特許 6404665 蛍光特性を有する複合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6404665

(24)【登録日】2018年9月21日

(45)【発行日】2018年10月10日

(54)【発明の名称】蛍光特性を有する複合体

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/195 20060101AFI20181001BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20181001BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/195ZNA

   !C12N15/31

【請求項の数】2

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2014-202984(P2014-202984)

(22)【出願日】2014年10月1日

(65)【公開番号】特開2016-69351(P2016-69351A)

(43)【公開日】2016年5月9日

【審査請求日】2017年9月27日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２４年度、独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】304023318

【氏名又は名称】国立大学法人静岡大学

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100124800

【弁理士】

【氏名又は名称】諏澤 勇司

(74)【代理人】

【識別番号】100126653

【弁理士】

【氏名又は名称】木元 克輔

(72)【発明者】

【氏名】成川 礼

(72)【発明者】

【氏名】池内 昌彦

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 守俊

【審査官】 北田 祐介

(56)【参考文献】

【文献】 Wesley D. Swingley et al., Niche adaptation and genome expansion in the chlorophyll d-producing cyanobacterium Acaryochloris marina, PNAS,2008, Vol.105, No.6, p.2005-2010

【文献】 Rei Narikawa et al., A New Type of Dual-Cys Cyanobacteriochrome GAF Domain Found in Cyanobacterium Acaryochloris marina, Which Has an Unusual Red/Blue Reversible Photoconversion Cycle, Biochemistry, 2014.7.16, Vol.53, p.5051-5059

【文献】 Michele E. Auldridge et al., Bacterial phytochromes: More than meets the light, Critical reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2011, Vol.46, No.1, p.67-88

【文献】 Uniprot[online]，Accession No.B0C946, ＵＲＬ: http://www.uniprot.org/uniprot/B0C946.txt?version=46, 公知日2014.6.11(entry version 46), 検索日2018.8.6, Swingley W.D. et al., Definition: Subname: Full=Two-component hybrid sensor and regulator

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／１９５

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質と、ビリベルジンと、が配列番号１に記載のアミノ酸配列の８５番目又はそれに相当するシステインを介して結合し、蛍光特性を有する複合体。

【請求項2】

前記複合体を構成するタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１に記載の複合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、蛍光特性を有する複合体に関する。

【背景技術】

【0002】

光は時間・空間分解能が高く、また、波長及び強度という二つのパラメーターによって細かく制御することができる。そのため、細胞内におけるタンパク質の局在などの測定に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光分子による、光を利用する分子イメージング手法が近年利用されている。しかしながら、細胞に存在する様々な要因（ヘモグロビン、メラニン、水など）により、低波長領域の光の多くは吸収されてしまうことから、低波長領域の光を吸収して蛍光を発するＧＦＰなどの蛍光分子を生体内で利用しようとすると、励起光が蛍光分子まで届きにくく、また蛍光の検出も困難であった。そのため、生体内での分子イメージングには、吸収され難い長波長光吸収型の蛍光分子が望まれている。

【0003】

近年、長波長領域の光を吸収するビリベルジン（ＢＶ）と結合するバクテリオフィトクロムという光受容体が注目されている。バクテリオフィトクロムは、ビリベルジンと共有結合することで、７００ｎｍ及び７５０ｎｍの波長により、可逆的に光変換する光受容体である。非特許文献１及び２には、このバクテリオフィトクロムを用いて、７００ｎｍ付近の波長の光を吸収し、７２５ｎｍ付近の波長の蛍光を発する蛍光プローブが開示されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｆｉｌｏｎｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．２９（２０１１），ｐｐ．７５７〜７６１

【非特許文献2】Ｓｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．３２４（２００９），ｐｐ．８０４〜８０７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、バクテリオフィトクロムを用いた蛍光プローブは、色素を結合するタンパク質領域の分子量が比較的大きく、また、タンパク質が二量体以上の多量体を形成するなどの課題がある。このような課題は、上記蛍光プローブを実用化する上で問題となる。

