特許 6405242 ＭＩＣＡ結合剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6405242

(24)【登録日】2018年9月21日

(45)【発行日】2018年10月17日

(54)【発明の名称】ＭＩＣＡ結合剤

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20181004BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20181004BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20181004BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20181004BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20181004BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   A61K39/395 T

   A61K39/395 L

   A61K47/68

   A61P35/00

   !C12N15/09 Z

【請求項の数】13

【全頁数】117

(21)【出願番号】特願2014-556052(P2014-556052)

(86)(22)【出願日】2013年2月7日

(65)【公表番号】特表2015-508757(P2015-508757A)

(43)【公表日】2015年3月23日

(86)【国際出願番号】EP2013052439

(87)【国際公開番号】WO2013117647

(87)【国際公開日】20130815

【審査請求日】2016年2月5日

(31)【優先権主張番号】61/595,902

(32)【優先日】2012年2月7日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/625,841

(32)【優先日】2012年4月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506000184

【氏名又は名称】イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＡＴＥ ＰＨＡＲＭＡ ＰＨＡＲＭＡ Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(72)【発明者】

【氏名】マチュー・ブルリー

(72)【発明者】

【氏名】ローラン・ゴーティエ

(72)【発明者】

【氏名】イヴァン・ペロ

(72)【発明者】

【氏名】セシル・ボナフー

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０３６９８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Am. J. Transplant.，２００７年，vol.7, no.7，pp.1842-1848

【文献】 Immunogenetics，２００９年，vol.61, no.2，pp.91-100

【文献】 Hum. Immunol.，２００８年，vol.69, no.12，pp.826-832

【文献】 Trends Mol. Med.，２０１０年，vol.16, no.3，pp.97-106

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現させた細胞、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現させた細胞、配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現させた細胞、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現させた細胞に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＩＣＢポリペプチドにさらに結合する抗体であり、かつ、該抗体と配列番号１の野生型ＭＩＣＡポリペプチドとの間の結合と比べて、Ｅ１００Ａ、Ｄ１０１Ｓ、Ｎ１０２Ａ、Ｓ１０３Ａ、Ｔ１０４Ｓ、Ｒ１０５Ａ、Ｎ１２１Ａ、Ｅ１２３Ｓ、Ｔ１２４ＡおよびＥ１２６Ａからなる群から選択される１、２、３、４つ、またはそれ以上の変異を有する変異体ＭＩＣＡポリペプチドへの低減された結合を有する抗体。

【請求項2】

配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現させたＣ１Ｒ細胞、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現させたＣ１Ｒ細胞、配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現させたＣ１Ｒ細胞、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現させたＣ１Ｒ細胞への結合についての２μｇ／ｍｌ以下のフローサイトメトリーにより測定され、４パラメーターロジスティックフィットを用いて計算されたＥＣ５０により特徴づけられる、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

Ｏ−結合および／またはＮ−結合グリカンを含むＭＩＣＡポリペプチドに結合する、請求項１または２に記載の抗体。

【請求項4】

配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドのアルファ１および／またはアルファ２ドメインに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項5】

ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項6】

腫瘍細胞によって発現されるグリコシル化ＭＩＣＡポリペプチドに結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項7】

配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドへの結合について、
（ａ）それぞれ配列番号４６および４７のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１９Ｅ９）；
（ｂ）それぞれ配列番号９０および９１のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１８Ｅ８）；
（ｃ）それぞれ配列番号１０１および１０２のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１０Ｆ３）；ならびに
（ｄ）それぞれ配列番号１１２および１１３のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１５Ｆ９）
からなる群から選択される抗体と競合する、請求項１に記載の抗体。

【請求項8】

配列番号４８に示されるアミノ酸配列ＳＤＹＡＷＮを含むＨＣＤＲ１領域；配列番号５１に示されるアミノ酸配列ＦＶＳＹＳＧＴＴＫＹＮＰＳＬＫＳを含むＨＣＤＲ２領域；配列番号５３に示されるアミノ酸配列ＧＹＧＦＤＹを含むＨＣＤＲ３領域；配列番号５４に示されるアミノ酸配列ＳＡＴＳＳＩＳＳＩＹＦＨを含むＬＣＤＲ１領域；配列番号５５に示されるアミノ酸配列ＲＴＳＮＬＡＳを含むＬＣＤＲ２領域；および配列番号５６に示されるアミノ酸配列ＱＱＧＴＴＩＰＦＴを含むＬＣＤＲ３領域を含む、ＭＩＣＡポリペプチドおよびＭＩＣＢポリペプチドに対して特異的に結合するモノクローナル抗体。

【請求項9】

ヒトＦｃγＩＩＩＡ受容体に結合するヒト重鎖定常領域を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項10】

毒性剤にコンジュゲートまたは共有結合している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。

【請求項12】

癌の治療において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

癌が癌腫である、請求項１２に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年２月７日に出願された米国仮出願第６１／５９５，９０２号明細書および２０１２年４月１８日に出願された米国仮出願第６１／６２５，８４１号明細書の利益を主張し；それらの全ては任意の図面を含め参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、２０１３年２月７日に作出され、７７ＫＢサイズの標題「ＰＣＴ Ｓｅｑ ｌｉｓｔ ＭＩＣＡ＿ＳＴ２５」のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0003】

本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドに結合し得る抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、ＭＩＣＡ発現細胞、特に腫瘍細胞により特徴づけられる障害の治療における増加された活性を有する。

【背景技術】

【0004】

免疫受容体ＮＫＧ２Ｄは、通常、ヒトＴ細胞（例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、γδＴ細胞）およびＮＫ細胞上で発現される。事前に活性化されたＣＤ８^＋細胞上で、ＮＫＧ２ＤはＤＡＰ１０会合を介するＣＤ２８およびＴＣＲシグナリングの相乗共刺激因子として機能する一方、ＮＫ細胞中では、それは直接的活性化因子として機能する。したがって、リガンドエンゲージメント時、ＮＫＧ２Ｄは、対合ＤＡＰ１０アダプタータンパク質を介して活性化または共刺激シグナルを直接運搬し、それにより癌および感染性疾患免疫を促進する。

【0005】

ヒトＮＫＧ２Ｄ（ｈＮＫＧ２Ｄ）についての種々のリガンド、例として、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ関連鎖ＡおよびＢポリペプチド（ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）、ＵＬ１６−結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリー、およびレチノイン酸初期転写産物−１（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｅａｒｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−１）（ＲＡＥＴ１）ファミリーが同定および特徴決定されている。ＭＩＣＡは、上皮腫瘍と会合することが多く、微生物感染により誘導され、ある自己免疫疾患病巣中で異常発現される。ＭＩＣＡの構造は、α１α２プラットフォームドメインおよび膜近位Ｉｇ様α３ドメインを有するＭＨＣクラスＩのタンパク質フォールドと類似する（非特許文献１）。ＭＩＣＡおよびその近縁ＭＩＣＢは、ＮＫＧ２Ｄについてのリガンドとしても機能し、両方とも多型性であり、多型はＮＫＧ２Ｄについての親和性に影響することが示されている（非特許文献２）。

【0006】

ＭＨＣクラスＩ鎖（ＭＩＣ）遺伝子を欠くマウスにおいて、ＵＬＢＰと構造的に関連するタンパク質のファミリーであるレチノイン酸初期（ＲＡＥ−１）分子がＮＫＧ２Ｄについてのリガンドとして機能する。ＲＡＥ−１発現は、発癌性物質により誘導され、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を刺激することが示されている。しかしながら、ネズミＮＫＧ２Ｄは、ヒトＭＩＣＡポリペプチドを認識する（非特許文献３）。

【0007】

癌生物学におけるＭＩＣＡの役割は、ＭＩＣＡが腫瘍細胞の細胞表面（例えば、^＊０１９アレル）から、およびエキソソームの表面上（^＊０８アレル）で可溶性形態として放出されるという事実により複雑化されている（非特許文献４）。可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）は、例えば、胃腸悪性腫瘍を有する患者の血清中で高レベルにおいて検出することができる（非特許文献５）。ＭＭＰ、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７、ならびにジスルフィドイソメラーゼＥｒｐ５は、ＭＩＣＡの開裂およびシェディングにおける役割を有することが報告されている（非特許文献６；非特許文献７；および非特許文献８）。膜結合ＭＩＣＡは、ＮＫおよび／またはＴ細胞上でのＮＫＧ２Ｄの発現を下方モジュレートすることが報告されている（非特許文献９）。特に、前掲の非特許文献３は、ＭＩＣＡＴｇマウスを試験し、非トランスジェニック脾細胞上での表面ＮＫＧ２Ｄの下方調節が、ＭＩＣＡトランスジェニックマウスからの脾細胞とのインビトロでの共培養後に最も明白であり、Ｈ２Ｋｂ−ＭＩＣＡマウスからの血清による処理後にわずかに明白であるにすぎない一方、対照細胞および非ｔｇＬＭからの血清とのインキュベーションはそれぞれ効果を有さないことを結論づけ、その全データは、Ｈ２−Ｋ−ＭＩＣＡ ＮＫ細胞上の低減された表面ＮＫＧ２ＤがＮＫＧ２Ｄ機能不全をもたらすことおよびインビボでＮＫＧ２Ｄ下方調節が主として細胞結合ＭＩＣＡへの持続曝露により引き起こされることを示唆する。

【0008】

ＮＫ細胞上のＮＫＧ２ＤがｓＭＩＣＡにより下方調節され（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）、より低い反応性のＮＫ細胞をもたらす報告も現れている。この根拠は明らかになり得る。それというのも、類似の系が観察されており、数あるタンパク質ファミリーのうち、例えば、Ｉｇ様およびＴＮＦスーパーファミリーは、可溶性形態として放出され、分子のその放出はリガンド密度の低減により細胞間相互作用に影響し、それぞれの受容体を担持するＮＫ細胞をモジュレートすることが示されているためである（非特許文献８）。結果的に、抗ＭＩＣＡ抗体を生成する試みは、ＭＩＣＡシェディングを阻害する抗体の開発に集中している。

【0009】

健常細胞上のＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの発現は、免疫活性化とトレランスとの間の平衡を破壊し、自己免疫を誘引し得ることも報告されている。遺伝的連鎖研究は、一部のＭＩＣＡアレルが１型糖尿病に正に関連し、Ｒａｅ１を島細胞上で発現する前糖尿病ＮＯＤマウスにおける疾患の発達を、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡張および機能を低減させるＮＫＧ２Ｄ遮断ｍＡｂによる処理により完全に予防することができることを示している。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ分子は、ＲＡ滑膜細胞中でも大幅に上方調節され、ＮＫＧ２Ｄ依存的にＴ細胞を活性化させる。さらに、関節リウマチ患者は、血清および炎症関節中の高レベルのＩＬ−１５およびＴＮＦ−ａを有し、それがＣＤ４＋ＣＤ２８−サブセットのＴ細胞上でＮＫＧ２Ｄの発現を誘導することが報告されている。セリアック病において、腸内での上皮内ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋ｃｄＴリンパ球の大量浸潤が報告されており、ＭＩＣタンパク質は活性疾患を有する患者における上皮細胞の表面上で強力に発現されるようになる。炎症性腸障害において、ＭＩＣ発現のレベルの増加が腸上皮細胞上で見出され、ＮＫＧ２Ｄを発現する腸上皮ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は腸炎症と相関することが見出された。

【0010】

ＮＫＧ２Ｄ系に基づき炎症を治療するこれまでのアプローチは、ＮＫＧ２ＤリガンドではなくＮＫＧ２Ｄ自体の遮断に集中している（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５。１つの可能性は、ＮＫＧ２ＤリガンドではなくＮＫＧ２Ｄへのこの集中が種々のリガンドおよび一部の場合において多数のアレルを含むＮＫＧ２Ｄリガンド系を標的化する困難性の認識に起因することである。

【0011】

ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢについて、５０を超えるＭＩＣＡアレルおよび少なくとも１３のＭＩＣＢアレルが認識されている。α１α２ドメイン（ＮＫＧ２Ｄ界面に関与するドメイン）におけるＭＩＣポリペプチドにわたる４３％のアミノ酸同一性が存在するにすぎず、アミノ酸置換の８０％が非保存的であり（非特許文献１６；非特許文献１７）、そのことは、集団における大多数の個体に有効な抗体を得る可能性が低いことを示唆する。さらに、ＭＩＣＡ中の１２９位におけるメチオニン／バリン二形性は、ＮＫＧ２Ｄ結合の差を決定し、残基１２９の側鎖は部分的に埋め込まれており、第１のα２ヘリカルストレッチ中のグルタミン１３６、アラニン１３９およびメチオニン１４０との疎水性相互作用を形成するが、それはＭＩＣＡのバリン１２９形態との比較においてこのドメインにおける立体構造の差に関連し得る（非特許文献１６）。

【0012】

まとめると、治療剤によりＭＩＣＡを標的化する新たなアプローチが必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２００１ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３

【非特許文献2】Ｓｔｅｉｎｌｅ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５３：２７９

【非特許文献3】Ｗｉｅｍａｎｎ（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：８２０−８２９

【非特許文献4】Ａｓｈｉｒｕ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０（２）：４８１−４８９

【非特許文献5】Ｓａｌｉｈ ｅｔ ａｌ，２００２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：４０９８

【非特許文献6】Ｗａｌｄｈａｕｅｒ（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６８（１５）６３６８−７６

【非特許文献7】Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｎａｔｕｒｅ

【非特許文献8】Ｓａｌｉｈ（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：４０９８−４１０２

【非特許文献9】Ｖｏｎ Ｌｉｌｉｅｎｆｅｌｄ−Ｔｏａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．

【非特許文献10】Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ

【非特許文献11】Ａｒｒｅｙｇｕｅ−Ｇａｒｃｉａ（２００８）ＢＭＣ

【非特許文献12】Ｊｉｎｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．

【非特許文献13】Ｏｇａｓａｗａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０（６）：７５７−７６７

【非特許文献14】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．６３（９）：２６１７−２６２９

【非特許文献15】Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ（２００９）ＭＡｂｓ１（２）：１１５−１２７

【非特許文献16】Ｓｔｅｉｎｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５３：２７９−２８７

【非特許文献17】Ｓｔｅｉｎｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１２５１０−１２５１５

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0014】

一態様において、本発明は、とりわけ、ヒトＭＩＣＡアレルにわたる（ならびに非ヒト霊長類ＭＩＣＡに対する）高親和性を有する抗体の発見から生じる。

【0015】

抗体は、特に、ＭＩＣＡの主なファミリーを表すことが決定される２つの主要なＭＩＣＡ群のそれぞれからの１つ以上のＭＩＣＡアレルに結合する：ＮＫＧ２Ｄに強力に結合するグループ１アレル（例として、ＭＩＣＡ^＊００１、^＊００２、^＊００７、^＊０１２、^＊０１７および^＊０１８）およびＮＫＧ２Ｄに弱く結合するグループ２（ＭＩＣＡ^＊００４、^＊００６、^＊００８、^＊００９および^＊０１９）。サブセットＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７および^＊００８または^＊００１、^＊００４、^＊００７、^＊００８および^＊０１９上に存在するエピトープに結合することにより、抗体は、ほとんど全ての個体に存在する両方の群のアレルをカバーする。任意選択で、抗体は、^＊００１を表面において発現するように作製された細胞への、^＊００４を表面において発現するように作製された細胞への、^＊００７を表面において発現するように作製された細胞への、および^＊００８を表面において発現するように作製された細胞への結合についての５μｇ／ｍｌ以下、任意選択で３μｇ／ｍｌ以下、２μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下または０．５μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を有する。

【0016】

高親和性結合は、とりわけ、抗体がＣＤＣおよびＡＤＣＣを有効に媒介するのに有利である。本発明は、高いＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を誘導するために最適な抗体結合領域であり、さらに主要ＭＩＣＡアレルにわたり依然として見出されるα１および／またはα２ドメイン内のＭＩＣＡ上のエピトープを提供する。エピトープは、一般に、α１および／またはα２ドメインの側面上に存在し、ＮＫＧ２Ｄ結合表面の完全に外側に存在し、またはＮＫＧ２Ｄ結合表面と部分的に重複している。さらに、ＡＤＣＣ／ＣＤＣの向上および複数アレル結合の特徴を示すα３エピトープが同定される。

【0017】

ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断する抗体の下位群も同定された。Ｆｃγ受容体により結合されるＦｃドメインを含む場合のＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性の誘導またはＦｃγ受容体により実質的に結合されないＦｃドメインを含む場合の炎症促進活性の遮断に加え、それらの抗体は、ＮＫＧ２ＤのｓＭＩＣＡ誘導下方モジュレーションを遮断し得るそれらの能力について有用であった。

【0018】

抗ＭＩＣＡ抗体の存在下でＭＩＣＡ発現細胞と接触されるＮＫＧ２Ｄ発現免疫細胞中のＮＫＧ２Ｄ活性を誘導する細胞（例えば、腫瘍細胞、形質移入体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｄ））の表面上のＭＩＣＡの能力を遮断しない抗体の他の下位群も同定された。ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性の誘導に加え、それらの抗体は、ＮＫＧ２Ｄ発現免疫エフェクター細胞が（例えば、任意のＦｃγ受容体媒介機序に加えて）ＮＫＧ２Ｄを介して標的細胞を溶解させ得るままになるようにＮＫＧ２Ｄの阻害を回避するそれらの能力について有用であった。

【0019】

組換えおよび細胞表面結合ＭＩＣＡは、異なる立体構造をとることができると考えられ、細胞結合ＭＩＣＡの結合は、ＭＩＣＡタンパク質に対する遠隔効果を有し得る。特に驚くべきことに、ＮＫＧ２Ｄによるシグナリングを誘導する細胞（例えば、腫瘍細胞、形質移入体）の表面上のＭＩＣＡの能力の遮断は、組換えタンパク質を使用した場合のＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄ相互作用を遮断する能力と常に相関しなかった（Ｂｉａｃｏｒｅ試験）。さらに、特に驚くべきことに、汎アレル抗体はα１α２ドメインの水平上のＮＫＧ２Ｄ結合帯域内で全く見出されなかった一方、ＮＫＧ２Ｄによるシグナリングを誘導する細胞（例えば、腫瘍細胞、形質移入体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｄ））の表面上のＭＩＣＡの能力のＭＩＣＡ遮断は、結合エピトープの局在と相関しなかった。ＮＫＧ２Ｄ相互作用区域から離れて局在する一部の抗体はＮＫＧ２Ｄ活性の誘導を遮断し得た一方、ＮＫＧ２Ｄ結合区域近傍または部分的に重複する一部の抗体は、ＮＫＧ２Ｄ活性の誘導を遮断しなかった。さらに、抗体は、それらのエピトープに応じてＣＤＣを媒介する能力において異なった。

【0020】

ＭＩＣＡのグループ１アレルは、一般に、残基１２９におけるＭを有する一方、グループ２アレルは、残基１２９におけるＶを有する。一実施形態において、ＭＩＣＡグループは、ＭＩＣＡポリペプチドの１２９位におけるメチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）残基の存在により特徴づけられ、Ｍは、ＮＫＧ２Ｄに強力に結合するＭＩＣＡ形態に関連し、Ｖは、ＮＫＧ２Ｄへのより弱い結合に関連する。

【0021】

一実施形態において、本発明は、１２９位におけるメチオニンを有するＭＩＣＡアレルおよび１２９位におけるバリンを有するＭＩＣＡアレルと交差反応する抗体を提供する。一態様において、本発明は、１２９位におけるメチオニンを有するヒトＭＩＣＡポリペプチドおよび１２９位におけるバリンを有するヒトＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。任意選択で、抗体は、１２９位におけるメチオニンを有するヒトＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現するように作製された細胞への、および１２９位におけるバリンを有するヒトＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現するように作製された細胞への結合についての５μｇ／ｍｌ以下、任意選択で３μｇ／ｍｌ以下、２μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下または０．５μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を有する。

【0022】

一実施形態において、抗体は、１５２位におけるバリンを有するＭＩＣＢポリペプチドに（例えば、配列番号６のＭＩＣＢポリペプチドに）さらに結合する。

【0023】

発見された結合領域は、グルコシル化ＭＩＣＡ、特にヒト腫瘍細胞により優位に発現されるグリコシル化を有するＭＩＣＡ上に存在したままである。

【0024】

一実施形態において、本発明は、とりわけ、ＭＩＣＡ発現腫瘍細胞のエフェクター細胞溶解（例えば、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞）の誘導においてインビトロおよびインビボで有効である一方、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断する抗体の発見から生じる。ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断する抗体は、本明細書に示されるとおりそのような抗体がＮＫＧ２ＤのｓＭＩＣＡ誘導下方調節を予防し得るという点で有利である。そのような遮断抗体は、例えば、循環中の高レベルの可溶性ＭＩＣＡを有する患者の治療に特に有用であり得る。別の実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡ発現腫瘍細胞のエフェクター細胞溶解（例えば、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞）の誘導においてインビトロおよびインビボで有効であり、ＭＩＣＡ発現細胞（例えば、腫瘍細胞）からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断せずに免疫エフェクター細胞の表面上のＮＫＧ２Ｄ発現のｓＭＩＣＡ誘導下方モジュレーションを阻害する抗体を提供する。そのような抗体は、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を阻害することによりＮＫＧ２Ｄ発現のｓＭＩＣＡ誘導下方モジュレーションを阻害し得る。任意選択で、抗体は、任意選択で９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１８Ｅ８、１４Ｂ４または１０Ｆ３のＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸改変を有する軽鎖および重鎖ＣＤＲを含む。

【0025】

別の実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡ発現細胞（例えば、腫瘍細胞）からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断せずに、およびＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を実質的に遮断せずにＭＩＣＡ発現腫瘍細胞のエフェクター細胞溶解（例えば、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞）の誘導においてインビトロおよびインビボで有効な抗体を提供する。任意選択で、抗体は、任意選択で６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、１５Ｆ９ １０Ａ７または１４Ｂ４のＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸改変を有する軽鎖および重鎖ＣＤＲを含む。

【0026】

一実施形態において、複数のＭＩＣＡアレル（例えば、１２９位におけるメチオニンを有するＭＩＣＡアレルおよび１２９位におけるバリンを有するＭＩＣＡアレル；ＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７および^＊００８アレル）と交差反応し、そのようなＭＩＣＡアレルに高親和性（例えば、ヒトＭＩＣＡポリペプチドの前記アレルを表面において発現するように作製された細胞への結合についての５μｇ／ｍｌ以下、任意選択で３μｇ／ｍｌ以下、２μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下または０．５μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０）で結合するα１α２ドメイン（ＮＫＧ２Ｄ界面に関与するドメイン）に結合する抗体が提供される。任意選択で、抗体は、ＮＫＧ２Ｄ界面の外側また部分的に外側に局在するが、完全にＮＫＧ２Ｄ界面内で局在しないα１α２ドメイン上の領域に結合する。

【0027】

ＭＩＣＡアレルへの結合および関連ＥＣ５０値は、例えば、本明細書の実施例３の方法に従ってフローサイトメトリーを使用して評価することができる。

【0028】

別の実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を実質的に遮断せずに（例えば、ＭＩＣＡおよびＮＫＧ２Ｄは、細胞の表面においてそれぞれ発現される）ＭＩＣＡのα１および／またはα２ドメインに結合する抗体の発見から生じる。そのような抗体は、任意選択で、ＭＩＣＡへの結合においてｈＮＫＧ２Ｄと競合しないと特徴づけることができる。任意選択で、抗体は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞中のＮＫＧ２Ｄ活性を誘導するＭＩＣＡの能力を阻害しない。そのような抗体は、任意選択で、ＭＩＣＡ発現標的細胞を溶解させるＮＫＧ２Ｄ発現エフェクター細胞（例えば、ＣＤ１６陰性エフェクター細胞）の能力を減少させず、または遮断しないと特徴づけることができる。抗体は、任意選択で、腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断しない。

【0029】

一実施形態において、非遮断α１α２ドメイン抗体は、Ｋ８１およびＤ８２からなる群から選択される１もしくは２つの残基、Ｑ８３およびＫ８４からなる群から選択される１もしくは２つの残基、Ｈ１０９、Ｙ１１１およびＬ１１６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、任意選択で残基Ｄ１１３、Ｑ１３１、Ｓ１３２およびＱ１３６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、Ｓ１３３、Ｒ１３４およびＴ１３７からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、ならびに／またはＭ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される１、２、３もしくは４つの残基を含む配列番号１のＭＩＣＡポリペプチド上のエピトープに結合する（例えば、抗体２０Ｃ６および１０Ａ７）。

【0030】

一実施形態において、非遮断α１α２ドメイン抗体は、Ｒ６およびＮ８からなる群から選択される１もしくは２つの残基、Ｅ９７およびＨ９９からなる群から選択される１もしくは２つの残基、Ｅ１００、Ｄ１０１およびＮ１０２からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、Ｓ１０３、Ｔ１０４およびＲ１０５からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、任意選択で残基Ｅ１１５、ならびに／またはＬ１７８、Ｒ１７９およびＲ１８０からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基を含むエピトープに結合する（例えば、抗体１５Ｆ９）。

【0031】

一実施形態において、非遮断α１α２ドメイン抗体は、配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドのＱ４８およびＷ４９からなる群から選択される１もしくは２つの残基、ならびに／または配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドのＥ５１、Ｄ５２、Ｖ５３およびＬ５４からなる群から選択される１、２、３もしくは４つの残基を含むエピトープに結合する（例えば、抗体６Ｅ４）。

【0032】

別の実施形態において、本発明は、とりわけ、ＭＩＣＡのα３ドメインに結合し、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を阻害しない（例えば、ＭＩＣＡおよびＮＫＧ２Ｄは、細胞の表面においてそれぞれ発現される）抗体の発見から生じる。任意選択で、抗体は、腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断しない。任意選択で、そのような抗体は、任意選択で、ＭＩＣＡへの結合においてｈＮＫＧ２Ｄと競合しないと特徴づけることができる。

【0033】

一実施形態において、非遮断α３ドメイン抗体は、Ｓ２２４、Ｈ２２５およびＤ２２６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、Ｔ２２７、Ｑ２２８およびＱ２２９からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、ならびに／またはＷ２３０およびＤ２３２からなる群から選択される１もしくは２つの残基を含むエピトープに結合する（例えば、抗体１６Ａ８）。

【0034】

別の実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡのα１および／またはα２ドメインに結合し、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を阻害する（例えば、ＭＩＣＡおよびＮＫＧ２Ｄは、細胞の表面においてそれぞれ発現される）抗体の発見から生じる。そのような抗体は、任意選択で、ＭＩＣＡへの結合においてｈＮＫＧ２Ｄと競合すると特徴づけることができる。抗体は、任意選択で、腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断せずに免疫エフェクター細胞の表面上のＮＫＧ２Ｄ発現のｓＭＩＣＡ誘導下方モジュレーションを阻害する。

【0035】

一実施形態において、遮断α１α２ドメイン抗体は、Ｅ１００、Ｄ１０１およびＮ１０２からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、Ｓ１０３、Ｔ１０４およびＲ１０５からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、Ｎ１２１およびＥ１２３からなる群から選択される１もしくは２つの残基、ならびに／またはＴ１２４およびＥ１２６からなる群から選択される１もしくは２つの残基を含むエピトープに結合する（例えば、抗体１９Ｅ９、１８Ｅ８および１０Ｆ３）。

【0036】

一実施形態において、遮断α１α２抗体は、配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドのＮ５６、Ｋ５７およびＴ５８からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、ならびに／または配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドのＲ６１およびＲ６４からなる群から選択される１もしくは２つの残基を含むエピトープに結合する（例えば、抗体９Ｃ１０および１２Ａ１０）。

【0037】

別の実施形態において、本発明は、とりわけ、ＭＩＣＡのα３ドメインに結合し、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を阻害する（例えば、ＭＩＣＡおよびＮＫＧ２Ｄは、細胞の表面においてそれぞれ発現される）抗体の発見から生じる。任意選択で、抗体は、腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断しない。任意選択で、そのような抗体は、任意選択で、ＭＩＣＡへの結合においてｈＮＫＧ２Ｄと競合すると特徴づけることができる。抗体は、任意選択で、免疫エフェクター細胞の表面上のＮＫＧ２Ｄ発現のｓＭＩＣＡ誘導下方モジュレーションを阻害する。抗体は、実質的には、腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを遮断し得、または任意選択で、腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断し得ない。

【0038】

一実施形態において、遮断α３ドメイン抗体は、Ｔ２２７、Ｑ２２８およびＱ２２９からなる群から選択される１、２または３つの残基を含むエピトープに結合する（抗体１４Ｂ４）。

【0039】

理論により拘束されるものではないが、ＭＩＣＡ（例えば、ｓＭＩＣＡまたは膜結合ＭＩＣＡ）およびＮＫＧ２Ｄ下方調節とエフェクター細胞の損傷との因果関係を想定する科学文献にかかわらず、ＭＩＣＡは、それ自体、腫瘍の状況において、エフェクター細胞の実質的な損傷を常に引き起こすわけではないことが考えられる。特に、ｓＭＩＣＡはＮＫＧ２Ｄの下方調節を引き起こし得る一方、インビボで生じるｓＭＩＣＡの濃度は多くの場合、低すぎてそれ自体、有意なＮＫＧ２Ｄ下方調節を引き起こし得ない（実施例９参照）。さらに、腫瘍の状況（例えば、確定または進行疾患）において、患者は、一般に、数ある効果のうち、ＮＫＧ２Ｄの下方モジュレーションを引き起こす潜在性を有する多数の非ＭＩＣＡ成分（例えば、ＴＧＦ−ベータ）を介する免疫抑制状態である。結果的に、ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断し、または遮断しない、およびＭＩＣＡシェディングを阻害しない薬剤は、それらがＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣを誘導し得る限り、癌の治療において有効である。ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断しない抗体は有利である。それというのも、ＭＩＣＡ発現腫瘍細胞は、（例えば、長期間の反復投与を有し、または高用量投与される治療について、免疫能が治療の間または治療後に患者中で再樹立する場合）存在する免疫担当エフェクター細胞上のＮＫＧ２Ｄにより認識可能なままである潜在性を有するためである。ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断する抗体は、そのような抗体がＮＫＧ２ＤのＭＩＣＡ誘導下方調節を予防し得るという点で有利である（実施例９参照）。そのような遮断抗体は、例えば、循環中の高レベルの可溶性ＭＩＣＡを有する患者の治療に特に有用であり得る。

【0040】

一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の結合（例えば、腫瘍細胞上の表面ＭＩＣＡとエフェクター細胞上の表面ＮＫＧ２Ｄの相互作用）を検出可能に低減させず、例えば、ＭＩＣＡおよびＮＫＧ２Ｄの相互作用を実質的に遮断せずＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合するＭＩＣＡ結合化合物、好ましくは、抗体（抗ＭＩＣＡ抗体）を提供する。一実施形態において、本発明は、腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断せずにＭＩＣＡポリペプチドに結合するＭＩＣＡ結合化合物（例えば、ＭＩＣＡ結合ポリペプチド）を提供する。一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を実質的に遮断せずに、および腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断せずにＭＩＣＡポリペプチドに結合するＭＩＣＡ結合化合物を提供する。

【0041】

別の実施形態において、本発明は、主要ＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ^＊００１、ＭＩＣＡ^＊００４、ＭＩＣＡ^＊００８ならびに任意選択でさらにＭＩＣＡ^＊００７および／またはＭＩＣＡ^＊０１９を認識するヒトＭＩＣＡに（特に、α１および／またはα２ドメイン中で）結合する抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、任意選択で、非ヒト霊長類種（例えば、カニクイザル）のＭＩＣＡをさらに認識する。一実施形態において、抗体は、任意選択で、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＩＣＢポリペプチドをさらに認識する。任意選択で、別の実施形態において、それらの抗体は、ＭＩＣＢをさらに認識しない。任意選択で、抗体は、腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断しない。任意選択で、抗体は、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を実質的に遮断しない。

【0042】

一実施形態において、本発明は、ヒト腫瘍細胞により発現されるグリコシル化ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。

【0043】

一実施形態において、本発明は、非ヒト霊長類細胞により発現されるＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。

【0044】

一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する抗体（抗ＭＩＣＡ抗体）であって、配列番号２（ＭＩＣＡ^＊００４）のポリペプチドおよび／または配列番号４（ＭＩＣＡ^＊００８）のポリペプチドに結合する抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、配列番号１（ＭＩＣＡ^＊００１）のポリペプチドにさらに結合する。一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、配列番号５（ＭＩＣＡ^＊０１９）のポリペプチドに結合する抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、配列番号３（ＭＩＣＡ^＊００７）のポリペプチドにさらに結合する。一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、配列番号２（ＭＩＣＡ^＊００４）のポリペプチド、配列番号４（ＭＩＣＡ^＊００８）のポリペプチドおよび配列番号５（ＭＩＣＡ^＊０１９）のポリペプチドに結合する抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、配列番号１（ＭＩＣＡ^＊００１）のポリペプチド、配列番号２（ＭＩＣＡ^＊００４）のポリペプチド、配列番号４（ＭＩＣＡ^＊００８）のポリペプチド、および配列番号５（ＭＩＣＡ^＊０１９）のポリペプチドに結合し、任意選択で、配列番号３（ＭＩＣＡ^＊００７）のポリペプチドにさらに結合する抗体を提供する。ＭＩＣＡアレルのグループ１およびグループ２の両方にわたるアレルＭＩＣＡ^＊００１、−^＊００４、および^＊００８、（および有利には、さらに^＊００７および^＊０１９）に結合することにより、実質的に全部のヒト集団がそのような本発明の抗ＭＩＣＡ剤による治療に好適である。任意の実施形態において、配列番号１〜５のポリペプチドは、Ｏ−グリカン（セリンまたはトレオニンに結合しているＮ−アセチルラクトサミン）を含み得る。任意の実施形態において、配列番号１〜５のポリペプチドは、コア２Ｏ−グリカン（Ｎ−アセチルガラクトサミンに連結しているＮ−アセチルグルコサミン分枝を含むＯ−グリカン）および／またはＮ結合グリカンを含み得る。一実施形態において、抗体は、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を実質的に遮断せずに、および／または腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断せずにＭＩＣＡポリペプチドに結合する。一実施形態において、抗体は、ＭＩＣＡのα１および／またはα２ドメインに結合する。一実施形態において、抗体は、ＭＩＣＡのα３ドメインに結合する。

【0045】

好ましくは、化合物は、抗体、任意選択で、２つのＩｇ重鎖および２つのＩｇ軽鎖を含むテトラマー抗体である。好ましくは、抗体は、ヒトＭＩＣＡポリペプチドについての１０^−９Ｍ未満、好ましくは、１０^−１０Ｍ未満、または好ましくは、１０^−１１Ｍ未満の、任意選択で二価である結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する。好ましくは、抗体は、枯渇抗体であって、任意選択で、ＭＩＣＡ発現腫瘍細胞に対するＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘導する抗体である。

【0046】

具体的な実施形態において、本発明は、ｈＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫまたはＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介細胞毒性を実質的に阻害せずにＮＫまたはＴ細胞による（例えば、インビボまたはインビトロでの）ＭＩＣＡ発現腫瘍細胞の枯渇を媒介する抗体を提供する。

【0047】

具体的な実施形態において、本発明の抗体は、ＭＩＣＡへの結合においてｈＮＫＧ２Ｄと競合しない。

【0048】

具体的な実施形態において、本発明の抗体がＭＩＣＡ発現細胞上のＭＩＣＡに結合している場合、ＭＩＣＡ発現細胞は、結合時に例えばｈＮＫＧ２Ｄの下方モジュレーションおよび／または内在化の刺激を介して細胞表面ｈＮＫＧ２Ｄの量を実質的に低減させず、高親和性および緩慢なオフレートを有し、カニクイザルおよび／またはアカゲザルＭＩＣＡと交差反応し、枯渇アイソタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ１などのものである。

【0049】

一態様において、本発明は、ＭＩＣＡを特異的に結合する抗体であって、以下の特性：
（ａ）ＭＩＣＡポリペプチドへの結合についての１０^−８Ｍ未満、好ましくは、１０^−９Ｍ未満、または好ましくは、１０^−１０Ｍ未満のＫｄを有する；
（ｂ）配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドの１〜８８、８９〜１８１および１８２〜２７４からなる群から選択されるドメインの残基に対応するセグメント中の少なくとも１つの残基に結合し、ならびに／または本明細書に記載のエピトープ（ＭＩＣＡ上の１つ以上アミノ酸残基）に結合する；
（ｃ）配列番号１〜５の配列をそれぞれ含む、ＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７、^＊００８、および^＊０１９ポリペプチドの２、３、４または５つに結合する；
（ｄ）腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断しない；
（ｅ）ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用（例えば、腫瘍細胞上の表面ＭＩＣＡとエフェクター細胞上の表面ＮＫＧ２Ｄの相互作用）を実質的に遮断しない；
（ｆ）エフェクター細胞（例えば、ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ１６−ＮＫ細胞）によるＭＩＣＡ発現細胞の溶解の実質的な減少を引き起こさない；
（ｇ）ＭＩＣＡを表面上で発現する細胞に対する補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導する；ならびに
（ｈ）ＭＩＣＡポリペプチドへの結合について、抗体６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、１５Ｆ９および１０Ａ７と競合する
の１つ以上（それらの任意の組合せ、または全てを含む）を有する抗体を提供する。

【0050】

本明細書の実施形態のいずれかにおいて、本発明の抗体は、上記（ａ）〜（ｈ）のいずれか１つ以上の特徴により特徴づけることができる。

【0051】

一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体を試験する方法であって、（ｉ）抗体がＭＩＣＡ発現細胞からのＭＩＣＡのシェディングを遮断するか否かを評価することおよび／または（ｉｉ）抗体がＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断するか否かを評価することを含む方法が提供される。ステップ（ｉ）は、任意選択で、ＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗体を、ＭＩＣＡポリペプチドを発現する細胞と接触させることを含み得る。ステップ（ｉｉ）は、任意選択で、ＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗体を、ＮＫＧ２Ｄポリペプチド（例えば、単離ポリペプチドまたは細胞の表面上で発現されたポリペプチド）の存在下で、ＭＩＣＡポリペプチド（例えば、単離ポリペプチドまたは細胞の表面上で発現されたポリペプチド）と接触させることを含み得る。

