとして、各組織抽出液中のα−チューブリン（α−ｔｕｂｌｉｎ）を同様に検出した。図中、ＩＢ：Ｍｙｌ９／１２は抗Ｍｙｌ９／１２抗体によるイムノブロッティングを、ＩＢ：α−ｔｕｂｕｌｉｎは抗α−チューブリン抗体によるイムノブロッティングを意味する。（実施例３）

【図3C】Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂが、骨髄中の巨核球および類洞血管内皮細胞（Ｓｉｎｕｓｏｉｄ ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ）に認められたことを説明する図である。左パネルは抗Ｍｙｌ９／１２抗体による免疫蛍光染色像を示し、右パネルは免疫蛍光染色像と明視野像との重ね合わせを示す。（実施例３）

【図3D】Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂの各ｍＲＮＡの高い発現が、骨髄から単離した類洞血管内皮細胞で認められたこと、およびＭｙｌ１２ｂ ｍＲＮＡの高い発現が巨核球（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ）で認められたことを説明する図である。一方、骨髄から単離したＢ細胞（Ｂ ｃｅｌｌｓ）や、骨髄の全細胞（Ｗｈｏｌｅ）におけるこれらのｍＲＮＡ発現量は少なかった。横軸は、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）の発現量に対するＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂの各ｍＲＮＡの相対発現（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を示す。（実施例３）

【図3E】Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂが、骨髄の類洞血管内皮細胞の細胞表面上に発現していることをフローサイトメーターを用いた解析により明らかにしたことを説明する図である。縦軸は細胞数を、横軸は抗Ｍｙｌ９／１２抗体による染色強度を示す。図中、Ｗｈｏｌｅは骨髄の全細胞を示す。（実施例３）

【図3F】マウス個体内で類洞血管内皮細胞（ＶＥ−カドヘリン^＋細胞）がＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂを発現しており、またその発現はＣｅｌｌＭａｓｋ^＋で示す細胞脂質二重膜の外側、つまり細胞表面であることを説明する図である。解析は、Ｃｙ５標識した抗Ｍｙｌ９／１２抗体１０μｇを尾静脈から投与したマウスを対象にして、骨髄組織切片を抗ＶＥ−カドヘリン抗体およびＣｅｌｌＭａｓｋ^登録商標（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて免疫染色することにより行った。（実施例３）

【図4】Ｍｙｌ９において、図２Ｄ、３Ａ、３Ｃ、３Ｅ、３Ｆ、５Ａ、５Ｃで用いた抗Ｍｙｌ９／１２抗体が特異的に認識する部位を説明する図である。図中、ＨｕｍａｎはヒトＭｙｌ９ アイソフォームａのアミノ酸配列を、ＭｏｕｓｅはマウスＭｙｌ９のアミノ酸配列を示す。中央のアミノ酸配列は、ヒトＭｙｌ９ アイソフォームａとマウスＭｙｌ９との間でアミノ酸配列を比較した結果を示し、「＋」はアミノ酸残基が異なることを示す。

【図5A】気道炎症を誘発させたマウスの肺組織切片の血管内皮細胞表面上にＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂの発現が認められたことを説明する図である。一方、気道炎症を誘発させていないマウスの肺組織切片では発現は認められなかった。左パネルは、気道炎症を誘発させていないマウスの結果を示す。中央パネルおよび右パネルは気道炎症を誘発させたマウスの結果を示す。（実施例４）

【図5B】気道炎症を誘発させたマウスの肺から調製した抽出液において、炎症非誘導肺抽出液と比較して、Ｍｙｌ９／１２ａ／１２ｂの発現の増加が認められたことを説明する図である。図中、Ｃｏｎｔｒｏｌは炎症非誘導を、Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎは炎症誘導を意味する。また、ＩＢ：Ｍｙｌ９／１２は抗Ｍｙｌ９／１２抗体によるイムノブロッティングを、ＩＢ：α−ｔｕｂｕｌｉｎは抗α−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体によるイムノブロッティングを意味する。（実施例４）

【図5C】気道炎症を誘発させたマウスでは肺胞洗浄液中に好酸球、好中球、リンパ球、およびマクロファージの浸潤が認められたが、抗原による感作の前に抗Ｍｙｌ９／１２抗体を投与することにより、これら細胞の浸潤が有意に抑制されたことを説明する図である。抗Ｍｙｌ９／１２抗体（Ａｎｔｉ−Ｍｌ９／１２Ａｂ）の投与による細胞の浸潤の抑制は、抗ＣＤ６９抗体抗体（Ａｎｔｉ−ＣＤ６９Ａｂ）の投与による該抑制効果と同程度であった。また、コントロール抗体（Ｃｏｎｔ Ａｂ）では、細胞の浸潤は抑制されなかった。縦軸は細胞数（Ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ）を示す。図中、Ｔｏｔａｌは全細胞、図中Ｎｏ ｔｒｅａｔは、炎症非誘導群であることを示す。（実施例４）

【発明を実施するための形態】

【0030】

本発明は、Ｍｙｌを特異的に認識する抗体であって、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する抗体の、炎症疾患の治療用の薬剤または医薬組成物の製造、あるいは、炎症疾患の治療における使用に関する。

【0031】

すなわち、本発明は、炎症疾患を治療するために使用される薬剤または医薬組成物に関する。本発明に係る炎症疾患の治療用の薬剤または医薬組成物は、Ｍｙｌを特異的に認識する抗体であって、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する抗体を、炎症疾患を治療するまたは低減するのに有効な量で含む。

【0032】

また本発明は、炎症疾患を治療する方法に関する。本発明に係る炎症疾患を治療する方法は、Ｍｙｌを特異的に認識する抗体であって、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する抗体を、炎症疾患を有すると診断されている対象に、炎症疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む。

【0033】

本発明はまた、ＭｙｌとＣＤ６９と共存下での作用の効果を阻害する化合物の同定方法に関し、本方法は、被検化合物の存在下で、ＭｙｌとＣＤ６９とを共存させ、次いで、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用を測定し、該作用の低下または消失が検出されたとき、被検化合物がＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害すると決定することを含む。

【0034】

本発明はさらに、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する化合物を選別することを特徴とする、炎症疾患の治療用組成物の有効成分となる候補化合物の同定方法に関する。

【0035】

「Ｍｙｌ」は本発明において、好ましくはＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂであり、より好ましくはＭｙｌ９である。また、Ｍｙｌは、ヒト由来のタンパク質であることが好ましいが、該ヒト由来のタンパク質と同質の機能を有し、かつ構造的相同性を有する哺乳動物由来のタンパク質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギなどのタンパク質であることができる。

