特許 6426661 Ｇタンパク質共役型受容体変異体及びその選択方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6426661

(24)【登録日】2018年11月2日

(45)【発行日】2018年11月21日

(54)【発明の名称】Ｇタンパク質共役型受容体変異体及びその選択方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20181112BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20181112BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20181112BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20181112BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20181112BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20181112BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20181112BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20181112BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/12ZNA

   C12Q1/02

   C12Q1/68

   C07K14/705

   C12N5/10

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

【請求項の数】6

【外国語出願】

【全頁数】64

(21)【出願番号】特願2016-129938(P2016-129938)

(22)【出願日】2016年6月30日

(62)【分割の表示】特願2014-100213(P2014-100213)の分割

【原出願日】2008年3月20日

(65)【公開番号】特開2016-187348(P2016-187348A)

(43)【公開日】2016年11月4日

【審査請求日】2016年8月1日

(31)【優先権主張番号】0705450.5

(32)【優先日】2007年3月22日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】0724052.6

(32)【優先日】2007年12月8日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】509264947

【氏名又は名称】ヘプテアズ・セラピューティクス・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】リチャード・ヘンダーソン

(72)【発明者】

【氏名】クリストファー・ゴードン・テート

(72)【発明者】

【氏名】フランシスカ・マグナニ

(72)【発明者】

【氏名】マリア・ジョセファ・セラノ−ベガ

(72)【発明者】

【氏名】柴田 庸子

(72)【発明者】

【氏名】アンソニー・ヨハネス・ウォーン

(72)【発明者】

【氏名】マルコム・ピーター・ウェアー

【審査官】 上條 肇

(56)【参考文献】

【文献】 European journal of biochemistry. 2002, Vol.269, No.1, p.82-92

【文献】 Brain research. 2006, Vol.1108, No.1, p.1-11

【文献】 The Journal of biological chemistry. 1998, Vol.273, No.26, p.16351-16357

【文献】 The Journal of biological chemistry. 2000, Vol.275, No.1, p.328-336

【文献】 Molecular pharmacology. 2006, Vol.70, No.3, p.838-850

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

Ｃ０７Ｋ １４／００ − １９／００

Ｃ１２Ｑ １／００ − ３／００

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

増大した立体構造の安定性を有するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を選択するための方法であって、
（ａ）親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を発現する宿主細胞を提供する工程、
（ｂ）親ＧＰＣＲの前記１つ又は複数の変異体を可溶化する工程、
（ｃ）親ＧＰＣＲが特定の立体構造にある際に前記親ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択する工程であって、前記リガンドが、検出可能に標識されている、工程、
（ｄ）界面活性剤の存在下でリガンド結合能の損失によって現れる変性を測定することによって、選択したリガンドの結合について親ＧＰＣＲの立体構造の安定性と比較して、各ＧＰＣＲ変異体が、前記リガンドの結合について増大した立体構造の安定性を有するか否かを測定する工程、及び
（ｅ）選択したリガンドの結合について親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造の安定性を有する変異体を選択する工程であって、工程（ｄ）においてＧＰＣＲが備える前記特定の立体構造が、工程（ｃ）において選択されるリガンドの分類に対応する工程、
を含み、
前記特定の立体構造が、アゴニスト又はアンタゴニスト立体構造である、
方法。

【請求項2】

前記方法が一回又は複数回繰り返され、前記方法に続く回では、工程（ｅ）において選択された変異体が親ＧＰＣＲを表す、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記リガンドが、完全なアゴニスト、部分的なアゴニスト、逆アゴニスト、及びアンタゴニストのいずれか１つである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記リガンドが、蛍光標識又は放射標識される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記宿主細胞が、細菌又は真核生物細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記細菌細胞が、大腸菌である、請求項５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）変異体及び増大した安定性を有するものを選択する方法に関する。特に、本発明は、それらの各々の親タンパク質と比較して、特定の条件下において増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体の選択及び調製に関する。その様なタンパク質は結晶化可能である可能性がより高く、そのため、親タンパク質よりも構造決定に適している。それらは、薬剤探索及び開発のための研究にも有用である。

【背景技術】

【0002】

過去２０年間に亘って、膜タンパク質の構造決定の速度は次第に向上されてきたが、大半の成功は、真核生物よりもむしろ細菌由来の膜タンパク質の結晶化におけるものであった（非特許文献１）。細菌の膜タンパク質は、大腸菌における標準的な技術を用いて、真核生物の膜タンパク質よりも容易に過剰発現することができ（非特許文献２及び３）、細菌タンパク質は場合によっては界面活性剤により安定であり、界面活性剤に対する安定性は、精製及び結晶化に本質的に必要な条件である。ゲノム配列決定プロジェクトは、特定のトランスポーター又はイオンチャンネルの多数のホモログのクローニング及び発現を可能にし、結晶化の成功率も非常に大きく改善した。しかしながら、現在までに解析されている１２０の異なる膜タンパク質構造のうち、７種のみの哺乳動物の完全な膜タンパク質の構造が存在し（http://blanco.biomol.uci.edu/)、これらの膜タンパク質の５種が天然の起源から精製されて、界面活性剤の溶液中で安定である。真核生物の膜タンパク質の過剰発現における困難性とは別に、真核生物の膜タンパク質は、多くの場合に、界面活性剤の溶液中において乏しい安定性を示し、それらが即時に変性又は沈殿せずに試験することが可能な結晶化条件の範囲が非常に制限される。理想的には、膜タンパク質は、任意の所定の界面活性剤溶液中において数日間に亘って安定であるべきであるが、回折に利用可能な品質の結晶を成長させるために最も適切な界面活性剤は、最も不安定化する界面活性剤、すなわち、短い脂肪族鎖と小さい若しくは荷電した頭部基と有するものである傾向がある。ヒトの膜タンパク質は医薬産業による治療剤開発に利用するために必要とされており、多くの場合において各種の異なる哺乳動物由来の受容体、チャンネル、及びトランスポーターには実質的に薬理学的な差異が存在する一方で、任意のホモログタンパク質が酵母及び細菌のゲノムには含まれていない可能性があることから、我々が解析したいものもヒトの膜タンパク質の構造である。かくして、結晶化及び構造決定並びに薬剤スクリーニング、バイオアッセイ、及びバイオセンサーにおける用途などの他の目的のために、界面活性剤に安定な真核生物の完全な膜タンパク質の生産を可能にする一般的な戦略の開発が非常に必要とされている。

【0003】

膜タンパク質は、細胞の生存能を保障するために膜において十分に安定であるように進化したが、界面活性剤溶液中で安定であるようには進化せず、このことは、膜タンパク質を人工的に進化させ、界面活性剤に安定な変異体を単離し得ることを示唆している（非特許文献４）。これが、その後、２種の細菌タンパク質、すなわち、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）（非特許文献５及び６）並びにバクテリオロドプシン（非特許文献７）について実証された。ＤＧＫのランダム変異誘発によって、熱安定性を増大する特定の点変異が同定され、組み合わせた際に、天然のタンパク質が５５℃で６分の半減期を有するのと比較して、最適な安定変異体が８０℃で３５分の半減期を有したため、その効果は相加的であった（非特許文献６）。界面活性剤耐性ＤＧＫ変異体の三量体がＳＤＳ中で安定になり、かくして、オリゴマー状態の安定性が熱安定性において重要な役割を担っているようであることが示された。変異誘発の目的は結晶化に適切な膜タンパク質を生産することであるが、ＤＧＫの構造は未だ決定されておらず、成功裡に結晶化したという報告は存在しない。へリックスＢに沿ったシステインスキャニング変異誘発によるバクテリアオロドプシンに対する更なる試験は、変異によって熱安定性を誘導するアミノ酸残基を予測することは不可能であり、構造における試験の際に、なぜ熱安定性が生じるのか明らかでないことを示した（非特許文献７）。

【0004】

ＧＰＣＲは、多数の生理プロセスを調節する非常に大きなタンパク質ファミリーを構成し、多数の効果的な薬剤の標的である。かくして、それらは、非常に薬理学的に重要なものである。ＧＰＣＲの一覧は、参照によって本明細書に取り込むFoord et al (2005) Pharmacol Rev. 57, 279-288に挙げられている。ＧＰＣＲは一般的には単離した際に不安定であり、数多くの努力が為されたにもかかわらず、例外的に天然に安定であるウシロドプシン以外のものを結晶化することができなかった。

【0005】

ＧＰＣＲは新薬の開発につながるような標的であり、現在の薬剤の四分の一超がＧＰＣＲを標的とすることを示すOverington et al (2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996が特に参照される。

【0006】

ＧＰＣＲは、アゴニスト及びアンタゴニストなどの各種の薬理学的な種類のリガンドと結合する多数の異なる立体構造で存在し、機能するためにこれらの立体構造の間で循環すると解されている（Kenakin T. (1997) Ann N Y Acad Sci 812, 116-125）。

【0007】

本発明の方法は、２１０位のＴｈｒ残基はＡｌａ残基で置換された不活性変異体ヒトカンナビノイド受容体１（Ｔ２１０Ａ）に対する［^３Ｈ］ＣＰ５５９４０の結合を含むＤ’Ａｎｔｏｎａらによって公開された方法を含まないと解されるであろう。

【0008】

本明細書に記載の明らかに過去に公開された文献の記載又は議論は、必ずしも、その文献が従来技術の一部であるか又は一般的な技術常識であると認めるものと解されるべきではない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】S. H. White (2004) Protein Sci 13, 1948-1949.

【非特許文献2】C. G. Tate (2001) FEBS Lett 504, 94-98.

【非特許文献3】R. Grisshammer, C. G. Tate (1995) Q Rev Biophys 28, 315-422.

【非特許文献4】J. U. Bowie (2001) Curr Opin Struct Biol 11, 397-402.

【非特許文献5】F. W. Lau, S. Nauli, Y. Zhou, J. U. Bowie (1999) J Mol Biol 290, 559-564.

【非特許文献6】Y. Zhou, J. U. Bowie (2000) J Biol Chem 275, 6975-6979.

【非特許文献7】S. Faham, D. Yang, E. Bare, S. Yohannan, J. P. Whitelegge, J. U. Bowie (2004) J Mol Biol 335, 297-305.

【非特許文献8】Y. Yarden, H. Rodriguez, S. K. Wong, D. R. Brandt, D. C. May, J. Burnier, R. N. Harkins, E. Y. Chen, J. Ramachandran, A. Ullrich, et al (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6795-6799.

【非特許文献9】T. Warne, J. Chirnside, G. F. Schertler (2003) Biochim Biophys Acta 1610, 133-140.

【非特許文献10】E. M. Parker, E. M. Ross (1991) J Biol Chem 266, 9987-9996.

【非特許文献11】E. M. Parker, K. Kameyama, T. Higashijima, E. M. Ross (1991) J Biol Chem 266, 519-527.

【非特許文献12】W. J. Degrip (1982) Methods in Enzymology 81, 256-265.

【非特許文献13】K. Palczewski, T. Kumasaka, T. Hori, C. A. Behnke, H. Motoshima, B. A. Fox, I. Le Trong, D. C. Teller, T. Okada, R. E. Stenkamp, et al (2000) Science 289, 739-745.

【非特許文献14】J. Li, P. C. Edwards, M. Burghammer, C. Villa, G. F. Schertler (2004) J Mol Biol 343, 1409-1438.

【非特許文献15】R. Jaenicke, G. Bohm (1998) Current Opinion in Structural Biology 8, 738-748.

【非特許文献16】J. Tucker, R. Grisshammer (1996) Biochem J 317 ( Pt 3), 891-899.

【非特許文献17】W. Schaffner, C. Weissmann (1973) Anal. Biochem. 56, 502-514.

【非特許文献18】C. G. Tate (1998) Methods Enzymol 296, 443-455.

【非特許文献19】H. M. Weiss, R. Grisshammer (2002) Eur J Biochem 269, 82-92.

【非特許文献20】Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Rosenbaum, D. M., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Edwards, P. C., Burghammer, M., Ratnala, V. R., Sanishvili, R., Fischetti, R. F., Schertler, G. F., Weis, W. I. and Kobilka, B. K. (2007) Nature 15, 383-387.

【非特許文献21】Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K. and Stevens, R. C. (2007) Science 318:1258-1265.

【非特許文献22】Minneman, K. P., Weiland, G. A. and Molinoff, P. B. (1980) Mol Pharmacol 17:1-7.

【非特許文献23】Parker, E. M., Swigart, P., Nunnally, M. H., Perkins, J. P. and Ross, E. M. (1995) J Biol Chem 270:6482-6487.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明者は、界面活性剤中におけるＧＰＣＲの安定性の欠如及びＧＰＣＲが多数の立体構造で存在する事実という、ＧＰＣＲを結晶化する試みに関連する２つの重要な課題が存在することを見出した。機能するために、ＧＰＣＲは少なくとも２種の立体構造、すなわち、アゴニスト結合形態とアンタゴニスト結合形態とで循環するように進化しており、これらの２種の立体構造の間の変化がリガンドの非存在下では頻繁に生じ得る。かくして、任意の精製受容体は、複数の立体構造の混合物を構成するであろう。結晶化を試みている間にＧＰＣＲにリガンドを単純に添加することでは、それらの構造決定には至らない。したがって、結晶化の可能性を改善するために、本発明者は、ＧＰＣＲの安定性を改善した変異体を選択し、加えて、好ましくは、その受容体を特定の生物学的に有意義な立体構造に固定した。

【0011】

本発明者は、特に生物学的に有意義な立体構造における、ＧＰＣＲの安定化が可能であるか否か、及び回折に利用可能な品質の結晶を得る可能性を有意に改善し得るその効果が十分に大きいものであるか否かを調べることとした。実施例１では、シチメンチョウの赤血球由来のβ１アドレナリン受容体（βＡＲ）（非特許文献８）を、多数の理由から本試験の試験対象として選択した。βＡＲは、放射標識された形態における市販の多数のリガンドを用いて十分に開発された薬理作用を有するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。加えて、βＡＲの過剰発現は、特に、バキュロウイルス発現系を用いて成功し、機能的な形態においてミリグラム量において精製し得た（非特許文献９）。実施例２では、ヒトアデノシン受容体を使用し、実施例３では、ラットニューロテンシンを使用した。

【0012】

増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択するための方法
本発明の第一の態様は、増大した安定性を有するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）変異体を選択するための方法であって、
（ａ）親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、
（ｂ）親ＧＰＣＲが特定の立体構造を備えている際に前記ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択する工程、
（ｃ）前記選択したリガンドの結合に関する親ＧＰＣＲの安定性と比較して、前記ＧＰＣＲ変異体又はその各々が前記リガンド結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定する工程、並びに
（ｄ）前記選択したリガンドの結合に関して、親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択する工程
を含む、方法を提供する。

【0013】

本発明者は、生物学的に有意義な形態（すなわち、薬理学的に有用な形態）におけるＧＰＣＲの結晶化可能性を改善するために、前記タンパク質の安定性を増大するだけではなく、前記タンパク質が特定の立体構造にある際に増大した安定性を有することが望ましいと解している。前記立体構造は、選択したリガンドによって決定され、生物学的に有意義な立体構造、特に薬理学的に有意義な立体構造である。かくして、本発明の方法は、特定の立体構造の増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択するための方法であると解されてよく、それらは増大した熱安定性の立体構造を有してよい。前記方法を使用して、安定な立体構造が固定されたＧＰＣＲを変異誘発によって作製してよい。選択されたＧＰＣＲ変異体は、より高い割合のものが特定の立体構造の状態である点で、親分子よりも純度が高い形態である。したがって、所定の受容体の立体構造に選択的に結合する１つ又は複数のリガンドを使用することによって他の立体構造から分離される当該立体構造の慎重な選択は、本発明の重要な特徴である。前記方法は、より結晶化に供しやすいＧＰＣＲ変異体を選択するための方法であると解されてもよい。

【0014】

かくして、本発明の方法は、増大した安定性を有するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）変異体を選択するための方法であって、
（ａ）親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、
（ｂ）親ＧＰＣＲが特定の立体構造を備えている際に前記ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択する工程、
（ｃ）前記選択したリガンドの結合に関する同じ特定の立体構造を備えた親ＧＰＣＲの安定性と比較して、前記ＧＰＣＲ変異体又はその各々が、特定の立体構造を備えている際に、前記リガンドの結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定する工程、並びに
（ｄ）前記選択したリガンドの結合に関して、親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択する工程
を含む、方法を含む。

【0015】

Hopkins & Groom (2002) Nature Rev. Drug Discovery 1, 727-730による新薬の開発につながるようなゲノムのレヴューにおいて、表１には、その多数がＧＰＣＲであるタンパク質ファミリーの一覧が含まれている。Overington et al (2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996は、薬剤標的のより詳細な記載を提供しており、図１は、四分の一超の現在の薬剤がＧＰＣＲを標的とすることを示している。経口薬の１８６種の全標的のうち、５２種のＧＰＣＲ標的が存在する。