【0052】

別の実施形態において、任意選択で、癌の治療のための、哺乳動物対象においてＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗体を産生する方法であって、ａ）複数の抗体を提供する、任意選択で、ＭＩＣＡポリペプチドを含む免疫原により非ヒト哺乳動物を免疫化するステップ；およびｂ）抗体を複数の抗体から選択する選択ステップを実施するステップを含み：
そのステップは：
（ｉ）抗体がヒトＭＩＣＡポリペプチド、任意選択で、配列番号１〜５のポリペプチドの１，２、３、４つもしくは全てに結合するか否かを試験し、抗体がヒトＭＩＣＡポリペプチドに結合する場合にその抗体を選択すること；および／または
（ｉｉ）抗体がＭＩＣＡ発現細胞からのＭＩＣＡのシェディングを遮断するか否かを試験し、抗体がシェディングを遮断しない場合にその抗体を選択すること；および／または
（ｉｉｉ）抗体がＭＩＣＡ（例えば、表面ＭＩＣＡ）とＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断するか否かを試験し、好ましくは、抗体がエフェクター細胞（例えば、ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ１６−ＮＫ細胞によるＭＩＣＡ発現細胞の溶解の実質的な減少を引き起こすか試験し、抗体がＭＩＣＡ（例えば、表面ＭＩＣＡ）とＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断しない場合、好ましくは、抗体がＭＩＣＡ発現細胞の溶解の実質的な減少を引き起こさない場合にその抗体を選択すること
を含む方法が提供される。

【0053】

一態様において、本発明は、とりわけ、ＭＩＣＡアレルの２つの主なグループからの主要ヒトＭＩＣＡアレルにわたる（ならびに非ヒト霊長類ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢに対する）高親和性を有する遮断抗ＭＩＣＡ抗体の発見から生じる。一実施形態において、ＭＩＣＡグループは、ＭＩＣＡポリペプチドの１２９位におけるメチオニン（Ｍ）またはバリン（Ｖ）残基の存在により特徴づけられ、Ｍは、ＮＫＧ２Ｄに強力に結合するＭＩＣＡ形態に関連し、Ｖは、ＮＫＧ２Ｄへのより弱い結合に関連する。一実施形態において、本発明は、１２９位におけるメチオニンを有するＭＩＣＡアレルおよび１２９位におけるバリンを有するＭＩＣＡアレルと交差反応する遮断抗体を提供する。一態様において、本発明は、１２９位におけるメチオニンを有するヒトＭＩＣＡポリペプチドおよび１２９位におけるバリンを有するヒトＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、ＭＩＣＡ媒介ｈＮＫＧ２Ｄ活性を阻害する抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、さらに結合し、抗体は、１５２位におけるバリンを有するＭＩＣＢポリペプチドに（例えば、配列番号１のＭＩＣＢポリペプチドに）結合する。好ましくは、前記抗体は、ＭＩＣＢ媒介ｈＮＫＧ２Ｄ活性を阻害する。１５２位におけるバリンを有するＭＩＣＢポリペプチドは、可溶性ＮＫＧ２Ｄへの強力な結合を示すと報告されている。１５２位におけるバリンを有するＭＩＣＢポリペプチドおよび１２９位におけるメチオニンを有するＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗体は、ＮＫＧ２Ｄへの強力な結合を有するアレルから生じるより大きい感受性または重度の疾患を有する個体において有利であり得る。

【0054】

本発明の遮断抗ＭＩＣＡ抗体はまた、ＭＩＣＡの主なファミリーを表すことが決定される２つの主要ＭＩＣＡグループ：ＮＫＧ２Ｄに強力に結合するグループ１アレル（例として、ＭＩＣＡ^＊００１、^＊００２、^＊００７、^＊０１２、^＊０１７および^＊０１８）およびＮＫＧ２Ｄに弱く結合するグループ２（ＭＩＣＡ^＊００４、^＊００６、^＊００８、^＊００９および^＊０１９）のそれぞれからの１つ以上の高率発生アレルと交差反応（結合）する。サブセットＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７、^＊００８および^＊０１９上に存在するエピトープに結合することにより、抗体は、ほとんど全ての個体に存在する両方のグループのアレルをカバーする。ＭＩＣＡのグループ１アレルは、一般に、残基１２９におけるＭを有する一方、グループ２アレルは残基１２９におけるＶを有する。

【0055】

別の態様において、本発明は、とりわけ、他の抗ＭＩＣＡ抗体または抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のいずれよりもＮＫＧ２Ｄ遮断において有意に有効であり、ＮＫＧ２Ｄ媒介細胞毒性の遮断においてもＭＩＣＡに結合する能力から予測されるよりも有効である、あるエピトープに対するＭＩＣＡに対する（ならびに非ヒト霊長類ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢに対する）抗体の発見から生じる。特に、ピコモル濃度範囲の親和性を有する抗ＭＩＣＡ抗体は、阻害において２ｌｏｇ小さい親和性（Ｋ_Ｄ）を有する抗ＭＩＣＡ抗体よりも４ｌｏｇ良好であった。

【0056】

本発明の遮断ＭＩＣＡ抗体は、ＮＫＧ２Ｄとのいかなる競合も、ＮＫＧ２Ｄによるいかなる置換も、ＮＫＧ２Ｄのいかなる残留結合も妨害する能力により特性づけることができる。他の高親和性ＮＫＧ２ＤまたはＭＩＣＡ抗体は、それらのリガンド（例えば、それぞれＭＩＣＡ／ＵＬＰＢ／ＲＡＥＴ１またはＮＫＧ２Ｄ）によりいくらかの置換を残し得る。さらに、ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用の結晶構造から観察されるとおり、ＮＫＧ２Ｄは、ホモダイマーとして作用し、ＭＩＣＡα１α２プラットフォームドメインの頂部と相互作用する２つの対称表面（それぞれのＮＫＧ２Ｄ鎖上に１つ）を有する。２つのＮＫＧ２Ｄ鎖は、両方とも、非対称ＭＩＣＡプラットフォームドメインの明らかに異なる表面への結合により相互作用に寄与する（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（５）：４４３−４５０参照）。したがって、本発明の抗体は、任意選択で、例えば、ＭＩＣＡポリペプチドへのＮＫＧ２Ｄホモダイマー中の両方のＮＫＧ２Ｄモノマーの結合を遮断（例えば、干渉、競合）することによりＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄ相互作用を完全に遮断し得る。他のＭＩＣＡ抗体（またはＮＫＧ２Ｄ抗体）は、２つのＮＫＧ２Ｄ結合部位の一方のみを完全に遮断し得る。

【0057】

本発明の遮断抗ＭＩＣＡ抗体による治療は、枯渇抗体（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプ）として使用される場合にＭＩＣＡ発現細胞を枯渇させるためのそれらの使用に加え、他のリガンド（例えば、ＵＬＢＰ）への結合および後続の活性化に利用可能なＮＫＧ２Ｄ受容体の数を低減させることにより不所望なより広い免疫系阻害の惹起を低減させずにＮＫＧ２ＤのＭＩＣＡおよび／またはＢ媒介活性化により駆動されると考えられる炎症病態においてＭＩＣＡ（およびＭＩＣＢ）を標的化する手段を提供する。そのような完全遮断抗ＭＩＣＡ抗体の可能性は、ＮＫＧ２Ｄ抗体の投与により引き起こされる全身性免疫抑制効果を引き起こさずに炎症の部位への（例えば、関節炎患者における関節または他の炎症部位中への）抗ＭＩＣＡ抗体の局所送達の可能性も開く。

【0058】

一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡ発現細胞のエフェクター細胞溶解（例えば、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞）の阻害においてインビトロおよびインビボで有効であり、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を実質的に遮断する抗体。

【0059】

一実施形態において、特に炎症または自己免疫障害の治療において使用される場合、本発明の抗体は、ＮＫＧ２Ｄ活性化、ＮＫＧ２Ｄシグナリング、ＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫ細胞もしくはＴ細胞の活性化、またはエフェクター細胞（例えば、ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ１６−ＮＫ細胞）によるＭＩＣＡ発現細胞の溶解を実質的に低減させ、または阻害する非枯渇抗体である。

【0060】

一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合し（抗ＭＩＣＡ抗体）、ＭＩＣＡとｈＮＫＧ２Ｄとの間の結合（例えば、細胞上の表面ＭＩＣＡとエフェクター細胞上の表面ＮＫＧ２Ｄとの相互作用）を低減させる（例えば、実質的に排除する）ＭＩＣＡ結合化合物、好ましくは、抗体を提供する。

【0061】

一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体または結合化合物は、ＭＩＣＢポリペプチドにさらに特異的に結合し、ＭＩＣＢとｈＮＫＧ２Ｄとの間の結合を低減させる（例えば、実質的に排除する）。

【0062】

一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡ（および任意選択でＭＩＣＢ）への結合においてｈＮＫＧ２Ｄと競合し、ｈＮＫＧ２ＤのＭＩＣＡ（および任意選択でＭＩＣＢ）への結合を妨害する抗体を提供する。

【0063】

一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡ（および任意選択でＭＩＣＢ）ポリペプチドとｈＮＫＧ２Ｄホモダイマーの両方のｈＮＫＧ２Ｄ鎖との相互作用を阻害または遮断する抗体を提供する。任意選択で、抗体はＭＩＣＡポリペプチド（および任意選択でＭＩＣＢポリペプチド）のα１ドメインおよびＭＩＣＡポリペプチド（および任意選択でＭＩＣＢポリペプチド）のα１ドメインの両方と、ｈＮＫＧ２Ｄホモダイマーとの相互作用を遮断する（例えば、抗体は、ＭＩＣＡα１α２プラットフォームとｈＮＫＧ２Ｄホモダイマーの両方のｈＮＫＧ２Ｄ鎖との相互作用を阻害する）。

【0064】

一実施形態において、本発明の抗体は、ポリペプチドのＨＣＭＶにも、ＵＬ１８にも、ＵＬＢＰ１にも、ＵＬＢＰ２にも、ＵＬＢＰ３にも、ＵＬＢＰ４にも、ＵＬＢＰ５にも、ＵＬＢＰ６にも実質的に結合しない（Ｃｈａｍｐｓａｕｒ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２３５：２６７−２８５参照）。

【0065】

一実施形態において、本発明は、１２９位におけるメチオニンを有するヒトＭＩＣＡポリペプチド（例えば、天然ＭＩＣＡアレル）および１２９位におけるバリンを有するヒトＭＩＣＡポリペプチド（例えば、天然ＭＩＣＡアレル）上の共通の決定基に特異的に結合し、任意選択で、１５２位におけるバリンを有するヒトＭＩＣＢポリペプチド（例えば、天然ＭＩＣＢアレル）上の共通の決定基にさらに特異的に結合する抗体であって、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間（および任意選択でＭＩＣＢとＮＫＧ２Ｄとの間）の結合を低減させる（例えば、排除する）抗体を提供する。

【0066】

さらなる実施形態において、本発明は、とりわけ、ヒトＭＩＣＡに、好ましくは、α１α２プラットフォームドメイン（すなわち、α１および／またはα２ドメイン）中で結合し、主要ＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ^＊００１、ＭＩＣＡ^＊００４、ＭＩＣＡ^＊００８ならびに任意選択でさらにＭＩＣＡ^＊００７および／またはＭＩＣＡ^＊０１９を認識し、任意選択で、非ヒト霊長類種（例えば、カニクイザル）のＭＩＣＡをさらに認識し、任意選択で、ＭＩＣＢをさらに認識する抗体の発見から生じる。一実施形態において、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＩＣＢポリペプチドをさらに認識する。任意選択で、抗体は、腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングをさらに実質的に阻害しない。

【0067】

一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する抗体（抗ＭＩＣＡ抗体）であって、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の結合を低減させ（例えば、実質的に排除し）、配列番号２（ＭＩＣＡ^＊００４）のポリペプチドおよび／または配列番号４（ＭＩＣＡ^＊００８）のポリペプチドに結合する抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、配列番号１（ＭＩＣＡ^＊００１）のポリペプチドにさらに結合する。一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、配列番号５（ＭＩＣＡ^＊０１９）のポリペプチドに結合する抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、配列番号３（ＭＩＣＡ^＊００７）のポリペプチドにさらに結合する。一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、配列番号２（ＭＩＣＡ^＊００４）のポリペプチド、配列番号４（ＭＩＣＡ^＊００８）のポリペプチドおよび配列番号５のポリペプチド（ＭＩＣＡ^＊０１９）に結合する抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、配列番号１（ＭＩＣＡ^＊００１）のポリペプチド、配列番号２（ＭＩＣＡ^＊００４）のポリペプチド、配列番号４（ＭＩＣＡ^＊００８）のポリペプチド、および配列番号５（ＭＩＣＡ^＊０１９）のポリペプチドに結合し、任意選択で、配列番号３（ＭＩＣＡ^＊００７）のポリペプチドにさらに結合する抗体を提供する。ＭＩＣＡアレルのグループ１およびグループ２の両方にわたるアレルＭＩＣＡ^＊００１、−^＊００４、および^＊００８、（および有利にはさらに^＊００７および^＊０１９）に結合することにより、実質的に全部のヒト集団が本発明のそのような抗ＭＩＣＡ剤による治療に好適である。一実施形態において、抗体は、ＭＩＣＡのα１および／またはα２ドメインに結合する。

【0068】

好ましくは、化合物は、抗体、任意選択で、２つのＩｇ重鎖および２つのＩｇ軽鎖を含むテトラマー抗体である。

【0069】

好ましくは、抗体は、ヒトＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢポリペプチド（例えば、本明細書において称されるいずれか１つ以上または全てのＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢアレル）についての１０^−９Ｍ未満、好ましくは、１０^−１０Ｍ未満、好ましくは、１０^−１１Ｍ未満、好ましくは、１０^−１２Ｍ未満、または好ましくは、１０^−１３Ｍ未満の、任意選択で一価または二価である結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する。好ましくは、抗体は、２つのＩｇ重鎖および２つのＩｇ軽鎖を含むテトラマー抗体であり、Ｋ_Ｄは二価である。任意選択で、抗体は、１０、５、または１μｇ／ｍｌ以下の特定のＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢポリペプチド、例えば、本明細書において称されるいずれか１つ以上または全てのＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢアレル）を発現するように作製された細胞への結合についてのＥＣ５０を有する。好適な細胞な例は、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ細胞である。

【0070】

一実施形態において、特に抗体が炎症または自己免疫疾患の治療または予防において使用される場合、化合物は、非枯渇抗体（抗体が結合する細胞を枯渇させない抗体）である。好ましくは、抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である。好ましくは、抗体は、Ｆｃγ３Ａ受容体（ＣＤ１６）により結合され得る定常領域を含まず、例えば、ヒトＩｇＧ４サブタイプの抗体またはＦｃドメインを欠く抗体断片である。好ましくは、抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常領域を含む。

【0071】

一実施形態において、抗体は、非ヒト霊長類細胞により発現されるＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する。具体的な実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＭＩＣＡへの結合についての高親和性および緩慢なオフレートを有し、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）および／またはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＭＩＣＡと交差反応する。

【0072】

一態様において、本発明は、ＭＩＣＡに特異的に結合する抗体であって、以下の特性：
（ａ）ＭＩＣＡポリペプチドへの結合についての１０^−９Ｍ未満、好ましくは、１０^−１０Ｍ未満、好ましくは、１０^−１１Ｍ未満、好ましくは、１０^−１２Ｍ未満、または好ましくは、１０^−１３Ｍ未満のＫ_Ｄを有し、好ましくは、それぞれのＭＩＣＡポリペプチドアレルＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、および^＊００８、任意選択で、さらに^＊００７および／または^＊０１９についての前記Ｋ_Ｄの親和性を有する；
（ｂ）配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドの１〜８８もしくは８９〜１８１からなる群から選択されるドメインの残基に対応するセグメント中の少なくとも１つの残基に結合し、および／または本明細書に記載のエピトープ（ＭＩＣＡ上の残基）に結合する；
（ｃ）１２９位におけるメチオニンを有するヒトＭＩＣＡポリペプチド（例えば、天然ＭＩＣＡアレル）および１２９位におけるバリンを有するヒトＭＩＣＡポリペプチド（例えば、天然ＭＩＣＡアレル）に結合し、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の結合を低減させ（例えば、実質的に排除し）；および／または１５２位におけるバリンを有するヒトＭＩＣＢポリペプチド（例えば、天然ＭＩＣＡアレル）に結合する；
（ｄ）配列番号１〜５の配列をそれぞれ含むＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７、^＊００８、および^＊０１９ポリペプチドの２、３、４または５つに結合する；
（ｅ）腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断しない；
（ｆ）ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用（例えば、腫瘍細胞上の表面ＭＩＣＡとエフェクター細胞上の表面ＮＫＧ２Ｄとの相互作用）を阻害および／または実質的に遮断し、任意選択で、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄホモダイマー内の両方のＮＫＧ２Ｄ鎖との相互作用を遮断する；
（ｇ）ＭＩＣＡ媒介ＮＫＧ２Ｄ活性化、ＮＫＧ２Ｄシグナリング、ＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫもしくはＴ細胞の活性化、またはエフェクター細胞（例えば、ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ１６−ＮＫ細胞）によるＭＩＣＡ発現細胞の溶解を低減させ、または阻害し得る；
（ｈ）（例えば、ｍＡｂがＣＤ１６により結合されるか否かに応じて、抗体のＦｃ領域の性質に応じて）ＭＩＣＡを表面上で発現する細胞に対する補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を実質的に誘導し、または誘導しない；
（ｉ）ＮＫＧ２Ｄ発現細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の表面上のＮＫＧ２Ｄ発現のｓＭＩＣＡ媒介下方モジュレーションを低減させ、または阻害し得る；ならびに
（ｊ）ＭＩＣＡポリペプチドへの結合について抗体９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１８Ｅ８または１０Ｆ３と競合する
の１つ以上（それらの任意の組合せ、またはそれらの全てを含む）を有する抗体を提供する。

【0073】

本明細書の実施形態のいずれかにおいて、本発明の抗体は、上記（ａ）〜（ｊ）のいずれか１つ以上の特徴により特徴づけることができる。

【0074】

一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体を試験する方法であって、（ｉ）抗体が残基１２９におけるメチオニンを有するＭＩＣＡポリペプチドおよび残基１２９におけるバリンを有するＭＩＣＡポリペプチドの両方（および任意選択で、さらに残基１５２におけるメチオニンを有するＭＩＣＢポリペプチド）に高親和性で結合するか否かを評価すること、ならびに（ｉｉ）抗体がＭＩＣＡ（および任意選択で、ＭＩＣＢ）とＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断するか否かを評価することを含む方法が提供される。一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体を試験する方法であって、（ｉ）抗体が配列番号１〜５の配列をそれぞれ含むＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７、^＊００８、および^＊０１９ポリペプチドの２、３、４または５つに高親和性で結合するか否かを評価することならびに（ｉｉ）抗体がＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断するか否かを評価することを含む方法が提供される。ステップ（ｉ）は、任意選択で、ＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗体を、ＭＩＣＡポリペプチドを発現する細胞と接触させることを含み得る。ステップ（ｉｉ）は、任意選択で、ＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗体を、ＮＫＧ２Ｄポリペプチド（例えば、単離ポリペプチドまたは細胞の表面上で発現されたポリペプチド）の存在下で、ＭＩＣＡポリペプチド（例えば、単離ポリペプチドまたは細胞の表面上で発現されたポリペプチド）と接触させることを含み得る。ステップ（ｉ）において前記ＭＩＣＡポリペプチドに結合し、ステップ（ｉｉ）においてＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断する抗体は、炎症または自己免疫障害のための候補治療として同定および／または選択することができる。

【0075】

別の実施形態において、任意選択で、癌の治療のための、哺乳動物対象においてＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗体を産生する方法であって、ａ）複数の抗体を提供する、任意選択で、ＭＩＣＡポリペプチドを含む免疫原により非ヒト哺乳動物を免疫化し、または抗体のファージディスプレイライブラリーを産生するステップ；およびｂ）抗体を前記複数の抗体から選択する選択ステップを実施することを含み、そのステップは、
（ｉ）抗体がヒトＭＩＣＡポリペプチド、任意選択で、ＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７、^＊００８、および^＊０１９アレル、例えば、配列番号１〜５の配列をそれぞれ含むポリペプチドの１、２、３つもしくは全てに高親和性で結合するか否かを試験し、抗体が前記ＭＩＣＡポリペプチドに高親和性で結合する場合にその抗体を選択すること；ならびに／または
（ｉｉ）抗体がＭＩＣＡと（例えば、表面ＭＩＣＡ、ＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７、^＊００８、および^＊０１９アレルのいずれか１、２、３つまたは全て）とｈＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断するか否か、および／もしくはＮＫＧ２Ｄ活性化、ＮＫＧ２Ｄシグナリング、ＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫもしくはＴ細胞の活性化、もしくはエフェクター細胞（例えば、ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞、ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ１６−ＮＫ細胞）によるＭＩＣＡ発現細胞の溶解を低減させ、もしくは阻害するか否かを試験し、抗体がＭＩＣＡとｈＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断する場合にその抗体を選択すること；ならびに／または
（ｉｉｉ）ＮＫＧ２Ｄ発現細胞を抗体の存在下で可溶性ＭＩＣＡポリペプチドと接触させる場合、抗体がＮＫＧ２Ｄ発現細胞中のＮＫＧ２Ｄ下方モジュレーション（細胞表面発現の減少）を低減させ、もしくは阻害するか否かを試験し、抗体がＮＫＧ２Ｄ下方モジュレーションを低減させ、もしくは阻害する場合にその抗体を選択することを含む方法が提供される。

【0076】

本方法は、任意選択で、抗体がＭＩＣＡ発現細胞からのＭＩＣＡのシェディングを遮断するか否かを試験し、抗体がシェディングを遮断しない場合にその抗体を選択することを含む選択ステップ（ｉｖ）を含み得る。

【0077】

一実施形態において、本発明の抗体は、Ｒ６、Ｎ８、Ｑ４８、Ｗ４９、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ５３、Ｌ５４、Ｎ５６、Ｋ５７、Ｔ５８、Ｒ６１、Ｒ６４、Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４、Ｅ９７、Ｈ９９、Ｅ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５、Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｄ１１３、Ｅ１１５、Ｌ１１６、Ｎ１２１、Ｅ１２３、Ｔ１２４、Ｅ１２６、Ｑ１３１、Ｓ１３２、Ｓ１３３、Ｒ１３４、Ｑ１３６、Ｔ１３７、Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３、Ｎ１４４、Ｌ１７８、Ｒ１７９、Ｒ１８０、Ｓ２２４、Ｈ２２５、Ｄ２２６、Ｔ２２７、Ｑ２２８、Ｑ２２９、Ｗ２３０およびＤ２３２（配列番号１〜５のいずれかのＭＩＣＡに関する）からなる群から選択されるヒトＭＩＣＡポリペプチドの１、２、３、４、５、６、７つ以上の残基を含むエピトープに結合する。

【0078】

一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡ結合化合物、好ましくは、ＭＩＣＡポリペプチドのα１および／またはα２ドメイン内で少なくとも部分的に、または任意選択で完全に結合する抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。α１およびα２ドメインは、配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドに関してアミノ酸残基１〜８８（任意選択で、１〜８５）および８９〜１８１（例えば、８６〜１８１）内にそれぞれ局在する。任意選択で、本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ＭＩＣＡポリペプチドのα１ドメイン内のアミノ酸残基（配列番号１の残基アミノ酸残基１〜８８（任意選択で、１〜８５））に結合する。任意選択で、本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ＭＩＣＡポリペプチドのα２ドメイン内のアミノ酸残基（配列番号１の残基アミノ酸残基８９〜１８１（任意選択で、８６〜１８１））に結合する。任意選択で、本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ＭＩＣＡポリペプチドのα１およびα２ドメイン内のアミノ酸残基に結合する。

【0079】

一実施形態において、抗体は、Ｑ４８およびＷ４９からなる群から選択される１もしくは２つの残基、ならびに／またはＥ５１、Ｄ５２、Ｖ５３およびＬ５４からなる群から選択される１、２、３もしくは４つの残基を含むエピトープに結合する（抗体６Ｅ４）。

【0080】

一実施形態において、抗体は、Ｎ５６、Ｋ５７およびＴ５８からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、ならびに／またはＲ６１およびＲ６４からなる群から選択される１もしくは２つの残基を含むエピトープに結合する（抗体９Ｃ１０および１２Ａ１０）。

【0081】

一実施形態において、抗体は、Ｋ８１およびＤ８２からなる群から選択される１もしくは２つの残基、Ｑ８３およびＫ８４からなる群から選択される１もしくは２つの残基、Ｈ１０９、Ｙ１１１およびＬ１１６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、任意選択で残基Ｄ１１３、Ｓ１３３、Ｒ１３４およびＴ１３７からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、ならびに／またはＭ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される１、２、３もしくは４つの残基を含むエピトープに結合する（抗体２０Ｃ６）。

【0082】

一実施形態において、抗体は、Ｋ８１およびＤ８２からなる群から選択される１もしくは２つの残基、Ｑ８３およびＫ８４からなる群から選択される１もしくは２つの残基、Ｈ１０９、Ｙ１１１およびＬ１１６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、任意選択で残基Ｄ１１３、Ｑ１３１、Ｓ１３２およびＱ１３６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、ならびに／またはＭ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される１、２、３もしくは４つの残基を含むエピトープに結合する（抗体１０Ａ７）。

【0083】

一実施形態において、抗体は、Ｅ１００、Ｄ１０１およびＮ１０２からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、Ｓ１０３、Ｔ１０４およびＲ１０５からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、Ｎ１２１およびＥ１２３からなる群から選択される１もしくは２つの残基、ならびに／またはＴ１２４およびＥ１２６からなる群から選択される１もしくは２つの残基を含むエピトープに結合する（抗体１９Ｅ９および１８Ｅ８）。

【0084】

一実施形態において、抗体は、Ｒ６およびＮ８からなる群から選択される１もしくは２つの残基、Ｅ９７およびＨ９９からなる群から選択される１もしくは２つの残基、Ｅ１００、Ｄ１０１およびＮ１０２からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、Ｓ１０３、Ｔ１０４およびＲ１０５からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、任意選択で残基Ｅ１１５、ならびに／またはＬ１７８、Ｒ１７９およびＲ１８０からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基を含むエピトープに結合する（抗体１５Ｆ９）。

【0085】

一実施形態において、本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドのα３ドメイン内で少なくとも部分的に結合するＭＩＣＡ結合化合物、好ましくは、抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。α３ドメインは、それぞれ配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドに関してアミノ酸残基１８２〜２７４内に局在する。一実施形態において、抗体は、Ｔ２２７、Ｑ２２８およびＱ２２９からなる群から選択される１、２または３つの残基を含むエピトープに結合する（抗体１４Ｂ４および１６Ａ８）。一実施形態において、抗体は、Ｓ２２４、Ｈ２２５およびＤ２２６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、Ｔ２２７、Ｑ２２８およびＱ２２９からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、ならびに／またはＷ２３０およびＤ２３２からなる群から選択される１もしくは２つの残基を含むエピトープに結合する（抗体１６Ａ８）。

【0086】

任意選択で、α１および／またはα２ドメイン内の上記残基のいずれかにおける変異を有するＭＩＣＡポリペプチドへの抗体の結合は、配列番号１の野生型ＭＩＣＡポリペプチドへの結合と比較して実質的に低減される。

【0087】

本発明は、抗ＭＩＣＡ抗体の使用が例えばヒト対象における癌、炎症および自己免疫障害の治療に有用であり得ることを提供する。

【0088】

一態様において、ＮＫＧ２ＤとＭＩＣＡとの間の相互作用を阻害しない抗体抗体、またはＮＫＧ２ＤとＭＩＣＡとの間の相互作用を阻害する抗体は、枯渇抗体である。そのような抗体は、癌の治療において特に有用であるが、炎症および自己免疫障害において使用することもできる。抗体は、所望の効果または抗体の使用に応じて毒性剤または他の薬剤にカップリングさせてまたはさせないで使用することができる。一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、「ネイキッド抗体（ｎａｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」であり、毒性剤にカップリングされておらず、任意選択で、ネイキッド抗体は、Ｆｃγ受容体、例えば、ＣＤ１６への結合を増加させるように改変されたＦｃ領域を含む。一実施形態において、ネイキッドまたはカップリング抗体は、Ｆｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）に結合するヒトＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１）を含む重鎖を含む。任意選択で、そのような抗体は、ＭＩＣＡを表面上で発現する細胞に対する補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導する。

【0089】

任意選択で、いずれかの実施形態において、抗体（例えば、ＩｇＧ１、抗体断片など）は、細胞に対して毒性である毒性剤（例えば、化学療法剤）をさらに含む。

【0090】

一態様において、エフェクター細胞中のＭＩＣＡ誘導ＮＫＧ２Ｄ活性を阻害する抗体は、非枯渇抗体（抗体が結合する細胞を枯渇させない抗体）である。一態様において、抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である。一態様において、抗体は、Ｆｃγ３Ａ受容体（ＣＤ１６）により結合され得る定常領域を含まず、例えば、ヒトＩｇＧ４サブタイプの抗体またはＦｃ断片を欠く抗体断片である。一実施形態において、抗体は、ＥＵインデックスによる残基２２８のセリンからプロリンへの変異を含むＩｇＧ４重鎖を含む。好ましくは、抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常領域を含む。そのような抗体は、炎症および自己免疫障害の治療において特に有用である。

【0091】

本開示は、ヒトＭＩＣＡに特異的に結合する抗体、抗体断片、および誘導体をさらに提供する。本発明は、そのような抗体組成物、その上癌、炎症障害および自己免疫障害を治療、予防および診断する本発明の方法のいずれかにおけるそれらの使用を提供する。

【0092】

一実施形態において、抗体は、ヒトＭＩＣＡポリペプチド（例えば、配列番号１〜５のＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７、^＊００８、および^＊０１９アレルの１、２、３つまたは全てのポリペプチド、好ましくは、ＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４および^＊００８のそれぞれ）についての１０^−８Ｍ未満、好ましくは、１０^−９Ｍ未満、または好ましくは、１０^−１０Ｍ未満の結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する。

【0093】

本発明の実施形態のいずれかの一態様において、抗体は、抗体６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９および１４Ｂ４からなる群から選択される抗体のそれぞれの重鎖および／または軽鎖の１、２または３つのＣＤＲを有する重鎖および／または軽鎖を有し得る。

【0094】

本発明の実施形態のいずれかの一態様において、抗体は、ＭＩＣＡポリペプチドへの結合について、モノクローナル抗体６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９および１４Ｂ４のいずれか１つまたは任意の組合せと競合する。一実施形態において、本発明の抗体は、ＭＩＣＡポリペプチドへの結合について、以下からなる群から選択される抗体と競合する：
（ａ）それぞれ配列番号７および８のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（６Ｅ４）；
（ｂ）（ａ）それぞれ配列番号２０および２１のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（２０Ｃ６）；
（ｃ）それぞれ配列番号３３および３４のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１６Ａ８）；
（ｄ）それぞれ配列番号４６および４７のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１９Ｅ９）；
（ｅ）それぞれ配列番号５７および５８のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（９Ｃ１０）；
（ｆ）それぞれ配列番号６８および６９のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１２Ａ１０）；
（ｇ）それぞれ配列番号７９および８０のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１０Ａ７）；
（ｈ）それぞれ配列番号９０および９１のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１８Ｅ８）；
（ｉ）それぞれ配列番号１０１および１０２のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１０Ｆ３）；
（ｊ）それぞれ配列番号１１２および１１３のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１５Ｆ９）；ならびに
（ｋ）それぞれ配列番号１２３および１２４のＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体（１４Ｂ４）。

【0095】

一実施形態において、抗体は、ヒトに好適である。一実施形態において、抗体は、キメラであり、例えば、非ネズミ、任意選択で、ヒト定常領域を含有する。一実施形態において、抗体は、ヒトまたはヒト化である。本発明の実施形態のいずれかの一態様において、抗体のアイソタイプは、ヒトＩｇＧ、任意選択で、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。一実施形態において、抗体は、ヒトＦｃドメインを含み、またはＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）により結合されるアイソタイプのもの、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプの抗体である。

【0096】

本発明の実施形態のいずれかの一態様において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、単鎖抗体断片、または複数の異なる抗体断片を含む多重特異的抗体から選択される抗体断片である。任意選択で、本発明の抗体は、さらにテトラマー（２つの重鎖および２つの軽鎖）であり、したがって、二価である（例えば、ＩｇＧ抗体）。

【0097】

ある実施形態において、本発明の抗体は、毒性剤をさらに含む。一実施形態において、毒性剤を含む抗体は、ＭＩＣＡを発現する細胞の死滅を直接引き起こし得る。一実施形態において、抗体は、ＭＩＣＡ発現細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％の細胞死を、例えばインビトロアッセイにおいて（例えば、免疫エフェクター細胞の不存在下で）直接誘導し得る。

【0098】

一態様において、本発明は、本発明の抗ＭＩＣＡ抗体を使用して治療する方法を提供する。抗体は、本明細書における実施形態のいずれかにおいて予防的または治療的治療として使用することができ；治療有効量の抗体を予防有効量の抗体と交換することができる。一態様において、本発明は、癌、自己免疫障害または炎症障害を有する患者を治療する方法であって、患者に医薬有効量の本発明によるＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する抗原結合化合物を投与することを含む方法を提供する。

【0099】

本発明の治療方法および本発明による抗ＭＩＣＡ抗体は、第２の治療剤、例として、癌を治療するために使用される場合に抗癌剤（例えば、化学療法薬、腫瘍ワクチン、腫瘍細胞上の腫瘍特異的抗原に結合する抗体、腫瘍細胞に対するＡＤＣＣを誘導する抗体、免疫応答を強化する抗体など）、または自己免疫もしくは炎症の治療に有用な薬剤との組合せで個体を治療するために使用することができる。一実施形態において、第２の治療剤は、活性化受容体に結合し、それを活性化させ、またはエフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞）上の阻害受容体に結合し、それを遮断する薬剤（例えば、抗体）である。一実施形態において、第２の治療剤は、腫瘍細胞上のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を上方調節する薬剤（例えば、化学療法剤）である。例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を使用することができる。例えば、バルプロエートおよびヒドララジンは、ＭＩＣＡ／Ｂ発現を増強し、シェディングを減少させる。（Ｃｈａｖｅｚ−Ｂｌａｎｃｏ ２０１１ Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ３９（６）：１４９１−１４９９）。

【0100】

循環中のｓＭＩＣのレベルの増加の存在は、不良予後および／またはＭＩＣ発現腫瘍に関連している。本発明は、さらに、本発明の抗ＭＩＣＡ剤（例えば、ＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗体）を使用する治療に応答する癌を有する対象を選択する方法であって、前記対象中の腫瘍細胞がＭＩＣＡポリペプチドをシェディングするか否かを（例えば、循環中のｓＭＩＣのレベルを評価して）決定することを含み、腫瘍細胞からのＭＩＣＡポリペプチドのシェディングの存在は、レスポンダー対象を示す方法に関する。

【0101】

本発明は、さらに、本発明の抗ＭＩＣＡ剤（例えば、ＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗体）を使用する治療に応答する障害（例えば、癌、自己免疫障害、炎症障害）を有する対象を選択する方法であって、前記対象中の細胞（例えば、腫瘍細胞、炎症促進細胞など）がＭＩＣＡポリペプチドを発現するか否かを決定することを含み、ＭＩＣＡポリペプチドの発現は、レスポンダー対象を示す方法に関する。一実施形態において、本方法は、前記対象中の細胞（例えば、腫瘍細胞、炎症促進細胞など）が、配列番号１〜５からなる群から選択されるＭＩＣＡポリペプチドを発現するか否かを決定することを含む。一実施形態において、本方法は、前記対象中の細胞が、配列番号１〜５の配列をそれぞれ含むＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７、^＊００８、および^＊０１９ポリペプチドからなる群から選択されるＭＩＣＡポリペプチドを発現するか否かを決定することを含み、ＭＩＣＡポリペプチドの発現は、レスポンダー対象を示す。一実施形態において、前記対象中の細胞がＭＩＣＡポリペプチドを発現するか否かを決定するステップは、対象からの生物学的試料（例えば、生検の実施および／または癌細胞、血液もしくは任意の組織試料などの試料を得ることによる）を、本発明の抗ＭＩＣＡ抗体（例えば、ＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７、^＊００８、および^＊０１９ポリペプチドの１、２、３、４つまたは全てに結合する抗体）と接触させることを含む。一実施形態において、本方法は、前記対象がシェディングされたＭＩＣＡを含むか否かを決定すること（例えば、循環中のｓＭＩＣＡを検出することまたはエキソソームの表面上（例えば、^＊００８アレル）のＭＩＣＡの存在を検出することを含む。

【0102】

任意選択で、本方法のいずれかにおいて、本方法は、レスポンダー対象にＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗体（例えば、本発明の抗ＭＩＣＡ抗体）を投与することをさらに含む。

【0103】

好ましい実施形態において、疾患関連細胞中のＭＩＣＡポリペプチドの発現は、ＭＩＣＡ特異的リガンドを使用して決定する。好ましくは、リガンドは、抗体、またはその断片もしくは誘導体である。

【0104】

別の態様において、本発明は、患者がＭＩＣＡポリペプチド、例えば、本発明の抗体により結合されるＭＩＣＡポリペプチド（１つ以上のＭＩＣＡアレル）を発現する疾患関連細胞（例えば、腫瘍細胞）を有するか否かを評価することを含む方法（例えば、診断アッセイ、レスポンダーアッセイなどを実施する方法）を含む。前記方法は、例えば、疾患関連細胞を含む患者からの生物学的試料を得ること、前記疾患関連細胞をそのような抗体と接触させること、および抗体が疾患関連細胞に結合するか否かを評価することを含み得る。ＭＩＣＡが疾患関連細胞により発現されるという知見は、患者がＭＩＣＡ発現細胞により特徴づけられる病態を有し、および／または本発明の抗ＭＩＣＡ抗体による治療に好適であることを示す。患者は、ＭＩＣＡ発現細胞により特徴づけられる特定の疾患に好適な治療によりさらに治療することができる。任意選択で、患者は、抗ＭＩＣＡ抗体により治療する。一実施形態において、本方法は、癌を有する対象を選択するために使用し、疾患関連細胞は癌細胞である。

