特許 6419693 腫瘍抗原ペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6419693

(24)【登録日】2018年10月19日

(45)【発行日】2018年11月7日

(54)【発明の名称】腫瘍抗原ペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/08 20060101AFI20181029BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20181029BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20181029BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20181029BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20181029BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20181029BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20181029BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20181029BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20181029BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/08ZNA

   C12N15/63 Z

   C12N5/078

   C12N5/0783

   A61K39/00 H

   A61K48/00

   A61K35/76

   A61P35/00

   A61P35/04

【請求項の数】11

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-510038(P2015-510038)

(86)(22)【出願日】2014年3月27日

(86)【国際出願番号】JP2014058756

(87)【国際公開番号】WO2014162962

(87)【国際公開日】20141009

【審査請求日】2017年3月22日

(31)【優先権主張番号】特願2013-75975(P2013-75975)

(32)【優先日】2013年4月1日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】599045903

【氏名又は名称】学校法人 久留米大学

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100062144

【弁理士】

【氏名又は名称】青山 葆

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(72)【発明者】

【氏名】伊東 恭悟

(72)【発明者】

【氏名】松枝 智子

(72)【発明者】

【氏名】七條 茂樹

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０３８０２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００１／０１１０４４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０１５０６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００２−５１６６７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 MINE, T., et al.，Humoral Responses to Peptides Correlate with Overall Survival in Advanced Cancer Patients Vaccinated，Clinical Cancer Research，２００４年，10，pp.929-937

【文献】 IMAI, N., et al.，IDENTIFICATION OF Lck-DERIVED PEPTIDES CAPABLE OF INDUCING HLA-A2-RESTRICTED AND TUMOR-SPECIFIC CTLS，Int. J. Cancer，２００１年，94，pp.237-242

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ３５／７６

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３５／０４

Ｃ１２Ｎ ５／０７８

Ｃ１２Ｎ ５／０７８３

Ｃ１２Ｎ １５／６３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１〜３いずれかに記載のペプチド。

【請求項2】

配列番号１〜３いずれかに記載のペプチドをコードする核酸分子。

【請求項3】

請求項２記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項4】

請求項１に記載のペプチドまたは請求項３に記載のベクターの少なくとも１種を含む、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための薬剤。

【請求項5】

請求項４に記載の細胞傷害性Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔ細胞である、薬剤。

【請求項6】

がん患者より採取された末梢血単核細胞を請求項１記載のペプチドまたは請求項３記載のベクターの少なくとも１種と接触させることを含む、がん反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。

【請求項7】

がん患者より採取された末梢血単核細胞を請求項１記載のペプチドまたは請求項３記載のベクターの少なくとも１種と接触させることを含む、抗原提示細胞を調製する方法。

【請求項8】

がん患者がＨＬＡ−Ａ２陽性がん患者である、請求項６または７記載の方法。

【請求項9】

請求項１に記載のペプチドまたは請求項３に記載のベクターの少なくとも１種を含む、がんを治療または予防するための医薬組成物。

【請求項10】

がんワクチンである、請求項９記載の医薬組成物。

【請求項11】

ＨＬＡ−Ａ２陽性がん患者の治療またはＨＬＡ−Ａ２陽性対象におけるがんの予防のためのものである、請求項９または１０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はがん治療並びに予防に有用な新規腫瘍抗原ペプチドに関する。

【背景技術】

【0002】

悪性腫瘍は日本人の死亡原因の第１位を占め年間約３３万人が死亡しており、世界では年間約６００万人ががんで死亡している。現在のがん治療においては、外科的切除、抗がん剤および放射線療法などが主に行われているが、かかる療法には再発やＱＯＬの問題、さらにはこれらの治療法の身体的な負担と治療効果を考量した場合、デメリットが多いために治療を受けることが困難である場合等、患者の状態によって治療の選択肢が限られてしまうといった問題がある。このような中、がんに対する免疫療法（ワクチン療法）は従前から手術、化学療法、放射線療法につぐ第４の治療法として待望されおり、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に認識される多くの腫瘍抗原およびそのペプチドが種々のタイプのがんより同定され、これらをペプチドワクチンとしてがん患者へ投与するがん治療法の臨床試験が進められている（非特許文献１）。

【0003】

ＣＴＬはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子に拘束されるが、このアレルは、その構造的相同性およびペプチド結合モチーフ解析に基づき数百種類に分類されている。中でも日本人に頻度が高いアレルとして、ＨＬＡ−Ａ２、‐Ａ２４が知られており、これらのＨＬＡを介してＣＴＬを誘導するペプチドワクチン候補が同定されてきている。また個々の型としては少数派であるＨＬＡ−Ａ３, −Ａ１１, −Ａ３１, −Ａ３３が共通のペプチド結合モチーフを有するＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに属することからＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ拘束性のペプチドワクチン候補についても同定が進められている。

【0004】

ヘルパーＴ細胞は抗原提示細胞のＨＬＡクラスＩＩ分子と抗原ペプチドとの複合体を認識して誘導、活性化される。活性化されたヘルパーＴ細胞はＢ細胞の増殖、分化を促進し、またＣＴＬの活性化を補助する機能を有している。がんに対する免疫療法（ワクチン療法）において、ＨＬＡクラスＩＩ結合性の抗原ペプチドを介してＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）を誘導すればＣＴＬを効率的に誘導し、がんワクチンの効果が増強されると考えられ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化するためのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドが注目されている（非特許文献２）。

