特許 6409133 スタリマイシンを調製する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6409133

(24)【登録日】2018年9月28日

(45)【発行日】2018年10月17日

(54)【発明の名称】スタリマイシンを調製する方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 17/16 20060101AFI20181004BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20181004BHJP

【ＦＩ】

   C12P17/16

   C12N1/20 E

【請求項の数】20

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2017-533622(P2017-533622)

(86)(22)【出願日】2015年11月10日

(65)【公表番号】特表2018-500032(P2018-500032A)

(43)【公表日】2018年1月11日

(86)【国際出願番号】CN2015094178

(87)【国際公開番号】WO2016101720

(87)【国際公開日】20160630

【審査請求日】2017年8月8日

(31)【優先権主張番号】201410813640.4

(32)【優先日】2014年12月24日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】510116819

【氏名又は名称】浙江海正薬業股▲ふん▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｈｉｓｕｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】蒋世春

(72)【発明者】

【氏名】蒋歓

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０１−１７４３９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０３１９０８０１（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開昭５０−００６７８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PLOS one，２０１４年 ６月，Vol.9(6), e99077，doi:10.1371/journal.pone.0099077

【文献】 Acta laser biology sinica，２０１４年 ４月，Vol.23, No.2，p.189-192

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １７／１６

Ｃ１２Ｎ １／２０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

スタリマイシンを調製する方法であって、
利用可能な炭素源、利用可能な窒素源、および３−ヒドロキシ−４−アミノ酪酸を含む発酵培地において、スタリマイシンを産生することができるストレプトマイセスを発酵させる工程と、
発酵中に、上記発酵培地に植物性油脂を加える工程と、
を含む、方法。

【請求項2】

上記ストレプトマイセスが、ストレプトマイセス ディスタリカス ＮＲＲＬ Ｎｏ．２８８６、ストレプトマイセス ディスタリカス Ｄ３２、または、ストレプトマイセス ディスタリカス ＤＺ２０６から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

上記発酵培地における上記３−ヒドロキシ−４−アミノ酪酸の重量濃度は、０．００５〜０．０５％であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

上記発酵培地における上記３−ヒドロキシ−４−アミノ酪酸の重量濃度は、０．０１％であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

上記発酵中とは、上記発酵が４８〜１２０時間行われた時点を意味する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

植物性油脂を加える間隔が、２４時間毎に１回であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

各時点に関して、上記発酵培地に加えられる植物性油脂の量の重量比は、０．３〜１．０％であり；
上記発酵培地に加えられる植物性油脂の総量の重量比は、１〜４％であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

各時点に関して、上記発酵培地に加えられる植物性油脂の量の重量比は、０．５％であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

上記発酵培地に加えられる植物性油脂の総量の重量比は、２％であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

上記植物性油脂は、菜種油、ひまわり油、落花生油、大豆油、オリーブ油、またはその混合物から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

上記植物性油脂は、大豆油であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

上記発酵培地における上記利用可能な炭素源の重量濃度は、４〜１０％であり；
上記発酵培地における上記利用可能な窒素源の重量濃度は、２〜７％であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

上記発酵培地における上記利用可能な炭素源の重量濃度は、５〜８％であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

上記発酵培地における上記利用可能な炭素源の重量濃度は、６％であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

上記発酵培地における上記利用可能な窒素源の重量濃度は、３〜６％であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

上記発酵培地における上記利用可能な窒素源の重量濃度は、５％であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

上記利用可能な炭素源が、ラクトース、マルトース、デキストリン、キャッサバ粉、コーンスターチ、グルコース、小麦でんぷん、ジャガイモでんぷん、グリセロール、植物性油脂、またはその混合物から選択され；
上記利用可能な窒素源は、大豆粉、黄大豆粕粉末、酵母粉末、コーンスティープリカー、コーンスティープリカー乾燥粉末、魚粉、ペプトン、落花生粕粉末、綿実粕粉末、糠、グルテン粉末、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、またはその混合物から選択されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

上記利用可能な炭素源が、グルコース、デキストリン、大豆油、またはその混合物から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

上記利用可能な窒素源は、大豆粉、グルテン粉末、またはその混合物から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

発酵温度は２０〜４０℃であり、発酵時間は１４４〜１９２時間であり、上記発酵培地のｐＨは６．０〜９．０であることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物薬物学の分野に関する。特に、発酵によってスタリマイシンを調製する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