【0105】

本発明は、患者を治療する方法であって、
ａ）患者が病原性ＭＩＣＡ発現細胞を有するか否かを決定すること、および
ｂ）患者が病原性ＭＩＣＡ発現細胞を有すると決定された場合、本発明の抗原結合化合物（例えば、抗体）を投与すること
を含む方法も提供する。

【0106】

本発明は、患者を治療する方法であって、
ａ）患者中でシェディングされたＭＩＣＡのレベルを測定すること、および
ｂ）患者がシェディングされたＭＩＣＡの上昇されたレベルを有すると決定された場合、免疫エフェクター細胞上のＮＫＧ２Ｄの下方モジュレーションを引き起こすｓＭＩＣＡの能力を阻害する本発明の抗原結合化合物（例えば、抗体）を投与すること
を含む方法も提供する。

【0107】

本発明のこれらおよび追加の有利な態様および特徴を本明細書の他箇所でさらに記載することができる。

【図面の簡単な説明】

【0108】

【図1】図１Ａ−Ｂは、フローサイトメトリーにより分析された、ＭＩＣＡ発現ＣＲ１形質移入細胞のＣ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００１、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００４、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００７およびＣ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００８への第１、第２および第３の免疫化系列から得られた抗体の結合を示す。

【図2】図２Ａ−Ｇは、暗陰影において抗体による結合の損失を（異なる組合せで）もたらした変異アミノ酸残基を含むＭＩＣＡポリペプチドの図を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合部位をＭＩＣＡポリペプチドの頂部において、中位陰影において（およびＭＩＣＡに結合しているリボンダイアグラムにおいても）示す。

【図3】図３は、単独のまたはアイソタイプ対照もしくはキメラ抗ＭＩＣＡ抗体とプレインキュベートされたＭＩＣＡ^＊０１−ＢｉｒＡのＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃチップ上への注入を示す重ね合わせたセンサーグラムを示す。センサーグラムは、Ｙ軸において正規化し、注入の終了においてＸ軸においてアラインした。センサーグラムは、２つの独立実験の代表例である。

【図4】図４は、^５１Ｃｒの標的細胞放出を計測することにより測定された、ＭＩＣＡ^＊０１９形質移入ＢａＦ／３のＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ１６−ＮＫ９２細胞媒介殺傷を低減させ、または阻害する抗ＭＩＣＡ抗体の能力を示すＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ａ遮断についての機能アッセイの結果を示す。

【図5】図５Ａ−Ｃは、抗ＭＩＣＡ抗体のＵＬＢＰ−１−Ｆｃ（Ｆｃ１）、ＭＩＣＢ−Ｆｃ（Ｆｃ２）、ＵＬＢＰ−２−Ｆｃ（Ｆｃ３）およびＵＬＢＰ−３−Ｆｃ（Ｆｃ４）上への注入を示す重ね合わせたセンサーグラムを示す。センサーグラムは、注入の開始においてＸ軸においてアラインした。

【図6】図６は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＭＩＣＡへの抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す。

【図7】図７は、抗ＭＩＣＡ抗体とのＭＩＣＡ発現細胞の一晩インキュベーション後の上清中の可溶性ＭＩＣＡ濃度を計測することにより評価された、ＭＩＣＡシェディングを遮断する能力についてのアッセイにおいて、抗α３ドメインＢＡＭ０３により媒介されるＭＩＣＡシェディングの阻害を示すが、１６Ａ８により媒介されるＭＩＣＡシェディングの阻害を示さない。

【図8】図８は、ＮＫＧ２Ｄが増加用量の組換え二価ＭＩＣＡ^＊０１９^＊Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下でその初期レベルの３０〜４０％だけ下方モジュレートされること、および実施例５Ｂ（表Ｅ）の細胞毒性アッセイにおいてＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断する抗ＭＩＣＡ抗体がＮＫ細胞上で発現されたＮＫＧ２ＤとＭＩＣＡ^＊０１９−Ｆｃとの相互作用を遮断しており、したがって、ＭＩＣＡ^＊０１９−Ｆｃにより誘導されるＮＫＧ２Ｄ下方モジュレーションを逆転させることを示す。

【図9】図９は、ヒト補体の存在下の示されるＲａｊｉ−ＭＩＣＡ^＊０１細胞の生存率を示す。結果は、抗ＭＩＣＡ（アイソタイプマッチ）が死滅細胞の数の増加を引き起こし、ＣＤＣをエピトープ依存的に誘導し得ることを示す。

【図10】図１０Ａは、抗ＭＩＣＡが陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）と比較してヒトＫＨＹＧ−１ ｈＣＤ１６Ｖ ＮＫ細胞系によるＣ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００８細胞の特異的溶解をそれぞれ誘導したことを示し、それにより、それらの抗体がＭＩＣＡ^＊００８発現標的細胞に対するＡＤＣＣを誘導することを示す。図１０Ｂは、細胞への抗体結合のレベルを示す。

【図11】図１１は、マウス長期Ｒａｊｉ−ＭＩＣＡ^＊０１腫瘍モデルの試験の結果を示す。キメラ抗ＭＩＣＡまたはＩＣ（３週間、３００μｇ ＩＰ２×／週）またはＰＢＳにより処理されたＲａｊｉ−ＭＩＣＡ０１Ｈｉｇｈが１５ＭでＩＶ移植されたＮｏｄ ＳＣＩＤマウスの生存期間。本発明の抗ＭＩＣＡ抗体は、生存期間を増加させた。

【発明を実施するための形態】

【0109】

導入
本発明の抗体は、ＭＩＣＡ発現細胞、特に腫瘍細胞および炎症または自己免疫プロセスに関与する細胞を直接および特異的に標的化し得る。本発明は、グループ１およびグループ２アレルの両方、さらにそれらのグループ内の主要ヒトＭＩＣＡアレルにわたり結合するそのような特性を有する多数の抗体を提供する。さらに、特定のアプローチに有用な異なる抗体が提供される。一部の抗体は、ＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄ相互作用を遮断し、ＮＫＧ２Ｄ表面発現の可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）誘導下方モジュレーションを妨害し；それにより、それらは患者におけるＮＫＧ２Ｄ発現を回復させるために有用である。そのような抗体は、リンパ球上のＮＫＧ２ＤによるＭＩＣＡの結合により引き起こされるＮＫＧ２Ｄ活性化を遮断するそれらの能力について使用することもでき、炎症および自己免疫障害の治療において特に有利である。他の抗体は、ＭＩＣＡへの結合についてＮＫＧ２Ｄと競合せず、エフェクター細胞上のＮＫＧ２Ｄ機能の維持が望まれる場合に癌の治療において有利である。任意選択で、抗体は、ＭＩＣＡ発現腫瘍細胞からのＭＩＣＡのシェディングを遮断しない。任意選択で、抗体は、ＭＩＣＡのα１α２ドメイン（α１ドメインおよびα２ドメインから形成されるＭＩＣＡタンパク質の一部）に結合する。さらに、ＭＩＣＡアレルにわたり存在し、高結合親和性のために抗体により標的化することができるα１α２ドメインおよびα３ドメイン上のエピトープが提供される。

【0110】

ＭＩＣＡ（ＰＥＲＢ１１．１）は、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｑ２９９８３参照）、その遺伝子およびｃＤＮＡならびにその遺伝子産物、またはその天然バリアントを指す。ＭＩＣＡ遺伝子およびタンパク質の命名は、異なるアレルについての配列のアクセッション番号への参照と一緒に、Ｆｒｉｇｏｕｌ Ａ．ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ−Ｐ．Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ．，３（２００５）：９５−１４５ ＩＳＢＮ：８１−７７３６−２４４−５に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＭＩＣＡ遺伝子およびタンパク質配列は、タンパク質およびＤＮＡレベルにおける多型を含み、Ｄｒ．Ｂａｈｒａｍの実験室により維持されるｈｔｔｐ：／／ｍｈｃ−ｘ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ｈｕｍａｎ．ｈｔｍからも利用可能である。

【0111】

ＭＩＣＡのアミノ酸配列は、Ｂａｈｒａｍ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：６２５９−６２６３およびＢａｈｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４４：８０−８１に最初に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＭＩＣＡ遺伝子は多型性であり、細胞外α１、α２、およびα３ドメイン中の多数のバリアントアミノ酸の特有の分布を示す。ＭＩＣＡの多型をさらに定義するため、Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．（１９９９）は、共通のおよび希少なＨＬＡ遺伝子型を有する２７５個体の中でそのアレルを試験した。ヒトＭＩＣＡの細胞外α１、α２、およびα３ドメインのアミノ酸配列を配列番号１〜５に示す。完全ＭＩＣＡ配列は、２３アミノ酸のリーダー配列、ならびに膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをさらに含む。選択ヒトＭＩＣＡアレルの細胞外α１、α２、およびα３ドメインのアミノ酸配列を配列番号１〜５に示す。ＭＩＣＡ^＊００１のアミノ酸配列を配列番号１に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６０に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ^＊００４のアミノ酸配列を配列番号２に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６３に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ^＊００７のアミノ酸配列を配列番号３に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６６に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ^＊００８のアミノ酸配列を配列番号４に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６７に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ^＊０１９のアミノ酸配列を配列番号５に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ２７００８に対応する。ヒトＭＩＣＢのアミノ酸配列を配列番号６に示され、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＩ１８７４７に対応する。

【0112】

ＭＩＣＡ遺伝子は、ＭｈｃＳＦおよびＩｇＳＦに属するタンパク質をコードする。このタンパク質は、膜貫通ＭＨＣ−Ｉ−アルファ様（Ｉ−アルファ様）鎖であり、３つの細胞外ドメイン、２つの遠位Ｇ様ドメイン、Ｇ−アルファ１様（「Ｄ１」または「α１」とも称される）およびＧ−アルファ２様（「Ｄ２」または「α２」とも称される）、および細胞膜に近位のＣ様ドメイン（「Ｄ３」または「α３」とも称される）、ならびに３つの領域、結合領域、膜貫通領域および細胞質領域（ＩＭＧＴ（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））のＩＭＧＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｈａｒｔ、ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｏｒｇおよびＬｅＦｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５；５：４５−６０による標識）を含む。リーダー、ＥＣＤ、ＴＭおよびＣＹドメインを含むＭＩＣＡ成熟タンパク質は、３６０〜３６６アミノ酸から構成され、差は、膜貫通領域中のマイクロサテライト多型から生じる。α１、α２およびα３は、任意の好適な番号付与系（例えば、ＩＭＧＴ番号付与系）に従って定義することができる。一実施形態において、α１ドメインは、配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドの残基位置１〜８８を含み；α２ドメインは、配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドの残基位置８９〜１８１を含み；α３ドメインは、配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドの残基位置１８２〜２７４を含む。α１およびα２ドメインは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ鎖、ＡＢ、ＢＣおよびＣＤターンならびにへリックスをそれぞれ含む。α３ドメインは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ鎖、ＢＣループ、ＣＤ鎖、ＤＥターンおよびＦＧループを含む。Ｏ−グリカン（セリンまたはトレオニンに結合しているＮ−アセチルラクトサミン）および／またはＮ−グリカンを含む、α１中に２つ、α２中に１つおよびα３ドメイン中に５つの８つの潜在的グリコシル化部位を有するＭＩＣＡタンパク質は、高度にグリコシル化される。ＭＩＣＡは、ある細胞中で構成的に発現される一方、低レベルのＭＩＣＡ発現は、通常、宿主免疫細胞接着を生じさせない。しかしながら、ＭＩＣＡは、急速に増殖する細胞、例えば、腫瘍細胞上で上方調節される。全てのＮＫＧ２ＤリガンドのＭＩＣＡは最も高度に発現され、それは広範な腫瘍タイプ（例えば、一般の癌種、膀胱癌、黒色腫、肺癌、肝細胞癌、膠芽細胞腫、前立腺癌、一般の血液悪性腫瘍、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ球性白血病にわたり見出されている。近年、Ｔｓｕｂｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）（ＥＭＢＯ Ｊ：１−１３）は、Ｏ−グリカン分枝酵素、コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）がＭＩＣＡ発現腫瘍細胞中で活性であることおよび腫瘍細胞からのＭＩＣＡがコア２Ｏ−グリカン（Ｎ−アセチルガラクトサミンに連結しているＮ−アセチルグルコサミン分枝を含むＯ−グリカン）を含有することを報告した。

【0113】

Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：７２７−７２９，１９９９は、ＮＫＧ２Ｄについてのストレス誘導性リガンドとしてのＭＩＣＡについての役割を提供した。本明細書において使用される「ＭＩＣＡ」は、ＭＩＣＡ遺伝子の任意のバリアント、誘導体、もしくはアイソフォームまたはそれらが指すコードされるタンパク質を含む任意のＭＩＣＡポリペプチドを指す。ＭＩＣＡ遺伝子は多型性であり、細胞外アルファ−１、アルファ−２、およびアルファ−３ドメイン中の多数のバリアントアミノ酸の特有の分布を示す。種々のアレルバリアントは、ＭＩＣＡポリペプチド（例えば、ＭＩＣＡ）について報告されており、それらのそれぞれは、それぞれの用語、例として、例えば、ヒトＭＩＣＡポリペプチドＭＩＣＡ^＊００１、ＭＩＣＡ^＊００２、ＭＩＣＡ^＊００４、ＭＩＣＡ^＊００５、ＭＩＣＡ^＊００６、ＭＩＣＡ^＊００７、ＭＩＣＡ^＊００８、ＭＩＣＡ^＊００９、ＭＩＣＡ^＊０１０、ＭＩＣＡ^＊０１１、ＭＩＣＡ^＊０１２、ＭＩＣＡ^＊０１３、ＭＩＣＡ^＊０１４、ＭＩＣＡ^＊０１５、ＭＩＣＡ^＊０１６、ＭＩＣＡ^＊０１７、ＭＩＣＡ^＊０１８、ＭＩＣＡ^＊０１９、ＭＩＣＡ^＊０２０、ＭＩＣＡ^＊０２２、ＭＩＣＡ^＊０２３、ＭＩＣＡ^＊０２４、ＭＩＣＡ^＊０２５、ＭＩＣＡ^＊０２６、ＭＩＣＡ^＊０２７、ＭＩＣＡ^＊０２８、ＭＩＣＡ^＊０２９、ＭＩＣＡ^＊０３０、ＭＩＣＡ^＊０３１、ＭＩＣＡ^＊０３２、ＭＩＣＡ^＊０３３、ＭＩＣＡ^＊０３４、ＭＩＣＡ^＊０３５、ＭＩＣＡ^＊０３６、ＭＩＣＡ^＊０３７、ＭＩＣＡ^＊０３８、ＭＩＣＡ^＊０３９、ＭＩＣＡ^＊０４０、ＭＩＣＡ^＊０４１、ＭＩＣＡ^＊０４２、ＭＩＣＡ^＊０４３、ＭＩＣＡ^＊０４４、ＭＩＣＡ^＊０４５、ＭＩＣＡ^＊０４６、ＭＩＣＡ^＊０４７、ＭＩＣＡ^＊０４８、ＭＩＣＡ^＊０４９、ＭＩＣＡ^＊０５０、ＭＩＣＡ^＊０５１、ＭＩＣＡ^＊０５２、ＭＩＣＡ^＊０５３、ＭＩＣＡ^＊０５４、ＭＩＣＡ^＊０５５およびＭＩＣＡ^＊０５６により包含される。野生型全長ＭＩＣＡと１つ以上の生物学的特性または機能をそれぞれ共有し、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を共有する任意の核酸またはタンパク質配列も包含される。

【0114】

本明細書において使用される「ｈＮＫＧ２Ｄ」および、特に記載のない限り、または文脈により矛盾がない限り、用語「ＮＫＧ２Ｄ」、「ＮＫＧ２−Ｄ」、「ＣＤ３１４」、「Ｄ１２Ｓ２４８９Ｅ」、「ＫＬＲＫ１」、「キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＫ、メンバー１」、または「ＫＬＲＫ１」は、ヒトキラー細胞活性化受容体遺伝子、そのｃＤＮＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７３６０）、およびその遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３１３８６）、またはその天然バリアントを指す。ＮＫおよびＴ細胞中で、ｈＮＫＧ２Ｄは、タンパク質、例えば、ＤＡＰ１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ２９４２５、ＡＡＤ５０２９３）とヘテロダイマーまたはより高次の複合体を形成し得る。本明細書においてｈＮＫＧ２Ｄに起因する任意の活性、例えば、細胞活性化、抗体認識などは、ヘテロダイマーの形態のｈＮＫＧ２Ｄ、例えば、ｈＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０、またはそれら２つの（および／または他の）成分とのより高次の複合体にも起因し得る。

【0115】

ＮＫＧ２Ｄとの複合体中のＭＩＣＡの三次元構造は、決定されている（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；２：４４３−４５１；コード１ｈｙｒ、およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ（Ｋａａｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４；３２：Ｄ２０８−Ｄ２１０）参照）。ＭＩＣＡがＮＫＧ２Ｄホモダイマーとの複合体中に存在する場合、ＭＩＣＡα２の残基６３〜７３（ＩＧＭＴ番号付与）が配列され、ほぼ２つのへリックスのターンを付与する。ＮＫＧ２Ｄの２つのモノマーは、ＭＩＣＡとの相互作用に等しく寄与し、それぞれのＮＫＧ２Ｄモノマー中の７つの位置がＭＩＣＡα１またはα２へリックスドメインの１つと相互作用する。

【0116】

本発明は、本発明の抗原結合化合物を使用する方法を提供し；例えば、本発明は、細胞増殖または活性を阻害する方法、分子を細胞（例えば、毒性分子、検出可能マーカーなど）に送達する方法、細胞を標的化、同定または精製する方法、細胞を枯渇、殺傷または排除する方法、細胞増殖を低減させる方法であって、細胞、例えば、ＭＩＣＡポリペプチドを発現する腫瘍細胞を、ＭＩＣＡポリペプチドに結合する本発明の抗原結合化合物に曝露することを含む方法を提供する。本発明の目的のため、「細胞増殖」は、細胞の成長または増殖の任意の態様、例えば、細胞成長、細胞分裂、または細胞周期の任意の態様を指し得ることが認識される。細胞は、細胞培養物（インビトロ）または哺乳動物（インビボ）、例えば、ＭＩＣＡ発現病変を罹患する哺乳動物中に存在し得る。本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドを発現する細胞の死滅を誘導し、またはその細胞を増殖もしくは活性を阻害する方法であって、細胞を、細胞の死滅を誘導し、および／または細胞の増殖を阻害するために有効な量の毒性剤に結合しているＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗原結合化合物に曝露させることを含む方法も提供する。したがって、本発明は、増殖疾患、およびＭＩＣＡポリペプチドの細胞発現の病原性拡張により特徴づけられる任意の病態を罹患する哺乳動物を治療する方法であって、例えば、癌の治療のために、医薬有効量の本明細書に開示の抗原結合化合物を投与することを哺乳動物に含む方法を提供する。

【0117】

定義
本明細書において使用される「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲において使用され、語「含む」とともに使用される場合、語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。本明細書において使用される「別の」は、少なくとも第２以上を意味し得る。

【0118】

「含む」が使用される場合、これは、好ましくは、「〜から本質的になる」、より好ましくは、「〜からなる」により置き換えることができる。

【0119】

本明細書全体内で「増殖疾患の治療」または「腫瘍の治療」、または「癌の治療」などは、抗ＭＩＣＡ結合剤（例えば、抗体）に関して挙げられる場合、それらは、（ａ）増殖疾患を治療する方法であって、（好ましくは、薬学的に許容可能な担体材料中の）抗ＭＩＣＡ結合剤を、そのような治療が必要とされる温血動物、特にヒトに、前記疾患の治療を可能とする用量（治療有効量）で、好ましくは、上記および下記で好ましいと規定される用量（量）で（少なくとも１つの治療のために）投与するステップを含む方法；（ｂ）増殖疾患の治療のための、抗ＭＩＣＡ結合剤の使用、または前記治療（特にヒト）において使用される抗ＭＩＣＡ結合剤；（ｃ）増殖疾患の治療のための医薬調製物の製造のための、抗ＭＩＣＡ結合剤の使用、増殖疾患の治療のための医薬調製物の製造のために抗ＭＩＣＡ結合剤を使用する方法であって、抗ＭＩＣＡ結合剤を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む方法、もしくは増殖疾患の治療に適切な有効用量の抗ＭＩＣＡ結合剤を含む医薬調製物；または（ｄ）ａ）、ｂ）、およびｃ）の任意の組合せを意味し、本出願が出願される国において特許化の許容可能な主題に従う。

【0120】

本明細書において使用される用語「癌」および「腫瘍」は、制御不能および進行性の増殖を含む細胞または組織の新たな成長と定義される。具体的な実施形態において、自然経過時に癌は致命的である。具体的な実施形態において、癌は侵襲性、転移性、および／または未分化（分化ならびに互いおよびそれらの軸のフレームワークへの配向の損失）である。

【0121】

本明細書において使用される用語「生検」は、試験の目的のため、例えば、診断を確定するための臓器からの組織の取出と定義される。生検のタイプの例としては、吸引の適用によるもの、例えば、シリンジに取り付けられた針を介するもの；組織の断片の装置による取出によるもの；内視鏡を介する適切な装置による取出によるもの；例えば、病巣全体の外科的切除によるもの；などが挙げられる。

【0122】

本明細書において使用される用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖中の定常ドメインのタイプに応じて、抗体は、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの１つに割り当てられる。これらのいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などにさらに分類される。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含む。それぞれのテトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖ペアから構成され、それぞれのペアは、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。それぞれの鎖のＮ末端は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸からなる可変領域を定義する。可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）および可変重鎖（Ｖ_Ｈ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」および「ミュー」と称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは、それらが生理学的状況における最も一般的な抗体であるため、およびそれらが研究室の環境において最も容易に作製されるため、本発明において用いられる好ましいクラスの抗体であり、ＩｇＧが特に好ましい。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。ヒト化、キメラ、ヒト、またはそれ以外ではヒトに好適な抗体が特に好ましい。「抗体」として、本明細書に記載の抗体のいずれかの任意の断片または誘導体も挙げられる。

【0123】

用語「に特異的に結合する」は、抗体が、好ましくは、競合結合アッセイにおいて、タンパク質の組換え形態、その中のエピトープ、または単離標的細胞の表面上に存在する天然タンパク質のいずれかを使用して評価される場合、結合パートナー、例えばＭＩＣＡに結合し得ることを意味する。競合結合アッセイおよび特異的結合を決定する他の方法は、下記にさらに記載され、当分野において周知である。

【0124】

抗体が特定のモノクローナル抗体（例えば、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８）「と競合する」と言われる場合、それは、抗体が、組換えＭＩＣＡ分子または表面発現ＭＩＣＡ分子のいずれかを使用する結合アッセイにおいてモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が結合アッセイにおいてＭＩＣＡポリペプチドまたはＭＩＣＡ発現細胞への６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８の結合を低減させる場合、抗体は、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８とそれぞれ「競合する」と言われる。

【0125】

本明細書において使用される用語「親和性」は、抗体のエピトープへの結合強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］（式中、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合抗原のモル濃度である）として定義される解離定数Ｋ_Ｄにより与えられる。親和性定数Ｋ_ａは、１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を測定する好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２、１９９３）、およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に見出すことができ、その参照文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を測定する当分野において周知の１つの好ましい標準的方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析によるもの）の使用である。

【0126】

本明細書に関する範囲内で、「決定基」は、ポリペプチド上での相互作用または結合の部位を指定する。

【0127】

用語「エピトープ」は、抗原決定基を指し、抗体が結合する抗原上の区域または領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、および特異的抗原結合抗体またはペプチドにより有効に遮断されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。それは、例えば、抗体または受容体と結合し得る複合抗原分子上の最も単純な形態または最小の構造領域である。エピトープは、直鎖または立体構造的／構造的であり得る。用語「直鎖エピトープ」は、アミノ酸の直鎖配列（一次構造）上で連続するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。用語「立体構造的または構造的エピトープ」は、全てが連続しておらず、したがって、分子のフォールディング（二次、三次および／または四次構造）により互いに近接されるアミノ酸の直鎖配列の分離部分を表すアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。立体構造的エピトープは、三次元構造に依存する。したがって、用語「立体構造的」は、「構造的」と交換可能に使用されることが多い。

【0128】

ＭＩＣＡ発現細胞に関する用語「枯渇」は、殺傷、排除、溶解またはそのような殺傷、排除もしくは溶解を誘導して試料中または対象中に存在するＭＩＣＡ発現細胞の数に負に影響し得るプロセス、方法、または化合物を意味する。

【0129】

本発明による「薬剤」または「化合物」は、小分子、ポリペプチド、タンパク質、抗体または抗体断片を含む。本発明に関する小分子は、一実施形態において、１０００ダルトン未満、特に８００ダルトン未満、より特定すると、５００ダルトン未満の分子量を有する化学物質を意味する。用語「治療剤」は、生物学的活性を有する薬剤を指す。用語「抗癌剤」は、癌細胞に対する生物学的活性を有する薬剤を指す。

【0130】

抗体に関する用語「ヒトに好適な」は、例えば本明細書に記載の治療方法にヒトにおいて安全に使用することができる任意の抗体、誘導体化抗体、または抗体断片を指す。ヒトに好適な抗体としては、全てのタイプのヒト化、キメラ、もしくは完全ヒト抗体、または抗体の少なくとも一部が、ヒトに由来し、またはそうでなければ一般に天然非ヒト抗体が使用される場合に誘発される免疫応答を回避するように改変されている任意の抗体が挙げられる。

【0131】

本発明の目的のため、「ヒト化」または「ヒト」抗体は、１つ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が、動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合している抗体を指す。そのような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように設計される。そのような抗体は、抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように「遺伝子操作」されたトランスジェニックマウスまたは他の動物から得ることができる（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ７：１３；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎ ６：５７９参照、それらの全教示は、参照により本明細書に組み込まれる）。完全ヒト抗体は、遺伝子または染色体形質移入（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法、およびファージディスプレイ技術により構築することもでき、それらは全て当分野において公知である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３参照）。ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞により生成することもできる（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および米国特許第５，２２９，２７５号明細書参照、それらは全て、参照により全体として組み込まれる）。

【0132】

「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が異なるもしくは変化されたクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域、もしくはキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤などに結合するように定常領域もしくはその一部が変化、置換、もしくは交換されている抗体分子；または（ｂ）可変領域、もしくはその一部が可変領域が異なるもしくは変化された抗原特異性を有する可変領域により変化、置換、もしくは交換されている抗体分子である。

【0133】

用語「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」および「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖、例えば、約アミノ酸（ａａ）２３０〜約ａａ４５０のヒトγ（ガンマ）重鎖、または他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体についてのα、δ、εおよびμ）におけるその相当配列、またはその天然アロタイプのＣ末端断片を指す。特に記載のない限り、免疫グロブリンについての一般に認められたＫａｂａｔアミノ酸番号付与が、本開示全体に使用される（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ参照、「Ｋａｂａｔ ＥＵ」とも称される）。

【0134】

用語「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」または「ＡＤＣＣ」は、当分野において十分理解されている用語であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する非特異的細胞毒性細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球、および好酸球が挙げられる。

【0135】

用語「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」は、当分野において十分理解されている用語であり、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を指す。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体化している分子（例えば、抗体）への補体系の第１の補体（Ｃ１ｑ）の結合により開始される。

【0136】

ＭＩＣＡに関する用語「シェディング」は、ＭＩＣＡを発現する細胞の細胞表面からのＭＩＣＡの可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）断片の放出を指す。そのようなシェディングは、細胞表面からのＥＣＤ断片の放出をもたらす細胞表面ＭＩＣＡのタンパク質分解開裂（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えば、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７の作用を介する）により引き起こされ得、または可溶性ＥＣＤもしくはその断片は、選択的転写産物によりコードされ得る。

【0137】

用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、通常、天然状態で見出される場合に材料に付随する成分を実質的または本質的に有さない材料を指す。純度および等質性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。調製物中に存在する優勢種であるタンパク質は、実質的に精製される。

【0138】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体である場合のアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。

【0139】

用語「組換え体」は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入もしくは天然核酸もしくはタンパク質の変化により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現し、または発現され、もしくは全く発現されない下で他で異常発現される天然遺伝子を発現する。

【0140】

本明細書において使用される「ＮＫ細胞」は、非慣用免疫に関与するリンパ球の下位集団を指す。ＮＫ細胞は、ある特徴および生物学的特性、例えば、特異的表面抗原、例として、ヒトＮＫ細胞についてＣＤ５６および／またはＣＤ１６の発現、細胞表面上のアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体の不存在、特異的細胞溶解機序の活性化により「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現し得ない細胞に結合し、それを殺傷する能力、ＮＫ活性化受容体についてのリガンドを発現する腫瘍細胞または他の疾患細胞を殺傷する能力、ならびに免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力により同定することができる。これらの特徴および活性のいずれかを使用し、当分野において周知の方法を使用してＮＫ細胞を同定することができる。ＮＫ細胞のいずれの下位集団も、ＮＫ細胞という用語により包含される。本発明に関する範囲内で、「活性」ＮＫ細胞は、生物学的に活性なＮＫ細胞、例として、標的細胞を溶解し、または他の細胞の免疫機能を向上させる能力を有するＮＫ細胞を指定する。例えば、「活性」ＮＫ細胞は、ＮＫ受容体を活性化させるためのリガンドを発現し、および／またはＮＫ細胞上のＫＩＲにより認識されるＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現し得ない細胞を殺傷し得る。ＮＫ細胞は、当分野において公知の種々の技術、例えば、血液試料からの単離、細胞吸着、組織または細胞回収などにより得ることができる。ＮＫ細胞を伴うアッセイのための有用なプロトコルは、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＫＳ ａｎｄ Ｃｏｌｏｎｎａ Ｍ）．Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．２１９−２３８（２０００）に見出すことができる。

【0141】

本明細書において使用される「Ｔ細胞」は、胸腺中で成熟し、数ある分子のうち、Ｔ細胞受容体を表面上でディスプレイするリンパ球の下位集団を指す。Ｔ細胞は、ある特徴および生物学的特性、例えば、特異的表面抗原、例として、ＴＣＲ、ＣＤ４またはＣＤ８の発現、腫瘍または感染細胞の殺傷するあるＴ細胞の能力、免疫系の他の細胞を活性化させるあるＴ細胞の能力、および免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力により同定することができる。これらの特徴および活性のいずれかを使用し、当分野において周知の方法を使用してＴ細胞を同定することができる。本発明に関する範囲内で、「活性」または「活性化」ＴまたはＮＫ細胞は、生物学的に活性なＴまたはＮＫ細胞、より特定すると、細胞溶解または例えば、サイトカインの分泌による免疫応答を刺激する能力を有するＴまたはＮＫ細胞を指定する。活性細胞は、多数の周知の方法のいずれか、例として、機能アッセイおよび発現ベースアッセイ、例えば、サイトカインの発現において検出することができる。

【0142】

本発明に関する範囲内で、ポリペプチドまたはエピトープに「結合する」抗体という用語は、前記決定基に特異性および／または親和性を有して結合する抗体を指定する。

【0143】

抗体
本発明の抗体は、異なるアレルにわたるヒトＭＩＣＡに結合する抗体である。一実施形態において、抗体は、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用（例えば、腫瘍細胞上の表面ＭＩＣＡと、エフェクター細胞上の表面ＮＫＧ２Ｄとの相互作用）を実質的に遮断せずにＭＩＣＡポリペプチドに結合する（抗ＭＩＣＡ抗体）。別の実施形態において、抗体は、ＭＩＣＡポリペプチドに結合し（抗ＭＩＣＡ抗体）、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を阻害し；好ましくは、抗体は、ｓＭＩＣＡにより引き起こされる免疫細胞の表面上のＮＫＧ２Ｄの下方モジュレーションを阻害する。一実施形態において、抗体は、細胞表面（例えば、腫瘍細胞）からのＭＩＣＡのシェディングを実質的に遮断せずに細胞の表面上のＭＩＣＡポリペプチドに結合する。一実施形態において、抗体は、ＭＩＣＡのα１および／またはα２ドメインに結合する。一実施形態において、抗体は、ＭＩＣＡのα３ドメインに結合する。一実施形態において、抗体は、ヒトＭＩＣＡアレル^＊００１、^＊００４および^＊００８、任意選択でさらに^＊００７および／または^＊０１９についての任意選択で、１０^−９Ｍ未満、好ましくは、１０^−１０Ｍ未満のＫｄにより特徴づけられる親和性を有する。

【0144】

一実施形態において、抗体は、ＭＩＣＡポリペプチドへの結合について抗体６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９および１４Ｂ４のいずれか１つ以上と競合する。好ましくは、抗体は、ＭＩＣＡポリペプチド上の実質的もしくは本質的に同一の、または同一のエピトープまたは「エピトープ部位」を認識し、それに結合し、またはそれについての免疫特異性を有する。

【0145】

抗体エピトープ
別の実施形態において、抗体は、抗体６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９および１４Ｂ４と実質的に同一のエピトープに結合する。別の実施形態において、抗体は、配列番号１〜５のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドの残基１〜８８、残基８９〜１８１、または残基１８２〜２７４に対応するセグメント中の少なくとも１つの残基と少なくとも部分的に重複し、またはそれを含む。一実施形態において、エピトープの全ての重要な残基は、配列番号１〜５のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドの残基１〜８８、残基８９〜１８１、または残基１８２〜２７４に対応するセグメント中に存在する。一実施形態において、抗体は、（ａ）α１および／またはα２ドメインならびに（ｂ）α３ドメインのジャンクションをスパンするエピトープに結合し、エピトープの全ての重要な残基は、配列番号１〜５のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドの残基１〜１８１（例えば、残基１〜８８（任意選択で、１〜８５）または８９〜１８１（任意選択で、８６〜１８１））に対応するセグメント中に存在する。一実施形態において、抗体は、配列番号１〜５のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドの残基１〜８８（任意選択で、１〜８５）または残基８９〜１８１（任意選択で、８６〜１８１））に対応するセグメント中の１、２、３、４、５、６、７つ以上の残基を含むエピトープに結合する。好ましくは、抗体により結合される残基は、ＭＩＣＡポリペプチドの表面上に、例えば、細胞の表面上で発現されるＭＩＣＡポリペプチド中に存在する。

【0146】

一実施形態において、抗体は、Ｒ６、Ｎ８、Ｑ４８、Ｗ４９、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ５３、Ｌ５４、Ｎ５６、Ｋ５７、Ｔ５８、Ｒ６１、Ｒ６４、Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４、Ｅ９７、Ｈ９９、Ｅ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５、Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｄ１１３、Ｅ１１５、Ｌ１１６、Ｎ１２１、Ｅ１２３、Ｔ１２４、Ｅ１２６、Ｑ１３１、Ｓ１３２、Ｓ１３３、Ｒ１３４、Ｑ１３６、Ｔ１３７、Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３、Ｎ１４４、Ｌ１７８、Ｒ１７９、Ｒ１８０、Ｓ２２４、Ｈ２２５、Ｄ２２６、Ｔ２２７、Ｑ２２８、Ｑ２２９、Ｗ２３０およびＤ２３２（配列番号１〜５のいずれかのＭＩＣＡに関する）からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７つ以上の残基を含むエピトープに結合する。

【0147】

一実施形態において、抗体は、以下を含むエピトープに結合する：
（ａ）Ｒ６およびＮ８からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｂ）Ｎ５６、Ｋ５７、Ｔ５８からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｃ）Ｒ６１およびＲ６４からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｄ）Ｋ８１、Ｄ８２からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｅ）Ｑ８３、Ｋ８４からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｆ）Ｅ９７、Ｈ９９からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｇ）Ｅ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｈ）Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｉ）Ｄ１１３、Ｅ１１５からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｊ）Ｎ１２１、Ｅ１２３からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｋ）Ｔ１２４およびＥ１２６からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｌ）Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｌ１１６からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｍ）Ｑ１３１、Ｓ１３２、Ｑ１３６からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｎ）Ｓ１３３、Ｒ１３４、Ｔ１３７からなる群から選択される１つ以上の残基；または
（ｏ）Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｐ）Ｓ２２４、Ｈ２２５およびＤ２２６からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｑ）Ｔ２２７、Ｑ２２８およびＱ２２９からなる群から選択される１つ以上の残基；および／または
（ｒ）Ｗ２３０およびＤ２３２からなる群から選択される１つ以上の残基。

【0148】

一実施形態において、抗体は、（ａ）〜（ｒ）の２、３もしくは４つの任意の組合せを含むエピトープに結合する。

【0149】

一実施形態において、抗体は、Ｑ４８、Ｗ４９、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ５３およびＬ５４からなる群から選択される１、２、３、４、５、または６つ以上の残基を含むエピトープに結合する。

【0150】

一実施形態において、抗体は、Ｎ５６、Ｋ５７、Ｔ５８、Ｒ６１およびＲ６４からなる群から選択される１、２、３、４、５、または６つ以上の残基を含むエピトープに結合する。

【0151】

一実施形態において、抗体は、Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４、Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｄ１１３、Ｌ１１６、Ｓ１３３、Ｒ１３４、Ｔ１３７、Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される１、２、３、４、５、または６つ以上の残基を含むエピトープに結合する。

【0152】

一実施形態において、抗体は、Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４、Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｄ１１３、Ｌ１１６、Ｑ１３１、Ｓ１３２、Ｑ１３６、Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される１、２、３、４、５、または６つ以上の残基を含むエピトープに結合する。

【0153】

一実施形態において、抗体は、Ｅ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５、Ｎ１２１、Ｅ１２３、Ｔ１２４およびＥ１２６からなる群から選択される１、２、３、４、５、または６つ以上の残基を含むエピトープに結合する。

【0154】

一実施形態において、抗体は、Ｒ６、Ｎ８、Ｅ９７、Ｈ９９、Ｅ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５、Ｅ１１５、Ｌ１７８、Ｒ１７９およびＲ１８０からなる群から選択される１、２、３、４、５、または６つ以上の残基を含むエピトープに結合する。

