特許 6417648 エタノールアミンリン酸の利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6417648

(24)【登録日】2018年10月19日

(45)【発行日】2018年11月7日

(54)【発明の名称】エタノールアミンリン酸の利用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/661 20060101AFI20181029BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20181029BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20181029BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20181029BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20181029BHJP

   A61P 19/02 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 1/00 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 1/04 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 25/00 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 25/28 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 25/14 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 25/16 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 21/00 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 3/02 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 5/48 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 3/10 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 5/38 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 13/12 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 1/18 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 17/06 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 37/08 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 37/06 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 1/02 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 27/02 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 11/00 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 9/10 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 15/08 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 1/16 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 11/02 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 11/06 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 27/06 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 21/02 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 25/18 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 25/24 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 3/06 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 9/12 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 9/04 20060101ALN20181029BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20181029BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/661

   A61P43/00 111

   A61P29/00

   A61P39/06

   A61P17/00

   A61P43/00 101

   !A61P19/02

   !A61P1/00

   !A61P1/04

   !A61P25/00 101

   !A61P25/28

   !A61P25/14

   !A61P25/16

   !A61P21/00

   !A61P3/02

   !A61P5/48

   !A61P3/10

   !A61P5/38

   !A61P13/12

   !A61P1/18

   !A61P17/06

   !A61P37/08

   !A61P37/06

   !A61P1/02

   !A61P27/02

   !A61P11/00

   !A61P9/10 101

   !A61P15/08

   !A61P1/16

   !A61P11/02

   !A61P11/06

   !A61P27/06

   !A61P9/10

   !A61P21/02

   !A61P25/18

   !A61P25/24

   !A61P3/06

   !A61P9/12

   !A61P9/04

   !A61P35/00

【請求項の数】9

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2013-158259(P2013-158259)

(22)【出願日】2013年7月30日

(65)【公開番号】特開2015-27968(P2015-27968A)

(43)【公開日】2015年2月12日

【審査請求日】2016年3月3日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003609

【氏名又は名称】株式会社豊田中央研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000110

【氏名又は名称】特許業務法人快友国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】平野 稔

【審査官】 六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０８−３１０９４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０９７９２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２１１９５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０１７１２５１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特許第５９４２９４０（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特表２００５−５１５２４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Archives of Biochemistry and Biophysics，２０１２年，522(2)，p.107-120

【文献】 ロシア国特許第８９１０５７号公報，AN:1982-90040E(WPIDS)

【文献】 笹島耕二ら，ヒト気管支上皮細胞の培養と機能（１）培養法と増殖・分化，呼吸，１９８８年，7(9)，pp.1044-1049

【文献】 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，１９８４年，81，p.5435-5439

【文献】 Journal of Cellular Physiology，１９８４年，119，p.320-326

【文献】 CHOPRA, D.P., et al.，Propagation of Differentiating NormalHuman Tracheobronchial Epithelial Cells in Serum-Free Medium，JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY，１９８７年，130，pp.173-181

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／３３−３３／４４

ＷＰＩ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

Ｊａｐｉｏ−ＧＰＧ／ＦＸ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

エタノールアミンリン酸を有効成分とする、炎症性サイトカインの抑制剤であって、
前記炎症性サイトカインは、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＡＲＥＧ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ７、ＣＣＬ２７、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１４、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ９、ＩＦＮＧ、ＩＬ１１、ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＩＬ２、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３１、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＮＯＤＡＬ、ＮＲＧ１、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＸＬＮＡ及びＶＥＧＦＡからなる群から選択される１種又は２種以上である、抑制剤。

【請求項2】

前記炎症性サイトカインは、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＡＲＥＧ、ＢＭＰ７、ＣＣＬ２７、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１４、ＧＤＦ１５、ＩＬ１１、ＩＬ１８、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３１、ＩＬ４、ＩＬ５及びＴＮＦＳＦ１５からなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１に記載の抑制剤。

【請求項3】

生体外で動物細胞にエタノールアミンリン酸を供給して炎症性サイトカインをコードする遺伝子の発現を抑制する方法であって、
前記炎症性サイトカインは、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＡＲＥＧ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ７、ＣＣＬ２７、ＣＳＦ１、ＣＸＣＬ１４、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ９、ＩＦＮＧ、ＩＬ１１、ＩＬ１８、ＩＬ１Ａ、ＩＬ２、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３１、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ７、ＮＯＤＡＬ、ＮＲＧ１、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＸＬＮＡ及びＶＥＧＦＡからなる群から選択される１種又は２種以上である、方法。

【請求項4】

エタノールアミンリン酸を有効成分とする、動物細胞のための抗酸化ストレス剤。

【請求項5】

前記動物細胞において、ＡＬＤＨ１８Ａ１、ＡＯＣ３、ＡＰＥＸ１、ＡＳＰＨ、ＢＤＨ１、ＣＡＴ、ＣＢＲ３、ＣＲＹＺ、ＣＹＢＢ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＨＴＫＤ１、ＤＩＯ２、ＧＰＸ８、ＨＴＡＴＩＰ２、ＩＤＨ１、ＩＶＤ、ＫＤＭ４Ｄ、ＬＯＸ、ＮＱＯ１、ＰＲＵＮＥ２、ＰＸＤＮＬ、ＰＹＣＲＬ、ＲＴＮ４１Ｐ１、ＳＣＯ２、ＳＤＲ１６Ｃ５、ＳＯＲＤ、ＳＴＥＡＰ３、ＴＭＥＭ１９５及びＴＸＮからなる群から選択される１種又は２種以上の遺伝子の発現を増強するための、請求項４に記載の抗酸化ストレス剤。

【請求項6】

ＮＱＯ１、ＣＡＴ及びＴＸＮからなる群から選択される１種又は２種以上の遺伝子の発現を増強するための、請求項５に記載の抗酸化ストレス剤。

【請求項7】

生体外で動物細胞にエタノールアミンリン酸を供給して酸化ストレスを抑制する方法。

【請求項8】

エタノールアミンリン酸を有効成分とする、上皮細胞のバリア機能向上剤（ただし、血清及び増殖因子の非存在下での使用を除く）。

【請求項9】

エタノールアミンリン酸を有効成分とする、上皮細胞の損傷に起因するアレルギーの予防又は治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書は、エタノールアミンリン酸の利用に関する。

【背景技術】

【0002】

エタノールアミンリン酸（Ethanolamine phosphate、以下、単にＥＰという。）は、エタノールアミンやホスホグリセロールエタノールアミンとともに動物の生体膜などにおいて広く存在している。また、ＥＰは、細胞膜の主要成分であるホスファチジルコリン（レシチン）および神経組織に多く存在するホスファチジルエタノールアミンなど細胞に必須なリン脂質の前駆体であることが知られている。

【0003】

一方、ＥＰやエタノールアミンは、細胞成長因子の増強剤として培地に添加できることが知られている（特許文献１、２、３）。また、ＥＰは、アセトアルデヒド脱水素酵素活性を増強する活性成分であり二日酔いなどの肝臓系疾患や腸粘膜障害に有用であることも知られている（特許文献４、５、６）。さらに、うつ病のバイオマーカーである可能性があることが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開平６−７８７５９号公報

【特許文献2】特表平４−５０１６６０号公報

【特許文献3】特表２０００−５０６３７４号公報

【特許文献4】特開２００２−１０４９６１号公報

【特許文献5】特開平８−３１０９９４号公報

【特許文献6】国際公開第９９／３９７０３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ＥＰの作用は、以上のように多様である。しかしながら、ＥＰの作用は、未だ全てが明らかになっているわけではない。また、ＥＰが細胞に作用するとき、いかなる遺伝子の発現を促進しあるいは抑制しているかは全く知られていない。ＥＰによる作用発現に関連する遺伝子を明らかにすることで、ＥＰの有用機能の探索や新たなＥＰの用途の提供や、ＥＰの作用を増強しあるいは細胞に対するＥＰ様に作用する化合物の探索が可能となる。

【0006】

本明細書は、ＥＰの作用に関連する遺伝子の発現レベルを明らかにするとともに、ＥＰの作用をさらに明らかにすることにより、新たなＥＰの利用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、ＥＰを細胞に投与した際に、ＥＰが細胞にもたらす新たな作用を見出すとともに、ＥＰによる発現が促進又は抑制される遺伝子を解析した。遺伝子発現解析によれば、特定の遺伝子群の発現促進と特定遺伝子群の発現抑制を確認できた。さらに、新たな作用を見出した。こうした知見に基づき以下の手段を提供する。

【0008】

（１）エタノールアミンリン酸を有効成分とする、炎症性サイトカインカインの抑制剤。
（２）エタノールアミンリン酸を有効成分とする、抗炎症剤。
（３）エタノールアミンリン酸を有効成分とする、抗酸化剤。
（４）エタノールアミンリン酸を有効成分とする、炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
（５）遺伝子の発現方法であって、ＥＰを動物細胞に投与することにより、以下に示す第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を促進し、以下に示す第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を抑制する、発現方法。
（第１の遺伝子群）

【0009】

【表1】

【0010】

【表2】

【0011】

【表3】

【0012】

（第２の遺伝子群）

【表4】

【0013】

【表5】

【0014】

【表6】

【0015】

（６）ＥＰに対する動物細胞の反応性を評価する方法であって、
ＥＰを動物細胞に投与する工程と、
ＥＰを投与した前記動物細胞における（５）に記載の第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベル及び／又は（５）に記載の第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
前記工程で得た１又は２以上の遺伝子の発現レベルに基づいて、ＥＰに対する前記動物細胞の反応性を評価する工程と、
を備える、方法。
（７）ＥＰの作用を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
動物細胞に対してＥＰと１又は２以上の試験化合物とを投与する工程と、
前記動物細胞における（５）に記載の第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベル及び／又は（５）に記載の第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
前記測定工程で得た１又は２以上の遺伝子の発現レベルに基づいて、前記１又は２以上の試験化合物のＥＰの作用に対する抑制作用又は増強作用を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
（８）（５）に記載の第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現産物及び当該遺伝子の発現を促進する化合物、並びに、
（５）に記載の第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現産物に対して抑制的に作用する化合物及び発現を抑制する化合物
からなる群から選択される１又は２以上の試験化合物を動物細胞に投与する工程と、
前記動物細胞の１又は２以上の細胞機能を測定する工程と、
を、備える、ＥＰ様化合物のスクリーニング方法。
（９）（５）に記載の第１の遺伝子群から選択される複数の遺伝子プローブを固定化した第１の領域と、（５）に記載の第２の遺伝子群から選択される複数の構成遺伝子をそれぞれ固定化した第２の領域と、を備える、ＥＰの作用の調節剤のスクリーニング用固相担体。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】異なるＦＢＳ濃度下における株化正常ヒト気道上皮細胞に対するＥＰの増殖効果を示す図であり、左図は、絶対値で表し、右図は、コントロールに対する比で表す。