【0016】

本発明において使用するのに適切なＧＰＣＲは、β−アドレナリン受容体、アデノシン受容体、特に、アデノシンＡ_２ａ受容体、及びニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）を含むが、それらに限らない。他の適切なＧＰＣＲは当該技術分野においてよく知られており、上述のHopkins & Groom (2002) Nature Rev. Drug Discovery 1, 727-730に挙げられているものを含む。加えて、International Union of Pharmacologyは、ＧＰＣＲの一覧を作成しており（参照によって本明細書に取り込むFoord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288、当該一覧は、http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForwardにおいて定期的に更新されている）。ＧＰＣＲは、それらのアミノ酸配列の類似性に基づいて、各種の異なる種類に分類されることに注意されるであろう。それらは、それらが結合する天然のリガンドによるファミリーにも分類される。全てのＧＰＣＲが本発明の範囲に含まれる。

【0017】

多数のＧＰＣＲのアミノ酸配列（及びそれらをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）は、例えばＧｅｎＢａｎｋを参照することによって、容易に利用可能である。特に、Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288は、Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)に由来するヒトの遺伝子記号並びにヒト、マウス、及びラットの遺伝子ＩＤを挙げている。ヒトゲノムの配列は実質的に完全であるため、ヒトＧＰＣＲのアミノ酸配列は、そこから推定し得ることに注意すべきである。

【0018】

ＧＰＣＲは任意の起源に由来してよいが、真核生物起源に由来することが特に好ましい。哺乳類又は鳥類などの脊椎動物に由来することは特に好ましい。ＧＰＣＲがラット、マス、ウサギ、若しくはイヌ、又はヒトを除く霊長類若しくはヒト、又はニワトリ若しくはシチメンチョウに由来することが特に好ましい。誤解を避けるために、「由来する」の意味には、ｃＤＮＡ又は遺伝子がその起源に由来する遺伝子材料を用いて元々得られたが、タンパク質がその後に任意の宿主細胞において発現されてよいことを含める。かくして、真核生物のＧＰＣＲ（鳥類又は哺乳類のＧＰＣＲ）が、大腸菌などの原核生物の宿主細胞で発現されてよいが、場合によって、鳥類又は哺乳類由来であると解されることは明らかである。

【0019】

ある場合においては、ＧＰＣＲは、２以上の異なるサブユニットからなってよい。例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体は、その生理学的なリガンド結合特性を獲得するために、一回膜貫通へリックスタンパク質（ＲＡＭＰ１）の結合を必要とする。ＧＰＣＲと結合して機能的な複合体を形成又は調節するエフェクタータンパク質、付属タンパク質、補助タンパク質、又はＧＰＣＲ相互作用タンパク質は当該技術分野においてよく知られており、例えば、受容体キナーゼ、Ｇタンパク質、及びアレスチンを含む（Bockaert et al (2004) Curr Opinion Drug Discov and Dev 7, 649-657）。

【0020】

親ＧＰＣＲの変異体は、任意の適切な方法で生産されてよく、任意の適切な形態で提供されてよい。かくして、例えば、親タンパク質の全て又は一部における各アミノ酸残基が独立に他のアミノ酸残基に変換された、親タンパク質の一連の特定の変異体が作製されてよい。例えば、膜を貫通していると予測されるタンパク質の部分に変異を作製することが好都合であってよい。ロドプシンの三次元構造は既知であり（Li et al (2004) J Mol Biol 343, 1409-1438; Palczewski et al (2000) Science 289, 739-745）、当該構造を使用してあるＧＰＣＲのモデルを作製することが可能である。かくして、簡便には、ＧＰＣＲの変異させる部分は、モデルに基づくものであってよい。同様に、疎水性に基づいてＧＰＣＲの膜貫通領域のモデルを作製するコンピュータープログラムを利用することも可能であり（Kyle & Dolittle (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132）、タンパク質の変異させる部分を選択する際にその様なモデルを使用してよい。従来の部位指向性変異導入を使用してよく、又は当該技術分野においてよく知られたポリメラーゼ連鎖反応に基づく手法を使用してよい。望ましいものではないが、タンパク質変異体の選択にリボソームディスプレイ法が使用されてもよい。

【0021】

典型的には、選択された各アミノ酸をＡｌａに置き換える（すなわち、Ａｌａスキャニング変異誘発）が、任意の他のアミノ酸に置き換えてもよい。選択したアミノ酸がＡｌａである場合は、好都合には、Ｌｅｕによって置き換えてもよい。代替的には、前記アミノ酸はＧｌｙに置き換えてもよく（すなわち、Ｇｌｙスキャニング変異誘発）、これは、特定の立体構造にあるタンパク質を固定化してよい隣接するヘリックスのより近接したパッキングを可能にする。選択されたアミノ酸がＧｌｙである場合は、好都合には、Ａｌａによって置き換えてよい。

【0022】

特定の位置における所定のアミノ酸を置き換えるのに使用されるアミノ酸は、典型的には天然のアミノ酸、特に「コード可能な」アミノ酸であるが、非天然アミノ酸（この場合、典型的には、タンパク質は、化学合成又は非天然アミノ酸アシルｔＲＮＡを使用して作製される）であってよい。「コード可能な」アミノ酸は、ｍＲＮＡの翻訳によってポリペプチドに取り込まれるものである。非天然アミノ酸を作製し、又は、例えば、タンパク質の翻訳後修飾若しくは半合成によって共有結合性の化学修飾によって所定の位置に非ペプチド結合を導入することが可能である。これらの翻訳後修飾は、リン酸化、糖鎖付加、又はパルミトイル化などの天然のものであるか又は合成若しくは生合成によるものであってよい。

【0023】

代替的には、前記変異体は、タンパク質全体又はその選択した一部に対するものであってよいランダム変異誘発法によって生産されてよい。ランダム変異誘発法は当該技術分野でよく知られている。

【0024】

好都合には、前記ＧＰＣＲ変異体は、親タンパク質と比較して、１つの置き換わったアミノ酸を有する（すなわち、１つのアミノ酸部位において変異を有する）。このように、単独のアミノ酸を置き換えることによる安定性に対する寄与が評価されてよい。しかしながら、安定性について評価されるＧＰＣＲ変異体は、親タンパク質と比較して２以上、例えば、２、３、４、５、又は６つの置き換わったアミノ酸を有してもよい。

【0025】

以下により詳細に議論しているように、変異の組み合わせが、本発明の選択方法の結果に基づいて為されてよい。幾つかの特定の態様では、１つの変異を有するタンパク質における変異の組み合わせが、安定性における更なる向上を誘導することが認められた。かくして、本発明の方法は、当該方法を実施して安定性を増大する変異を同定し、当該方法の工程（ａ）において提供される１つの変異を有するＧＰＣＲにおいて同定した変異を組み合わせることによって、繰返し使用されてよいと解されるであろう。かくして、多数の変異を有するタンパク質変異体が、本発明の方法を使用して選択されてよい。

【0026】

親ＧＰＣＲは、天然のタンパク質である必要はない。好都合には、大腸菌などの適切な宿主生物中で発現することが可能な遺伝子操作を受けたものであってよい。例えば、実施例１に記載の、好都合に操作したシチメンチョウβ−アドレナリン受容体は、切断されており、アミノ酸配列の１〜３３残基を欠失している（すなわち、βＡＲ_{３４−４２４}）。親ＧＰＣＲは、天然のタンパク質の切断型であるか（一方又は両方の末端が切断されている）、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよい。代替的又は付加的に、親ＧＰＣＲは、天然のＧＰＣＲと比較して、例えば、可溶性、タンパク質分解安定性を改善するために修飾されてよい（例えば、切断、ループの欠失、グリコシル化部位の変異、又はシステインなどの反応性アミノ酸側鎖の変異）。いずれにしても、親ＧＰＣＲは、天然のＧＰＣＲに結合することが既知のものである、選択したリガンドに結合することが可能なタンパク質である。好都合には、親ＧＰＣＲは、適当なリガンドを加えて、Ｇタンパク質活性化によって影響を受けることが一般的に知られている１つ又は複数の下流の活性の任意のものに作用してよい。

【0027】

しかしながら、前記変異体の安定性は、安定性における増大を評価できるため、親と比較されると解されるであろう。

【0028】

特定の立体構造を備えている親ＧＰＣＲに結合するリガンドが選択される。典型的には、前記リガンドは、親ＧＰＣＲの１つの立体構造に結合する（そして、前記ＧＰＣＲに当該立体構造をとらせる）が、ＧＰＣＲが採用し得ない他の立体構造に強力に結合することはない。かくして、前記リガンドの存在は、ＧＰＣＲが特定の立体構造をとらせることを促進すると解されてよい。かくして、本発明の方法は、生物学的に有意義な立体構造（例えば、リガンド結合状態）に捕らわれ、当該立体構造でより安定であるＧＰＣＲ変異体を選択する方法であると解されてよい。

【0029】

好ましくは、ＧＰＣＲが工程（ｃ）で備える特定の立体構造が、工程（ｂ）で選択されるリガンドの種類と対応する。

【0030】

好ましくは、前記選択されるリガンドはアゴニストに分類されるリガンド由来のものであり、前記特定の立体構造はアゴニスト立体構造であるか、又は前記選択されるリガンドはアンタゴニストに分類されるリガンド由来のものであり、前記特定の立体構造はアンタゴニスト立体構造である。

【0031】

好ましくは、前記選択されるリガンドはアゴニストに分類されるリガンドに由来し、ＧＰＣＲが工程（ｃ）で備える特定の立体構造がアゴニスト立体構造である。好ましくは、受容体変異体に対する前記選択されるリガンドの結合親和性は、野生型の受容体に対するもの以上であり、選択されるリガンドに対して顕著に低減した結合を示す変異体は、典型的には、除外される。

【0032】

「リガンド」によって、本願では、ＧＰＣＲに結合し、且つ、ＧＰＣＲに特定の立体構造をとらせる任意の分子が含まれる。好ましくは、前記リガンドは、ＧＰＣＲ分子全体の半分超に特定の立体構造をとらせるものである。

【0033】

多数の適切なリガンドが既知である。

【0034】

典型的には、前記リガンドは完全なアゴニストであり、ＧＰＣＲに結合することが可能であり、例えば、Ｇ−タンパク質結合、下流のシグナル伝達現象、又は血管拡張などの生理学的なアウトプットによって測定される、完全な（１００％の）生物学的応答を誘導することが可能である。かくして、典型的には、前記生物学的応答は、関連するエフェクター経路の刺激後のＧ−タンパク質におけるＧＤＰ／ＧＴＰ交換である。前記測定は、典型的には、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換又はその経路の最終産物（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、又はリン酸イノシトール）のレベルにおける変化である。前記リガンドは、部分的アゴニストであり、ＧＰＣＲに結合することが可能であり、部分的（＜１００％）な生物学的応答を誘導することが可能である。

【課題を解決するための手段】

【0035】

前記リガンドは、受容体に結合する分子であり、その基礎的な（すなわち、アゴニストによって刺激されていない）活性を場合によっては０にまでも低減する逆アゴニストであってもよい。

【0036】

前記リガンドは、受容体に結合し、アゴニストの結合を阻害して、生物学的応答を妨げるアンタゴニストであってもよい。逆アゴニスト及び部分的アゴニストは、あるアッセイ条件下では、アンタゴニストとなり得る。

【0037】

上記リガンドは、オルトステリック（orthosteric）であってよく、これは、それらが内在性アゴニストと同じ部位に結合するという意味を含む。または、それらはアロステリック（allosteric）又はアロトピック（allotopic）であってよく、これは、それらがオルトステリック部位と異なる部位に結合するという意味を含む。上記リガンドはシントピック（syntopic）であってよく、これは、それらが同じ又は重複する部位で他のリガンドと相互作用するという意味を含む。それらは、可逆的又は非可逆的であってよい。

【0038】

アンタゴニストに関しては、サーマウンタブル（surmountable）であってよく、これは、アゴニストの最大の効果が、アンタゴニストを用いた事前処理又は同時処理によって低減されないという意味を含み；或いは、それらはインサーマウンタブル（insurmountable）であってよく、これは、アゴニストの最大の効果が、アンタゴニストの事前処理又は同時処理のいずれかによって低減されるという意味をふくみ；或いは、それらはニュートラル（neutral）であってよく、これは、アンタゴニストが逆アゴニスト又は部分的アゴニスト活性を有しないものであるという意味を含む。典型的には、アンタゴニストは、逆アゴニストでもある。

【0039】

本発明に使用するリガンドは、ポジティブアロステリックモジュレータ、ポテンシエーター、ネガティブアロステリックモジュレータ、及びインヒビターなどのアロステリックモジュレータであってもよい。それらは、それら自体でアゴニスト又は逆アゴニストとしての活性を有してよく、又はそれらはアゴニスト又は逆アゴニストの存在下でのみ活性を有してよく、その場合には、ＧＰＣＲと結合するためにその様な分子と組み合わせて使用される。

【0040】

参照によって本明細書に取り込むNeubig et al (2003) Pharmacol. Rev. 55, 597-606は、各種のリガンドを開示している。

【0041】

好ましくは、上述のリガンドは、低分子の有機又は無機成分であるが、ペプチド又はポリペプチドであってよい。典型的には、前記リガンドが低分子の有機又は無機成分である際は、５０から２０００、１００から１０００など、例えば、１００から５００のＭ_ｒを有する。

【0042】

典型的には、前記リガンドは、ｍＭからｐＭ、例えばμＭ（マイクロモーラー）からｎＭの範囲のＫ_ｄでＧＰＣＲに結合する。一般的には、最も低いＫ_ｄを有するリガンドが好ましい。

【0043】

有機低分子のリガンドは、当該技術分野においてよく知られており、例えば、以下の実施例を参照のこと。他の低分子のリガンドは、５ＨＴ１Ａ受容体において完全なアゴニストである５ＨＴ；５ＨＴ１Ａ受容体に部分的なアゴニストであるエルトプラジン（Newman-Tancredi et al (1997) Neurophamacology 36, 451-459参照）；ドーパミンＤ２受容体アゴニストである（＋）−ブタクラモール及びスピペロン（Roberts & Strange (2005) Br. J. Pharmacol. 145, 34-42参照）；並びにＣＢ２のニュートラルアゴニストであるＷＩＮ５５２１２−３（Savinainen et al (2005) Br. J. Pharmacol. 145, 636-645）を含む。

【0044】

前記リガンドは、ペプチドミメティック、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はアプタマーであってよい。Ｎａ^＋又はＺｎ^＋などのイオン、オレアミドなどの脂質、又はヘパリンなどの炭水化物であってもよい。

【0045】

前記リガンドは、ＧＰＣＲに結合するポリペプチドであってよい。そのようなポリペプチド（オリゴペプチド含む）は、典型的には、５００から５０，０００の分子量であるが、それより大きいものであってもよい。前記ポリペプチドは、天然のＧＰＣＲ相互作用タンパク質又はＧＰＣＲと相互作用する他のタンパク質又はその誘導体若しくは断片であってよいが、特定の立体構造にあるＧＰＣＲに選択的に結合するものである。ＧＰＣＲ相互作用タンパク質は、シグナル伝達と関連するもの及び輸送に関連するものを含み、多くの場合においては、ＧＰＣＲのＣ末端部分のＰＤＺドメインを介して作用する。

【0046】

あるＧＰＣＲに結合することが既知のポリペプチドは、Ｇタンパク質、アレスチン、ＲＧＳタンパク質、Ｇタンパク質受容体キナーゼ、ＲＡＭＰ、１４−３−３タンパク質、ＮＳＦ、ペリプラキン、スピノフィリン、ＧＰＣＲキナーゼ、レセプターチロシンキナーゼ、イオンチャンネル又はそのサブユニット、アンキリン、並びにＳｈａｎｋｓ又はＨｏｍｅｒタンパク質の任意のものを含む。他のポリペプチドは、ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１又はＮＲ２ａ、カルシオン、又はフィブロネクチンドメインフレームワークを含む。前記ポリペプチドは、フィブリンー１などのＧＰＣＲの細胞外ドメインに結合するものであってよい。前記ポリペプチドは、ヘテロオリゴマーにおいて選択したＧＰＣＲを結合する他のＧＰＣＲであってよい。ＧＰＣＲにおけるタンパク質−タンパク質相互作用のレヴューは、参照によって本明細書に取り込むMilligan & White (2001) Trends Pharmacol. Sci. 22, 513-518又はBockaert et al (2004) Curr. Opinion Drug Discov. Dev. 7, 649-657において認められる。

【0047】

ポリペプチドリガンドは、好都合には、ＧＰＣＲに結合する抗体であってよい。用語「抗体」によって、本願では、天然の抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片が含まれる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子及びドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む、遺伝子操作した抗体及びその結合特性において抗体様である分子も含む。ラクダ科の動物の抗体及びラクダ科の抗体であって遺伝子操作したものも挙げられてよい。ＧＰＣＲに結合するその様な分子は当該技術分野において既知であり、任意に、既知の技術を使用して作製されてよい。適切な抗体は、立体構造エピトープを認識する傾向があるため、ＧＰＣＲに対するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で現在使用されているものである。

【0048】

前記ポリペプチドは、アンキリンリピートタンパク質、アルマジロリピートタンパク質、ロイシンリッチタンパク質、テトラトリオペプチドリピートタンパク質、又は設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰ）などのモジュール構成に基づく結合タンパク質、或いはリポカリン若しくはフィブロネクチンドメイン又はヒトγクリスタリン若しくはヒトユビキチンのいずれかに基づくアフィリンスカフォールド（affilin scaffold）であってもよい。