スタリマイシンは、ストレプトマイセス ネトロプシス（Streptomyces netropsis）またはストレプトマイセス ディスタリカス（S. distallicus）から生成される抗生物質である。その塩酸塩は黄白色の結晶性粉末であり、分子式はＣ_２２Ｈ_２７Ｎ_９Ｏ_４・ＨＣｌであり、分子量は５１７．９７５であり、融点は１８４〜１８７℃である。スタリマイシンは、水溶性であるが、有機溶媒には溶解しない。本製品は、光および多湿を避けた状態で保管されなくてはならない。スタリマイシンには、グラム陽性菌、菌類およびウイルスに対する抑制効果があり、その作用機序は、主にＤＮＡ合成を抑制することである。スタリマイシンは、単純疱疹、帯状疱疹およびワクシニア・ウイルス等によって引き起こされる皮膚感染および粘膜感染に対して、主に使用される。スタリマイシンは、ある種の抗癌活性を有するオリゴペプチド抗生物質でもある。スタリマイシンは、小分子標的配列の発現および遺伝子スイッチを制御することによって、特定のＤＮＡ配列に対する結合性を示し、かつＤＮＡを認識し得る。スタリマイシンは、抗マラリア薬および抗血管形成薬として使用され得る。スタリマイシンは、臨床応用に関する有毒性がより低く、かつ有効性がより高い抗生物質の一種である。中国においては、スタリマイシンの研究は殆ど行われておらず、本製品は主に輸入されている。［Arcamone, F; Penco, S; Orezzi, P.G; Nicolella, V; Pirelli, A.Nature 1964,203,1064］、［Michaelw.Van Dyke, Robert P.Hertzberg Peter B. Dervian Proc.Natl.Acad.sci. USA 1982,79: 5470-5474］、［Stockert JC,Castillo P D Bella JL.DNA-induced distamycin A fluorescence. Histochemistry, 1990.94:45-47］、［Baliga R, Crothers DM.The Kinetic basis for sequence discrimination by distamycin A Jam Chem soc 2000.122: 11751-11752］等の幾つかの文献は、スタリマイシンおよびその類似体の物理化学的性質および抗腫瘍活性等の、幾つかの内容を開示している。イタリアのPharmacia社の発明特許（公開番号：ＣＮ １４６８０９９ Ａ）は、様々なスタリマイシン誘導体の抗腫瘍効果を開示しており、その応用の見込みが大きくなっている。Hori et al.は、スタリマイシンの、染色体不安定部を誘発するという特性を研究した。これは、ストレス要因によって引き起こされる人間の染色体の不安定性に対する手掛かりを提供する特性であった。中国特許（公開番号：ＣＮ ８６１０４７７４ Ａ）は、スタリマイシン誘導体の調製方法を開示している。しかしながら、スタリマイシンを調製する先進的な発酵方法は、中国国内および外国の文献において報告されていない。現在のところ、発酵のレベルが低く、工程が不完全であり、スタリマイシン製造用の菌株の良い特性の発現が不十分である。そのため、低力価、大きな生産変動、低収率および高コスト等、スタリマイシンには幾つかの短所が存在する。［Selection of High Distamycin Producing Strain, Jiang Shichun etc. (Acta Laser Biology Sinica, 2014, 23(2), 189-192)］において、変異株ストレプトマイセス ディスタリカス ＤＺ２０６は、突然変異によって得られている。上記変異株の収率は、原株のストレプトマイセス ディスタリカス Ｄ３２の１．３８倍であり、スタリマイシンの生産水準を上げる方法を提供している。しかしながら、発酵工程をさらに最適化させていないため、ストレプトマイセス ディスタリカス ＤＺ２０６株の潜在能力は十分に発掘され得ず、収率の大幅な増大に対して制限がある。従って、スタリマイシンを調製する高効率な方法を探求する研究が続いている。

【発明の概要】

【0003】

本発明はまた、スタリマイシンを調製する高効率的な方法をも提供する。上記工程は、（１）利用可能な炭素源、利用可能な窒素源、および３−ヒドロキシ−４−アミノ酪酸を含む発酵培地において、スタリマイシンを産生することができるストレプトマイセスを発酵させる工程、ならびに、（２）発酵中に、上記発酵培地に植物性油脂を加える工程を含む。

【0004】

好ましい実施形態において、上記スタリマイシンを産生することができるストレプトマイセスは、ストレプトマイセス ディスタリカス ＮＲＲＬ Ｎｏ．２８８６、ストレプトマイセス ディスタリカス Ｄ３２、ストレプトマイセス ディスタリカス ＤＺ２０６から選択される。