【図2】無血清時における細胞画像を示す図であり、左図は、ＥＰ０μＭの場合であり、右図は、ＥＰ１０００μＭの場合である。

【図3】初代ヒト気道上皮細胞に対するＥＰの増殖作用を示す図である。

【図4】初代ヒト肺線維芽細胞におけるＥＰの増殖作用を示す図である。

【図5】初代ヒト毛乳頭細胞に対するＥＰの増殖作用を示す図である。

【図6】初代ヒト毛乳頭細胞に対するＥＰ及びミノキシジルの増殖作用を示す図である。

【図7】がん細胞（Ａ５４９、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０）及びモデル細胞（ＨＥＫ２９３）におけるＥＰの増殖作用を示す図である。

【図8】ＥＰによる細胞増殖効果のＭＥＫ１／２阻害薬による抑制を示す図である。

【図9】ＥＰ及びその代謝誘導体からの細胞構成成分に至る代謝マップを示す図である。

【図10】ＥＰ及びその代謝誘導体による細胞増殖／毒性効果を示す図である。

【図11】ＧＡＢＡ受容体作動薬の細胞増殖抑制効果の確認結果を示す図である。左図はＧＡＢＡによる結果を示し、右図はホモタウリンによる結果を示す。

【図12】ＧＡＢＡ受容体拮抗薬の細胞増殖抑制効果の確認結果を示す図である。

【図13】ＦＢＳ及びＥＰによる、無血清ストレス誘導カスパーゼ３／７活性上昇の阻害効果確認結果を示す図である。

【図14】ＥＰによる株化正常気道上皮細胞のバリア機能促進効果の確認結果を示す図である。

【図15】ヒト気道上皮細胞がん細胞株Calu-3（左図）及びヒト正常初代ケラチノサイトＨＥＫａ（右図）に対するＥＰのバリア機能向上効果の確認結果を示す図である。

【図16】ＥＰにより２倍以上発現減少したアポトーシス関連遺伝子のＨ₂Ｏ₂処理サンプルとの比較を示すボックスプロットである。

【図17】全アポトーシス関連プローブのＥＰ及びＨ₂Ｏ₂処理による発現比の散布図である。

【図18】ＥＰにより２倍以上発現減少した酸化還元関連遺伝子のＨ₂Ｏ₂処理サンプルとの比較を示すボックスプロットである。

【図19】酸化還元遺伝子関連プローブのＥＰ及びＨ₂Ｏ₂処理による発現比の散布図である。

【図20】ＥＰにより有意に発現変化した遺伝子の数（１．５倍以上あるいは１／１．５倍以下、ｐ＜０．０５）

【図21】ＥＰ前処理有無による過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）による細胞毒性を示す図である。

【図22】ＥＬＩＳＡ法を用いた各ＥＰ濃度前処理によるＴＨＰ−１から分泌されたＬＰＳ誘導ＴＮＦ−αの定量結果を示す図である。

【図23】ＥＬＩＳＡ法を用いた各ＥＰ濃度前処理によるＴＨＰ−１から分泌されたＬＰＳ誘導ＩＬ−８の定量結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本明細書は、種々の細胞活性化作用を有するＥＰの作用に関連する遺伝子の発現レベルを明らかにすることにするとともに、ＥＰの新たな利用を提供する。

【0018】

本明細書は、ＥＰを細胞に投与した際の細胞に対する作用及び当該作用の起因となる遺伝子群の発現促進と発現抑制に関する。本発明者によれば、ＥＰの新たな作用に関する知見とこれらの遺伝子の発現状況とに関する知見により、ＥＰによる遺伝子の発現制御、ＥＰ様化合物やＥＰ作用増強剤、ＥＰとの合剤成分などのスクリーニング方法を提供できる、また、ＥＰの作用に関連する遺伝子の発現解析に用いるための固相担体も提供される。

【0019】

さらに、ＥＰは、動物細胞の機能増強、例えば、細胞増殖、アポトーシス抑制、バリア機能向上など多種にわたる機能を有している。また、毛髪育成作用も有している。さらに、炎症性サイトカインの抑制作用、抗炎症作用及び抗酸化作用を有している。

【0020】

以下、本明細書の開示について詳細に説明する。

【0021】

（遺伝子の発現方法）
本明細書に開示される遺伝子の発現方法は、ＥＰを動物細胞に投与することにより、第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を促進し、第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を抑制する工程を備えることができる。本方法によれば、動物細胞に対するＥＰの投与により、動物細胞に対して特定の遺伝子の発現状況を構築できる。この遺伝子の発現状況は、動物細胞の機能増強に関与している。したがって、本発現方法は、こうした遺伝子の発現状況を呈する動物細胞の製造方法でもある。

【0022】

動物細胞としては、特に限定しないで、ヒト及び非ヒト動物の細胞が挙げられる。細胞の種類も特に限定されない。動物細胞は初代であっても株化細胞であってもよい。また、由来も特に限定されないが、肺、気道、表皮に由来する細胞が挙げられる。また、細胞形態として、上皮細胞であってもよいし、線維芽細胞などの結合組織の細胞であってもよい。さらに、動物細胞は、ＥＳ細胞ほか、体細胞から人工的に誘導された万能細胞（ｉＰＳ細胞）であってもよいし、こうした細胞から分化させた細胞であってもよい。また、動物細胞は、組織又は器官又はその一部を構成していてもよい。

【0023】

動物細胞としては、なかでも、気道上皮細胞、肺線維芽細胞、角質上皮細胞及び毛乳頭細胞がＥＰによる細胞増殖対象として好ましく挙げられる。これらの細胞は、初代細胞であっても株化細胞であってもよい。また、動物細胞は、動物個体から採取された動物細胞とすることができる。

【0024】

動物細胞にＥＰを投与する方法は特に限定されない。動物細胞がＥＰを接触するようにすればよい。典型的には、ＥＰを含有する培地において動物細胞を培養する態様が挙げられる。

【0025】

動物細胞にＥＰを投与して全ヒトゲノムを対象とした発現解析において１．５倍以上あるいは１／１．５倍以下（ｐ＜０．０５）に変化した遺伝子（プローブ）はそれぞれ８０１個及び１９３９個であった。これらの遺伝子につき、機能解析（ＧＯ解析）した結果を以下の表７及び表８に示す。表７は、発現上昇した遺伝子の機能の抽出結果のうち上位２０種であり、表８は、発現減少した遺伝子の機能の抽出結果であり上位２０種である。なお、発現解析には、専用解析ソフトＧｅｎｅ ｓＳｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いた。

【0026】

（ＥＰにより有意に発現上昇した遺伝子の機能の分類、上位２０種、ｐ値に基づく順位）

【表7】

【0027】

（ＥＰにより有意に発現減少した遺伝子の機能の分類、上位２０種、ｐ値に基づく順位）

【表8】

【0028】

表７に示すように、ＥＰの投与により発現が上昇する遺伝子は、細胞増殖に関連するものとして血管形成や分化に関与する遺伝子機能（ＧＯ:0001568、0048514、0001944）が存在していた。

【0029】

また、表８に示すように、ＥＰの投与により発現が減少する遺伝子は、細胞死、アポトーシスに関連する遺伝子機能（ＧＯ：0042981、0043067、0043070、0010941、0006917、0012502、0012503、0043065、0043068、0043071、0010942、0006915）が存在していた。

【0030】

表７に示すＧＯ解析によって得られた機能分子のうち、機能分子（Ｇ：0001944）としての遺伝子（２９プローブ、２０遺伝子）を表９に示す。また、ＧＯ解析によれば、上位２０位に含まれないが、細胞増殖（ＧＯ:0008283）に関与する遺伝子のうち発現上昇１．５倍以上（ｐ＜０．０５）を満たす遺伝子（１６プローブ、１２遺伝子）を表１０に示す。

【0031】

（ＥＰにより有意に発現上昇した増殖関連遺伝子（血管形成関連遺伝子ＧＯ：0001944）

【表9】

【0032】

（ＥＰにより有意に発現上昇した増殖関連遺伝子（細胞増殖関連遺伝子ＧＯ：0008283）

【表10】

【0033】

（ＥＰにより有意に発現減少したアポトーシス関連遺伝子（アポトーシス制御関連遺伝子ＧＯ：0042981）のうちアポトーシス促進作用を有する遺伝子

【表11】

【0034】

（ＥＰにより有意に発現減少したアポトーシス関連遺伝子（アポトーシス制御関連遺伝子ＧＯ：0042981）のうちアポトーシス促進作用を有する遺伝子

【表12】

【0035】

（ＥＰにより有意に発現減少したアポトーシス関連遺伝子（アポトーシス制御関連遺伝子ＧＯ：0042981）のうちアポトーシス促進作用を有する遺伝子

【表13】

【0036】

（ＥＰにより有意に発現上昇したアポトーシス制御遺伝子（アポトーシス制御関連遺伝子ＧＯ：0042981）のうちアポトーシス抑制作用を有する遺伝子

【表14】

【0037】

（ＥＰにより有意に発現減少したサイトカイン又はケモカイン関連遺伝子

【表15】

【0038】

（第１の遺伝子群）
第１の遺伝子群は、ＥＰを動物細胞に投与することにより、その発現が促進される遺伝子からなる。こうした遺伝子としては、表９、表１０及び表１４に示す遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、ＥＰによる特有の作用の発現に関連があると考えられる。第１の遺伝子群は、好ましくは表９に示す遺伝子群からなる。また、好ましくは表１４に示す遺伝子からなる。

【0039】

（第２の遺伝子群）
第２の遺伝子群は、ＥＰを動物細胞に投与することにより、その発現が抑制される遺伝子からなる、こうした遺伝子としては、表１１〜表１３及び表１５に示す遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、ＥＰによる特有の作用の発現に関連があると考えられる。第２の遺伝子群は、好ましくは表１１〜１３に示す遺伝子からなる。また、第２の遺伝子群は、好ましくは表１５に示す遺伝子からなる。

【0040】

こうした遺伝子の発現の確認は、通常のヒト全ゲノム遺伝子についてのプローブを備えるアレイ等を用いた発現解析手法を用いてもよいし、特定の遺伝子を標的とした発現解析を行ってもよい。アレイ等や必要な試薬は、商業的に入手できるほか、網羅的な遺伝子発現解析や特定遺伝子に関する発現解析は、周知技術であり、当業者であれば適切に実施することができる。

【0041】

（ＥＰによる遺伝子発現評価用の固相担体）
ＥＰ投与による動物細胞における特定遺伝子の発現状況の確認は、好ましくは、第１の遺伝子群から選択される１又は２以上遺伝子を検出するための１又は２以上のプローブを固定化した第１の領域と、第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子を検出するための１又は２以上のプローブを固定化した第２の領域と、を備える、固相担体を用い行うことが好ましい。