【0049】

本発明の１つの実施態様では、前記リガンドはＧＰＣＲに共有結合し、例えば、Ｇ−タンパク質又はアレスチン融合タンパク質などである。幾つかのＧＰＣＲ（例えば、トロンビン受容体）は、プロテアーゼによってＮ末端で切断され、新しいＮ末端はアゴニスト部位と結合する。かくして、その様なＧＰＣＲは天然のＧＰＣＲ−リガンド融合体である。

【0050】

抗体又は他の「ユニバーサルな」結合ポリペプチド（例えば、多数の異なるＧＰＣＲに結合することが既知のＧタンパク質）の使用は、天然のリガンド及び低分子リガンドが未知の「オーファン」ＧＰＣＲに対する本発明の方法の使用において特に有利であり得ると解されるであろう。

【0051】

一度リガンドが選択されると、当該選択したリガンドの結合に関して親ＧＰＣＲと比較して、前記ＧＰＣＲ変異体又はその各々が、前記リガンドの結合に関して増大した安定性を有するか否かが測定される。当該工程（ｃ）は、選択したリガンドによって決定される特定の立体構造について、前記ＧＰＣＲ変異体又はその各々が（親と比較して）増大した安定性を有するか否かを測定するものである。かくして、前記ＧＰＣＲ変異体は、選択したリガンド結合の間に測定されるか又はリガンド結合によって測定される、選択したリガンドの結合の結合に関して増大した安定性を有する。以下に記載するように、増大した安定性が、選択したリガンドの結合の間に評価されることが好ましい。

【0052】

増大した安定性は、好都合には、不安定にする可能性がある曝露条件下（例えば、熱、強力な界面活性剤条件、及びカオトロピック剤など）における、前記変異体の寿命の延長によって測定される。前記曝露条件下における不安定化は、典型的には、変性又は構造の損失の測定によって測定される。以下に記載するように、これは、リガンド結合能の損失又は二次若しくは三次構造の指標の損失によって現れる。

【0053】

以下の図１２（特に好ましい実施態様を記載する）に関して記載するように、ＧＰＣＲ変異体の安定性を測定するために使用してよい各種のアッセイ形式が存在する。

【0054】

１つの実施態様では、前記ＧＰＣＲ変異体を、当該変異体の安定性を測定する方法に供する前にリガンドと接触させる（前記ＧＰＣＲ変異体及びリガンドは、試験の間に接触した状態のままである）。かくして、例えば、本発明の方法が、１つの立体構造においてリガンドと結合し、且つ、改善された熱安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択するために使用される際は、前記受容体を、加熱される前に前記リガンドと接触させ、次いで、加熱後に前記受容体に結合しているリガンドの量を使用して、親受容体との比較における熱安定性を表わしてよい。これによって、変性条件（例えば、熱）に曝露した後にリガンド結合能を保持しているＧＰＣＲの量の測定が提供され、これが安定性の指標である。

【0055】

代替的（であるが上記のものよりは好ましいものではない）実施態様では、前記ＧＰＣＲ変異体を、前記リガンドと接触させる前に、前記変異体の安定性を測定する手法に供する。かくして、例えば、本発明の方法が、１つの立体構造においてリガンドと結合し、且つ、改善された熱安定性を有する膜受容体変異体を選択するために使用される際は、前記リガンドと接触させる前に、まず前記受容体を加熱し、次いで、前記受容体に結合したリガンドの量を使用して熱安定性を表わしてよい。そして、これによって、変性条件に曝露した後にリガンド結合能を保持しているＧＰＣＲの量の測定が提供される。

【0056】

双方の実施態様において、前記変異体の安定性の比較が、同一の条件下における親分子を参照することによって為されると解されるであろう。

【0057】

これらの実施態様の双方において、選択された変異体は、親タンパク質と比較して、特定の立体構造を備える際に増大した安定性を有するものである。

【0058】

好ましい経路は、特定のＧＰＣＲに依存し、リガンドの非存在下におけるタンパク質のとり得る立体構造の数に依存するであろう。図１２に記載の実施態様では、所望の立体構造が選択される可能性を増大するため、リガンドが加熱工程の間に存在することが好ましい。

【0059】

したがって、本発明は、増大した熱安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択するための方法であって、（ａ）親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、（ｂ）前記親ＧＰＣＲに結合するアンタゴニスト又はアゴニストを選択する工程、（ｃ）前記アンタゴニスト又はアゴニストの存在下において、特定の温度で特定の時間の後に前記選択したアンタゴニスト又はアゴニストに結合するＧＰＣＲ変異体の能力を測定することによって、前記変異体又はその各々が親ＧＰＣＲと比較して増大した熱安定性を有するか否かを測定する工程、及び（ｄ）同一の条件下における親ＧＰＣＲよりも、特定の温度で特定の時間の後に多くの前記選択したアゴニスト又はアンタゴニストと結合するＧＰＣＲ変異体を選択する工程を含む、方法、を含むと解されるであろう。工程（ｃ）では、特定の温度における一定の期間が、典型的には、前記選択したアンタゴニスト又はアゴニストと結合するＧＰＣＲ変異体の能力の測定において使用される。工程（ｃ）では、典型的には、選択した前記アンタゴニスト又はアゴニストの結合が当該温度で一定期間の間に５０％低減する（５０％の受容体が不活化されていることを示す：「見かけ上の」Ｔｍ）温度及び時間が選択される。

【0060】

好都合には、前記リガンドを使用してＧＰＣＲをアッセイする（すなわち、前記アッセイを使用して非変性状態であるか否かを測定する）際は、前記リガンドは検出可能に標識、例えば、放射標識又は蛍光標識される。他の実施態様では、リガンド結合は、二次検出系、例えば、抗体又は検出部位に共有結合する他の高親和性結合パートナー、例えば、比色分析において使用されてよい酵素（例えば、アルカリホスファターゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ）を使用して、未結合のリガンドの量を測定することによって評価されてよい。ＦＲＥＴ法が使用されてもよい。その安定性の測定においてＧＰＣＲ変異体をアッセイするために使用するリガンドは、前記方法の工程（ｂ）において選択されるものと同じリガンドである必要はないと解されるであろう。

【0061】

リガンド結合能を非変性タンパク質の存在の指標として使用して、親ＧＰＣＲ及びＧＰＣＲ変異体の安定性を測定することが好都合であるが、他の方法が当該技術分野で知られている。例えば、内在するトリプトファン蛍光の使用又は１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）などの外来性の蛍光プローブの使用のいずれかによる、蛍光スペクトルにおける変化が、アンフォールディングの感度の良好な指標であってよく、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ（商標）法（Mezzasalma et al, J Biomol Screening, 2007, Apr;12(3):418-428）において説明されている。タンパク質分解に対する安定性、質量分析器によって測定される重水素／水素交換、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ Ｇｅｌ、キャピラリーゾーン電気泳動、円偏光二色性（ＣＤ）分光法、及び光散乱を使用して、二次又は三次構造と関連するシグナルの損失によってアンフォールディングを測定してよい。しかしながら、これらの方法の全てが、それらを使用する前に、適度な量（例えば、高いｐｍｏｌ／ｎｍｏｌ量）で精製されたタンパク質を必要とするが、実施例に記載の方法は、ｐｍｏｌ量の本質的に未精製のＧＰＣＲを使用する。

【0062】

好ましい実施態様では、工程（ｂ）において、各々の存在がＧＰＣＲに同一の特定の立体構造を備えさせる、２又はそれ以上の同じ種類のリガンドを選択する。かくして、当該実施態様において、同じ種類の１つ又は複数の（天然又は非天然）リガンド（例えば、完全なアゴニスト又は部分的アゴニスト又はアンタゴニスト又は逆アゴニスト）が使用されてよい。平行して又は連続的に当該方法に同じ種類の多数のリガンドを含めることによって、例えば結合部位において親と実質的に異なるが、代償的変化によって依然としてリガンドに結合することが可能な多数の変性を有する受容体の立体構造を、思わず遺伝子操作及び選択する理論的なリスクが最小化される。以下：
１．例えば結合分析、機能分析、又は分光分析によって根拠付けられる共通の薬理学的分類を有する、化学的に異なるリガンドのセット（例えば、ｎ＝２から５）を選択する工程（これらのリガンドは、例えば野生型受容体及び／又は変異型受容体を使用する競争結合試験並びに／或いはそれらが共通のファーマコフォアを表わす必要は無いが分子モデリングによって根拠付けられるように、受容体の共通の空間的領域に結合すると解されるべきである）；
２．安定性を増大することが意図される１つ又は複数の受容体変異体を作製し、リガンドセットの全てを使用してタイト結合についてアッセイする工程（前記アッセイは、平行、多重、又は連続的に為されてよい）；
３．例えば、各リガンドについての結合等温線の測定によって、及びリガンドを用いた安定性のシフトの測定によって（典型的には、野生型と比較してウィンドウが狭い）、安定化された受容体変異体の確実性を確認する工程
を使用して当該リスクを軽減してよい。

【0063】

変異による結合部位に対する影響によって生じる見掛けの親和性における変化に対する監視のために、好ましくは、同じ薬理学的分類を有するが、異なる化学的分類を有するリガンドを使用して、受容体をプロファイルするべきである。典型的には、これらによって、異なる分子認識特性を有するが、同様の親和性におけるシフト（変異体ｖｓ親、例えば野生型）が示されるべきである。結合実験は、好ましくは、同じ薬理学的分類内の標識リガンドを使用して実施するべきである。

【0064】

それにもかかわらず、同じ薬理学的分類内のリガンドの複数の化学的分類に特異的な立体構造基質が存在する可能性があり、これらは、その手法において、選択したリガンドの化学的分類に依存して特異的に安定化される可能性があることが認識されるべきである。

【0065】

典型的には、前記選択したリガンドは、親ＧＰＣＲに対する結合と同様の作用強度でＧＰＣＲ変異体に結合する。典型的には、ＧＰＣＲ変異体及び親ＧＰＣＲに対する特定のリガンド結合についてのＫｄ値は、互いに５から１０倍、例えば、２から３倍の範囲である。典型的には、親ＧＰＣＲと比較してＧＰＣＲ変異体に対するリガンドの結合は、最大で５倍弱く、最大で１０倍強いであろう。

【0066】

典型的には、選択された立体構造で安定化された受容体変異体は、親受容体と同程度（典型的には、２から３倍以内）又はそれ以上の親和性で選択したリガンドに結合するはずである。アゴニスト−立体構造変異体について、前記変異体は、典型的には、親ＧＰＣＲと同じ又はそれ以上の親和性で前記アゴニストと結合し、典型的には、親ＧＰＣＲと同定又はそれ以下の親和性でアンタゴニストと結合する。同様に、アンタゴニスト−立体構造変異体について、前記変異体は、典型的には、親ＧＰＣＲと同じ又はそれ以上の親和性でアンタゴニストと結合し、典型的には、親ＧＰＣＲと同じ又はそれ以下の親和性でアゴニストと結合する。

【0067】

選択するリガンドについての親和性における顕著な低減（典型的には２から３倍超）を示す変異体は、典型的には除外する。

【0068】

典型的には、同じ分類を有する一連のリガンドの結合の序列は同程度であるが、当該序列において１つ又は２つの逆転が存在する可能性があり、あるいは一連のリガンドに異常値が存在する可能性がある。

【0069】

更なる実施態様では、同じ立体構造の受容体に結合する２つ又はそれ以上のリガンド、例えば、アロステリックモジュレータ及びオルトステリックアゴニストを使用してよい。

【0070】

誤解を避けるために、また、実施例から明らかなように、効果的な方法に多数のリガンドを使用することが必要なわけではない。

【0071】

更なる実施態様では、選択したリガンドに結合することが可能であるが、第一のリガンドとは異なる分類のものである第二の選択したリガンドには結合できないか又は親ＧＰＣＲより弱く結合するＧＰＣＲ変異体を選択することも有利であってよい。かくして、例えば、ＧＰＣＲ変異体は、選択したアンタゴニストの結合に関して増大した安定性を有するものであることに基づいて選択されるものであってよいが、その様に選択されたＧＰＣＲ変異体を更に試験して、完全なアゴニストに結合するか（又は親ＧＰＣＲよりも弱く完全なアゴニストに結合するか）否かを測定する。完全なアゴニストに結合しない（又は結合が低減する）変異体が選択される。このように、１つの特定の立体構造に固定化されているＧＰＣＲを更に選択する。

【0072】

選択されたリガンド（本発明の方法の工程（ｂ）で選択したもの）及び上述の更なる（第二の）リガンドが、リガンドの種類の任意のペア、例えば、完全なアゴニストとアンタゴニスト；アンタゴニストと逆アゴニスト；逆アゴニストとアンタゴニスト；逆アゴニストと完全なアゴニスト；及び完全なアゴニストと逆アゴニストなどであってよい。

【0073】

前記受容体変異体が、更なる（第二の）リガンドに対する親受容体の親和性の５０％未満の親和性、より好ましくは１０％未満、更に好ましくは１％未満又は０．１％未満又は０．０１％未満の親和性で更なる（第二の）リガンドに結合することが好ましい。かくして、前記受容体変異体と第二のリガンドとの相互作用のＫ_ｄは、親受容体よりも高い。実施例１に示すように、β−アドレナリン受容体変異体であるβＡＲ−ｍ２３（アンタゴニストを使用して本発明の方法によって選択される）は、親よりも３桁弱く（すなわち、Ｋ_ｄが１０００倍以上）アゴニストに結合する。同様に、実施例２では、アデノシンＡ２ａ受容体変異体であるＲａｎｔ２１が、親よりも２から４桁弱くアゴニストに結合する。

【0074】

このタイプの対抗選択を使用して、より特異的（及び、そのため、より迅速且つより効率的）に変異誘発法を、リガンドによって決まる純粋な立体構造に対する経路に沿って管理することが可能であるため有用である。

【0075】

好ましくは、ＧＰＣＲ変異体は、構造の完全性を維持している適切な可溶化形態で提供され、機能的形態である（例えば、リガンドに結合することが可能である）。特定のタンパク質について有効な当業者に選択されてよい適当な可溶化系、例えば、適切な界面活性剤（又は他の両親媒性剤）及び緩衝液系を使用する。典型的には、使用してよい界面活性剤は、例えば、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）又はＣＨＡＰＳ又はオクチルグルコシド（ＯＧ）又は他の多数の界面活性剤を含む。コレステロールヘミスクシネート若しくはコレステロール自体又はヘプタン−１，２，３−トリオールなどの他の化合物を含めることも好都合であってよい。グリセロール又はプロリン又はベタインの存在は有用であってよい。ＧＰＣＲは、一度膜から可溶化されると、アッセイするために十分に安定である必要があることは重要である。幾つかのＧＰＣＲについては、ＤＤＭは十分であるが、望ましい場合には、グリセロール又は他のポリオールを添加して、アッセイのための安定性を増大させてよい。さらなるアッセイのための安定性は、任意にグリセロールの存在下において、例えば、ＤＤＭ、ＣＨＡＰＳ、及びコレステロールヘミスクシネートの混合物に可溶化することによって達成されてよい。特に不安定なＧＰＣＲについては、ジギトニン又はアンフィポール（amphipol）或いは従来の界面活性剤の非存在下において膜から直接ＧＰＣＲを可溶化することが可能であり、顕著な数の脂質をＧＰＣＲに結合させた状態のままとすることによって典型的に安定性を維持する他のポリマーを使用して可溶することが望ましい。機能的な形態の非常に不安定な膜タンパク質を可溶化するために、ナノディスク（nanodisc）を使用してもよい。

【0076】

典型的には、ＧＰＣＲ変異体は、（例えば、大腸菌などの前記変異体を発現させた宿主細胞由来の膜画分の）粗抽出物で提供される。タンパク質変異体が、典型的には少なくとも７５％、より典型的には少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％のサンプル中に存在するタンパク質を占める形態で提供されてよい。言うまでもなく、典型的には、上述のように可溶化され、多くの場合にＧＰＣＲ変異体は界面活性剤及び／又は脂質分子と相互作用する。

【0077】

任意の変性又は変性条件に対して、例えば、熱、界面活性剤、カオトロピック剤、又は極端なｐＨのいずれか１つ又は複数に対して増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体が選択される。

【0078】

熱に対する安定性（すなわち、熱安定性）に関して、これは、リガンド結合を測定することによって、或いは特定の温度における蛍光、ＣＤ、又は光散乱などの分光学的方法によって容易に測定することが可能である。典型的には、ＧＰＣＲがリガンドに結合する際は、特定の温度においてリガンドに結合するＧＰＣＲの能力を使用して、前記変異体の熱安定性を測定してよい。「見かけのＴ_ｍ」、すなわち、５０％の受容体が所定の条件下で所定の時間（例えば、３０分）に亘ってインキュベートした後に、不活化される温度を測定することも好都合であり得る。より高い熱安定性のＧＰＣＲ変異体は、それらの親と比較してより大きな見かけのＴ_ｍを有する。

【0079】

界面活性剤又はカオトロピックに対する増大した安定性に関しては、典型的には、前記ＧＰＣＲを、試験界面活性剤又は試験カオトロピック剤の存在下において所定の時間に亘ってインキュベートして、例えば、リガンド結合又は上述の分光学的方法を使用して安定性を測定する。