【0005】

好ましい実施形態において、上記発酵培地における上記３−ヒドロキシ−４−アミノ酪酸（構造は、以下に示されており、ＨＡＢＡと略記される）の重量濃度は、０．００５〜０．０５％であり、好ましくは、０．０１％である。

【0006】

【化1】

【0007】

好ましい実施形態において、上記発酵は、好ましくは、発酵が４８〜１２０時間行われた時点において上記発酵培地に植物性油脂を加える工程を含む。

【0008】

好ましい実施形態において、植物性油脂を加える間隔は、好ましくは２４時間毎に１回である。

【0009】

好ましい実施形態において、各時点において上記発酵培地に加えられる植物性油脂の量の重量比は、好ましくは０．３〜１．０％であり、より好ましくは０．５％である。上記発酵培地に加えられる植物性油脂の総量の重量比は、好ましくは１〜４％、より好ましくは２％である。

【0010】

好ましい実施形態において、上記植物性油脂は、菜種油、ひまわり油、落花生油、大豆油、オリーブ油、またはその混合物から好ましくは選択され、より好ましくは大豆油である。

【0011】

好ましい実施形態において、上記発酵培地における上記利用可能な炭素源の重量濃度は、好ましくは４〜１０％であり、より好ましくは５〜８％であり、最も好ましくは６％である。上記発酵培地における上記利用可能な窒素源の重量濃度は、好ましくは２〜７％であり、より好ましくは３〜６％であり、最も好ましくは５％である。

【0012】

好ましい実施形態において、上記利用可能な炭素源は、ラクトース、マルトース、デキストリン、キャッサバ粉、コーンスターチ、グルコース、小麦でんぷん、ジャガイモでんぷん、グリセロール、植物性油脂、またはその混合物から好ましくは選択され、より好ましくは、グルコース、デキストリン、大豆油、またはその混合物である。上記利用可能な窒素源は、大豆粉、黄大豆粕粉末、酵母粉末、コーンスティープリカー、コーンスティープリカー乾燥粉末、魚粉、ペプトン、落花生粕粉末、綿実粕粉末、糠、グルテン粉末、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、またはその混合物から好ましくは選択され、より好ましくは、大豆粉、グルテン粉末、またはその混合物である。

【0013】

好ましい実施形態において、発酵温度は、好ましくは２０〜４０℃であり、発酵時間は、好ましくは１４４〜１９２時間であり、上記発酵培地のｐＨは、６．０〜９．０である。

【0014】

本発明において、ストレプトマイセス ディスタリカス ＮＲＲＬ Ｎｏ．２８８６は、米国特許第３１９０８０１号に示されている。ストレプトマイセス ディスタリカス Ｄ３２およびストレプトマイセス ディスタリカス ＤＺ２０６は、［Selection of High Distamycin Producing Strain, Jiang Shichun etc. Acta Laser Biology Sinica, 2014, 23(2), 189-192)］の論文に示されている。

【0015】

本発明において言及されている斜面胞子培養培地は、（１）３〜５％の利用可能な炭素源を含む。適した利用可能な炭素源には、コーンスターチ、キャッサバ粉、デキストリン、ラクトース、グルコース、マルトース等が含まれる。上記斜面胞子培養培地は、（２）１〜２％の利用可能な窒素源を含む。適した利用可能な窒素源には、酵母粉末、酵母抽出物、カゼイン、ペプトン、コーンスティープリカー、魚粉、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が含まれる。

【0016】

本発明に係る上記斜面胞子培養培地の調製、シード培養培地の調製、および発酵培養工程は、以下の通りである。

【0017】

［斜面胞子培養培地の調製］
調製された上記斜面胞子培養培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌する。上記調製された上記斜面胞子培養培地は、固形培地が好ましい。適した培養温度は２０〜４０℃であり、最適温度は２９±２℃である。インキュベーション時間は、４〜１４日間であり、好ましくは、６〜１２日間である。

【0018】

［シード培養培地の調製］
本発明のシード培養培地は、（１）１〜４％の利用可能な炭素源を含む。適した利用可能な炭素源には、でんぷん、デキストリン、グリセロール、グルコース、ラクトース、マルトース等が含まれる。上記シード培養培地は、（２）１〜４％の利用可能な窒素源を含む。適した利用可能な窒素源には、黄大豆粕粉末、酵母粉末、ペプトン、コーンスティープリカー、糠、グルテン粉末、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等が含まれる。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌する。冷却後、斜面胞子懸濁液を、上記シード培養培地に植菌し、培養した。振盪フラスコの充填量は、上記フラスコの容積の１０〜１５％であった。上記培地を、８層のガーゼによって濾過した。攪拌機の回転速度は２００〜２４０ｒｐｍであり、シード槽の充填量は６５％〜７５％であり、通気の比率は１：１ ｖ／ｖ／ｍであり、回転速度は２００〜２４０ｒｐｍであり、適した培養温度は２０〜４０℃であり、最適温度は２９±２℃であり、培養時間は２０〜４８時間であり、菌糸の濃度は５〜２０％である。