【0036】

Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂのアミノ酸配列、およびそれらをコードする核酸のヌクレオチド配列は、当業者に良く知られている。ヒト由来のＭｙｌ９をコードする核酸として、配列番号１に記載のヌクレオチド配列（ＮＭ＿００６０９７．４）で表されるＭｙｌ９ アイソフォームａをコードするＤＮＡ、および配列番号３に記載のヌクレオチド配列（ＮＭ＿１８１５２６．２）で表されるＭｙｌ９ アイソフォームｂをコードするＤＮＡを例示できる。また、ヒト由来のＭｙｌ９ アイソフォームａおよびアイソフォームｂとして、それぞれ配列番号２および４に記載のアミノ酸配列（ＮＰ＿００６０８８．２およびＮＰ＿８５２６６７．１）で表されるポリペプチドを例示できる。Ｍｙｌ９ アイソフォームｂは、アイソフォームａのアミノ酸配列の第６３−１１６番目のアミノ酸残基が欠失しているもので、平滑筋細胞や一部の細胞で発現している。ヒト由来のＭｙｌ１２ａをコードする核酸として、配列番号５に記載のヌクレオチド配列（ＮＭ＿００６４７１．２）で表されるＤＮＡを例示できる。また、ヒト由来のＭｙｌ１２ａとして、配列番号６に記載のアミノ酸配列（ＮＰ＿００６４６２．１）で表されるポリペプチドを例示できる。ヒト由来のＭｙｌ１２ｂをコードする核酸として、配列番号７、９、および１１に記載のヌクレオチド配列（ＮＭ＿００１１４４９４４．１、ＮＭ＿０３３５４６．３、およびＮＭ＿００１１４４９４５．１）で表される転写変異体１、２、および３を例示できる。これら転写変異がコードするアミノ酸配列を、配列番号８、１０、および１２（ＮＰ＿００１１３８４１６．１、ＮＰ＿２９１０２４．１、およびＮＰ＿００１１３８４１７．１）に示す。マウス由来のＭｙｌ９をコードする核酸として、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列（ＮＭ＿１７２１１８．１）で表されるＤＮＡを例示できる。また、マウス由来のＭｙｌ９として、配列番号１４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドを例示できる。マウス由来のＭｙｌ１２ａコードする核酸として、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列（ＮＭ＿０２６０６４．２）で表されるＤＮＡを例示できる。また、マウス由来のＭｙｌ１２ａとして、配列番号１６に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドを例示できる。マウス由来のＭｙｌ１２ｂコードする核酸として、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列（ＮＭ＿０２３４０２．２）で表されるＤＮＡを例示できる。また、マウス由来のＭｙｌ１２ｂとして、配列番号１８に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドを例示できる。なお、ＮＭ＿ＸＸＸＸＸＸ．Ｘ、ＮＭ＿ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．Ｘ、ＮＰ＿ＸＸＸＸＸＸ．Ｘ、ＮＰ＿ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．Ｘ（ここでＸは数字である）などで表されている番号は、米国立医学図書館（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋに登録された遺伝子およびタンパク質のアクセッション番号である。

【0037】

「Ｍｙｌを特異的に認識する抗体」とは、Ｍｙｌ以外のタンパク質であってＭｙｌとはアミノ酸配列相同性の低いタンパク質に比べて、より選択的にＭｙｌを認知する抗体を意味する。例えば、Ｍｙｌ以外のタンパク質であってＭｙｌとはアミノ酸配列相同性の低いタンパク質に比べて、より選択的にＭｙｌに作用する抗体や、より選択的にＭｙｌに結合する抗体を意味する。認識の有無は、公知の抗原抗体反応により決定できる。Ｍｙｌ９とＭｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ９とＭｙｌ１２ｂは、アミノ酸配列の相同性がそれぞれ９４．２％または９３．６％の相同性を有し、Ｍｙｌ１２ａとＭｙｌ１２ｂは９７．７％の相同性を有する。そのため、Ｍｙｌ９を特異的に認識する抗体が、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂを特異的に認識することがある。また逆に、Ｍｙｌ１２ａやＭｙｌ１２ｂを特異的に認識する抗体が、Ｍｙｌ９を特異的に認識することがある。

【0038】

本発明に係る抗体として、好ましくはＭｙｌ９を特異的に認識する抗体、Ｍｙｌ１２ａを特異的に認識する抗体、Ｍｙｌ１２ｂを特異的に認識する抗体、より好ましくはＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂのいずれをも認識する抗体を挙げることができる。例えば、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂのアミノ酸配列のうち相同性の高い部分アミノ酸配列を特異的に認識する抗体を挙げることができる。このような部分アミノ酸配列として、配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列を例示できる。配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列は、Ｍｙｌ９のアミノ酸配列のＮ末領域に存在する部分アミノ酸配列であり、、Ｍｙｌ１２ａおよびＭｙｌ１２ｂの対応する領域のアミノ酸配列と相同性がきわめて高い。また、配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなる領域を特異的に認識する抗体が、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害したことから、この領域はＭｙｌとＣＤ６９との作用部位を含む領域であると推定される。

【0039】

「ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用」とは、ＭｙｌとＣＤ６９とが共存したときに生じるＭｙｌとＣＤ６９との相互作用を意味する。「相互作用」とは、例えば２つの同種あるいは別種のタンパク質が特異的に作用し合い、その結果、一方のあるいは両方のタンパク質の機能が変化する、例えば亢進する、または低減することを意味する。特異的に作用するとは、その作用に関わるタンパク質以外のタンパク質に比べて、より選択的に作用することを意味する。すなわち、「ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用」は、ＣＤ６９の機能を起こさせるＭｙｌの作用であるということができる。また、「ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用」として、ＭｙｌとＣＤ６９との結合を挙げることができる。

【0040】

「ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果」とは、ＭｙｌとＣＤ６９とが共存下で作用した結果生じるＣＤ６９の機能の変化、例えば、ＣＤ６９の機能の発現または亢進、あるいはＭｙｌの作用によるＣＤ６９の機能変化によって生じる生理機能の変化を意味する。ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果として、ＣＤ６９を発現したＣＤ４ Ｔ細胞の骨髄への移行を挙げることができる。

【0041】

「ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する」とは、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を低減させることをいう。

【0042】

本発明に係る抗体は、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する抗体であり、好ましくはＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する抗体、より好ましくはＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する抗体である。

【0043】

本発明に係る抗体は、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂを抗原として用いて作製することができる。抗原は、これらいずれかの全長タンパク質でもよく、該タンパク質の部分ペプチドであってもよい。抗原は、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。特異的な抗体を作成するためには、抗原に固有なアミノ酸配列からなる領域、すなわち、免疫学的に特異的なそのエピトープを含有するペプチドを用いることが好ましい。抗原として好ましく使用できるペプチドとして、配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。

【0044】

かかる全長タンパク質および該タンパク質の部分ペプチドは、該タンパク質またはペプチドをコードする核酸を一般的遺伝子工学的手法（Sambrook J. et al. ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)、Ulmer, K.M., Science, 219: 666-671, 1983、Ehrlich H.A. ed., PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification. Stockton Press, New York (1989)など）で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物として作製できる。または、該細胞や生体生物由来の試料から調製したものであることができ、これらからさらに精製されたものであってもよい。

【0045】

抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答等の免疫誘導を行うことにより抗体が得られる。担体はそれ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめる担体であれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン等が例示できる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせを例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。