【0080】

極端なｐＨに関しては、典型的な試験ｐＨは、例えば、４．５から５．５（低ｐＨ）の範囲又は８．５から９．５（高ｐＨ）の範囲で選択されるであろう。

【0081】

比較的強力な界面活性剤を結晶化の段階で使用するため、ＧＰＣＲ変異体がその様な界面活性剤の存在下において安定であることが好ましい。ある界面活性剤の「強力」さは、ＤＤＭ、Ｃ_１１→Ｃ_１０→Ｃ_９→Ｃ_８マルトシド又はグルコシド、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）及びＳＤＳの順である。ＧＰＣＲ変異体がＣ_９マルトシド又はグルコシド、Ｃ_８マルトシド又はグルコシド、ＬＤＡＯ、及びＳＤＳのいずれかに対して良い安定であることが特に好ましく、そのため、これらの界面活性剤を安定性試験に使用することが好ましい。

【0082】

測定の容易性のため、熱安定性を測定することが好ましく、所定の条件に関して親タンパク質と比較して増大した熱安定性を有する変異体を選択する。熱は変性剤としての作用を有し、サンプルを冷却すること、例えば、氷上に置くことで容易に取り除くことが可能であると解されるであろう。熱安定性は、他の変性剤又は変性条件に対する安定性の指針でもある可能性がある。かくして、増大した熱安定性は、変性界面活性剤、特にＤＤＭよりも変成作用が強いもの、例えば、より小さな頭部基及びより短いアルキル鎖並びに／又は荷電した頭部基を有する界面活性剤中の安定性に置き換えられる可能性がある。本発明者は、熱安定性を有するＧＰＣＲが強力な界面活性剤に対してもより安定であることを発見した。

【0083】

変性条件として極端なｐＨを使用する際は、中和剤を添加することによって迅速にこれを取り除くことができると解されるであろう。同様に、カオトロピック剤を変性剤として使用する際は、カオトロピック剤がカオトロピック効果を奏する濃度未満にサンプルを希釈することによって、変性効果を除去し得る。

【0084】

本発明の特定の実施態様では、ＧＰＣＲは、βアドレナリン受容体（例えば、シチメンチョウ由来）であり、リガンドはアンタゴニストであるジヒドロアルプレノロール（ＤＨＡ）である。

【0085】

本発明の更に好ましい実施態様では、ＧＰＣＲがアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）（例えば、ヒト由来）であり、リガンドがアンタゴニストであるＺＭ ２４１３８５（４−［２−［［７−アミノ−２−（２−フリル）［１，２，４−］−トリアゾロ［２，３−α］［１，３，５］トリアジン−５−イル］アミノ］エチル］フェノール）又はアゴニストであるＮＥＣＡ（５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン）である。

【0086】

更に好ましい実施態様では、ＧＰＣＲがニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）（例えば、ラット由来）であり、リガンドがアゴニストであるニューロテンシンである。

【0087】

本発明の第二の態様は、ＧＰＣＲ変異体を調製する方法であって、
（ａ）本発明の第一の態様に係る方法を実施する工程、
（ｂ）増大した安定性について選択された１つ又は複数のＧＰＣＲ変異体中の１つ又は複数の変異したアミノ酸残基の位置を同定する工程、及び
（ｃ）同定した位置の１つ又は複数に変異を含むＧＰＣＲ変異体を合成する工程
を含む、方法を提供する。

【0088】

実施例において認められるように、驚くべきことに、ＧＰＣＲの内部の単独のアミノ酸に対する変化が、前記タンパク質が特定の立体構造を備える条件下おいて、親タンパク質と比較して前記タンパク質の安定性を増大させる。かくして、本発明の第二の態様に係る方法の第一の実施態様では、親タンパク質の１つのアミノ酸残基がタンパク質変異体では変化している。典型的には、前記アミノ酸残基は、本発明の第一の態様に係る方法において試験した変異体において認められるアミノ酸残基に変化される。しかしながら、任意の他のアミノ酸残基、例えば、任意の天然アミノ酸残基（特に、「コード可能な」アミノ酸残基）又は非天然アミノ酸に置き換えられてよい。一般的には、簡便にするために、アミノ酸残基は、１９の他のコード可能なアミノ酸の１つに置き換えられる。好ましくは、本発明の第一の態様において選択した変異体に存在する置き換えられたアミノ酸残基である。

【0089】

実施例で認められるように、安定性における更なる増大が、親タンパク質のアミノ酸の２つ以上を置き換えることによって得られてよい。典型的には、置き換えられたアミノ酸の各々が、本発明の第一の態様に係る方法を使用して同定されたものである。典型的には、同定された各アミノ酸は、タンパク質変異体に存在するアミノ酸に置き換えられてよいが、上述のように、それは任意の他のアミノ酸で置き換えられてもよい。

【0090】

典型的には、ＧＰＣＲ変異体は、親タンパク質と比較して、１から１０の置き換えられたアミノ酸、好ましくは１から８、典型的には２から６、例えば、２、３、４、５、又は６の置き換えられたアミノ酸を含む。

【0091】

多数の変異体が、本発明の第一の態様に係る選択方法に供されてよいと解されるであろう。換言すると、多数の変異体が、本発明の第一の態様に係る方法の工程（ａ）で提供されてよい。本発明の第一及び／又は第二の態様によって、その構造が非常に安定な多数の点変異タンパク質を作製するために選択された多数の変異誘発されたＧＰＣＲが作製されてよいと解されるであろう。

【0092】

ＧＰＣＲ変異体は任意の適切な方法によって調製されてよい。好都合には、前記タンパク質変異体は、適切な核酸分子にコードされ、適切な宿主細胞において発現される。前記ＧＰＣＲ変異体をコードする適切な核酸分子は、当該技術分野でよく知られている標準的なクローニング技術、部位特異的突然変異誘発法、及びＰＣＲを用いて作製されてよい。適切な発現系は、細菌又は酵母における構成的又は誘導性の発現系、バキュロウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、及びレンチウイルスなどのウイルス発現系、又は昆虫若しくは哺乳動物細胞における一過性トランスフェクションを含む。適切な宿主細胞は、大腸菌、乳酸連鎖球菌、サッカロミセスセレビシアエ、スキゾサッカロミセスポンベ、ピチアパストリス、スポドプテラフルギペルダ、及びトリコプルシアニ細胞を含む。適切な動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ｓ２、ＣＨＯ、ＮＳＯ、及びＤＴ４０などを含む。幾つかのＧＰＣＲは、機能するために特定の脂質（例えば、コレステロール）を必要とする。その場合には、脂質を含む宿主細胞を選択することが望ましい。加えて又は代替的に、前記脂質は、前記タンパク質変異体の単離及び精製の間に添加してもよい。これらの発現系及び宿主細胞は、本発明の第一の態様に係る方法の工程（ａ）におけるＧＰＣＲ変異体について使用してもよいと解されるであろう。

【0093】

遺伝子及びｃＤＮＡのクローニング及び操作のため、ＤＮＡを変異させるため、及び宿主細胞においてポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるための分子生物学的方法が、参照によって本明細書に取り込む「Molecular cloning, a laboratory manual”, third edition, Sambrook, J. & Russell, D.W. (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY」に例示されているように、当該技術分野においてよく知られている。

【0094】

本発明の第一又は第二の態様の更なる実施態様では、選択又は調製したＧＰＣＲ変異体がＧタンパク質に結合することが可能であるか否かを測定する。前記選択又は調製したＧＰＣＲ変異体が、親ＧＰＣＲと同程度の広がり及び／又は親和性の順位で、選択したリガンドと同じ分類の複数のリガンドに結合することが可能であるか否かを測定することも好ましい。

【0095】

本発明の第三の態様は、本発明の第二の態様に係る方法によって調製したＧＰＣＲ変異体を提供する。

【0096】

本発明は、親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する、特に増大した熱安定性を有するＧＰＣＲ変異体を含む。

【0097】

β−アドレナリン受容体変異体
β−アドレナリン受容体は当該技術分野においてよく知られている。それらは互いに配列相同性を共有し、アドレナリンに結合する。

【0098】

本発明の第四の態様は、対応する野生型のβ−アドレナリン受容体と比較した際に、図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号による以下の位置：Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338の任意の１つ又は複数に対応する位置で異なるアミノ酸を有する、β−アドレナリン受容体変異体を提供する。

【0099】

β−アドレナリン受容体変異体は、任意のβ−アドレナリン受容体変異体であってよいが、所定のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体アミノ酸配列に参照されるアミノ酸の位置の１つ又は複数において変異されている。

【0100】

ＧＰＣＲ変異体が、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷ（Thompson et al (1994) Nucl. Acids Res. 22, 4673-4680）を使用して測定すると、前記所定のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体配列と比較した際に少なくとも２０％アミノ酸配列同一性を有する者であることが特に好ましい。より好ましくは、前記受容体変異体は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する。一般的に、より高い程度のアミノ酸同一性が、天然のリガンドが結合するオルトステリック（「活性」）部位の付近では保存されている。

【0101】

以下の実施例１及び図１に記載のように、親シチメンチョウβ−アドレナリン配列（図９に示す）における以下のアミノ酸残基：Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338の個々の置換は、熱安定性の増大を引き起こす。

【0102】

かくして、本発明は、親と比較した際に、これらのアミノ酸残基の１つ又は複数が他のアミノ酸残基によって置き換えられているシチメンチョウβ−アドレナリン受容体変異体を含む。本発明は、親受容体における１つ又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸残基に置き換えられている、他の起源に由来するβ−アドレナリン受容体変異体も含む。誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するβ−アドレナリン受容体であってよく、又はその切断型であってよく、又は天然のタンパク質又はその断片との融合体であってよく、又はリガンド結合能を保持している天然配列と比較して変異を含有してよい。

【0103】

「対応するアミノ酸残基」によって、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体と他のβ−アドレナリン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して比較する際に、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体中の所定のアミノ酸残基に対して整列（アライン）する他のβ−アドレナリン受容体のアミノ酸残基が含まれる。

【0104】

図９は、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体とヒトβ１、β２、及びβ３−アドレアなリン受容体との間のアラインメントを示す。

【0105】

ヒトβ１のＩｌｅ７２はシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のＩｌｅ５５と対応し；ヒトβ２のＩｌｅ４７はシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のＩｌｅ５５と対応し；ヒトβ３のＴｈｒ５１がシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のＩｌｅ５５と対応していることが認められる。ヒトβ１、β２、及びβ３における他の対応するアミノ酸残基は図９を参照して容易に同定することが可能である。

【0106】

特定のアミノ酸がＡｌａに置き換えられることが好ましい。しかしながら、特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置きかえられることが好ましい（例えば、図１におけるシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のAla 234、Ala 282、及びAla 334）。

【0107】

さらに大きい安定性が与えられる可能性があるため、β−アドレナリン受容体は、２以上のアミノ酸の位置において、親と比較して異なるアミノ酸を有することが好ましい。特に好ましいヒトβ１受容体変異体は、以下のアミノ酸残基：K85, M107, Y244, A316, F361 及び F372の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する残基である場合を除く）。

【0108】

上述の３又は４又は５又は６の変異の組み合わせを有するヒトβ１受容体変異体を調製する。

【0109】

特に好ましいヒトβ２受容体変異体は、以下のアミノ酸：K60, M82, Y219, C265, L310 及びF321の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。

【0110】

上述の３又は４又は５又は６の変異の組み合わせを有するヒトβ２受容体変異体を調製する。図２６は、β１−ｍ２３における６の熱安定化変異（R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M）は、ヒトβ２受容体に転用して（対応する変異K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321M）、ヒトβ２−ｍ２３を作製した際の熱安定性に対する効果を示す。ヒトβ２及びβ２−ｍ２３のＴｍは、２９℃及び４１℃の各々であり、かくして、熱安定化変異を１つの受容体から他の受容体に転用可能であることが例示される。したがって、特に好ましいヒトβ２受容体変異体は、K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321Mの変異を含むものである。

【0111】

特に好ましいヒトβ３受容体変異体は、以下のアミノ酸：W64, M86, Y224, P284, A330 及びF341の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられたものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）

【0112】

上述の３又は４又は５又は６の変異の組み合わせを有するヒトβ３受容体変異体が、好ましい。

【0113】

特に好ましい変異の組み合わせは、実施例１の表１及び２に詳細に記載しており、本発明は、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体変異体を含み、さらに、対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸、典型的には実施例１の表１及び２に示すものと同じアミノ酸に置き換えられているβ−アドレナリン受容体変異体も含む。

【0114】

特に好ましい変異体は、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体を参照して挙げられているアミノ酸残基に対応するアミノ酸に変異を含有するものである(R68S, Y227A, A282L, A334L) (下記の表２のm6-10参照); (M90V, Y227A, F338M) (下記の表２のm7-7参照); (R68S, M90V, V230A, F327A, A334L) (下記の表２のm10-8参照); 及び (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) (下記の表２のm23参照)。

【0115】

アデノシン受容体変異体
アデノシン受容体は当該技術分野においてよく知られている。それらは互いに配列相同性を共有し、アデノシンに結合する。

【0116】

本発明の第五の態様は、対応する野生型アデノシンと比較した際に、図１０に記載のヒトアデノシンＡ_２ａ受容体の番号付けした以下の位置：Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315, Ala 54, Val 57, His 75, Thr 88, Gly 114, Gly 118, Thr 119, Lys 122, Gly 123, Pro 149, Glu 151, Gly 152, Ala 203, Ala 204, Ala 231, Leu 235, Val 239の任意の１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するアデノシン受容体変異体を提供する。

【0117】

アデノシン受容体変異体は任意のアデノシン受容体の変異体であってよいが、所定のヒトアデノシンＡ２ａ受容体アミノ酸配列を参照して記載されるアミノ酸位置の１つ又は複数において変異されている。

【0118】

ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して測定すると、ＧＰＣＲ変異体が所定のヒトアデノシンＡ_２ａ受容体配列を比較した際に、少なくとも２０％の配列同一性を有するものであることが特に好ましい。好ましくは、ＧＰＣＲ変異体は、少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％の配列同一性を有する。典型的には、より高い程度の配列保存がアデノシン結合部位に存在する。

【0119】

以下の実施例２に記載するように、（図１０に示す）ヒトアデノシンＡ_２ａ受容体配列の以下のアミノ酸残基：Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315の個々の置き換えは、アゴニストである５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ）を使用して測定した際の熱安定性における増大を引き起こす。

【0120】

（図１０に示す）ヒトＡ_２ａ受容体配列における以下のアミノ酸残基：Ala 54, Val 57, His 75, Thr 88, Gly 114, Gly 118, Thr 119, Lys 122, Gly 123, Pro 149, Glu 151, Gly 152, Ala 203, Ala 204, Ala 231, Leu 235, Val 239の置き換えは、アンタゴニストであるＺＭ ２４１３８５（4-[2-[[7-アミノ-2-(2-フリル) [1,2,4]-トリアゾロ[2,3-α][1,3,5]トリアジン-5-イル]アミノ]エチル]フェノール）を使用して測定した際の熱安定性の増大を引き起こす。

【0121】

かくして、本発明は、親と比較すると、これらのアミノ酸残基の１つ又は複数が他のアミノ酸残基に置き換えられているヒトアデノシンＡ_２ａ受容体変異体を含む。本発明は、親受容体の１つ又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸残基に置き換えられている、他の起源に由来するアデノシン受容体変異体も含む。誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するアデノシン受容体であってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。

【0122】

「対応するアミノ酸残基」によって、ヒトアデノシン受容体Ａ_２ａ受容体及び他のアデノシン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて比較する際に、ヒトアデノシンＡ_２ａ受容体における所定のアミノ酸残基に対して整列（アライン）する他のアデノシン受容体におけるアミノ酸残基が含まれる。

【0123】

図１０は、ヒトアデノシンＡ_２ａ受容体及び３種の他のヒトアデノシン受容体（Ａ２ｂ、Ａ３、及びＡ１）の間のアラインメントを示す。

【0124】

例えば、Ａ_２ｂ受容体（ＡＡ２ＢＲと示されている）におけるＳｅｒ１１５がＡ_２ａ受容体のＧｌｙ１１４と対応することが認められる。同様に、Ａ_３受容体（ＡＡ３Ｒと示されている）におけるＡｌａ６０がＡ_２ａ受容体におけるＡｌａ５４に対応することなどが認められる。ヒトアデノシン受容体Ａ_２ｂ、Ａ_３、及びＡ_１における他の対応するアミノ酸残基は、図１０を参照して容易に同定することが可能である。

【0125】

親の特定のアミノ酸がＡｌａに置き換わることが好ましい。しかしながら、親の特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置き換えることが好ましい。

【0126】

アデノシン受容体変異体が、２以上のアミノ酸の位置において親と比較して異なるアミノ酸を有することが好ましい。特に好ましいヒトアデノシンＡ２ｂ受容体は、以下のアミノ酸残基：A55, T89, R123, L236 及びV240の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換わっているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。

【0127】

３又は４又は５の上述の変異を有するヒトアデノシンＡ２ｂ受容体変異体が好ましい。

【0128】

特に好ましいヒトアデノシンＡ３受容体は、以下のアミノ酸残基：A60, T94, W128, L232 及びL236の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。