【0155】

一実施形態において、抗体は、Ｓ２２４、Ｈ２２５、Ｄ２２６、Ｔ２２７、Ｑ２２８、Ｑ２２９、Ｗ２３０およびＤ２３２からなる群から選択される１、２、３、４、５、または６つ以上の残基を含むエピトープに結合する。一実施形態において、抗体は、Ｔ２２７、Ｑ２２８およびＱ２２９からなる群から選択される１、２、３、４、５、または６つ以上の残基を含むエピトープに結合する。

【0156】

一実施形態において、抗体は、以下を含むエピトープに結合する：
（ａ）Ｋ８１、Ｄ８２からなる群から選択される１つ以上の残基、およびＱ８３、Ｋ８４からなる群から選択される１つ以上の残基；
（ｂ）Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基、およびＨ１０９、Ｙ１１１、Ｌ１１６からなる群から選択される１、２、もしくは３つの残基；
（ｃ）残基Ｄ１１３、およびＫ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４からなる群から選択される１、２、３もしくは４つの残基；
（ｄ）Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基、およびＱ１３１、Ｓ１３２、Ｑ１３６からなる群から選択される１、２、もしくは３つの残基；
（ｅ）Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基、およびＳ１３３、Ｒ１３４、Ｔ１３７からなる群から選択される１、２、もしくは３つの残基；
（ｆ）Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基、およびＭ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される１、２、もしくは３つの残基；
（ｇ）Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｌ１１６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基；任意選択で、Ｄ１１３；およびＱ１３１、Ｓ１３２、Ｑ１３６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基；
（ｈ）Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｌ１１６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基；任意選択で、Ｄ１１３；およびＳ１３３、Ｒ１３４、Ｔ１３７からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基；
（ｉ）Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｌ１１６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基；任意選択で、Ｄ１１３；およびＭ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；
（ｊ）Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｌ１１６からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基；任意選択で、Ｄ１１３；Ｓ１３３、Ｒ１３４、Ｔ１３７からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基；およびＭ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される１、２、３もしくは４つの残基；
（ｋ）Ｒ６、Ｎ８からなる群から選択される１つ以上の残基、およびＥ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；
（ｌ）Ｎ１２１、Ｅ１２３、Ｔ１２４およびＥ１２６からなる群から選択される１、２、３もしくは４つの残基、ならびにＥ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；または
（ｍ）Ｓ２２４、Ｈ２２５およびＤ２２６からなる群から選択される１、２、もしくは３つの残基、Ｔ２２７、Ｑ２２８およびＱ２２９からなる群から選択される１、２、もしくは３つの残基、ならびにＷ２３０およびＤ２３２からなる群から選択される１もしくは２つの残基。

【0157】

任意選択で、本発明の抗体のエピトープは、完全にＭＩＣＡのα１および／またはα２ドメイン内に存在し得る。任意選択で、さらに、抗体は、ＭＩＣＡシェディングに要求されるα３ドメイン領域に実質的に結合しないと特徴づけることができる。

【0158】

一実施形態において、本発明の抗体は、ＭＩＣＡポリペプチドアレル^＊００１、^＊００４および^＊００８（および任意選択でさらに^＊００７および^＊０１９）の表面上に存在する１つ以上のアミノ酸に結合する。

【0159】

ＭＩＣＡ変異体が形質移入された細胞への抗ＭＩＣＡ抗体の結合を計測し、野生型ＭＩＣＡポリペプチド（例えば、配列番号１〜５のいずれか１つ以上）に結合する抗ＭＩＣＡ抗体の能力と比較することができる。抗ＭＩＣＡ抗体と変異体ＭＩＣＡポリペプチドとの間の結合の低減は、結合親和性の低減（例えば、公知の方法、例えば、特定の変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験により、または変異体ポリペプチドへの結合のＢｉａｃｏｒｅ試験により計測される場合）および／または抗ＭＩＣＡ抗体の全結合能の低減（例えば、ポリペプチド濃度に対する抗ＭＩＣＡ抗体濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少により証明される場合）が存在することを意味する。結合の有意な低減は、変異残基が抗ＭＩＣＡ抗体への結合に直接関与し、抗ＭＩＣＡ抗体がＭＩＣＡに結合する場合に結合タンパク質に近接することを示す。

【0160】

一部の実施形態において、結合の有意な低減は、抗ＭＩＣＡ抗体と変異体ＭＩＣＡポリペプチドとの間の結合親和性および／または能力が、その抗体と野生型ＭＩＣＡポリペプチドとの間の結合に対して４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超または９５％超だけ低減されることを意味する。ある実施形態において、結合は、検出可能な限界未満に低減される。一部の実施形態において、結合の有意な低減は、変異体ＭＩＣＡポリペプチドへの抗ＭＩＣＡ抗体の結合が、抗ＭＩＣＡ抗体と野生型ＭＩＣＡポリペプチドとの間で観察される結合の５０％未満（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％未満）である場合に証明される。

【0161】

一部の実施形態において、野生型ＭＩＣＡポリペプチド（例えば、配列番号１〜５の配列を含む）中の残基１〜８８（任意選択で、１〜８５）、残基８９〜１８１（任意選択で、８６〜１８１）、または残基１８２〜２７４（またはその部分配列）に対応するセグメント中の残基が異なるアミノ酸により置換されている変異体ＭＩＣＡポリペプチドについて有意に低い結合を示す抗ＭＩＣＡ抗体が提供される。一部の実施形態において、野生型ＭＩＣＡポリペプチド（例えば、配列番号１〜５の配列を含む）中の残基１〜８８（任意選択で、１〜８５）、残基８９〜１８１（任意選択で、８６〜１８１）、または残基１８２〜２７４（またはその部分配列）に対応するセグメント中の残基が異なるアミノ酸により置換されている変異体ＭＩＣＡポリペプチドについて有意に低い結合を示す抗ＭＩＣＡ抗体が提供される。

【0162】

一部の実施形態において、Ｒ６、Ｎ８、Ｑ４８、Ｗ４９、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ５３、Ｌ５４、Ｎ５６、Ｋ５７、Ｔ５８、Ｒ６１、Ｒ６４、Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４、Ｅ９７、Ｈ９９、Ｅ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５、Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｄ１１３、Ｅ１１５、Ｌ１１６、Ｎ１２１、Ｅ１２３、Ｔ１２４、Ｅ１２６、Ｑ１３１、Ｓ１３２、Ｓ１３３、Ｒ１３４、Ｑ１３６、Ｔ１３７、Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３、Ｎ１４４、Ｌ１７８、Ｒ１７９、Ｒ１８０、Ｓ２２４、Ｈ２２５、Ｄ２２６、Ｔ２２７、Ｑ２２８、Ｑ２２９、Ｗ２３０およびＤ２３２からなる群から選択される残基が異なるアミノ酸により置換されている変異体ＭＩＣＡ抗体について、野生型ＭＩＣＡポリペプチドと比較して有意に低い結合を示す抗ＭＩＣＡ抗体が提供される。

【0163】

一部の実施形態において、
（ａ）Ｑ４８、Ｗ４９、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ５３およびＬ５４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；
（ｂ）Ｎ５６、Ｋ５７、Ｔ５８、Ｒ６１およびＲ６４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；
（ｃ）Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４、Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｄ１１３、Ｌ１１６、Ｓ１３３、Ｒ１３４、Ｔ１３７、Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；
（ｄ）Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４、Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｄ１１３、Ｌ１１６、Ｑ１３１、Ｓ１３２、Ｑ１３６、Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；
（ｅ）Ｅ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５、Ｎ１２１、Ｅ１２３、Ｔ１２４およびＥ１２６からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；
（ｆ）Ｒ６、Ｎ８、Ｅ９７、Ｈ９９、Ｅ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５、Ｅ１１５、Ｌ１７８、Ｒ１７９およびＲ１８０からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；または
（ｇ）Ｓ２２４、Ｈ２２５、Ｄ２２６、Ｔ２２７、Ｑ２２８、Ｑ２２９、Ｗ２３０およびＤ２３２からなる群から選択される１、２、３、４つ以上の残基；
が異なるアミノ酸により置換されている変異体ＭＩＣＡポリペプチドについて、野生型ＭＩＣＡポリペプチドと比較して有意に低い結合を示す抗ＭＩＣＡ抗体が提供される。

【0164】

一部の実施形態において、
（ａ）Ｒ６およびＮ８からなる群から選択される残基；
（ｂ）Ｎ５６、Ｋ５７、Ｔ５８からなる群から選択される残基；
（ｃ）Ｒ６１およびＲ６４からなる群から選択される残基；
（ｄ）Ｋ８１、Ｄ８２からなる群から選択される残基；
（ｅ）Ｑ８３、Ｋ８４からなる群から選択される残基；
（ｆ）Ｅ９７、Ｈ９９からなる群から選択される残基；
（ｇ）Ｅ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２からなる群から選択される残基；
（ｈ）Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５からなる群から選択される残基；
（ｉ）Ｄ１１３、Ｅ１１５からなる群から選択される残基；
（ｊ）Ｎ１２１、Ｅ１２３からなる群から選択される残基；
（ｋ）Ｔ１２４およびＥ１２６からなる群から選択される残基；
（ｌ）Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｌ１１６からなる群から選択される残基；
（ｍ）Ｑ１３１、Ｓ１３２、Ｑ１３６からなる群から選択される残基；
（ｎ）Ｓ１３３、Ｒ１３４、Ｔ１３７からなる群から選択される残基；
（ｏ）Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４からなる群から選択される残基；
（ｐ）Ｓ２２４、Ｈ２２５およびＤ２２６からなる群から選択される残基；
（ｑ）Ｔ２２７、Ｑ２２８およびＱ２２９からなる群から選択される残基；ならびに／または
（ｒ）Ｗ２３０およびＤ２３２からなる群から選択される残基；
が異なるアミノ酸により置換されている変異体ＭＩＣＡポリペプチドについて、野生型ＭＩＣＡポリペプチドと比較して有意に低い結合を示す抗ＭＩＣＡ抗体が提供される。

【0165】

任意の実施形態において、Ｒ６、Ｎ８、Ｑ４８、Ｗ４９、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ５３、Ｌ５４、Ｎ５６、Ｋ５７、Ｔ５８、Ｒ６１、Ｒ６４、Ｋ８１、Ｄ８２、Ｑ８３、Ｋ８４、Ｅ９７、Ｈ９９、Ｅ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５、Ｈ１０９、Ｙ１１１、Ｄ１１３、Ｅ１１５、Ｌ１１６、Ｎ１２１、Ｅ１２３、Ｔ１２４、Ｅ１２６、Ｑ１３１、Ｓ１３２、Ｓ１３３、Ｒ１３４、Ｑ１３６、Ｔ１３７、Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３、Ｎ１４４、Ｌ１７８、Ｒ１７９、Ｒ１８０、Ｓ１９４、Ｅ１９５、Ｎ１９７、Ｓ２２４、Ｈ２２５、Ｄ２２６、Ｔ２２７、Ｑ２２８、Ｑ２２９、Ｗ２３０またはＤ２３２置換は、それぞれＲ６Ａ、Ｎ８Ａ、Ｗ１４Ａ、Ｑ４８Ａ、Ｗ４９Ｓ、Ｅ５１Ｓ、Ｄ５２Ａ、Ｖ５３Ｓ、Ｌ５４Ａ、Ｎ５６Ａ、Ｋ５７Ｓ、Ｔ５８Ａ、Ｒ６１Ａ、Ｒ６４Ａ、Ｋ８１Ａ、Ｄ８２Ａ、Ｑ８３Ａ、Ｋ８４Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ９７Ａ、Ｈ９９Ａ、Ｅ１００Ａ、Ｄ１０１Ｓ、Ｎ１０２Ａ、Ｓ１０３Ａ、Ｔ１０４Ｓ、Ｒ１０５Ａ、Ｈ１０９Ａ、Ｙ１１１Ａ、Ｄ１１３Ａ、Ｅ１１５Ａ、Ｌ１１６Ａ、Ｎ１２１Ａ、Ｅ１２３Ｓ、Ｔ１２４Ａ、Ｅ１２６Ａ、Ｑ１３１Ａ、Ｓ１３２Ａ、Ｓ１３３Ａ、Ｒ１３４Ｓ、Ｑ１３６Ｓ、Ｔ１３７Ａ、Ｍ１４０Ｓ、Ｎ１４１Ａ、Ｒ１４３Ｓ、Ｎ１４４Ａ、Ｌ１７８Ａ、Ｒ１７９Ｓ、Ｒ１８０Ａ、Ｓ２２４Ａ、Ｈ２２５Ｓ、Ｄ２２６Ａ、Ｔ２２７Ａ、Ｑ２２８Ｓ、Ｑ２２９Ａ、Ｗ２３０ＡまたはＤ２３２Ａ置換として規定することができる。

【0166】

一部の実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、変異体ＭＩＣＡポリペプチド（例えば、表Ｄの変異体１〜６１のいずれか１つの変異体）について、または表Ｄの変異体１〜６１のいずれか１つの変異残基を有するポリペプチドへの、野生型ＭＩＣＡポリペプチド（実施例４に示される、特定の抗ＭＩＣＡ抗体が有意に低い結合を有する変異体または残基以外）と比較して有意に低い結合を示さないことにより特徴づけられる。

【0167】

抗ＭＩＣＡ抗体の産生
本発明の抗体は、当分野において公知の種々の技術により産生することができる。典型的には、これらは、ＭＩＣＡポリペプチド、好ましくは、ヒトＭＩＣＡポリペプチドを含む免疫原による非ヒト動物、好ましくは、マウスの免疫化により産生される。ＭＩＣＡポリペプチドは、ヒトＭＩＣＡポリペプチドの全長配列、またはその断片もしくは誘導体、典型的には、免疫原性断片、すなわち、ＭＩＣＡポリペプチドを発現する細胞の表面上で露出されるエピトープ、好ましくは、６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９または１４Ｂ４抗体により認識されるエピトープを含むポリペプチドの一部を含み得る。そのような断片は、典型的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７つの連続アミノ酸、いっそうより好ましくは、その少なくとも約１０の連続アミノ酸を含有する。断片は、典型的には、本質的に、受容体の細胞外ドメインに由来する。好ましい実施形態において、免疫原は、典型的には細胞の表面における脂質膜中の野生型ヒトＭＩＣＡポリペプチドを含む。具体的な実施形態において、免疫原は、任意選択で、治療または溶解されるインタクトな細胞、特にインタクトなヒト細胞を含む。別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、組換えＭＩＣＡポリペプチドである。具体的な実施形態において、免疫原は、インタクトな腫瘍細胞を含む。

【0168】

非ヒト哺乳動物を抗原により免疫化するステップは、マウス中での抗体の産生を刺激する当分野において周知の任意の様式で実施することができる（例えば、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）参照、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。免疫原は、任意選択で、アジュバント、例えば完全または不完全フロイントアジュバントを有する緩衝液中で懸濁または溶解される。免疫原の量、緩衝液のタイプおよびアジュバントの量を測定する方法は、当業者に周知であり、本発明を決して限定するものではない。これらのパラメーターは、異なる免疫原について異なり得るが、容易に解明される。

【0169】

同様に、抗体の産生を刺激するために十分な免疫化の局在および頻度も、当分野において周知である。典型的な免疫プロトコルにおいて、非ヒト動物に１日目および約１週間後に再度、抗原を腹腔内注射する。この後、約２０日目、任意選択で、アジュバント、例えば、不完全フロイントアジュバントによる抗原のリコール注射を行う。リコール注射は静脈内で実施し、数日間連続して繰り返すことができる。この後、４０日目、典型的にはアジュバントを用いずに静脈内または腹腔内のいずれかでブースター注射を行う。このプロトコルは、約４０日後、抗原特異的抗体を産生するＢ細胞の産生をもたらす。免疫化において使用される抗原に指向される抗体を発現するＢ細胞の産生をもたらす限り、他のプロトコルを使用することもできる。

【0170】

ポリクローナル抗体調製のため、血清を免疫化非ヒト動物から得、その中に存在する抗体を周知技術により単離する。血清を、固体支持体に結合している上記免疫原のいずれかを使用して親和性精製してＭＩＣＡポリペプチドと反応する抗体を得ることができる。

【0171】

代替的実施形態において、非免疫化非ヒト哺乳動物からのリンパ球を単離し、インビトロで成長させ、次いで細胞培養物中で免疫原に曝露させる。次いで、リンパ球を回収し、下記の融合ステップを実施する。

【0172】

好ましいモノクローナル抗体について、次のステップは、免疫化非ヒト哺乳動物からの脾細胞を単離し、続いてそれらの脾細胞を不死化細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを形成することである。非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離は、当分野において周知であり、典型的には、麻酔された非ヒト哺乳動物から脾臓を摘出し、それを小片に切断し、脾細胞を脾膜から細胞濾過器のナイロンメッシュを介して適切な緩衝液中に搾出して単一の細胞懸濁液を産生することを含む。細胞を洗浄し、遠心分離し、いかなる赤血球も溶解する緩衝液中で再懸濁させる。溶液を再び遠心分離し、最終的にペレット中の残留リンパ球を新たな緩衝液中で再懸濁させる。

【0173】

リンパ球は、単離され、単一の細胞懸濁液中で存在する場合、不死細胞系と融合させることができる。これは、典型的には、マウス骨髄腫細胞系であるが、ハイブリドーマの作出に有用な多数の他の不死細胞系は当分野において公知である。好ましいネズミ骨髄腫系としては、限定されるものではないが、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＸ６３ Ａｇ８６５３およびＳＰ−２細胞に由来するものが挙げられる。融合は、ポリエチレングリコールなどを使用して行う。次いで、得られたハイブリドーマを、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する選択培地中で成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨害する。

【0174】

ハイブリドーマは、典型的には、マクロファージのフィーダー層上で成長させる。マクロファージは、好ましくは、脾細胞を単離するために使用される非ヒト哺乳動物のリッターメイトからのものであり、典型的には、ハイブリドーマをプレーティングする数日前に不完全フロイントアジュバントなどによりプライミングする。融合方法は、Ｇｏｄｉｎｇ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0175】

細胞は、コロニー形成および抗体産生に十分な時間、選択培地中で成長させておく。これは通常、約７〜約１４日間である。

【0176】

次いで、ハイブリドーマコロニーを、ＭＩＣＡポリペプチド遺伝子産物、任意選択で、抗体６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９または１４Ｂ４により特異的に認識されるエピトープに特異的に結合する抗体の産生についてアッセイする。アッセイは、典型的には、比色ＥＬＩＳＡタイプアッセイであるが、ハイブリドーマを成長させるウェルに適合させることができる任意のアッセイを用いることができる。他のアッセイとしては、ラジオイムノアッセイまたは蛍光活性化細胞選別が挙げられる。所望の抗体産生について陽性のウェルを試験して１つ以上の区別されるコロニーが存在するか否かを決定する。２つ以上のコロニーが存在する場合、細胞を再クローニングおよび成長させ、単一細胞のみが所望の抗体を産生するコロニーを生じさせていることを確保することができる。

【0177】

本発明のモノクローナル抗体を産生することが確認されているハイブリドーマは、適切な培地、例えばＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０中でより大量に成長させることができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、動物中で腹水腫瘍としてインビボで成長させることができる。

【0178】

モノクローナル抗体（または腹水）を含有する成長培地は、所望のモノクローナル抗体を産生するために十分に成長させた後、細胞から分離し、その中に存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、典型的には、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡもしくはプロテインＧ−セファロース、または固体支持体、例えば、アガロースもしくはセファロースビーズに結合している抗マウスＩｇを使用するクロマトグラフィーにより達成する（全ては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１８−１０３７−４６，Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＣに記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。結合抗体は、典型的には、抗体含有画分の即時中和を伴う低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３．０以下のグリシンまたは酢酸緩衝液）の使用により、プロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出させる。これらの画分は、必要に応じてプール、透析、および濃縮する。

【0179】

外見上単一のコロニーを有する陽性のウェルを、典型的には、再クローニングおよび再アッセイして１つのモノクローナル抗体のみが検出および産生されていることを確保する。

【0180】

抗体は、例えば、（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるとおり、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択により産生することもできる。

【0181】

ＭＩＣＡ、特に、モノクローナル抗体６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９または１４Ｂ４と実質的または本質的に同一のエピトープに結合する１つ以上の抗体の同定は、抗体競合をアッセイすることができる種々の免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを使用して容易に決定することができる。多くのそのようなアッセイは、定型的に実施され、当分野において周知である（例えば、１９９７年８月２６日に交付された米国特許第５，６６０，８２７号明細書参照、具体的には参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の抗体が結合するエピトープの実際的な決定は、本明細書に記載のモノクローナル抗体と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗体を同定するために決して要求されないことが理解される。

【0182】

例えば、試験すべき試験抗体が異なる動物源から得られ、またはさらに異なるＩｇアイソタイプのものである場合、対照（例えば、６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９または１４Ｂ４）および試験抗体を混合（または予備吸着）し、ＭＩＣＡポリペプチドを含有する試料にアプライする単純な競合アッセイを用いることができる。ウエスタンブロッティングに基づくプロトコルおよびＢＩＡＣＯＲＥ分析の使用は、そのような競合試験における使用に好適である。

【0183】

ある実施形態において、対照抗体（例えば、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８）を、変動量の試験抗体と、ＭＩＣＡ抗原試料にアプライする前のある期間、予備混合する（例えば、約１：１０または約１：１００）。他の実施形態において、対照および変動量の試験抗体は、ＭＩＣＡ抗原試料に曝露させる間、単純に混合することができる。（例えば、未結合抗体を除去するための分離または洗浄技術を使用することにより）結合抗体を遊離抗体から、（例えば、種特異的もしくはアイソタイプ特異的二次抗体を使用し、または６Ｅ４、２０Ｃ６もしくは１６Ａ８を検出可能な標識により特異的に標識することにより）６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８を試験抗体から区別することができる限り、試験抗体が６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８の抗原への結合を低減させるか否かを決定することができ、それは試験抗体が６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８と実質的に同一のエピトープを認識することが示す。完全に無関連な抗体の不存在下での（標識）対照抗体の結合は、高値の対照として機能し得る。低値の対照は、標識（６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８）抗体を全く同一のタイプ（６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８）の未標識抗体とインキュベートすることにより得ることができ、この場合、競合が生じ、標識抗体の結合を低減させる。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での標識抗体の反応性における有意な低減は、実質的に同一のエピトープを認識する試験抗体、すなわち、標識（６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８）抗体と「交差反応する」または競合する抗体を示す。６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８のＭＩＣＡ抗原への結合を、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、またはより好ましくは少なくとも約８０％もしくは９０％（例えば、約６５〜１００％）だけ低減させる任意の試験抗体を、約１：１０〜約１：１００の６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８：試験抗体の任意の比において、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８と実質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体であるとみなす。好ましくは、そのような試験抗体は、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８のＭＩＣＡ抗原への結合を、少なくとも約９０％（例えば約９５％）だけ低減させる。

【0184】

競合は、例えばフローサイトメトリー試験により評価することもできる。そのような試験において、所与のＭＩＣＡポリペプチドを担持する細胞は、最初に例えば、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８と、次いで蛍光色素またはビオチンにより標識された試験抗体とインキュベートすることができる。飽和量の６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８とのプレインキュベーション時に得られる結合が、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８とのプレインキュベーションなしの抗体により得られる（蛍光を介して計測される）結合の、約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％または１０％）である場合、抗体は、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８と競合すると言われる。あるいは、飽和量の試験抗体とプレインキュベートされた細胞上の（蛍光色素またはビオチンによる）標識６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８抗体について得られる結合が、試験抗体とのプレインキュベーションなしの場合に得られる結合の、約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％または１０％）である場合、抗体は、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８と競合すると言われる。

【0185】

試験抗体を、ＭＩＣＡ抗原が固定化された表面に飽和濃度において予備吸着およびアプライする単純な競合アッセイを用いることもできる。単純な競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥチップ（または表面プラズモン共鳴分析に好適な他の媒体）である。次いで、対照抗体（例えば、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８）を、ＭＩＣＡ飽和濃度において表面と接触させ、対照抗体のＭＩＣＡおよび表面結合を計測する。対照抗体のこの結合を、試験抗体の不存在下での対照抗体のＭＩＣＡ含有表面への結合と比較する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での対照抗体によるＭＩＣＡ含有表面の結合の有意な低減は、試験抗体が対照抗体と実質的に同一のエピトープを認識し、その結果、試験抗体が対照抗体と「交差反応する」ことを示す。対照（例えば、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８）抗体のＭＩＣＡ抗原への結合を少なくとも約３０％以上、好ましくは約４０％だけ低減させる任意の試験抗体を、対照（例えば、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８）と実質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体であるとみなすことができる。好ましくは、そのような試験抗体は、対照抗体（例えば、６Ｅ４、２０Ｃ６または１６Ａ８）のＭＩＣＡ抗原への結合を少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％以上）だけ低減させる。対照および試験抗体の順序は入れ替えることができ、すなわち、競合アッセイにおいて、最初に対照抗体を表面に結合させることができ、その後に試験抗体を表面と接触させることが認識される。好ましくは、ＭＩＣＡ抗原についてより高い親和性を有する抗体を最初に表面に結合させる。それというのも、二次抗体について見られる結合の減少（抗体が交差反応していると想定）がより顕著な大きさであると予期されるためである。そのようなアッセイのさらなる例が、例えば、Ｓａｕｎａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：３３−４１に提供され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0186】

好ましくは、ＭＩＣＡエピトープを認識するモノクローナル抗体は、かなりの割合またはさらには全ての関連ＭＩＣＡアレル上に存在するエピトープと反応する。一態様において、本発明の抗ＭＩＣＡ抗体は、ＭＩＣＡ^＊００４および^＊００８、任意選択で、さらにＭＩＣＡ^＊００１、^＊００７および／または^＊００１９に結合する。

【0187】

好ましい実施形態において、抗体は、ＭＩＣＡ陽性細胞の発現により特徴づけられる疾患を有する１つまたは複数の個体、すなわち、本発明の抗ＭＩＣＡ抗体を使用する本明細書に記載の方法の１つによる治療のための候補である個体からのＭＩＣＡ発現細胞に結合する。したがって、細胞上のＭＩＣＡを特異的に認識する抗体を得たら、それをＭＩＣＡ陽性細胞（例えば、癌細胞）に結合するその能力について試験することができる。特に、患者を本抗体の１つにより治療する前、例えば、血液試料または腫瘍生検物中の患者から採取された悪性腫瘍細胞に結合する抗体の能力を試験し、治療が患者において有益になる確率を最大化することが有益である。

【0188】

一実施形態において、本発明の抗体は、免疫アッセイにおいてバリデートしてＭＩＣＡ発現細胞、例えば、悪性腫瘍細胞に結合するそれらの能力を試験する。例えば、腫瘍生検を実施し、腫瘍細胞を回収する。次いで、細胞に結合する所与の抗体の能力を、当分野において周知の標準的方法を使用して評価する。個体または患者のかなりの割合（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上）からのＭＩＣＡを発現することが公知の細胞、例えば、腫瘍細胞のかなりの割合（例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上）に結合することが見出される抗体は、患者中の悪性腫瘍細胞の存在またはレベルを決定するための診断目的のための本発明における使用、または本明細書に記載の治療方法における使用、例えば、悪性腫瘍細胞の数または活性を増加または減少させるための使用の両方に好適である。抗体の細胞への結合を評価するため、抗体は、直接または間接的に標識することができる。間接的に標識する場合、典型的には、二次標識抗体を添加する。

【0189】

抗体がエピトープ領域内で結合するか否かの決定は、当業者に公知の手法において実施することができる。そのようなマッピング／特徴決定方法の一例として、抗ＭＩＣＡ抗体についてのエピトープ領域を、ＭＩＣＡタンパク質中の露出アミン／カルボキシルの化学修飾を使用するエピトープ「フットプリンティング」により決定することができる。そのようなフットプリンティング技術の１つの具体例は、ＨＸＭＳ（質量分析により検出される水素−重水素交換）の使用であり、この場合、受容体およびリガンドタンパク質のアミドプロトンの水素／重水素交換、結合、および逆交換が生じ、タンパク質結合に関与する骨格アミド基は逆交換から保護され、したがって重水素化されたままになる。関連領域は、この箇所において、ペプシンタンパク質加水分解、高速マイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離、および／またはエレクトロスプレーイオン化質量分析により同定することができる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ Ｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７（２）ｐｐ．２５２−２５９（１９９９）Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５６Ａ−２６５Ａ参照。好適なエピトープ同定技術の別の例は核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、この場合、典型的には、遊離抗原および抗原結合ペプチド、例えば抗体と複合体化された抗原の二次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。抗原は、典型的には、ＮＭＲスペクトルにおいて、抗原に対応するシグナルのみが見られ、抗原結合ペプチドからのシグナルが全く見られないように、１５Ｎにより選択的に同位体標識する。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸から生じる抗原シグナルは、典型的には、複合体のスペクトルにおける位置を、遊離抗原のスペクトルと比較してシフトさせ、結合に関与するアミノ酸をそのように同定することができる。例えば、Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｒｅｓ Ｆｏｕｎｄ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．２００４；（４４）：１４９−６７；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８１（１）ｐｐ．６１−６７（１９９８）；およびＳａｉｔｏ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６ Ｊｕｎ；９（３）：５１６−２４参照。

【0190】

エピトープマッピング／特徴決定は、質量分析法を使用して実施することもできる。例えば、Ｄｏｗｎａｒｄ，Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００ Ａｐｒ；３５（４）：４９３−５０３およびＫｉｓｅｌａｒ ａｎｄ Ｄｏｗｎａｒｄ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｍａｙ １；７１（９）：１７９２−１８０１参照。プロテアーゼ消化技術も、エピトープマッピングおよび同定に関して有用であり得る。抗原決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化により、例えばトリプシンをＭＩＣＡに対して約１：５０の比またはｐＨ７〜８における一晩消化において使用し、次いでペプチド同定のための質量分析（ＭＳ）分析を行うことにより決定することができる。続いて、抗ＭＩＣＡ結合剤によりトリプシン開裂から保護されるペプチドを、トリプシン消化を受けた試料と、抗体とインキュベートされ、次いで、例えば、トリプシンによる消化を受けた試料との比較により同定することができる（それにより、結合剤についてのフットプリントが明らかになる）。他の酵素、例えば、キモトリプシン、ペプシンなどをさらに、または代替的に類似のエピトープ特徴決定方法において使用することができる。さらに、酵素消化は、潜在的な抗原決定基配列が、表面露出されておらず、したがって、免疫原性／抗原性に関して最も関連性が少ないＭＩＣＡポリペプチドの領域内に存在するか否かを分析する迅速な方法を提供し得る。

【0191】

部位特異的変異誘発は、結合エピトープの解明に有用な別の技術である。例えば、「アラニンスキャニング」において、タンパク質セグメント内のそれぞれの残基をアラニン残基により置き換え、結合親和性についての結果を計測する。変異が結合親和性の有意な低減をもたらす場合、それは結合に関与する可能性が最も高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち、フォールディングされていないタンパク質に結合しない抗体）を使用し、アラニン置換がタンパク質のフォールディング全体に影響を与えないことを確認することができる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５；２６７：３８３-３８６；およびＷｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６；９３：１−６参照。

【0192】

エピトープ「フットプリンティング」に電子顕微鏡を使用することもできる。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３５５：２７５−２７８は、天然ササゲモザイクウイルスのカプシド表面上のＦａｂ断片の物理的フットプリントを測定するため、低温電子顕微鏡観察、三次元画像再構成、およびＸ線結晶分析の協調的適用を使用した。

【0193】

エピトープ評価のための「ラベルフリー」アッセイの他の形態としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ）および反射干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、Ｆａｅｇｅｒｓｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ １９９０；３：２０８−１４；Ｎｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ−ｔｏｇｒ．１９９３；６４６：１５９-１６８；Ｌｅｉｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８；３７：３３０８-３３１１；Ｋｒｏｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ２００２；１７：９３７−９４４参照。

【0194】

本発明の抗体と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗体は、本明細書に記載の例示的な競合アッセイの１つ以上において同定することができることにも留意すべきである。

【0195】

脊椎動物または細胞中での抗体の免疫化および産生時、特定の選択ステップを実施して特許請求される抗体を単離することができる。これに関し、具体的な実施形態において、本発明はまた、そのような抗体を産生する方法であって、（ａ）非ヒト哺乳動物を、ＭＩＣＡポリペプチドを含む免疫原により免疫化するステップ；および（ｂ）前記免疫化動物から抗体を調製するステップ；および（ｃ）ＭＩＣＡに結合し得る、ステップ（ｂ）からの抗体を選択するステップを含む方法に関する。

【0196】

典型的には、本発明により提供される抗ＭＩＣＡ抗体は、ＭＩＣＡポリペプチドについての約１０^４〜約１０^１１Ｍ^−１（例えば、約１０^８〜約１０^１０Ｍ^−１）の範囲の親和性を有する。例えば、特定の態様において、本発明は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析による）により測定される場合、ＭＩＣＡに関して１×１０^−９Ｍ未満の平均解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。より特定の例示的態様において、本発明は、ＭＩＣＡについて約１×１０^−８Ｍ〜約１×１０^−１０Ｍ、または約１×１０^−９Ｍ〜約１×１０^−１１ＭのＫＤを有する抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。

【0197】

抗体は、例えば、約１００、６０、１０、５、または１ナノモル濃度以下（すなわち、それらよりも良好な親和性）、好ましくは、ナノモル濃度以下、または任意選択で約５００、２００、１００または１０ピコモル濃度以下の平均ＫＤにより特徴づけることができる。ＫＤは、例えば、例えば、組換え産生ヒトＭＩＣＡタンパク質をチップ表面上に固定化し、次いで溶液中の試験すべき抗体をアプライすることにより測定することができる。一実施形態において、本方法は、ＭＩＣＡへの結合について抗体６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９または１４Ｂ４と競合し得る（ｂ）からの抗体を選択するステップ（ｄ）をさらに含む。

【0198】

実施形態のいずれかの一態様において、本方法により調製される抗体は、モノクローナル抗体である。別の態様において、本発明の方法により抗体を産生するために使用される非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、齧歯類、ウシ、ブタ、ニワトリ、ウマ、ウサギ、ヤギ、またはヒツジである。本発明の抗体は、６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９または１４Ｂ４を包含する。さらに、本発明の抗体は、任意選択で、Ｓａｌｉｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）（Ｂｌｏｏｄ １０２（４）：１３８９−１３９６）に記載の抗体ＢＡＭＯ１またはＢＡＭＯ３、Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：１２４４５−１２４５０、Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：１７３７−１７４０または国際公開第２００８／１３１４０６号パンフレット（そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の抗体２Ｃ１０、３Ｈ５、６Ｄ４もしくは６Ｇ６以外の抗体、または例えばＣＤＲもしくは抗原結合領域の全部もしくは一部を含む上記の誘導体であると規定することができる。

【0199】

代替的実施形態によれば、ＭＩＣＡポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体をコードするＤＮＡは、本発明のハイブリドーマから単離し、適切な宿主中への形質移入に適切な発現ベクター中に配置する。次いで、宿主を抗体、またはそのバリアント、例えば、そのモノクローナル抗体のヒト化バージョン、抗体の活性断片、抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体、または検出可能部分を含むバージョンの組換え産生に使用する。

【0200】

本発明のモノクローナル抗体、例えば、抗体６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９または１４Ｂ４をコードするＤＮＡは、慣用の手順を使用して（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離および配列決定することができる。ＤＮＡは、単離したら、発現ベクター中に配置することができ、次いでそれを他で免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞中に形質移入して組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を得る。本明細書の他箇所において記載されるとおり、そのようなＤＮＡ配列は、多数の目的のいずれかのため、例えば、抗体をヒト化するため、断片もしくは誘導体を産生するため、または例えば抗原結合部位中の抗体の配列を改変するために改変して抗体の結合特異性を最適化することができる。一実施形態において、本発明は、抗体（例えば、６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９または１４Ｂ４）の軽鎖および／または重鎖をコードする単離核酸配列、ならびにそのような核酸を（例えば、ゲノム中で）含む組換え宿主細胞を含む。

【0201】

抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現は、当分野において周知である（例えば、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，ｐｐ．２５６（１９９３）；およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０，ｐ．１５１（１９９２）参照。

【0202】

活性の評価
抗原結合化合物を得たら、それを一般に、ＮＫＧ２ＤとＭＩＣＡ（例えば、ｓＭＩＣＡまたは膜結合ＭＩＣＡ）との間の相互作用を遮断するその能力、細胞からのＭＩＣＡのシェディングを遮断するその能力、ＮＫＧ２ＤのｓＭＩＣＡ誘導下方モジュレーションを阻害するその能力、ＭＩＣＡ発現細胞の死滅を引き起こすその能力、ＭＩＣＡ発現標的細胞に対するＡＤＣＣもしくはＣＤＣを誘導するその能力、ならびに／またはＭＩＣＡ発現標的細胞の増殖を阻害し、および／もしくはその排除を引き起こすその能力について評価する。

【0203】

ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の結合を低減させ、またはその相互作用を遮断する抗原結合化合物の能力の評価は、例えば、本明細書に提供される実施例におけるように本方法の任意の好適な段階において実施することができる。例えば、ＭＩＣＡを表面上で発現する腫瘍細胞を、ＮＫＧ２Ｄを表面上で発現する細胞（例えば、エフェクター細胞）と、候補抗ＭＩＣＡ抗体を添加してまたは添加せずに接触させることができる。ＭＩＣＡ発現細胞およびＮＫＧ２Ｄ発現細胞との間の結合を評価することができ、結合を低減させない抗体を選択する。別の可能性は、単離ＭＩＣＡポリペプチドを単離ＮＫＧ２Ｄポリペプチド、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドを表面において発現する細胞と接触させること、およびＭＩＣＡとＮＫＧ２ＤポリペプチドまたはＮＫＧ２Ｄを発現する細胞との間の結合を評価することを含む。別の可能性は、単離ＮＫＧ２ＤポリペプチドをＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現する細胞と接触させること、およびＭＩＣＡポリペプチドまたはＭＩＣＡを発現する細胞の間の結合を評価することを含む。