【0005】

例えば、本発明者らはＣＴＬを誘導するＨＬＡクラスＩ分子に結合するペプチドとしてＳｒｃチロシンキナーゼファミリーのひとつであるＬｃｋ（ｐ５６^Ｌｃｋ）に由来するペプチドを同定している。ＬｃｋはＴ細胞の分化並びに機能に必須であることが知られているが、このタンパク質は大腸がん、小細胞肺がん、前立腺がんを含むいくつかの悪性腫瘍において異所性に発現しており、特に転移性病変部位に好発することが報告されている。このため、遠隔転移患者からのＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍反応性ＣＴＬが認識するＬｃｋ由来ペプチドの同定や、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ陽性の転移性がん患者に対するがんワクチンとして有用なペプチドの同定が行われてきた（特許文献１、２、非特許文献３〜５）。そして、同定されたＬｃｋ由来ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４陽性またはＨＬＡ−Ａ２陽性がん患者に対してワクチンとして投与する臨床試験も実施してきている（非特許文献６）。しかしながら、これらの同定されたＬｃｋ由来ペプチドのいくつかについては、これらのペプチドを認識するＣＤ４陽性Ｔ細胞が患者の浸潤リンパ球より分離されることが報告されているが、今まで同定されているＬｃｋ由来ペプチドはＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導すべくＨＬＡクラスＩ分子に最適化されたペプチドである(非特許文献７)。

【0006】

がんペプチドワクチンの候補として、高いＣＤ８陽性Ｔ細胞誘導能を有し、該ペプチドに対する抗体を産生しやすい新規エピトープを同定することが望まれている。

【0007】

近年ではｉｎ ｓｉｌｉｃｏによるクラスＩおよびクラスＩＩのエピトープ解析が可能となってきたが、候補に挙がるエピトープは膨大な種類であり、また、予測される結合能と実際のＣＤ８、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導能は異なることが多く、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏにて得られるデータに基づいて有用なペプチドを見出すことは困難である。

【0008】

例えば、ＳＹＦＰＥＩＨＩ、ＢＩＩＭＡＳ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ、およびＥｐｉＴＯＰ等のエピトープ予測データベースを用いると、ＨＬＡクラスＩＩのエピトープの場合では、１５ｍｅｒで４９５通、８−１１ｍｅｒで１６４通の候補が得られ、ＨＬＡクラスＩのエピトープの場合では、８−１１ｍｅｒで２００２通のペプチド候補が得られる。しかしながら、候補ペプチドを実際に試験すると、データベースより予測されるＨＬＡとの結合スコアと試験により確認されるＣＤ４、ＣＤ８陽性Ｔ細胞誘導能がかい離していることが多く、有用な活性を有するペプチドを見出すことは困難である。
いずれにせよｉｎ ｓｉｌｉｃｏによるエピトープの解析は今まで報告されているデータに基づき行われるため、ＨＬＡクラスＩにおいては、１２ｍｅｒ以上のペプチドについては十分なデータベースがなく、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの解析をすることができない。１２ｍｅｒ以上のペプチドはその配列中に含まれる８〜１１ｍｅｒのエピトープ候補を予測解析することは可能であるが、ＨＬＡクラスＩに結合する際のプロセシングにより期待されるエピトープが結合できるようなプロセシングを受けるかどうかの予測は困難であり、未だ有用なペプチドを見いだすための実用に耐えるものではない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】ＷＯ０１／０１１０４４

【特許文献2】ＷＯ２００９／０２２６５２

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Yamada A et al., Cancer Sci 97:970-976,2006

【非特許文献2】Widenmeyer M et al., Int. J. Cancer 131(1): 140-149, 2012

【非特許文献3】Harashima N et al., Eur J Immunol 31: 323-332, 2001

【非特許文献4】Imai N et al., Int J Cancer 94: 237-242, 2001

【非特許文献5】Naito M et al., British Journal of Cancer 97: 1648 -1654, 2007

【非特許文献6】Mine T et al., Clin Cancer Res 10: 929-937, 2004

【非特許文献7】Amedei A et al., Cancer Immuno.l Immunother. 58: 1819-1830, 2009

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、がん患者、特に転移性がん患者の治療並びに予防に有用ながん抗原ペプチドを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明は、Ｌｃｋ由来の下記１５ｍｅｒペプチドを提供する。
Ｌｃｋ３３ ＫＧＲＬＬＩＲＮＧＳＥＶＲＤＰ（配列番号１）
Ｌｃｋ３７４ ＤＴＬＳＣＫＩＡＤＦＧＬＡＲＬ（配列番号２）
Ｌｃｋ４８７ ＦＤＹＬＲＳＶＬＥＤＦＦＴＡＴ（配列番号３）

【0013】

本発明はまた、本発明のペプチドをコードする核酸分子および該核酸分子を含むベクターを提供する。

【0014】

本発明はまた、本発明のペプチドまたはベクターのいずれかを含む、がんを治療または予防するための医薬組成物、特に本発明のペプチドを含むがんワクチンである該医薬組成物を提供する。