【0129】

３又は４又は５の上述の変異を有するヒトアデノシンＡ３受容体変異体が好ましい。

【0130】

特に好ましいヒトアデノシンＡ１受容体は、以下のアミノ酸残基：A57, T91, A125, L236, 及びL240の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。

【0131】

変異の特に好ましい組み合わせは実施例２に詳細に記載している。本発明は、これらのヒトアデノシンＡ２ａ受容体、及び対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸、典型的には実施例２に示すものと同じアミノ酸によって置き換えられている他のアデノシン受容体変異体を含む。

【0132】

特に好ましいアデノシン受容体変異体は、ヒトアデノシンＡ２ａ受容体を参照して挙げられているアミノ酸残基に対応するアミノ酸に変異を含有するものである(A54L, K122A, L235A) (Rant 17); (A54L, T88A, V239A, A204L) (Rant 19); 及び(A54L, T88A, V239A, K122A) (Rant 21)。

【0133】

ニューロテンシン受容体変異体
ニューロテンシン受容体は当該技術分野において知られている。それらは配列相同性を共有し、ニューロテンシンに結合する。

【0134】

本発明の第六の態様は、対応する野生型のニューロテンシン受容体と比較した際に、図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けして記載した以下の位置：Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, Pro 399の任意の１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するニューロテンシン受容体変異体を提供する。

【0135】

ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して測定すると、ＧＰＣＲ変異体が所定のラットニューロテンシン受容体配列を比較した際に、少なくとも２０％の配列同一性を有するものであることが特に好ましい。好ましくは、ＧＰＣＲ変異体は、少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％の配列同一性を有する。

【0136】

ニューロテンシン受容体変異体は任意のニューロテンシン受容体変異体であってよいが、所定のラットニューロテンシン受容体アミノ酸配列を参照して言及されるアミノ酸位置の１つ又は複数で変異している。

【0137】

以下の実施例３に記載しているように、（図１１及び２８に示す）ラットニューロテンシン受容体配列の以下のアミノ酸残基：Leu 72, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Lys 176, Thr 179, Met 181, Ser 182, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Leu 256, Asn 262, Val 268, Met 293, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Ser 362, Ala 385, Cys 386, Trp 391, Arg 392, His 393, Lys 397, Pro 399の個々の置き換えは、ニューロテンシンの不在下について考えた際に熱安定性における増大を引き起こす。

【0138】

以下の実施例３に記載のように、（図１１及び２８に記載の）ラットニューロテンシン受容体配列における以下のアミノ酸残基：Ala 69, Ala 73, Ala 86, Ala 90, His 103, Val 165, Glu 166, Ala 177, Arg 183, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Ile 260, Thr 279, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Pro 389, Gly 390, Arg 395の個々の置き換えは、ニューロテンシンの存在下について考えると、熱安定性における増大を引き起こす。

【0139】

かくして、本発明は、親と比較すると、これらのアミノ酸残基の１つ又は複数が他のアミノ酸残基によって置き換えられているラットニューロテンシン受容体変異体を含む。本発明は、親受容体の１つ又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸残基によって置き換えられている他の起源に由来するニューロテンシン受容体変異体も含む。誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するニューロテンシン受容体であってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してもよいが、リガンド結合能を保持する。

【0140】

「対応するアミノ酸残基」によって、ラットニューロテンシン受容体と他のニューロテンシン受容体とをＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷとを使用して比較する際に、ラットニューロテンシン受容体における所定のアミノ酸残基に対して整列（アライン）する他のニューロテンシン受容体におけるアミノ酸残基が含まれる。

【0141】

図１１は、ラットニューロテンシン受容体と２つのヒトニューロテンシン受容体１及び２との間のアラインメントを示す。例えば、ヒトニューロテンシン受容体１のＡｌａ８５がラットニューロテンシン受容体のＡｌａ８６が対応し；ヒトニューロテンシン受容体１のＰｈｅ３５３がラットニューロテンシン受容体のＰｈｅ３５８に対応することなどが認められる。ヒトニューロテンシン受容体１及び２における他の対応するアミノ酸残基は、図１１を参照して容易に同定可能である。

【0142】

親の特定のアミノ酸残基がＡｌａに置き換えられることが好ましい。しかしながら、親の特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置き換えられることが好ましい。

【0143】

ニューロテンシン受容体変異体は、２以上のアミノ酸の位置において、親と比較すると異なるアミノ酸を有することが好ましい。特に好ましいヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ１）は、以下のアミノ酸残基：Ala 85, His 102, Ile 259, Phe 337 及びPhe 353の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基がAla又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。

【0144】

３又は４又は５の上述の変異を有するヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ１）が好ましい。

【0145】

特に好ましいヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ２）は、以下のアミノ酸残基：V54, R69, T229, P331 及びF347の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基がAla又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。３又は４又は５の上述の変異を有するヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ２）が好ましい。

【0146】

特に好ましい変異の組み合わせは、実施例３に詳細に記載している。本発明は、ラットニューロテンシン受容体変異体を含み、さらに、対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸、典型的には実施例３に示すものと同じアミノ酸によって置き換えられている他のニューロテンシン受容体変異体も含む。

【0147】

特に好ましいニューロテンシン受容体変異得体は、ラットニューロテンシン受容体を参照して挙げられているアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基における変異を含有するものである(F358A, A86L, I260A, F342A) (Nag7m); (F358A, H103A, I260A, F342A) (Nag7n)。

【0148】

ムスカリン受容体変異体
ムスカリン受容体は当該技術分野において知られている。それらは配列相同性を共有し、ムスカリンに結合する。

【0149】

本発明の第七の態様は、対応する野生型のムスカリン受容体と比較した際に、図１７に記載のヒトムスカリン受容体Ｍ１の番号付けした以下の位置：Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 及びMet 384の任意の１つ又は複数に対応する位置で異なるアミノ酸を有するムスカリン受容体変異体を提供する。

【0150】

ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して測定すると、ＧＰＣＲ変異体が所定のヒトムスカリン受容体配列を比較した際に、少なくとも２０％の配列同一性を有するものであることが特に好ましい。好ましくは、ＧＰＣＲ変異体は、少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％の配列同一性を有する。

【0151】

ムスカリン受容体変異体は、任意のムスカリン受容体の変異体であってよいが、所定のムスカリン受容体アミノ酸配列を参照して挙げられているアミノ酸の位置の１つ又は複数で変異されている。

【0152】

かくして、本発明は、親と比較すると、これらのアミノ酸残基の１つ又は複数が他のアミノ酸残基によって置き換えられたヒトムスカリン受容体変異体を含む。本発明は、親受容体における１つ又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸によって置き換えられている他の起源由来のムスカリン受容体変異体も含む。誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するムスカリン受容体であってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質又はその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。

【0153】

「対応するアミノ酸残基」によって、ヒトムスカリン受容体と他のムスカリン受容体とをＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して比較した際に、ヒトムスカリン受容体における所定のアミノ酸に対して整列（アライン）する他のムスカリン受容体におけるアミノ酸残基が含まれる。

【0154】

特定のアミノ酸残基がＡｌａで置き換えられることが好ましい。しかしながら、特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置き換えられることが好ましい。

【0155】

実施例１から３に示し、且つ、上述しているように、本発明者は、シチメンチョウβ１アドレナリン受容体、ヒトアデノシン受容体、ラットニューロテンシン受容体、及びヒトムスカリン受容体の配列全体に広く分布する熱安定化変異を同定した。図１７は、ヒトβ−２ＡＲの配列を有するこれらの配列のアラインメントを提供し、熱安定化変異が前記配列に位置する際に、全部で７０のうち１１例において、２つの配列が同じ位置に変異を含有している（図１７において星印で示す）。かくして、１つ又は複数の安定化変異が１つのＧＰＣＲで同定されると、増大した安定性を有する更なるＧＰＣＲを、ＧＰＣＲのアミノ酸配列アラインメント及び対応する１つ又は複数の位置で１つ又は複数の変異を作製することによって産生されてよい。この概念は、シチメンチョウβ１−２３の６つの熱安定化変異がヒトβ２受容体に直接転用した図２６に明確に例示されている。結果として得られた変異体であるβ２−２３は、ヒトβ２受容体よりも１２℃高いＴｍを有していた。

【0156】

したがって、本発明の第八の態様は、親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を製造するための方法であって、
（ｉ）第一の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異のアミノ酸配列において、１つ又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する、１つ又は複数の位置を同定する工程、及び
（ｉｉ）対応する１つ又は複数の位置において、第二のＧＰＣＲを規定するアミノ酸配列に１つ又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程
を含む、方法を提供する。

【0157】

第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体は、本発明の第一又は第二の態様に係る方法に従って選択又は調製されてよい。したがって、第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体は、本発明の第三、第四、第五、第六、又は第七の態様に係る変異体であってよい。したがって、本発明の第八の態様に係る方法を使用して、変異誘発により安定で立体構造が固定されたＧＰＣＲを作製するために使用してよい。

【0158】

例えば、特定の立体構造における増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体の選択の後に、安定化変異を同定し、第二のＧＰＣＲの対応する位置のアミノ酸が置き換えられ、第二の親ＧＰＣＲと比較して特定の立体構造において増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を製造することが可能である。

【0159】

誤解を避けるために言及すると、第一の親ＧＰＣＲは、天然の配列を有するＧＰＣＲであってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。

【0160】

典型的には、１つ又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する、１つ又は複数の位置を同定することは、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）を使用して、それらのアミノ酸配列を親ＧＰＣＲの配列とアラインメントすることを伴う。

【0161】

「対応する１つ又は複数の位置」によって、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣｌｕｓｔａｌ Ｗを使用して、第一の及び第二のＧＰＣＲがアラインメントによって比較される際に、第一のＧＰＣＲのアミノ酸配列における位置に整列（アライン）する第二のＧＰＣＲのアミノ酸配列における位置を含む。例えば、図１７におけるアラインメントで示すように、シチメンチョウβ１−ｍ２３における６つの安定化変異であるR68S, M90V, Y227A, A282L, F327A 、及びF338Mが、ヒトβ２受容体における残基であるK60, M82, Y219, C265, L310 、及びF321の各々に対応する位置である。

【0162】

第二のＧＰＣＲのアミノ酸配列における対応する１つ又は複数の位置を同定して、それらの位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置き換える。典型的には、前記アミノ酸は、第一の親ＧＰＣＲの変異体における対応する位置のアミノ酸を置き換えたものと同じアミノ酸で置き換えられる（但し、それらのアミノ酸が既にその残基に存在する場合を除く）。例えば、シチメンチョウβ１−ｍ２３の６８位では（Ｒ６８Ｓ）、アルギニン残基がセリン残基で置き換えられている。したがって、ヒトβ２受容体の対応する位置である６０位（Ｋ６０）において、リジン残基が好ましくはセリン残基で置き換えられる。

【0163】

変異は、例えば、上述のように、且つ、当該技術分野においてよく確立された技術を使用して、アミノ酸配列において作製されてよい。

【0164】

第二のＧＰＣＲは任意の他のＧＰＣＲであってよいと解されるであろう。例えば、１つの種に由来するＧＰＣＲにおける安定化変異は、他の種に由来する第二のＧＰＣＲに転用してよい。同様に、１つの特定のＧＰＣＲアイソフォームにおける安定化変異は、異なるアイソフォームである第二のＧＰＣＲに転用してよい。好ましくは、第二の親ＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲの分類又はファミリーのものである。系統発生解析は、タンパク質配列の類似性に基づいて、ＧＰＣＲを３つの主な分類、すなわち、クラス１、２、及び３に分けており、それらのフェノタイプはロドプシン、セレクチンレセプター、及びメタボトロピックグルタメート受容体の各々である（Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288）。かくして、第二のＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲの分類のＧＰＣＲであってよい。同様に、ＧＰＣＲは、グルタメート及びＧＡＢＡなどの天然のリガンドによってファミリーに分類されている。かくして、第二のＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲファミリーのものであってよい。ＧＰＣＲの分類及びファミリーの一覧は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288）によって作成されており、その一覧はhttp://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForwardで定期的に更新されている。

【0165】

第二の親ＧＰＣＲは、第一のＧＰＣＲにおける変異の対応する位置を第二のＧＰＣＲにおいて決定し得るように、第一の親ＧＰＣＲと整列（アライン）することが可能でなくてはならないと解されるであろう。かくして、典型的には、第二の親ＧＰＣＲは、前記第一の親ＧＰＣＲに対して少なくとも２０％の配列同一性を有し、より好ましくは第一の親ＧＰＣＲに対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の配列同一性を有する。しかしながら、幾つかのＧＰＣＲは、低い配列同一性を有しており（例えば、ファミリーＢ及びＣのＧＰＣＲ）、同時に構造においては非常に似ている。かくして、２０％の配列同一性のしきい値は絶対的なものではない。

【0166】

本発明者は、増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体における１つ又は複数の変異が存在する構造モチーフの同定が、増大した安定性を有する更なるＧＰＣＲ変異体を製造するのに有用であろうと考えた。

【0167】

したがって、本発明の第九の態様は、親Ｇ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と比較して増大した安定性を有するＧＰＣＲを製造するための方法であって、
（ｉ）第一の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、
（ｉｉ）１つ又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する、１つ又は複数の構造モチーフを構造膜タンパク質モデルにおいて同定する工程、及び
（ｉｉｉ）第二の親ＧＰＣＲにおける１つ又は複数の対応する構造モチーフを規定するアミノ酸配列における１つ又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異を提供する工程
を含む、方法を提供する。

【0168】

１つ又は複数の既知の構造モデルにおいて安定化変異をマッピングすることを使用して、その様な安定化変異を有する特定の構造モチーフを同定してよい。本発明者は、その様なモチーフを同定するために、β２−アドレナリン受容体の構造モデルに対してβ１アドレナリン受容体の安定化変異をマッピングした（Rasmussen et al (2007) Nature 450, 383-387; Cherezov et al (2007) Science 318:1258-65; Rosenbaum et al (2007) Science 318:1266-1273）。例えば、表（ｖｉ）は、本発明者がヒトβ２−アドレナリン受容体に対してマッピングしたシチメンチョウβ１−アドレナリン受容体変異体を挙げており、それらが存在する対応する構造モチーフを記載している。実施例４に記載のように、Ｙ２２７Ａ変異（ヒトβ２受容体のＹ２１９に対応する）のヒトβ２アドレナリン受容体に対するマッピングは、変異がヘリックス界面におけるパッキングを改善し得るように、ヘリックス間の界面に位置することを明らかにする（実施例１５、１６、及び２３参照）。同様に、Ｍ９０Ｖ変異（ヒトβ_２受容体におけるＭ８２に対応する）のヒトβ_２−受容体に対するマッピングは、ヘリックスがねじれる部分でヘリックス２に変異が存在することを明らかにする（図１５、１６、及び２０参照）。他の変異は、脂質二重膜、疎水性−親水性境界領域、タンパク質結合ポケット、及びループ領域に向いている膜貫通ヘリックス表面を含む更なる構造モチーフに存在することが認められた（表（ｖｉ）及び図１８−１９、２１−２２、及び２４−２５）。

【0169】

その様な構造モチーフは、安定化変異を含有することによって、タンパク質の安定性の決定に重要である。したがって、これらのモチーフを変異の標的とすることは、安定化ＧＰＣＲ変異体の産生を容易にするであろう。事実、同じ構造モチーフに２以上の変異がマップされた複数の例が存在する。例えば、シチメンチョウβ１アドレナリン受容体Y２２７Ａ、Ｖ２３０Ａ、及びＡ２３４Ｌ変異は、同じヘリックス界面にマップされ、Ｖ８９Ｌ及びＭ９０Ｖ変異は同じヘリックスのねじれにマップされ、Ｆ３２７Ａ及びＡ３３４Ｌ変異は脂質二重膜に向いた同じヘリックス表面にマッピングされた（表（ｖｉ））。かくして、１つの安定化変異が同定された際は、変異が存在する構造モチーフの決定は、更なる安定化変異の同定を可能にするであろう。

【0170】

本発明の第九の態様の実施態様では、第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体が、本発明の第一、第二、又は第八の態様に係る方法に従って選択又は調製される。したがって、第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体が、本発明の第三、第四、第五、第六、又は第七の態様に係る変異体の任意のものであってもよい。したがって、本発明の第九の態様に係る方法は、安定な立体構造が固定されたＧＰＣＲを変異誘発によって作製するために使用されてもよい。例えば、特定の立体構造における増大された安定性を有するＧＰＣＲ変異体の選択の後に、その様な安定化変異が存在する構造モチーフを同定してよい。他のＧＰＣＲにおいて、対応する構造モチーフを規定するアミノ酸配列における１つ又は複数の変異を作製することが、次いで、親ＧＰＣＲと比較して特定の立体構造において増大された安定性を有するＧＰＣＲ変異体を製造するために使用されてよい。

