特許 6404687 蛍光イメージング装置及び蛍光イメージング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6404687

(24)【登録日】2018年9月21日

(45)【発行日】2018年10月10日

(54)【発明の名称】蛍光イメージング装置及び蛍光イメージング方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/64 20060101AFI20181001BHJP

【ＦＩ】

   G01N21/64 Z

【請求項の数】6

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2014-237133(P2014-237133)

(22)【出願日】2014年11月21日

(65)【公開番号】特開2016-99253(P2016-99253A)

(43)【公開日】2016年5月30日

【審査請求日】2017年6月14日

(73)【特許権者】

【識別番号】000001096

【氏名又は名称】倉敷紡績株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000040

【氏名又は名称】特許業務法人池内・佐藤アンドパートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】丸岡 弘規

(72)【発明者】

【氏名】南條 祐子

(72)【発明者】

【氏名】松本 勇樹

(72)【発明者】

【氏名】谷口 博文

(72)【発明者】

【氏名】高田 仁夫

【審査官】 吉田 将志

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−２８７９６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−２１１４４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−１３９１７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５１００７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／００９９２６４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１４０２１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／００６５４４０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−０９６９２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５２２１５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０１４５７８６（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２１／６２−７４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

蛍光物質を有する生体又は生体から摘出された組織である被検体に励起光を照射する照射手段と、
前記被検体より発せられた蛍光を複数の波長に分光する分光手段と、
前記分光された各波長の蛍光画像を取得する撮像手段と、
前記蛍光画像を解析する解析手段を含み、
前記解析手段は、予め記憶された基準データを備えており、前記基準データは、被検体における蛍光物質の蛍光のスペクトルデータと、生体が摂取した状態における飼料の蛍光のスペクトルデータ及び／又は生体に溜まった尿の蛍光のスペクトルデータを含み、前記蛍光画像と前記基準データを用いてノイズ除去処理を行い、
前記ノイズ除去処理で除去されるノイズは、生体が摂取した状態における飼料の蛍光及び／又は生体に溜まった尿の蛍光を含むことを特徴とする蛍光イメージング装置。

【請求項2】

前記ノイズ除去処理で除去されるノイズは、さらに生体又は生体から摘出された組織の自家蛍光を含む請求項１に記載の蛍光イメージング装置。

【請求項3】

前記ノイズ除去処理は、前記蛍光画像から前記ノイズを除去して目的の蛍光物質の蛍光成分のみを抽出する処理である請求項１又は２に記載の蛍光イメージング装置。

【請求項4】

蛍光物質を有する生体又は生体から摘出された組織である被検体に励起光を照射する工程と、
前記被検体より発せられた蛍光を複数の波長に分光する工程と、
前記分光された各波長の蛍光画像を取得する工程と、
前記蛍光画像を解析する工程を含み、
前記解析は、前記蛍光画像と予め記憶された基準データを用いたノイズ除去処理を行い、
前記基準データは、被検体における蛍光物質の蛍光のスペクトルデータと、生体が摂取した状態における飼料の蛍光のスペクトルデータ及び／又は生体に溜まった尿の蛍光のスペクトルデータを含み、
前記ノイズ除去処理で除去されるノイズは、生体が摂取した状態における飼料の蛍光及び／又は生体に溜まった尿の蛍光を含むことを特徴とする蛍光イメージング方法。

【請求項5】

前記ノイズ除去処理で除去されるノイズは、さらに生体又は生体から摘出された組織の自家蛍光を含む請求項４に記載の蛍光イメージング方法。

【請求項6】

前記ノイズ除去処理は、前記蛍光画像から前記ノイズを除去して目的の蛍光物質の蛍光成分のみを抽出する処理である請求項４又は５に記載の蛍光イメージング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体を対象とする蛍光イメージング装置及び蛍光イメージング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生体の炎症部位や腫瘍などの疾患部位の細胞に結合する蛍光色素や蛍光タンパク質などの蛍光物質を用い、炎症部位や腫瘍などの疾患部位の特定や経時変化を画像化するのに蛍光イメージング装置が用いられている。蛍光イメージング装置では、通常、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)カメラなどの撮像手段により蛍光を画像化しているが、得られた蛍光画像は、観察対象である蛍光物質の蛍光に加えて、ノイズである生体組織固有の自家蛍光を含んでいる。また、飼料の蛍光、尿の蛍光などのノイズを含む場合もある。