【0046】

本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。モノクロ−ナル抗体は、公知方法、例えばハイブリドーマ法を用いて作製することができる（Kohler and Milstein, Nature, 256:495, 1975）。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物を、典型的には抗原を用いて免疫して、特異的に抗原に結合する抗体を産生するかまたは産生することが可能なリンパ球を誘導する。代替的には、抗体を産生するかまたは産生することが可能なリンパ球を用いて、自体公知の永久増殖性細胞への形質転換手段を導入することによりハイブリドーマを作製する。例えば、かかるリンパ球と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させて、ハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選別する。該ハイブリドーマを培養することにより、培養液から抗体を回収することができる。ハイブリドーマの選別は、例えば公知方法によりスクリーニングすることにより実施できる（Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988)、Goding, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York (1986)）。すなわち、ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体とＭｙｌとの特異的な免疫反応性や、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果の阻害を試験することにより、所望のものを選択することができる。

【0047】

天然の抗体構造単位は、典型的には四量体を含有する。かかる四量体は各々、ポリペプチド鎖の２つの相同対（各々の対は１つの全長軽鎖（例えば、約２５ｋＤａ）および１つの全長重鎖（例えば、約５０ｋＤａ〜７０ｋＤａ）を有する）から構成される。典型的には、各々の鎖のアミノ末端部は、典型的に抗原認識に関与する約１００個〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各々の鎖のカルボキシ末端部は、典型的にはエフェクター機能に関与し得る定常領域を規定する。ヒト軽鎖は典型的にはκ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は典型的にはμ、δ、γ、αまたはεとして分類され、抗体アイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして規定される。ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない幾つかのサブクラスを有する。ＩｇＭはＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むが、これらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡも同様に、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むが、これらに限定されないサブクラスに細分される。軽鎖および重鎖においては、可変領域および定常領域は約１２アミノ酸以上のＪ領域によって連結され、重鎖はまた、約１０アミノ酸以上のＤ領域を含み得る（Paul, W., ed., Fundamental Immunology Ch. 7 (2nd ed.) Raven Press, N. Y. (1989)など）。各々の軽／重鎖対の可変領域は、典型的には抗原結合部位を形成する。

【0048】

可変領域は、典型的には３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる）によって連結される比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という同じ全体構造を呈する。各々の対の２つの鎖からのＣＤＲは、典型的にはフレームワーク領域によって整列し、これにより特異的なエピトープへの結合が可能となる。軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方は、Ｎ末端からＣ末端へ、典型的にはドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含有する。

【0049】

本発明に係る抗体は、無傷抗体（ｉｎｔａｃｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）または抗体断片のいずれであってもよい。「無傷抗体」とは、天然の抗体と同様の四量体の構造単位からなる抗体を意味する。「抗体断片」とは、無傷抗体の一部、例えば無傷抗体の抗原結合領域または可変領域等を含む断片を意味する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ１断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、線状抗体（Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062, 1995）、一本鎖抗体分子、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。「Ｆａｂ断片」は単一の抗原結合部位を有する抗原結合断片であり、抗体をパパイン分解することにより、１つの抗体から各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一のＦａｂ断片を作製することができる。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、抗体をペプシン処理することにより作製することができる抗体断片であり、依然として抗原を架橋することが可能である。「Ｆｖ断片」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する抗体断片であり、密接に非共有結合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体から成る。単一の可変ドメイン、または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含有するＦｖの半分は、抗原を認識し、結合することができる。一本鎖抗体分子である「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、かつこれらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在することを特徴とするものである。ＦｖポリペプチドはＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含有することができる（Rosenburg and Moore eds., Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)など）。「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号、およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448, 1993など）。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短かいリンカーを用いることで、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を生じさせることができる。

【0050】

本発明に係る抗体は、キメラ抗体、あるいは、部分ヒト化または完全ヒト化されたヒト化抗体として作製することができる。非ヒト抗体は当該技術分野で既知の任意の適用可能な方法を用いてヒト化することができる。ヒト化抗体は、免疫系が部分的または完全にヒト化されたトランスジェニック動物を用いて作製できる。本発明に係る抗体またはその断片は、部分的または完全にヒト化できる。キメラ抗体は当該技術分野で既知の任意の技法を用いて作製することができる（米国特許第５，１６９，９３９号、同第５，７５０，０７８号、同第６，０２０，１５３号、同第６，４２０，１１３号、同第６，４２３，５１１号、同第６，６３２，９２７号および同第６，８００，７３８号など）。

【0051】

本発明に係る抗体は、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害するため、ＣＤ６９の機能的異常や量的異常、例えばＭｙｌによるＣＤ６９の活性化、に起因する各種疾患の解明、防止、改善および／または治療のために有用である。

【0052】

「ＣＤ６９」は、Ｃタイプレクチンファミリーに属するＩＩ型の膜貫通型タンパク質である。ＣＤ６９のアミノ酸配列、およびＣＤ６９をコードする核酸のヌクレオチド配列は、当業者に良く知られている。ヒト由来のＣＤ６９をコードする核酸として、配列番号１９に記載のヌクレオチド配列（ＮＭ＿００１７８１．２）で表されるＤＮＡを例示できる。また、ヒト由来のＣＤ６９として、配列番号２０に記載のアミノ酸配列（ＮＰ＿００１７７２．１）で表されるポリペプチドを例示できる。

【0053】

ＣＤ６９の機能的異常や量的異常に起因する各種疾患として、炎症疾患を好ましく挙げることができる。ＣＤ６９は、血小板に恒常的に発現しており、また、活性化した好中球や好酸球などにも発現がみられることから、血小板の機能発現や局所の炎症反応における役割が推測されている。また、関節炎の発症において好中球上のＣＤ６９が重要な役割を果たしていることが明らかになっている（非特許文献５）。さらに、ＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ６９がアレルギー性気道炎症を制御しており、ＣＤ６９に対する抗体はアレルギー性気道炎症を抑制することが報告されている（非特許文献６）。

【0054】

「炎症疾患」とは、炎症状態を伴う疾患を意味する。炎症状態とは、生体に作用する各種の傷害因子に対する全体的または部分的な一連の生体防御反応、例えば、免疫系の細胞の数の変化、該細胞の移動速度の変化、および該細胞の活性の変化により生じる、組織的障害や循環障害などの病理学的状態を意味する。免疫系の細胞としては、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球若しくはマクロファージ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、小膠細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、好酸球、肥満細胞、または免疫に特異的に関連する他のあらゆる細胞、例えば、サイトカイン産生内皮細胞若しくはサイトカイン産生上皮細胞を挙げることができる。

【0055】

炎症疾患は、炎症状態を伴う疾患であれば特に限定されないが、好ましくはアレルギー性気道炎症などの気道炎症や自己免疫疾患を挙げることができる。より具体的には、喘息、アトピー性皮膚炎、炎症性腸疾患、関節炎などを上げることができる。

【0056】

「治療」とは、ある処置をすることにより、疾患やその症状を消失させるか、低減させるか、あるいはその進行を止めることを意味する。「治療」には、疾患の発症を防止することも含まれ得る。

【0057】

本発明に係る抗体は、必要に応じて、医薬用に許容される担体（医薬用担体）を含む医薬組成物として製造できる。

【0058】

医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースを例示できる。これらは、目的とする薬剤の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組み合わせて使用される。そのほか、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤などを適宜使用することもできる。安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体を例示できる。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸などのいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などのいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などが包含される。緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）を例示できる。等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンを例示できる。キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸を例示できる。