【0171】

本発明者は、ヒトβー２ＡＲ、ラットＮＴＲ１、シチメンチョウβ−１ＡＲ、ｈｉｔｏアデノシンＡ２ａＲ、及びヒトムスカリンＭ１受容体のアミノ酸配列（図１７）の多重配列アラインメントを実施し、同定された熱安定化変異（実施例１から３）が前記配列に存在する際は、全部で７０のうち１１例において、２つの配列が同じ位置で変異を有していることが示されている（図１７において星印で示す）。いずれかの理論につなげることを意図しないが、本発明者は、これらの位置の熱安定化変異は、構造膜タンパク質モデルにマッピングするための促進された転用可能性を有するものであるはずである。かくして、１つの実施態様では、第一の親ＧＰＣＲの変異体は、対応する親受容体と比較した際に、図１７に記載のヒトβ２ＡＲの番号付けした以下の位置：Ala 59, Val 81, Ser 143, Lys 147, Val 152, Glu 180, Val 222, Ala 226, Ala 271, Leu 275 及びVal 317の任意の１つ又は複数に対応する位置で異なるアミノ酸を有する、ヒトβ−２ＡＲ、ラットＮＴＲ１、シチメンチョウβ−１ＡＲ、ヒトアデノシンＡ２ａＲ、又はヒトムスカリンＭ１受容体である。

【0172】

１つ又は複数の構造モチーフを同定するために、安定化変異を膜タンパク質の既知の構造にマッピングする。

【0173】

「膜タンパク質」によって、細胞又はオルガネラの膜に結合又は接合するタンパク質を意味する。好ましくは、前記膜タンパク質は、膜に持続的に組み込まれ、脂質二重層を物理的に破壊する界面活性剤、非極性溶媒、又は変性剤を用いてのみ除去され得る完全な膜タンパク質である。

【0174】

膜タンパク質の構造モデルは任意の適切な構造モデルであってよい。例えば、前記モデルは、既知の結晶構造であってよい。ＧＰＣＲ結晶構造の例は、ウシロドプシン（Palczewski, K. et al., Science 289, 739-745. (2000)）及びヒトβ２アドレナリン受容体（Rasmussen et al, Nature 450, 383-7 (2007); Cherezov et al (2007) Science 318:1258-65; Rosenbaum et al (2007) Science 318:1266-1273）を含む。ヒトβ２アドレナリン受容体構造の座標は、RCSB Protein Data Bankにおいて2rh1, 2r4r 及び2r4sの登録番号で認められる。代替的には、構造モデルは、ホモロジーに基づくか又はｄｅ ｎｏｖｏ構造予測法を使用して、コンピューターによって生成されるモデルであってよい（Qian et al Nature (2007) 450: 259-64）。

【0175】

所定のＧＰＣＲ変異体の安定化変異は、ＧＰＣＲに対して十分な構造類似性を有する任意の膜タンパク質の構造モデルにマッピングされてよい。特に、膜タンパク質のドメインは、転用可能な所定の変異について、安定化変異が存在するＧＰＣＲドメインに対して十分な構造類似性を有する。

【0176】

タンパク質ドメインは、典型的には、単独のタンパク質として単独で存在するか又は他のドメインとの組み合わせにおける大きなタンパク質の一部であってよい二次構造要素の個別的に折りたたまれた集合として規定される。一般的には、機能的な進化単位である。

【0177】

ＧＰＣＲは本質的には大きなＮ末端ドメインを有するものを除く単独のドメインタンパク質である。したがって、典型的には、その構造モデルは、ＧＰＣＲに対して十分な類似性を有する少なくとも１つのドメインを含む膜タンパク質のものである。

【0178】

構造類似性は、配列同一性の分析によって間接的に又は構造の比較によって直接的に決定されてよい。

【0179】

配列同一性に関しては、変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有するＧＰＣＲドメインをコードするアミノ酸配列を、構造モデルが利用可能な膜タンパク質のドメインをコードするアミノ酸配列と整列（アライン）する。これらの配列の１つ又は複数は、主要保存ドメインに加えて、挿入配列又はＮ末端若しくはＣ末端伸長を含有してよい。最適なアラインメントのために、その様な配列は、分析を歪めないように除外する。問題のドメインに亘る十分な配列同一性を有する膜タンパク質を、次いで、変異をマッピングするための構造モデルとして使用してよい。可溶性タンパク質ドメインについては、それらの３Ｄ構造は、配列同一性が増大すると１００％まで増大する構造保存のレベルとともに、約２０％の配列同一性で広範に保存されており、良好には３０％超の同一性で保存されていることが示されている（Ginalski,K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177）。かくして、構造膜タンパク質モデルが、第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を含有するＧＰＣＲドメイン変異体と少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％又は９９％の配列同一性を共有するドメインを含有する膜タンパク質のモデルである。

【0180】

配列同一性は、ＢＬＡＳＴ又はＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Altschul et al, NAR (1997), 25, 3389-3402）などのアルゴリズム又はHidden Markov Models (Eddy S et al, J Comput Biol (1995) Spring 2 (1) 9-23)に基づく方法を使用して測定してよい。典型的には、２つのポリペプチドの間の配列同一性の％は、任意の適切なコンピュータープログラム、例えば、University of Wisconsin Genetic Computing GroupのＧＡＰプログラムを使用して測定してよく、配列が最適に整列（アライン）されたポリペプチドに関して同一性の％を計算すると解されるであろう。そのアラインメントは、代替的には、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用して実施されてよい（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。使用するパラメータは、以下：Fast pairwise alignment parameters: K-tuple(word) size; 1, window size; 5, gap penalty; 3, number of top diagonals; 5. Scoring method: x percent. Multiple alignment parameters: gap open penalty; 10, gap extension penalty; 0.05. Scoring matrix: BLOSUMのものであってよい。

【0181】

配列同一性に加えて、構造類似性が、構造モデルの比較によって直接的に決定されてよい。構造モデルを使用して、配列中で連続的であるか又はそうでなくてよい、配列分析のみからは明らかでない構造類似領域を検出してよい。例えば、ファミリーＢ及びＣのＧＰＣＲは類似した構造を共有すると解されているが、それらの配列同一性は非常に低い。同様に、水輸送アクアポリンであるホウレンソウＳｏＰｉｐ２、大腸菌ＡｑｐＺ、メタノコッカスＡｑｐＭ、ラットＡｑｐ４、ヒトＡｑｐ１、及びヒツジＡｑｐ０は、低い配列同一性を共有しているが、それら全ては類似した構造を有する。

【0182】

高い忠実性の構造モデルが、構造が相同的なタンパク質の既知の構造に基づいてモデルを作製するＭＯＤＥＬＬＥＲ（Sali A and Blundell T, J Mol Biol (1993) 234(3) 779-815）などの標準的なソフトウェアパッケージを使用して未知の構造のタンパク質について作製されてよい。その様なモデリングは、配列同一性の増大とともに改善する。典型的には、未知の構造の配列と既知の３Ｄ構造の配列との間の配列同一性は、３０％超である（Ginalski,K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177）。加えて、配列のみに基づくｄｅ ｎｏｖｏ構造予測法を使用して、未知の構造のタンパク質のモデルを作製してよい（Qian et al, (2007) Nature 450:259-64）。構造を実験的に測定又はモデリングによって導き出すと、構造類似領域が、２以上の３Ｄ構造の直接的な比較によって検出されてよい。それらは、例えば、ＤＡＬＩ（Holm, L and Sander, C (1996) Science 273, 595-603）などのソフトウェアを使用して検出可能な特定の構造及びトポロジーといった二次的な構造要素を含んでよい。それらは、アミノ酸側鎖及びポリペプチド主鎖の局所的な配列、特定の空間配置における原子の特定のセット若しくは原子のグループを含んでよく、例えば、グラフ理論的表現を使用して検出されてもよい(Artymiuk,P et al, (2005) J Amer Soc Info Sci Tech 56 (5) 518-528)。この手法において、比較するタンパク質又はタンパク質の領域内の原子又は原子のグループが、典型的には、ノードの間の角度及び間隔を表示するグラフのエッジとともにグラフのノードとして表わされる。これらのグラフにおける共通のパターンは、共通の構造モチーフを示す。この手法が拡張されて、水素結合ドナー若しくはアクセプター、疎水性、形状、電荷、又は芳香性などの原子又は原子のグループの任意の記述子を含んでよく、例えば、ＧＲＩＤ及び類似性調査のための基礎として使用される当該表示を使用して、その様な記述子にしたがってタンパク質が空間的にマッピングされてよい。前記方法、ソフトウェアの利用可能性、及び使用者の規定するパラメータ、しきい値、及び許容値の選択のためのガイドラインの説明は上述の参考文献に記載している。

【0183】

好ましい実施態様では、構造膜タンパク質モデルは構造ＧＰＣＲモデルである。ＧＰＣＲの構造モデルは、第一の親ＧＰＣＲのモデルであってよいと解されるであろう。例えば、増大された安定性を有するＧＰＣＲ変異体内の安定化変異は、第一の親ＧＰＣＲ構造及びその様な変異が存在する構造モチーフに直接マッピングされてよい。第一の親ＧＰＣＲの構造が未知である場合は、他のＧＰＣＲの構造モデルを使用してよい。例えば、１つの種に由来するＧＰＣＲの安定化変異は、他の種に由来する同じＧＰＣＲの既知の構造モデルにマッピングされてよい。同様に、１つの特定のＧＰＣＲアイソフォームにおける安定化変異は、他のＧＰＣＲアイソフォームの既知の構造モデルにマッピングされてよい。さらに、１つのＧＰＣＲに由来する安定化変異は、同じ分類又はファミリーの他のＧＰＣＲにマッピングしてよい。ＧＰＣＲの分類及びファミリーの一覧は、International Union of Pharmacology (Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288)によって作成されており、当該一覧は、http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForwardで定期的に更新されている。

【0184】

上述のように、構造モデルが、ＧＰＣＲ変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸を有するドメインに亘って十分な構造類似性を有する任意のＧＰＣＲのものであってよいと解されるであろう。かくして、ＧＰＣＲが、第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を含有するタンパク質ドメインに亘って、第一の親ＧＰＣＲの変異体と少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％又は９９％の配列同一性を共有することが好ましい。しかしながら、発明者は、２０％の配列同一性のしきい値は絶対的なものではないと認識している。第一の親ＧＰＣＲに対して２０％未満の配列同一性を有するＧＰＣＲは、低い配列同一性が他の類似性、例えば、第一の親ＧＰＣＲと比較して同じ配列モチーフの存在、同じG−タンパク質に対する結合、又は同じ機能を有すること、或いは同じ疎水性親水性指標のプロットを有することによって相殺される場合に、安定化変異が転用される構造モデルとしても役に立ち得る。

【0185】

構造モデルに対する安定化変異のマッピングは、当該技術分野において既知の適切な任意の方法を使用して実施されてよい。例えば、典型的には、構造モデルが利用可能なＧＰＣＲのアミノ酸配列を、第一の親ＧＰＣＲの変異体のアミノ酸配列と整列（アライン）する。第一の親ＧＰＣＲと関係する、ＧＰＣＲ変異体の少なくとも１つの異なるアミノ酸残基の１つ又は複数の位置は、構造モデルが利用可能なＧＰＣＲのアミノ酸配列に存在してよい。

【0186】

「構造モチーフ」によって、熱安定化変異のＧＰＣＲ構造モデルにおける位置の三次元的記載を含める。例えば、構造モチーフは、ＧＰＣＲの内部の任意の二次又は三次構造モチーフであってよい。「三次構造モチーフ」によって、水素結合ドナー若しくはアクセプター、疎水性、形状、電荷、又は芳香性などの原子又は原子のグループの任意の記述子を含める。例えば、タンパク質は、ＧＲＩＤ及び構造モチーフを規定するための基礎として使用される当該表示を使用してその様な記述子にしたがって空間的にマッピングされてよい（Baroni et al (2007) J Chem Inf Mod 47, 279-294）。

【0187】

表（ｖｉ）は、安定化変異が存在することが認められるシチメンチョウβ１アドレナリン受容体の構造モチーフを挙げている。表から認められるように、変異は多数の異なる位置に存在している。３つの変異が、水性溶媒に接近可能であることが予測されるループ領域に存在する。８つの変異が、膜貫通α−ヘリックスに存在し、脂質二重層に向いており；これらの変異のうち３つが、ヘリックスの末端近辺であり、疎水性−親水性境界層にあると解されてよい。８つの変異は、膜貫通α−ヘリックスの間にあり、そのうち３つはヘリックスのねじれた又は歪められた領域のいずれかに存在し、他の２つの変異は１つのヘリックスに存在するが、変異残基に対する空間に近接したねじれを含む１つ又は複数の他のヘリックスと近接していると認められる。これらの後者の変異は、ねじれ領域内のアミノ酸のパッキングに作用し、熱安定性を生じさせ得る。他の変異は基質結合ポケットに存在する。

【0188】

したがって、１つの実施態様では、構造モチーフは、ヘリックス界面、ヘリックスねじれ、ヘリックスねじれの逆のヘリックス、脂質二重層に向いたヘリックス表面、疎水性−親水性境界層における脂質二重層に向いたヘリックス表面、ループ領域、又はタンパク質結合ポケットのいずれかである。

【0189】

安定化変異が存在する構造モチーフの同定は、タンパク質安定性におけるモチーフの重要性を示唆する。したがって、対応する１つ又は複数の構造モチーフを規定するアミノ酸配列における１つ又は複数の変異の作製は、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供するはずである。

【0190】

構造モチーフを規定するアミノ酸配列は、タンパク質の二次又は三次構造において結合して構造モチーフを形成する、アミノ酸残基の一次アミノ酸配列である。その様な一次アミノ酸配列が連続的又は非連続的なアミノ酸残基を含んでよいと解されるであろう。かくして、構造モチーフを規定するアミノ酸配列の同定は、関与する残基を決定し、配列を実質的に規定することを伴うであろう。変異は、例えば、上述のように、当該技術分野においてよく確立された技術を使用して、アミノ酸配列において作製されてよい。

【0191】

「対応する１つ又は複数の構造モチーフ」によって、第二の親ＧＰＣＲに存在する構造モデルにおいて同定される一つ又は複数の類似構造モチーフを意味する。例えば、ヘリックス界面を同定する場合には、第二の親ＧＰＣＲにおける対応するヘリックス界面は、構造モデルに存在するヘリックスに類似するヘリックスの間の界面であろう。ヘリックスのねじれを同定した場合には、対応するヘリックスのねじれは、構造モデルに存在するねじれたヘリックスに類似するヘリックスにおけるねじれであろう。第二の親ＧＰＣＲにおける１つ又は複数の類似する構造モチーフは、例えば配列アラインメントによって、構造モデルにおける１つ又は複数のモチーフを規定する第二の親ＧＰＣＲの配列中の類似のアミノ酸配列を検索することによって同定されてよい。さらに、コンピューターに基づくアルゴリズムは、当該技術分野において広く利用可能であり、アミノ酸配列に基づくタンパク質モチーフの存在の予測に使用されてよい。かくして、アミノ酸配列内の特定のモチーフの相対的な位置及び他のモチーフに関連する位置に基づいて、類似する構造モチーフが容易に同定されてよい。第二の親ＧＰＣＲの構造モデルが利用可能である場合に、類似する１つ又は複数の構造モチーフがタンパク質の構造に対して直接マッピングされてよいと解されるであろう。典型的には、類似する構造モチーフを規定するアミノ酸配列は、構造モデルにおいてモチーフを規定する配列と少なくとも２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、及び９０％、並びにさらに好ましくは９５％及び９９％の配列同一性を有する。

【0192】

１つの実施態様では、第二の親ＧＰＣＲは第一の親ＧＰＣＲである。誤解を避けるために言及すると、第二の親ＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲの天然の配列を有してよく、又は切断型であってよく、又は天然タンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。

【0193】

代替的な態様において、第二の親ＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲではない。例えば、増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの変異体が同定されてよいが、増大した安定性を有する異なるＧＰＣＲの変異体を産生することが望ましい。好ましくは、第二の親ＧＰＣＲは、上述の第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲの分類又はファミリーのものである。しかしながら、第二の親ＧＰＣＲが任意の既知のＧＰＣＲであってよいが、第一の親ＧＰＣＲの変異体の安定化変異が存在する対応する構造モチーフを含有するように、第一の親ＧＰＣＲと顕著な構造類似性を共有すると解されるであろう。かくして、典型的には、第二の親ＧＰＣＲが、第一の親ＧＰＣＲと少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の配列同一性を有する。しかしながら、上述のように、幾つかのＧＰＣＲは、低い配列同一性を有するが（例えば、ファミリーＢ及びＣのＧＰＣＲ）、構造において類似する。かくして、２０％の配列同一性のしきい値は絶対的なものではない。

【0194】

増大された安定性についてＧＰＣＲにおいてスクリーニングされ得る数千の変異体が潜在的に存在するため、安定性に対する寄与において重要であることが既知の特定の変異を標的とすることが有利である。したがって、本発明の第八及び第九の態様に係る方法は、増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択する方法において使用してよい。特に、本発明の第八又は第九の態様に係る方法を実施して、安定性の決定に重要な構造モチーフを規定する特定のアミノ酸残基又はアミノ酸配列に対する変異を標的としてよい。

【0195】

したがって、１つの実施態様では、本発明の第八又は第九の態様に係る方法は、
（Ｉ）特定の立体構造を備えた第二の親ＧＰＣＲに結合するものであるリガンドを選択する工程、
（ＩＩ）第二の親ＧＰＣＲの変異体又はその各々が、特定の立体構造を備える際に、同じ特定の立体構造を備えている第二の親ＧＰＣＲのリガンド結合についての安定性と比較して、選択したリガンドの結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定する工程、及び
（ＩＩＩ）選択したリガンドの結合に関して第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択する工程
をさらに含む。