【0204】

例えば、薬剤がＭＩＣＡのＮＫＧ２Ｄとの相互作用と遮断するか否かを決定するため、以下の試験を実施する：ＭＩＣＡが形質移入された細胞系Ｃ１ＲまたはＲＭＡを、増加濃度の試験抗ＭＩＣＡｍＡｂの存在下または不存在下で可溶性ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質とインキュベートする。細胞を洗浄し、次いでＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分を認識する二次抗体とインキュベートし、再度洗浄し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で標準的方法により分析する。抗ＭＩＣＡｍＡｂの不存在下で、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質は、Ｃ１ＲまたはＲＭＡ細胞に十分結合する。ＮＫＧ２ＤへのＭＩＣＡ結合を遮断する抗ＭＩＣＡｍＡｂの存在下で、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃの細胞への結合の低減が存在する。

【0205】

好ましくは、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の結合を低減させ、またはその相互作用を遮断する抗原結合化合物の能力の評価は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞（例えば、ＮＫまたはＴ細胞）の機能に対する抗ＭＩＣＡ抗体の効果を評価することにより実施することもできる。好ましくは、ＮＫＧ２Ｄを発現するが、ＣＤ１６を発現しないＮＫまたはＴ細胞を使用してＣＤ１６媒介ＡＤＣＣ効果のいかなる寄与も回避する。抗ＭＩＣＡ抗体がＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄ相互作用を低減させ、または遮断する場合、ＮＫまたはＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介活性化を減衰させることが予期される。したがって、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の結合を低減させず、その相互作用も遮断しない抗体は、ＮＫまたはＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介活性化を実質的に低減させず、遮断もしない。このことは、典型的な細胞毒性アッセイにより評価することができ、その例は本明細書に記載される。多数の細胞ベースアッセイのいずれか、例として、遺伝子発現ベース活性、細胞毒性ベースアッセイ、および増殖アッセイを使用してＮＫＧ２Ｄ活性を評価することができる。一態様において、インビトロアッセイは、ヒト患者からのＮＫ細胞もしくはＴ細胞、または、受容体の発現が細胞の活性を検出可能に変化させ、例えば、細胞をＮＫＧ２Ｄリガンドにより活性化可能とする限り、例えば、ＮＫＧ２Ｄコードトランス遺伝子が形質移入されたＴ細胞系を使用する。ＮＫＧ２Ｄ活性を反映する任意の好適な生理学的変化を使用して試験化合物または抗体の有用性を評価することができる。例えば、種々の効果、例えば、遺伝子発現、サイトカイン産生、細胞成長、細胞増殖、ｐＨ、細胞内セカンドメッセンジャー、例えば、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、もしくはｃＡＭＰ、または活性、例えば、細胞毒性活性もしくは他のＴ細胞を活性化させる能力の変化を計測することができる。一実施形態において、受容体の活性は、ＮＫＧ２Ｄ応答遺伝子、例えば、ＣＤ２５、ＩＦＮ−ガンマ、またはＴＮＦ−アルファの発現を検出することにより評価する（例えば、Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ １００：９４５２−９４５７；Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：１−１１参照）。一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ活性は、ＮＫＧ２Ｄ＋ＴまたはＮＫ細胞をＭＩＣＡ発現細胞および抗ＭＩＣＡ抗体の存在下でインキュベートし、ＴまたはＮＫ細胞によるＴＮＦ−アルファまたはＩＦＮ−ガンマの放出を阻害する化合物または試験抗体の能力を評価することにより評価する。

【0206】

標的細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介殺傷を評価する例示的な細胞毒性アッセイも、本明細書の実施例に記載される。ここでは、ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ１６−ＮＫ９２細胞を低減させ、または阻害する抗ＭＩＣＡ抗体の能力を使用し、５１Ｃｒの標的細胞放出を計測することによりＭＩＣＡ^＊０１９形質移入ＢａＦ／３のＮＫ細胞媒介殺傷を評価する。インビトロ細胞毒性アッセイは、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）に記載の当分野において周知の標準的方法により実施する。ＭＩＣＡ発現標的細胞を、^５１Ｃｒにより標識してからＮＫ細胞を添加し、次いで殺傷を、殺傷の結果としての細胞から培地への^５１Ｃｒの放出に比例して推定する。ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の結合を低減させ、またはその相互作用を遮断する薬剤の添加は、ＮＫＧ２Ｄを介する活性シグナリングの開始および伝播の妨害をもたらす。したがって、そのような薬剤の添加は、標的細胞のＮＫ媒介殺傷の減少をもたらす。

【0207】

ＮＫＧ２Ｄによる細胞の活性化（例えば、サイトカイン産生、細胞成長、細胞増殖、ｐＨ、細胞内セカンドメッセンジャー、ＭＩＣＡ発現細胞のＮＫ媒介殺傷）を低減させず、遮断もしない（例えば、低減なしまたは５％、１０％、２０％もしくは３０％未満の低減）抗原結合化合物を「非遮断」ｍＡｂと命名する。ＮＫＧ２Ｄによる細胞の活性化を低減させ、または遮断する抗原結合化合物を「遮断」ｍＡｂと命名する。

【0208】

ＭＩＣＡ発現細胞からのＭＩＣＡのシェディングを遮断する抗原結合化合物の能力の評価は、本明細書に提供される実施例におけるように本方法の任意の好適な段階において実施することができる。一例において、細胞の試料を提供し、ＥＬＩＳＡ法を使用して可溶性細胞外ＭＩＣＡを検出する。一例において、本発明の抗原結合化合物を哺乳動物に投与し、循環ｓＭＩＣＡの存在もしくは不存在、またはレベルを計測する。インビトロ検出アッセイの例は、Ｎｏｌｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０６（１）：１２−２０に記載されている。手短に述べると、市販のＭＩＣＡ Ｅｌｉｓａキット（Ｂａｍｏｍａｂ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することができる。プレートを捕捉抗ＭＩＣＡｍＡｂのＢＡＭＯ−１によりＰＢＳ中２μｇ／ｍｌにおいて一晩コートし、次いで１００μｌの１５％ＢＳＡの添加により３７℃において２時間ブロッキングし、洗浄する。スタンダードおよび試料を添加し、プレートを３７℃において２時間インキュベートする。プレートを洗浄し、検出ｍＡｂのＢＡＭＯ−３を７．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌにおいて３７℃において２時間添加する。次いで、プレートを洗浄し、抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ（７．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ中１：８０００）を３７℃において１時間添加する。次いで、プレートを洗浄し、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して発色させる。吸光度を４５０ｎｍにおいて計測する。

【0209】

ＡＤＣＣ、ＣＤＣを誘導し、またはそうでなければ（毒性剤の送達による）ＭＩＣＡ発現標的細胞の活性の排除もしくは阻害をもたらす抗原結合化合物の能力の評価は、例えば、本明細書に提供される実施例におけるように本方法の任意の好適な段階において実施することができる。この評価は、治療的使用が予定される抗体（または他の化合物）の同定、産生および／または発達に関与する種々のステップの１つ以上において有用であり得る。例えば、活性は、候補抗原結合化合物を同定するスクリーニング方法に関して、または抗原結合化合物を選択し、ヒトに好適とする（例えば、抗体の場合においてキメラまたはヒト化とする）方法、抗原結合化合物を発現する細胞（例えば、組換え抗原結合化合物を発現する宿主細胞）を得、機能抗体（または他の化合物）を産生するその能力について評価する方法、および／またはある量の抗原結合化合物を産生し、（例えば、産物のバッチまたはロットを試験するために）活性について評価すべき方法において評価することができる。一般に、抗原結合化合物は、ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合することが公知である。このステップは、複数（例えば、高スループットスクリーニング法を使用して極めて多数またはより少数）の抗原結合化合物を試験することを含み得る。

【0210】

ＣＤＣおよびＡＤＣＣの試験を実施することができ、種々のアッセイ、例として、本明細書の実験実施例に記載のものにより測定することができる。ＡＤＣＣの試験は、典型的には、結合した抗ＭＩＣＡ抗体を有するＭＩＣＡ発現標的細胞（例えば、癌または他のＭＩＣＡ発現細胞）が補体の関与なしでエフェクター細胞（例えば、Ｆｃ受容体を担持する白血球）により認識される細胞媒介細胞毒性を評価することを含む。ＭＩＣＡ抗原を発現しない細胞を任意選択で対照として使用することができる。ＮＫ細胞の細胞毒性の活性化は、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ産生）または細胞毒性マーカー（例えば、ＣＤ１０７動員）の増加を計測することにより評価する。好ましくは、本発明の抗体は、標的（ＭＩＣＡ発現）細胞の存在下で対照抗体（例えば、ＭＩＣＡに結合しない抗体、ネズミ定常領域を有するＭＩＣＡ抗体）と比較して少なくとも２０％、５０％、８０％、１００％、２００％または５００％のサイトカイン産生、細胞毒性マーカーの発現、または標的細胞溶解の増加を誘導する。別の例において、標的細胞の溶解は、例えば、クロム放出アッセイにおいて検出し、好ましくは、本発明の抗体は、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の溶解を誘導する。

【0211】

抗体ＣＤＲ配列
抗体６Ｅ４
抗体６Ｅ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号７として列記し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号８として列記する。ヒト鎖定常領域（それぞれ重鎖および軽鎖）に融合している抗体６Ｅ４の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号９および１０としてそれぞれ列記する。具体的な実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体６Ｅ４と本質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し；任意選択で、抗体は、抗体６Ｅ４の抗原結合領域を含む。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体６Ｅ４は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴づけることができる。１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、６Ｅ４のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２部分を含む。６Ｅ４の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、６Ｅ４の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。６Ｅ４の可変軽鎖可変領域または６Ｅ４の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２もしくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択で、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択で、抗体６Ｅ４の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかがヒトＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択で、ヒト定常領域、任意選択で、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプに融合している抗体が提供される。

【0212】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドであって、抗体は、配列番号１１〜１３に記載のアミノ酸配列ＳＹＹＡＭＳ、ＧＦＴＦＳＹもしくはＧＦＴＦＳＹＹＡＭＳ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ１領域；配列番号１４〜１５に記載のアミノ酸配列ＴＩＳＲＧＧＮＹＩＹＹＴＤＳＶＫＧもしくはＴＩＳＲＧＧＮＹＩＹ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ２領域；配列番号１６に記載のアミノ酸配列ＩＳＤＹＤＧＡＷＬＡＹ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ３領域；配列番号１７に記載のアミノ酸配列ＲＳＳＱＳＩＩＨＴＮＧＮＴＹＬＥ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ１領域；配列番号１８に記載のアミノ酸配列ＫＩＳＮＲＦＳ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ２領域；配列番号１９に記載のアミノ酸配列ＦＱＧＳＨＶＰＷＴ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、欠失され、または異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ３領域を含むポリペプチドを提供する。

【0213】

別の態様において、本発明は、ヒトＭＩＣＡに結合する抗体であって、
（ａ）配列番号７の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｂ）配列番号８の軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｃ）配列番号７の重鎖可変領域（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）および配列番号８の軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｄ）配列番号１１〜１６に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｅ）配列番号１７、１８および１９に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｆ）配列番号１１〜１６に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）ならびに配列番号１７、１８および１９に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｇ）配列番号７のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）
を含む抗体を提供する。

【0214】

本明細書の実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲの組と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。

【0215】

別の態様において、本発明は、ＭＩＣＡ結合について上記（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0216】

抗体２０Ｃ６
抗体２０Ｃ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２０として列記し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２１として列記する。重鎖定常領域（それぞれ重鎖および軽鎖に融合している抗体２０Ｃ６の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２２および２３としてそれぞれ列記する。一実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体２０Ｃ６と本質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し；任意選択で、抗体は、抗体２０Ｃ６の抗原結合領域を含む。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体２０Ｃ６は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴づけることができる。１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、２０Ｃ６のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２部分を含む。２０Ｃ６の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、２０Ｃ６の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。２０Ｃ６の可変軽鎖可変領域または２０Ｃ６の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２もしくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択で、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１、２、３、４または５つのアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択で、抗体１６Ａ８の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかがＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択で、ヒト定常領域、任意選択で、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプに融合している抗体が提供される。

【0217】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドであって、抗体は、配列番号２４〜２６に記載のアミノ酸配列ＴＳＧＭＧＶＧ、ＧＦＳＬＳＴＳＧもしくはＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ１領域；配列番号２７〜２８に記載のアミノ酸配列ＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＮＰＳＬＫもしくはＨＩＷＷＤＤＤＫ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ２領域；配列番号２９に記載のアミノ酸配列ＲＴＱＧＹＦＤＹ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ３領域；配列番号３０に記載のアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ１領域；配列番号３１に記載のアミノ酸配列ＹＡＳＱＳＩＳ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ２領域；および／または配列番号３２に記載のアミノ酸配列ＱＮＧＨＳＦＰＷＴ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、欠失され、もしくは異なるアミノ酸により置換されていてよく、または配列は、１つ以上のアミノ酸の挿入を含み得る）を含むＬＣＤＲ３領域を含むポリペプチドを提供する。

【0218】

別の態様において、本発明は、ヒトＭＩＣＡに結合する抗体であって、
（ａ）配列番号２０の重鎖可変領域（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｂ）配列番号２１の軽鎖可変領域（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｃ）配列番号２０の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）および配列番号２１の軽鎖可変領域（１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｄ）配列番号２４〜２９に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｅ）配列番号３０、３１および３２にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｆ）配列番号２４〜２９に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）ならびに配列番号３０、３１および３２に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｇ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｈ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）
を含む抗体を提供する。

【0219】

本明細書の実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲの組と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。

【0220】

別の態様において、本発明は、ＭＩＣＡ結合について上記（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0221】

抗体１６Ａ８
抗体１６Ａ８の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３３として列記し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３４として列記する。重鎖定常領域（それぞれ重鎖および軽鎖に融合している抗体１６Ａ８の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３５および３６にそれぞれ列記する。一実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体１６Ａ８と本質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し；任意選択で、抗体は、抗体１６Ａ８の抗原結合領域を含む。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体１６Ａ８は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴づけることができる。１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、１６Ａ８のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２部分を含む。１６Ａ８の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、１６Ａ８の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。１６Ａ８の可変軽鎖可変領域または１６Ａ８の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２もしくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択で、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１、２、３、４または５つのアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択で、抗体１６Ａ８の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかがＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択で、ヒト定常領域、任意選択で、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプに融合している抗体が提供される。

【0222】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドであって、抗体は、配列番号３７〜３９に記載のアミノ酸配列ＲＹＡＭＳ、ＧＦＴＦＳＲもしくはＧＦＴＦＳＲＹＡＭＳ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ１領域；配列番号４０〜４１に記載のアミノ酸配列ＴＩＦＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶもしくはＴＩＦＳＧＧＳＹ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ２領域；配列番号４２に記載のアミノ酸配列ＰＮＷＥＲＴＦＤＹ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ３領域；配列番号４３に記載のアミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ１領域；配列番号４４に記載のアミノ酸配列ＦＡＳＴＲＥＳ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ２領域；および／または配列番号４５に記載のアミノ酸配列ＱＱＨＹＳＴＰＰＴ、もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、欠失され、もしくは異なるアミノ酸により置換されていてよく、または配列は、１つ以上のアミノ酸の挿入を含み得る）を含むＬＣＤＲ３領域を含むポリペプチドを提供する。

【0223】

別の態様において、本発明は、ヒトＭＩＣＡに結合する抗体であって、
（ａ）配列番号３３の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｂ）配列番号３４の軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｃ）配列番号３３の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）および配列番号３４の軽鎖可変領域（１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｄ）配列番号３７〜４２に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｅ）配列番号４３、４４および４５にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｆ）配列番号３７〜４２に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）ならびに配列番号４３、４４および４５に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｈ）配列番号３４のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）
を含む抗体を提供する。

【0224】

本明細書の実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲの組と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。

【0225】

別の態様において、本発明は、ＭＩＣＡ結合について上記（ａ）〜（ｈ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0226】

抗体１９Ｅ９
抗体１９Ｅ９の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４６として列記し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４７として列記する。

【0227】

具体的な実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体１９Ｅ９と本質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し；任意選択で、抗体は、抗体１９Ｅ９の抗原結合領域を含む。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体１９Ｅ９は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴づけることができる。１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、１９Ｅ９のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２部分を含む。１９Ｅ９の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、１９Ｅ９の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。１９Ｅ９の可変軽鎖可変領域または１９Ｅ９の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２もしくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択で、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択で、抗体１９Ｅ９の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかがヒトＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択で、ヒト定常領域、任意選択で、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプに融合している抗体が提供される。

【0228】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドであって、抗体は、配列番号４８〜５０に記載のアミノ酸配列ＳＤＹＡＷＮ、ＧＹＳＩＴＳＤもしくはＧＹＳＩＴＳＤＹＡＷＮ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ１領域；配列番号５１〜５２に記載のアミノ酸配列ＦＶＳＹＳＧＴＴＫＹＮＰＳＬＫＳもしくはＦＶＳＹＳＧＴＴＫ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ２領域；配列番号５３に記載のアミノ酸配列ＧＹＧＦＤＹ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ３領域；配列番号５４に記載のアミノ酸配列ＳＡＴＳＳＩＳＳＩＹＦＨ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ１領域；配列番号５５に記載のアミノ酸配列ＲＴＳＮＬＡＳ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ２領域；配列番号５６に記載のアミノ酸配列ＱＱＧＴＴＩＰＦＴ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、欠失され、または異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ３領域を含むポリペプチドを提供する。

【0229】

別の態様において、本発明は、ヒトＭＩＣＡに結合する抗体であって、
（ａ）配列番号４６の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｂ）配列番号４７の軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｃ）配列番号４８〜５３に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｄ）配列番号５４、５５および５６に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｅ）配列番号４８〜５３に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）ならびに配列番号５４、５５および５６に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｆ）配列番号４６のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）
を含む抗体を提供する。

【0230】

本明細書の実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲの組と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。

【0231】

別の態様において、本発明は、ＭＩＣＡ結合について上記（ａ）〜（ｇ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0232】

抗体９Ｃ１０
抗体９Ｃ１０の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号５７として列記し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号５８として列記する。具体的な実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体９Ｃ１０と本質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し；任意選択で、抗体は、抗体９Ｃ１０の抗原結合領域を含む。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体９Ｃ１０は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴づけることができる。１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、９Ｃ１０のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２部分を含む。９Ｃ１０の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、９Ｃ１０の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。９Ｃ１０の可変軽鎖可変領域または９Ｃ１０の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２もしくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択で、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択で、抗体９Ｃ１０の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかがヒトＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択で、ヒト定常領域、任意選択で、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプに融合している抗体が提供される。

【0233】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドであって、抗体は、配列番号５９〜６１に記載のアミノ酸配列ＲＹＷＭＮ、ＧＹＳＦＴＲもしくはＧＹＳＦＴＲＹＷＭＮ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ１領域；配列番号６２〜６３に記載のアミノ酸配列ＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤもしくはＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ２領域；配列番号６４に記載のアミノ酸配列ＧＮＦＦＹＶＭＤＹ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ３領域；配列番号６５に記載のアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ１領域；配列番号６６に記載のアミノ酸配列ＡＳＥＳＩＳＧ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ２領域；配列番号６７に記載のアミノ酸配列ＱＱＳＮＦＷＰＦＴ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、欠失され、または異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ３領域を含むポリペプチドを提供する。

【0234】

別の態様において、本発明は、ヒトＭＩＣＡに結合する抗体であって、
（ａ）配列番号６７の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｂ）配列番号６８の軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｃ）配列番号５９〜６４に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｄ）配列番号６５、６６および６７に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｅ）配列番号５９〜６４に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）ならびに配列番号６５、６６および６７に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｆ）配列番号５７のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｇ）配列番号５８のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）
を含む抗体を提供する。

【0235】

本明細書の実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲの組と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。

【0236】

別の態様において、本発明は、ＭＩＣＡ結合について上記（ａ）〜（ｇ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0237】

抗体１２Ａ１０
抗体１２Ａ１０の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号６８として列記し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号６９として列記する。具体的な実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体１２Ａ１０と本質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し；任意選択で、抗体は、抗体１２Ａ１０の抗原結合領域を含む。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体１２Ａ１０は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴づけることができる。１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、１２Ａ１０のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２部分を含む。１２Ａ１０の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、１２Ａ１０の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。１２Ａ１０の可変軽鎖可変領域または１２Ａ１０の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２もしくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択で、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択で、抗体１２Ａ１０の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかがヒトＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択で、ヒト定常領域、任意選択で、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプに融合している抗体が提供される。

【0238】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドであって、抗体は、配列番号７０〜７２に記載のアミノ酸配列ＮＹＷＭＮ、ＧＹＳＦＴＮもしくはＧＹＳＦＴＮＹＷＭＮ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ１領域；配列番号７３〜７４に記載のアミノ酸配列ＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤもしくはＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ２領域；配列番号７５に記載のアミノ酸配列ＤＤＦＦＴＭＤＹ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ３領域；配列番号７６に記載のアミノ酸配列ＲＡＳＱＮＩＶＴＳＩＨ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ１領域；配列番号７７に記載のアミノ酸配列ＹＡＳＥＳＩＳ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ２領域；配列番号７８に記載のアミノ酸配列ＱＱＳＮＩＷＰＬＴ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、欠失され、または異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ３領域を含むポリペプチドを提供する。

【0239】

別の態様において、本発明は、ヒトＭＩＣＡに結合する抗体であって、
（ａ）配列番号６８の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｂ）配列番号６９の軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｃ）配列番号７０〜７５に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｄ）配列番号７６、７７および７８に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｅ）配列番号７０〜７５に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）ならびに配列番号７６、７７および７８に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｆ）配列番号６８のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｇ）配列番号６９のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）
を含む抗体を提供する。

【0240】

本明細書の実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲの組と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。

【0241】

別の態様において、本発明は、ＭＩＣＡ結合について上記（ａ）〜（ｇ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0242】

抗体１０Ａ７
抗体１０Ａ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号７９として列記し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号８０として列記する。具体的な実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体１０Ａ７と本質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し；任意選択で、抗体は、抗体１０Ａ７の抗原結合領域を含む。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体１０Ａ７は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴づけることができる。１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、１０Ａ７のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２部分を含む。１０Ａ７の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、１０Ａ７の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。１０Ａ７の可変軽鎖可変領域または１０Ａ７の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２もしくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択で、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択で、抗体１０Ａ７の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかがヒトＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択で、ヒト定常領域、任意選択で、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプに融合している抗体が提供される。

【0243】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドであって、抗体は、配列番号８１〜８３に記載のアミノ酸配列ＴＳＧＭＧＶＧ、ＧＦＳＬＳＴＳＧもしくはＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ１領域；配列番号８４〜８５に記載のアミノ酸配列ＨＩＷＷＤＤＤＲＹＹＮＰＳＬＫＳもしくはＨＩＷＷＤＤＤＲＹ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ２領域；配列番号８６に記載のアミノ酸配列ＲＬＮＧＹＦＤＹ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ３領域；配列番号８７に記載のアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ１領域；配列番号８８に記載のアミノ酸配列ＹＡＳＱＳＩＳ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ２領域；配列番号８９に記載のアミノ酸配列ＱＮＧＨＳＦＰＦＴ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、欠失され、または異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ３領域を含むポリペプチドを提供する。

【0244】

別の態様において、本発明は、ヒトＭＩＣＡに結合する抗体であって、
（ａ）配列番号７９の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｂ）配列番号８０の軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｃ）配列番号８１〜８６に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｄ）配列番号８７、８８および８９に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｅ）配列番号８１〜８６に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）ならびに配列番号８７、８８および８９に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｆ）配列番号７９のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｇ）配列番号８０のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）
を含む抗体を提供する。

【0245】

本明細書の実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲの組と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。

【0246】

別の態様において、本発明は、ＭＩＣＡ結合について上記（ａ）〜（ｇ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0247】

抗体１８Ｅ８
抗体１８Ｅ８の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号９０として列記し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号９１として列記する。具体的な実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体１８Ｅ８と本質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し；任意選択で、抗体は、抗体１８Ｅ８の抗原結合領域を含む。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体１８Ｅ８は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴づけることができる。１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、１８Ｅ８のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２部分を含む。１８Ｅ８の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、１８Ｅ８の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。１８Ｅ８の可変軽鎖可変領域または１８Ｅ８の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２もしくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択で、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択で、抗体１８Ｅ８の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかがヒトＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択で、ヒト定常領域、任意選択で、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプに融合している抗体が提供される。

【0248】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドであって、抗体は、配列番号９２〜９４に記載のアミノ酸配列ＳＤＹＳＷＨ、ＧＹＳＩＴＳＤもしくはＧＹＳＩＴＳＤＹＳＷＨ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ１領域；配列番号９５〜９６に記載のアミノ酸配列ＮＩＨＹＳＧＲＩＮＹＮＰＳＬＲＳもしくはＮＩＨＹＳＧＲＩＮ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ２領域；配列番号９７に記載のアミノ酸配列ＲＲＴＦＧＮＦＥＤＹ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ３領域；配列番号９８に記載のアミノ酸配列ＲＳＳＳＳＶＮＹＭＨ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ１領域；配列番号９９に記載のアミノ酸配列ＡＴＳＴＬＡＳ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ２領域；配列番号１００に記載のアミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、欠失され、または異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ３領域を含むポリペプチドを提供する。

【0249】

別の態様において、本発明は、ヒトＭＩＣＡに結合する抗体であって、
（ａ）配列番号９０の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｂ）配列番号９１の軽鎖可変領域（１、２、３つまたは）；ならびに／または
（ｃ）配列番号９２〜９７に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｄ）配列番号９８、９９および１００に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｅ）配列番号９２〜９７に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）ならびに配列番号９８、９９および１００に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｆ）配列番号９０のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｇ）配列番号９１のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）
を含む抗体を提供する。

【0250】

本明細書の実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲの組と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。

【0251】

別の態様において、本発明は、ＭＩＣＡ結合について上記（ａ）〜（ｇ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0252】

抗体１０Ｆ３
抗体１０Ｆ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１０１として列記し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１０２として列記する。具体的な実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体１０Ｆ３と本質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し；任意選択で、抗体は、抗体１０Ｆ３の抗原結合領域を含む。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体１０Ｆ３は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴づけることができる。１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、１０Ｆ３のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２部分を含む。１０Ｆ３の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、１０Ｆ３の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。１０Ｆ３の可変軽鎖可変領域または１０Ｆ３の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２もしくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択で、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択で、抗体１０Ｆ３の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかがヒトＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択で、ヒト定常領域、任意選択で、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプに融合している抗体が提供される。

【0253】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドであって、抗体は、配列番号１０３〜１０５に記載のアミノ酸配列ＳＹＴＭＨ、ＧＹＴＦＴＳもしくはＧＹＴＦＴＳＹＴＭＨ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ１領域；配列番号１０６〜１０７に記載のアミノ酸配列ＹＩＮＰＳＳＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤもしくはＹＩＮＰＳＳＧＹＴＥ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ２領域；配列番号１０８に記載のアミノ酸配列ＧＧＤＷＤＶＤＷＦＶＹ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ３領域；配列番号１０９に記載のアミノ酸配列ＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ１領域；配列番号１１０に記載のアミノ酸配列ＳＴＳＫＬＡＳ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ２領域；配列番号１１１に記載のアミノ酸配列ＱＨＲＳＴＹＰＦＴ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、欠失され、または異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ３領域を含むポリペプチドを提供する。

【0254】

別の態様において、本発明は、ヒトＭＩＣＡに結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１０１の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｂ）配列番号１０２の軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｃ）配列番号１０３〜１０８に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｄ）配列番号１０９、１１０および１１１に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｅ）配列番号１０３〜１０８に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）ならびに配列番号１０９、１１０および１１１に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｆ）配列番号１０１のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｇ）配列番号１０２のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）
を含む抗体を提供する。

【0255】

本明細書の実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲの組と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。

【0256】

別の態様において、本発明は、ＭＩＣＡ結合について上記（ａ）〜（ｇ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0257】

抗体１５Ｆ９
抗体１５Ｆ９の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１１２として列記し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１１３として列記する。具体的な実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体１５Ｆ９と本質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し；任意選択で、抗体は、抗体１５Ｆ９の抗原結合領域を含む。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体１５Ｆ９は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴づけることができる。１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、１５Ｆ９のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２部分を含む。１５Ｆ９の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、１５Ｆ９の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。１５Ｆ９の可変軽鎖可変領域または１５Ｆ９の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２もしくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択で、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択で、抗体１５Ｆ９の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかがヒトＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択で、ヒト定常領域、任意選択で、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプに融合している抗体が提供される。

【0258】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドであって、抗体は、配列番号１１４〜１１６に記載のアミノ酸配列ＳＧＹＳＷＨ、ＧＹＳＩＴＳＧもしくはＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＨ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ１領域；配列番号１１７〜１１８に記載のアミノ酸配列ＦＩＨＹＳＧＳＴＤＹＮＰＳＬＫＳもしくはＦＩＨＹＳＧＳＴＤ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ２領域；配列番号１１９に記載のアミノ酸配列ＤＹＧＨＷＹＦＤＶ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ３領域；配列番号１２０に記載のアミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＳＹＤＶＡ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ１領域；配列番号１２１に記載のアミノ酸配列ＹＡＳＮＲＹＴ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ２領域；配列番号１２２に記載のアミノ酸配列ＱＱＤＹＳＳＬＴ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、欠失され、または異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ３領域を含むポリペプチドを提供する。

【0259】

別の態様において、本発明は、ヒトＭＩＣＡに結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１１２の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｂ）配列番号１１３の軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｃ）配列番号１１４〜１１９に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｄ）配列番号１２０、１２１および１２２に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｅ）配列番号１１４〜１１９に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）ならびに配列番号１２０、１２１および１２２に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｆ）配列番号１１２のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｇ）配列番号１１３のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）
を含む抗体を提供する。

【0260】

本明細書の実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲの組と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。

【0261】

別の態様において、本発明は、ＭＩＣＡ結合について上記（ａ）〜（ｇ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0262】

抗体１４Ｂ４
抗体１４Ｂ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１２３として列記し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１２４として列記する。具体的な実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体１４Ｂ４と本質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体を提供し；任意選択で、抗体は、抗体１４Ｂ４の抗原結合領域を含む。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体１４Ｂ４は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列により特徴づけることができる。１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、１４Ｂ４のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２部分を含む。１４Ｂ４の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、モノクローナル抗体は、１４Ｂ４の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。１４Ｂ４の可変軽鎖可変領域または１４Ｂ４の軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２もしくは３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択で、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択で、抗体１４Ｂ４の抗原結合領域の一部または全部を含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかがヒトＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択で、ヒト定常領域、任意選択で、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプに融合している抗体が提供される。

【0263】

別の態様において、本発明は、抗体をコードする精製ポリペプチドであって、抗体は、配列番号１２５〜１２７に記載のアミノ酸配列ＳＹＷＭＮ、ＧＹＳＦＴＳもしくはＧＹＳＦＴＳＹＷＭＮ、もしくはＧ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ１領域；配列番号１２８〜１２９に記載のアミノ酸配列ＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤもしくはＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ２領域；配列番号１３０に記載のアミノ酸配列ＥＭＧＰＹＴＬＤＹ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＨＣＤＲ３領域；配列番号１３１に記載のアミノ酸配列ＲＡＳＱＮＩＤＴＳＩＨ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ１領域；配列番号１３２に記載のアミノ酸配列ＹＡＳＥＳＩＳ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ２領域；配列番号１３３に記載のアミノ酸配列ＱＱＳＮＹＷＰＬＴ、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列（これらのアミノ酸の１つ以上は、欠失され、または異なるアミノ酸により置換されていてよい）を含むＬＣＤＲ３領域を含むポリペプチドを提供する。

【0264】

別の態様において、本発明は、ヒトＭＩＣＡに結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１２３の重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｂ）配列番号１２４の軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｃ）配列番号１２５〜１３０に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｄ）配列番号１３１、１３２および１３３に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｅ）配列番号１２５〜１３０に示される重鎖ＣＤＲ１、２および３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）ならびに配列番号１３１、１３２および１３３に示される軽鎖ＣＤＲ１、２および３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列（ＣＤＲ中の１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｆ）配列番号１２３のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である重鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）；ならびに／または
（ｇ）配列番号１２４のアミノ酸配列を有する可変領域と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である軽鎖可変領域（１、２、３つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸により置換されていてよい）
を含む抗体を提供する。

【0265】

本明細書の実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のいずれかは、その少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０連続アミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に列記される特定のＣＤＲもしくはＣＤＲの組と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％配列同一性を共有するアミノ酸配列を有すると特徴づけることができる。

【0266】

別の態様において、本発明は、ＭＩＣＡ結合について上記（ａ）〜（ｇ）のモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0267】

本発明の抗体のいずれか、例えば、６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９または１４Ｂ４において、規定の可変領域およびＣＤＲ配列は、保存的配列改変（１、２、３、４、５、６、７、８つ以上の配列改変）を含み得る。保存的配列改変は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に有意に影響せず、変化もさせないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変としては、アミノ酸置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、当分野において公知の標準的技術、例えば、部位特異的変異導入およびＰＣＲ媒介変異導入により本発明の抗体中に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、典型的には、アミノ酸残基を、類似の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えるものである。規定の可変領域およびＣＤＲ配列は、１、２、３、４つ以上のアミノ酸挿入、欠失または置換を含み得る。置換を行う場合、好ましい置換は、保存的改変である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基により置き換えることができ、または変化された抗体は、保持された機能（すなわち、本明細書に記載の特性）について本明細書に記載のアッセイを使用して試験することができる。

【0268】

用語「同一性」または「同一である」は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、２つ以上のアミノ酸残基の文字列間でのマッチの数によって決定された、ポリペプチド間の配列の関連性の程度を示す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により対処されるギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列の小さい方の間での同一のマッチのパーセントの尺度である。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法により容易に計算することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載のものが挙げられる。

【0269】

同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大マッチを与えるように設計される。同一性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記述されている。２つの配列間の同一性を判定するための好ましいコンピュータプログラムの方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、例としてＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前掲）から公的に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して同一性を決定することもできる。

【0270】

ＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアの定義）、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの定義系による、本発明による抗体のＣＤＲの配列を以下の表Ａ中にまとめた。任意の好適な番号付与系を任意の他の表示の不存在下で、指定されたＣＤＲ領域に対して使用することができる一方、本明細書において使用される番号付与はＡｂｍである。そのような番号付与は、以下の表示を使用して確立されている：ＣＤＲ−Ｌ１：開始：約残基２４、前の残基：常にＣｙｓ、後の残基：常にＴｒｐ（典型的には、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎだけでなく、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）、長さ：１０〜１７残基；ＣＤＲ−Ｌ２：開始：Ｌ１の末端の後に常に１６残基、前の残基：一般にＩｌｅ−Ｔｙｒ（それだけでなく、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｈｅ）、長さ：常に７残基；ＣＤＲ−Ｌ３、開始：Ｌ２の末端の後に常に３３残基、前の残基：常にＣｙｓ、後の残基：常にＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ、長さ：７〜１１残基；ＣＤＲ−Ｈ１、開始：約残基２６（Ｃｙｓの後に常に４残基）（Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭ定義、Ｋａｂａｔ定義は５残基後から開始する）、前の残基：常にＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ、後の残基：常にＴｒｐ（典型的には、Ｔｒｐ−Ｖａｌだけでなく、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ−Ａｌａ）、長さ：１０〜１２残基（ＡｂＭ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は最後の４残基を除外する）；ＣＤＲ−Ｈ２、開始：ＣＤＲ−Ｈ１のＫａｂａｔ／ＡｂＭ定義の末端の後に常に１５残基、前の残基：典型的にはＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（しかし、多数の変動、Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａ後の残基）、長さ：Ｋａｂａｔ定義では１６〜１９残基；ＡｂＭ（およびＣｈｏｔｈｉａ）定義では、７残基前で終了する；ＣＤＲ−Ｈ３、開始：ＣＤＲ−Ｈ２の末端の後に常に３３残基（Ｃｙｓの後に常に２残基）、前の残基：常にＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ（典型的にはＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）、後の残基：常にＴｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ、長さ：３〜２５残基。

【0271】

本発明による抗体の可変鎖の配列を以下の表Ｂ中に列記し、リーダー配列をそれぞれの配列の開始において下線により示し（任意の抗体鎖を、リーダー配列の末端直後のアミノ酸位置において開始すると規定することができる）、それぞれのＣＤＲを下線により示す。本明細書の任意の実施形態において、ＶＬまたはＶＨ配列は、シグナルペプチドまたはその任意の部分を含有するまたは欠くように規定または番号付与することができる。

【0272】

一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのものである。一実施形態において、本発明の抗体は、その結合および／または機能特性を保持する抗体断片である。

【0273】

【表1】

【0274】

【表2】

【0275】

【表3】

【0276】

【表4】

【0277】

【表5】

【0278】

【表6】

【0279】

【表7】

【0280】

本発明の実施形態のいずれかの一態様において、本発明の任意の抗体は、式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）から選択されるそれぞれの式によるＣＤＲ１、２および／または３配列を有する重鎖および／または軽鎖を含み得る。本明細書の任意の実施形態において、特定のＨＣＤＲ１〜３またはＬＣＤＲ−１〜３は、式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）の配列を有すると規定することができる。１つの好ましい実施形態において、抗体は、３つのＬＣＤＲを含む軽鎖および３つのＨＣＤＲを含む重鎖を含む。

【0281】

一実施形態において、ＨＣＤＲ１は、式（Ｉ）：
Ｇ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５（配列番号２６１）
のアミノ酸配列を含み、
式中、Ｘａａ_１は、ＰｈｅまたはＴｙｒであり得、Ｘａａ_２は、ＴｈｒまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ_３は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＰｈｅであり得、Ｘａａ_４は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり得、Ｘａａ_５は、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｒｇであり得る。任意選択で、前記Ｘａａ_１〜５のいずれか１、２または３つは、示されるアミノ酸のいずれかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得る。