【0006】

ところで、シアノバクテリアが有するフィトクロム様光受容タンパク質として、シアノバクテリオクロムが知られている。シアノバクテリオクロムは、フィコシアノビリン（ＰＣＢ）及びフィコビオロビリンなどの開環テトラピロールと結合し、紫−青／緑色光、紫／黄色光及び緑／赤色光の間で可逆的に光変換を示す。シアノバクテリオクロムは、２５ｋＤａ程度の発色団結合ドメイン（ＧＡＦドメイン）単量体で色素と結合することができるため、上記のフィトクロムを用いた蛍光プローブよりも低分子で利用できる。しかしながら、フィコシアノビリンよりも長波長領域の光を吸収する色素と結合するシアノバクテリオクロムは従来知られていない。

【0007】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、分子量が小さく単量体で機能し、且つ、長波長領域の光を吸収し、蛍光を発する蛍光プローブとして利用できる複合体を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、特定のシアノバクテリオクロムのＧＡＦドメインがビリベルジンと結合し、長波長領域の光を吸収し、蛍光を発することを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。

【0009】

すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］及び［２］に関する。
［１］配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質と、ビリベルジンと、が配列番号１に記載のアミノ酸配列の８５番目又はそれに相当するシステインを介して結合し、蛍光特性を有する複合体。
［２］前記複合体を構成するタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、［１］に記載の複合体。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、分子量が小さく単量体で機能し、且つ、長波長領域の光を吸収し、蛍光を発する蛍光プローブとして利用できる複合体を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図1は、ＡＭ１＿１５５７ｇ２のＣＢＢ染色及び亜鉛を用いた蛍光染色を示す。

【図2】図２Ａ〜Ｆは、ＡＭ１＿１５５７ｇ２と色素の複合体の吸収スペクトルを示す。Ａ及びＤにおいて、実線はＰｒ型、破線はＰｇ型の吸収スペクトルを示す。Ｂ及びＥにおいて、実線はＰｆｒ型、破線はＰｏ型の吸収スペクトルを示す。Ｃ及びＦにおいて、実線はＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢ、破線はＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶの差スペクトルを示す。図２Ｇ及びＨは、ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢ及びＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶの光変換を示す。図２Ｉは、ＡＭ１＿１５５７ｇ２が各種色素と結合した複合体が示す極大吸収波長を示す。

【図3】図３は、ＡＭ１＿１５５７ｇ２が各種色素と結合した複合体を、光変換させたときの吸収スペクトルを示す。

【図4】図４Ａは、ＡＭ１＿１５５７ｇ２−Ｃ８５ＡのＣＢＢ染色及び亜鉛を用いた蛍光染色を示す。図４Ｂは、ＡＭ１＿１５５７ｇ２−Ｃ８５Ａの吸収スペクトルを示す。Ｂにおいて、実線はＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶのＰｆｒ型、破線はＡＭ１＿１５５７ｇ２−Ｃ８５Ａの吸収スペクトルを示す。

【図5】図５は、ＡＭ１＿１５５７ｇ２が各種色素と結合した複合体を光変換させたときの蛍光スペクトルを示す。図５において、実線はＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶのＰｆｒ型、破線はＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢのＰｒ型の蛍光スペクトルを示す。

【図6】図６Ａ〜Ｃは、ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢ及びフリーのＰＣＢの蛍光変化を示す。Ａ及びＢにおいて、ａはフリーのＰＣＢ、ｂはＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢを示す。図６Ｄ〜Ｆは、ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶ及びフリーのＢＶの蛍光変化を示す。Ｄ及びＥにおいて、ａはフリーのＢＶ、ｂはＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶを示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。

【0013】

本明細書において「蛍光特性」とは、特定の波長領域の光を吸収し、蛍光を発する機能のことである。

【0014】

本実施形態の複合体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質と、ビリベルジンと、が配列番号１に記載のアミノ酸配列の８５番目又はそれに相当するシステインを介して結合し、蛍光特性を有する。

【0015】

本明細書において「相応するシステイン」とは、アミノ酸配列を配列番号１に記載のアミノ酸配列と比較した際に、配列番号１に記載のアミノ酸配列の８５番目のシステインに対応するシステインのことである。