【0019】

［発酵培養］
本発明の上記発酵培地は、（１）４〜１０％の利用可能な炭素源を含む。適した利用可能な炭素源には、コーンスターチ、デキストリン、グリセロール、グルコース、キャッサバ粉、ジャガイモ粉末、小麦でんぷん、ラクトース、マルトース、植物性油脂等が含まれる。上記利用可能な炭素源は、好ましくは、デキストリン、グルコース、大豆油、またはその混合物である。上記発酵培地は、（２）２〜７％の利用可能な窒素源を含む。適した利用可能な窒素源には、黄大豆粕粉末、落花生粕粉末、綿実粕粉末、大豆粉、酵母粉末、ペプトン、コーンスティープリカー、コーンスティープリカー乾燥粉末、魚粉、糠、グルテン粉末、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が含まれる。上記利用可能な窒素源は、大豆粉、グルテン粉末、またはその混合物であることが好ましい。発酵中（４８〜１２０時間）に、菜種油、ひまわり油、落花生油、大豆油、オリーブ油、またはその混合物から選択される、１〜４％の利用可能な植物性油脂が加えられる。上記植物性油脂は、好ましくは、大豆油、菜種油であり、より好ましくは、大豆油である。上記植物性油脂は、好ましくは、濃度１〜４％であり、最適濃度は２％である。利用可能なＨＡＢＡの濃度は、０．００５〜０．０５％であり、好ましくは０．０１％である。上記培養培地を、１２１〜１２５℃、０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌する。冷却後、上記斜面胞子懸濁液を、培養のために上記シード培養培地に植菌する。振盪フラスコの充填量は、上記フラスコの容積の１０〜１２％である。また、上記培地を、８層のガーゼによって濾過する。攪拌機の回転速度は２００〜２４０ｒｐｍであり、発酵槽の充填量は６５〜７５％であり、通気の比率は１：０．８ ｖ／ｖ／ｍであり、回転速度は２００〜２４０ｒｐｍであり、培養温度は２０〜４０℃であり、最適温度は２９±２℃であり、培養時間は１４４〜１９２時間であり、菌糸の濃度は３０〜５０％である。

【0020】

［スタリマイシンの力価の決定］
スタリマイシンを検出する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法：
発酵後、３倍量（体積）の８０％エタノールを、発酵した菌糸液に加える。混合物を１５〜３０分間浸漬して濾過し、濾液をＨＰＬＣ検出に掛ける。検出条件は以下の通りである。カラム：Shandon Hypersil ２５０×２．１ｍｍ、カラム温度：４０℃、移動相：溶媒Ａはアセトニトリル；溶媒Ｂはドデシル硫酸ナトリウム水溶液１２ｇ／Ｌ（調製方法：１２グラムのドデシル硫酸ナトリウムに、８５％リン酸水溶液を１２ｍｌ加える。純水を、体積が１，０００ｍｌに達するまで加える。その後、２０％水酸化ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨを２．６に調整する）、上記移動相の流速：０．２５ｍｌ／分、検出波長：３０４ｎｍ。スタリマイシンの保持時間は、８．２分間である。上記移動相の勾配条件は、以下の通りである。

【0021】

【表1】

【0022】

［本発明は、従来法に対して、以下の利点を有する］
本発明は、スタリマイシンを効率的に発酵させる方法を提供する。すなわち、スタリマイシンを産生することができるストレプトマイセスを、液体シード培養培地へ植菌する工程；細胞が成熟するまで待機する工程；最適な発酵培地へと、上記細胞を移植する工程；および工程条件の調整、を提供する。また、発酵中に、培養培地にフィーディングする方法によって、上記発酵水準が実質的に上昇し、スタリマイシンの収率が従来法（国際的に一線級の水準である）の２．２倍に達する。上記発酵工程の改良のため、発酵した菌糸は、従来のペースト状から粒状形状になる。このことは、固体と液体との分離に役立ち、それ故、抽出の収率が高まる。それと同時に、装置および原料の利用率が増大し、生産コストは大きく削減される。上記方法により、国際市場に参入するための、および国産化のための基盤が築かれる。それ故、大きな経済的利益および社会的利益を有する。