【0042】

この固相担体によれば、第１の遺伝子群に属する遺伝子検出用のプローブと第２の遺伝子群に属する遺伝子検出用のプローブとが担体上の異なる位置に保持されているため、検出判定が容易になっている。なお、こうしたプローブを固定化した固相単体は、いわゆるサンプルＤＮＡを含んだ溶液に固相担体を浸漬してプローブとサンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行うものであってもよいし、こうした溶液を固相担体上を展開させてサンプルＤＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションを行うものであってもよい。ハイブリダイゼーションの形態に応じて、適宜固相担体の材料が選択されるほか、プローブを固定する配置も適宜選択される。さらに、ハイブリダイズ産物の検出についても、蛍光色素を用いるのみならず、目視にて視認可能な標識を用いることができる。細胞等から抽出したＲＮＡやＤＮＡに由来するＤＮＡサンプルと特定遺伝子を検出するプローブとのハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、当業者であれば、周知技術に基づいて、第１の遺伝子群及び第２の遺伝子群で特定される遺伝子を検出するため固相担体を作製することができる。

【0043】

この種の固相担体は、また、本明細書に開示される発現方法のほか、ＥＰの作用の調節剤のスクリーニング用固相担体、ＥＰに対する動物細胞の反応性の評価方法、ＥＰ様化合物のスクリーニング方法等にも利用できる。

【0044】

本方法によれば、ＥＰを動物細胞に投与することにより、特定の遺伝子群の発現を促進及び／又は抑制できる。こうした発現の動物細胞を得ることにより、細胞機能が増強した細胞を創出して、こうした細胞のさらなる機能や用途を開発するのに用いることができる。

【0045】

本方法によれば、特定の動物個体に由来する自家細胞である動物細胞（体細胞等）、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞にＥＰを投与して動物細胞の機能強化（バリア機能向上、アポトーシスの抑制）や細胞増殖を図って、それを自家に移植するための増殖細胞としてもよい。必要に応じて分化させてもよい。なお、こうした細胞、特に体細胞や分化させた細胞は、特定の３次元形態（シート、管状体等）の細胞構造体であってもよい。移植部位は、動物個体における状態に応じて、例えば欠損部位や損傷部位など、適宜決定される。自家移植は、皮膚、軟骨、骨、神経組織、肝臓等の各種臓器等が挙げられる。細胞を各種用途（発酵、医療（補綴や移植を含む）、薬剤、）に用いる場合において、細胞を増殖等させるのに有用である。

【0046】

（ＥＰに対する動物細胞の反応性の評価方法）
本明細書に開示されるＥＰに対する動物細胞の反応性の評価方法は、ＥＰを動物細胞に投与する工程と、ＥＰを投与した前記動物細胞における第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベル及び／又は第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程と、前記工程で得た１又は２以上の遺伝子の発現レベルに基づいて、ＥＰに対する前記動物細胞の反応性を評価する工程と、を備えることができる。

【0047】

本方法によれば。ＥＰを動物細胞に投与することにより、その動物細胞に対するＥＰの反応性を評価して、効果的に、ＥＰ投与により細胞の増殖能、バリア機能性、アポトーシスの抑制を強化できる細胞を選択することができる。動物細胞、動物細胞へのＥＰの投与、第１の遺伝子群及び第２の遺伝子群及びその検出については、既に本発現方法に関して説明した態様をそのまま本方法にも適用できる。

【0048】

反応性の評価にあたっては、第１の遺伝子群に属する遺伝子に対する一定以上の発現上昇を確認できた遺伝子数（比率）、発現上昇を確認できた遺伝子の発現強度が挙げられる。こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が大きいほど、ＥＰに対する高感度の反応性を肯定することができる。反対に、こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が低いほど、ＥＰに対する低感度の反応性を肯定できる。

【0049】

同様に、反応性の評価にあたっては、第２の遺伝子群に属する遺伝子に関する一定以上の発現減少を確認できた遺伝子数（比率）、発現減少を確認できた遺伝子の発現強度の低さが挙げられる。こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度の低さが大きいほど、ＥＰに関する高感度の反応性を肯定することができる。反対に、こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が低いほど、ＥＰに対する低感度の反応性を肯定できる。

【0050】

（ＥＰの作用を調節する化合物のスクリーニング方法）
本明細書に開示されるＥＰの作用を調節する化合物のスクリーニング方法は、動物細胞に対してＥＰと１又は２以上の試験化合物とを投与する工程と、前記動物細胞における第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベル及び／又は第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程と、前記測定工程で得た１又は２以上の遺伝子の発現レベルに基づいて、前記１又は２以上の試験化合物のＥＰの作用に対する抑制作用又は増強作用を評価する工程と、を備えることができる。

【0051】

本スクリーニング方法によれば、ＥＰの細胞機能増強作用をさらに増強するあるいは抑制する化合物をスクリーニングすることができる。こうした化合物を取得することで、ＥＰとともに用いて一層細胞機能を増強できる化合物を提供できる。また、ＥＰとともに用いるとＥＰの細胞機能増強作用を低下させてしまう化合物を特定して、こうした化合物を回避できる。なお、動物細胞、動物細胞へのＥＰの投与、第１の遺伝子群及び第２の遺伝子群及びその検出については、既に本発現方法に関して説明した態様をそのまま本方法にも適用できる。

【0052】

試験化合物としては、ホルモンやサイトカインカインなどのほか脂質を含む生体膜成分を含む低分子有機化合物のほか、ペプチド、タンパク質、糖類、ＤＮＡ、ＲＮＡ等、あるいはこれらの複合体など高分子有機化合物であってもよい。金属塩などの各種の無機塩類を含む無機化合物等であってもよい。試験化合物とＥＰとを動物細胞に投与する方法は特に限定されない。典型的には、試験化合物とＥＰとを含む培地で動物細胞を培養すること等が挙げられる。なお、被験化合物は典型的には、動物細胞の培地に一時的に、継続的に、あるいは断続的に供給することができる。

【0053】

ＥＰの作用に対する増強作用の評価にあたっては、第１の遺伝子群に属する遺伝子に関する一定以上の発現上昇を確認できた遺伝子数（比率）、発現上昇を確認できた遺伝子の発現強度が挙げられる。こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が大きいほど、ＥＰの作用に対する増強作用を肯定することができる。反対に、こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が低いほど、ＥＰの作用に対する抑制作用を肯定できる。

【0054】

同様に、ＥＰの作用に対する増強作用の評価にあたっては、第２の遺伝子群に属する遺伝子に関する一定以上の発現減少を確認できた遺伝子数（比率）、発現減少を確認できた遺伝子の発現強度の低さが挙げられる。こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度の低さが大きいほど、ＥＰの作用に対する増強作用を肯定することができる。反対に、こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が低いほど、ＥＰの作用に対する抑制作用を肯定できる。

【0055】

（ＥＰ様化合物のスクリーニング方法）
本明細書に開示されるＥＰ様化合物のスクリーニング方法は、第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現産物及び当該遺伝子の発現を促進する化合物、並びに、
以下に示す第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現産物に対して抑制的に作用する化合物及び発現を抑制する化合物
からなる群から選択される１又は２以上の試験化合物を動物細胞に投与する工程と、
前記動物細胞の１又は２以上の細胞機能を測定する工程と、
を、備えることができる。

【0056】

本スクリーニング方法によれば、ＥＰの作用に関連する遺伝子の発現産物やその発現促進化合物、発現産物に対して抑制的に作用する化合物、遺伝子発現抑制化合物からなる群から試験化合物を選択し細胞に投与して細胞機能を評価することで、ＥＰの作用の少なくとも一部を実現する化合物を効率的にスクリーニングできる。

【0057】

遺伝子の発現産物としては、ＲＮＡ、タンパク質が挙げられる。また、その発現促進化合物といては、転写因子や転写因子を活性化する化合物等が挙げられる。発現産物に対して抑制的に作用する化合物としては、例えば、発現産物であるｍＲＮＡを消化するｓｉＲＮＡ等や発現産物であるタンパク質と拮抗するタンパク質等が挙げられる。遺伝子発現抑制化合物としては、ｓｉＲＮＡほか、ノックアウトのためのコンストラクト等が挙げられる。こうした化合物の投与方法は、その化合物の種類に応じて適宜決定される。例えば、タンパク質の場合には、細胞に導入する当該タンパク質の発現コンストラクトとして投与する必要がある。また、ｓｉＲＮＡの場合には、ｓｉＲＮＡコンストラクトを細胞内に導入してもよいし、ｓｉＲＮＡ自体を細胞に導入するようにしてもよい。低分子有機化合物等動物の細胞膜を透過する化合物の場合には、培地に添加してもよい。

【0058】

細胞機能の評価は、以下に示す、ＥＰが動物細胞機能増強剤として使用される場合の機能に基づいて評価することができる。すなわち、作用の評価は、細胞の種類や被験化合物の種類や作用の種類によって種々に異なるが、当業者であれば、評価の目的に応じて適宜設定することができる。

【0059】

（動物細胞機能増強剤）
ＥＰは、動物細胞機能増強剤の有効成分として用いることができる。ＥＰは、またそのリン酸基においてナトリウム、カリウムなどの一価の金属イオン、カルシウム、マグネシウムなどの二価の金属イオン等との塩を形成するリン酸イオンの形態であってもよい。

【0060】

ＥＰの作用は、動物細胞、特には、ヒトを含む哺乳類動物細胞に有効である。また、こうしたＥＰの作用に基づけば、ＥＰはそれ自体、外用のほか、血管等の脈管経由による投与、経口投与、注入や注射による投与のほか、各種投与形態において、動物細胞に対して各種作用を発現するものである。

【0061】

（細胞増殖機能）
細胞機能増強剤が増強する動物細胞の一つの機能としては、細胞増殖機能が挙げられる。ＥＰの細胞増殖機能の一つの特徴は、血清又は各種成長因子などの増殖因子の存在下での細胞増殖のほか、血清及び増殖因子の非存在下であってもＥＰは動物細胞の増殖を確保することができることが挙げられる。換言すれば、糖などの炭素源と無機塩のみを含む基本培地にＥＰを添加することで動物細胞の増殖を確保することができる。これらの作用は、ＥＰの代謝経路の類縁化合物であるエタノールアミン、ホスホリルコリン、ＣＤＰ−コリン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミンでは得られない作用である。

【0062】

なお、ここで血清とは、動物の血液由来であれば特に限定されないが、典型的には、牛胎児、牛新生児、仔牛、成牛などのウシ、ヤギ、ニワトリ及びブタなどの各種動物の血液由来の血清が挙げられる。増殖因子も、特に限定されないで、公知の細胞増殖にもちいられうる内因性タンパク質が挙げられる。典型的には、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等が挙げられる。

【0063】

細胞機能増強剤の他の一つの特徴は、異形細胞よりも正常細胞の増殖を選択的に促進することが挙げられる。がん細胞などの異形細胞よりも正常細胞に対して選択的に増殖機能を発揮することで、特に、生体に適用した場合において、異形細胞の増殖促進に基づく悪影響がないこと及び正常細胞を増殖させることが治療上や予防上の意義が大きい疾患（例えば、各種のがんが挙げられる。また、創傷治癒が必要な疾患が挙げられる。）において有意義である。