【0282】

一実施形態において、ＨＣＤＲ１は、式（ＩＩ）：
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５（配列番号２６２）
のアミノ酸配列を含み、
式中、Ｘａａ_１は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｒｇであり得、Ｘａａ_２は、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＴｙｒであり得、Ｘａａ_３は、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐであり得、Ｘａａ_４は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＭｅｔであり得、Ｘａａ_５は、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＡｓｎであり得る。任意選択で、前記Ｘａａ_１〜５のいずれか１、２または３つは、示されるアミノ酸のいずれかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得る。

【0283】

一実施形態において、ＨＣＤＲ１は、式（ＩＩＩ）：
Ｘａａ_１−Ｙ−Ｘａａ_２−Ｍ−Ｘａａ_３（配列番号２６３）
のアミノ酸配列を含み、
式中、Ｘａａ_１〜３は、それぞれ、示されるアミノ酸のいずれかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得、Ｘａａ_１は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｒｇであり得、Ｘａａ_２は、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐであり得、Ｘａａ_３は、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＡｓｎであり得る。

【0284】

一実施形態において、ＨＣＤＲ２は、式（ＩＶ）：
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７−Ｘａａ_８−Ｘａａ_９−Ｘａａ_１０（配列番号２６４）
のアミノ酸配列を含み、
式中、Ｘａａ_１は、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、ＴｙｒまたはＭｅｔであり得、Ｘａａ_２は、ＶａｌまたはＩｌｅであり得、Ｘａａ_３は、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＴｒｐであり得、Ｘａａ_４は、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＰｒｏであり得、Ｘａａ_５は、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ_６は、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ_７は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、ＡｒｇまたはＧｌｙであり得、Ｘａａ_８は、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、ＩｌｅまたはＴｈｒであり得、Ｘａａ_９は、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＡｓｐであり得、Ｘａａ_１０は、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｕであり得る。任意選択で、前記Ｘａａ_１〜１０のいずれか１、２、３または４つは、示されるアミノ酸のいずれかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得る。

【0285】

一実施形態において、ＨＣＤＲ３は、式（Ｖ）：
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７−Ｘａａ_８−Ｘａａ_９（配列番号２６５）
のアミノ酸配列を含み、
式中、Ｘａａ_１は、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり得、Ｘａａ_２は、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＧｌｕまたはＭｅｔであり得、Ｘａａ_３は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、ＡｓｎまたはＴｈｒであり得、Ｘａａ_４は、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＰｒｏであり得、Ｘａａ_５は、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり得、Ｘａａ_６は、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＡｓｎであり得、Ｘａａ_７は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、ＭｅｔまたはＬｅｕであり得、Ｘａａ_８は、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり得、Ｘａａ_９は、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、ＰｈｅまたはＶａｌであり得る。任意選択で、前記Ｘａａ_１〜９のいずれか１、２、３または４つは、示されるアミノ酸のいずれかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得る。

【0286】

一実施形態において、ＬＣＤＲ１は、式（ＶＩ）：
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７−Ｘａａ_８−Ｘａａ_９−Ｘａａ_１０−Ｘａａ_１１（配列番号２６６）
のアミノ酸配列を含み、
式中、Ｘａａ_１は、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり得、Ｘａａ_２は、ＳｅｒまたはＡｌａであり得、Ｘａａ_３は、ＴｈｒまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ_４は、ＳｅｒまたはＧｌｎであり得、Ｘａａ_５は、ＡｓｎまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ_６は、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅであり得、Ｘａａ_７は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ_８は、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＡｓｐであり得、Ｘａａ_９は、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＴｙｒであり得、Ｘａａ_１０は、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり得、Ｘａａ_１１は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、ＡｓｎまたはＨｉｓであり得る。任意選択で、前記Ｘａａ_１〜１１のいずれか１、２、３または４つは、示されるアミノ酸のいずれかの保存的もしくは非保存的置換、または欠失または挿入であり得る。

【0287】

一実施形態において、ＬＣＤＲ２は、式（ＶＩＩ）：
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７（配列番号２６７）
のアミノ酸配列を含み、
式中、Ｘａａ_１は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＡｌａであり得、Ｘａａ_２は、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ_３は、ＳｅｒまたはＧｌｕであり得、Ｘａａ_４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ_５は、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＩｌｅであり得、Ｘａａ_６は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＩｌｅまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ_７は、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＧｌｙであり得る。任意選択で、前記Ｘａａ_１〜７のいずれか１、２、３または４つは、示されるアミノ酸のいずれかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得る。

【0288】

一実施形態において、ＬＣＤＲ３は、式（ＶＩＩＩ）：
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７−Ｘａａ_８−Ｘａａ_９（配列番号２６８）
のアミノ酸配列を含み、
式中、Ｘａａ_１は、ＰｈｅまたはＧｌｎであり得、Ｘａａ_２は、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり得、Ｘａａ_３は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＴｒｐまたはＡｒｇであり得、Ｘａａ_４は、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＴｈｒまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ_５は、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＴｙｒであり得、Ｘａａ_６は、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＡｓｎまたはＴｒｙであり得、Ｘａａ_７は、Ｐｒｏであり、Ｘａａ_８は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＬｅｕであり得、Ｘａａ_９は、Ｔｈｒである。任意選択で、前記Ｘａａ_１〜９のいずれか１、２、３または４つは、示されるアミノ酸のいずれかの保存的もしくは非保存的置換または欠失または挿入であり得る。

【0289】

一実施形態において、本発明の抗体は、
ａ 配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；および／または
ｂ 配列番号２６７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；および／または
ｃ 配列番号２６８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
を含む軽鎖を含み得る。

【0290】

一実施形態において、本発明の抗体は、
ｄ 配列番号２６１、２６２および２６３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；ならびに／または
ｅ 配列番号２６４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；ならびに／または
ｆ 配列番号２６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）
を含む重鎖を含み得る。

【0291】

断片および誘導体
本発明の抗体の断片および誘導体（特に記載がなくまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、本出願において使用される用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」により包含される）、好ましくは６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、９Ｃ１０、１９Ｅ９、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９または１４Ｂ４様抗体は、当分野において公知の技術により産生することができる。「断片」は、インタクト抗体の一部、一般に抗原結合部位または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；連続アミノ酸残基の１つの不断配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書において「単鎖抗体断片」または「単鎖ポリペプチド」と称される）、例として、限定されるものではないが、（１）単鎖Ｆｖ分子、（２）会合重鎖部分を有さない、１つの軽鎖可変ドメインのみを含有する単鎖ポリペプチド、または軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片、および（３）会合軽鎖部分を有さない、１つの重鎖可変領域のみを含有する単鎖ポリペプチド、または重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを有するその断片；ならびに抗体断片から形成される多重特異的抗体が挙げられる。とりわけ、ナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体または「ｄＡｂ」が含まれる。

【0292】

本抗体の断片は、標準的方法を使用して得ることができる。例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片は、慣用技術に従って単離抗体のプロテアーゼ消化により産生することができる。免疫反応性断片は、公知の方法を使用し、例えば、インビボでクリアランスを遅延させ、より望ましい薬物動態学的特性を得るように改変することができ、断片をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により修飾することができることが理解される。

【0293】

あるいは、本発明の抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡを、本発明の断片をコードするように改変することができる。次いで、改変ＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、それを使用して適切な細胞を形質転換または形質移入し、次いでそれが所望の断片を発現する。

【0294】

ある実施形態において、本発明の抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、発現ベクター中への挿入前、例えばヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコード配列を相同非ヒト配列の代わりに置換し、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全部もしくは一部を共有結合させることにより改変することができる。そのようにして、元の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換する。

【0295】

したがって、別の実施形態によれば、本発明の抗体は、ヒト化されている。本発明による抗体の「ヒト化」形態は、特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）であり、それらはネズミ免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）らの残基が元の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置き換えられている一方、元の抗体の所望の特異性、親和性、および能力を維持するヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。

【0296】

一部の例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられていてよい。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはインポートされたＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれにおいても見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに改良し、最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部は、元の抗体のそれらに対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．５９３（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐｐ．１５３４；および米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照、それらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0297】

ヒト化抗体の作製に使用すべき軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減させるために極めて重要である。いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法によれば、本発明の抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、マウスの配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として認める（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，ｐｐ．２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．１９６，１９８７，ｐｐ．９０１）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の下位群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列からの特定のフレームワークを使用する。同一フレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体について使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８９，ｐｐ．４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，ｐ．２６２３（１９９３））。

【0298】

抗体がＭＩＣＡ受容体についての高親和性および他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されていることはさらに重要である。この目的を達成するため、好ましい方法によれば、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析プロセスによりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者には周知である。選択される候補免疫グロブリン配列の考えられる三次元構造を図示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の精査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の推定される役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンのその抗原への結合能に影響を与える残基の分析が可能になる。このようにして、所望の抗体特性、例えば標的抗原についての親和性の増加が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサスおよびインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接的に、最も実質的に関与する。

【0299】

「ヒト化」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、免疫化に使用されるマウスとしてＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用することである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、免疫グロブリン遺伝子が機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子により置き換えられている本発明によるネズミ宿主である。したがって、このマウスにより、またはこのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマ中で産生される抗体は、既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６，１６２，９６３号明細書記載されており、それは参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0300】

ヒト抗体は、種々の他の技術により、例えば免疫化のため、ヒト抗体レパートリーを発現するように遺伝子操作されている他のトランスジェニック動物を使用することにより（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５）、またはファージディスプレイ法を使用する抗体レパートリーの選択により産生することもできる。そのような技術は、当業者に公知であり、本出願に開示されるモノクローナル抗体から出発して実施することができる。

【0301】

本発明の抗体は、重鎖／軽鎖の一部が元の抗体中の対応配列と同一または相同である一方、鎖の残部が、別種に由来し、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体の断片に、それらが所望の生物学的活性および結合特異性を示す限り、誘導体化することもできる（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、前掲；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐｐ．６８５１（１９８４））。

【0302】

本発明は、細胞に指向され、実施形態において、細胞中に内在化される抗ＭＩＣＡ抗体分子を提供する。これらは、治療剤または検出可能な薬剤をＭＩＣＡ発現細胞にまたはその細胞中に送達し得るが、ＭＩＣＡポリペプチドが発現されない細胞にも細胞中にも送達し得ない。したがって、本発明は、治療剤または検出可能な薬剤（またはＭＩＣＡ発現細胞へ送達すべき関心対象のペイロードとして機能とする任意の他の部分にコンジュゲートされている本明細書に記載の抗ＭＩＣＡ抗体を含む抗ＭＩＣＡイムノコンジュゲートも提供する。実施形態において、抗ＭＩＣＡイムノコンジュゲートのＭＩＣＡについての親和性は、非コンジュゲート抗体についての親和性の少なくとも１０、２５、５０、７５、８０、９０、または９５％である。これは、細胞表面ＭＩＣＡまたは単離ＭＩＣＡを使用して測定することができる。

【0303】

本発明の抗体または抗体部分を誘導体化（または標識）することができる有用な検出可能な薬剤としては、蛍光化合物、種々の酵素、補欠分子族、発光材料、生物発光材料、蛍光発光金属原子、例えば、ユウロピウム（Ｅｕ）、および他のアンタニド（ａｎｔｈａｎｉｄｅ）、ならびに放射性材料（上記）が挙げられる。例示的な蛍光検出可能な薬剤としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−ｌ−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリンなどが挙げられる。抗体は、検出可能な酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどにより誘導体化することもできる。抗体を検出可能な酵素により誘導体化する場合、それは、酵素が使用して検出可能な反応産物を産生する追加の試薬の添加により検出する。例えば、検出可能な薬剤セイヨウワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加が検出可能な発色反応産物をもたらす。抗体は、補欠分子族（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）により誘導体化することもできる。例えば、抗体は、ビオチンにより誘導体化し、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的な計測を介して検出することができる。好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンが挙げられ；発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。あるいは、抗ＭＩＣＡ抗体は、抗ＭＩＣＡ抗体に結合する二次抗体と会合させることができ、その場合、二次抗体は、検出可能な標識により誘導体化されており；前記二次抗体をインビトロまたはインビボで抗ＭＩＣＡ抗体と接触させて結合させることは、抗ＭＩＣＡが標識抗体として機能することを可能とする。

【0304】

検出可能な部分へのコンジュゲーションは、とりわけ、本発明の抗体を診断目的に使用する場合に有用である。そのような目的としては、限定されるものではないが、ＭＩＣＡ発現細胞の存在についての生物学的試料、例えば、血液試料または組織生検物のアッセイ、および個体中のＭＩＣＡ発現細胞の存在、レベル、または活性の検出が挙げられる。そのようなアッセイおよび検出方法は、例えば、患者の細胞中のＭＩＣＡ発現を検出すること、および患者の細胞がＭＩＣＡを発現することが決定された場合、続いて本発明のＭＩＣＡモジュレート抗体を投与することを含む、本発明の診断／治療方法において使用することができる。

【0305】

ある実施形態において、本抗体は、生物学的試料からＭＩＣＡ発現細胞を精製するために使用する。生物学的試料は、患者から、例えば、診断もしくはエクスビボ治療目的のため、または研究目的のためにそのような細胞源を得るために個体もしくは非ヒト霊長類から得ることができる。

【0306】

１つのそのような一実施形態において、本発明の標識抗体は、ＦＡＣＳ選別において使用し、ＭＩＣＡ発現細胞を生物学的試料から精製または単離することが可能である。あるいは、一部の実施形態において、本発明の抗体の固体支持体へのコンジュゲーションは、生物学的試料、例えば血液試料からの、細胞表面上にＭＩＣＡ受容体を担持する細胞、または個体からの組織生検物からの細胞、の親和性精製におけるツールとして有用であり得る。この精製方法は、得られた精製細胞集団の場合の、本発明の別の代替的な実施形態である。

【0307】

ＭＩＣＡ発現細胞を単離または精製するために使用される方法にかかわらず、そのように実施する能力は、多数の目的のため、例えば、ＭＩＣＡ関連障害を、例えば本明細書に記載の抗ＭＩＣＡ抗体の投与前に、ＭＩＣＡ発現細胞の数または活性を評価することにより診断するために有用である。さらに、精製ＭＩＣＡ発現細胞は、例えば、細胞およびそれらの種々の特性および挙動をより良好に特徴づけ、ならびにそれらの挙動、活性、生存、または増殖をモジュレートするために使用することができる化合物または方法を同定するため、研究関連で有用である。

【0308】

改変定常領域
ＡＤＣＣおよびＣＤＣを誘導する本発明の抗ＭＩＣＡ抗体の能力の観点から、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性、マスト細胞脱顆粒、および食作用、ならびに免疫調節シグナル、例えば、リンパ球増殖および抗体分泌の調節に影響し得るＦｃ受容体に結合するそれらの能力を増加させる改変を有する本発明の抗体を作製することもできる。典型的な改変としては、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換、欠失、挿入）、および／または変化されたタイプのグリコシル化、例えば、低フコシル化を含む改変ヒトＩｇＧ１定常領域が挙げられる。そのような改変は、Ｆｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）との相互作用に影響し得る。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、活性化（すなわち、免疫系向上）受容体である一方、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は、阻害（すなわち、免疫系減衰）受容体である。改変は、例えば、エフェクター（例えば、ＮＫ）細胞上のＦｃγＲＩＩＩａへのＦｃドメインの結合を増加させ得る。

【0309】

抗ＭＩＣＡ抗体は、好ましくは、任意選択で改変されているヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのＦｃドメイン（またはその一部）を含む。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２２８）の２３０〜４４７位配列のアミノ酸配列を以下に示す：
ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１３４）。

【0310】

残基２３０〜３４１（Ｋａｂａｔ ＥＵ）は、ＦｃＣＨ２領域である。残基３４２〜４４７（Ｋａｂａｔ ＥＵ）は、ＦｃＣＨ３領域である。抗ＭＩＣＡ抗体は、１つ以上の位置中の１つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失、挿入）を有するバリアントＦｃ領域を含み得、その改変は、ＦｃγＲ（例として、活性化および阻害ＦｃγＲ）についてのバリアントＦｃ領域の親和性およびアビディティーを増加させる。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸改変は、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡについてのバリアントＦｃ領域の親和性を増加させる。別の実施形態において、バリアントＦｃ領域は、同等の親抗体（すなわち、Ｆｃ領域中の１つ以上のアミノ酸改変を除き本発明の抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体）のＦｃ領域よりも低い親和性でＦｃγＲＩＩＢにさらに特異的に結合する。例えば、アミノ酸３１０および４３５位におけるヒスチジン残基の一方または両方は、例えば、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリンまたはトレオニンにより置換されていてよく（例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０８０２７７号パンフレット参照）；そのような置換定常領域は、活性ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を減少させずに阻害ＦｃγＲＩＩＢへの結合の減少を提供する。一部の実施形態において、そのような改変は、親抗体に対してＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡについてのバリアントＦｃ領域の親和性を増加させ、ＦｃγｙＲＩＩＢについてのバリアントＦｃ領域の親和性も向上させる。他の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸改変は、親抗体のＦｃ領域に対してＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡについてのバリアントＦｃ領域の親和性を増加させるが、ＦｃγＲＩＩＢについてのバリアントＦｃ領域の親和性を変化させない。別の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸改変は、親抗体に対してＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＡについてのバリアントＦｃ領域の親和性を向上させるが、ＦｃγＲＩＩＢについての親和性を低減させる。親和性および／またはアビディティーの増加は、（改変Ｆｃ領域を有さない）親分子の結合活性を細胞中で検出することができない低レベルのＦｃγＲを発現する細胞中での検出可能なＦｃγＲへの結合またはＦｃγＲ関連活性をもたらす。

【0311】

一実施形態において、Ｆｃ領域のアミノ酸の前記１つ以上の改変は、１つ以上のＦｃγＲ受容体についての抗体の親和性およびアビディティーを低減させる。具体的な実施形態において、本発明は、バリアントＦｃ領域を含む抗体であって、前記バリアントＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、バリアントＦｃ領域は、１つのＦｃγＲにのみ結合し、前記ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＡである抗体を包含する。

【0312】

ＦｃγＲについての分子、例えば、本発明の抗体の親和性および結合特性は、抗体−抗原またはＦｃ−ＦｃγＲ相互作用、すなわち、それぞれ抗体への抗原の特異的結合またはＦｃγＲへのＦｃ領域の特異的結合を測定する当分野において公知のインビトロアッセイ（生化学または免疫ベースアッセイ）、例として、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイを使用して測定することができる。

【0313】

一部の実施形態において、バリアントＦｃ領域を含む本発明の分子は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ以上のアミノ酸改変を有する）を含む。他の実施形態において、バリアントＦｃ領域を含む本発明の分子は、アミノ酸２３１〜３４１から伸長すると定義されるＦｃ領域のＣＨ２ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ以上のアミノ酸改変を有する）を含む。一部の実施形態において、本発明の分子は、少なくとも２つのアミノ酸改変（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ以上のアミノ酸改変を有する）を含み、少なくとも１つのそのような改変はＣＨ３領域中に存在し、少なくとも１つのそのような改変はＣＨ２領域中に存在する。本発明は、ヒンジ領域中のアミノ酸改変をさらに包含する。特定の実施形態において、本発明は、アミノ酸２１６〜２３０から伸長すると定義されるＦｃ領域のＣＨ１ドメイン中のアミノ酸改変を包含する。

【0314】

Ｆｃ改変の任意の組合せ、例えば、米国特許第７，６３２，４９７号明細書；米国特許第７，５２１，５４２号明細書；米国特許第７，４２５，６１９号明細書；米国特許第７，４１６，７２７号明細書；米国特許第７，３７１，８２６号明細書；米国特許第７，３５５，００８号明細書；米国特許第７，３３５，７４２号明細書；米国特許第７，３３２，５８１号明細書；米国特許第７，１８３，３８７号明細書；米国特許第７，１２２，６３７号明細書；米国特許第６，８２１，５０５号明細書および米国特許第６，７３７，０５６号明細書；ＰＣＴ公開の国際公開第２０１１／１０９４００号パンフレット；国際公開第２００８／１０５８８６号パンフレット；国際公開第２００８／００２９３３号パンフレット；国際公開第２００７／０２１８４１号パンフレット；国際公開第２００７／１０６７０７号パンフレット；国際公開第０６／０８８４９４号パンフレット；国際公開第０５／１ １５４５２号パンフレット；国際公開第０５／１１０４７４号パンフレット；国際公開第０４／１０３２２６９号パンフレット；国際公開第００／４２０７２号パンフレット；国際公開第０６／０８８４９４号パンフレット；国際公開第０７／０２４２４９号パンフレット；国際公開第０５／０４７３２７号パンフレット；国際公開第０４／０９９２４９号パンフレットおよび国際公開第０４／０６３３５１号パンフレット；ならびにＰｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０（４）：４８７−４９０；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６；２７７（３０）：２６７３３−２６７４０およびＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４）に開示される異なる改変の任意の組合せを作製することができる。

【0315】

本発明は、バリアントＦｃ領域を含む抗ＭＩＣＡ抗体であって、バリアントＦｃ領域は、分子が野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して向上されたエフェクター機能を有するように、野生型Ｆｃ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ以上のアミノ酸改変を有する）を含み、任意選択で、バリアントＦｃ領域は、２２１、２４３、２４７、２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１６、３２０、３２２、３２６、３２９、３３０、３３２、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３５９、３６０、３７０、３７３、３７６、３７８、３９２、３９６、３９９、４０２、４０４、４１６、４１９、４２１、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８および／または４３９位のいずれか１つ以上における置換を含む抗体を包含する。

【0316】

本発明は、バリアントＦｃ領域を含む抗ＭＩＣＡ抗体であって、バリアントＦｃ領域は、分子が野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して向上されたエフェクター機能を有するように、野生型Ｆｃ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ以上のアミノ酸改変を有する）を含み、任意選択で、バリアントＦｃ領域は、３２９、２９８、３３０、３３２、３３３および／または３３４位のいずれか１つ以上における置換（例えば、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａおよび／またはＫ３３４Ａ置換）を含む抗体を包含する。

【0317】

一実施形態において、バリアントまたは野生型Ｆｃ領域を有する抗体は、抗体のＦｃ受容体結合能を増加させる変化されたグリコシル化パターンを有し得る。そのような炭水化物改変は、例えば、変化されたグリコシル化機序を有する宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる。変化したグリコシル化機序を有する細胞は、当分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現し、それにより変化したグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１、ならびに欧州特許第１，１７６，１９５号明細書；ＰＣＴ公開の国際公開第０６／１３３１４８号パンフレット；国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット；国際公開第９９／５４３４２号パンフレット参照、そのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0318】

一般に、変化されたグリコシル化を有するそのような抗体は、抗体が、ある所望の特性、例として、限定されるものではないが、非改変抗体または天然定常領域を有し、ネズミ骨髄腫ＮＳＯおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１，１２：１８０−７）により生産される抗体、本明細書の実施例セクション、または組換え治療抗体を産生するために一般に使用される他の哺乳動物宿主細胞系において産生されるＨＥＫ２９３Ｔ発現抗体と比較して向上されたＡＤＣＣおよびエフェクター細胞受容体結合活性を産生する特定のＮ−グリカン構造を有するように、「糖最適化（ｇｌｙｃｏ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）」されている。

【0319】

哺乳動物細胞系中で産生されるモノクローナル抗体は、それぞれの重鎖のＡｓｎ２９７におけるＮ−結合グリコシル化部位を含有する。抗体上のグリカンは、典型的には、極めて低い分岐Ｎ−アセチルグルコサミン（分岐ＧｌｃＮＡｃ）を有しまたは有さず、高レベルのコアフコシル化を有する複雑な二分岐（ｂｉａｔｅｎｎａｒｙ）構造である。グリカン末端は、極めて低い末端シアル酸を含有しまたは含有せず、変動量のガラクトースを含有する。抗体機能に対するグリコシル化の効果の観点については、例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６−３１（１９９７）参照。多数の研究が、抗体グリカン構造の糖組成の変化がＦｃエフェクター機能を変化させ得ることを示す。抗体活性に寄与する重要な炭水化物構造は、Ｆｃ領域Ｎ−結合オリゴ糖の最内部のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌａｃＮＡｃ）残基へのアルファ−１，６結合を介して結合しているフコース残基であると考えられる（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

【0320】

ＦｃγＲ結合は、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３タイプのＦｃ領域中の保存Ａｓｎ２９７において共有結合しているオリゴ糖の存在を要求する。近年、非フコシル化オリゴ糖構造は、インビトロＡＤＣＣ活性の大幅な増加に関連している。本発明による「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域中の約２９７位において局在しているアミノ酸アスパラギンを意味し；抗体のマイナー配列変異に基づき、Ａｓｎ２９７は、上流または下流（通常、＋３以下のアミノ酸）に局在している一部のアミノ酸でもあり得る。

【0321】

歴史的に、ＣＨＯ細胞中で産生される抗体は、非フコシル化集団の約２〜６％を含有する。ＹＢ２／０（ラット骨髄腫）およびＬｅｃｌ３細胞系（アルファ６−フコシルトランスフェラーゼの基質であるＧＤＰ−フコースまたはＧＤＰ糖中間体の欠損をもたらす欠損ＧＤＰマンノース４，６−デヒドラターゼを有するＣＨＯ系のレクチン変異体は、７８〜９８％の非フコシル化種を有する抗体を産生することが報告されている。他の例において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはノックアウト技術を用いて細胞を遺伝子操作してＦＵＴ８ｍＲＮＡ転写産物レベルを減少させ、または遺伝子発現を完全にノックアウトすることができ、そのような抗体は、最大７０％の非フコシル化グリカンを含有することが報告されている。

【0322】

本発明は、Ａｓｎ２９７における糖鎖によりグリコシル化されているＭＩＣＡに結合する抗体であって、ＦｃγＲＩＩＩへのＦｃ部分を介する増加された結合親和性を示す抗体を含む。本発明の一実施形態において、抗体は、ＦｃｙＲＩＩＩａへの抗体結合および／またはＡＤＣＣを改善するＦｃ領域中の少なくとも１つのアミノ酸変化を含む定常領域を含む。

【0323】

一態様において、本発明の抗体は、それらの定常領域中で低フコシル化されている。そのような抗体は、アミノ酸変化を含み得、またはアミノ酸変化を含み得ないが、そのような低フコシル化を生じさせるための条件下で産生または処理することができる。一態様において、本発明の抗体組成物は、本明細書に記載のキメラ、ヒトまたはヒト化抗体を含み、組成物中の抗体種の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７５、８５、９０、９５％または実質的に全ては、フコースを欠くコア炭水化物構造（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）を含む定常領域を有する。一実施形態において、フコースを有するコア炭水化物構造を含む抗体を有さない抗体組成物が提供される。コア炭水化物は、好ましくは、Ａｓｎ２９７における糖鎖である。

【0324】

一実施形態において、本発明は、本発明の抗体組成物、例えば、ＭＩＣＡに結合し、Ａｓｎ２９７における糖鎖によりグリコシル化されている組成物であって、抗体は、部分的にフコシル化されている組成物を含む。部分的にフコシル化されている抗体は、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースを欠く組成物中の抗ＭＩＣＡ抗体の比率が２０％〜９０％、好ましくは、２０％〜８０％、好ましくは、２０％〜５０％、５５％、６０％、７０％もしくは７５％、３５％〜５０％、５５％、６０％、７０％もしくは７５％、または４５％〜５０％、５５％、６０％、７０％もしくは７５％であることを特徴とする。好ましくは、抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３タイプのものである。

【0325】

糖鎖は、任意の特徴（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造の存在および比率）、例として、ヒト細胞からの抗体の、または齧歯類細胞、ネズミ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）もしくは鳥類細胞中で組換え発現される抗体のＡｓｎ２９７に結合しているＮ−結合グリカンの特徴をさらに示し得る。

【0326】

一実施形態において、抗体は、細胞系がコア炭水化物中のフコースを欠くタンパク質を産生するように、フコシルトランスフェラーゼ酵素を欠いている細胞中で発現させる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠き、その結果、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞系中で発現される抗体はそれらのコア炭水化物上のフコースを欠く。これらの細胞系は、２つの置換ベクターを使用するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中でのＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊により作出された（Ｙａｍａｎｅ ｅｔ ａｌ．による米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号明細書；およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４−２２参照、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。他の例としては、ＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊するためのアンチセンス抑制、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）干渉またはイントロン含有ヘアピンＲＮＡ（ｉｈｐＲＮＡ）干渉の使用が挙げられる。一実施形態において、抗体は、細胞系中で発現される抗体がアルファ１，６結合関連酵素の低減または排除による低フコシル化を示すように、機能的に破壊された、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系中で発現させる。

【0327】

一実施形態において、抗体は、遺伝子操作細胞系中で発現される抗体が抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす分岐ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｍ）改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＨＩ））を発現するように遺伝子操作された細胞系中で発現させる（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．によるＰＣＴ公開の国際公開第９９／５４３４２号パンフレット；およびＵｍａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0328】

別の実施形態において、抗体を発現させ、フコシダーゼ酵素を使用してフコシル残基を開裂させる。例えば、フコシダーゼアルファ−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−５５２３）。他の例において、抗体を産生する細胞系をグリコシル化阻害剤により処理することができ；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．９９：６５２−６６５（２００８）は、非フコシル化オリゴマンノースタイプＮグリカンを有する抗体の産生をもたらすアルファ−マンノシダーゼＩ阻害剤、キフネンシンによるＣＨＯ細胞の処理を記載した。

【0329】

一実施形態において、抗体は、フコシルを抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンに付加するための低い酵素活性を天然で有し、またはその酵素活性を有さない細胞系、例えば、ラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）中で発現させる。細胞系の他の例としては、フコシルをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合させる能力の低減を有し、宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化ももたらすバリアントＣＨＯ細胞系、Ｌｅｄ３細胞が挙げられる（国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ）；およびＳｈｉｅｌｄｓ，ＲＸ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態において、抗体は、鳥類細胞、好ましくは、低フコース含有量を有する抗体を天然に生じさせるＥＢｘ（登録商標）細胞（Ｖｉｖａｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）中で発現させる、例えば、国際公開第２００８／１４２１２４号パンフレット。低フコシル化グリカンは、植物起源の細胞系中で産生することもでき、例えば、国際公開第０７／０８４９２６Ａ２号パンフレット（Ｂｉｏｌｅｘ Ｉｎｃ．）、国際公開第０８／００６５５４号パンフレット（Ｇｒｅｅｎｏｖａｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧＭＢＨ）、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0330】

診断および治療における使用
ある実施形態において、本抗体は、生物学的試料からＭＩＣＡ陽性細胞を精製または同定するために使用する。生物学的試料は、患者から、例えば、診断もしくはエクスビボ治療目的のため、または研究目的のためにそのような細胞源を得るために個体もしくは非ヒト霊長類から得ることができる。

【0331】

ＭＩＣＡ陽性細胞は、多数の標準的方法のいずれかを用いて本抗体を使用して精製または同定することができる。例えば、末梢血細胞を、ＭＩＣＡに特異的な、および任意選択で典型的に細胞上に存在する他の細胞表面分子に対する標識抗体を使用するＦＡＣＳスキャナーを使用して選別することができる。

【0332】

さらに、本発明の抗体は、固体支持体にコンジュゲートまたは共有結合していてよく、患者または他の個体からの生物学的試料、例えば、血液試料または組織生検物からＭＩＣＡ陽性細胞またはＭＩＣＡを発現する任意の細胞を精製または同定するために使用することができる。具体的には、生物学的試料を、試料内の細胞が抗体に結合することを可能とする条件下で抗体と接触させ、次いで細胞を固体支持体結合抗体から溶出させる。

【0333】

ＭＩＣＡ陽性細胞を単離、精製または同定するために使用される方法にかかわらず、そのように実施する能力は、多数の目的のため、例えば、ＭＩＣＡ発現細胞の病原性拡張により特徴づけられる障害を、患者から得られるＭＩＣＡ陽性細胞の数もしくは活性もしくは他の特徴を評価することにより診断するため、または例えば、抗体を使用する本明細書に記載の治療の１つの前に患者の細胞の活性もしくは挙動をモジュレートする本発明の抗体、もしくはその断片もしくは誘導体の能力を評価するために有用である。さらに、精製ＭＩＣＡ陽性細胞は、例えば、細胞ならびにそれらの種々の特性および挙動をより良好に特徴づけ、ならびにそれらの挙動、活性、または増殖をモジュレートするために使用することができる化合物または方法を同定するため、研究関連で有用である。本発明の抗体は、診断方法において、例えば、患者からの細胞、例えば、疾患細胞上のＭＩＣＡポリペプチドを検出する方法においても有用であり得る。

【0334】

本発明は、細胞の表面上のＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する本発明による抗原結合剤（例えば、抗体）を含む医薬組成物も提供する。抗体は、好ましくは、細胞の成長もしくは活性を阻害し、および／またはＭＩＣＡ陽性細胞の排除を、好ましくは、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣの誘導を介してもたらす。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。

【0335】

本発明は、ＭＩＣＡ陽性細胞の成長もしくは活性の阻害、および／またはＭＩＣＡ陽性細胞の枯渇が必要とされる患者中のＭＩＣＡ陽性細胞の成長もしくは活性を阻害し、および／またはＭＩＣＡ陽性細胞を枯渇させる方法であって、前記患者に本発明による組成物を投与するステップを含む方法をさらに提供する。そのような治療方法は、多数の障害、例として、限定されるものではないが、癌の治療に使用することができる。

【0336】

本明細書において実証されるとおり、非遮断抗ＭＩＣＡ抗体は、エフェクター細胞によるＭＩＣＡ発現細胞の溶解の誘導において特に有効である。抗体は、ＭＩＣＡに結合し、それらがエフェクター細胞による溶解を誘導するエフェクター細胞上のＦｃγ受容体の活性化をエンゲージすることにより、それらがＮＫ細胞反応性のＮＫＧ２Ｄ媒介活性化の中和を妨害するＮＫＧ２Ｄシグナリングを遮断しないことにより、またはＮＫＧ２Ｄシグナリングを遮断し、ｓＭＩＣＡ誘導ＮＫＧ２Ｄ下方モジュレーションを低減させることによる二重の作用機構を有する。抗体は、好ましくは、結合するＭＩＣＡ発現細胞（例えば、腫瘍細胞）の枯渇をもたらすヒト重鎖定常領域配列を含み、好ましくは、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣを誘導するＦｃ部分を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。そのような組成物は、本発明の「抗体組成物」とも称される。一実施形態において、本発明の抗体組成物は、上記の抗体実施形態に開示される抗体を含む。

【0337】

一態様において、本発明の治療方法は、個体に、ＭＩＣＡに結合する抗原結合化合物を含む組成物を治療有効量で投与することを含む。治療有効量は、例えば、インビボでのＭＩＣＡ細胞の枯渇の増加、またはＭＩＣＡ発現細胞に対するＮＫＧ２Ｄ＋エフェクター細胞（ＮＫ細胞）の活性化、反応性、細胞毒性および／またはＩＦＮγ−産生の頻度の増加を引き起こすために十分であり得る。

【0338】

本発明の方法は、有利には、癌および他の増殖疾患、例として、限定されるものではないが、癌種、例として、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌および皮膚癌、例として、扁平上皮癌腫；リンパ球系の造血腫瘍、例として、白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫；骨髄細胞系の造血腫瘍、例として、急性および慢性骨髄性白血病、ならびに前骨髄球性白血病；間葉起点の腫瘍、例として、線維肉腫および横紋筋肉腫；他の腫瘍、例として、神経芽細胞腫および神経膠腫；中枢神経系および末梢神経系の腫瘍、例として、星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および神経鞘腫；間葉起点の腫瘍、例として、線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫；ならびに他の腫瘍、例として、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、および奇形癌の治療に利用される。本発明により治療することができる他の例示的障害としては、リンパ球系の造血腫瘍、例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞腫瘍、例として、限定されるものではないが、Ｔ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、例として、小細胞および脳状細胞タイプのもの；好ましくは、Ｔ細胞タイプの大型顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病性リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄＴ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ１＋）大細胞リンパ腫；腸Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球性；およびリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）が挙げられる。

【0339】

一部の実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体または組成物の投与前に、患者の細胞上（例えば、腫瘍細胞）上のＭＩＣＡの存在を評価し、例えば、患者中のＭＩＣＡ陽性細胞の相対レベルおよび活性を測定し、患者の細胞への抗体の結合効力を確認する。次いで、腫瘍細胞がＭＩＣＡを発現する患者を、抗ＭＩＣＡ抗体または組成物により治療することができる。このことは、障害の部位からＰＢＬまたは腫瘍細胞の試料を得、例えば、イムノアッセイを使用して試験してＭＩＣＡおよび任意選択で細胞上のさらなる他のマーカーの相対的優位性を測定することにより達成することができる。他の方法、例えば、ＲＮＡベースの方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノザンブロッティングを使用してＭＩＣＡおよび他の遺伝子の発現を検出することもできる。

【0340】

一実施形態において、患者のＭＩＣＡ陽性細胞の活性もしくは成長を阻害し、またはその細胞を枯渇させることが求められる場合、患者のＭＩＣＡ陽性細胞の増殖を阻害し、またはその細胞を枯渇させる抗ＭＩＣＡ抗体の能力を評価する。ＭＩＣＡ陽性細胞を抗ＭＩＣＡ抗体または組成物により枯渇させる場合、患者を抗ＭＩＣＡ抗体または組成物による治療に応答性であることを決定し、任意選択で、患者を抗ＭＩＣＡ抗体または組成物により治療する。

【0341】

治療は、抗体または化合物投与の複数のラウンドを含み得る。例えば、投与の初回ラウンド後、患者中のＭＩＣＡ発現細胞（例えば、悪性腫瘍細胞について）のレベルおよび／または活性を一般に再計測し、依然として上昇している場合、投与の追加のラウンドを実施することができる。このようにして、ＭＩＣＡ検出および抗体または化合物投与の複数ラウンドを、例えば、障害が管理下になるまで実施することができる。

【0342】

一部の実施形態において、本方法は、前記患者に、免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、またはＭＩＣＡ発現細胞上に存在するポリペプチドに結合する二次抗体（例えば、枯渇抗体）から選択される適切な追加（第２）の治療剤を投与する追加のステップを含み得る。そのような追加の薬剤は、前記患者に、前記抗体と一緒に単一剤形として、または別個の剤形として投与することができる。抗体の投与量（または集合的に抗体および追加の治療剤の投与量）は、患者における治療応答を検出可能に誘導し、促進し、および／または向上させるために十分である。別個に投与する場合、抗体、断片、または誘導体および追加の治療剤は、望ましくは、患者に検出可能な併用治療利益をもたらす（例えば、タイミング、用量数などに関する）条件下で投与する。