【0003】

ノイズを除去する方法として、マルチスペクトル解析を行うことが知られている。マルチスペクトル解析では、生体より発せられた蛍光を複数の波長に分光し、撮像して得られた複数の蛍光画像を画素単位でスペクトル解析することで、蛍光物質の蛍光か、それともノイズかを判別する。その際、判別の基準となるスペクトルデータが必要となる。従来は、例えば、作業者が撮像して得られた蛍光画像上で観察対象である蛍光物質由来の蛍光や自家蛍光と思われる部位をそれぞれ選択するティーチング作業により、基準となるスペクトルデータを登録する手法が用いられた。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかし、撮像した後に、ティーチング作業により基準となるスペクトルデータを決定する方法では、観察対象である蛍光物質の蛍光が微弱で自家蛍光に隠れてしまっている場合や、観察対象である蛍光物質が光っている部位が分かっていない場合などには、正確なティーチング作業ができないという問題がある。また、ノイズの種類が自家蛍光以外にも複数ある場合、ノイズの種類毎にティーチング作業を行う必要があり、ノイズ除去処理が煩雑となる。

【0005】

本発明は、上記従来の問題を解決するため、蛍光画像解析において正確かつ簡便にノイズを除去することができる蛍光イメージング装置及び蛍光イメージング方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、蛍光物質を有する生体又は生体から摘出された組織である被検体に励起光を照射する照射手段と、上記被検体より発せられた蛍光を複数の波長に分光する分光手段と、上記分光された各波長の蛍光画像を取得する撮像手段と、上記蛍光画像を解析する解析手段を含み、上記解析手段は、基準データを備えており、上記基準データは、被検体における蛍光物質の蛍光のスペクトルデータと、生体が摂取した状態における飼料の蛍光のスペクトルデータ及び／又は生体に溜まった尿の蛍光のスペクトルデータを含み、上記蛍光画像と上記基準データを用いてノイズ除去処理を行い、上記ノイズ除去処理で除去されるノイズは、生体が摂取した状態における飼料の蛍光及び／又は生体に溜まった尿の蛍光を含むことを特徴とする蛍光イメージング装置に関する。

【0007】

本発明は、蛍光物質を有する生体又は生体から摘出された組織である被検体に励起光を照射する工程と、上記被検体より発せられた蛍光を複数の波長に分光する工程と、上記分光された各波長の蛍光画像を取得する工程と、上記蛍光画像を解析する工程を含み、上記解析は、上記蛍光画像と予め記憶された基準データを用いたノイズ除去処理を行い、上記基準データは、被検体における蛍光物質の蛍光のスペクトルデータと、生体が摂取した状態における飼料の蛍光のスペクトルデータ及び／又は生体に溜まった尿の蛍光のスペクトルデータを含み、上記ノイズ除去処理で除去されるノイズは、生体が摂取した状態における飼料の蛍光及び／又は生体に溜まった尿の蛍光を含むことを特徴とする蛍光イメージング方法。

【0008】

上記ノイズ除去処理で除去されるノイズは、さらに生体又は生体から摘出された組織の自家蛍光を含むことが好ましい。上記ノイズ除去処理は、上記蛍光画像から上記ノイズを除去して目的の蛍光物質の蛍光成分のみを抽出する処理であることが好ましい。

【発明の効果】

【0009】

本発明は、解析手段が少なくとも生体における蛍光物質の蛍光のスペクトルデータを含む基準データを予め備え、蛍光画像と基準データを用いて多成分解析を行うことで、正確かつ簡便にノイズを除去することができる蛍光イメージング装置を提供する。また、本発明は、蛍光画像の解析において、蛍光画像と少なくとも生体における蛍光物質の蛍光のスペクトルデータを含む基準データを用い、多成分解析を行うことで、正確かつ簡便にノイズを除去することができる蛍光イメージング方法を提供する。具体的には、多成分解析処理において、予め記憶した基準データを用い、蛍光物質の種類やノイズの種類を選択するたけで、ティーチング作業なしに、正確かつ簡便に様々な種類のノイズを除去することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は本発明の一実施例の蛍光イメージング装置の模式的説明図である。