【0064】

なお、異形細胞としては、正常細胞で通常観察される細胞形態から隔たっている細胞を意味している。典型的には、被験細胞を光学顕微鏡を使って観察した場合に、形態が正常から隔たっている細胞を意味している。ここで正常細胞とは、細胞の種類によって異なるが例えば核の大きさ等などによる評価によって決定されうる。また、異形細胞が有する正常細胞からの隔たりも細胞種類によっても異なるが、典型的には、がん細胞等が挙げられる。

【0065】

ＥＰを細胞増殖剤として用いるとき、細胞増殖機能が発揮される範囲で添加されればよいが、例えば、１００ｎＭ以上１０ｍＭ以下、好ましくは１μＭ以上１ｍＭ以下、より好ましくは１０μＭ以上１ｍＭ以下の範囲で培地等に含めることができる。

【0066】

（バリア機能促進機能）
細胞機能増強剤が増強する動物細胞の他の一つの機能としては、上皮系細胞のバリア機能促進機能が挙げられる。上皮細胞は、生体からのバリア機能を達成する組織を構成する細胞であり、上皮系細胞とは、分化により上皮細胞としてのバリア機能を発揮する細胞を意味している。上皮系細胞のバリア機能を増強することで、有害物質やアレルゲンの進入を抑制できる上皮細胞及び組織を作製できる。なお、ＥＰは、上皮系細胞の細胞増殖機能も有していることから、効果的にこうした組織や細胞集団を構築できる。ＥＰをバリア機能促進剤として用いるときは、バリア機能を促進できる範囲であれば特に限定されないが、例えば、ＥＰを細胞増殖剤として用いるのと同様の濃度で培地等に含めることができる。

【0067】

本明細書におけるバリア機能とは、より具体的には、外界からの非特異的な高分子及び刺激性の低分子の侵入に対する侵入防止機構を意味している。生体の上皮は、異物侵入を抑制するために、上皮細胞間にタイトジャンクションと呼ばれる密接結合のための構造体を形成して隣接する細胞間（細胞間隙）の分子の移動を抑制している。本明細書におけるバリア機能とはより具体的にこうした異物侵入の抑制促進作用、換言すればタイトジャンクションの強度向上作用を意味している。こうしたバリア機能は、すなわち、タイトジャンクションの強度は、細胞シート上下の経上皮電気抵抗（transepthelial electrical resistance; TRT）により評価される。また、そのタイトジャンクションの強度の上昇はデキストラン等の高分子の細胞シート間の透過速度の低下により評価される。

【0068】

（アポトーシス抑制機能）
細胞機能増強剤が増強する動物細胞の他の一つの機能は、アポトーシス抑制機能である。アポトーシス抑制機能を発揮することで、細胞の増殖や機能を発揮させることができる。なお、既に説明したように、ＥＰは、正常細胞の増殖機能を担っているので、アポトーシス抑制機能は、正常細胞のアポトーシス抑制機能であるといえる。アポトーシス抑制剤として用いるときは、アポトーシス抑制機能を促進できる範囲であれば特に限定されないが、例えば、ＥＰを細胞増殖剤として用いるのと同程度の濃度で培地等に含めることができる。

【0069】

（培養細胞構造体の作製剤）
ＥＰは、上皮細胞のほか線維芽細胞の細胞増殖機能を有していること、及びバリア機能促進機能を有していることから、上皮細胞、線維芽細胞、及びこれらの二つの細胞を増殖させて形成する各種の培養細胞構造体の作製剤として有用である。例えば、皮膚代替物となる細胞シートを始めとする各種形態の培養細胞構造体が挙げられる。培養細胞構造体の形態は特に限定されない。細胞構造体の形態は特に限定されないで、細胞構造体の用途や適用する組織や臓器形態に応じて適宜選択される。例えば、シート状、棒状、管状等、球形状等が挙げられる。また、培養細胞構造体の作製方法自体は、当業者において周知であり、ＥＰの有効量を培養細胞構造体を培養する培地に含有させることにより、ＥＰを培養細胞構造体の作製剤として利用できる。培養細胞構造体の作製剤として用いるときは、細胞増殖機能及びバリア機能を促進できる範囲であれば特に限定されないが、例えば、ＥＰを細胞増殖剤として用いるのと同程度の濃度で培地等に含めることができる。

【0070】

（毛髪育成剤）
ＥＰは、毛髪育成剤としても利用できる。ＥＰは、毛乳頭細胞の増殖効果を有している。毛乳頭細胞の増殖は、毛髪の育成効果を意味している。したがって、ＥＰを有効成分として含む、頭皮などを含む各種の皮膚に適用する外用の毛髪育成剤が提供される。毛髪育成剤としての形態は特に限定されないで、公知の頭皮や皮膚に適用される外用剤の形態が採用可能である。例えば、ローション、クリーム、エッセンス、シャンプー、リンス等が挙げられる。ＥＰは、毛髪育成作用がある範囲で含まれればよく、例えば、０．０００００１質量％以上１質量％の範囲で含めることができる。好ましくは０．０００１質量％以上０．１質量％以下である。また、外用剤としての用法・用量も特に限定されないが、例えば、１回以上３回以下／日を外用で用いることができる。

【0071】

（サイトカインカインの抑制剤及び抗炎症剤）
ＥＰは、サイトカインの抑制剤としても利用できる。ＥＰを細胞に投与することで、サイトカイン及びケモカインをコードする遺伝子の発現の抑制を確認できている。ＥＰ投与による発現が減少しているサイトカイン及びケモカインについては、既に表９に示した。これらのサイトカイン及びケモカインは、いずれも炎症性サイトカインである。また、後述する実施例においても示すように、ＬＰＳ刺激を付与した動物細胞においては、ＩＬ−８及びＴＮＦ−αの誘導が明らかに抑制されていた。したがって、ＥＰは、サイトカイン、より具体的には、炎症性サイトカインの抑制剤である。炎症性サイトカイン（炎症誘発性サイトカイン）としては、ＡＲＥＧ、ＢＭＰ７、ＣＣＬ２７、ＣＳＦ１，ＣＸＣＬ１４、ＧＤＦ１５、ＩＬ１１、ＩＬ１８、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３１、ＩＬ４、ＩＬ５、ＴＮＦＳＦ１５、ＶＥＧＦＡ等が挙げられる。

【0072】

ＥＰは、抗炎症剤としても利用できる。すなわち、ＥＰは、炎症反応に起因する炎症性疾患の予防又は治療用組成物として用いることができる。既に記載したように、ＥＰは炎症性サイトカインをコードする遺伝子の発現を抑制し、ＬＰＳ刺激を付与した動物細胞において炎症性サイトカインであるＩＬ−８及びＴＮＦ−αの誘導を抑制する（Singhらの方法による）。これらのＥＰの抗炎症性の評価は、マクロファージのモデル細胞として長く研究の対象とされてきた細胞株であるヒト単球様培養細胞THP-1を用いて行っている。この細胞株は、近年h-CLATと呼ばれるアレルギー誘発物質の判定においても、その有用性が認められている（Toxicol In Vitro, 2006 Aug; 20 (5):763-73）。また本細胞株は、動物個体を使わない抗炎症作用のある化合物や食品評価に応用できることがSingh（Clin Chem. 2005 Dec;51 (12):2252-6）らによって示されている。

【0073】

炎症性疾患としては、例えば、多臓器（例えば、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）および強皮症など）、特定の組織または臓器（例えば、筋骨格組織（関節リウマチ、強直性脊椎炎））、消化管（クローン病および潰瘍性大腸炎）、中枢神経系（アルツハイマー病、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、パーキンソン病、および慢性疲労症候群）、膵β細胞（インスリン依存性糖尿病）、副腎（アジソン病）、腎臓（グッドパスチャー症候群、ＩｇＡ腎症、間質性腎炎）、外分泌腺（シェーグレン症候群および自己免疫性膵炎）、および皮膚（乾癬およびアトピー性皮膚炎）に関連する自己免疫疾患；慢性炎症性疾患（例えば、変形性関節症、歯周病、糖尿病性腎症、糖尿病性潰瘍、網膜症、慢性閉塞性肺疾患、動脈硬化症、移植片対宿主病、慢性骨盤内炎症性疾患、子宮内膜症、慢性肝炎、および結核など）；ＩｇＥ媒介性（Ｉ型）過敏症（例えば、鼻炎、喘息、アナフィラキシー、皮膚炎、および眼の疾患など）を含むが、これらに限られない、炎症性疾患を治療するのに用いられ得る。皮膚炎の病状としては、光線性角化症、酒さ性ざ瘡、尋常性ざ瘡、アレルギー性接触皮膚炎、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、皮膚薬剤反応、多形性紅斑、紅斑性狼瘡、光線皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、強皮症、および蕁麻疹が挙げられる。眼の症状としては、加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、ドライアイ、ブドウ膜炎、および緑内障が挙げられる。

【0074】

ＥＰは、炎症性疾患に用いられる公知の抗炎症剤、抗生物質等から選択される別の治療剤もまた投与される場合又はこれらの治療剤と組み合わせて投与される場合に、本発明に従って用いることができる。

【0075】

ＥＰの炎症性疾患の予防又は治療用組成物としての使用に際しては、任意の適切な投与経路を用いることができる。例えば、経口、局所的、非経口、眼内、直腸、膣内、吸入、口腔、舌下、および鼻腔内の送達経路のいずれもが、適切となり得る。この目的のために、適切な医薬組成物を用いることができる。

【0076】

有効成分を含む医薬組成物は、経口使用に適する形態、例えば錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性の散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬質もしくは軟質カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤であって良い。組成物は、即時放出形態または制御放出形態であって良い。

【0077】

なお、経口使用を意図する組成物は、医薬組成物の製造のための、当業者に知られている任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は、甘味剤、矯味剤、着色剤、および保存剤からなる群より選択される１以上の物質を含み得るものであり、これらは当業者であれば適宜組み合わせて用いることができる。

【0078】

その他、ＥＰを有効成分とする水性懸濁液、油性懸濁液、散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬質もしくは軟質カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤等の公知の製剤形態を、当業者は適宜必要な添加剤を選択して製造することができる。

【0079】

ＥＰは、坐剤として製剤化されてもよいし、局所使用のためのクリーム、軟膏、ゼリー、溶液、または懸濁剤などとして製剤化されてもよい。局所適用には、洗口液および含嗽剤が含まれる。

【0080】

ＥＰの有効な投与量は、治療される個体及び投与方法により変化するものである。例えば、ヒトの経口投与を意図される製剤は、組成物の総量の約１〜約９９％の間で変化し得る。例えば、投与単位形態は一般的に、約１ｍｇ〜約１ｍｇの活性成分を含む。任意の個体についてのＥＰの投与レベルは、個体の年齢、体重、一般的健康状態、性別、投与に関連する食事時間(diet time of administration)、投与経路、排泄速度、薬物の組合せ、および治療を受ける特定の疾患の重篤度を含む様々な因子に因ることが理解されるであろう。