【0015】

本発明はさらに、がん患者より採取された末梢血単核細胞を本発明のペプチドまたはベクターと接触させることを含む、がん反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。

【0016】

本発明はさらに、がん患者より採取された末梢血単核細胞を本発明のペプチドまたはベクターと接触させることを含む、抗原提示細胞を調製する方法を提供する。

【発明の効果】

【0017】

本発明のペプチドは高いＣＤ８陽性Ｔ細胞誘導能示し、ペプチド特異的ＣＴＬを効率よく誘導、活性化することができる。さらに本発明のペプチドはまた液性免疫に認識されやすい。よって、本発明のペプチドはがんペプチドワクチンとして、特に患者の血清中の抗ペプチド抗体量を測定することにより投与ペプチドを決定するテーラーメイド型のペプチドワクチンとして特に好適に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】配列番号１のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）並びにＳＱ−１細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ１１陽性肺がん細胞株）に対する細胞傷害活性を測定した結果を示す図。横軸にエフェクター細胞／標的細胞比を、縦軸に特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者２、７）。

【図2】配列番号２のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）並びにＳＱ−１細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ１１陽性肺がん細胞株）に対する細胞傷害活性を測定した結果を示す図。横軸にエフェクター細胞／標的細胞比を、縦軸に特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者２、５）。

【図3】配列番号３のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）並びにＳＱ−１細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ１１陽性肺がん細胞株）に対する細胞傷害活性を測定した結果を示す図。横軸にエフェクター細胞/標的細胞比を、縦軸に特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者２、５）。

【図4A】配列番号１のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）への細胞傷害活性に対す細胞傷害活性を示す抗ＨＬＡクラスＩ抗体および抗ＣＤ８抗体の影響を示す図。Ｎｏ Ａｂは抗体なし、ｃｌａｓｓ Ｉは抗ＨＬＡクラスＩ抗体、ＣＤ８は抗ＣＤ８抗体を共存させて培養した場合それぞれの特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者８）。

【図4B】配列番号１のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）への細胞傷害活性に対する抗ＨＬＡクラスＩ抗体および抗ＣＤ８抗体の影響を示す図。Ｎｏ Ａｂは抗体なし、ｃｌａｓｓ Ｉは抗ＨＬＡクラスＩ抗体、ＣＤ８は抗ＣＤ８抗体を共存させて培養した場合それぞれの特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者９）。

【図4C】配列番号１のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）への細胞傷害活性に対する抗ＨＬＡクラスＩ抗体および抗ＣＤ８抗体の影響を示す図。Ｎｏ Ａｂは抗体なし、ｃｌａｓｓ Ｉは抗ＨＬＡクラスＩ抗体、ＣＤ８は抗ＣＤ８抗体を共存させて培養した場合それぞれの特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者１０）。

【図5A】配列番号２のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）への細胞傷害活性に対する抗ＨＬＡクラスＩ抗体および抗ＣＤ８抗体の影響を示す図。Ｎｏ Ａｂは抗体なし、ｃｌａｓｓ Ｉは抗ＨＬＡクラスＩ抗体、ＣＤ８は抗ＣＤ８抗体を共存させて培養した場合それぞれの特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者８）。

【図5B】配列番号２のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）への細胞傷害活性に対する抗ＨＬＡクラスＩ抗体および抗ＣＤ８抗体の影響を示す図。Ｎｏ Ａｂは抗体なし、ｃｌａｓｓ Ｉは抗ＨＬＡクラスＩ抗体、ＣＤ８は抗ＣＤ８抗体を共存させて培養した場合それぞれの特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者５）。

【図5C】配列番号２のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）への細胞傷害活性に対する抗ＨＬＡクラスＩ抗体および抗ＣＤ８抗体の影響を示す図。Ｎｏ Ａｂは抗体なし、ｃｌａｓｓ Ｉは抗ＨＬＡクラスＩ抗体、ＣＤ８は抗ＣＤ８抗体を共存させて培養した場合それぞれの特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者１０）。

【図6A】配列番号１のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）への細胞傷害活性に対する抗ＨＬＡクラスＩ抗体および抗ＣＤ８抗体の影響を示す図。Ｎｏ Ａｂは抗体なし、ｃｌａｓｓ Ｉは抗ＨＬＡクラスＩ抗体、ＣＤ８は抗ＣＤ８抗体を共存させて培養した場合それぞれの特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者８）。

【図6B】配列番号１のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）への細胞傷害活性に対する抗ＨＬＡクラスＩ抗体および抗ＣＤ８抗体の影響を示す図。Ｎｏ Ａｂは抗体なし、ｃｌａｓｓ Ｉは抗ＨＬＡクラスＩ抗体、ＣＤ８は抗ＣＤ８抗体を共存させて培養した場合それぞれの特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者５）。

【図6C】配列番号１のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、ＳＷ６２０細胞（Ｌｃｋ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株）への細胞傷害活性に対する抗ＨＬＡクラスＩ抗体および抗ＣＤ８抗体の影響を示す図。Ｎｏ Ａｂは抗体なし、ｃｌａｓｓ Ｉは抗ＨＬＡクラスＩ抗体、ＣＤ８は抗ＣＤ８抗体を共存させて培養した場合それぞれの特異的放出量（細胞傷害活性）を示す（患者１０）。