【図2】図２は蛍光物質の蛍光と自家蛍光が混ざったスペクトルデータ、自家蛍光のスペクトルデータ、蛍光物質の蛍光のスペクトルデータを示す図である。

【図3】図３Ａは蛍光物質を皮下に投与されたマウスにおけるマルチスペクトル蛍光画像であり、図３Ｂは図３Ａの蛍光画像から自家蛍光を除去して作成した蛍光物質の蛍光画像であり、図３Ｃは図３Ｂの蛍光画像をマウスの明視野画像と重ね合せた画像である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明の蛍光イメージング装置は、蛍光物質を有する被検体をin vivoで観察し、様々な薬剤や腫瘍、炎症などの疾患の生理学的、病理学的、薬理学的影響を研究することができる。被検体は、特に限定されず、生体及び生体から摘出された組織のいずれであってもよい。生体は、特に限定されず、例えば、動物、植物、昆虫、魚類等が挙げられる。動物としては、特に限定されず、例えば、マウス、ラット、カエル、ヤモリ、イモリ、線虫等が挙げられる。動物は人体であってもよい。植物としては、特に限定されず、例えば、稲、シロイヌナズナ、タバコ等が挙げられる。被検体は、観察しやすい観点から、マウス、ラットなどの小動物であることが好ましい。被検体自体が細胞、組織などに蛍光物質を有してもよく、蛍光イメージング観察する前に、被検体の体内に蛍光物質を導入してもよい。蛍光物質の導入は、特に限定されないが、動物の場合、例えば、皮下、静脈、腹腔などからの投与によって行うことができる。

【0012】

上記蛍光物質としては、特定の波長の光に曝して励起した時に、励起光とは異なる波長の光を放出する蛍光成分を有するものであればよく、特に限定されない。上記蛍光物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質、及びこれらを含む蛍光試薬などが挙げられる。また、上記蛍光物質は、蛍光色素や蛍光タンパク質で標識した細胞なども含む。上記蛍光物質は、生体の炎症部位や腫瘍などの疾患部位の細胞や組織に結合又は集積する。蛍光色素は、特に限定されないが、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、タマリン類、ピレン類、シアニン類に加えて、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒや、Ｑｄｏｔなどが挙げられる。蛍光タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ルマジンタンパク質（ＬｕｍＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などが挙げられる。蛍光試薬としては、例えば、片山化学工業株式会社製の「ＧＬＹＣＯＬＩＰＯ^TMＫシリーズＫ１Ｃｙ３」や、パーキンエルマー社製の「ＩｎｔｅｇｒｉＳｅｎｓｅ７５０」などの各種市販品を用いることができる。また、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質を用いる場合には、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ社製の「ＭＣＦ−７／ＧＦＰ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ」などの各種市販品を用いることができる。

【0013】

以下、図面を用いて本発明の蛍光イメージング装置を説明する。図１は、本発明の一実施例の蛍光イメージング装置の模式的説明図である。図１に示しているように、該実施例の蛍光イメージング装置１は、主に、蛍光物質を有する被検体１０に励起光を照射する照射手段２と、励起光が照射された被検体１０より発せられた蛍光を複数の波長に分光する分光手段３と、分光された各波長の蛍光画像を取得する撮像手段４と、蛍光画像を解析する解析手段５で構成されている。蛍光イメージング装置１は、また、被検体１０が載置される試料台６を備えていてもよい。試料台６は、被検体１０の体温を保持するためのヒーターを備えていることが好ましい。また、試料台６には、外付けの麻酔装置と連結されているマスクが装着されていてもよい。

【0014】

照射手段２は、被検体に励起光を照射することができるものであればよく、特に限定されない。例えば、照射手段２は、光源と励起フィルタからなる励起光源２１と、照射部２２と、励起光源２１からの励起光を照射部２２までにガイドするライトガイド２３で構成することができる。光源としては、例えば、キセノン光源、ハロゲン光源、レーザ光源、水銀ランプ、メタルハライドランプなどを用いることができる。励起フィルタは、観察する蛍光物質に合せて適宜決めればよく、例えば、ＧＦＰを用いる場合は、中心波長４７０ｎｍのバンドパスフィルタなどを用いることができる。照射部２２により、被検体１０に対する励起光の照射方向が決められる。必要に応じて、２方向以上に照射できるように、複数の照射部２２を有してもよい。好ましくは、被検体１０全体に対して一様に励起光を照射するため、被検体１０の斜め上方の４方向から照射してもよい。