【0081】

（抗酸化剤又は抗酸化ストレス剤）
また、ＥＰは、酸化に対する細胞の抵抗性を高める。このため、ＥＰは、抗酸化ストレス剤としても利用できる。すなわち、生体における酸化に起因する疾患の予防又は治療剤として用いることができる。ＥＰを細胞に投与すると、抗酸化物質であるチオレドキシン（ＴＸＮ）や過酸化水素分解酵素（ＣＡＴ）の発現上昇が認められたこと、並びに後述する実施例でも説明するように、過酸化水素による細胞毒性を低減することがわかった。以上のことから、ＥＰは、細胞に対して酸化ストレスに抵抗性を付与できる。

【0082】

酸化や酸化ストレスに起因する疾患としては、アテローム動脈硬化症などの動脈硬化症及び動脈硬化に関連する狭心症などの、パーキンソン病、狭心症、心筋梗塞、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脳梗塞、統合失調症、双極性障害、脆弱Ｘ症候群、慢性疲労症候群、脂質異常症、糖尿病、高血圧、心不全、肝癌。例えば、上記した炎症性疾患が挙げられる。

【0083】

ＥＰは、また、食品又は栄養補助組成物としてあるいはこれらに対する各種機能発現のための添加物として用いることができる。食品としては特に限定しないで、各種の固形食品（ゲル状食品を含む）のほか各種の液状食品が挙げられる。

【0084】

ＥＰは、当技術分野で知られている任意の適切な方法を用いて調製することができる。すなわち、ＥＰは、市販で入手可能であるか、または有機合成化学の分野における当業者によって市販で入手可能な物質から容易に得られる。

【0085】

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照により本明細書に組み入れられる。

【実施例】

【0086】

以下、本明細書の開示を具現化した実施例について説明するが、以下の実施例は本明細書の開示を限定するものではない。

【実施例1】

【0087】

（ホスホエタノールアミンの細胞増殖効果）
９６ウェルプレートに株化正常ヒト気道上皮細胞（ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞）（ＡＴＣＣ）を１×１０⁴cells/ｃｍ²となるように播種した。培地は、１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。２４時間後に、細胞をＰＢＳで２００μｌ／ウェルで穏やかに洗浄し、０、０．１２５、０．２５、及び０．５％ＦＢＳに置換した（９０μｌ／ウェル）。培地交換後、１０μｌ／ウェルでＥＰ溶液を加える。９６時間後に増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ−８アッセイの操作は以下のとおりとした。
（１）９６ウェルプレートからデカンテーション及びタッピングにより培地を除去
（２）予め３７℃で加温した無血清培地（ＲＰＭＩ−１６４０）に、１０分の１の割合になるように、ＷＳＴ−８試薬（同仁化学）を混和し、培地を除去したウェルに添加した。
（３）ＣＯ₂インキュベータ内で１時間呈色反応を行い、吸光プレートリーダーで４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度を測定した。
（４）各ウェル間の補正として、吸光度４５０ｎｍ−吸光度６５０ｎｍを求める。
（５）ブランクの４ウェルの平均値を全ウェルの補正値から差し引いて、これを相対的な細胞数相当値とした。結果を図１及び図２に示す。

【0088】

図１（ａ）及び（ｂ）には、異なるＦＢＳ濃度下におけるＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に対するＥＰの細胞増殖効果を示す。（ａ）は、絶対値で示し、（ｂ）は、ＥＰ０μＭ時の吸光度に対する比として表している。

【0089】

図１（ａ）に示すように、ＥＰ濃度依存的にＢＥＡＳ−２Ｂ細胞は増殖した。ｍＭレベルでの高濃度域でも、ＥＰに起因すると考えられる明らかな毒性は認められなかった。また、ＦＢＳを一切含まない条件でも、ＥＰは細胞を増殖させることができ、０．５％ＦＢＳの時とさほど変わらず細胞を増殖させることができた。図１（ｂ）に示すように、ＦＢＳが培地に含まれていないと、低血清ストレスで細胞は死滅する（ＥＰ ０μＭ参照）。しかしながら、ＥＰを添加することで、最大１１倍の細胞増殖が認められた（図１（ｂ）。

【0090】

また、図２には、ＥＰ０μＭとＥＰ１０００μＭとの細胞増殖状態画像を示す。図２に示すように、ＥＰ０μＭでは、細胞死を起こしたりあるいは線維芽細胞状に萎縮したりしていたのに対し、ＥＰ１０００μＭでは容器底面を覆うように細胞が増殖した。また、細胞は同心円方向に進展し互いに密着した。

【実施例2】

【0091】

（初代正常ヒト気道上皮細胞（ＨＢＥｐＣ）での増殖効果）
９６ウェルプレートにＨＢＥｐＣ細胞（IWAKI）を３×１０⁴cells/ｃｍ²となるように播種した。培地はＢＥＧＭ（タカラバイオ、完全培地）を使用した。２４時間後に、細胞をＨＥＰＥＳバッファーで１ウェルあたり２００μｌで穏やかに洗浄し、基礎培地（下垂体抽出物、ペプチド増殖因子を含まない培地）ＢＥＢＭに対し、抗生物質ＧＡ−１０００のみを添加したものに置換した（１ウェルあたり９０μｌ）。培地交換後、設定濃度の１０倍濃度のＥＰ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加え、９６時間後に、増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ−８アッセイは、実施例１と同様に行った。結果を図３に示す。

【0092】

図３に示すように、初代正常ヒト気道上皮細胞に対してもＥＰは増殖促進効果を有していた。また、基礎培地には、下垂体抽出物やペプチド増殖因子を含まないため、こうしたものとの組み合わせあるいは相乗効果に依拠せず無血清培地であっても、初代正常ヒト気道上皮細胞に対して増殖促進効果があった。また、ＥＰは、濃度依存的に増殖促進効果を有しており、ｍＭレベルでも毒性を示さず７μＭでも２倍程度の増殖促進効果を発揮した。

【実施例3】

【0093】

（初代正常ヒト肺線維芽細胞 （NHLF）での増殖効果）
９６ウェルプレートにＮＨＬＦ細胞（タカラバイオ）を３×１０⁴cells/ｃｍ²となるように播種した。培地は、１０％ＦＢＳＤＭＥＭを使用した。２４時間後に、細胞をＰＢＳで１ウェルあたり２００μｌで穏やかに洗浄し、０％ＦＢＳ ＤＭＥＭに置換した（１ウェルあたり９０μｌ）。培地交換後、１０μｌ／ウェルのＥＰ溶液を加え、１２４時間後に、増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ−８アッセイは、実施例１と同様に行った。結果を図４に示す。

【0094】

図４に示すように、初代ヒト線維芽細胞においても、ＥＰは、増殖促進効果を発揮することを確認した。肺の線維芽細胞の増殖は、喘息における気道リモデリング形成に大きな役割を果たす。これまで気道リモデリングは、喘息や慢性閉塞性肺疾患などの病態形成に関与すると思われていたが、線維芽細胞の増殖は損傷した上皮の創傷治癒過程における重要な役割を果たすことが明らかになりつつあり、ＥＰの喘息治癒効果の１つとして挙げられる。

【実施例4】

【0095】

（初代正常ケラチノサイト（角化細胞、HEKa）での増殖効果）
４８ウェルプレートにＨＥＫａ細胞（タカラバイオ）を２×１０⁴cells/ｃｍ²になるように播種した。培地は、基礎培地Epilife（M-EPI-500-CA, Invitrogen）に対し、添加因子としてHKGS Kit (S-001-K, Invitrogen)を使用した。なお、このHKGS Kitには、ウシ下垂体抽出物、ウシインシュリン、ヒドロコルチゾン、ウシトランスフェリン及びヒトＥＧＦを含んでいる。２４時間後に、細胞を１ウェルあたり４００μｌのＰＢＳで穏やかに洗浄し、１ウェルあたり２５２μｌの基礎培地 Epilife に置換し、２４時間培養した。培養後、ＥＰ溶液を１ウェルあたり２８μｌ加え、ＥＰ投与後２１日後に、増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ−８アッセイは、試薬及び培地量を２．８倍とする以外は実施例１と同様に行った。結果を図５に示す。

【0096】

図５に示すように、初代ヒトケラチノサイトにおいても、ＥＰは増殖促進効果を発揮した。増殖促進効果は、最低濃度15.6μＭでほぼ最大効果が得られている。ケラチノサイトは皮膚を構成する細胞であり、この細胞を増殖および機能付加を行う物質は極めて有用性が高い。再生医療における、皮膚シートの作製時に、ＥＰを応用することが可能であり、動物性のタンパクを含まない、アレルギー作用の少ない組織片作製のための培地成分として利用が可能である。

【実施例5】

【0097】

（初代正常ヒト毛乳頭細胞 （HHDPC）での増殖効果）
９６ウェルプレートにＨＨＤＰＣ細胞（コスモバイオ）を１×１０⁴cells/ｃｍ²となるように播種した。培地は、完全培地ＭＳＣＭ（500、ScienCell）を使用した。２４時間後に、細胞を１ウェルあたり２００μｌのPBSで穏やかに洗浄し、１ウェルあたり９０μｌの０％ＦＢＳ ＤＭＥＭに体積比１％の完全培地ＭＳＣＭを添加したものに置換して24時間培養した。培養後、ＥＰ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加え、ＥＰ投与後６日後に、増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ−８アッセイは、実施例１と同様に行った。臨床で発毛作用が認められているミノキシジルについても同様に試験した。結果を図６に示す。

【0098】

図６に示すように、ＥＰは、臨床で発毛作用が認められているミノキシジルと同等あるいはそれ以上の増殖効果を発揮した。ミノキシジルの有効濃度は数十〜４００ｎＭの狭い範囲であり、それ以上では毒性が出るが、本成分は非常に広い濃度域で増殖効果が認められており、安全性の高い化合物であることがわかった。また、ミノキシジルは高濃度であると細胞毒性を呈するが、ＥＰは細胞内内在性物質であり毒性を呈しない点において有利である。ＨＨＤＰＣ細胞における増殖効果とヒトにおける発毛／育毛作用との相関が既に認められており、ＥＰは、発毛／育毛剤として利用可能であることがわかった。

【実施例6】

【0099】

（がん細胞、および不死化モデル細胞での増殖効果）
（１）Ａ５４９およびＨＥＫ２９３細胞；付着系細胞の場合
９６ウェルプレートにＡ５４９(ヒトII型肺胞上皮細胞：腺癌）及びＨＥＫ２９３（アデノウイルス不死化ヒト胎児腎細胞）を１×１０⁴cells/ｃｍ²になるように播種した。培地は０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。播種から２４時間後に、１ウェルあたり２０μｌのＰＢＳで細胞を洗浄し、０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０に置換した。培地交換後、設定濃度の１０倍濃度のＥＰ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加えた。ＥＰ添加後９６時間後に、増殖試験（WST-8 アッセイ）を実施した。ＷＳＴ−８アッセイは、実施例１と同様に行った。結果を図７に示す。