【0059】

本発明に係る抗体は、炎症疾患を治療するための１つまたは複数の公知の抗炎症疾患治療薬と組み合わせて利用することができる。

【0060】

本発明に係る抗体を含む医薬組成物は、該抗体に加え、炎症疾患の治療に有効な付加的な活性成分を組み合わせて含むことができる。

【0061】

医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾病の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。

【0062】

本発明に係る医薬組成物を投与するときには、本医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。

【0063】

投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。本発明に係る薬剤は、経口経路および非経口経路のいずれによっても投与できるが、経口投与がより好ましい。非経口経路としては、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができる。

【0064】

剤形は、特に限定されず、種々の剤形とすることができる。例えば、溶液製剤として使用できるほかに、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。また持続性剤形または徐放性剤形であってもよい。

【0065】

具体的には、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤、経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション、口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤、ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤、坐剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。

【0066】

経口用固形製剤を調製する場合は、上記有効成分に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などを製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などを、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどを、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などを、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどを、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などを例示できる。

【0067】

経口用液体製剤を調製する場合は、上記化合物に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤などを加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などを製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウムなどが、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどを挙げることができる。

【0068】

注射剤を調製する場合は、上記化合物にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内および静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤および緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどを挙げることができる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などを挙げることができる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどを挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖などを例示できる。

【0069】

ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する化合物の同定方法は、被検化合物の存在下で、ＭｙｌとＣＤ６９とを共存させ、次いで、ＭｙｌとＣＤ６９との作用を測定し、該作用を阻害する化合物を選択することにより実施できる。

【0070】

ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する化合物の同定方法は、例えば、被検化合物の存在下で、ＭｙｌとＣＤ６９とを共存させ、次いで、ＭｙｌとＣＤ６９との結合を測定し、該結合を阻害する化合物を選択することによっても実施できる。

【0071】

また、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する化合物の同定方法は、Ｍｙｌの代わりに、Ｍｙｌのアミノ酸配列においてＭｙｌがＣＤ６９と作用すると推定されるＮ末側領域のペプチド、例えば配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列で表される領域のペプチドを使用することによっても実施することができる。

【0072】

ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する化合物の同定方法は、好ましくは、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を含む：
（ｉ）Ｍｙｌと被検化合物とを接触させる工程、
（ｉｉ）ＭｙｌとＣＤ６９とを共存させる工程、および
（ｉｉｉ）ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用を測定する工程。

【0073】

上記工程（ｉ）において、Ｍｙｌと被検化合物との接触は、ＣＤ６９の非存在下および存在下のいずれでも行うことができるが、ＣＤ６９の非存在下で行うことにより、Ｍｙｌに作用して、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する化合物を同定することができるため、より好ましい。

【0074】

ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の測定結果を、Ｍｙｌを被検化合物と接触させた場合と接触させなかった場合とで比較することにより、該被検化合物がＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用に及ぼす効果を判定することができる。ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用が、Ｍｙｌを被検化合物と接触させなかったときと比較して、被検化合物と接触させたときに減少した場合、該被検化合物はＭｙｌとＣＤ６９の共存下での作用を阻害すると判定できる。

【0075】

ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の測定は、一般的な医薬品スクリーニングシステムで使用されている様々な解析方法を利用して実施できる。例えば、ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用を可能にする条件を選択し、当該条件下で、ＭｙｌとＣＤ６９とを共存させ、ＭｙｌとＣＤ６９との作用を検出する。ＭｙｌとＣＤ６９との共存を可能にする条件はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の条件でもインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の条件でもよく、インビトロの条件が好ましい。ＭｙｌおよびＣＤ６９は、一般的遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物として作製できる。または、該細胞や生体生物由来の試料から調製したものであることができ、これらからさらに精製されたものであってもよい。

【0076】

例えば、ＭｙｌとＣＤ６９との結合の測定を測定するときは、ＭｙｌとＣＤ６９との結合により形成される複合体と、結合していない遊離のＭｙｌおよびＣＤ６９とを分離し、該複合体をイムノブロッティングなどの公知の方法によって検出することにより実施できる。または、ＭｙｌとＣＤ６９との結合反応を行い、その後、ＣＤ６９に結合したＭｙｌを、Ｍｙｌに対する抗体を使用して測定することにより、結合の測定が実施できる。Ｍｙｌに結合した抗体は、標識物質で標識した二次抗体を使用して検出できる。あらかじめ標識物質で標識化した抗体を使用して検出を実施することもできる。あるいは、ＣＤ６９との結合反応に使用するＭｙｌをあらかじめ所望の標識物質で標識化して使用し、上記同定方法を行い、該標識物質を検出することにより結合の検出が可能である。標識物質として、一般的な結合解析方法で使用されている物質がいずれも利用でき、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇなどのタグペプチド類、蛍光色素、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの酵素類、あるいはビオチンなどを例示できる。簡便には、放射性同位体元素が利用できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を使用して実施できる。

【0077】

あるいは、ＭｙｌとＣＤ６９との結合の測定は、ビアコアシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ ｓｙｓｔｅｍ）などの表面プラズモン共鳴センサー、シンチレーションプロキシミティアッセイ法（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ、ＳＰＡ）、または蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）を応用した方法により実施できる。

【0078】

ＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する化合物の同定方法により同定された化合物は、炎症疾患の治療用組成物の有効成分となり得る。すなわち、本発明に係るＭｙｌとＣＤ６９との共存下での作用の効果を阻害する化合物の同定方法を利用して、そのような化合物を選別することにより、炎症疾患の治療用組成物の有効成分となる候補化合物を提供することができる。

【0079】

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。

【実施例1】

【0080】

ＣＤ６９に作用して、その機能を発現させ得る分子の探索を実施した。具体的には、ＣＤ６９と結合するタンパク質の探索を行った。まず、ＣＤ６９タンパク質を、遺伝子工学的手法により取得し、精製した。

【0081】

具体的にはまず、マウスＣＤ６９タンパク質（以下、ｍＣＤ６９と略称する）の精製を行った。ＰＣＲにてマウス脾臓ｃＤＮＡより作製したｍＣＤ６９細胞外領域（Ｅｘｔｒａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ：転写開始部位から１８８〜６００番目：以下、ＥＣと略称することがある）配列をＮ末端側にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴと略称する）タグが組み込まれたｐＥＴ４２ａ（ＴＡＫＡＲＡ社）のマルチクローニングサイトに挿入し、大腸菌ｍＣＤ６９ＥＣ発現ベクターｐＥＴ４２ａ ＧＳＴ−ｍＣＤ６９ＥＣを作成した。ｐＥＴ４２ａ ＧＳＴ−ｍＣＤ６９ＥＣを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株へ形質転換したものをイソプロピル β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する；Ｓｉｇｍａ社）を用いてタンパク質発現誘導を行った。発現させたＧＳＴ−ｍＣＤ６９ＥＣタンパク質は不溶性画分に含まれ、正しい立体構造を形成していないため、以下のようにリフォールディングを行った。変性バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ 塩酸グアニジン、１０ｍＭ イミダゾール（ｐＨ８．０））で溶解し、ソニケーター（Ｍｉｃｒｏｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ：ＭＩＳＯＮＩＸ社）を用いて破砕した。精製過程はすべて、ＡＫＴＡ プライム プラス（ＧＥヘルスケア社）を用いてグラジエント流速で行った。さらに、リフォールディングバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ 尿素、１０ｍＭ イミダゾール（ｐＨ８．０））で置換を行い、洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）および溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、 ５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ イミダゾール）処理後、透析膜（ＧＥヘルスケア）を用いて、リン酸緩衝食塩水（以下、ＰＢＳと略称する）へ置換を行い、ＧＳＴ−ｍＣＤ６９ＥＣのタンパク質を得た。コントロールタンパク質には、同様に変性ならびにリフォールディングを行ったＧＳＴタンパク質を用いた。

