【図1A】ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸のアラインメント。ＢＣ及びＦＧループは、配列番号１８の残基２２〜２８及び７５〜８６を枠で囲んで示す。一部の変異体は、熱安定性を高めるＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ及びＥ８６Ｉ置換を含む（残基の番号付けはテンコン（配列番号１）に基づく）。

【図1B】ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸のアラインメント。ＢＣ及びＦＧループは、配列番号１８の残基２２〜２８及び７５〜８６を枠で囲んで示す。一部の変異体は、熱安定性を高めるＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ及びＥ８６Ｉ置換を含む（残基の番号付けはテンコン（配列番号１）に基づく）。

【図2】テンコン２７の骨格（配列番号９９）及びランダム化されたＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧの別の表面を有するＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号１００）の配列アラインメント。ループ残基は、枠で囲んで示す。ループ及び鎖は配列の上に示される。

【図3】ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アラインメントＣループ及びＣＤ鎖、並びにＦループ及びＦＧ鎖は枠で囲んで示してあり、残基２９〜４３及び６５〜８１にわたっている。

【図4】一重特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子で前処理し、ＨＧＦで刺激した、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害を示す。一重特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５、図にＡ５として示される）の単独、又はＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとの組合わせ（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２、図に８３ｖ２として示される）と比較した場合に、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ１）の効能の有意な増大が認められた。

【図5】一重特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子で前処理した細胞におけるＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害。高いレベルのＥＧＦＲ、ＮＣＩ−Ｈ２９２（図５Ａ）及びＨ５９６（図５Ｂ）を発現している細胞株では、抗ＥＧＦＲ一重特異性及び二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲのリン酸化の減少に同様の効能がある。ｃ−Ｍｅｔに対して低いレベルのＥＧＦＲを発現している細胞株であるＮＣＩ−Ｈ４４１（図５Ｃ）では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、一重特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン単独と比較してＥＧＦＲリン酸化の阻害効能を向上させている。ＥＧＦＲに対してｃ−Ｍｅｔのレベルが低い細胞株であるＮＣＩ−Ｈ２９２（図５Ｄ）及びＨ５９６（図５Ｅ）では、一重特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン単独と比較して、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子によってｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害効果は有意に増大している。この試験で使用した分子は、二重特異性ＥＣＢ５（図で１７−Ａ３として示される）、一重特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインＰ５３Ａ１Ｒ５−１７（図で１７として示される）、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子ＥＣＢ３（図で８３−Ｈ９として示される）、及び一重特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＰ１１４ＡＲ７Ｐ９３−Ｈ９（図でＨ９として示される）であった。

【図6】二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を６時間又は７２時間投与したマウスから単離された腫瘍における薬物力学的シグナル伝達いずれの分子も６時間後及び７２時間後にｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、及びＥＲＫのリン酸化を有意に低減させたが、阻害の程度は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＦＮ３ドメインの親和性に依存した。二重特異性分子は、高親和性（図の８３はｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２である）又は中親和性（図の１７ｖ２はＰ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２である）のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、高親和性（図のＡ３はＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３である）又は中親和性（図のＡ５はＰ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５である）のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと連結することによって生成した。

【図7】アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）と連結された親和性の異なる二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の血漿（上図）及び腫瘍（下図）への蓄積を、ＩＰ投与の６時間（左図）及び７２時間後（右図）に示す。投与６時間後に、中親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１７ｖ２）又は高親和性ＥＧＦＲ結合ドメイン（８３ｖ２）を有する二重特異性分子を投与したマウスにおいて腫瘍への蓄積は最大となった。二重特異性分子には、高親和性又は中親和性のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、８３ｖ２−Ａ５−ＡＢＤ（ＥＣＢ１８；ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔに対して高／中）、８３ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８；高／高）、１７ｖ２−Ａ５（ＥＣＢ２８；中／中）、１７ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３９；中／高）で組み込んだ。図中、８３ｖ２はｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２を指し、１７ｖ２はｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２を指し、Ａ３はｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３を指し、Ａ５はｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５を指す。

【図8】Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスに移植した。腫瘍が約８０ｍｍ³の平均体積に達した時点で、マウスに二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（２５ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢＳ溶媒を週３回投与した。いずれの二重特異性分子も腫瘍増殖を低下させ、腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）はｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲに対する分子の親和性に依存した（高ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３８）を指し、高ＥＧＦＲ−中ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ１８）を指し、中ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３９）を指し、中ＥＧＦＲ−中ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ２８）を指す。）

【図9】Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスに移植し、マウスを異なる治療薬で処置した。治療薬の抗腫瘍活性を示す（二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８）を指す。他の治療薬は、クリゾチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、及びクリゾチニブとエルロチニブの併用である。）

【図10】ＳＫＭＥＳ−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスに移植し、マウスを異なる治療薬で処置した。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ³）の変化として示す。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体ＥＭ１−ｍＡｂを、２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇを週２回、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、セツキシマブは２０ｍｇ／ｋｇを週２回腹腔内投与した。図の矢印は投与日を示す。抗体の後の数値は、投与した用量を示す。

【図11】ＨＣＣ８２７腫瘍異種移植片をヌードマウスに移植し、そのマウスを示した用量のエルロチニブ又はＥＭ１−ｍＡｂで処置した。ＥＭ１−ｍＡｂは週２回、エルロチニブは１日１回、４週間にわたって投与した。図の矢印は投与日を示す。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ³）の変化として示す。

【図12】ＳＮＵ−５腫瘍異種移植片をＣＢ１７／ＳＣＩＤマウスに移植し、そのマウスを１０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ、又は１０ｍｇ／ｋｇ若しくは１ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂで処置した。抗体は週２回、４週間にわたって投与した。図の矢印は投与日を示す。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ³）の変化として示す。

【図13】Ｈ１９７５−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をヌードマウスに移植し、そのマウスを１０ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ、１０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂ、５０ｍｇ／ｋｇのエルロチニブ、１５ｍｇ／ｋｇのアファチニブ、又は１０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂと１５ｍｇ／ｋｇのアファチニブの組合わせで処置した。抗体は週２回、小分子は１日１回、３週間にわたって投与した。図の矢印は投与日を示す。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ³）の変化として示す。

【図14】ＨＣＣ８２７−ＥＲ１腫瘍異種移植片をヌードマウスに移植し、そのマウスを１０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂ、２５ｍｇ／ｋｇのエルロチニブ、又はこれらの組合わせで処置した。ＥＭ１−ｍＡｂは週２回、エルロチニブは１日１回、１９日間にわたって投与した。図の矢印は投与日を示す。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ³）の変化として示す。

【図15】２０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂの単回投与後のＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスに移植されたＨ１９７５ＨＧＦ腫瘍異種移植片から単離した腫瘍ライセート中の平均のＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔレベル。受容体のレベルは、処置後の示された時間におけるＰＢＳコントロールの％として示した。

【図16】Ｈ１９７５−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をヌードマウスに移植し、そのマウスを１０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂ、又はＦｃ受容体の結合がなくエフェクター機能が欠如した１０ｍｇ／ｋｇのＥＭ１−ｍＡｂ変異体ＩｇＧ２Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓで処置した。抗体は週２回、示された日に投与した。治療薬の抗腫瘍活性を、経時的な腫瘍サイズ（ｍｍ³）の変化として示す。