【0015】

分光手段３は、励起光を異なる波長の光に分光することができるものであればよく、特に限定されない。例えば、分光手段３としては、複数のバンドパスフィルタを用いることができる。本発明において、「複数」とは、２以上を意味する。特に限定されないが、例えば、多成分解析、例えばマルチスペクトル解析の精度及び速度を両立する観点から、分光手段３は、３以上のバンドパスフィルタで構成されていることが好ましく、より好ましくは４以上のバンドパスフィルタで構成されている。複数のバンドパスフィルタは回転ホルダーにセットして用いることができる。バンドパスフィルタの組み合わせは、観察対象である蛍光物質の蛍光ピーク波長などの条件に合わせて適宜選択すればよく、例えば、３００〜１５００ｎｍ、通常は４００〜１２００ｎｍの範囲における任意の波長を透過するものであればよい。具体的には、蛍光物質がＧＦＰの場合、分光手段３としては、透過波長がそれぞれ５２０ｎｍ、５４０ｎｍ、５６８ｎｍ、６００ｎｍ、６３２ｎｍ、６６０ｎｍｎｍである６種類のハンドパスフィルタを回転ホルダーにセットしたものを用いることができる。

【0016】

撮像手段４は、被検体１０からの蛍光を検出して画像化することができるものであればよく、特に限定されない。撮像手段４としては、例えば、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ等にレンズを組み合わせて用いることができる。ＣＣＤカメラとしては、ペルチェ冷却式高感度ＣＣＤカメラを用いてもよい。

【0017】

蛍光イメージング装置１において、照射部２２、分光手段３、撮像手段４、試料台６は、暗箱７の中に配置されている。

【0018】

解析手段５は、蛍光画像に対して多成分解析処理、例えばマルチスペクトル解析を行うことができるものであればよく、特に限定されない。本発明において、解析手段５は、基準データ４０を備えている。基準データ４０は、解析手段５に予め記憶されたものであり、被検体における蛍光物質の蛍光のスペクトルデータを含む。基準データ４０は、被検体における蛍光物質の蛍光のスペクトルデータに加えて、被検体を蛍光イメージング方法で観察する際の主なノイズ、具体的には、被検体の自家蛍光のスペクトルデータを含むことが好ましい。また、基準データ４０は、必要に応じて、被検体が摂取する飼料の蛍光のスペクトルデータ、被検体の老廃物（尿など）の蛍光のスペクトルデータを含むことが好ましい。基準データ４０は、被検体の種類ごとの被検体における蛍光物質の蛍光のスペクトルデータ、被検体の自家蛍光のスペクトルデータ、被検体が摂取する飼料の蛍光のスペクトルデータ、被検体の老廃物（尿など）の蛍光のスペクトルデータであってもよい。このように、観察条件に合わせて基準データ４０を作成しておくことで、多成分解析処理の精度が高くなる。解析手段５は、さらに、蛍光画像記憶部や蛍光画像表示部を有することが好ましい。解析手段５としては、例えば、多成分解析処理を行うプログラムと、基準データ、蛍光画像記憶部及び蛍光画像表示部を備えているコンピュータを用いることができる。蛍光画像表示部には、液晶モニタなどの表示手段を用いることができる。本発明において、特に指摘がない場合、「被検体の自家蛍光」は、生体組織固有の自家蛍光を意味する。例えば、皮膚由来の蛍光、臓器由来の蛍光などである。

【0019】

解析手段５が行う多成分解析処理は、ノイズ除去処理又は蛍光成分分離処理であることが好ましい。ノイズ除去処理は基準データ４０を用いて蛍光画像からノイズを除去し、目的の蛍光物質の蛍光成分のみを抽出する処理である。また、蛍光成分分離処理は、蛍光画像から１種類以上の蛍光物質の蛍光を分離する処理である。基準データ４０に複数の蛍光物質の蛍光のスペクトルデータを登録しておけば、複数の種類の目的の蛍光物質の蛍光に分離することができる。