【図7A】配列番号２（Ｌｃｋ３７４−８３３）のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、Ｌｃｋ３７５−８３８を提示するＴ２細胞に対する細胞傷害活性を示す図（患者７５７）。

【図7B】配列番号２（Ｌｃｋ３７４−８３３）のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、Ｌｃｋ３７７−８３４を提示するＴ２細胞に対する細胞傷害活性を示す図（患者７５７）。

【図7C】配列番号３（Ｌｃｋ４８７−５０１）のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣの、Ｌｃｋ４８９−４９７を提示するＴ２細胞に対する細胞傷害活性を示す図（患者７２８）。

【図8A】配列番号２（Ｌｃｋ３７４−８３３）または配列番号３（Ｌｃｋ４８７−５０１）のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣのペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生能を示す図。

【図8B】配列番号２（Ｌｃｋ３７４−８３３）または配列番号３（Ｌｃｋ４８７−５０１）のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣのペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生能を示す図。

【図8C】配列番号２（Ｌｃｋ３７４−８３３）または配列番号３（Ｌｃｋ４８７−５０１）のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣのペプチド特異的ペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生能を示す図。

【図8D】配列番号２（Ｌｃｋ３７４−８３３）または配列番号３（Ｌｃｋ４８７−５０１）のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣのペプチド特異的ペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生能を示す図。

【図8E】配列番号２（Ｌｃｋ３７４−８３３）または配列番号３（Ｌｃｋ４８７−５０１）のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣのペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生能を示す図。

【図8F】配列番号２（Ｌｃｋ３７４−８３３）または配列番号３（Ｌｃｋ４８７−５０１）のペプチドで刺激したがん患者由来ＰＢＭＣのペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生能を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明のペプチドは、がん抗原として同定されたＬｃｋのアミノ酸配列の一部よりなるペプチドである。Ｌｃｋのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. Ｘ１３５２９にて開示されている。

【0020】

本発明のペプチドはＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導することができる。ペプチドがＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導するか否かは、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をペプチドで刺激し、その後抗ＣＤ８抗体にて細胞を染色して染色された細胞の比率を調べればよい。同時に抗ＩＦＮ−γ抗体にて染色してその染色細胞の割合を調べることによって、ペプチドによって細胞傷害活性の誘導が生じたことを確認できる。

【0021】

本発明においてペプチド特異的ＣＴＬが誘導されたかどうかは、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をペプチドで刺激し、そのペプチド刺激ＰＢＭＣが対応ペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）を産生するかをＥＬＩＳＡ法やELISPOT（Enzyme-Linked Immuno Spot)法等により測定して調べることができる。また、^５１Ｃｒ放出測定法等により、誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を確認することができる。

【0022】

ペプチドが「液性免疫に認識される」あるいは、「抗体陽性」とは、そのペプチドに特異的なＩｇＧが生体内に存在すること、つまりはペプチド特異的ＩｇＧががん患者の血漿から検出されることを意味する。細胞性免疫と液性免疫の両方に認識されるペプチドは、免疫原性が高くＣＴＬ誘導能に優れると期待されるため、本発明のペプチドとして好ましい。血漿中の特異的ＩｇＧは、常套的なＥＬＩＳＡ法等によって測定することができる。

【0023】

本発明のペプチドは、通常のペプチド合成により製造することができる。そのような方法として、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York，1966； The Proteins, Vol2, Academic Press Inc.,New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株）、１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、１９８５；医薬品の開発続 第十四巻・ペプチド合成、広川書店、１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。

【0024】

本発明のペプチドは、がん患者においてがん細胞を傷害するＣＴＬを効率的に誘導し増殖させることができる。即ち本発明のペプチドは、がん反応性ＣＴＬを誘導するため、およびがんに対する医薬組成物を製造するためなどに使用することができ、がんの治療または予防において有用である。

【0025】

本発明のペプチドはがん細胞を傷害するＣＴＬを効率的に誘導し、増殖させることができる。対象となるがんとしては大腸がん、小細胞肺がん、前立腺がん等が例示されるがこれらに限定されない。また、上記のとおり、Ｌｃｋペプチドが転移性病変部位に好発することから、本発明のペプチドは特に転移性がんの制御に有用であると考えられる。本発明のペプチドはＨＬＡ−Ａ２陽性がん患者由来のＰＢＭＣからのペプチド反応性ＣＴＬの誘導能を有していることを確認しており、特にＨＬＡ−Ａ２陽性対象のがんの治療並びに予防に好適に用いられる。

【0026】

本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドを１または２種類以上含有し、その含有ペプチドに特異的ながん反応性ＣＴＬを誘導することにより治療効果を発揮する。本発明の医薬組成物は、がんワクチンとして使用することができる。がん患者のＣＴＬは相異なるがん抗原ペプチドを認識する細胞の集合であることから、複数種類のペプチドを組み合わせて使用するとさらに効果的である。本発明のペプチド以外のがん抗原ペプチドと組み合わせても良い。本発明の医薬組成物は、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントとともに投与することもできる。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状製剤、リピッドを結合させた製剤などにしてもよい。

【0027】

投与方法は、例えば皮内投与または皮下投与などである。投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常医薬組成物中の本発明のペプチドの量として０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇである。これを数日、数週または数ヶ月に１回、１〜３年間継続して投与することが好ましい。