【0082】

次に、ＣＤ６９に結合するタンパク質が存在すると考えられる骨髄抽出液（以下、ＢＭ ｌｙｓａｔｅと略称する）を調製した。骨髄への記憶ＣＤ４ Ｔ細胞の移行にはＣＤ６９が関与することが報告されており（非特許文献４）、このことから骨髄にはＣＤ６９に作用してその機能的な働きを調節する分子が存在すると考えられる。具体的には、マウス大腿骨の骨髄をコラゲナーゼ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ社）により処理した後に、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ社）含有の溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＮａＮ_３、１０％ グリセロール、１％ トリトン−Ｘ１００^登録商標）で溶解することにより、骨髄抽出液を調製した。

【0083】

得られた骨髄抽出液を、精製したＧＳＴ−ｍＣＤ６９ＥＣタンパク質と混合し、抗ＧＳＴ抗体（ＷＡＫＯ社）およびプロテイン−Ｇ（ＧＥヘルスケア社）を用いて免疫沈降した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離処理後、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ ＣＢＢ Ｇ−２５０ステイン（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてクマシー ブリリアント ブルー（以下、ＣＢＢと略称する）染色を行った。

【0084】

図１Ａに示すように、ＧＳＴ−ｍＣＤ６９ＥＣタンパク質に結合するタンパク質を示す特異的なバンドが検出された。このバンドを切り出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により、ＧＳＴ−ｍＣＤ６９ＥＣタンパク質に結合するタンパク質の同定を行った。その結果、ＧＳＴ−ｍＣＤ６９ＥＣタンパク質に結合するタンパク質は、図１Ｂの太線で示すアミノ酸配列を持つＭｙｌ９またはＭｙｌ９と相同性の高いＭｙｌ１２ａおよびＭｙｌ１２ｂであることが明らかになった。

【0085】

次に、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂが実際にＣＤ６９と結合するのかを検討した。まず、ｍＣＤ６９ＥＣ配列をＮ末端にＦｌａｇタグが組み込まれたｐ３ｘＦＬＡＧ ＣＭＶ−９（Ｓｉｇｍａ社）に挿入し、Ｎ末端にＦｌａｇ−Ｔａｇを付加したｍＣＤ６９ＥＣ配列の発現ベクターを作製した。当該発現ベクターを２９３Ｔ細胞へ形質転換して３ｘＦｌａｇ ｍＣＤ６９ＥＣを過剰発現させた後、細胞抽出液を調製した。コントロールとして、３ｘＦｌａｇペプチドを過剰発現させた２９３Ｔ細胞から細胞抽出液を調製した。これら細胞抽出液から、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２１）タグ抗体ビーズ（ＷＡＫＯ社）を用いて、３ｘＦｌａｇ ｍＣＤ６９ＥＣタンパク質または３ｘＦｌａｇペプチドを精製した。ここで、ＤＹＫＤＤＤＤＫは、アミノ酸一文字標記で表したペプチドである。これら精製タンパク質をそれぞれ、骨髄抽出液（ＢＭ ｌｙｓａｔｅ）と上記同様に反応させ、抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社）およびプロテイン−Ｇ（ＧＥヘルスケア社）を用いて免疫沈降を行った。免疫沈降を実施後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＢｉｏＲａｄ社）へ転写した。次いで、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂを認識する抗体（以下、抗Ｍｙｌ９／１２抗体と称する）を用いてイムノブロッティングを行った。すなわち、一次抗体にウサギ抗Ｍｙｌ９抗体（Ａｂｃａｍ社）、二次抗体にホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＣＳＴ社）を用い、ＥＣＬ検出試薬（ＧＥヘルスケア社）を用いてＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ＋（ＢｉｏＲａｄ社）により各タンパク質を検出した。なお、ｍＣＤ６９ＥＣタンパク質の糖鎖切断処理は、１μｇの３ｘＦＬＡＧ ｍＣＤ６９ＥＣに対し、５００ＵのＮ−グリコシダーゼ ＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＢ社）を添加して行った。

【0086】

その結果、抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体で免疫沈降された３ｘＦｌａｇ ｍＣＤ６９ＥＣタンパク質と抗Ｍｙｌ９／１２抗体との結合を示すバンドが認められた（図１Ｃ）。一方、抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体で免疫沈降された３ｘＦｌａｇペプチドでは、抗Ｍｙｌ９／１２抗体との結合を示すバンドは認められなかった。この結果は、ｍＣＤ６９ＥＣタンパク質と抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体で認識されるＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂとの結合を示す。また、この結合はＣＤ６９ＥＣを予め糖鎖修飾切断酵素であるＰＮＧａｓｅ Ｆで処理した場合に増強した（図１Ｃ）。

【0087】

これら結果から、骨髄抽出液中に存在するタンパク質、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂが、ＣＤ６９と結合することが明らかになった。また、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９との結合は、ＣＤ６９を糖鎖修飾切断酵素で処理することにより増強することが判明した。

【実施例2】

【0088】

記憶ＣＤ４ Ｔ細胞はＣＤ６９を介して骨髄へ移行することが報告されていることから、生体内におけるＣＤ６９の機能の解析を行った。また、ＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ６９の糖鎖修飾状態が、該細胞の活性化に伴いどのように変化するのか解析した。

【0089】

まず、糖鎖修飾阻害剤ツニカマイシンで処理したＣＤ６９タンパク質の分子量を測定した。マウスＣＤ６９遺伝子の全長配列（以下、ｍＣＤ６９ＦＬと略称することがある）をＦＬＡＧベクターに組み込んで得られたｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ ｍＣＤ６９ＦＬをＦｕＧＥＮＥ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて２９３Ｔ細胞に過剰発現させ、細胞を回収する最後の２４時間、ツニカマイシン １０ｍｇ／ｍｌで処理した。回収した細胞をプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ社）含有の溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＮａＮ_３、１０％ グリセロール、１％ トリトン−Ｘ１００^登録商標）を用いて溶解し、得られた細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離処理し、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ社）へ転写した。一次抗体にはウサギ抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社）、二次抗体にはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＣＳＴ社）を用いてイムノブロッティングを行った。ＥＣＬ検出試薬（ＧＥヘルスケア社）を用いてＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ＋（ＢｉｏＲａｄ社）によりタンパク質を検出した。