【0020】

基準データ４０の作成の一例として、マウスを被検体とする基準データ４０の作成について以下に説明する。

【0021】

＜基準データ４０の作成の一例＞
（１）ガラス管にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した所定の濃度の蛍光物質を充填してマウスの皮下に挿入した後、撮像し、得られた蛍光画像上で蛍光物質が光っている部位を選択し、蛍光物質の蛍光とマウスの自家蛍光が混ざったスペクトルデータを取得する。
（２）次に、同様のガラス管に蛍光物質を希釈するのに用いたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を充填して上記（１）の場合と同じ部位に挿入し、撮像し、得られた蛍光画像上で上記（１）において選択した部位と同じ部位を選択し、マウスの自家蛍光のスペクトルデータを取得する。該スペクトルデータを、解析手段に、マウスの自家蛍光のスペクトルデータ（基準データ）として登録する。
このように、ガラス管を挿入する方法を用いることで、略同じ時間の、略同じ部位における、蛍光物質と自家蛍光の混合スペクトルデータ及び自家蛍光のみのスペクトルデータを取得することができる。蛍光物質の蛍光や自家蛍光は経時変化するとともに、部位によっても強度が異なる。上記の方法で同時刻・同部位の２つのスペクトルデータを取得することで、マウスなどの被検体における蛍光物質のスペクトルデータの真値を得ることができる。また、下記（３）で説明するスペクトルデータを差し引きする処理の際に、波形がクリップしないように蛍光の強度を本来の強度から増減する処理（レベル補正）が不要となる。
（３）次に、蛍光物質の蛍光とマウスの自家蛍光が混ざったスペクトルデータからマウスの自家蛍光のスペクトルデータを差し引いて、蛍光物質の蛍光のスペクトルデータを取得する。このときレベル補正が不要なため、正確な蛍光物質の蛍光のスペクトルデータを取得することができる。該スペクトルデータを、解析手段に、蛍光物質の蛍光のスペクトルデータ（基準データ）として登録する。このように作成した蛍光物質の蛍光のスペクトルデータ（基準データ）は、マウスの皮膚を透過して得られた蛍光物質の蛍光のスペクトルデータであり、生体に投与された状態の蛍光物質の蛍光のスペクトルをほぼ正確に再現しており、解析の精度が高くなる。
なお、上記（１）〜（３）の手順を蛍光物質の種類を変えて複数回行い、複数の蛍光物質の蛍光のスペクトルデータ（基準データ）を登録することもできる。例えば、複数の蛍光色素や蛍光タンパク質の蛍光のスペクトルデータをそれぞれ基準データに登録しておいてもよい。
（４）また、飼料を食べさせたマウスを撮像し、得られた蛍光画像上で飼料が光っている部位を選択し、スペクトルデータを取得する。得られたスペクトルデータを飼料の蛍光のスペクトルデータ（基準データ）として登録する。このように作成した飼料の蛍光のスペクトルデータ（基準データ）は、生体が摂取した状態、即ち生体における飼料の蛍光のスペクトルデータであり、精度が高くなる。
（５）また、尿が溜まった状態でマウスを撮像し、得られた蛍光画像上で尿が光っている部位を選択し、スペクトルデータを取得する。得られたスペクトルデータを尿の蛍光のスペクトルデータ（基準データ）として登録する。

【0022】

照射手段２により蛍光物質を有する被検体に励起光を照射し、上記励起光で照射された被検体より発せられた蛍光を分光手段３により複数の波長に分光し、上記分光された各波長の蛍光画像を撮像手段３により取得し、解析手段５により上記蛍光画像に対して多成分解析処理を行う。

【0023】

上記多成分解析処理は、蛍光画像と、予め記憶された基準データを用いて行う。基準データとして１種類の蛍光物質の蛍光のスペクトルデータ及び自家蛍光のスペクトルデータを備えている場合について説明する。具体的には、解析手段５における基準データ４０を呼び出し、蛍光画像における各画素ごとのスペクトルデータと、基準データ４０における蛍光物質の蛍光のスペクトルデータ及び自家蛍光のスペクトルデータを比較し、蛍光の種類（蛍光物質の蛍光又は自家蛍光）を判別する。例えば、分光手段がｎ種類のバンドパスフィルタである場合、蛍光物質の蛍光のスペクトル（発光スペクトル）及び自家蛍光のスペクトル（発光スペクトル）は、それぞれ、下記式（１）及び（２）で示される。