【0016】

蛍光特性を有する複合体を構成するタンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するタンパク質であることが好ましく、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であることがより好ましい。

【0017】

配列番号１に記載のアミノ酸配列は、シアノバクテリウム（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ ＭＢＩＣ１１０１７）由来のシアノバクテリオクロムの２番目のＧＡＦドメインである「ＡＭ１＿１５５７ｇ２」のアミノ酸配列である（以下、配列番号１に記載のアミノ酸配列が示すタンパク質及びこれと９０％以上の同一性を有し、蛍光特性を有するタンパク質を「ＡＭ１＿１５５７ｇ２等」と総称する場合もある。）。

【0018】

ＡＭ１＿１５５７ｇ２等の調製方法については、特に限定されるものではなく、シアノバクテリウムから精製してもよく、化学合成したものでもよく、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質であってもよい。組み換えタンパク質は、ＡＭ１＿１５５７ｇ２等をコードするＤＮＡを適切なベクターに組み入れ、発現系に導入することにより、産生することができる。ＡＭ１＿１５５７ｇ２等の発現系は、特に限定されるものではなく、例えば、大腸菌が挙げられる。

【0019】

ＡＭ１＿１５５７ｇ２は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の８５番目のシステインを介して、色素と結合する。そのため、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質においても、配列番号１に記載のアミノ酸配列の８５番目のシステインに相応するシステインが保存されている必要がある。また、ＡＭ１＿１５５７ｇ２等は、上記システインを有しているため、単量体の状態で色素と結合することができる。

【0020】

ＡＭ１＿１５５７ｇ２等と結合する色素としては、開環テトラピロール類が挙げられる。開環テトラピロール類としては、例えば、フィコシアノビリン（ＰＣＢ）、フィコビオロビリンなどの低波長領域の光を吸収するもの、ビリベルジン（ＢＶ）などの長波長領域の光を吸収するものなどが挙げられる。色素としてＢＶを用いる場合、複合体は６００ｎｍ以上の長波長領域の光を吸収することができる。色素の調製方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ＰＣＢの生合成を可能にするｐＫＴ２７１やＢＶの生合成を可能にするｐＫＴ２７０などのベクターを大腸菌に導入し、発現させてもよい。

【0021】

ＡＭ１＿１５５７ｇ２等とＰＣＢが結合した複合体は、５３０ｎｍ〜５６０ｎｍの波長領域に極大吸収波長を有する緑色光吸収型（Ｐｇ型）、及び６４０ｎｍ〜６６０ｎｍの波長領域に極大吸収波長を有する赤色光吸収型（Ｐｒ型）の二つの形態を有する。この複合体は、Ｐｇ型の時に、５３０ｎｍ〜５６０ｎｍの波長領域の光が照射されることでＰｒ型になり、Ｐｒ型の時に、６４０ｎｍ〜６６０ｎｍの波長領域の光が照射されることでＰｇ型になり、Ｐｇ型とＰｒ型は可逆的に光変換することができる。また、この複合体は、Ｐｒ型の時には６６０ｎｍ〜６９０ｎｍの波長領域に極大蛍光波長を有する蛍光を発し、Ｐｇ型の時にはほぼ蛍光を発しない。

【0022】

ＡＭ１＿１５５７ｇ２等とＢＶが結合した本実施形態の複合体は、６０５ｎｍ〜６３５ｎｍの波長領域に極大吸収波長を有する橙色光吸収型（Ｐｏ型）、及び６９０ｎｍ〜７１０ｎｍの波長領域に極大吸収波長を有する遠赤色光吸収型（Ｐｆｒ型）の二つの形態を有する。本実施形態の複合体は、Ｐｏ型の時に、６０５ｎｍ〜６３５ｎｍの波長領域の光が照射されることでＰｆｒ型になり、Ｐｆｒ型の時に、６９０ｎｍ〜７１０ｎｍの波長領域の光が照射されることでＰｏ型になり、Ｐｏ型とＰｆｒ型は可逆的に光変換することができる。また、本実施形態の複合体は、Ｐｆｒ型の時には７１５ｎｍ〜７４５ｎｍの波長領域に極大蛍光波長を有する蛍光を発し、Ｐｏ型の時にはＰｆｒ型の時よりも蛍光が減少する。