【0028】

本発明の核酸分子は、本発明のペプチドを提供できるものである。本発明の核酸分子を含むベクターを抗原提示細胞に導入し発現させると、本発明のペプチドが産生され、ＨＬＡ分子と複合体を形成して細胞表面に提示される。この抗原提示細胞はペプチド特異的がん反応性ＣＴＬを効率的に増殖、活性化させることができる。

【0029】

本発明のベクターは、患者に投与して患者体内で本発明のペプチドを発現させるために使用できる。また、本発明のベクターを体外で適当な細胞、例えば患者由来の樹状細胞に導入した後に、その細胞を患者体内に戻しても良い。これらの方法は当業界において周知である（Hrouda D, Dalgleish AG. Gene therapy for prostate cancer. Gene Ther 3: 845-52, 1996）。

【0030】

本発明のベクターとしては、各種プラスミドおよびウィルスベクター、例えばアデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等が挙げられる（Liu M, Acres B, Balloul JM, Bizouarne N, Paul S, Slos P, Squiban P. Gene-based vaccines and immunotherapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A 101 Suppl, 14567-71, 2004）。ベクターの調製方法は当業界にて周知である（Molecular Cloning: A Laboraroy Manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory）。

【0031】

本発明のベクターを、がんを治療または予防するための医薬組成物として患者に投与する場合、その投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により変化するが、ＤＮＡ含量として０．１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１μｇ〜５０ｍｇである。投与方法には、静脈注射、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。

【0032】

本発明のＣＴＬ誘導方法は、がん反応性ＣＴＬを提供するものである。本発明において「がん反応性」とは、標的がん細胞上のがん抗原ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を認識し、その細胞を傷害しうる性質を有することを意味する。ＣＴＬの誘導は、例えば、がん患者から採取されたＰＢＭＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明のペプチドの存在下培養することにより行う。本発明の方法により誘導されるＣＴＬは、養子免疫療法、すなわちＰＢＭＣを採取した患者体内に誘導したＣＴＬを戻してがん細胞を傷害するがん治療法に有用である。つまり本発明の方法により誘導されるＣＴＬは、がん、特に転移性がんを治療または予防、あるいは転移を予防するための医薬として使用可能である。

【0033】

本発明のＣＴＬ誘導キットは、前記ＣＴＬ誘導方法を実施するために用いられる。本発明のキットは、本発明のペプチドを１または２種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含んでもよい。

【0034】

本発明の抗原提示細胞調製方法は、がん細胞を傷害するＣＴＬを誘導するための抗原提示細胞を提供するものである。抗原提示細胞の調製は、例えば、がん患者由来の抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチドをパルスして取り込ませるか、あるいはそのような細胞に本発明のベクターを周知の方法により導入し発現させることにより行う。抗原提示能を有する細胞は例えば樹状細胞であり、患者より採取されたＰＢＭＣから培養プレート接着細胞を分離し、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で約１週間培養することにより調製することができる。本発明の方法により調製された抗原提示細胞は、その細胞表面に提示するペプチドとＨＬＡ分子との複合体を特異的に認識するＣＴＬを誘導することができ、患者に投与されると患者体内でがん反応性ＣＴＬの誘導を促進することができる。つまり本発明の方法により調製される抗原提示細胞は、がんを処置または予防するための医薬として使用可能である。

【0035】

本発明の抗原提示細胞調製キットは、前記抗原提示細胞調製方法を行うために用いられる。本発明のキットは、本発明のペプチドを１または２種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含むこともできる。

【0036】

本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例により制限されるものではない。

【実施例1】

【0037】

がん患者血漿中の抗ペプチドＩｇＧ抗体の測定
本発明者らはＨＬＡ−Ａ２結合性ならびにＨＬＡ−ＤＲ結合性を指標にｉｎ ｓｉｌｉｃｏスクリーニングを行い、９４種類のペプチドを特定し、これらのペプチドをペプチド純度７０％以上となるよう作製した。

【0038】

患者血漿３２例中（肺がん４例、膀胱がん３例、肝臓がん４例、前立腺がん４例、乳がん３例、膵臓がん３例、胆道がん３例、大腸がん３例、胃がん３例、食道がん２例）の、各被検ペプチドに対する抗ペプチドＩｇＧ抗体をＬｕｍｉｎｅｘ法（Komatsu N, Shichijo S, Nakagawa M, Itoh K., Scand J Clin Invest 2004;64:1-11.）にて測定した。なお、本明細書において各ペプチドの名称は、当該ペプチドのＣ末端アミノ酸のＬｃｋタンパク質の配列上の位置を示す数値をＬｃｋのあとに続けたものである。また、明細書の一部においてはＣ末端アミノ酸の位置とＮ末端アミノ酸の位置をＬｃｋのあとに続きけた標記としている。