【0024】

蛍光物質の発光スペクトル：ｋ（λ１）、ｋ（λ２）・・・ｋ（λｎ） （１）
自家蛍光の発光スペクトル：ｇ（λ１）、ｇ（λ２）・・・ｇ（λｎ） （２）

【0025】

そして、蛍光画像が蛍光物質の蛍光と自家蛍光の線形加算によるものと仮定した場合、蛍光画像のスペクトルデータ（蛍光物質の蛍光と自家蛍光が混ざったスペクトルデータ）は、下記式（３）で示される。

【0026】

蛍光画像のスペクトルデータ：ｍ（λ１）＝ａ×ｋ（λ１）＋ｂ×ｇ（λ１）、
ｍ（λ２）＝ａ×ｋ（λ２）＋ｂ×ｇ（λ２）、
・・・
ｍ（λｎ）＝ａ×ｋ（λｎ）＋ｂ×ｇ（λｎ） （３）
上記式（３）において、ａは蛍光物質の蛍光の線形加算係数、ｂは自家蛍光の線形加算係数である。

【0027】

上記式（３）に対し、最小二乗法を用いて、蛍光物質の蛍光の線形加算係数ａ、自家蛍光の線形加算係数ｂを求めることができる。同様の手法で、飼料の蛍光の線形加算係数、尿の蛍光の線形加算係数を求めることができる。判別した結果に基づいて、上記蛍光画像から、自家蛍光などのノイズを除去し、蛍光物質の蛍光のみからなる画像を作成する。そして、蛍光物質の蛍光のみからなる画像と被検体、例えばマウスの明視野画像を重ね合せることで、被検体、例えばマウスにおける蛍光物質の蛍光画像が得られる。なお、蛍光の種類（蛍光物質の蛍光又は自家蛍光）を判別する手法は、最小二乗法に限定されない。

【実施例】

【0028】

以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

【0029】

＜基準データの作成＞
被検体としてマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ系統、♀、４週齢）を用い、蛍光物質としてＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ社製の「ＭＣＦ−７／ＧＦＰ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ」を用いた。

【0030】

（Ｉ）照射手段２：励起光源２１、照射部２２（マウスの斜め上方４方向からマウスの身体全体に出来るだけ均一に励起光が当たるような位置にセットした。）、ライドガイド２３
（II）分光手段３：回転ホルダーにセットした６枚のバンドパスフィルタ（透過波長は、それぞれ、５２０ｎｍ、５４０ｎｍ、５６８ｎｍ、６００ｎｍ、６３２ｎｍ、６６０ｎｍｎｍである）
（III）撮像手段４：ペルチェ冷却式高感度ＣＣＤカメラ（１４０万画素）
（IV）解析手段５：外部コンピュータ。蛍光画像表示部（図示無い）として外部コンピュータに接続した表示手段（液晶モニタ）を備える。蛍光画像表示部には蛍光画像のほか、解析に必要な各種情報を表示することができる。
（Ｖ）試料台６：ヒーターを内蔵し、外部の麻酔装置と連結されているマスクを備えていた。
（ＶＩ）明視野撮影用のＬＥＤ照明（図示無い）
蛍光イメージング装置１００において、解析手段５、励起光源２１以外は、暗箱７の内部に配置されていた。なお、解析手段５として用いる外部コンピュータは、照射手段２、分光手段３と連結され、これらの機能を制御する制御部を備えている。暗箱７の内部には、励起光照射手段とは別に、白色ＬＥＤ光源からなる明視野撮影用の照明を備えており、必要に応じてマウスの明視野画像を撮影できる。