【0023】

複合体の吸収波長及び蛍光波長は、特に限定されるものではないが、例えば、分光器により測定することができる。

【0024】

本実施形態の複合体の作製方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、単離したＡＭ１＿１５５７ｇ２等及びＢＶを混合してもよく、細胞内でＡＭ１＿１５５７ｇ２等及びヘムからＢＶを合成するヘムオキシゲナーゼを同時に発現させてもよく、細胞内で発現させたＡＭ１＿１５５７ｇ２等に外部からＢＶを添加してもよい。

【0025】

本実施形態の複合体は、蛍光特性を有することから蛍光プローブとして利用することができる。例えば、標的タンパク質及びＡＭ１＿１５５７ｇ２等が融合タンパク質として発現するベクターを設計し、これを宿主細胞に導入、発現後、ＢＶと結合させることで、標的タンパク質の局在、挙動などを、発する蛍光により観測することができる。この際のビリベルジンの添加方法については、特に限定されるものではなく、直接細胞に透過させて導入させてもよいし、ＢＶを発現するベクターを組み込んでもよい。本実施形態の複合体は、長波長領域の光を吸収し、遠赤色光の蛍光を発することができるため、励起光や発する蛍光が生体内の要因により吸収され難く、動物体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における蛍光プローブとして、特に有用である。

【0026】

本実施形態の複合体は、照射する光の波長を切り替えることにより、可逆的にＰｏ型とＰｆｒ型とを光変換することができるため、発する蛍光の強度を切り替えられる光スイッチング能を有する。複合体がこの光スイッチング能を有することにより、例えば、移動する生体分子を本実施形態の複合体で標識することで、標識した生体分子の動きを観測した後に、蛍光を減少させることができるため、同一の細胞で何度も繰り返して標識した生体分子の動きを観測することができる。そのため、本実施形態の複合体は、移動する生体分子の分子動態の時間的変化を解析するための蛍光プローブとしても利用することができる。

【実施例】

【0027】

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0028】

＜実施例１：ＡＭ１＿１５５７ｇ２と色素が結合した複合体の確認＞
（ＡＭ１＿１５５７ｇ２の調製）
ＡＭ１＿１５５７ｇ２をコードするＤＮＡは、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ ＭＢＩＣ１１０１７のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、配列番号２及び３に記載の塩基配列のプライマーによりＰＣＲで増幅した。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を、インフュージョンシステム（タカラバイオ社製）を用いて、ｐＥＴ２８ａベクターに導入し、ｐＥＴ２８ａ＿ＡＭ１＿１５５７ｇ２を調製した。

【0029】

（ＡＭ１＿１５５７ｇ２と色素の複合体の調製）
ＢＶ又はＰＣＢの生合成を可能とするｐＫＴ２７０又はｐＫＴ２７１を導入した発現用大腸菌Ｃ４１株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に、ｐＥＴ２８ａ＿ＡＭ１＿１５５７ｇ２を導入し、培養した。大腸菌の細胞内で形成されたＡＭ１＿１５５７ｇ２とＢＶ又はＰＣＢとが結合した複合体は、Ｈｉｓ−Ｔａｇを利用してニッケルアフィニティーカラムにより精製した。

【0030】

（複合体の確認）
ＢＶ又はＰＣＢが結合した複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルをＣＢＢ染色又は亜鉛を用いた蛍光測定に使用した。蛍光染色はＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルを２０μＭの酢酸亜鉛に室温で３０分浸透処理して行われ、その後、蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ ＩＩ、タカラバイオ社製）を用いて蛍光を測定した。