【0023】

（１）本発明の方法を用いることにより、細菌の高収率特性が、十分に発揮され得る。上記菌糸は、発酵の初期段階において活発に成長し、発酵代謝の速度は速く、抗生物質の収率は著しく増大する。これは、感染率を減少させるためには好都合である。

【0024】

（２）本発明の方法を用いることにより、発酵の後に得られる原料液体の粘度は低く、濾過速度は速く、得られる濾液は透明である。これは、抽出の収率および最終製品の品質を高めるためには好都合である。従来法における発酵の生産性等が低いこと、粘度が高いこと、ペーストが形成されること、溶液が完全には濾過され得ないこと、収率が低いこと、損失が大きいこと、等の異常事態は回避される。

【0025】

（３）本発明の方法を用いることにより、培養工程においてＨＡＢＡが発酵基礎培地に加えられており、また、植物性油脂を加える工程が導入される。そのため、発酵水準が確実に上がり、かつ同時に液漏れを回避する。また、槽の容積が増大し、発酵の指標が上昇し、かつ発酵力価が従来法の２．２倍に達する。その結果、生産水準は大いに改善され、その上、生産コストは著しく削減される。

【0026】

（４）本発明においては、ＨＡＢＡを上記発酵培地に加え、上記培地における炭素栄養および窒素栄養の組成および比率を調整する。同時に、培養工程中に、植物性油脂が加えられる。そのため、高収率性が十分に発揮され、抗生物質の分泌が速くなり収率が増大し、有効成分の割合が増し、不純物がより少ない。また、濾過された菌糸の残渣の水分含有率は少なく、フィルターの残渣が固着しておらず、脱着が容易であり、労働強度が低減される。

【0027】

（５）本発明は、既存の医薬品製造装置に、何らの追加出資無しで実施することができる。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本発明が当業者に十分に理解されるように、本発明を以下の実施例によってさらに説明する。上記実施例は、本発明を説明するために与えられているが、本発明を限定するものではない。本発明の本質に係る、本発明の多少の変更は、本発明によって保護されている範囲にすべて属する。特に記載がない限り、本発明における百分率は、すべて重量パーセントまたは重量パーセント濃度である。

【0029】

ストレプトマイセス ディスタリカス ＮＲＲＬ Ｎｏ．２８８６は、米国特許第３１９０８０１号において開示されており、米国のAgricultural Research Service Culture Collectionから得ることができる。

【0030】

ストレプトマイセス ディスタリカス Ｄ３２およびストレプトマイセス ディスタリカス ＤＺ２０６は、［Selection of High Distamycin Producing Strain, Jiang Shichun etc. Acta Laser Biology Sinica, 2014, 23(2), 189-192］において開示されており、Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., LTD.から得ることができる。

【0031】

〔比較例１ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株：ストレプトマイセス ディスタリカス ＮＲＲＬ Ｎｏ．２８８６。

【0032】

（２）斜面胞子の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ４．５、酵母粉末 １．５、塩化ナトリウム ０．３、硫酸マグネシウム７水和物 ０．０５、炭酸カルシウム ０．２、硫酸アンモニウム ０．０５、ＥＤＴＡ ０．０２、滅菌前のｐＨは６．２であった。天然水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（２５０ｍＬのナス型瓶中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。後の使用のために上記培地を適切に冷却した後、横向きに静置し、斜面を形成させた。

【0033】

スタリマイシンを産生する菌株（ストレプトマイセス ディスタリカス ＮＲＲＬ Ｎｏ．２８８６）の胞子溶液を、何も播種されていない斜面上に均一に塗布した。そして、２９±２℃の定温にて６〜１２日間、インキュベーター中で培養した。成熟後の上記胞子は、灰白色であった。

【0034】

（３）振盪フラスコのシード培養培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、胞子を含む培地の塊を掘り出し、シード培養培地に植菌した。その後、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で、温度２９±２℃にて４０時間、培養した。菌糸の濃度は７％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、明らかに分枝および分節を有していた。

【0035】

（４）振盪フラスコの培養培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で１６８時間、培養した。瓶中の菌糸の濃度は約３５％であり、ｐＨは約７．５であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを上記発酵培地に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、７３０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0036】

〔比較例２ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株：ストレプトマイセス ディスタリカス Ｄ３２。