【0100】

（２）ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０細胞；浮遊経系胞の場合
ＥＰ投与前に対数増殖状態になるように、１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０にて２〜１０×１０⁵cells/ｃｍ²となるように１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０にてＴＨＰ−１（ヒト急性単球性白血病細胞）およびＨＬ−６０（ヒト骨髄性白血病細胞）を対数増殖培養した。その後、１０００ｒｐｍで細胞培養液を遠心・沈殿させ、０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０に２×１０⁴cells/ｃｍ²になるように、１ウェルあたり９０μｌを９６ウェルプレートに分注した。次いで、ＥＰ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加えて、７２時間後に、増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）を行った。浮遊系の細胞に対するＷＳＴ−８アッセイは、培養中の細胞懸濁液に対して、直接ＷＳＴ−８アッセイ試薬を１ウェルあたり１０μｌずつを分注し、１時間後に、４５０ｎｍ、６００ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定し、以上の実施例と同様にデータ解析を行った。結果を図８に示す。

【0101】

図７に示すように、Ａ５４９、ＨＬ６０及びＨＥＫ２９３については、ＥＰは高濃度域でも全く細胞増殖能を示さなかった。これに対して、ＴＨＰ−１については、１２５μＭ以上の高濃度域においてわずかに細胞増殖能が認められた。

【0102】

以上の結果から、ＥＰは、正常細胞に対して高い選択性で増殖効果を発揮し、がん細胞に対してはほとんど増殖効果を発揮しないことがわかった。

【実施例7】

【0103】

（ＭＥＫ１／２阻害剤による本成分の増殖効果の抑制確認実験）
細胞増殖の調節はいくつもの細胞内シグナルが介在することが知られている。一般的には細胞外からの増殖シグナル（ホルモン）が、細胞膜レセプターに結合し、細胞内のタンパクを数段階の階層シグナルで活性化し、最下層の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（Mitogen-activated Protein Kinase；ＭＡＰＫ）が細胞核内に移行し、次いで細胞増殖に必要な遺伝子の発現調節を行う事が知られている。ＭＡＰＫはいくつかのファミリーが知られており、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、ｐ３８，ＥＲＫ５，ＥＲＫ７などが同定されている。ＥＰの増殖効果のメカニズムとして上記のいずれかが想定された。予備検討を実施したところＥＲＫ１／２の上位階層にあるＭＥＫ１／２（ＥＲＫ１／２を活性化（リン酸化する分子））阻害薬により増殖効果が抑制されることが分かった。

【0104】

株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ−２Ｂを１ｘ１０⁴cells/ｃｍ²になるように、９６ウェルプレートに播種した。培地には１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。２４時間後にＭＥＫ１／２ 阻害薬Ｕ０１２６（Ｃａｙｍａｎ）を含む１ウェルあたり９０μｌの０．１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０で置換した。その後、２．５μＭのＥＰ溶液を１０ｕｌ／ウェルで加えた（最終濃度２５０ｎＭ）。７２時間経過後、増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ−８アッセイは、実施例１と同様に行った。結果を図８に示す。

【0105】

図８に示すように、ＭＥＫ１／２阻害薬で添加しないとき、ＥＰ２５０μＭによる処理によって、細胞が３倍程度に増殖した。一方、異なるＭＥＫ１／２阻害薬を投与したとき、当該薬剤の単独処理により細胞数の減少が認められるが、２５μＭのＥＰによる増殖抑制効果はそれよりも上回っていた。以上のことから、ＥＰの増殖メカニズムの一つとして、ＭＥＫ１／２およびその下流のＭＡＰＫであるＥＲＫ１／２を介した増殖シグナルが関与していることがわかった。

【実施例8】

【0106】

（ＥＰの代謝上位／下位物質による増殖効果）
ＥＰは細胞膜の主要成分ホスファチジルコリン（レシチン）および神経組織に多く存在するホスファチジルエタノールアミンなど細胞に必須なリン脂質の前駆体であることが知られている。ＥＰの増殖効果が、これら細胞構成物質の補給に起因するかどうかを確認するための実験として、ＥＰの代謝上位および下位の物質による増殖効果有無の検討を行った。ＥＰ及びＥＰの上位／下位成分の上記細胞構成成分に至る代謝マップを図９に示す。

【0107】

株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ−２Ｂを１ｘ１０⁴cells/ｃｍ²になるように、９６ウェルプレートに播種した。培地には１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。２４時間後に、１ウェルあたり９０μｌの０．１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０で置換した。ＥＰおよびＥＰ代謝誘導体を１０μｌ／ウェルで加えた。７２時間後に、増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ−８アッセイは、実施例１と同様に行った。ＥＰ及びその誘導体による増殖／毒性作用を図１０に示す。

【0108】

図１０に示すように、ＥＰは用量依存的に増殖作用をもたらしたが、その他の成分では大きな増殖促進作用は認められなかった。また、ＥＰの代謝上位にあるエタノールアミンの作用は、ＥＰに比べて極めて微弱であることがわかった。以上のことから、ＥＰの増殖作用は脂質前駆体の補給によるものではなく、ＥＰの特異的作用であることがわかった。

【実施例9】

【0109】

（ＧＡＢＡ受容体作動薬による増殖効果およびＧＡＢＡ‐Ａ受容体拮抗薬による増殖抑制作用）
本成分を包括的化合物データベースであるＰｕｂＣｈｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）にて構造類似化合物を検索すると、生理活性物質ＧＡＢＡ‐Ａ受容体作動薬のｈｏｍｏｔａｕｒｉｎｅが該当する。本成分による細胞増殖効果がＧＡＢＡ受容体を介するかどうかを確認するために、ＧＡＢＡ作動薬および拮抗薬による介入実験を実施した。

【0110】

株化正常ヒト気道上皮細胞 ＢＥＡＳ−２Ｂを１ｘ１０⁴cells/ｃｍ²になるように、９６ウェルプレートに播種した。培地には１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。２４時間後に、１ウェルあたり９０μｌの０．１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０に置換した。次いで、ＧＡＢＡ （ＧＡＢＡ−ＡおよびＧＡＢＡ−Ｂ受容体作動薬）およびｈｏｍｏｔａｕｒｉｎｅ（ホモタウリン）（ＧＡＢＡ−Ａ作動薬）を１ウェルあたり１０μｌ加えた。７２時間後に増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ−８アッセイは実施例１と同様に行った。結果を図１１に示す。

【0111】

株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ−２Ｂを１ｘ１０⁴cells/ｃｍ²になるように９６ウェルプレートに播種した。培地には１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。２４時間後に、１ウェルあたり、ＧＡＢＡ−Ａ阻害薬（（−）−Ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ Ｍｅｔｈｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，＃１４３４３ ＳＩＧＭＡ；ＢＭと略）を含む９０μｌの０．１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０で置換した。ＥＰ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加えた。７２時間後に増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ−８アッセイは実施例１と同様に行った。結果を図１２に示す。

【0112】

図１１に示すように、ＧＡＢＡ−ＡおよびＧＡＢＡ−Ｂ受容体作動薬ＧＡＢＡおよびＥＰ構造類似物質ＧＡＢＡ−Ａ受容体作動薬ホモタウリンは統計的に有意な増殖作用をもたらさなかった。また、図１２に示すように、ＧＡＢＡ−Ａ受容体拮抗薬ＢＭによりＥＰの増殖作用は阻害されなかった。以上のことから、ＥＰの増殖作用はＧＡＢＡ受容体を介さないメカニズムによりもたらされることがわかった。

【実施例10】

【0113】

（ＥＰによる無血清誘導カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）３／７活性上昇阻害効果）
ＥＰは無血清において、単独で細胞増殖をもたらす。一般的に動物細胞は複数の増殖因子の存在がなければ生存できない。これらが欠如すると、細胞に備わったアポトーシスと呼ばれる自殺機能（プログラムされた細胞死）が稼動する。アポトーシスの細胞内経路はいくつか知られているが、知られている全てのアポトーシス経路はｃａｓｐａｓｅ３／７とよばれるペプチダーゼの活性上昇に集約される。よって、本成分のアポトーシス調節作用の有無はｃａｓｐａｓｅ３／７活性を測定する事により推定が可能となる。そこで以下の実験を行った。

【0114】

株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を５ｘ１０⁴cells/ｃｍ²になるように９６ウェルプレートに播種する。培地は、１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０を使用した。２４時間後に、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳで細胞を穏やかに洗浄し、１ウェルあたり９０μｌの０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０で置換した。培地交換後、ＥＰあるいはＦＢＳ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加えた。２４時間後に、増殖試験（ＷＳＴ−８アッセイ）及びｃａｓｐａｓｅ３／７アッセイ（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ３／７アッセイ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を実施した。ＷＳＴ−８アッセイは実施例１と同様に行い、ｃａｓｐａｓｅ３／７アッセイは、添付文書どおり行った。ｃａｓｐａｓｅ ３／７活性は発光試験により測定し、ブランク平均値を引いた値から、ＷＳＴ−８アッセイの補正吸光度（相対的な細胞数に相当）で除算することにより、細胞あたりのｃａｓｐａｓｅ ３／７活性を算出した。結果を図１３に示す。

【0115】

図１３左のＦＢＳ濃度とカスパーゼ３／７活性との関係に示すように、無血清培地に交換する事により上昇したカスパーゼ３／７活性はＦＢＳ添加により濃度依存的に低下した。一方、図１３右のＥＰ濃度とカスパーゼ３／７活性との関係に示すように、ＥＰ１０００μＭでカスパーゼ３／７活性は０．７２倍程度に低下した。回帰曲線により、ＥＰ１０００μＭは、ＦＢＳ２．２％の効果に相当する。以上のことから、ＥＰは細胞増殖能に加え、アポトーシス経路の最終シグナル経路であるｃａｓｐａｓｅ３／７を強く阻害することがわかった。したがって、ＥＰはアポトーシス抑制剤として機能することがわかった。

【実施例11】

【0116】

（ＥＰによる株化正常気道上皮細胞のバリア機能（経上皮電気抵抗・物質透過性）
株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ２Ｂをセルカルチャーインサート（３５３１０４，ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ）に１ｘ１０⁵cells/ｃｍ²となるように播種した（図１４参照）。使用培地は１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０とした。培地量は、インサート側２００μｌ、ウェル側を７５０μｌとした。翌日、１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０に以下４条件の試薬を調製したものに１日１回置換／培地交換し、ＭｉｌｌｉＣｅｌｌ（ミリポア）にて経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）を測定した。
条件１； コントロール
条件２； ＥＰ １ｍＭ
条件３； デキサメタゾン １μＭ （デキサメタゾン（Ｄｅｘ）：バリア機能を高めることを知られる陽性対照物質）
条件４； ＥＰ １ｍＭ およびＤｅｘ １μＭ

【0117】

細胞播種から７日後に、透過性試験を以下のとおり実施した。
[透過性試験]
４Ｋダルトンの蛍光デキストラン分子（ＳＩＧＭＡ）を０．１ｍｇ／ｍｌになるようにセルカルチャーインサートに加え、１時間後、ウェル側の培地を２０μｌ取り出し、各濃度における蛍光強度から浸透した蛍光デキストラン量を推定した。インサート側からウェル側への物質の浸透速度Ｐａｐｐは一般的に下記の式で求められる。結果を図１４に示す。
Ｐａｐｐ＝（ウェル側培地の体積／インサート面積×初期インサート濃度）×（ウェル側の変化濃度／経過時間）