【0031】

ＣＢＢ染色及び蛍光測定の結果を図１に示す。蛍光測定の結果から、ＢＶ及びＰＣＢは、ＡＭ１＿１５５７ｇ２と結合して複合体を形成していることが示された。また、ＣＢＢ染色及び蛍光測定の結果から、ＡＭ１＿１５５７ｇ２とＢＶ又はＰＣＢが結合した複合体は、およそ２５ｋＤａであることが示された。

【0032】

＜実施例２：複合体の吸収スペクトルの測定＞
複合体の吸収波長は、分光光度計（ＵＶ−２６００、島津製作所社製）を用いて、室温で測定した。様々な波長の光は、波長可変光源（Ｏｐｔｏ−Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ、浜松ホトニクス社製）を用いて照射した。タンパク質が変性した複合体の波長は、複合体を８Ｍの尿素（ｐＨ２．０）で変性したものを用いて、測定を行った。

【0033】

ＡＭ１＿１５５７ｇ２とＰＣＢが結合した複合体（ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢ）は、６４９ｎｍに極大吸収波長を有するＰｒ型と５４５ｎｍに極大吸収波長を有するＰｇ型との間で、可逆的に光変換した（図２Ａ）。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢ水溶液は、この光変換に伴い、青色（Ｐｒ型）からピンク色（Ｐｇ型）に変化した（図２Ｇ）。ＡＭ１＿１５５７ｇ２とＢＶが結合した複合体（ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶ）は、６９７ｎｍに極大吸収波長を有するＰｆｒ型と６２２ｎｍに極大吸収波長を有するＰｏ型との間で、可逆的に光変換した（図２Ｂ）。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶ水溶液は、この光変換に伴い、緑色（Ｐｒ型）から青色（Ｐｏ型）に変化した（図２Ｈ）。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶのＰｆｒ型及びＰｏ型の極大吸収波長は、ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢのＰｒ型及びＰｇ型の極大吸収波長から、それぞれ赤色光側に４８ｎｍ及び７７ｎｍシフトしていた（図２Ｉ）。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢのＰｒ型のスペクトルからＰｇ型のスペクトルを引いた差スペクトルをとった結果、６４９ｎｍ及び３５１ｎｍにポジティブピークが確認でき、５４０ｎｍにネガティブピークが確認された（図２Ｃの破線）。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶのＰｆｒ型のスペクトルからＰｏ型のスペクトルを引いた差スペクトルをとった結果、６９９ｎｍ及び３７８ｎｍにポジティブピークが確認でき、６０６ｎｍにネガティブピークが確認された（図２Ｃの実線）。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢ及びＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶを酸処理した結果、それぞれ図２Ｄ及びＥのスペクトルを示した。また、酸処理したＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢ及びＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶの差スペクトルは図２Ｆのようになった。

【0034】

ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢの光変換における吸収スペクトルの変化を測定した結果、５８４ｎｍ及び４４９ｎｍにおいて等吸収点が見られた（図３Ａ）。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶの光変換における吸収スペクトルの変化を測定した結果、６５２ｎｍ及び４８０ｎｍにおいて等吸収点が見られた（図３Ａ）。

【0035】

＜実施例３：ＡＭ１＿１５５７ｇ２と色素の結合位置の探索＞
ＡＭ１＿１５５７ｇ２の８５番目のシステインをアラニンに置換した変異体ＡＭ１＿１５５７ｇ２＿Ｃ８５Ａの作製を行った。ｐＥＴ２８ａ＿ＡＭ１＿１５５７ｇ２を鋳型にして、配列番号４及び５に記載の塩基配列のプライマー及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）に用いてｐＥＴ２８ａ＿ＡＭ１＿１５５７ｇ２＿Ｃ８５Ａを作製した。ｐＫＴ２７０又はｐＫＴ２７１を導入した発現用大腸菌Ｃ４１株で発現させた。発現させたＡＭ１＿１５５７ｇ２＿Ｃ８５Ａを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルをＣＢＢ染色及び亜鉛を用いた蛍光測定に使用した。