【0037】

（２）斜面胞子の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ４．５、酵母粉末 １．５、塩化ナトリウム ０．３、硫酸マグネシウム７水和物 ０．０５、炭酸カルシウム ０．２、硫酸アンモニウム ０．０５、ＥＤＴＡ ０．０２、滅菌前のｐＨは６．２であった。天然水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（２５０ｍＬのナス型瓶中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。後の使用のために上記培地を適切に冷却した後、横向きに静置し、斜面を形成させた。

【0038】

スタリマイシンを産生する菌株（ストレプトマイセス ディスタリカス Ｄ３２）の胞子溶液を、上述の何も播種されていない斜面上に均一に塗布した。そして、２９±２℃の定温にて６〜１２日間、インキュベーター中で培養した。成熟後の上記胞子は、灰白色であった。

【0039】

（３）振盪フラスコのシード培養培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、胞子を含む培地の塊を掘り出し、シード培養培地に植菌した。その後、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で、温度２９±２℃にて４０時間、培養した。菌糸の濃度は８％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、明らかに分枝および分節を有していた。

【0040】

（４）振盪フラスコの培養培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で１６８時間、培養した。瓶中の菌糸の濃度は約３５％であり、ｐＨは約７．９であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを上記発酵培地に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、１，０３０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0041】

〔比較例３ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株：ストレプトマイセス ディスタリカス ＤＺ２０６。

【0042】

（２）斜面胞子の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ４．５、酵母粉末 １．５、塩化ナトリウム ０．３、硫酸マグネシウム７水和物 ０．０５、炭酸カルシウム ０．２、硫酸アンモニウム ０．０５、ＥＤＴＡ ０．０２、滅菌前のｐＨは６．２であった。天然水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（２５０ｍＬのナス型瓶中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。後の使用のために上記培地を適切に冷却した後、横向きに静置し、斜面を形成させた。

【0043】

スタリマイシンを産生する菌株（ストレプトマイセス ディスタリカス ＤＺ２０６）の胞子溶液を、上述の何も播種されていない斜面上に均一に塗布した。そして、２９±２℃の定温にて６〜１２日間、インキュベーター中で培養した。成熟後の上記胞子は、灰白色であった。

【0044】

（３）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、胞子を含む培地の塊を掘り出し、シード培養培地に植菌した。その後、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で、温度２９±２℃にて４０時間、培養した。菌糸の濃度は１０％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、明らかに分枝および分節を有していた。

【0045】

（４）振盪フラスコ中の培養培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で１６８時間、培養した。瓶中の菌糸の濃度は約３５％であり、ｐＨは約７．９であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを上記発酵培地に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、２，４２０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0046】

〔比較例４ スタリマイシンの調製〕
小型の発酵槽を用いた実験
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、比較例３に記載の通りである。

【0047】

（２）振盪フラスコ中の菌糸の調製
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は２００ｍＬであった（１，０００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、胞子を含む培地の塊を掘り出し、シード培養培地に植菌した。その後、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で、温度２９±２℃にて４０時間、培養した。菌糸の濃度は約１４％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、明らかに分枝および分節を有していた。

【0048】

（３）シード槽中の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は６５Ｌであった（１００Ｌのシード槽中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、上記振盪フラスコ中の菌糸液を植菌した。その後、温度２９±２℃、回転速度２２０ｒ／分、通気の比率１：１ ｖ／ｖ／ｍにて４０時間、培養した。菌糸の濃度は１２％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、太く丈夫であり、明らかに分枝および分節を有していた。

【0049】

（４）発酵槽中の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は７００Ｌであった（１，０００Ｌの発酵槽中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃、撹拌回転速度は２２０ｒ／分、通気の比率は１：０．８ ｖ／ｖ／ｍ、発酵周期は１６８時間であった。菌糸の濃度は約４０％であり、ｐＨは８．２であり、外観は暗い黄色であった。発酵液を前処理した後、スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、２，４７０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0050】

〔実施例１ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株：ストレプトマイセス ディスタリカス ＤＺ２０６。

【0051】

（２）斜面胞子の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ４．５、酵母粉末 １．５、塩化ナトリウム ０．３、硫酸マグネシウム７水和物 ０．０５、炭酸カルシウム ０．２、硫酸アンモニウム ０．０５、ＥＤＴＡ ０．０２、滅菌前のｐＨは６．２であった。天然水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。後の使用のために上記培地を適切に冷却した後、横向きに静置し、斜面を形成させた。

【0052】

スタリマイシンを産生する菌株（ストレプトマイセス ディスタリカス ＤＺ２０６）の胞子溶液を、上述の何も播種されていない斜面上に均一に塗布した。そして、２９±２℃の定温にて６〜１２日間、インキュベーター中で培養した。成熟後の上記胞子は、灰白色であった。