【0118】

図１４左に示すように、ＥＰを投与した株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ２Ｂでは４９％のＴＥＲの上昇が認められた。上皮のバリア機能は、一般的には、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）に相関することが知られており、物質の透過速度はＴＥＲと逆相関の関係にある。図１４右に示すように、蛍光デキストラン分子の透過速度Ｐａｐｐを測定したところ、ＥＰを投与した細胞においては、２５％もの透過速度の低下、すなわち、バリア機能の亢進が認められた。また、この細胞においては、陽性対照物質であるデキサメタゾン単独処理、及びデキサメタゾンとＥＰとの共処理ではＴＥＲ上昇、Ｐａｐｐの低下は認められなかった。以上のことから、ＥＰには、バリア機能の亢進および上皮細胞の増殖効果により、喘息患者の損傷した気道域においてアレルゲン等の透過が妨げられることにより、喘息治療効果が期待できる。

【実施例12】

【0119】

（ＢＥＡＳ−２Ｂ以外の細胞におけるＥＰのバリア機能修飾作用）
（Ｃａｌｕ−３ ヒトがん化気道上皮細胞）
Ｃａｌｕ−３をセルカルチャーインサート（３５３１０４， ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ）に３ｘ１０⁵cells/ｃｍ²になるように播種した。１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０にてコンフルエントになるまで培養し、コンフルエントになった時点で、０．１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０に下記を含むものに置換し、１日１回培地交換した。実施例１１と同様にＴＥＲを測定した。結果を図１５に示す。
条件１； コントロール
条件２； デキサメタゾン １μＭ
条件３； ＥＰ １ｍＭ

【0120】

（ＨＥＫａ ヒト初代正常ケラチノサイト、成人）
ＨＥＫａをセルカルチャーインサート（３５３１０４，ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ）に６ｘ１０⁴cells/ｃｍ²になるように播種した。培地は基礎培地Ｅｐｉｌｉｆｅ（Ｍ−ＥＰＩ−５００−ＣＡ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対し、添加因子としてＨＫＧＳ Ｋｉｔ（Ｓ−００１−Ｋ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた完全培地で培養し、コンフルエントになった時点で、完全培地にＣａｌｕ−３と同様の条件１〜３で特定化合物を含むものに置換し、１日１回培地交換した。実施例１１と同様にＴＥＲを測定した。結果を図１５に示す。

【0121】

図１５左に示すように、Ｃａｌｕ−３、ＨＥＫａともにコントロールに対して統計的に有意なＴＥＲ値の上昇が認められた（それぞれ２．０および２．３倍）。これらの結果から、ＥＰによるバリア機能亢進作用は上皮細胞に一般的に認められる作用であることがわかった。また、ヒトの皮膚を構成するケラチノサイトの場合、ＥＰにより細胞増殖の促進およびＴＥＲ値の向上がみられるため、再生医療分野での質の高い移植片作製の際の有力な補助剤、あるいは化粧品分野における肌荒れ、敏感肌などに対する添加剤、あるいは抗アトピー薬有効成分として利用することが可能である。

【実施例13】

【0122】

本実施例はＥＰの各種作用に関連してDNAマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析を実施した。

【0123】

（細胞、アレイ、試薬等）
実験には正常株化気道上皮細胞BEAS-2Bを用いた。この細胞は10% FBS RPMI-1640で拡大培養し、24ウェルプレートに1x10⁵/cm²の密度で播種した。24時間後に0.1% FBS RPMI-1640に置換し、最終濃度0 もしくは1mM EPになるように投与した（n=４）。24時間後、細胞をDNAマイクロアレイのサンプルとした。RNA抽出はQIAGEN社のRNeasy Mini Kitを使用した。DNAマイクロアレイ実験はWhole Human Genome DNA マイクロアレイ 4x44K（Agilent)を利用し、DNAマイクロアレイ実験に必要なラベリング試薬等は全てAgilent社のものを用いた。

【0124】

（DNAマイクロデータの解析）
DNAマイクロアレイ実験データは専用解析ソフトGeneSpring (Agilent)にて統計解析および変動した遺伝子から遺伝子の機能解析（Gene Ontology [GO]解析）を実施した。GO解析は統計的に有意に変動した遺伝子セットが既知の機能分類遺伝子セットにどれぐらい当てはまるかを確率的に求めるものである。計算されたp値は与えられた全ての遺伝子数(本DNAマイクロアレイでは約4万の遺伝子数)から実際に変動した遺伝子の数だけ任意に取り出した時に、それらの遺伝子から類推される機能分類が、どれぐらいの確率で偶然起き得るかを示すものである。p値の計算式は下記の通り。

【0125】

【数1】

【0126】

N; 全アレイ遺伝子数
Np; アレイ中のある機能分類に含まれる遺伝子の総数
Nq; ある機能分類に含まれない遺伝子の総数
x; 変動遺伝子の中にある機能分類が含まれていた数
n; 変動遺伝子の総数

【0127】

細胞を1mM EP処理24時間後に変動した遺伝子のうち、1.5倍以上および1/1.5倍以下（p<0.05）に発現変化したプローブ*（遺伝子）は801および1939個であった。それぞれGO解析を実施し、一つの機能分類に関して、3個以上の遺伝子を含みかつp<0.05を満たすものをそれぞれ表７及び表８に示した（p値による上位20機能）。EP処理により、BEAS-2Bおよび多くの細胞の増殖が促進された。この時、EPにより発現上昇した遺伝子の中で細胞増殖に関連する機能に該当するものとしては、血管形成や分化に関与する遺伝子機能（GO:0001568, GO:0048514, GO:0001944）などが多く含まれていた。EPの細胞増殖を担う機能分子としてこれらの遺伝子（29プローブ*、20遺伝子）が挙げられる（表９）。また、GO解析では上位20位に含まれないが、細胞増殖(cell proliferation: GO:0008283)に関与する遺伝子のうち、1.5倍以上, p<0.05を満たす遺伝子（16プローブ*、12遺伝子）を表１０に示した。これらの遺伝子はEPの細胞増殖機能を担う実行分子となりうることがわかった。

【0128】

なお、プローブは、DNAマイクロアレイ中に搭載されている遺伝子の断片的なＤＮＡ配列である。なお、同じ遺伝子が複数プローブを持つ（重複がある）場合があるため、遺伝子の種類はプローブ数よりも少ない。

【実施例14】

【0129】

EPにより、アポトーシス（細胞の自殺機能）が抑制されることをこれまでに見出した。これを裏付けるように、発現低下した遺伝子の中にはアポトーシス関連機能が際立っていた（上位20機能分類中9個、表８）。アポトーシス制御（regulation of apoptosis, GO: 0042981)に関して発現減少していた遺伝子は147プローブ（123遺伝子）存在した。「アポトーシス制御」はアポトーシスを促進あるいは抑制する機能を含む。また本GO解析は、コンピュータによる自然言語処理により抽出されており、一部該当機能との関連が認められないものが含まれる可能性がある。よって、本147プローブに関して、アポトーシスとの関連を医学生物学文献データベースであるPubMedにより調査し、その結果を表１６に示す。

【0130】

【表16】

【0131】

GO解析では主要なEP機能として挙がらなかったが、EPにより統計的に有意に発現上昇（1.5倍以上、p<0.05)したアポトーシス制御遺伝子の促進あるいは抑制効果を表１７に示す。

【0132】

【表17】

【0133】

EPにより、アポトーシスが抑制されることから、発現減少した遺伝子でアポトーシス抑制に重要なのはアポトーシス促進効果のある遺伝子であり、逆に発現上昇した遺伝子のうちアポトーシスを抑制する遺伝子がEPによるアポトーシス抑制機能をもたらす実効分子として挙げられる（表１１〜１４）。

【0134】

特に、主要な細胞死リガンドであるFASLGのレセプターであるFAS(A_23_P63896, TNF receptor superfamily, member 6) (FAS), transcript variant 1, NM_000043）は0.36倍 (p=0.0046)発現減少しており、有力なアポトーシス抑制実行分子として挙げられる。

【実施例15】

【0135】

（EPにより発現減少した遺伝子のH₂O₂処理サンプルでの遺伝子発現動態比較）
EPは酸化ストレスにより誘導される低分子として同定された。一方EPを細胞に投与すると細胞増殖機能の他、アポトーシス抑制作用をもたらす事を見出した。このことからEPは酸化ストレスに対して何らかの保護的な機能をもたらしている可能性があるため、代表的な酸化ストレス試薬である過酸化水素H₂O₂による遺伝子発現の相関解析を行った。

【0136】

EPの遺伝子発現データは実施例１３のものを使用する。細胞調整およびH₂O₂投与は実験１３と同様の方法で行い、最終濃度125μＭ H₂O₂を6時間処理したものをDNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析サンプルとした。

【0137】

EPにより2倍以上発現減少（p<0.05）したアポトーシス関連遺伝子（apoptosis, GO:0006915, 全734プローブ）のうち、EPおよびH₂O₂においてシグナルが検出可能な（マイクロアレイ解析ソフトGeneSpringにてPresent or Marginal）有効データ30プローブに関してボックスプロットを図１６に示した。EPにより発現減少したアポトーシス関連遺伝子は、酸化ストレス試薬H₂O₂により概ね発現上昇しており、EPは細胞に対して酸化ストレスと相反する作用をもたらすことが明らかになった

【0138】

（全アポトーシス関連遺伝子のEPおよびH2O2処理サンプル間の遺伝子発現動態比較）
全アポトーシス関連遺伝子（apoptosis, GO:0006915, 全734プローブ）を、EPおよびH₂O₂において十分なシグナルが得られた有効データ611プローブに関する散布図を図１７に示す。アポトーシス関連遺伝子は発現上昇・減少含めゲノムレベルにおいて、統計的に有意な負の相関にあることが示された（ピアソン相関係数0.48, p=3x10^-37）。

【0139】

（酸化還元関連遺伝子のEPおよびH₂O₂処理サンプル間の遺伝子発現動態相関解析）
上記散布図からアポトーシス関連遺伝子におけるEPとH₂O₂の発現変動は負の相関が認められた。このことから、EPにより細胞内が酸化ストレスに対して保護的（還元的）な環境がもたらされている可能性がある。酸化還元関連遺伝子は、細胞内の酸化・還元状態に対して発現が調節されており、EPにより細胞内が還元的な作用がもたらされているとすると、これらの遺伝子は酸化ストレスにおける動態と逆相関となる。

【0140】

酸化ストレス関連遺伝子（oxidation reduction GO:0055114 ）に関して、EP-H₂O₂間の遺伝子発現相関解析を行ったもの（ボックスプロット:21プローブ、散布図; 614プローブ）を図１８及び図１９に示した。アポトーシス関連遺伝子同様、酸化還元関連遺伝子はEPおよびH₂O₂処理間で負の相関があることが、EPにより有意に発現減少したセットならびにゲノムレベルにおいて示された（ピアソン相関係数 -0.19, p=2x10^-6）。