【0031】

（１）ガラス管にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した蛍光物質（ＭＣＦ７／ＧＦＰ細胞を５０００個／μＬになるようＰＢＳで調整した１０μＬの懸濁液）を充填してマウスの皮下に挿入した後、撮像した。得られた蛍光画像上で蛍光物質が光っている部位を選択し、図２に示すスペクトルデータＡを取得した。スペクトルデータＡは、蛍光物質の蛍光とマウスの自家蛍光が混ざったスペクトルデータであった。マウスは麻酔された状態であった。以下でも同様である。
（２）次に、同様のガラス管に蛍光物質を希釈するのに用いたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を充填して上記（１）の場合と同じ部位に挿入し、撮像した。得られた蛍光画像上で上記（１）において蛍光物質が光っている部位と同じ部位を選択し、図２に示すスペクトルデータＢを取得した。スペクトルデータＢは、マウスの自家蛍光のスペクトルデータである。スペクトルデータＢを、解析手段５に、マウスの自家蛍光のスペクトルデータ（基準データ）として登録した。
（３）次に、スペクトルデータＡからスペクトルデータＢを差し引いて、図２に示すスペクトルデータＣを得た。スペクトルデータＣは、蛍光物質の蛍光のスペクトルデータである。スペクトルデータＣを、解析手段５に、蛍光物質の蛍光のスペクトルデータ（基準データ）として登録した。
（４）また、飼料を食べさせたマウスを撮像し、得られた蛍光画像上で飼料が光っている部位を選択し、スペクトルデータを取得した（図示無し）。得られたスペクトルデータを、解析手段５に、飼料の蛍光のスペクトルデータ（基準データ）として登録した。
（５）また、尿が溜まった状態でマウスを撮像し、得られた蛍光画像上で尿が光っている部位を選択し、スペクトルデータを取得した（図示無し）。得られたスペクトルデータを解析手段５に、尿の蛍光のスペクトルデータ（基準データ）として登録した。
上記において、スペクトルデータは６波長のシグナル値からなる波形データであった。上記のように解析手段５に基準データを登録することにより、図１に示す構成の蛍光イメージング装置とした。

【0032】

（実施例１）
実施例１では、上述したようにして、基準データ４０を登録した図１に示す蛍光イメージング装置を用いた。まず、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ系統、♀、４週齢）に麻酔をかけた後、蛍光物質（ＭＣＦ７／ＧＦＰ細胞を１０００個／μＬになるようＰＢＳで調整した５０μＬの懸濁液）を体内に投与し、試料台６の上にマウス１０を固定し、マスクを装着した。マウス１０に照射手段２の照射部２２より、励起光を４方向にて照射し、分光手段３の回転ホルダーを回転させてフィルタを切り替えながら各波長（５２０ｎｍ、５４０ｎｍ、５６８ｎｍ、６００ｎｍ、６３２ｎｍ、６６０ｎｍｎｍ）の画像を撮像手段４にて順番に撮像し、図３Ａに示す蛍光画像を得た。解析手段５における基準データ４０を呼び出し、図３Ａに示す蛍光画像における各画素ごとのスペクトルデータと基準データを比較し、上記で説明した多成分解析処理を行うことにより、蛍光の種類（蛍光物質の蛍光、自家蛍光、飼料の蛍光、尿の蛍光）を判別し、判別した結果に基づいて、図３Ａに示す蛍光画像から、自家蛍光などのノイズを除去し、図３Ｂに示す蛍光物質の蛍光のみからなる画像を作成した。次に、蛍光物質の蛍光のみからなる画像とマウスの明視野画像を重ね合せ、マウスにおける腫瘍部位に集積した蛍光物質の蛍光画像を図３Ｃに示した。

【0033】

上述したとおり、本発明では、予め記憶された被検体（生体）における蛍光物質の蛍光のスペクトルデータ及び被検体の自家蛍光のスペクトルデータなどの基準データを用いることにより、コントロールの被検体、例えばマウスなどを用いることやティーチング作業を行うことなしに、正確かつ簡便に、様々な種類のノイズを除去し、目的の蛍光物質の蛍光画像を作成することができる。

【符号の説明】

【0034】

１ 蛍光イメージング装置
２ 照射手段
３ 分光手段
４ 撮像手段
５ 解析手段
６ 試料台
７ 暗箱
１０ 蛍光物質を有する被検体
２１ 励起光源
２２ 照射部
２３ ライトガイド
４０ 基準データ

【図1】

【図2】

【図3】