【0053】

（３）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、胞子を含む培地の塊を掘り出し、シード培養培地に植菌した。その後、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で、温度２９±２℃にて４０時間、培養した。菌糸の濃度は１２％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、明らかに分枝および分節を有していた。

【0054】

（４）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．００５、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％の大豆油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えた大豆油の量は、合計約２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。上記発酵培地の、菌糸の濃度は約３５％であり、ｐＨは約７．８であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，４３０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0055】

〔実施例２ スタリマイシンの調製〕
小型の発酵槽を用いた実験
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0056】

（２）振盪フラスコ中の菌糸の調製
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は２００ｍＬであった（１，０００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、胞子を含む培地の塊を掘り出し、シード培養培地に植菌した。その後、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で、温度２９±２℃にて４０時間、培養した。菌糸の濃度は約１２％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、分枝および分節を有していた。

【0057】

（３）シード槽中の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は６５Ｌであった（１００Ｌのシード槽中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、上記振盪フラスコ中の菌糸液を植菌した。その後、温度２９±２℃、撹拌回転速度２２０ｒ／分、通気の比率１：１ ｖ／ｖ／ｍにて４０時間、培養した。菌糸の濃度は１４％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、太く丈夫であり、明らかに分枝および分節を有していた。

【0058】

（４）発酵槽中の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３．０、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、大豆油 ０．１、ＨＡＢＡ ０．０１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は７００Ｌであった（１，０００Ｌの発酵槽中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、シード液を植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃、撹拌回転速度は２２０ｒ／分、通気の比率は１：０．８ ｖ／ｖ／ｍであった。４８時間の培養後、１日に１回、大豆油を０．３％加えた。全発酵工程中に供給された大豆油の量は、合計１．２％であった。発酵周期は１６８時間であった。菌糸の濃度は約４０％であり、ｐＨは８．２であり、外観は暗い黄色であった。発酵液を前処理した後、スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，３６０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0059】

〔実施例３ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0060】

（２）振盪フラスコ中の菌糸の調製
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は２００ｍＬであった（１，０００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、胞子を含む培地の塊を掘り出し、シード培養培地に植菌した。その後、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で、温度２９±２℃にて４０時間、培養した。菌糸の濃度は約１２％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、分枝および分節を有していた。

【0061】

（３）シード槽中の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は６５Ｌであった（１００Ｌのシード槽中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、上記振盪フラスコ中の菌糸液を植菌した。その後、温度２９±２℃、撹拌回転速度２２０ｒ／分、通気の比率１：１ ｖ／ｖ／ｍにて４０時間、培養した。菌糸の濃度は１３％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、太く丈夫であり、明らかに分枝および分節を有していた。

【0062】

（４）発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０１、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は７００Ｌであった（１，０００Ｌの発酵槽中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、シード液を植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃、回転速度は２２０ｒ／分、通気の比率は１：０．８ ｖ／ｖ／ｍであった。４８時間の培養後、１日に１回、大豆油を０．５％加えた。全発酵工程中に供給された大豆油の量は、合計２％であった。発酵周期は１６８時間であった。菌糸の濃度は約３８％であり、ｐＨは８．４であり、外観は暗い黄色であった。発酵液を前処理した後、スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，４００ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0063】

〔実施例４ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0064】

（２）振盪フラスコ中の菌糸の調製
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は２００ｍＬであった（１，０００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、胞子を含む培地の塊を掘り出し、シード培養培地に植菌した。その後、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で、温度２９±２℃にて４０時間、培養した。菌糸の濃度は約１４％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、分枝および分節を有していた。

【0065】

（３）シード槽中の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ２、コーンスティープリカー ２．５、炭酸カルシウム １．０、硫酸アンモニウム ０．１、リン酸二水素カリウム ０．０１、ｐＨ６．０。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は６５Ｌであった（１００Ｌのシード槽中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、上記振盪フラスコ中の菌糸液を植菌した。その後、温度２９±２℃、回転速度２２０ｒ／分、通気の比率１：１ ｖ／ｖ／ｍにて４０時間、培養した。菌糸の濃度は１４％であり、外観は淡黄色であった。顕微鏡観察によると、上記菌糸は濃く染まっており、太く丈夫であり、明らかに分枝および分節を有していた。