【0090】

図２Ａに示すように、２９３Ｔ細胞に過剰発現させたＣＤ６９ＦＬは約３５ｋＤａ前後にバンドが認められたのに対し、ツニカマイシンで処理した場合、分子量の小さいＣＤ６９ＦＬが検出された。

【0091】

次に、ＣＤ４ Ｔ細胞に発現するＣＤ６９タンパク質の分子量を調べるため、イムノブロッティングでＣＤ６９の検出を行った。まず、ＣＤ４ Ｔ細胞からＴｈ２細胞を分化誘導し、ＦＬＡＧ−ｔａｇを付加したＣＤ６９ＦＬをレトロウイスルベクターを用いて導入し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降および抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロッティングを行い、Ｔｈ２細胞の活性化に伴うＣＤ６９の糖鎖修飾状態の変化を調べた。レトロウィルスは、ＰｌａｔＥ細胞にｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ ＧＦＰ（ＩＧ）−Ｍｏｃｋ（空）ベクターまたはｐＭＸｓ−ＩＧ−ＦＬＡＧ ＣＭＶ２ ｍＣＤ６９ＦＬベクターを導入することにより作製した。ＣＤ４ Ｔ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞から、フルオレセイン イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）および抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて単離した。Ｔｈ２細胞分化条件下（２５Ｕ／ｍｌ インターロイキン−２（ＩＬ−２）、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−４および抗インターフェロンγ（ＩＦＮγ）中和抗体存在下）において、固相化抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β抗体（Ｈ５７）および抗ＣＤ２８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を用いてＣＤ４ Ｔ細胞を刺激し、Ｔｈ２細胞に分化誘導した。Ｄａｙ２に、固相化レトロネクチンを用いて作製したレトロウィルスを細胞に感染させた。Ｄａｙ５に細胞を回収し、１日間培養液で培養したものをレスティング（Ｒｅｓｔｉｎｇ）細胞として用いた。また、Ｄａｙ５に回収した細胞を２日間培養液で培養し、固相化抗ＴＣＲβ抗体を用いて２４時間刺激したものを実験に用いた。細胞抽出液を上記方法と同様の処理により調製し、ウサギ抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体およびプロテイン−Ｇ（ＧＥヘルスケア社）を用いて免疫沈降を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ社）へ転写した。上記と同様の抗体を用いてイムノブロッティングを行い、タンパク質を検出した。

【0092】

図２Ｂに示すように、刺激を行っていないＴｈ２細胞（図２Ｂ、左から２番目のレーン）に比べて、抗ＴＣＲβ抗体により刺激した活性化Ｔｈ２細胞（図２Ｂ、右のレーン）では糖鎖修飾を受けていないと推測される分子量の小さいＣＤ６９の発現が認められた。

【0093】

ＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ６９の糖鎖修飾状態の変化と機能の関連を調べるため、刺激後２４時間および４８時間のＣＤ４ Ｔ細胞の骨髄への移行を観察した。ＣＤ４ Ｔ細胞を、ビオチン標識抗ＣＤ４ Ｆａｂ化抗体およびストレプトアビジン マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて、Ｔ細胞表面マーカー分子であるＴｈｙ１．１を発現しているマウスの脾臓から単離し、固相化した抗ＣＤ３ε抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）および抗ＣＤ２８抗体を用いて刺激した。刺激して２４時間後または４８時間後に細胞を回収し、汎白血球表面分子であるＬｙ５．１を発現するマウスへ、尾静脈注射により移入し、１時間後に骨髄および脾臓におけるＴｈｙ１．１^＋ＣＤ４^＋細胞を検出した。検出には、ＦＩＴＣ標識Ｌｙ５．１抗体、フィコエリスリン−シアニン７（以下、ＰＥ−Ｃｙ７と略称する）標識ＣＤ４抗体、アロフィコシアニン−シアニン７（以下、ＡＰＣ−Ｃｙ７と略称する）標識Ｂ２２０抗体、およびＰＢ標識Ｔｈｙ１．１抗体を用いた。ＣＤ４ Ｔ細胞の骨髄への移行能は、骨髄における移入細胞数を脾臓における移入細胞数で割った割合で示した。

【0094】

図２Ｃに示すように、刺激後４８時間からＴｈｙ１．１^＋ＣＤ４^＋細胞の骨髄への移行が認められた。

【0095】

これら結果および実施例１の結果から、刺激されたＣＤ４ Ｔ細胞は糖鎖修飾の少ないＣＤ６９を発現し、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂとの結合を介して骨髄へ移行すると考えることができる。

【0096】

Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９との結合が、刺激したＣＤ４ Ｔ細胞の骨髄への移行に関与するか否かを検討した。具体的には、上記方法と同様の方法で、マウス脾臓から単離したＴｈｙ１．１^＋ＣＤ４ Ｔ細胞を固相化抗ＣＤ３ε抗体で刺激し、８時間後に細胞を回収し、Ｔ細胞表面分子であるＴｈｙ１．２を発現しているＣ５７ＢＬ／６マウスへ移入した。移入１時間前に抗Ｍｙｌ９／１２抗体（ＭＢＬ社）またはコントロールであるウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社）をマウスに腹腔内投与し、細胞の移入の１時間後に骨髄および末梢血におけるＴｈｙ１．１^＋ＣＤ４^＋細胞を上記方法と同様の方法で検出し、Ｔｈｙ１．１およびＣＤ４ダブルポジティブの細胞の割合を算出した。また、ＣＤ４ Ｔ細胞の骨髄への移行能は、骨髄における移入細胞数を末梢血における移入細胞数で割った割合で示した。

【0097】

図２Ｄの右パネルに示すように、骨髄へ移行したＴｈｙ１．１^＋ＣＤ４^＋細胞と血液中のＴｈｙ１．１^＋ＣＤ４^＋細胞（骨髄へ移行していない細胞）の割合は、コントロール群に比べて抗Ｍｙｌ９／１２抗体投与群で低下していた。すなわち、Ｍｙｌ９またはＭｙｌ１２とＣＤ６９との共存下における作用を阻害することにより、ＣＤ４ Ｔ細胞の骨髄への移行が阻害されることが判明した。この結果から、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９との相互作用によりＣＤ４ Ｔ細胞が効率的に骨髄へ移行していることが示唆された。

【0098】

これらの結果および実施例１の結果から、抗原刺激後２４時間〜４８時間のＣＤ４ Ｔ細胞は糖鎖修飾を受けないＣＤ６９を発現することで、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂと結合し、骨髄へ移行することが示唆された。

【実施例3】

【0099】

骨髄中のＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂがＣＤ６９と結合することにより、ＣＤ４ Ｔ細胞が骨髄へ移行することが示唆されたため、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂを発現する細胞の同定を行った。

【0100】

まず、マウスの各臓器の組織切片について、抗Ｍｙｌ９／１２抗体を用いた免疫染色法により、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂを発現する細胞の同定を実施した。具体的には、マウス大腿骨、脾臓、胸腺、および腸管膜リンパ節を４％パラホルムアルデヒドで固定後、３０％スクロースに置換した。作製した各臓器の凍結切片を抗Ｍｙｌ９／１２抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて染色した。染色手順は説明書に従い、組織学的解析はコンフォーカルレーザー顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で行った。