【0039】

各患者の末梢血より得た希釈血清（１００μL）と被検Ｌｃｋ由来ペプチドをコートしたカラーコードビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ （Ａｕｓｔｉｎ, ＴＸ, ＵＳＡ）（５μL）を９６ウェルフィルタープレート（ＭＡＢＶＮ１２５０, Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ., Ｂｅｄｆｏｒｄ, ＭＡ, ＵＳＡ）のウェルに投入し、プレートをプレートシェーカー上にて室温で１．５時間振とうしながらインキュベートした。１．５時間後、プレートのウェル内のビーズをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳにて洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＢＡ−３０８０（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢ, ＣＡ, ＵＳＡ）（１００μＬ）と添加してプレートシェーカー上で振とうしながら１時間室温で反応させた。プレート中のビーズを洗浄し、ストレプトアビジン標識ＰＥ（１００μＬ）（Ｓ−８６６,Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｅｕｇｅｎｅ, Ｏｒｅｇｏｎ, ＵＳＡ）を加え、プレートシェーカー上で振とうしながら３０分間室温で反応させた。ビーズを３回洗浄し、続いてＴｗｅｅｎ−ＰＢＳ（１００μＬ）を各ウェルに添加し、１００μＬの試料をＬｕｍｉｎｅｘ（商標）で測定し、測定値（蛍光強度：ＦＩＵ）が５０より大きい値である場合を抗体陽性とした。全３２例を測定した結果、抗体陽性率が比較的高かった１７種のペプドにつき、がん患者において当該ペプチドに対する抗体を産生しやすいと判断し、以下の試験に用いた。試験に用いた１７ペプチドを下記表１に示す。表中ＩＡ２としたのはｉｎ ｓｉｌｉｃｏスクリーニングにおいてＨＬＡ−Ａ２結合性が示唆されたペプチドを、IIDRとしたのは同ＨＬＡ−ＤＲ結合性が示唆されたペプチドを意味する。

【0040】

【表1】

【実施例2】

【0041】

ＣＤ８（＋）ＩＮＦ−γ（＋）細胞誘導
実施例１でがん患者において抗ペプチド抗体を産生しやすいことが分かった１７ペプチドを、純度９５％以上で合成した。ペプチドはＤＭＳＯ溶液として培地へ添加した。各ペプチドのＣＤ８陽性ＣＦＮ−γ陽性Ｔ細胞の誘導能をＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇにより検討した。まず、凍結保存していたＨＬＡ−Ａ２陽性のがん患者由来のＰＢＭＣを解凍し、１０μｇ／ｍＬのペプチドを含む培養液にて５日間培養した（Ｄａｙ０−５）。次いでＤａｙ５、８、１１および１４に１０μｇ／ｍＬのペプチドを含む培養液で培地交換を行い、細胞をペプチドで刺激した。

【0042】

各患者のＨＬＡならびに癌腫を表２に示す。

【表2】

【0043】

細胞の刺激終了後、培養液に１０μｇ/ｍＬのペプチドおよびＧｏｌｉｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、細胞外分泌物（ＩＦＮ−γ等）の細胞外分泌を抑制して細胞内に留めさせる試薬）ならびにＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ） を含む培養液で５時間培養後、細胞を洗浄し、蛍光標識された抗ＣＤ８抗体で４℃、２０分間の染色を行った。染色後、細胞を洗浄した後に、Ｃｙｔｏｐｅｒｍ／Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、細胞固定液）で細胞を固定ならびに細胞膜の透過処理を４℃、２０分間で行った。その後に、蛍光標識した抗ＩＦＮ‐γ抗体で細胞内にあるＩＦＮ−γを染色した。

【0044】

染色された細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で測定し、ＰＢＭＣ中のＣＤ８およびＩＦＮ−γ陽性細胞の割合を算出した。従来よりペプチド特異的ＣＴＬ誘導能が知られ、がんペプチドワクチンとして用いられる既存のＬｃｋ由来ペプチドであるＬｃｋ４２２、ならびにＣＥＦペプチドプール（CEF Peptide Pool Cat#3615-1 (MABTECH))を用いて同じ試験を行った。陰性コントロールとしてはペプチドを添加しないで同じ試験を行った（ＤＭＳＯ）。ＩＦＮ−γ陽性の細胞は、ペプチドによって細胞傷害活性が誘導された細胞を見ていることになる。結果を表３に示す。

【0045】

表３に示されるように、配列番号１〜３が優れたＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導能を有することが分かった。

【0046】

【表3】

【実施例3】

【0047】

細胞傷害活性の検討
細胞傷害活性を検討するにあたり、ＰＢＭＣからのペプチド反応性ＣＴＬの誘導は既報の方法に一部変更を加えて検出した（Hida N, Maeda Y, Katagiri K, Takasu H, Harada M, Itoh K., Cancer Immunol Immunother 2002;51:219-28.）。具体的にはＵ底９６ウェルマイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ, Ｒｏｓｋｉｌｄｅ, Ｄｅｎｍａｒｋ）において各ペプチド（１０μｇ／ｍＬ）を含む培養液２００μＬを用いて、がん患者由来のＰＢＭＣ（１ ｘ １０^５ 細胞／ウェル）を２ウェル一組にて培養した。患者はいずれもＨＬＡ−Ａ２陽性の前立腺がん患者である。

【0048】

用いた培養液は４５％ ＲＰＭＩ １６４０、４５パーセント ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ, Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ, ＭＤ）、１０パーセント ＦＣＳ、２０ Ｕ／ｍＬ インターロイキン‐２（ＩＬ−２）および０．１ｍＭ ＭＥＭ 非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）より構成されている。培養は、３または４日毎に培養液の半分を除去して対応ペプチド（２０μｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２（２０ Ｕ／ｍＬ）を含む新しい培養液と交換して行った。そして培養１５日目に細胞傷害活性の測定にこれらの細胞を用いた。