【0343】

腫瘍（例えば、固形腫瘍）治療のため、例えば、本発明の組成物の投与は、古典的なアプローチ、例えば、手術、放射線療法、化学療法などとの組合せで使用することができる。したがって、本発明は、本抗体を手術または放射線治療と同時に、その前もしくはその後に使用し；または慣用の化学療法剤、放射線療法剤もしくは抗血管新生剤、もしくは標的化免疫毒素もしくはコアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）とともに、その前もしくはその後に患者に投与する併用療法を提供する。

【0344】

例示的な抗癌抗血管新生剤は、受容体チロシンキナーゼ、例として、限定されるものではないが、ＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体、ＦＧＦ−１，２）、ＰＤＧＦＲ（血小板由来成長因子受容体）、アンギオポエチン受容体（Ａｎｇ−１，２）、ＨＧＦＲ（肝細胞成長因子受容体）、エフリン受容体（Ｅｐｈ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ−２，３ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＣＳＦ−１Ｒ、ＭＥＴ、Ｆｌｔ−３、ｃ−Ｋｉｔ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｐ３８アルファおよびＦＧＦＲ−１によるシグナリングを阻害する。さらなる抗血管新生剤としては、ＶＥＧＦ発現および産生の種々の調節物質、例えば、ＥＧＦＲ、ｆｌｔ−１、ＫＤＲ、ＨＥＲ−２、ＣＯＸ−２、またはＨＩＦ−１αの１つ以上を阻害する薬剤を挙げることができる。別の好ましいクラスの薬剤としては、ＩＭｉＤ（免疫調節薬）、広範な効果、例として、免疫および非免疫関連効果の両方を有するサリドマイドに由来するアナログが挙げられる。ＩＭｉＤクラスの代表例としては、ＣＣ−５０１３（レナリドミド、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（商標））、ＣＣ−４０４７（Ａｃｔｉｍｉｄ（商標））、およびＥＮＭＤ−０９９５が挙げられる。別のクラスの抗血管新生剤としては、シレンギチド（ＥＭＤ１２１９７４、インテグリン阻害剤）、メタロプロテイナーゼ（ＭＰＰ）、例えば、マリナスタット（ｍａｒｉｎａｓｔａｔ）（ＢＢ−２５１）が挙げられる。別のクラスの抗血管新生剤としては、ファルネシル化阻害剤、例えば、ロナファルニブ（Ｓａｒａｓａｒ（商標））、チピファルニブ（Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（商標））が挙げられる。他の抗血管新生剤、例えば、ベバクジマブ（Ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）（ｍＡｂ、阻害ＶＥＧＦ−Ａ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ｍＡｂ、阻害ＶＥＧＦＲ−２、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＣＤＰ−７９１（ペグ化ＤｉＦａｂ、ＶＥＧＦＲ−２、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；２Ｃ３（ｍＡｂ、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＶＥＧＦトラップ（可溶性ハイブリッド受容体ＶＥＧＦ−Ａ、ＰｌＧＦ（胎盤成長因子）Ａｖｅｎｔｉｓ／Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）も、好適であり得る。別の好ましいクラスの薬剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）クラス、例として、例えば、ＰＴＫ−７８７（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、バタラニブ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＡＥＥ７８８（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−２およびＥＧＦＲ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＺＤ６４７４（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、ＥＧＦＲ、Ｚａｃｔｉｍａ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＡＺＤ２１７１（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＳＵ１１２４８（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ＰＤＧＦＲ、スニチニブ、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ１３９２５（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ０１３７３６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＥＰ−７０５５（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、Ｃｅｐｈａｌｏｎ）；ＣＰ−５４７，６３２（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＧＷ７８６０２４（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＧＷ７８６０３４（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ソラフェニブ（ＴＫＩ、Ｂａｙ４３−９００６、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ＰＤＧＦＲ Ｂａｙｅｒ／Ｏｎｙｘ）；ＳＵ４３１２（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＭＧ７０６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、Ａｍｇｅｎ）、ＸＬ６４７（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ４、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＸＬ９９９（ＴＫＩ、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、Ｆｌｔ−３、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＫＣ４１２（ＴＫＩ、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲ、ＰＫＣ、ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ−２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＥＥ７８８（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＯＳＩ−９３０（ＴＫＩ、ｃ−ｋｉｔ、ＶＥＧＦＲ、ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＯＳＩ−８１７（ＴＫＩ、ｃ−ｋｉｔ、ＶＥＧＦＲ、ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＤＭＰＱ（ＴＫＩ、ＥＲＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ｅｒｂＢ２、ｐ５６、ｐｋＡ、ｐｋＣ）、ＭＬＮ５１８（ＴＫＩ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＣＴ５３５１８、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、レスタウリニブ（ｌｅｓｔａｕｒｉｎｉｂ）（ＴＫＩ、ＦＬＴ３、ＣＥＰ−７０１、Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、ＺＤ１８３９（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ、ゲフィチニブ、Ｉｒｅｓｓａ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＯＳＩ−７７４（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ、エルロチニブ、Ｔａｒｃｅｖａ、ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ラパチニブ（ＴＫＩ、ＥｒｂＢ−２、ＥＧＦＲ、ＧＤ−２０１６、Ｔｙｋｅｒｂ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が挙げられる。ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ−α、β、Ｆｌｔ−３、ｃ−Ｋｉｔ、ｐ３８アルファ、ＭＥＴ、ｃ−ＲＡＦ、ｂ−ＲＡＦ、ｂｃｒ／ａｂｌおよびＦＧＦＲ−１からなる群から選択される１つ以上の受容体チロシンキナーゼを阻害するチロシンキナーゼ阻害剤が最も好ましい。

【0345】

一実施形態において、第２の薬剤は、エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）活性化受容体の天然リガンドまたはＮＫＧ２Ｄ以外のＮＫ細胞活性化受容体に結合し、その受容体を活性化させる抗体である。一実施形態において、薬剤は、標的細胞（例えば、感染細胞、腫瘍細胞、炎症促進細胞）の表面上のＮＫＧ２Ｄ以外のＮＫ細胞活性化受容体の天然リガンドの存在を増加させる薬剤である。ＮＫ細胞活性化受容体としては、例えば、天然細胞毒性受容体、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４または活性化ＫＩＲ受容体（ＫＩＲ２ＤＳ受容体、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４）が挙げられる。本明細書において使用される用語「活性化ＮＫ受容体」は、刺激された場合、ＮＫ活性に関連する当分野において公知の任意の特性または活性の計測可能な増加、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生、細胞内遊離カルシウムレベル、例えば、本明細書の他箇所に記載の再指向殺傷アッセイにおいて細胞を標的化する能力、またはＮＫ細胞増殖を刺激する能力の増加を引き起こすＮＫ細胞の表面上の任意の分子を指す。用語「活性化ＮＫ受容体」としては、限定されるものではないが、活性化形態またはＫＩＲタンパク質（例えば、ＫＩＲ２ＤＳタンパク質）、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１８ＲおよびＩＬ−２１Ｒが挙げられる。

【0346】

一実施形態において、抗癌剤は、腫瘍細胞の表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を上方調節する化学療法剤または放射線である。これとしては、周知の化学療法、例として、イオン化およびＵＶ照射、ＤＮＡ複製の阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼの阻害剤、クロマチン改変処理、ならびにアポトーシス誘導剤、例えば、ＨＤＡＣ阻害剤トリコスタチンＡおよびバルプロ酸が挙げられる。好ましい治療は、ＤＮＡ損傷応答経路を活性化させるもの、より好ましくは、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）もしくはＡＴＲ（ＡＴＭ−およびＲａｄ３関連）タンパク質キナーゼ、もしくはＣＨＫ１、またはさらにＣＨＫ２もしくはｐ５３を活性化させるものである。後者の例としては、イオン化放射、ＤＮＡ複製の阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤およびクロマチン改変剤または処理、例として、ＨＤＡＣ阻害剤が挙げられる。ＮＫＧ２Ｄリガンドを上方調節する組成物は、Ｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３６（７０５４）：１１８６−９０にさらに記載されている。ＮＫＧ２Ｄは、数あるリガンドのうち、ＭＨＣクラスＩ関連ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ糖タンパク質と相互作用する活性化受容体である。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ（Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：７２７−７２９、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）は、抗原提示における役割を有さず、一般に、腸管上皮中にのみ見出され、ウイルスおよび細菌感染、悪性形質転換、ならびに増殖により許容タイプの細胞中でストレス誘導され得る。ＮＫＧ２Ｄは、ＣＤ２８と類似する会合ＤＡＰ１０アダプタータンパク質を介してシグナリングするＣ型レクチン様活性化受容体である。それは、ほとんどのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞ＣＤ８Ｔ細胞およびＴ細胞上で発現されるが、一般に、ＣＤ４Ｔ細胞上では発現されない。他のＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、例えば、最初はヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質ＵＬ１６についてのリガンドとして同定されたＵＬＢＰタンパク質、例えば、ＵＬＢＰ−１、−２、および−３が挙げられる（Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：１２３−１３３、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。さらなるＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、ＵＬＢＰ様ファミリーのタンパク質のメンバーであるＲＡＥ１ＴＧが挙げられる（Ｂａｃｏｎ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：１０７８−１０８４）。

【0347】

さらなる抗癌剤としては、アルキル化剤、細胞毒性抗生物質、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、植物誘導体、ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗剤、および抗有糸分裂剤が挙げられる。好ましい例としては、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、または上記の任意のアナログもしくは誘導体バリアントを挙げることができる。

【0348】

アルキル化剤は、高度に化学反応性であり、好適な物質との共有結合を急速に形成する化合物を形成する物質である。１つのそのような標的は、正常状態でなく二重らせんがヘリカーゼによりほどかれている場合のＤＮＡである。これは、アルキル化に感受性であるＤＮＡの「内側」を露出させる。ほとんどのアルキル化剤は、双極性であり、すなわち、それらは、ＤＮＡと反応し得る２つの基を含有する。したがって、それらは、ＤＮＡの一本鎖の２つの部分または２つの別個の鎖間の「架橋」を形成し得；いずれにしても、これは、複製プロセスに関与する酵素の作用を干渉し、それらの効果を完了させ得ない。次いで、細胞は、それが物理的に分裂し得ないため、または異常なＤＮＡがアポトーシスを刺激するために死滅する。例としては、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド）、ニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（例えば、カルムスチン、ロムスチン）、金属塩（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）、エチレンアミン誘導体（例えば、チオテパ）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）およびトリアゼン（例えば、ダカルバジン）が挙げられる。

【0349】

代謝拮抗剤は、核酸の合成に要求される天然代謝産物と構造または機能が類似する化学物質のグループである。代謝拮抗剤分子は、それらの正常代謝産物を模倣し、核酸合成を担う酵素を遮断し、またはＤＮＡ中に取り込まれ、不正確な遺伝コードを産生し、アポトーシスをもたらす。３つの主なクラスの代謝拮抗剤が存在する。ホレートは、プリン分子の合成に必要な物質である。ホレートアナログ（例えば、メトトレキサート、ラルトリトレキセド（ｒａｌｔｒｉｔｒｅｘｅｄ））は、ホレート分子と類似し、メトトレキサートなどの物質を使用して酵素ジヒドロホレートレダクターゼを阻害し、プリンチミンの不十分な産生をもたらすことができる。ピリミジンアナログ（例えば、シタラビン、フルオロアシル（ｆｌｕｏｒｏａｃｉｌ）（５−ＦＵ）、ゲムシタビン）は、ピリミジン分子と似ており、核酸の合成を阻害することにより（例えば、フルオロウラシル）、またはＤＮＡ中に取り込まれることにより（例えば、シタラビン）機能する。プリンアナログ（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、フルダラビン）は、ピリミジンアナログと類似の様式で機能するが、追加の（および負に特徴づけられる）作用機序を有し得る。

【0350】

細胞毒性抗生物質は、それらが全て天然源、細菌のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のグループに由来するため、そう呼ばれる。それらは、異なる様式で核酸の機能および合成に影響する。アントラサイクリングループとしては、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびイダルビシンが挙げられる。それらは、ＤＮＡとインターカレートし、トポイソメラーゼＩＩ酵素に影響する。このＤＮＡギラーゼは、ＤＮＡ二重らせんをほどき、ねじり力が軽減されるとそれを再連結し；アントラサイクリンは、ＤＮＡ−トポイソメラーゼＩＩ複合体を安定化させ、したがって鎖の再連結を妨害する。ダクチノマイシンおよびミトキサントロンは、類似の作用機序を有する。ブレオマイシンは、ＤＮＡ鎖の断片化を引き起こす。マイトマイシンは、アルキル化剤と同様に機能し、ＤＮＡ架橋を引き起こす。

【0351】

植物誘導体としては、微小管の前駆体に結合し、それらの形成を妨害するビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチンが挙げられる。これは、有糸分裂のプロセスを阻害する。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）も、微小管に対して作用する。それらは、微小管をそれらのポリマー化状態で安定化させ、有糸分裂の停止も引き起こす。ポドフィルム属（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｙｕｍ）誘導体、例えば、エトポシドおよびテニポシドはトポイソメラーゼＩＩを阻害する一方、イリノテカンおよびトポテカンはトポイソメラーゼＩを阻害すると考えられる。

【0352】

感染疾患を治療する場合、治療は、本発明による組成物を単独で、またはそのような疾患を治療するために公知の他の治療および／または治療剤、例として、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗生物質、抗寄生虫剤および抗原虫剤との組合せで用い得る。これらの方法が追加の治療剤による追加の治療を含む場合、それらの薬剤は、単一剤形としてまたは別個の複数剤形として本発明の抗体と一緒に投与することができる。別個の剤形として投与する場合、追加の薬剤は、本発明の抗体の投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。

【0353】

本発明の方法および抗体、特にＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の相互作用を遮断し、および／またはＭＩＣＡ誘導ＮＫＧ２Ｄ活性を阻害する非枯渇抗体は、有利には、炎症および自己免疫障害の治療に利用することもできる。本発明のポリペプチド、抗体および他の化合物により治療することができる例示的な自己免疫または炎症病態または障害としては、限定されるものではないが、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、乾癬性関節炎、変形性関節炎、脊椎関節症（強直性脊椎炎）、全身硬化症（強皮症）、特発性炎症筋障害（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、血管炎、全身性血管炎、側頭動脈炎、アテローム性動脈硬化症、サルコイドーシス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症）、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫介在性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫介在性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎、自己免疫性卵巣炎）、自己免疫性精巣炎、自己免疫性ブドウ膜炎、抗リン脂質症候群、中枢および末梢神経系の脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発性神経障害またはギランバレー症候群、ならびに慢性炎症脱髄性多発性神経障害、肝胆汁性疾患、例えば、感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎および他の肝臓指向性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、ウイルス性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、ウェゲナー肉芽腫、ベーチェット病、ならびに硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病、セリアック病、グルテン過敏性腸疾患、ならびにウィップル病、自己免疫性または免疫介在性皮膚疾患、例として、水疱性皮膚疾患、多形成紅斑および接触性皮膚炎、ヘルペス様皮膚炎、乾癬、尋常性天疱瘡、白斑（ロイコデルマ）、アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食品に対する過敏性および蕁麻疹、肺の免疫疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、ならびに移植関連疾患、例として、移植片拒絶および移植片対宿主病が挙げられる。

【0354】

炎症または自己免疫疾患を本発明の抗ＭＩＣＡ抗体により治療する場合、本発明の治療方法は、個体を第２の治療剤、例として、通常、抗体を投与する特定の治療目的に利用される薬剤により治療することをさらに含み得る。第２の治療剤は、通常、治療される特定の疾患または病態のための単剤療法においてその薬剤に典型的に使用される量で投与する。一実施形態において、第２の治療剤は、一般に許容される有効用量未満の用量で投与し；例えば、種々の実施形態において、組成物は、一般に許容される有効用量の約１０％〜７５％未満の投与量を含み、投与する。好ましくは、第２の治療剤は、タンパク質分解酵素、炎症性メディエーター、または炎症促進性サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−αおよび／もしくはインターロイキン−１（ＩＬ−１）を低減させる薬剤である。好ましくは、第２の治療剤は、ＤＭＡＲＤまたはＤＭＤであり、任意選択で、さらに、第２の治療剤は、メトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（商標））、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ（商標））、スルファサラジン（Ａｚｕｌｆｉｄｉｎｅ（登録商標））、レフルノミド（Ａｒａｖａ（商標））、腫瘍壊死因子阻害剤（例えば、可溶性ＴＮＦα受容体、例えば、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、中和（好ましくは、非枯渇）抗ＴＮＦα抗体、例えば、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（商標））またはセルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ（商標））、Ｔ細胞共刺激遮断剤（例えば、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（商標））、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体アンタゴニスト治療剤（アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（商標））、抗ＢｌｙＳ抗体（Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標））、プロテオソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、チロシンキナーゼ阻害剤、筋肉内金剤、または別の免疫調節もしくは細胞毒性剤（例えば、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ（商標）、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ（Ｎｅｏｒａｌ（商標）、Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（商標））またはキナーゼ阻害剤（例えば、ＳＹＫキナーゼ阻害剤、例えば、ホスチマチニブ（ｆｏｓｔｉｍａｔｉｎｉｂ）（Ｒ７８８）またはＪＡＫ１、ＪＡＫ２阻害剤、例えば、ＩＮＣＢ２８０５０、タネズマブまたはタソシチニブ（ＣＰ−６９０，５５０））である。

【0355】

本発明の治療方法において、本発明の抗原結合化合物および第２の治療剤は、別個に、一緒に、もしくは連続的に、またはカクテルで投与することができる。一部の実施形態において、本発明の抗原結合化合物は、第２の治療剤の投与前に投与する。例えば、本発明の抗原結合化合物は、第２の治療剤の投与の約０〜３０日前に投与することができる。一部の実施形態において、本発明の抗原結合化合物は、第２の治療剤の投与の約３０分〜約２週間、約３０分〜約１週間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約６時間、約６時間〜約８時間、約８時間〜１日、または約１〜５日前に投与する。一部の実施形態において、本発明の抗原結合化合物は、治療剤の投与と同時に投与する。一部の実施形態において、本発明の抗原結合化合物は、第２の治療剤の投与後に投与する。例えば、本発明の抗原結合化合物は、第２の治療剤の投与の約０〜３０日後に投与することができる。一部の実施形態において、本発明の抗原結合化合物は、第２の治療剤の投与の約３０分〜約２週間、約３０分〜約１週間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約６時間、約６時間〜約８時間、約８時間〜１日、または約１〜５日後に投与する。

【0356】

本発明の抗原結合化合物は、キットに含めることができる。キットは、任意選択で、任意数の抗体および／または他の化合物、例えば、１、２、３、４、または他の任意数の抗ＭＩＣＡ抗体および／または他の化合物をさらに含有し得る。キットの内容物についての本説明が決して限定されるものではないことが理解される。例えば、キットは、他のタイプの治療または診断剤を含有し得る。好ましくは、キットは、例えば本明細書に記載の方法を詳述する、抗体および／または薬剤を使用するための説明書も含む。

【0357】

医薬配合物
これらの組成物中で使用することができる薬学的に許容可能な担体としては、限定されるものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝液物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。本発明の抗体は、患者におけるＭＩＣＡ発現細胞の活性をモジュレートする、例えば、阻害する方法において用いることができる。この方法は、前記組成物を前記患者と接触させるステップを含む。そのような方法は、予防および治療目的の両方において有用である。

【0358】

患者への投与における使用のため、組成物は、患者への投与のために配合する。本発明の組成物は、経口投与、非経口投与、吸入スプレー投与、局所投与、直腸投与、経鼻投与、バッカル投与、経膣投与または移植されたリザーバーを介して投与することができる。本明細書において使用されるものとしては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術が挙げられる。抗体は、例えば、約２５ｍｇ〜５００ｍｇの量の単一用量で存在し得る。

【0359】

本発明の組成物の無菌の注射可能な形態は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、好適な分散剤または浸潤剤および懸濁化剤を使用する当分野において公知の技術に従って配合することができる。無菌の注射可能な調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール中溶液としての、非経口的に許容可能な非毒性の希釈剤または溶媒中の、無菌の注射可能な溶液または懸濁液でもあり得る。用いることができる許容可能なビヒクルおよび溶媒のうち、水、リンガー液および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、無菌固定油は、慣用的に溶媒または懸濁培地として用いられる。この目的のため、任意の無刺激性固定油、例として、合成モノもしくはジグリセリドを用いることもできる。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、薬学的に許容可能な天然油、例えば、特にポリオキシエチル化型のオリーブ油またはヒマシ油の場合と同様、注射剤の調製において有用である。これらの油性溶液または懸濁液は、薬学的に許容可能な剤形、例として、エマルジョンおよび懸濁液の配合において一般に使用される長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えばカルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤も含有し得る。他の一般に使用される界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび薬学的に許容可能な固体、液体、または他の剤形の製造において一般に使用される他の乳化剤またはバイオアベイラビリティー向上剤を配合の目的に使用することもできる。

【0360】

本発明の組成物は、任意の経口的に許容可能な剤形、例として、限定されるものではないが、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または液剤で経口投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。典型的には、潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムも添加される。カプセル剤形態での経口投与のため、有用な希釈剤としては、例えばラクトースが挙げられる。経口使用に水性懸濁液が要求される場合、活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と合わせる。所望により、ある甘味剤、香味剤または着色剤を添加することもできる。

【0361】

あるいは、本発明の組成物は、直腸投与のために坐剤の形態で投与することができる。これらは、薬剤を、室温において固体であるが直腸温度において液体であり、したがって直腸中で融解し、薬剤を放出する好適な非刺激性賦形剤と混合することにより調製することができる。そのような材料としては、ココアバター、蜜ろうおよびポリエチレングリコールが挙げられる。

【0362】

本発明の組成物は、治療の標的が、特に、局所適用により容易に接近可能である領域または器官、例として、眼、皮膚、または下部腸管の疾患を含む場合、局所投与することもできる。好適な局所配合物は、これらの領域または器官のそれぞれについて容易に調製される。局所適用のため、組成物は、１つ以上の担体中で懸濁または溶解された活性成分を含有する好適な軟膏剤に配合することができる。本発明の化合物の局所投与のための担体としては、限定されるものではないが、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水が挙げられる。あるいは、組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体中で懸濁または溶解された活性成分を含有する好適なローション剤またはクリーム剤に配合することができる。好適な担体としては、限定されるものではないが、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられる。

【0363】

本抗体は、キット中に含めることができる。キットは、任意選択で、任意数の抗体および／または他の化合物、例えば、１、２、３、４、または他の任意数の治療抗体および／または化合物をさらに含有し得る。キットの内容物についての本説明が決して限定されるものではないことが理解される。例えば、キットは、他のタイプの治療化合物を含有し得る。好ましくは、キットは、例えば本明細書に記載の方法を詳述する抗体を使用するための説明書も含む。

【0364】

剤形
本発明により使用されるアンタゴニストの治療配合物は、所望の純度を有するアンタゴニストを、任意選択の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤と混合することにより、凍結乾燥配合物または水溶液の形態で貯蔵のために調製する。配合に関する一般的な情報については、例えば、Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８^ｔｈ Ｅｄ．（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）；Ａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３）；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）；およびＷａｌｔｅｒｓ（ｅｄ．），Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｖｏｌ １１９（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００２）参照。

【0365】

許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに非毒性であり、それらとしては、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；酸化防止剤、例として、アスコルビン酸およびメチオニン；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；単糖、二糖、および他の炭水化物、例として、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。

【0366】

例示的抗体配合物は、例えば、国際公開第１９９８／５６４１８号パンフレットに記載されており、それは、４０ｍｇ／ｍＬのリツキシマブ、２５ｍＭの酢酸塩、１５０ｍＭのトレハロース、０．９％のベンジルアルコール、および０．０２％のｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０（商標）をｐＨ５．０において含み、２〜８℃における２年間の貯蔵の最小の保存可能期間を有する抗ＣＤ２０抗体のための液体複数回用量配合物を記載する。別の関心対象の抗ＣＤ２０配合物は、１０ｍｇ／ｍＬのリツキシマブを９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬのｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０（商標）、および注射滅菌水、ｐＨ６．５中で含む。

【0367】

皮下投与に適合された凍結乾燥配合物は、例えば、米国特許第６，２６７，９５８号明細書（Ａｎｄｙａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。そのような凍結乾燥配合物は、好適な希釈液により高タンパク質濃度に再構成することができ、再構成された配合物は本明細書において治療することができる哺乳動物に皮下投与することができる。

【0368】

本明細書の配合物は、２つ以上の活性化合物（上記の第２の医薬）、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有し得る。そのような医薬のタイプおよび有効量は、例えば、配合物中に存在するＢ細胞アンタゴニストの量およびタイプ、ならびに対象の臨床パラメーターに依存する。好ましいそのような第２の医薬は、上記のとおりである。

【0369】

活性成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中で、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタアシレート）マイクロカプセル中で封入することもできる。そのような技術は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前掲に開示されている。

【0370】

徐放性配合物を調製することができる。好適な徐放性調製物の例としては、アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透明マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、形成品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフィア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が挙げられる。

【0371】

インビボ投与に使用することができる配合物は、無菌でなくてはならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。これらの組成物中で使用することができる薬学的に許容可能な担体としては、限定されるものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝液物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。

【0372】

本発明のさらなる態様および利点を以下の実験セクションに開示し、それは、説明としてみなすべきであり、本出願の範囲を限定するものとみなすべきではない。

【実施例】

【0373】

実施例１：抗ＭＩＣＡ抗体の生成
免疫化＃１
抗ヒトＭＩＣＡ抗体を得るため、Ｂａｌｂ／ｃマウスを組換えヒトＭＩＣＡ細胞外ドメイン組換えＦｃタンパク質（ＭＩＣＡ^＊０１９アレル、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手）により免疫化した。マウスは、５０μｇのＭＩＣＡタンパク質および完全フロイントアジュバントのエマルジョンによる１回の一次免疫化を腹腔内で、５０μｇのＭＩＣＡタンパク質および不完全フロイントアジュバントのエマルジョンによる二次免疫化を腹腔内で、ならびに最後に１０μｇのＭＩＣＡタンパク質によるブーストを静脈内で受けた。免疫脾細胞を、ブーストの３日後にＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合させ、放射線照射された脾細胞の存在下で培養した。

【0374】

一次スクリーン：成長クローンの上清（ＳＮ）を、ＭＩＣＡ^＊０１９構築物が形質移入されたＢａｆ／３細胞系を使用するフローサイトメトリーによる一次スクリーンにおいて試験した。陽性上清を選択し、非形質移入Ｂａｆ／３細胞系へのフローサイトメトリーによる結合の欠如について試験した。手短に述べると、ＦＡＣＳスクリーニングのため、上清中の反応抗体の存在を、ＰＥにより標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）により明らかにした。

【0375】

二次スクリーン：クローンの上清をさらにＥＬＩＳＡアッセイを使用して試験してＭＩＣＡ細胞外ドメイン組換えＦｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン組換えＦｃタンパク質との間の相互作用を遮断する能力を評価した。初期スクリーニングから選択された潜在的に関心対象のハイブリドーマを、９６ウェルプレート中で限定希釈技術によりクローニングした。得られた抗体上清ＩｇＧ２ｂアイソタイプの９Ｃ１０ならびにＩｇＧ１アイソタイプの６Ｅ４、２０Ｃ６および１９Ｅ９を得た。

【0376】

免疫化＃２
抗ヒトＭＩＣＡ抗体を得るため、Ｂａｌｂ／ｃマウスを組換えヒトＭＩＣＡ細胞外ドメイン組換え−Ｈｉｓタンパク質（ＭＩＣＡ^＊００１アレル）により免疫化した。マウスは、５０μｇのＭＩＣＡタンパク質および完全フロイントアジュバントのエマルジョンによる１回の一次免疫化を腹腔内で、５０μｇのＭＩＣＡタンパク質および不完全フロイントアジュバントのエマルジョンによる二次免疫化を腹腔内で、ならびに１０μｇのＭＩＣＡタンパク質による１回のブーストを静脈内で受けた。免疫脾細胞を、Ｘ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合させ、放射線照射された脾細胞の存在下で培養した。

【0377】

一次スクリーン：成長クローンの上清（ＳＮ）を、異なるＣ１Ｒベース細胞系の細胞の混合物を使用するフローサイトメトリーによる一次スクリーンにおいて試験し、それぞれの細胞系に異なる構築物（ＭＩＣＡ^＊００１、ＭＩＣＡ^＊００４、ＭＩＣＡ^＊００７またはＭＩＣＡ^＊００８のいずれか）を形質移入した。手短に述べると、ＦＡＣＳスクリーニングのため、上清中の反応抗体の存在を、ＰＥにより標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）により明らかにした。

【0378】

二次スクリーン：クローンの上清をさらにＥＬＩＳＡアッセイを使用して試験し、組換えヒトＭＩＣＡ完全細胞外ドメイン組換え−Ｈｉｓタンパク質（ＭＩＣＡ^＊００１アレル）に結合せずにＭＩＣＡ細胞外ドメインα３組換えタンパク質に結合する能力を評価した。初期スクリーニングから選択された潜在的に関心対象のハイブリドーマを、９６ウェルプレート中で限定希釈技術によりクローニングした。

【0379】

ＩｇＧ２ａアイソタイプのクローン１６Ａ８を含むＭＩＣＡ細胞外ドメインα３抗体を得た。

【0380】

免疫化＃３
抗ヒトＭＩＣＡ抗体を得るため、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＭＩＣＡ^＊０１、ＭＩＣＡ^＊０４、ＭＩＣＡ^＊０７またはＭＩＣＡ^＊０８が形質移入された１０００万個のＣ１Ｒ細胞の１：１：１：１の比（２５０万個のそれぞれの形質移入細胞）におけるミックスにより免疫化した。マウスは、合計１０００万個の形質移入細胞および完全フロイントアジュバントによる１回の一次免疫化を腹腔内で、１０００万個の形質移入細胞（２５０万個のそれぞれの形質移入細胞）および不完全フロイントアジュバントによる二次免疫化を腹腔内で、ならびに最後に１００万個の形質移入細胞（２５万個のそれぞれの形質移入細胞）による１回のブーストを静脈内で受けた。免疫脾細胞をＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合させ、放射線照射された脾細胞の存在下で培養した。

【0381】

一次スクリーン：成長クローンの上清（ＳＮ）を、異なるＣ１Ｒベース細胞系およびＢａｆ／３細胞系の細胞の混合物を使用するフローサイトメトリーによる一次スクリーンにおいて試験し、それぞれの細胞系に異なる構築物（Ｃ１ＲについてＭＩＣＡ^＊００１、ＭＩＣＡ^＊００４、ＭＩＣＡ^＊００７またはＭＩＣＡ^＊００８のいずれかおよびＢａｆ／３についてＭＩＣＡ^＊０１９）を形質移入した。手短に述べると、ＦＡＣＳスクリーニングのため、上清中の反応抗体の存在を、ＰＥにより標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）により明らかにした。

【0382】

二次スクリーン：クローンの上清をさらにＥＬＩＳＡアッセイを使用して試験し、組換えヒトＭＩＣＡ完全細胞外ドメイン組換え−Ｆｃタンパク質（ＭＩＣＡ^＊０１９アレル）に結合せずにＭＩＣＡ細胞外ドメインα３組換えタンパク質に結合する能力を評価した。初期スクリーニングから選択された潜在的に関心対象のハイブリドーマを、９６ウェルプレート中で限定希釈技術によりクローニングした。

【0383】

得られた抗体上清ＩｇＧ１アイソタイプの１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３および１５Ｆ９ならびにＩｇＭアイソタイプの１４Ｂ４を得た。

【0384】

続いて、抗体９Ｃ１０、１９Ｅ９、６Ｅ４、２０Ｃ６、１６Ａ８、１２Ａ１０、１０Ａ７、１８Ｅ８、１０Ｆ３、１５Ｆ９および１４Ｂ４をヒトＩｇＧ１アイソタイプにキメラ化した（それぞれ、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１２Ａ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ａ７、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１８Ｅ８、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ｆ３、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１５Ｆ９およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１４Ｂ４とも称する）。

【0385】

実施例２ − 固定化ＭＩＣＡタンパク質への結合
組換えヒトＭＩＣＡ細胞外ドメイン組換えタンパク質モノマーまたはダイマー（ＭＩＣＡ^＊０１９アレル−Ｆｃタンパク質またはＭＩＣＡ^＊００１−Ｈｉｓタンパク質）のいずれか、ならびに他のＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣＢおよびＵＬＢＰ１〜２への６Ｅ４、２０Ｃ６および１６Ａ８の結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析して一価および二価親和性をそれぞれ得た。

【0386】

タンパク質固定化のため、組換えタンパク質：ＭＩＣＡ−Ｆｃ ＭＩＣＢ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５９９−ＭＢ、アクセッション番号ＣＡＩ１８７４７、配列番号６）、ＵＬＢＰ１−Ｆｃ、ＵＬＢＰ２−Ｆｃを、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（チップ）上のデキストラン層中のカルボキシル基に共有結合により固定化した。チップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））により活性化させた。タンパク質をカップリング緩衝液（１０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．６）中で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（すなわち、結合試験について１０００〜１６００ＲＵ）に達するまで注入した。残留する活性化基の不活化は、１００ｍＭのエタノールアミンｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。

【0387】

抗体結合分析は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（中性ｐＨ）を使用して実行した。抗ＭＩＣＡ抗体（ランニング緩衝液中で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈）を、固定化組換え標的タンパク質を含有するデキストラン層上で１０μｌ／分の一定流速において２分間注入し、２分間解離させてから１０ｍＭのＮａＯＨ、５００ｍＭのＮａＣｌ再生緩衝液の４０μｌ／分の流速における１０秒間の注入により再生させた。

【0388】

二価親和性計測のため、ＭＩＣＡ−Ｈｉｓタンパク質を、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）が事前に固定化されたカルボキシメチル化デキストラン）上でＮｉ^２＋／ＮＴＡキレート化を介して固定化した。抗ＭＩＣＡ抗体をランニング緩衝液ＨＢＳ−Ｐ中で濃度系列（０．０１〜１００ｎＭ）に希釈し、固定化抗原上に注入した。

【0389】

それぞれのサイクルは、３つのステップからなるものであった。最初に、ＮＴＡチップをＮｉＳＯ_４（５００ｍＭ）により活性化させた。第２に、ＭＩＣＡ−Ｈｉｓタンパク質（ランニング緩衝液ＨＢＳ−Ｐ中で１０μｇ／ｍｌに希釈）を、１０μＬ／分の一定流速における２分間の注入を介して表面上に固定化した。次いで、抗体を固定化抗原上に４０μｌ／分の流速において２分間注入した。続いて、ランニング緩衝液を抗体解離分析のために４０μｌ／分において５分間注入した。それぞれのサイクル後、表面を０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．３の６０秒間の注入により再生させて表面から残留抗原および抗体を完全に剥離させた。得られたセンサーグラムを適切なモデルを使用するグローバルフィッティングにより分析した。

【0390】

一価親和性計測のため、キメラ抗ＭＩＣＡ抗体をプロテインＧチップ上に捕捉させた。

【0391】

親和性は、シングルサイクルカイネティクス（ＳＣＫ）を使用して測定した。ＳＣＫサイクルは、以下のとおりであった：昇順でのＭＩＣＡ−ＨｉｓまたはＭＩＣＡ−ＢｉｒＡの５つの系列希釈物（０．０１〜１００ｎＭ）の（または分析の間に減算すべきブランク注入のための緩衝液の）３０μｌ／分における連続１２０秒間の注入。最後の濃度を注入した後、複合体を６００秒間解離させてから適切な再生緩衝液の４０μｌ／分における１０秒間の注入により再生させる。再生後、チップをランニング緩衝液中で６０秒間安定化させておく。曲線を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用してフィッティングする。

【0392】

ビオチン−コンジュゲートマウス抗体６Ｅ４（ＭＩＣＡ^＊００１−Ｈｉｓに対する）についてのＭＩＣＡ結合についてのｐＨ７．４における二価平均Ｋ_Ｄ（Ｍ）は３．０９９^−１１Ｍ）であった一方、一価親和性は２．０^＊１０^−９Ｍであった。ビオチン−コンジュゲートマウス抗体２０Ｃ６（ＭＩＣＡ^＊００１−Ｈｉｓに対する）についてのｐＨ７．４における二価平均Ｋ_Ｄ（Ｍ）は３．３^＊１０^−１０Ｍであった一方、一価親和性は６．５^＊１０^−９Ｍであった。

【0393】

ビオチン−コンジュゲートマウス抗体９Ｃ１０（ＭＩＣＡ^＊００１−Ｈｉｓに対する）についてのＭＩＣＡ結合についてのｐＨ７．４における二価平均Ｋ_Ｄ（Ｍ）は、６．２^＊１０^−１３Ｍであった。ビオチン−コンジュゲートマウス抗体１９Ｅ９（ＭＩＣＡ^＊００１−Ｈｉｓに対する）についてのＭＩＣＡ結合についてのｐＨ７．４における二価平均Ｋ_Ｄ（Ｍ）は３．２^＊１０^−１３Ｍであった一方、一価親和性は７．８^＊１０^−１０Ｍであった。

【0394】

ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９抗体についてのＭＩＣＡ−ＢｉｒＡに対するｐＨ７．４における一価親和性（平均ＫＤ）は、６．５^＊１０^−９Ｍ（ｎ＝３）であった。

【0395】

ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６抗体についてのＭＩＣＡ−ＢｉｒＡに対するｐＨ７．４における一価親和性（平均ＫＤ）は、４^＊１０^−８Ｍ（ｎ＝３）であった。

【0396】

ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４抗体についてのＭＩＣＡ−ＢｉｒＡに対するｐＨ７．４における一価親和性（平均ＫＤ）は、８．９^＊１０^−９Ｍ（ｎ＝４）であった。