【0101】

図３Ａに示すように、抗Ｍｙｌ９／１２抗体で認識されるタンパク質、すなわちＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂを発現する細胞は骨髄に存在することが判明した。また、脾臓でも当該タンパク質がわずかながら認められた。

【0102】

次に、マウスの各臓器、すなわちマウス大腿骨の骨髄、脾臓、胸腺、および腸管膜リンパ節それぞれから組織抽出液を調製し、抗Ｍｙｌ９／１２抗体を用いたイムノブロッティングにより、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂの発現レベルを検討した。具体的には、マウス大腿骨の骨髄、脾臓、胸腺、および腸管膜リンパ節をプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ社）含有の溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＮａＮ_３、１０％ グリセロール、１％ トリトン−Ｘ１００^登録商標）を用いて溶解した。骨髄は溶解前にコラゲナーゼ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ社）で処理したものを用いた。得られた各組織抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離処理後、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ社）へ転写した。一次抗体には、ウサギ抗Ｍｙｌ９抗体（Ａｂｃａｍ社）およびマウス抗α−チューブリン抗体（ＮｅｏＭａｒｃｋｅｒｓ社）を用いた。二次抗体にはそれぞれＨＲＰ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（ＣＳＴ社）および抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＥＣＬ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア社）を用いてＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ＋（ＢｉｏＲａｄ社）により各タンパク質を検出した。

【0103】

図３Ｂに示すように、骨髄細胞抽出液に抗Ｍｙｌ９／１２抗体で認識されるタンパク質、すなわちＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂの高い発現が認められた。

【0104】

さらに、骨髄中に存在するＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂ発現細胞を免疫染色法により解析した。具体的には、骨髄組織切片を上記同様に処理し、蛍光色素を用いて免疫染色を行った。

【0105】

図３Ｃに示すように、巨核球（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ）および類洞血管内皮細胞が、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂを発現していることがわかった。

【0106】

また、巨核球および類洞血管内皮細胞におけるＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂのｍＲＮＡ発現量を測定した。比較対象としてＢ細胞および全細胞についても、これらｍＲＮＡの測定を行った。具体的には、マウス大腿骨の骨髄をコラゲナーゼ ＩＶ処理後、抗血管内皮カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ）抗体、抗ＴＥＲ１１９抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗Ｇｒ１抗体、抗ＴＣＲβ抗体、および抗Ｂ２２０抗体を用いて、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ^＋ＰＥＣＡＭ^＋ＣＤ４５⁻ＴＥＲ１１９⁻細胞、ＣＤ４１^＋ＣＤ６１^＋ＣＤ１９⁻Ｇｒ１⁻ＴＣＲβ⁻細胞、およびＢ２２０^＋細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ^ＴＭ セルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により単離し、それぞれ類洞血管内皮細胞、巨核球、およびＢ細胞として用いた。

【0107】

これら各細胞と骨髄細胞（Ｗｈｏｌｅ）をＴＲＩｚｏｌ^登録商標（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で処理して全ＲＮＡを調整し、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐ^登録商標 ＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲによる解析を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ^登録商標 ７５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムにより行った。解析に用いたＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂの各ＴａｑＭａｎプローブはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。また、β−アクチンの検出にはＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社のプローブとプライマー（β−Ａｃｔｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧ−３´（配列番号２２）およびβ−Ａｃｔｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ：５´−ＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡ（配列番号２３））を用いた。

【0108】

図３Ｄに示すように、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂの発現は、いずれも類洞血管内皮細胞で高いことが判明した。また、Ｍｙｌ１２ｂは巨核球でも高い発現が認められた。

【0109】

さらに、フローサイトメーターにより細胞表面上に発現するＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂを調べた。具体的には、マウス大腿骨を抗ＶＥ−カドヘリン抗体および抗Ｍｙｌ９／１２抗体を用いて染色を行った。ヨウ化プロビジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ社）を用いてＰＩ⁻の生細胞を検出し、骨髄細胞（Ｗｈｏｌｅ）およびＶＥ−カドヘリン^＋類洞血管内皮細胞におけるＭｙｌ９およびＭｙｌ１２の発現をＦＡＣＳＣａｎｔｏ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて解析した。

【0110】

図３Ｅに示すように、骨髄細胞ではＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂの発現はほとんど認められない（左パネル）のに対し、類洞血管内皮細胞（ＶＥ−カドヘリン^＋細胞）ではＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂの発現発現が認められた（右パネル）。

【0111】

また、マウス個体内で細胞表面上にＭｙｌ９またはＭｙｌ１２が発現しているか検討した。具体的には、Ｃｙ５標識した抗Ｍｙｌ９／１２抗体１０μｇをマウス尾静脈から投与し、３０分後の骨髄組織切片を抗ＶＥ−カドヘリン抗体およびＣｅｌｌＭａｓｋ^登録商標（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により免疫染色を行った。

【0112】

図３Ｆに示すように、類洞血管内皮細胞（ＶＥ−カドヘリン^＋細胞）がＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂを発現しており、またその発現はＣｅｌｌＭａｓｋ^＋で示す細胞脂質二重膜の外側、つまり細胞表面であることが判明した。

【実施例4】

【0113】

ＣＤ６９はアレルギー性気道炎症に重要であることが報告されている（非特許文献６）。そこで、ＣＤ６９と結合することが判明したＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂのアレルギー性気道炎症への関与の検討、および抗Ｍｙｌ９／１２抗体の投与による気道炎症への抑制効果の検討を行った。

【0114】

実施例の一部で使用した抗Ｍｙｌ９／１２抗体（ＭＢＬ社）は、ＭＢＬ社に依頼して、Ｍｙｌ９のＮ末側の１〜２７番目個のアミノ酸残基にキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を結合させたペプチドを抗原として用い、ウサギに免疫することにより製造したポリクローナル抗体である。当該ペプチドのアミノ酸配列はＥＦ−ハンドドメインのＮ末側のアミノ酸配列であり、ヒトおよびマウスで保存されており、また、Ｍｙｌ１２ａおよびＭｙｌ１２ｂのＮ末側にも存在する。したがって本抗体は、ヒトおよびマウスのＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂのＮ末側のアミノ酸配列からなるドメインを特異的に認識すると考えられる（図４）。

【0115】

まず、マウスに気道炎症を誘発させ、肺組織切片におけるＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂの発現を調べた。具体的には、Ｄａｙ０およびＤａｙ７に卵白アルブミン（ＯＶＡ）１００μｇ／マウス（Ｓｉｇｍａ社）をアラム４ｍｇ／マウス（Ｔｈｅｒｍｏ社）と共にＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内投与して免疫した。その後、Ｄａｙ１４、１５、および１６にＰＢＳまたは１％ ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ社）を吸入させて感作し、気道炎症を誘導した。ＯＶＡの吸入には超音波式ネブライザーを用いた（Ｏｍｒｏｎ社）。ＰＢＳを吸入させた（Ｃｏｎｔｒｏｌ）マウスをコントロールとして、ＯＶＡを吸入させた（Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）マウスを炎症誘導サンプルとして用いた。吸入暴露４８時間後のＤａｙ１８にマウス肺を４％パラホルムアルデヒドで固定後、３０％スクロースで置換した。一次抗体には、ウサギ抗Ｍｙｌ９抗体（Ａｂｃａｍ社；Ｍｙｌ１２ａおよびＭｙｌ１２ｂも認識する）を用い、二次抗体にはＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。核染色（Ｎｕｃｌｅｕｓ）および脂質染色（細胞質（Ｃｙｔｏｓｏｌ）付近も染まる）の検出には、それぞれＴＯＰＲＯ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＣｅｌｌ Ｍａｓｋ（ＣｅｌｌＭａｓｋ^登録商標 オレンジ プラズマ メンブレン ステイン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。染色手順は説明書に従い、組織学的解析はコンフォーカルレーザー顕微鏡ＬＳＭ７１０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で行った。