【0066】

（４）発酵槽中の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３．０、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、大豆油 ０．１、ＨＡＢＡ ０．０１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は７００Ｌであった（１，０００Ｌの発酵槽中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、滅菌した。冷却後、シード液を植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃、回転速度は２２０ｒ／分、通気の比率は１：０．８ ｖ／ｖ／ｍであった。４８時間の培養後、２４時間毎に１回、大豆油を１．０％加えた。全発酵工程中に供給された大豆油の量は、合計４％であった。発酵周期は１６８時間であった。菌糸の濃度は約３６％であり、ｐＨは７．８であり、外観は暗い黄色であった。発酵液を前処理した後、スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，２１０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0067】

〔実施例５ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0068】

（２）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0069】

（３）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０１、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％の大豆油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えた大豆油の量は、合計２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。菌糸の濃度は約３５％であり、ｐＨは８．３であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，５００ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0070】

〔実施例６ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0071】

（２）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0072】

（３）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０５、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％の大豆油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えた大豆油の量は、合計２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。菌糸の濃度は約３５％であり、ｐＨは８．０であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，２２０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0073】

〔実施例７ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、比較例１に記載の通りである。

【0074】

（２）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養は、比較例１に記載の通りである。

【0075】

（３）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０１、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％の大豆油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えた大豆油の量は、合計２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。菌糸の濃度は約３４％であり、ｐＨは８．５であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、１，６１０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0076】

〔実施例８ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、比較例２に記載の通りである。

【0077】

（２）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養は、比較例２に記載の通りである。

【0078】

（３）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０１、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％の大豆油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えた大豆油の量は、合計２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。菌糸の濃度は約３５％であり、ｐＨは８．４であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、２，２７０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0079】

〔実施例９ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0080】

（２）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0081】

（３）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０１、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％の菜種油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えた菜種油の量は、合計２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。菌糸の濃度は約３５％であり、ｐＨは８．３であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，４００ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0082】

〔実施例１０ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0083】

（２）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0084】

（３）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０１、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％の落花生油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えた落花生油の量は、合計２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。菌糸の濃度は約３８％であり、ｐＨは８．３であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，２００ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0085】

〔実施例１１ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0086】

（２）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0087】

（３）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０１、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％のオリーブ油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えたオリーブ油の量は、合計２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。菌糸の濃度は約４２％であり、ｐＨは８．２であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，２３０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0088】

〔実施例１２ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0089】

（２）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0090】

（３）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０１、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％のひまわり油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えたひまわり油の量は、合計２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。発酵液の菌糸の濃度は約４０％であり、ｐＨは８．５であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを上記発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，２１０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0091】

〔実施例１３ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0092】

（２）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0093】

（３）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ４、デキストリン ２、グルテン粉末 ２．５、大豆粉 ３、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０１、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％の大豆油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えた大豆油の量は、合計２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。発酵液の菌糸の濃度は約３７％であり、ｐＨは８．２であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを上記発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，４５０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0094】

〔実施例１４ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0095】

（２）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0096】

（３）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：デキストリン ６、グルテン粉末 ３、大豆粉 ２．５、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０１、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％の大豆油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えた大豆油の量は、合計２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。発酵液の菌糸の濃度は約３８％であり、ｐＨは８．２であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを上記発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，３３０ｕｇ／ｍＬと測定された。

【0097】

〔実施例１５ スタリマイシンの調製〕
（１）菌株ならびに斜面胞子の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0098】

（２）振盪フラスコ中のシード培養培地の調製および培養は、実施例１に記載の通りである。

【0099】

（３）振盪フラスコ中の発酵培地の調製および培養
培地の製法（％）：グルコース ６、グルテン粉末 １．５、大豆粉 ４、塩化ナトリウム ０．２５、炭酸カルシウム ０．３、リン酸二水素カリウム ０．０２、ＨＡＢＡ ０．０１、大豆油 ０．１、ｐＨ６．２。飲用水を用いて培地を調製し、充填量は５０ｍＬであった（５００ｍＬの三角フラスコ中）。上記培地を、温度１２１〜１２５℃、圧力０．１０〜０．１３ＭＰａにて３０分間、湿熱滅菌した。その後、シード液を発酵培地に植菌し、植菌量は１０％であった。培養温度は２９±２℃であり、回転速度２２０ｒ／分の攪拌機で４８時間、培養した。その後、０．５％の大豆油を、２４時間毎に加えた（全発酵工程中に加えた大豆油の量は、合計２％であった）。上記発酵培地を１６８時間培養し、瓶に入れた。発酵液の菌糸の濃度は約３２％であり、ｐＨは８．４であり、外観は暗い黄色であった。３倍量（体積）の８０％エタノールを上記発酵液に加えて、３０分間浸漬した。濾過して、濾液を回収した。スタリマイシンの力価は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、５，３９０ｕｇ／ｍＬと測定された。