【0397】

ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ２−１６Ａ８抗体についてのＭＩＣＡ−ＢｉｒＡに対するｐＨ７．４における一価親和性（平均ＫＤ）は、１．１５^＊１０^−８Ｍ（ｎ＝４）であった。

【0398】

ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１５Ｆ９抗体についてのＭＩＣＡ−ＢｉｒＡに対するｐＨ７．４における一価親和性（平均ＫＤ）は、６．１^＊１０^−８Ｍ（ｎ＝１）であった。

【0399】

ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１２Ａ１０抗体についてのＭＩＣＡ−ＢｉｒＡに対するｐＨ７．４における一価親和性（平均ＫＤ）は、５．３^＊１０^−８Ｍ（ｎ＝１）であった。

【0400】

ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１８Ｅ８抗体についてのＭＩＣＡ−ＢｉｒＡに対するｐＨ７．４における一価親和性（平均ＫＤ）は、５．４^＊１０^−８Ｍ（ｎ＝１）であった。

【0401】

ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ｆ３抗体についてのＭＩＣＡ−ＢｉｒＡに対するｐＨ７．４における一価親和性（平均ＫＤ）は、８．３^＊１０^−９Ｍ（ｎ＝１）であった。

【0402】

実施例３ − ＭＩＣＡアレルへの結合
第１、第２および第３の免疫化系列から得られた抗体（ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１２Ａ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ａ７、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１８Ｅ８、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ｆ３、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１５Ｆ９およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１４Ｂ４を含む）の結合を、Ｓａｌｉｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０２（４）：１３８９−９１３９６に記載されているＭＩＣＡ発現ＣＲ１形質移入細胞Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００１、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００４、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００７およびＣ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００８（Ｐｒ．Ａ．Ｓｔｅｉｎｌｅ，Ｅｂｅｒｈａｒｄ−Ｋａｒｌｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）への結合について試験した。結合は、フローサイトメトリーにより分析した。

【0403】

フローサイトメトリー。細胞を回収し、ＰＢＳ１×／ＢＳＡ０，２％／ＥＤＴＡ２ｍＭの緩衝液中である用量範囲の抗ＭＩＣＡｍＡｂを使用して４℃において３０分の間染色した。染色緩衝液中での２回の洗浄後、細胞をマウス抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥモノクローナル抗体（１／１１）により４℃において３０分間染色した。２回の洗浄後、染色をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ上で得、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

【0404】

結果。抗体ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１２Ａ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ａ７、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１８Ｅ８、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ｆ３，およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１５Ｆ９は、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００１、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００４、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００７およびＣ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００８細胞のそれぞれに結合した（抗体ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１２Ａ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ｆ３については図１Ａを、抗体ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１８Ｅ８，ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１５Ｆ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ａ７については図１Ｂ参照）。しかしながら、試験された他の抗体は、アレル特異的であり、ＭＩＣＡ^＊００１、^＊００４、^＊００７および^＊００８の全てを認識しなかった。試験ＭＩＣＡアレルの全てを認識しない抗体の例として、２つの抗アルファ３ドメイン抗体ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１４Ｂ４を図１Ｂに示す。ＥＣ５０値を表Ｃにμｇ／ｍｌ（４パラメーターロジスティックフィットを使用して計算）で示す。

【0405】

【表8】

【0406】

実施例４ − エピトープマッピング
抗体を、種々のＭＩＣＡ^＊００１変異体への結合についてさらに試験した。ＭＩＣＡ変異体を、ＰＣＲにより生成した（以下の表Ｄ参照）。全てのＭｘ−Ｒプライマーを、以下の５’プライマーＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＣＣＧＧＴＣＴＴＣ（配列番号１３５）とともに使用した。全てのＭｘ−Ｆプライマーを、以下の３’プライマーＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＡＧＧＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＡＧＣ（配列番号１３６）とともに使用した。増幅された配列をアガロースゲル上で流し、次いでＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（参照番号７４０６０９）を使用して精製した。変異体３を作出するため、第３のＰＣＲを行うことが必要であった。これらのＰＣＲに使用されるプライマーは、Ｍ３ａ−Ｆプライマー（５’−ＡＣＧＧＴＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＧＴＣＡＧ−３’）（配列番号１３７）とＭ３ｂ−Ｒプライマー（５’−ＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＴＧＡＴＡＴＧＡＧＣＣＡＧＧＧＴＣ−３’）（配列番号１３８）であった。次いで、それぞれの変異体について生成された２または３つのＰＣＲ産物を、ＣｌｏｎＴｅｃｈ ＩｎＦｕｓｉｏｎシステム（参照番号６３９６４４）を用いて製造業者の説明書に従って制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸＢａＩにより消化されたＳＥＬＥＸＩＳｐＳＵＲＥｔｅｃｈ１９２（ＨＹＧＲＯ）ベクター中にライゲートした。

【0407】

配列決定後、変異配列を含有するベクターを、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（参照番号Ａ１２２２）を使用してミニプレップとして調製した。次いで、ベクターを、ＯＺ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳのＨＹＰＥ−５（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（参照番号ＨＹＲ１０００３）を製造業者の説明書に従って使用してＣＨＯＫ１ＳＶ細胞形質移入に使用した。形質移入は、３００ｎｇのＤＮＡを１：８のＨＹＰＥ−５：ＤＮＡの比において使用して実施した。

【0408】

【表9】

【0409】

【表10】

【0410】

【表11】

【0411】

【表12】

【0412】

【表13】

【0413】

【表14】

【0414】

抗体は、非変異野生型ＭＩＣＡへの結合のいかなる損失も示さなかったが、１つ以上の変異体への結合を損失し、それにより、いくつかのエピトープを同定した。

【0415】

抗体６Ｅ４は、Ｑ４８Ａ、Ｗ４９Ｓ、Ｅ５１Ｓ、Ｄ５２Ａ、Ｖ５３ＳおよびＬ５４Ａ置換を有する変異体１０および１１への結合の損失を有したが、他のいかなる変異体への結合も損失しなかった。したがって、６Ｅ４の主要エピトープは、残基Ｑ４８およびＷ４９の１つ以上、ならびに／または残基Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ５３およびＬ５４の１つ以上を含む。これらの残基は、ＭＩＣＡのα１ドメイン内に存在する（エピトープは、α２またはα３ドメイン内の残基をさらに含み得る）。

【0416】

図２Ａは、暗陰影において抗体による結合の損失を（異なる組合せで）もたらした変異アミノ酸残基を含むＭＩＣＡポリペプチドの図を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合部位を中位陰影において（およびＭＩＣＡに結合しているリボンダイアグラムにおいても）ＭＩＣＡポリペプチドの頂部において示す。６Ｅ４は、ＮＫＧ２Ｄ結合表面から離れたＭＩＣＡの側面におけるα１ドメインに結合することを確認することができ、このことは、６Ｅ４がＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄ相互作用を遮断しない知見と一致する。

【0417】

抗体９Ｃ１０および１２Ａ１０は、Ｎ５６Ａ、Ｋ５７Ｓ、Ｔ５８Ａ、Ｒ６１ＡおよびＲ６４Ａ置換を有する変異体１２および１３への結合の損失を有したが、他のいかなる変異体への結合も損失しなかった。したがって、９Ｃ１０および１２Ａ１０の主要エピトープは、残基Ｎ５６およびＫ５７の１つ以上、ならびに／または残基Ｔ５８、Ｒ６１、およびＲ６４の１つ以上を含む。これらの残基は、ＭＩＣＡのα１ドメイン内に存在する（エピトープは、α２またはα３ドメイン内の残基をさらに含み得る）。

【0418】

図２Ｂは、暗陰影において９Ｃ１０および１２Ａ１０による結合の損失を（異なる組合せで）もたらした変異アミノ酸残基を含むＭＩＣＡポリペプチドの図を示す。９Ｃ１０および１２Ａ１０は、考えられる部分的重複を有するＮＫＧ２Ｄ結合表面近傍のＭＩＣＡの側面におけるα１ドメインに結合することを確認することができ、このことは、９Ｃ１０および１２Ａ１０がＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄ相互作用を遮断する知見と一致する。

【0419】

抗体２０Ｃ６は、Ｋ８１Ａ Ｄ８２Ａ Ｑ８３Ａ Ｋ８４Ａ Ｈ１０９Ａ Ｙ１１１Ａ Ｄ１１３Ａ Ｌ１１６Ａ Ｓ１３３Ａ Ｒ１３４Ｓ Ｔ１３７Ａ Ｍ１４０Ｓ Ｎ１４１Ａ Ｒ１４３Ｓ Ｎ１４４Ａ置換を有する変異体１６、１７、２１、６０、２７および２８のそれぞれへの結合の損失を有したが、他のいかなる変異体への結合も損失しなかった。したがって、２０Ｃ６の主要エピトープは、残基Ｋ８１およびＤ８２の１つ以上、残基Ｑ８３およびＫ８４の１つ以上、残基Ｈ１０９、Ｙ１１１およびＬ１１６の１つ以上、残基Ｄ１１３、残基Ｓ１３３、Ｒ１３４およびＴ１３７の１つ以上、ならびに／または残基Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４の１つ以上を含む。これらの残基は、ＭＩＣＡのα１およびα２ドメイン内に存在する（エピトープは、α３ドメイン内の残基をさらに含み得る）。

【0420】

抗体１０Ａ７は、２０Ｃ６とのエピトープの部分的重複を有した。１０Ａ７は、Ｋ８１Ａ、Ｄ８２Ａ、Ｑ８３Ａ、Ｋ８４Ａ、Ｈ１０９Ａ、Ｙ１１１Ａ、Ｄ１１３Ａ、Ｌ１１６Ａ、Ｑ１３１Ａ、Ｓ１３２Ａ、Ｑ１３６Ｓ、Ｍ１４０Ｓ、Ｎ１４１Ａ、Ｒ１４３ＳおよびＮ１４４Ａ置換を有する変異体１６、１７、２１、６０、２６および２８のそれぞれへの結合の損失を有したが、他のいかなる変異体への結合も損失しなかった。したがって、１０Ａ７の主要エピトープは、残基Ｋ８１およびＤ８２の１つ以上、残基Ｑ８３およびＫ８４の１つ以上、残基Ｈ１０９、Ｙ１１１および（ａｂｄ）Ｌ１１６の１つ以上、残基Ｄ１１３、残基Ｑ１３１、Ｓ１３２およびＱ１３６の１つ以上、ならびに／または残基Ｍ１４０、Ｎ１４１、Ｒ１４３およびＮ１４４の１つ以上を含む。これらの残基は、ＭＩＣＡのα１およびα２ドメイン内に存在する（エピトープは、α３ドメイン内の残基をさらに含み得る）。

【0421】

図２Ｃは、暗陰影において２０Ｃ６による結合の損失を（異なる組合せで）もたらした変異アミノ酸残基を含むＭＩＣＡポリペプチドの図を示す。図２Ｄは、暗陰影において１０Ａ７による結合の損失を（異なる組合せで）もたらした変異アミノ酸残基を含むＭＩＣＡポリペプチドの図を示す。２０Ｃ６および１０Ａ７は、考えられる部分的重複を有するＮＫＧ２Ｄ結合表面近傍のＭＩＣＡの側面におけるα１およびα２ドメインに結合することを確認することができる。このことは、２０Ｃ６がＭＩＣＡ ＮＫＧ２Ｄ相互作用を遮断する知見と一致する。

【0422】

抗体１９Ｅ９、１８Ｅ８および１０Ｆ３は、Ｅ１００Ａ、Ｄ１０１Ｓ、Ｎ１０２Ａ、Ｓ１０３Ａ、Ｔ１０４Ｓ、Ｒ１０５Ａ、Ｎ１２１Ａ、Ｅ１２３Ｓ、Ｔ１２４ＡおよびＥ１２６Ａ置換を有する変異体１９、２０、２３および２４への結合を損失したが、他のいかなる変異体への結合も損失しなかった。したがって、１９Ｅ９、１８Ｅ８および１０Ｆ３の主要エピトープは、残基Ｅ１００、Ｄ１０１およびＮ１０２の１つ以上、残基Ｓ１０３、Ｔ１０４、およびＲ１０５の１つ以上、残基Ｎ１２１、およびＥ１２３の１つ以上、ならびに／または残基Ｔ１２４およびＥ１２６の１つ以上を含む。これらの残基は、ＭＩＣＡのα２ドメイン内に存在する（エピトープは、α１またはα３ドメイン内の残基をさらに含み得る）。

【0423】

図２Ｅは、暗陰影において１９Ｅ９、１８Ｅ８および１０Ｆ３による結合の損失を（異なる組合せで）もたらした変異アミノ酸残基を含むＭＩＣＡポリペプチドの図を示す。１９Ｅ９、１８Ｅ８および１０Ｆ３は、ＮＫＧ２Ｄ結合表面近傍のＭＩＣＡの側面におけるα２ドメインに結合することを確認することができ、このことは、１９Ｅ９、１８Ｅ８および１０Ｆ３がＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄ相互作用を遮断する知見と一致する。

【0424】

抗体１５Ｆ９は、Ｒ６Ａ、Ｎ８Ａ、Ｅ９７Ａ、Ｈ９９Ａ、Ｅ１００Ａ、Ｄ１０１Ｓ、Ｎ１０２Ａ、Ｓ１０３Ａ、Ｔ１０４Ｓ、Ｒ１０５Ａ、Ｅ１１５Ａ、Ｌ１７８Ａ、Ｒ１７９ＳおよびＲ１８０Ａ置換を有する変異体１、１８、１９、２０、６１および３６への結合を損失したが、他のいかなる変異体への結合も損失しなかった。したがって、１５Ｆ９の主要エピトープは、残基Ｒ６およびＮ８の１つ以上、残基Ｅ９７およびＨ９９の１つ以上、残基Ｅ１００、Ｄ１０１およびＮ１０２の１つ以上、残基Ｓ１０３、Ｔ１０４およびＲ１０５の１つ以上、残基Ｅ１１５、ならびに／または残基Ｌ１７８、Ｒ１７９およびＲ１８０の１つ以上を含む。これらの残基は、ＭＩＣＡのα２ドメイン内に存在する（エピトープは、α１またはα３ドメイン内の残基をさらに含み得る）。

【0425】

図２Ｆは、暗陰影において１５Ｆ９による結合の損失を（異なる組合せで）もたらした変異アミノ酸残基を含むＭＩＣＡポリペプチドの図を示す。１５Ｆ９は、ＮＫＧ２Ｄ結合表面下方のＭＩＣＡの側面におけるα２ドメインに結合することを確認することができる。１５Ｆ９は、ｓＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄ相互作用を遮断する。

【0426】

抗体１６Ａ８は、Ｓ２２４Ａ、Ｈ２２５Ｓ、Ｄ２２６Ａ、Ｔ２２７Ａ、Ｑ２２８Ｓ、Ｑ２２９Ａ、Ｗ２３０ＡおよびＤ２３２Ａ置換を有する変異体４５、４６、および４７への結合を損失したが、他のいかなる変異体への結合も損失しなかった。したがって、１６Ａ８の主要エピトープは、残基Ｗ２３０および／またはＤ２３２の１つ以上、残基Ｔ２２７、Ｑ２２８およびＱ２２９の１つ以上、残基Ｓ２２４、Ｈ２２５およびＤ２２６の１つ以上を含む。１６Ａ８のエピトープは、主としてＭＩＣＡのα３ドメイン内に存在する。

【0427】

図２Ｇは、暗陰影において１６Ａ８による結合の損失を（異なる組合せで）もたらした変異アミノ酸残基を含むＭＩＣＡポリペプチドの図を示す。１６Ａ８は、ＮＫＧ２Ｄ結合表面から離れたα３ドメインに結合することを確認することができる。

【0428】

抗体１４Ｂ４は、Ｔ２２７Ａ、Ｑ２２８Ｓ、およびＱ２２９Ａ置換を有する突然変異体４６への結合を損失したが、他のいかなる突然変異体への結合も損失しなかった。したがって、１４Ｂ４の主要エピトープは、残基Ｔ２２７、Ｑ２２８およびＱ２２９の１つ以上を含み、抗体１６Ａ８との部分的重複を有した。１４Ｂ４のエピトープは、主としてＭＩＣＡのα３ドメイン内に存在する。１４Ｂ４は、ＮＫＧ２Ｄ結合表面から離れたα３ドメインに結合することを確認することができる（しかしながら、１４Ｂ４は、機能的遮断抗体である）。

【0429】

実施例５ − ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断する抗ＭＩＣＡ抗体の能力
Ａ．表面プラズモン共鳴により評価された、抗ＭＩＣＡ抗体の存在下でのＮＫＧ２Ｄ−ＦｃへのＭＩＣＡ^＊００１−Ｈｉｓの結合
ＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で２５℃において実施した。全てＢｉａｃｏｒｅ実験において、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がランニング緩衝液として機能し、１０ｍＭのＮａＯＨ、５００ｍＭのＮａＣｌが再生緩衝液として機能し、センサーグラムをＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１およびＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアにより分析した。

【0430】

溶液競合実験のため、ヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）組換えタンパク質をＣＭ５センサーチップ上に共有結合により固定化した。可溶性ヒトＭＩＣＡ^＊０１−ＢｉｒＡまたはヒトＭＩＣＡ^＊０１９−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）組換えタンパク質を、１０μｇ／ｍｌの一定濃度において５〜１０モル濃度当量過剰の抗体とプレインキュベートし、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃチップ上に１０μｌ／分の流速において２分間注入した。それぞれのサイクル後、センサーチップを適切な再生緩衝液の５秒間の注入により再生させた。図３は、結果の代表例を示し、結果を表Ｅにまとめる。

【0431】

Ｂ．ＮＫ９２ＮＫ細胞系によるＲａｊｉ−ＭＩＣＡ^＊０８形質移入細胞のＮＫＧ２Ｄ依存性溶解を遮断する抗ＭＩＣＡ抗体の能力
ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断する抗ＭＩＣＡ抗体の能力を評価した。抗体を、ＭＩＣＡ^＊００８形質移入ＲａｊｉのＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ１６−ＮＫ９２細胞媒介殺傷を低減させ、または阻害する能力について、^５１Ｃｒの標的細胞放出を計測することにより試験した。インビトロ細胞毒性アッセイを、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）に記載の当分野において周知の標準的方法により実施した。ＭＩＣＡ発現標的細胞を^５１Ｃｒにより標識してからＮＫ細胞系を添加し、次いで殺傷を、殺傷の結果としての細胞から培地への^５１Ｃｒの放出に比例するものとして推定した。ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の結合を低減させ、またはその相互作用を遮断する薬剤の添加は、ＮＫＧ２Ｄを介する活性シグナリングの開始および伝播の妨害をもたらした。したがって、そのような薬剤の添加は、標的細胞のＮＫ媒介殺傷の減少をもたらす。市販の遮断抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＦ（ａｂ’）２断片を、ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ遮断の陽性対照として使用し、リツキシマブ（キメラヒトＩｇＧ１抗ＣＤ２０）を陰性対照として使用して溶解がＡＤＣＣを介して媒介されないことを確保し、抗ＭＩＣＡと同一の条件で産生された無関連キメラヒトＩｇＧ１の形態の追加の陰性対照を使用する。結果の例を図４に示し、表Ｅにまとめる。

【0432】

ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ａ７は、組換え非グリコシル化ＭＩＣＡ^＊００１−ＢｉｒＡと二価ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ組換えタンパク質との相互作用を遮断する一方、それらは、ＮＫ９２によるＲａｊｉ−ＭＩＣＡ^＊０８のＮＫＧ２Ｄ媒介殺傷を遮断しない。第１の仮定は、これら２つの抗ＭＩＣＡが組換えＭＩＣＡ^＊００１についての最小の一価親和性を有し、したがって、細胞間細胞毒性アッセイにおいてＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断するために要求される試験されるものよりも多い量の抗体をもたらすことである。興味深いことに、このことは、抗体が、腫瘍の治療においてインビボで使用される場合、高用量においていくらかの遮断能力を有し得る（すなわち、ｍＡｂ濃度がＡＤＣＣ／ＣＤＣによるＭＩＣＡ＋細胞の有意な枯渇を引き起こすために十分であるため、ＡＤＣＣ／ＣＤＣが優勢な活性機序である時間において）が、インビボ抗体濃度が（高）用量の投与の数日／週後で減少するため、抗体は、非遮断性になり、患者の内因性ＮＫＧ２Ｄ受容体が最適に機能することを可能とすることを暗示する。あるいは、Ｂｉａｃｏｒｅにおいて組換えタンパク質を使用して評価された遮断能力は、細胞膜に存在する天然完全グリコシル化タンパク質間の分子ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用の複雑性を予測し得ない。ＮＫＧ２Ｄ−ＦｃおよびＭＩＣＡ組換えタンパク質の両方は、試験の間それらの天然立体構造であり得ない。最後に、使用される２つの実験手順間で観察される遮断能力の差を担い得る四次構造に関していくらかの別々のアレル特異性が存在し得る。

【0433】

さらに、エピトープは、ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ遮断能力を予測しない。それというのも、例えば、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位上に直接存在しないエピトープを用いる両方のアッセイにおいて遮断抗ＭＩＣＡ抗体であるためである（図２Ｅ）。ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１４Ｂ４は、試験アレルに結合する場合、ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断しているが、そのエピトープはａ３ドメイン上に存在し、このことはＭＩＣＡ立体構造がＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１４Ｂ４結合時に変化することを示唆する。ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６についてのエピトープは、ＮＫＧ２Ｄ結合部位近傍に存在するが、重複せず（図２Ｃ、２Ｄおよび２Ｆ）、ＭＩＣＡ^＊００８に対して機能的に遮断しないと考えられる。

【0434】

【表15】

【0435】

実施例６ − 抗ＭＩＣＡ抗体とヒトＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２およびＵＬＢＰ３との交差反応
交差結合試験のため、ヒトＵＬＢＰ−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ^＊）、ＭＩＣＢ−Ｆｃ（^＊）、ＵＬＢＰ−２−Ｆｃ（^＊）およびＵＬＢＰ−３−Ｆｃ（^＊）組換えタンパク質を、ＣＭ５センサーチップの１〜４つのフローセル上でそれぞれ共有結合により固定化した。抗ＭＩＣＡ抗体（１０μｇ／ｍｌの一定濃度）を４つのフローセル上に並行して１０μｌ／分の流速において２分間注入した。それぞれのサイクル後、センサーチップを適切な再生緩衝液の５秒間の注入により再生させた。

【0436】

図５Ａは、ＭＩＣＢならびにＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０のＵＬＰＢ−１、−２および−３に対する交差反応の不存在を示す。図５Ｂは、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９がＭＩＣＢに結合するが、ＵＬＢＰ−１、−２および−３に結合しないことを示す。図５Ｃは、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８がＭＩＣＢに弱いが有意に結合するが、ＵＬＢＰ−１、−２および−３に結合しないことを示す。試験されなかった抗体は、同一のエピトープ領域を共有する他の抗体と類似のプロファイルを有することが予期される。

【0437】

表Ｆは、全ての試験抗ＭＩＣＡ抗体についての結果をまとめる。

【0438】

【表16】

【0439】

実施例７ − 抗ＭＩＣＡ抗体とカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＭＩＣタンパク質との交差反応
第１、第２および第３の免疫化系列（ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１２Ａ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１８Ｅ８、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ｆ３、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１５Ｆ９およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１４Ｂ４を含む）から得られた抗体の結合を、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＭＩＣホモログタンパク質への結合について試験した。ＭＩＣ＃９−１、ＭＩＣ＃９−２およびＭＩＣ＃２−７を含む３つの配列をカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ｃＤＮＡから連続的にクローニングし、マウス細胞系Ｂａｆ／３中で形質移入した。結合をフローサイトメトリーにより分析し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ組換えタンパク質を対照として使用してカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＭＩＣタンパク質の表面発現を検出した。

【0440】

フローサイトメトリー。細胞を回収し、ＰＢＳ１×／ＢＳＡ０，２％／ＥＤＴＡ２ｍＭの緩衝液中である用量範囲の抗ＭＩＣＡｍＡｂを使用して、またはＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）により４℃において３０分の間染色した。染色緩衝液中での２回の洗浄後、抗ＭＩＣＡ抗体とインキュベートした細胞をマウス抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥモノクローナル抗体（１／１１）により４℃において３０分間染色した。ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃとインキュベートした細胞は、ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（１／２００）により４℃において３０分間染色した。２回の洗浄後、染色をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ上で得、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用して分析した。

【0441】

ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１２Ａ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ｆ３、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１５Ｆ９およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１４Ｂ４抗体は、ＭＩＣ＃２−７カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）タンパク質に結合する。ＭＩＣ＃２−７は、ＭＩＣＡ^＊０１９、ＭＩＣＡ^＊０４４、ＭＩＣＡ^＊００１およびＭＩＣＢ^＊００２との９９．６％、９７．８％、９５．６％および８６．９％のタンパク質相同性をそれぞれ表す。ＭＩＣ＃２−７に加えて、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４はＭＩＣ＃９−１にも結合する。ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８は、試験された実験条件でＭＩＣ＃９−２タンパク質に結合する。結果を図６に示す。

【0442】

実施例８ − ＭＩＣＡシェディングの阻害
抗α３ドメイン１６Ａ８抗体を、市販のＢＡＭ０３（Ｓａｌｉｈ ｅｔ ａｌ（２００３）、前掲参照）と、ＭＩＣＡシェディングを遮断するその能力について比較した。Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊０１およびＣ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊０４細胞のミックスを、ＰＢＳ１×中で洗浄して培養物中に存在する可溶性ＭＩＣＡを除去し、次いで完全培地中である用量範囲（０／１／３／１０／３０μｇ／ｍｌ）の１６Ａ８またはＢＡＭ０３の存在または不存在下で一晩培養した。次いで、細胞培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡにおいて可溶性ＭＩＣＡの存在について試験した。１６Ａ８もＢＡＭ０３も、ＥＬＩＳＡにおいて使用された抗ＭＩＣＡ抗体を干渉していない（データ示さず）。細胞とＢＡＭ０３との一晩のインキュベーションは、上清中の可溶性ＭＩＣＡ濃度の減少をもたらす一方、１６Ａ８は、可溶性ＭＩＣＡの減少を誘導しない。結果を図７に示し、ＢＡＭ０３により媒介されるＭＩＣＡシェディングの阻害を示し、１６Ａ８により媒介されるＭＩＣＡシェディングの阻害を示さない。

【0443】

実施例９ − ＮＫＧ２Ｄ下方モジュレーションに対する抗ＭＩＣＡ抗体の効果
ＮＫ細胞上のＮＫＧ２ＤがｓＭＩＣＡにより下方調節され（Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ；Ａｒｒｅｙｇｕｅ−Ｇａｒｃｉａ（２００８）ＢＭＣ；Ｊｉｎｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．）、より低い反応性のＮＫ細胞をもたらすことが報告されている。可溶性ＭＩＣＡにより誘導される下方調節を模倣するため、以下の実験を実施した。

【0444】

４人の健常ドナーからの解凍ＰＢＭＣを、低温凝集（Ｒｕｂｉｎｓｔｉｅｎ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）により単球の非特異的除去後にリンパ球において濃縮した。細胞（ウェル当たり１．１０ｅ５個の細胞）を、９６ウェルプレート中で増加濃度の可溶性ＭＩＣＡ^＊０１９−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で、抗ＭＩＣＡ抗体（１０μｇ／ｍＬ単位でのＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６）の存在下または不存在下で４℃または３７℃において２４時間インキュベートした。可溶性ＭＩＣＡにより誘導されるＮＫＧ２Ｄ下方モジュレーションおよび抗ＭＩＣＡ抗体によるその遮断をフローサイトメトリーにより評価した。細胞を以下のヒト特異的マウス抗体：抗ＣＤ１４ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３Ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、抗ＣＤ５６ＰＥ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＮＫＧ２Ｄ ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により染色し、ゲーティングされたＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ発現について分析した。

【0445】

この実験設定において、ＮＫＧ２Ｄは、増加用量の組換え二価ＭＩＣＡ^＊０１９^＊Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下でその初期レベルの３０〜４０％だけ下方モジュレートされる（図８）。この効果は、培養培地中で２〜１０μｇ／ｍｌで確認され、癌患者からの血清中で観察される可溶性ＭＩＣＡの記載レベル（悪性障害において３０〜１５５７ｐｇ／ｍｌの範囲、ｎ＝２９６、Ｈｏｌｄｅｎｒｉｅｄｅｒ（２００６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）を大きく上回る。ＮＫＧ２Ｄ下方モジュレーションは、一価ＭＩＣＡ^＊０１−Ｈｉｓ組換えタンパク質を使用するこれらの実験条件で観察されない（データ示さず）。ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９抗ＭＩＣＡ抗体は、実施例５Ｂ（表Ｅ）の細胞毒性アッセイにおいてＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断し、ＮＫ細胞上で発現されたＮＫＧ２ＤとＭＩＣＡ^＊０１９−Ｆｃとの相互作用を遮断しており、したがって、ＭＩＣＡ^＊０１９−Ｆｃタンパク質により誘導されるＮＫＧ２Ｄ下方モジュレーションを逆転させる（図８）。ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６抗ＭＩＣＡは、ＭＩＣＡ^＊０１９−Ｆｃ媒介ＮＫＧ２Ｄ下方モジュレーションを逆転させない（図８）。この抗体は表面プラズモン共鳴によるＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ／ＭＩＣＡ^＊０１９−Ｆｃ結合を遮断しているが（表Ｅ）、実施例５Ｂ（表Ｅ）の細胞毒性アッセイにおいてＮＫＧ２Ｄ／ＭＩＣＡ^＊０８を遮断しておらず、初代細胞に対するＮＫＧ２Ｄ下方モジュレーションを逆転させておらず、このことは、組換えタンパク質を使用するＮＫＧ２Ｄ／ＭＩＣＡ遮断実験が、少なくとも試験された実験条件において生物学的機能を予測し得ない事実を強調する。

【0446】

実施例１０ − 抗ＭＩＣＡ抗体は、ＣＤＣを介してＭＩＣＡ発現標的の殺傷を媒介し得る
ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８を、ＭＩＣＡ^＊００１完全タンパク質をコードするレンチウイルスが形質導入されたヒトＲａｊｉ腫瘍細胞に対するＣＤＣを媒介するそれらの能力について試験した。これらのＲａｊｉ−ＭＩＣＡ^＊０１細胞は、それらの細胞表面においてＭＩＣＡ^＊０１を発現する。

【0447】

手短に述べると、１０００００個のＲａｊｉ−ＭＩＣＡ^＊０１細胞を示される用量の抗ＭＩＣＡ抗体と４℃において１時間インキュベートした。次いで、２０％（最終濃度）のＨｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（Ｑｕｉｄｅｌ）を含有する培養培地を細胞に添加し、３７℃において３時間インキュベートした。細胞を洗浄し、７−ＡＡＤとインキュベートして死滅細胞を染色した。細胞をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ上でのフローサイトメトリーにより得、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用して分析した。結果を示される条件における７−ＡＡＤ陽性細胞の割合として表現する。

【0448】

結果を図９に示す。結果は、ヒト補体の存在下での示されるＲａｊｉ−ＭＩＣＡ^＊０１細胞の生存率を示す。結果は、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４、およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９が死滅細胞の数の増加を引き起こすことを示す（それぞれ、ＥＣ５０値は、０．９７、２、１．０１および２．３５μｇ／ｍｌである）（図９）。死滅細胞の最大割合は、試験される異なる抗ＭＩＣＡにより変動する（図９）。特に、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８は、補体細胞毒性を媒介していない。これら５つの抗ＭＩＣＡは、同一オーダーのＣ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊０１を染色するためのＥＣ５０値を有するため（表Ｃ）、補体媒介細胞毒性は、エピトープ依存的であると考えられる（９Ｃ１０＞２０Ｃ６＝６Ｅ４＞１９Ｅ９＞＞１６Ａ８）。

【0449】

実施例１１ − 抗体は、ＡＤＣＣを介してＭＩＣＡ発現標的を殺傷し得る
ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１２Ａ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１８Ｅ８、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１０Ｆ３、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１５Ｆ９およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１４Ｂ４を、ＭＩＣＡ^＊００８が形質移入されたＣ１Ｒ腫瘍細胞（Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００８）に対するＡＤＣＣを媒介するそれらの能力について試験した。

【0450】

手短に述べると、ヒトＣＤ１６（Ｖアイソフォーム）が形質移入されたヒトＮＫ細胞系ＫＨＹＧ−１の細胞溶解活性を、（Ｇｒｅｉｎｅｒ）からのＶ底９６ウェルプレート中で古典的な４時間の^３１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価した。手短に述べると、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００８細胞を^５１Ｃｒ（１００μＣｉ（３．７ＭＢｑ）／１×１０^６個の細胞）により標識し、次いでｈＣＤ１６Ｖ（ヒトＩｇＧ１に結合させるため）が形質移入されたＫＨＹＧと、２０に等しいエフェクター／標的比において示される濃度における抗体および１０μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２のＯＮ−７２（いかなるＮＫＧ２Ｄ媒介細胞毒性も遮断するため）の存在下で混合した。短時間の遠心分離および３７℃における４時間のインキュベーション後、５０μＬの上清を取り出し、^５１Ｃｒ放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）により計測した。全ての実験群をトリプリケートで分析し、特異的溶解の割合を以下のとおり決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自発放出）／（平均ｃｐｍ全放出−平均ｃｐｍ自発放出）。全放出の割合は２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）における標的細胞の溶解により得た。

【0451】

結果を図１０Ａに示す。ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６およびＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８は、それぞれ、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）と比較してヒトＫＨＹＧ−１ ｈＣＤ１６Ｖ ＮＫ細胞系によるＣ１Ｒ−ＭＩＣＡ^＊００８細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、それらの抗体はＭＩＣＡ^＊００８発現標的細胞に対するＡＤＣＣを誘導することを示す。標的細胞溶解の程度は、細胞への抗体結合と相関する（図１０Ｂ）。

【0452】

実施例１２ − キメラ抗ＭＩＣＡ９Ｃ１０、１９Ｅ９、６Ｅ４、２０Ｃ６および１６Ａ８は、ＲＡＪＩ−ＭＩＣＡ^＊０１Ｈｉｇｈゼノグラフトのマウスモデルにおいて抗腫瘍効力を示す
抗体を、ＲＡＪＩ細胞が高レベルの抗原ＭＩＣＡ^＊０１を発現するマウス長期ＲＡＪＩ−ＭＩＣＡ^＊０１腫瘍モデルにおいて試験した。Ｎｏｄ ＳＣＩＤマウスに１５．１０^６個のＲＡＪＩ−ＭＩＣＡ^＊０１Ｈｉｇｈを静脈内（ＩＶ）移植し、対照アイソタイプ対照抗体（ＩＣ）またはキメラ抗体ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−９Ｃ１０、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１９Ｅ９、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−６Ｅ４、ＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−２０Ｃ６、またはＣＨＧ１−Ｍ−ＭＩＡ−１６Ａ８のいずれかにより、３００μｇ／マウスの投与量において、腫瘍細胞移植日から３週間、ＩＰ２回／週で処理した。

【0453】

ＲＡＪＩ−ＭＩＣＡ^＊０１Ｈｉｇｈを、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清、１％のＬ−グルタミン、１％のナトリウム／ピルビン酸塩を補給された含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培養培地中で、マウス中への注射前に抗体を用いずに培養した。

【0454】

マウスを１週間に２回秤量した。カプラン・マイヤー生存曲線を確立して処理マウスの生存期間を評価した。

【0455】

結果を図１１に示す。全てのキメラ抗体は、抗腫瘍活性を示した。アイソタイプ対照を受けた動物は、２７日間の生存期間の中央値を有した一方、最小有効キメラ抗体（１６Ａ８）により処理されたマウスは７７日間の生存期間の中央値を有した。全ての他の抗体については、動物の５０％超が１００日目において依然として生存し、このことは生存期間の中央値の計算を妨げ、極めて強力な抗腫瘍効果を示す。

【0456】

全ての見出しおよび小見出しは、本明細書において便宜的に使用されるにすぎず、決して本発明を限定するものとして解釈すべきではない。上記要素のその全ての考えられる変形形態における任意の組合せは、本明細書に特に記載されず、または特に文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。本明細書の値の範囲の記述は、本明細書に特に記載のない限り、その範囲内に含まれるそれぞれの別個の値を個別に参照する略記方法として機能するものにすぎず、それぞれの別個の値は、あたかもそれが本明細書において個々に記述されるように、本明細書に組み込まれる。特に記載のない限り、本明細書に提供される全ての正確な値は、対応する近似値を代表する（例えば、特定の因子または計測値に関連して提供される全ての正確な例示値は、適宜「約」により修飾される、対応する近似測定値も提供するものとみなすことができる）。

【0457】

本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特に記載されず、または特に文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。

【0458】

本明細書に提供される任意および全ての例、または例示的な文言（例えば、「例えば」）の使用は、本発明をより良好に説明するものにすぎず、特に記載のない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の文言は、任意の要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものとして、そのように明示されない限り、解釈すべきでない。

【0459】

本明細書の特許文書の引用および組込みは、便宜的に行われるにすぎず、そのような特許文書の有効性、特許性および／または権利行使可能性に関するいかなる見解も反映するものではない。１つまたは複数の要素に対する参照などの用語を使用する本発明の任意の態様または実施形態の本明細書の記載は、特に記載されず、または文脈と明らかに矛盾しない限り、その特定の１つまたは複数の要素「からなる」、「本質的にその要素からなる」またはその要素を「実質的に含む」本発明の類似の態様または実施形態へのサポートを提供するものとする（例えば、特定の要素を含む本明細書に記載の組成物は、特に記載されず、または文脈と明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物も記載するものとして理解すべきである）。

【0460】

本発明は、適用可能な法律により許容される最大の程度までの、本明細書に提示される態様または特許請求の範囲に記載される、主題の全ての改変形態および均等物を含む。

【0461】

本明細書に引用される全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、あたかも参照により組み込まれることが個別具体的に示されるように、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0462】

上記発明を、理解を明確にすることを目的として、説明および例として、いくらか詳細に記載したが、本発明の教示に照らして添付の特許請求の範囲の趣旨からも範囲からも逸脱することなくある変更および改変をそれに対して行うことができることは当業者に容易に明らかである。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]