【0116】

図５Ａに示すように、炎症誘導されたマウスの肺組織切片では血管内皮細胞表面上にＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂの発現が認められた（中央パネルおよび右パネル）。一方、気道炎症を誘導していないマウスの肺組織切片では発現は認められなかった（図５Ａの左パネル）。

【0117】

次に、気道炎症を誘発させたマウスの肺におけるＭｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、またはＭｙｌ１２ｂの発現をイムノブロッティングにより検討した。具体的には、上記方法と同様の方法で免疫および感作を行ったＣ５７ＢＬ／６マウスの肺をコラゲナーゼ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ社）により処理した後、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ社）含有の溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＮａＮ_３、１０％ グリセロール、１％ トリトン−Ｘ１００^登録商標）を用いて溶解した。得られた肺抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ社）へ転写した。一次抗体には、ウサギ抗Ｍｙｌ９抗体（Ａｂｃａｍ社）およびマウス抗α−チューブリン抗体（ＮｅｏＭａｒｃｋｅｒｓ社）を用いた。二次抗体にはそれぞれＨＲＰ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（ＣＳＴ社）および抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＥＣＬ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア社）を用いてＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ＋（ＢｉｏＲａｄ社）により各タンパク質を検出した。

【0118】

図５Ｂに示すように、炎症非誘導肺抽出液と比較して、炎症誘導肺抽出液においてＭｙｌ９／１２ａ／１２ｂの発現の増加が認められた。

【0119】

上記結果から、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂは、ＣＤ６９が関与するアレルギー性気道炎症に寄与すると考えることができる。

【0120】

そこで、抗Ｍｙｌ９／１２抗体の投与により気道炎症が抑制されるのか検討を行った。まず、Ｄａｙ０およびＤａｙ７にＢＡＬＢ／ｃマウスにＯＶＡ １００μｇ／マウス（Ｓｉｇｍａ社）をアラム４ｍｇ／マウス（Ｔｈｅｒｍｏ社）と共にを腹腔内投与して免疫し、Ｄａｙ１４およびＤａｙ１６に１％ ＯＶＡ溶液（Ｓｉｇｍａ社）を吸入させ感作させた。ＯＶＡの吸入には超音波式ネブライザーを用いた（Ｏｍｒｏｎ社）。感作１日前のＤａｙ１３およびＤａｙ１５にウサギ抗Ｍｙｌ９／１２抗体（ＭＢＬ社）またはアルメニアン ハムスター抗ＣＤ６９抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）をそれぞれ１００μｇ／マウスを腹腔内投与した。コントロール抗体としてウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を用い、同様に１００μｇ／マウスを腹腔内投与した。Ｄａｙ１７に肺胞洗浄を行い、肺胞洗浄液中の浸潤細胞を抗Ｍｙｌ９／１２抗体投与群、抗ＣＤ６９抗体投与群、コントロール抗体投与群の間で比較した。肺胞洗浄は、マウスにペントバルビタールＮａ（７０−９０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔した後、気道を切開してカニューレ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を挿管し、生理食塩水（大塚製薬）を肺に注入して細胞を回収することにより行った。回収した細胞はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で懸濁し、サイトスピン３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてスライドガラスに貼り付けた。メイ グリュンワルド ギムザ（Ｍａｙ−Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ）（ＭＥＲＣＫ社）試薬を用いてギムザ染色を行い、スライドガラス１枚につき５×１０^２個の細胞を数え、細胞を形態学的基準によって好酸球（Ｅｏ）、好中球（Ｎｅｕ）、リンパ球（Ｌｙｍ）、マクロファージ（ＭΦ）に識別した。

【0121】

図５Ｃに示すように、抗Ｍｙｌ９／１２抗体投与群では、抗ＣＤ６９抗体投与群と同程度に、浸潤細胞の中の好酸球、好中球、リンパ球、マクロファージが有意に減少していた。また、Ｄａｙ１７にメサコリン誘導性の気道抵抗の上昇を測定した結果、コントロール抗体投与群ではメサコリンの濃度依存的に気道抵抗値が上昇したのに対し、抗Ｍｙｌ９／１２抗体投与群では有意差は認められないものの、気道抵抗値が低下していた（データ非開示）。

【0122】

以上の結果から、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂは、炎症誘導された血管内皮細胞に特異的に発現し、また、抗Ｍｙｌ９／１２抗体投与により気道炎症が減弱することが示唆された。

【産業上の利用可能性】

【0123】

本発明に係る抗ミオシン調節軽鎖ポリペプチド抗体を含む組成物は、炎症疾患の治療に有用であり、また、本発明に係る化合物の同定方法は炎症疾患の治療用組成物の有効成分となる候補化合物の同定に有用である。このように、本発明は炎症疾患に係る医薬の開発やその治療などの医療分野において有用である。

【配列表フリーテキスト】

【0124】

配列番号１：（１）：（５１９）コード領域。
配列番号１：ヒトＭｙｌ９ アイソフォームａをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号３：（１）：（３５７）コード領域。
配列番号３：ヒトＭｙｌ９ アイソフォームｂをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号５：（１）：（５１６）コード領域。
配列番号５：ヒトＭｙｌ１２ アイソフォームａをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号７：（１）：（５１９）コード領域。
配列番号７：ヒトＭｙｌ１２ アイソフォームｂをコードする転写変異体１のヌクレオチド配列。
配列番号９：（１）：（５１９）コード領域。
配列番号９：ヒトＭｙｌ１２ アイソフォームｂをコードする転写変異体２のヌクレオチド配列。
配列番号１１：（１）：（５１９）コード領域。
配列番号１１：ヒトＭｙｌ１２ アイソフォームｂをコードする転写変異体３のヌクレオチド配列。
配列番号１３：（１）：（５１９）コード領域。
配列番号１３：マウスＭｙｌ９をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１５：（１）：（５１９）コード領域。
配列番号１５：マウスＭｙｌ１２ アイソフォームａをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１７：（１）：（５１９）コード領域。
配列番号１７：マウスＭｙｌ１２ アイソフォームｂをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号１９：（１）：（６００）コード領域。
配列番号１９：ヒトＣＤ６９をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号２１：タグペプチド。
配列番号２２：プライマー用に設計したオリゴヌクレオチド。
配列番号２３：プライマー用に設計したオリゴヌクレオチド。
配列番号２４：Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、およびＭｙｌ１２ｂのＮ末端部分アミノ酸配列に相同性がきわめて高いアミノ酸配列。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]