【0049】

細胞傷害活性に用いる標的細胞は、Ｌｃｋを発現するＨＬＡ−Ａ１１陽性肺がん細胞株のＳＱ−１およびＨＬＡ−Ａ２陽性結腸腺がん細胞株のＳＷ６２０を用いた。ＳＱ−１は１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、ＳＷ６２０は１０％ＦＣＳ含有ＥＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で培養した後に測定に用いた。

【0050】

ペプチド刺激ＰＢＭＣ（エフェクター細胞）の細胞傷害活性の測定は、各標的細胞に対する^５１Ｃｒ放出測定法により測定した。まず、丸底９６ウェルプレートにおいて各ウェルにつき２０００個の^５１Ｃｒで標識した標的細胞を、エフェクター細胞/標的細胞の比率を変えて６時間で共培養し、培養上清中の放射線量を測定することで、細胞傷害の結果、細胞外に放出された特異的^５１Ｃｒ放出を以下の式により計算した。

【0051】

特異的放出＝（被験試料の放出‐自然放出）／（最大放出‐自然放出）Ｘ１００

【0052】

エフェクター細胞なしで^５１Ｃｒ標識細胞を培養した場合の上清中の^５１Ｃｒ量が自然放出であり、^５１Ｃｒ標識細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）を添加して培養した場合の上清中の^５１Ｃｒ量が最大放出である。特異的放出は、傷害された標的細胞の割合、すなわち細胞傷害活性を示す。結果を図１〜３に示す。

【0053】

配列番号１〜３の本発明のペプチド刺激により誘導されたＴ細胞は、Ｌｃｋ^＋ＨＬＡ−Ａ２^＋細胞株であるＳＷ６２０を傷害したが、Ｌｃｋ^＋ＨＬＡ−Ａ２４／Ａ１１^＋細胞であるＳＱ−１細胞を傷害しなかった。

【実施例4】

【0054】

配列番号１〜３のペプチドによるＣＴＬの誘導が、ＨＬＡクラスＩ拘束性であるかどうかを確認するために、細胞傷害活性の測定の際に１０μｇ／ｍＬの抗‐ＨＬＡ‐クラスＩ（Ｗ６／３２：マウスＩｇＧ２ａ）または抗‐ＣＤ８（Ｌ２４３：マウスＩｇＧ２ａ）抗体をエフェクター細胞と^５１Ｃｒ標識した標的細胞の共培養時にウェルへ添加して、特異的放出量すなわち細胞傷害活性に与える影響も測定した。結果を図４から６に示す。

【0055】

いずれの抗体を共存させた場合にも、^５１Ｃｒの放出量が抑制され、本願発明のペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性の細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。

【実施例5】

【0056】

部分ペプチドを提示する細胞に対する細胞傷害活性
配列番号２または３のペプチドにより誘導したＣＴＬの、その部分ペプチドを提示したＴ２細胞に対する細胞傷害活性を調べた。
ペプチドによるＣＴＬ誘導ならびに細胞傷害活性の測定は実施例３に示す方法に従って行った。
ＰＢＭＣとしては患者番号７５７および７２８の患者（いずれもＨＬＡ−Ａ２、Ａ２４陽性の大腸がん患者）から得たＰＢＭＣを用いた。実施例３と同じスケジュールで配列番号２または３のペプチドで刺激して細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。

【0057】

細胞傷害活性の測定に用いる標的細胞として、Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ２モチーフとして知られるＬｃｋ３７５−３８３（配列番号１９）、Ｌｃｋ３７７−３８４（配列番号２０）またはＬｃｋ４８７−５０１（配列番号２１）でパルスした細胞を用いた。また比較対象としてＨＬＡ−Ａ２に結合するＨＩＶ由来ペプチド（Ｇａｇ７７ ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ：配列番号２２）でパルスしたＴ２細胞を用いた。T2細胞は細胞表面に発現するHLA分子にペプチド断片を結合させる過程で必要なTAP（transporter associated with antigen processing）分子が欠損している。Ｔ２細胞表面には通常ペプチドを結合しない形でＨＬＡ分子が発現されている。この細胞に、in vitroでペプチドをパルスすると、ＨＬＡ―Ａ２結合モチーフを有するペプチドが、空のＨＬＡ分子に結合する。すなわち、本試験で標的細胞として用いた細胞は、Ｌｃｋ３７５−３８３、Ｌｃｋ３７７−３８４またはＬｃｋ４８７−５０１がＨＬＡ−Ａ２に結合して表面に提示された細胞である。

【0058】

結果を図７に示す。図７に示されるようにＨＬＡ−Ａ２陽性患者由来のＰＢＭＣにおいてＬｃｋ３７４−３８８（１５残基）によって誘導されたＴ細胞がこの配列に含まれるＨＬＡクラスＩ結合ペプチドＬｃｋ３７５−３８３またはＬｃｋ３７７−３８４（それぞれ９残基および８残基）を提示したＴ２細胞に対して傷害活性を示した。すなわち、前者のペプチドの刺激によって後者のペプチドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞が誘導された。Ｌｃｋ４８７−５０１（１５残基）も同様に、Ｌｃｋ４８９−４９７（９残基アミノ酸からなるペプチド）を提示したＴ２細胞に対して傷害活性を示すことを確認した。