【0196】

工程（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）は、上述の本発明の第一の態様に係る方法の工程（ｂ）、（ｃ）、及び（ｃ）に対応することに気付くであろう。したがって、安定性を評価するリガンド及び方法は、好ましくは本発明の第一の態様に係る方法に関して上述しているものである。

【0197】

本発明の第十の態様は、本発明の第十の態様に係る方法によって生産される親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体である。

【0198】

１つの実施態様では、本発明の第十の態様に係るＧＰＣＲ変異体は、親受容体と比較して、（ｉ）図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けした以下の位置：Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 67, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315、（ｉｉｉ）図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けした以下の位置：Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, Pro 399、並びに（ｉｖ）図１７に記載のムスカリン受容体の番号付けした以下の位置：Le
u 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 及びMet 384の任意の１つ又は複数に対応する位置に少なくとも１つの異なるアミノ酸を有するＧＰＣＲ変異体である。

【0199】

図１７に示すシチメンチョウβ１ＡＲ、ヒトアデノシン受容体、ラットニューロテンシン受容体、及びヒトムスカリン受容体アミノ酸配列のアラインメントは、７０のうちの１１例において、２つの配列が同じ位置、すなわち、図１７に記載のヒトβ２ＡＲの番号付けした以下の位置：Ala 59, Val 81, Ser 143, Lys 147, Val 152, Glu 180, Val 222, Ala 226, Ala 271, Leu 275 及びVal 317に変異を含有することを示す。したがって、好ましい実施態様では、本発明の第十の態様に係るＧＰＣＲ変異体は、親受容体と比較して、これらの位置の任意の１つに異なるアミノ酸を有するものである。

【0200】

１つの実施態様では、本発明の第十の実施態様に係るＧＰＣＲ変異体は、βアドレナリン受容体変異体である。例えば、β−アドレナリン受容体変異体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有してよく、前記受容体変異体は、親受容体と比較して、図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けした以下の位置：Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する。

【0201】

１つの実施態様では、本発明の第十の態様に係るＧＰＣＲ変異体は、アデノシン受容体変異体である。例えば、アデノシン受容体変異体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有してよく、前記受容体変異体は、親受容体と比較して、図１０に記載のヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けした以下の位置：Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する。

【0202】

１つの実施態様では、本発明の第十の態様に係るＧＰＣＲ変異体はニューロテンシン受容体変異体である。例えば、ニューロテンシン受容体変異体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有してよく、前記受容体変異体は、親受容体と比較して、図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けした以下の位置：Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, Pro 399のいずれかに対応する位置で異なるアミノ酸を有する。

【0203】

１つの実施態様では、本発明の第十の態様に係るＧＰＣＲ変異体は、ムスカリン受容体変異体である。例えば、ムスカリン受容体変異体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有してよく、前記受容体変異体は、図１７に記載のヒトムスカリン受容体の番号付けした以下の位置：Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 及びMet 384のいずれかに対応する位置において異なるアミノ酸を有する。

【0204】

本発明のＧＰＣＲ変異体は、熱、界面活性剤、カオトロピック剤、及び極端なｐＨのいずれか１つに対する増大した安定性を有することが好ましい。

【0205】

本発明のＧＰＣＲ変異体が増大した熱安定性を有することが好ましい。

【0206】

β−アドレナリン受容体、アデノシン受容体、及びニューロテンシン受容体を含む本発明のＧＰＣＲ変異体が、それらのリガンドの存在下又は不在下に、親と比較して増大した熱安定性を有することが好ましい。典型的には、リガンドは、アンタゴニスト、完全なアゴニスト、部分的アゴニスト、又は逆アゴニストであり、オルトステリック又はアロステリックのいずれかである。上述のように、リガンドは、抗体などのポリペプチドであってよい。

【0207】

本発明のＧＰＣＲ変異体、例えば、β−アドレナリン受容体変異体又はアデノシン受容体変異体又はニューロテンシン受容体変異体が、親よりも少なくとも２℃、好ましくは少なくとも５℃、より好ましくは少なくとも８℃、さらに好ましくは少なくとも１０℃又は１５℃又は２０℃安定であることが好ましい。典型的には、親受容体及び受容体変異体の熱安定性は、同じ条件下で測定される。典型的には、熱安定性は、ＧＰＣＲが特定の立体構造を備えている条件下でアッセイされる。典型的には、当該選択される条件は、ＧＰＣＲに結合するリガンドの存在下である。

【0208】

本発明のＧＰＣＲ変異体が、可溶化され、且つ、適切な界面活性剤中で精製される際に、ドデシルマルトシド中で精製されたウシロドプシンと類似の熱安定性を有することが好ましい。ＧＰＣＲ変異体が、３０分間に亘る４０℃の加熱後に少なくとも５０％のリガンド結合活性を保持することが、特に好ましい。ＧＰＣＲ変異体が、３０分間に亘る５５℃の加熱後に少なくとも５０％のリガンド結合活性を保持することが、さらに好ましい。

【0209】

本明細書に開示するＧＰＣＲ変異体は、結晶化試験に関して有用であり、且つ、薬剤探索プログラムにおいて有用である。それらは、例えば表面プラズモン共鳴又は蛍光に基づく技術による、受容体／リガンド動態及び熱動力学的パラメータの生物物理学的測定において使用されてよい。それらは、リガンド結合スクリーニングに使用してもよく、ハイスループットスクリーニングにおいて又はバイオセンサーチップとして使用するための固体表面に結合させてよい。ＧＰＣＲ変異体を含有するバイオセンサーチップを使用して、分子、特に生体分子を検出してよい。

【0210】

本発明は、本発明のＧＰＣＲ変異体をコードするポリヌクレオチドも含む。特に、ポリヌクレオチドは、本発明のβ−アドレナリン受容体変異体又はアデノシン受容体変異体又はニューロテンシン受容体変異体をコードするものを含む。前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。典型的には、前記ＧＰＣＲ変異体を発現するために使用しうるベクターなどのベクターに含まれる。適切なベクターは、細菌又は哺乳動物又は昆虫細胞において発現を可能にする及び／又は増殖するものである。

【0211】

本発明は、ＧＰＣＲ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有する、細菌又は真核生物細胞などの宿主細胞も含む。適切な細胞は、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞を含む。

【0212】

本発明を、以下の図面及び実施例を参照してより詳細に記載する。

【図面の簡単な説明】

【0213】

【図1】βＡＲにおけるアミノ酸変化は熱安定性を誘導する。安定性指数は、３２℃で３０分間に亘ってサンプルを加熱した後に変異体の残存する結合活性の％を示す。全ての値は、βＡＲ_{３４−４２４}（５０％、破線で示す）に対して標準化されて、アッセイの間の任意の実験のばらつきを除去する。バーは各変異体の安定性を示す。ｘ軸の文字は、変異に存在するアミノ酸を示す。βＡＲ_{３４−４２４}における本来のアミノ酸及びその位置は下に示す。βＡＲ_{３４−４２４}における同じアミノ酸に対応するバーは同じ色のものであり、最も良好な変異を矢印で示す。誤差は、測定を重複して行って算出し、最も良好な変異体は、その後に再びアッセイして各変異についてのＴｍを測定し、各変異体についての安定性の正確な順位を得た（実施例１参照）。

【図2】βＡＲ_{３４−４２４}における熱安定化変異に対応する位置であるロドプシンにおける側鎖。βＡＲ_{３４−４２４}における変異アミノ酸残基に対応するロドプシンにおけるアミノ酸残基を、ロドプシン、β１アドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、及びアデノシンＡ_２ａ受容体の間のアラインメントに基づいて、ロドプシン構造に示す（データ示さず）。同じ膜貫通ヘリックスにおける側鎖は、同じ色の空間充填モデルとして示す。アミノ酸残基の名前及び位置はロドプシンのものである。

【図3】βＡＲにおける熱安定性の進化。βＡＲ−ｍ１０−８から出発して、変異の組み合わせを系統的に再配列させて、変異の最適な組み合わせを見出した（表２参照）。

【図4】ａｐｏ−ｓｔａｔｅ又は結合したアンタゴニスト［^３Ｈ］−ＤＨＡの含有におけるβＡＲ−ｍ２３及びβＡＲ_{３４−４２４}の安定性。リガンドの非存在下（ａｐｏ−ｓｔａｔｅ、破線）においてＴｍを測定するために、界面活性剤で可溶化した受容体を、結合アッセイを実施する前に、所定の温度で３０分に亘ってインキュベートした。アンタゴニストが結合した形態のＴｍ測定のために（連続線）、界面活性剤で可溶化した受容体を、［^３Ｈ］−ＤＨＡと事前インキュベートした後に所定の温度でインキュベートした。βＡＲ−ｍ２３（丸）及びβＡＲ_{３４−４２４}（四角）。データポイントは、代表的な実験の二回重複した測定によるものである。

【図5】βＡＲ−ｍ２３及びβＡＲ_{３４−４２４}に対するアゴニストの競争的結合。結合アッセイをＤＤＭ中で部分的に精製した受容体に対して実施した；βＡＲ−ｍ２３（三角）及びβＡＲ_{３４−４２４}（四角）。［^３Ｈ］−ＤＨＡは部分的に精製した受容体のＫ_Ｄの三倍大きい濃度で使用した（方法参照）。［^３Ｈ］−ＤＨＡ結合は、アゴニストであるノルエピネフリン（ａ）及びイソプレナリン（ｂ）又はアンタゴニストであるアルプレノロール（ｃ）の濃度の増大とともに競争的であった。異なるリガンドについてのＬｏｇＥＣ_５０及び対応するＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰によって算出し、ＬｏｇＥＣ_５０の誤差は１０％未満であった。βＡＲ_{３４−４２４}及びβＡＲ−ｍ２３に対するリガンド結合のＥＣ_５０は、ノルエピネフリン、βＡＲ_{３４−４２４} １．５μＭ、βＡＲ−ｍ２３ ３．７ｍＭ；イソプレナリン、βＡＲ_{３４−４２４}３３０ｎＭ、βＡＲ−ｍ２３ ２０μＭ；アルプレノロール、βＡＲ ７８ｎＭ、βＡＲ−ｍ２３ １１２ｎＭ。

【図6】５種の異なる界面活性剤におけるβＡＲ−ｍ２３及びβＡＲ_{３４−４２４}の安定性。ＤＤＭ中で可溶化したβＡＲ−ｍ２３（ａ）及びβＡＲ_{３４−４２４}（ｂ）のサンプルは、各種の異なる界面活性剤：ＤＤＭ（四角）、ＤＭ（三角）、ＯＧ（逆三角）、ＬＤＡＯ（菱形）、及びＮＧ（丸）に交換することが可能なＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムで部分的に精製した。βＡＲはＯＧ、ＮＧ、及びＬＤＡＯ中で非常に不安定であるため、６℃で精製した後に任意の活性を測定することが不可能であった。アッセイは方法に記載のように実施し、曲線及び破線の間の交差下部分でＴｍを示している。結果は、平行に実施した代表的な実験の二回重複した試験によるものである。（ｃ）βＡＲ−ｍ２３変異体の結晶の顕微鏡写真であり、Ｘ線回折による良好な秩序を示した。

【図7】βＡＲ_{３４−４２４}の熱安定性曲線（Ｔｍ）。結合アッセイを、「方法」に記載したように放射リガンドである［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（ＤＨＡ）を使用して実施した。サンプルをアッセイの前に異なる温度で３０分間に亘って加熱した。Ｔｍは結合が５０％まで低減する温度を表わし、その値を破線で示す。データポイントは、単独の試験の二回重複によるものである。この実験を数回繰り返し、同様の結果であった。

【図8】βＡＲ_{３４−４２４}及びβＡＲ−ｍ２３の膜の飽和結合アッセイ。結合アッセイは、放射リガンドとして［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（ＤＨＡ）使用する「方法」に記載のように実施した；βＡＲ_{３４−４２４}（ａ）及びβＡＲ−ｍ２３（ｂ）。スカッチャードプロットは、Ｂ_ｍａｘ及びＫ_Ｄについての対応する値とともに差込図として示した。データポイントは、各タンパク質の２つの独立した実験の二回重複によるものである。データは、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して非線形回帰によって分析した。

【図9A】ヒトβ１、β２、及びβ３受容体とシチメンチョウβ−アドレナリン受容体とのアラインメント。

【図9B】ヒトβ１、β２、及びβ３受容体とシチメンチョウβ−アドレナリン受容体とのアラインメント。

【図10A】ヒトアデノシン受容体のアラインメント。

【図10B】ヒトアデノシン受容体のアラインメント。

【図11A】ニューロテンシン受容体のアラインメント。

【図11B】ニューロテンシン受容体のアラインメント。

【図12】受容体熱安定性を測定するために使用するリガンド（＋）及びリガンド（−）の２つの異なるアッセイ様式を示すフローチャート。

【図13-1】熱安定性アデノシンＡ２ａ受容体変異体であるＲａｎｔ２１の薬理学的プロフィール。（Ａ）アンタゴニスト及び（Ｂ）アゴニストの可溶化受容体に対する飽和結合。（Ｃ−Ｆ）アンタゴニストである（Ｃ）ＸＡＣ及び（Ｄ）テオフィリン並びにアゴニストである（Ｅ）ＮＥＣＡ及び（Ｆ）Ｒ−ＰＩＡの濃度の増大による［^３Ｈ］ＺＭ２４１３８５結合の阻害；未標識リガンドの不在下における［^３Ｈ］ＺＭ２４１３８５（１０ｎＭ）の結合は１００％に設定した。各可溶化受容体は、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５及び０．０２５％ ＤＤＭ）中で氷上において１時間に亘ってリガンドとインキュベートした（Ａ、Ｃ−Ｆ）。示されているデータは、三回重複して測定した各データポイントで、２つの独立した実験によるものである。Ｋ_Ｄ及びＫ_ｉ値は表（ｉｉｉ）に示す。

【図13-2】熱安定性アデノシンＡ２ａ受容体変異体であるＲａｎｔ２１の薬理学的プロフィール。（Ａ）アンタゴニスト及び（Ｂ）アゴニストの可溶化受容体に対する飽和結合。（Ｃ−Ｆ）アンタゴニストである（Ｃ）ＸＡＣ及び（Ｄ）テオフィリン並びにアゴニストである（Ｅ）ＮＥＣＡ及び（Ｆ）Ｒ−ＰＩＡの濃度の増大による［^３Ｈ］ＺＭ２４１３８５結合の阻害；未標識リガンドの不在下における［^３Ｈ］ＺＭ２４１３８５（１０ｎＭ）の結合は１００％に設定した。各可溶化受容体は、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５及び０．０２５％ ＤＤＭ）中で氷上において１時間に亘ってリガンドとインキュベートした（Ａ、Ｃ−Ｆ）。示されているデータは、三回重複して測定した各データポイントで、２つの独立した実験によるものである。Ｋ_Ｄ及びＫ_ｉ値は表（ｉｉｉ）に示す。

【図14】熱安定変異体は、野生型受容体と比較した際の加熱に対する、脂質（Ａ）依存性の低減及びＤＤＭ（Ｂ）のより高い濃度における増大された生存を示す。受容体は、１％ＤＤＭ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５及び４００ｍＭ ＮａＣｌ）で可溶化し、ＩＭＡＣ工程についてＮｉ−ＮＴＡアガロースに固定化した。ＤＤＭ及び／又は脂質の適当な濃度を含有する緩衝液の交換を、Ｎｉ−ＮＴＡビーズからの洗浄及び溶出の間に実施した。

【図15】ヒトβ２アドレナリン受容体構造における相同残基（Ｍ８２、Ｙ２１９、Ｃ２６５、及びＡ３２１）に対する、シチメンチョウβ１アドレナリン受容体におけるＭ９０Ｖ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２８２Ｌ、及びＦ３３８Ｍ ｍ２３変異のマッピング（Rasmussen et al (2007) Nature 15;383-387; pdb accession codes 2R4R and 2R4S）が、ヘリックス界面及びヘリックスのねじれの各々に位置することを明らかにする。シチメンチョウβ１アドレナリン受容体における熱安定変異に対応する位置におけるアミノ酸残基を、標識空間充填モデルとして示している。

【図16】ヒトβ２アドレナリン受容体構造における相同残基に対する、シチメンチョウβ１アドレナリン受容体におけるｍ２３のマッピング（Cherezov et al (2007) Science, 318:1258-65; pdb accession code 2RH1）。β２ＡＲのＣαトレースが、除去された誘導部分（Ｔ４リソザイム）で示される。βＡＲ−ｍ２３における６つの変異（R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M）は、ヒトβ２ＡＲにおけるアミノ酸残基K60, M82, Y219, C265, L310, F321と対応する。Ｌｙｓ６０は、ヘリックス１の細胞内末端上に位置し、脂質−水界面を向いている。Ｍｅｔ８２はヘリックス２の中央部付近に存在し、リガンド結合ポケットを向いている；基質であるカラゾロールとＭｅｔ側鎖との最も近接した間隔は５．７Åである。Ｔｙｒ２１９はヘリックス５の細胞内末端に対し、ヘリックス５−ヘリックス６界面に存在する。Ｃｙｓ２６５はヘリックス５と６の間のループ領域の末端に存在し、膜貫通領域の反対の方向に向いている。Ｌｅｕ３１０及びＰｈｅ３２１の双方はヘリックス７に存在し、双方が脂質二重層を向いている。