【0141】

個別の遺伝子に着目すると、酸化ストレス指標として一般的に利用されるヘムオキシゲナーゼ-1 （A_23_P120883, HMOX1, heme oxygenase (decycling) 1, NM_002133)が1/2.3倍（p=0.017）に発現減少しており、EPによる細胞内の還元化が示唆された。また、この還元化に関して遺伝子発現産物であり抗酸化物質であるチオレドキシン（A_24_P175519, TXN, thioredoxin, NM_003329)の発現が1.4倍(p=0.021)に発現上昇しており、EPの抗酸化ストレス機能の実行分子のひとつとして挙げられる。

【0142】

（サイトカイン・ケモカイン類のEP-H₂O₂処理による遺伝子発現動態比較）
EPは酸化ストレスでもたらされるアポトーシス、酸化還元関連遺伝子の発現動態と負の相関にあることを示した。酸化ストレスは細胞死の他に、サイトカイン類など炎症を誘発する遺伝子や炎症などをもたらす免疫細胞を誘引するケモカイン類を発現誘導することが知られている。EPおよびH₂O₂により統計的に有意に発現変化（1.5倍以上あるいは1/1.5倍以下に発現変化、p<0.05）した遺伝子の数を図２０に示した。H₂O₂処理ではサイトカイン、ケモカインともに発現誘導がもたらされた。一方、ＥＰは特にサイトカイン類を多く発現減少させており、炎症反応を抑える機能としては表１５に示すサイトカイン類およびケモカイン類を減少させることが挙げられる。なかでも、炎症誘発性サイトカインとしては、ＡＲＥＧ、ＢＭＰ７、ＣＣＬ２７、ＣＳＦ１，ＣＸＣＬ１４、ＧＤＦ１５、ＩＬ１１、ＩＬ１８、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３１、ＩＬ４、ＩＬ５、ＴＮＦＳＦ１５、ＶＥＧＦＡ等が挙げられる。

【0143】

以上の結果から、EPおよび酸化ストレス物質H₂O₂によって変動する分子は逆相関にあることから、EPが細胞に対して酸化ストレスに対して保護的な作用（抗酸化作用）をもたらすことが期待される。EPによるこのような細胞保護効果の作用機序を明らかにするために、抗酸化に関連する遺伝子機能分類である酸化還元（oxidation reduction, GO:0055114）および細胞酸化還元恒常性(cell redox homeostasis, GO:0045454)に着目し、酸化ストレスに対して防御的な遺伝子の変動の抽出を行った。結果を表１８に示す。

【0144】

【表18】

【0145】

表１８に示すように、酸化還元（oxidation reduction, GO:0055114）および細胞酸化還元恒常性(cell redox homeostasis, GO:0045454)に関する遺伝子のうち、EPにより1.4倍以上発現上昇し、p<0.05以下を満たすプローブの数は34個あった。うち、遺伝子の発現上昇により、細胞保護作用・抗酸化作用あるいは酸化ストレスに起因する疾患に対する組織保護作用が推定される、あるいは、遺伝子の発現減少あるいは機能欠失により、酸化ストレスやそれに起因する疾患などがもたらされる遺伝子に関して、医学生物学文献データベースであるPubMedにより調査し、関連が認められるものに関して文献IDを表１８最右列に付した。

【0146】

酸化還元（oxidation reduction, GO:0055114）および細胞酸化還元恒常性(cell redox homeostasis, GO:0045454)に該当する遺伝子セットのうち、上述のようにTXNの他、カタラーゼ（A_23_P105138, CAT, catalase (CAT), mRNA [NM_001752], NM_001752）やNADPH:キノンレダクターゼ-1(A_23_P206661, NQO1, NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1 (NQO1), transcript variant 1, mRNA, NM_000903)などの活性酸素除去酵素や解毒代謝酵素の発現上昇をもたらす。特にCATは過酸化水素の除去酵素として機能するため、本遺伝子の発現上昇は活性酸素による細胞損傷に対して保護的に機能する。またNOQ1はキノン類の還元に関わる酵素であり、活性酸素の産生を抑制する抗酸化酵素としても知られている

【実施例16】

【0147】

（ＥＰ処理による酸化ストレス耐性獲得の確認）
EPによるによる遺伝子発現変化は、酸化ストレスによるそれと逆の相関にある。特に酸化ストレス指標HMOX1の発現減少は、細胞内が定常状態よりも還元的な環境をもたらされている事を示唆し、それを裏付けるように抗酸化物質であるTXNの発現上昇が認められている。一方で、上記のことは遺伝子発現変化からの機能類推であり、実際に酸化ストレスによる細胞毒性がEPにより減弱されることを示す必要がある。このため、以下の実験を行った。

【0148】

正常株化気道上皮細胞BEAS-2Bを96 ウェルプレートに1x10⁵/cm2の密度で播種し、24時間後に最終濃度0, 250, 500μＭ EPを含む0.5% FBS RPMI-1640に置換した。培地交換からさらに24時間後に0.5% FBS RPMI-1640に置換し、段階希釈したH₂O₂を投与した (n=4)。H₂O₂投与から24時間後に細胞毒性試験WST-8 アッセイ（Cell Counting Kit-8, 同仁化学研究所）を実施した。データ解析は統計解析ソフトGraphPad Prism 5を用い、50%細胞死濃度EC₅₀を算出した。0, 250μＭ, 500μＭ EPを前処理した細胞におけるH₂O₂による細胞死の用量応答曲線を図２１に示した。

【0149】

図２１に示すように、250μＭ および500μＭ EP前処理はEP前処理のないグループに比べ、高濃度H₂O₂で毒性が現れており、酸化ストレスに対して耐性能を獲得していることが示された。一般的に、化合物の細胞毒性の強さは50%細胞死濃度EC₅₀の逆数に比例する。各EP前処理におけるEC₅₀およびその時の相対毒性を表１９に示す。

【0150】

【表19】

【0151】

表１９に示すように、２５０−５００μＭＥＰ処理によりＨ_２Ｏ_２の細胞毒性はおよそ３割程度減弱していることが示された。このことは、ゲノムレベルでの遺伝子発現変化のみならず、細胞の表現型として酸化ストレスに対して耐性能がＥＰにより付与されたといえるものである。

【実施例17】

【0152】

実施例１５より、ＥＰにより多くのサイトカイン・ケモカインの発現抑制をもたらされることが明らかになった。このことはＥＰに抗炎症作用の可能性を示唆するものである。炎症は細菌などの異物の刺激によって、全ての組織で生じうる急性反応であり、次いで血管透過性の亢進や、リンパ球などの免疫担当細胞の炎症部位への浸潤、免疫担当細胞から炎症誘発性サイトカイン分泌による炎症反応の拡大に繋がる。実施例１５で使用した細胞は気道上皮細胞であり、免疫担当細胞における同様の効果を確認する必要がある。また、実施例１５は遺伝子発現レベルの効果であり、抗炎症作用を示すには炎症担当細胞からの分泌される炎症誘発性サイトカインやケモカインが機能体であるタンパクレベルでの分泌抑制を示す必要がある。以下の実施例では、Singhら（Clin Chem, 2005 Dec; 51(12):2252-6）の方法によりＥＰの抗炎症作用を確認した。

【0153】

ヒト単球様培養細胞ＴＨＰ−１を１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０を増殖培地として、以下のように対数増殖培養を行った。２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４ｘ１０⁵／ｍｌになるように播種し（５００μｌ／ｗｅｌｌ）、ＥＰを含む増殖培地を追加的に添加し、最終的に目的のＥＰ濃度（０．１ｍＭ、１ｍＭ）になるように調整した。ＥＰ投与２時間後、さらにＬＰＳ（リポサッカライド）を含む増殖培地を投与して、０．１μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌとなるように調整した。

【0154】

リポサッカライドを投与後４時間及び２４時間後に、培地を回収し遠心により細胞を沈殿させ、培地上清をＥＬＩＳＡの試料とした。なお、ＥＬＩＳＡの測定指標として、Ｓｉｎｇｈらの報告と同じく炎症誘発性サイトカインＴＮＦα及び炎症担当細胞を誘引するケモカインであるＩＬ−８を用いた。結果を図２２及び図２３に示す。

【0155】

Ｓｉｎｇｈらは短時間のＬＰＳ処理によるＴＮＦαの分泌抑制により抗炎症薬のスクリーニングが可能であると報告している（既出）。これはＬＰＳ刺激によるＴＮＦαの分泌促進が、通常なら２〜６時間程度でピークとなるためである。図２２に示すように、１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ刺激による誘導ＴＮＦα量が４時間刺激では約２６０ｐｇ／ｍｌ（ＥＰなし）であったのに対し、２４時間刺激では約７０ｐｇ／ｍｌ（ＥＰ１ｍＭ）に減少しており、Ｓｉｎｇｈらにおける評価と同様の結果となっていた。また、図２２に示すように、ＥＰは、４時間及び２４時間刺激の双方において、ＴＮＦα誘導を用量依存的に分泌抑制している。

【0156】

また、図２３に示すように、ＩＬ−８においても用量依存的な分泌の抑制がＥＰによりもたらされていた。ＩＬ−８はＬＰＳ刺激に対して４時間よりも２４時間において分泌促進されやすい傾向にあったが、２４時間刺激後においてＥＰによるＩＬ−８分泌抑制効果が明確に現れていた-。

【0157】

さらに、図２２及び図２３において、２４時間目（２時間の前処理を含むとＥＰ処理２６時間目）ではＥＰはＬＰＳ未処理の細胞に対しても、ＴＮＦα、ＩＬ−８の分泌を抑制していた。すなわち、１ｍＭＥＰ２６時間処理でＴＮＦαを約７８％、ＩＬ−８を約４３％分泌抑制した。これは特にＬＰＳなどのような刺激がなくとも、マクロファージのような免疫担当細胞からのサイトカインやケモカインの恒常的な分泌抑制効果が発揮されることを示すものである。

【0158】

近年、メタボリックシンドロームに見られるように、肥満により特に外傷や感染症がない状態でも血中のＴＮＦαなどの炎症性サイトカインの濃度上昇が動脈硬化のような疾患へ繋がることが報告されている（Isr Med Assoc J. 2008 Jul; 10(7):494-8）。また、肥満時に血中に増加する酸化ＬＤＬによりマクロファージファージよりＴＮＦ−αが産生され、動脈硬化が促進されると考えられている（Artrioscler Thromb Vasc Biol. 1996 Dec; 16(12); 1573-9）.

【0159】

以上のことから、ＥＰは抗炎症効果が期待されるだけでなく、炎症によって誘発されるサイトカインやケモカインによりもたらされる疾患（動脈硬化またはそれによる心筋梗塞や脳梗塞のような閉塞性血管傷害）に対しても予防・治療的な効果をもたらす可能性があることがわかった。

【0160】

以上、本発明の実施形態および実施例について詳細に説明したが、これらは例示に過ぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。

【0161】

本明細書または図面に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組合せによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載の組合せに限定されるものではない。また、本明細書または図面に例示した技術は複数目的を同時に達成し得るものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】