【実施例6】

【0059】

マウス腫瘍モデル由来脾臓細胞のペプチド特異的細胞傷害活性の誘導
ＢＡＬＢ／ｃマウスにＬｃｋを発現する腫瘍細胞株Ｃｏｌｏｎ２６を移植した。コントロール群としては腫瘍移植を行わないマウスを用いた。

【0060】

移植後３６日目に腫瘍移植群（ｎ＝８）とコントロール群（ｎ＝８）（腫瘍移植無し）から脾臓を摘出した。両群から得られた脾臓細胞を１０％ＦＢＳ＋０．１％２−メルカプトエタノール＋１％ペニシリン・ストレプトマイシン／ＲＰＭＩ１６４０培地で調整し、Ｌｃｋ３７４−３８８（配列番号２）またはＬｃｋ４８７−５０１（配列番号３）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加して３日間培養した。Ｍｏｃｋ群は各細胞を培地のみで同様に培養した。

【0061】

得られた細胞のペプチド特異的ＣＴＬ活性は細胞のＩＦＮ−γ産生能をＥＬＩＳＰＯＴ法にて測定することにより評価した。ＥＬＩＳＰＯＴ法はＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴキット（MABTECH）を用いて実施した。

【0062】

３日間の細胞培養終了後、細胞をカウントし、１０％ＦＢＳ＋０．１％２−メルカプトエタノール＋１％ペニシリン・ストレプトマイシン／ＲＰＭＩ１６４０培地中で調整した。

【0063】

抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（mAb-AN 18 Cat#3321-3-1000, MABTECH）を固相化したニトロセルロースメンブレンプレート（Multi Screen HTS Filter Plate Ca#MSHAS4510, Millipore）に、２×１０^５／ｗｅｌｌとなるよう調整した細胞を添加した。
ペプチドを１０−２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製したプレートへ添加した。Ｍｏｃｋ群には何も添加しなかった。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１６時間以上培養した。

【0064】

培養終了後、細胞を洗浄した。キット製造元の説明にしたがい、ビオチン結合抗マウスＩＦＮ−γ ｍＡｂ、ストレプトアビジン−ＡＬＰ、およびＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を用いてスポットを可視化した。スポット数は、ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（CTL-ImmunoSpot, Cellular Technology, Ltd.）を用いて計測した。各群のＭｏｃｋを１としてスポット数の相対値を比較した。結果を下記表に示す

【0065】

【表4】

【0066】

表４より、腫瘍移植群はコントロール群と比してＩＦＮ−γ産生細胞の増加が確認された。腫瘍の増殖により、生体内においても両ペプチドに対する細胞性免疫が活性化していることが示唆される。

【実施例7】

【0067】

癌患者由来ＰＢＭＣに対する各ペプチドのＣＴＬ誘導能の評価
癌患者由来ＰＢＭＣを各ペプチドで刺激した場合のＣＴＬ誘導能を、各細胞からのＩＦＮ−γの放出をＥＬＩＳＰＯＴ法にて測定することにより確認した。
ＥＬＩＳＰＯＴ法はＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴキット（mAb-1-D1K、Cat＃3420-3-1000, MABTECH）を用いて行った。
各患者の末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）を１０％ＡＢ型ヒト血清（Gemini Biosciences)を添加したＩＭＤＭ（Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco）で調整し、５×１０^５／ｗｅｌｌとなるよう９６穴丸底プレートへ添加した。各ウエルへＬｃｋ３７４−３８８（配列番号２）またはＬｃｋ４８７−５０１（配列番号３）ペプチドを１０−２０μｇ／ｍｌとなるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４日間培養した。Ｍｏｃｋ群には何も添加せずに同様に培養した。
一方、ＥＬＩＳＰＯＴ用ニトロセルロースメンブレンプレート（Multi Screen HTS Filter Plate Ca#MSHAS4510, Millipore）に抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体を固相化し、３７℃、１時間ブロッキングした。
培養後のＰＢＭＣをカウントし、新たな１０％ ＡＢ型ヒト血清／ＩＭＤＭ中に懸濁し、５×１０^５／ｗｅｌｌとなるよう抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を固相化したニトロセルロースメンブレンプレートへ添加した。ここへペプチドを１０−２０μｇ／ｍｌ添加し、１６時間以上、３７℃、５％の条件下で培養した。
培養終了後、細胞を洗浄した。洗浄後、キット製造元の説明にしたがい、ビオチン結合抗ヒトＩＦＮ−γｍＡｂ、ストレプトアビジン−ＡＬＰ、およびＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を用いてＩＦＮ−γが結合したスポットを可視化した。各フィルターの画像を撮影し、スポット数を計測した。スポット数は、ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（CTL-ImmunoSpot, Cellular Technology, Ltd.）を用いて計測した。
がん患者のＨＬＡならびに罹患しているがん種を下記表５に示す：

【表5】

【0068】

ＥＬＩＳＰＯＴを用いたT細胞応答の結果を図８に示す。図中の数値はスポット数を示す。配列番号２または３のペプチドで癌患者末梢血リンパ球を刺激することによってペプチド特異的にＩＦＮ−γを産生する細胞傷害性細胞が誘導された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]