【0036】

ＣＢＢ染色ではおよそ２５ｋＤａの位置にＡＭ１＿１５５７ｇ２＿Ｃ８５Ａのバンドが確認できるが、蛍光測定では何も見られなかった（図４Ａ）。また、ＡＭ１＿１５５７ｇ２＿Ｃ８５Ａの吸収スペクトルを測定した結果（実線）、通常のＡＭ１＿１５５７ｇ２のＰｆｒ型（破線）と異なり、ＢＶに由来する吸収スペクトルを示さなくなった（図４Ｂ）。ＡＭ１＿１５５７ｇ２＿Ｃ８５Ａは、ＢＶを発現する大腸菌を用いて作製したにもかかわらず、ＡＭ１＿１５５７ｇ２に対するＢＶの結合も見られず、ＢＶに由来する吸収スペクトルも示さなかったことから、ＡＭ１＿１５５７ｇ２とＢＶの結合には、アミノ酸配列で８５番目のシステインが重要であることが判明した。

【0037】

＜実施例４：複合体の蛍光スペクトルの測定＞
（複合体の蛍光スペクトルの測定）
複合体の蛍光スペクトルは、ＳＩＬＶＥＲ−Ｎｏｖａスペクトロメーター（ＳｔｅｌｌａｒＮｅｔ社製）を用いて測定した。

【0038】

それぞれの複合体の蛍光スペクトルを測定した結果、ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢのＰｒ型（破線）は６７６ｎｍに極大蛍光波長を有し、一方でＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶのＰｆｒ型（実線）は７３０ｎｍに極大蛍光波長を有していた（図５）。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶの蛍光極大波長はＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢの蛍光極大波長よりも、赤色光側に５４ｎｍシフトしていた。

【0039】

（複合体の光スイッチング能の測定）
複合体の蛍光イメージは、ＣＣＤカメラ（Ｒｏｌｅｒａ−ＸＲ Ｆａｓｔ １３９４、Ｑ−ｉｍａｇｉｎｇ社製）を備えた蛍光顕微鏡（ＭＶＸ１０、オリンパス社製）で測定した。ＣＣＤカメラは、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で制御した。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢは、６５５±２０ｎｍの波長の光で励起し、７１６±２０ｎｍの光を透過するフィルターを用いて蛍光イメージを測定した。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶは、７１０±３７．５ｎｍの波長の光で励起し、８１０±４５ｎｍの光を透過するフィルターを用いて蛍光イメージを測定した。タイムラプス撮影は５０ｍｓの露光時間で、５００ｍｓ間隔で行った。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢの蛍光イメージは、６５５±２０ｎｍの赤色光を常時照射しておき、時々５１０±２０ｎｍの緑色光を照射した時に発する蛍光を測定した。ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶの蛍光イメージは、７１０±３７．５ｎｍの遠赤色光を常時照射しておき、時々５９０±２０ｎｍの橙色光を照射した時に発する蛍光を測定した。

【0040】

フリーのＰＣＢ（図中ａ）及びＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢ（図中ｂ）は、透過光では変化しないが、緑色光を照射するとＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢのみ蛍光を発した（図６Ａ及びＢ）。また、ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＰＣＢがＰｇ型の時に緑色光を照射すると、Ｐｒ型に光変換して蛍光を発するようになるが、緑色光から赤色光に切り替えると、Ｐｒ型から再びＰｇ型に光変換し、蛍光はほとんど発しなくなった（図６Ｃ）。

【0041】

フリーのＢＶ（図中ａ）及びＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶ（図中ｂ）は、透過光では変化しないが、橙色光を照射するとＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶのみ蛍光を発した（図６Ｄ及びＥ）。また、ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶがＰｏ型の時に橙色光を照射すると、Ｐｆｒ型に光変換して蛍光を発するようになるが、橙色光から遠赤色光に切り替えると、Ｐｆｒ型から再びＰｏ型に光変換し、蛍光強度は減少した（図６Ｆ）。

【0042】

ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶは、照射する光の波長を切り替えることで、繰り返し光変換することができた。さらにＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶは、光変換を繰り返しても、蛍光強度には影響がなかった。そのため、ＡＭ１＿１５５７ｇ２−ＢＶは、優れた光スイッチング能を有しているといえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]