【図17-1】ヒトβ−２ＡＲ、ラットＮＴＲ、シチメンチョウβ−１ＡＲ、ヒトアデノシンＡ２ａＲ、及びヒトムスカリンＭ１受容体の多重配列アラインメント。各配列において、熱安定化変異が四角で囲って印を付けている。２以上の配列に生じている変異を星で示す。

【図17-2】ヒトβ−２ＡＲ、ラットＮＴＲ、シチメンチョウβ−１ＡＲ、ヒトアデノシンＡ２ａＲ、及びヒトムスカリンＭ１受容体の多重配列アラインメント。各配列において、熱安定化変異が四角で囲って印を付けている。２以上の配列に生じている変異を星で示す。

【図17-3】ヒトβ−２ＡＲ、ラットＮＴＲ、シチメンチョウβ−１ＡＲ、ヒトアデノシンＡ２ａＲ、及びヒトムスカリンＭ１受容体の多重配列アラインメント。各配列において、熱安定化変異が四角で囲って印を付けている。２以上の配列に生じている変異を星で示す。

【図18】ヒトβ２ＡＲ構造（ｐｄｂ登録コード２ＲＨ１）に対する、シチメンチョウβ１ＡＲ変異１５５Ａのマッピング（ヒトβ２ＡＲＩ４７）。変異は、３ヘリックス（Ｈ１、Ｈ２ねじれ、Ｈ７ねじれ）の間の界面に存在する。左：側面図；右：平面図である。

【図19】ヒトβ２ＡＲ構造（ｐｄｂ登録コード２ＲＨ１）に対する、シチメンチョウβ１ＡＲ変異Ｖ８９Ｌのマッピング（ヒトβ２ＡＲＶ８１）。変異は、２ヘリックスのねじれに存在する。ヘリックスは番号付けして、結合したアンタゴニストは空間充填モデルとして示す。シチメンチョウβ１アドレナリン受容体における熱安定化変異に対応する位置のアミノ酸残基は空間充填モデルとして示しており、明確にするために矢印で示す。左：側面図；右：平面図である。

【図20】ヒトβ２ＡＲ構造（ｐｄｂ登録コード２ＲＨ１）に対する、シチメンチョウβ１ＡＲ変異Ｍ９０Ｖのマッピング（ヒトβ２ＡＲＭ８２）。変異は、結合ポケットに対して向いているヘリックス２のねじれに存在する。ヘリックスは番号付けして、結合したアンタゴニストを空間充填モデルとして示す。シチメンチョウβ１アドレナリン受容体における熱安定化変異に対応する位置のアミノ酸残基は、空間充填モデルとして示しており、明確にするために矢印で示す。左：側面図；右：平面図であった。

【図21】ヒトβ２ＡＲ構造（ｐｄｂ登録コード２ＲＨ１）に対する、シチメンチョウβ１ＡＲ変異Ｉ１２９Vのマッピング（ヒトβ２ＡＲＩ１２１）。変異はヘリックス５のねじれの逆に存在する。ヘリックスは番号付けして、結合したアンタゴニストを空間充填モデルとして示す。シチメンチョウβ１アドレナリン受容体における熱安定化変異に対応する位置のアミノ酸残基を空間充填モデルとして示し、明確にするために矢印で示す。左：側面図；右：底面図である。

【図22】ヒトβ２ＡＲ構造（ｐｄｂ登録コード２ＲＨ１）に対する、シチメンチョウβ１ＡＲ変異Ｆ３３８Ｍのマッピング（ヒトβ２ＡＲＦ３２１）。変異はヘリックス７のねじれに存在する。ヘリックスは番号付けして、結合したアンタゴニストは空間充填モデルとして示す。シチメンチョウβ１アドレナリン受容体における熱安定化変異に対応する位置のアミノ酸残基を空間充填モデルとして示し、明確にするために矢印で示す。左：側面図；右：平面図である。

【図23】ヒトβ２ＡＲ構造（ｐｄｂ登録コード２ＲＨ１）に対する、シチメンチョウβ１ＡＲ変異Ｙ２２７Ａのマッピング（ヒトβ２ＡＲＹ２１９）。変異はヘリックス−ヘリックス界面に存在する。ヘリックスは番号付けして、結合したアンタゴニストは空間充填モデルとして示す。シチメンチョウβ１アドレナリン受容体における熱安定化変異に対応する位置のアミノ酸残基を空間充填モデルとして示し、明確にするために矢印で示す。左：側面図；右：底面図である。

【図24】ヒトβ２ＡＲ構造（ｐｄｂ登録コード２ＲＨ１）に対する、シチメンチョウβ１ＡＲ変異Ａ２８２Ｌのマッピング（ヒトβ２ＡＲＣ２６５）。変異はループ領域に存在する。ヘリックスは番号付けして、結合したアンタゴニストは空間充填モデルとして示す。シチメンチョウβ１アドレナリン受容体における熱安定化変異に対応する位置のアミノ酸残基を空間充填モデルとして示し、明確にするために矢印で示す。左：側面図；右：平面図である。

【図25】ヒトβ２ＡＲ構造（ｐｄｂ登録コード２ＲＨ１）に対する、シチメンチョウβ１ＡＲ変異Ｒ６８Ｓのマッピング（ヒトβ２ＡＲＫ６０）。変異は脂質−水境界に存在し、溶媒に向いている。ヘリックスは番号付けして、結合したアンタゴニストは空間充填モデルとして示す。シチメンチョウβ１アドレナリン受容体における熱安定化変異に対応する位置のアミノ酸残基を空間充填モデルとして示し、明確にするために矢印で示す。左：側面図；右：斜視図である。

【図26】３つのβアドレナリン受容体（シチメンチョウβ１（■）、ヒトβ１（▼）、及びヒトβ２（●））並びに２つの熱安定化受容体（シチメンチョウβ１−ｍ２３（▲）及びヒトβ２−ｍ２３（◆））の熱安定性の比較。β１−ｍ２３における６つの熱安定化変異（Ｒ６８Ｓ、Ｍ９０Ｖ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２８２Ｌ、Ｆ３２７Ａ、Ｆ３３８Ｍ）を、図９におけるアラインメントに基づいて、ヒトβ２受容体（Ｋ６０Ｓ、Ｍ８２Ｖ、Ｙ２１９Ａ、Ｃ２６５Ｌ、Ｌ３１０Ａ、Ｆ３２１Ｍ）に直接転用して、β２−ｍ２３を作製した。結果として得られる変異体は、哺乳動物細胞において一過的に発現させて、０．１％ドデシルマルトシドに可溶化して、マイナスリガンドフォーマット（ａｐｏ状態で加熱し、氷上で停止させ、３Ｈ−ＤＨＡを添加する）で熱安定性を評価した。シチメンチョウβ１及びβ２−ｍ２３の見かけのＴｍは、２３℃及び４５℃の各々であり、大腸菌で発現させた受容体において過去に認められているように２２℃のΔＴｍを示した。ヒトβ２及びβ２−ｍ２３のＴｍは、２９℃及び４１℃の各々であり、ａｐｏ受容体は１２℃で安定化されることが示された。このことは、１つの受容体から他の受容体に熱安定化変異を転用することが可能であるという概念を例示するものであり、この場合には５９％の配列同一性を有する。ヒトβ１受容体（Ｔｍ〜１２℃）は、シチメンチョウβ１受容体よりも非常に低い安定性を示す。

【図27】シチメンチョウβ１アドレナリン受容体、ヒトアデノシン受容体、及びラットニューロテンシン受容体の、ヒトβアドレナリン受容体、ヒトアデノシン受容体、及びヒトニューロテンシン受容体の各々に対する同一性の割合。

【図28A】ニューロテンシン受容体のアラインメント。

【図28B】ニューロテンシン受容体のアラインメント。

【発明を実施するための形態】

【0214】

実施例
（実施例１）
界面活性剤耐性形態におけるβ−アドレナリン受容体の立体構造安定化
要約
ヒトゲノムによってコードされる５００超の非嗅覚Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）が存在し、その多くが潜在的な治療標的であると予測されているが、ファミリーの全てを代表するものとしてウシロドプシンのみの構造が利用可能である。ＧＰＣＲ構造決定における進歩の欠落には多数の理由が存在するが、本発明者は、これらの受容体の界面活性剤安定性を改善すること、及び同時にそれらを１つの好ましい立体構造に固定化することが、結晶化の可能性を大幅に改善するであろうと仮説を立てた。ＧＰＣＲ、すなわちβ−アドレアンリン受容体の界面活性剤可溶化熱安定化変異体の単離のための一般的な戦略は、アラニンスキャニング変異誘発、それに続く受容体安定性のアッセイに基づいて開発した。試験した３１８の変異体のうち、１５が安定性における測定可能な増大を示した。最初の変異部位の各々におけるアミノ酸の最適化の後に、最適に安定化した受容体を特定の変異を組み合わせることによって構築した。最も安定な受容体変異体であるβＡＲ−ｍ２３は、６つの点変異を有し、天然のタンパク質よりも結合したアンタゴニストの存在下で２１℃高いＴｍを生じさせ、βＡＲｍ２３はウシロドプシンと同程度に安定であった。加えて、βＡＲ−ｍ２３は広範な界面活性剤において顕著により安定で、結晶化に理想的であり、リガンドの不在下においてアンタゴニスト立体構造で好適に存在した。

【0215】

結果
β１アドレナリン受容体の熱安定性を増大する単一変異の選択
シチメンチョウ赤血球由来のβＡＲはよく特性決定されており、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞において高レベルで発現されるため、構造研究に理想的な対象である（非特許文献１０、１１）。βＡＲの最も良好な過剰発現は、残基３４−４２４を含有する受容体の切断型を使用して得られ（βＡＲ_{３４−４２４}）（非特許文献９）、これが本研究の出発点として使用された。アラニンスキャニング変異誘発を使用して、変異した際に、受容体の熱安定性を変化させるβＡＲ_{３４−４２４}におけるアミノ酸を規定した；アラニンが配列中に存在する場合には、ロイシン残基に変異させた。全部で３１８の変異をアミノ酸残基３７−３６９、７つの膜貫通ドメインを含む領域、及びＣ末端の２３アミノ酸残基に作製した；１５アミノ酸残基における変異は、ＤＮＡ鋳型における強力な二次構造によって得られなかった。各変異体の配列決定をして所望の変異のみが存在することを確認した後に、受容体を大腸菌において機能的に発現させ、安定性についてアッセイした。

【0216】

熱安定性についてのアッセイは、受容体を３０分間に亘って３２℃で加熱し、氷上で反応を停止させ、次いで、アンタゴニストである［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールを使用して放射リガンド結合アッセイを実施して未処理の対象と比較して残存する機能的なβＡＲ_{３４−４２４}分子の数を測定することによって、未精製界面活性剤可溶化受容体に対して実施した。非変異βＡＲ_{３４−４２４}をアッセイ前に３０分間に亘って３２℃で加熱することで、未加熱の対照の約５０％まで結合が低減した（図７）；変異体についての全てのデータは、実施した全てのアッセイにおいて非変異βＡＲ_{３４−４２４}を対照として含めることによって標準化した。一巡目のスクリーニングにおいて、１８の変異が安定性における明らかな増大を示し、加熱後に７５％超のアゴニスト結合を保持し、天然のβＡＲ_{３４−４２４}の少なくとも５０％のレベルで大腸菌において発現した。これらの変異の更なる安定性の増大の可能性の観点から、１８残基の各々を２−５の異なるサイズ又は電荷の代替的なアミノ酸残基に変異させた（図１）。これら１８の変異体のうち、１２が更なる変化によって改善し、５が他のアミノ酸が存在する場合に更に良好な熱安定性を有し、第一のスクリーニングに由来する１つの変異が擬陽性であったことが明らかになった。加えて、アラニンへの変異では安定化されなかった３つの残基（Ｖ８９、Ｓ１５１、Ｌ２２１）を広範な他のアミノ酸残基に変異させた；アラニンに変異させた際に熱安定性に影響しなかった２つの位置は、他の変化によっても影響を受けなかった。対照的に、Ｖ８９はアラニンに変異させた際により低い熱安定性を示したが、Ｌｅｕに変異させた際は熱安定性が増大した。かくして、最初のアラニンスキャニングは、任意の所定の位置について試験したもののうち最も良好なアミノ酸残基の三分の二を示した。

【0217】

変異された際に熱安定性の最も良好な増大を示した１６のアミノ酸残基の各々について予測される位置及び環境を、構造が既知のロドプシンの配列とβＡＲ配列とのアラインメントによって決定した（図２）。これらの残基の１４は、膜貫通α−ヘリックスに存在すると予測され、そのうち５つの残基は脂質に向いていると予測され、４つは深く埋め込まれており、残部の残基はヘリックスの間の界面に存在すると予測された。連続的なアミノ酸であるG６７及びＲ６８（ロドプシンにおけるＶ６３及びＱ６４）またはヘリックス５におけるクラスターＹ２２７、Ｒ２２９、Ｖ２３０、及びＡ２３４（ロドプシンにおけるＹ２２３、Ｑ２２５、Ｌ２２６、及びＶ２３０）などの、これらの残基の幾つかは、βＡＲ構造において互いに相互作用していると予測されるだろう。βＡＲ中で相互作用し得る他のアミノ酸残基は、外側のループ２のＱ１９４Ａ及び外側のループ３のＤ３２２Ａであった（ロドプシンにおけるＧ１８２及びＰ２８５の各々）。

【0218】

個々の変異の各々がβＡＲ_{３４−４２４}に与えた安定性の増大は、各変異体のＴｍを測定することによって決定した（結果示さず）；ここでＴｍは３０分間に亘って受容体を加熱した後の機能的な結合における５０％の低減を与える温度である。８℃までＴｍを増大させたＭ９０Ａ及びＹ２２７Ａを除いて、各変異は１から３℃でβＡＲ_{３４−４２４}のＴｍを増大させた。

【0219】

最適な安定受容体を作製するための変異の組み合わせ
最初に、βＡＲの一次アミノ酸配列において互いに隣接する、熱安定性を改善した変異を組み合わせた。Ｇ６７Ａ及びＲ６８Ｓという変異又はヘリックス５の末端の変異の異なる組み合わせ（Ｙ２２７Ａ、Ｒ２２９Ｑ、Ｖ２３０Ａ、及びＡ２３４Ｌ）を含有する構築物を発現させて、アッセイした；Ｔｍ値（結果示さず）は、βＡＲ_{３４−４２４}のＴｍよりも１から３℃のみ高く、１つの変異は実際には僅かにより安定でないものであり、一次アミノ酸配列において互いに隣接する変異の組み合わせは大きく熱安定性を改善するものではないことが示唆された。続いて、構造において互いに離れていると予測された変異を組み合わせた。各種のプライマー混合物を使用してＰＣＲ反応を実施し、無作為な様式で５つの異なる変異を組み合わせ、次いで、熱安定性について試験した（表１）。これらの組み合わせの最も良好なものは、βＡＲ_{３４−４２４}のＴｍと比較して１０℃より大きくＴｍを増大させた。幾つかの場合では、個々の変異の連続的な包含でＴｍに対しては相加的な効果が明らかに存在した。これは一連の３つの変異体、ｍ４−１、ｍ４−７、及びｍ４−２において認められ、ｍ４−１に対するＶ２３０Ａの付加はＴｍを２℃増大させ、ｍ４−７におけるＤ３３２Ａという付加的な変異はＴｍをさらに３℃増大させる。Ｙ２２７Ａ及びＭ９０Ａを含有する変異体の全ては、１０℃以上のＴｍの増大を示した。これらの２つの変異が共に、βＡＲ_{３４−４２４}のＴｍを１３℃まで増大させたが（ｍ７−５）、アンタゴニスト結合全体はβＡＲ_{３４−４２４}の５０％であり、これらの変異体の発現低下が示唆された。ｍ７−５に対するＦ３３８Ｍの添加は熱安定性を増大しなかったが、大腸菌における機能的な発現のレベルを増大させた。

【0220】

【表1】

【0221】

大腸菌において依然として高レベルで発現した、最も熱安定である得られた変異体は、ｍ６−１０、ｍ７−７、及びｍ１０−８であった。これらの変異体は合計して全部で１０の異なる変異を含有し、８つの変異はそれらの変異体の少なくとも２種に存在していた。ｍ１０−８を鋳型として使用し、ｍ６−１０及びｍ７−７に存在する変異を添加又は置換することによって、変異誘発の二順目を実施した（図３）；これらの変異の幾つかはβＡＲの一次アミノ酸配列において非常に近接していたため、上述のように付加的でなかったが、多数の変異はＴｍをさらに改善した（表２）。例えば、ｍ１０−８における２つの変異を交換して、ｍ１８を作製すると、４９．６℃までＴｍを上昇させ、Ａ２８２Ｌを添加してｍ２３を作製すると、Ｔｍをさらに３℃増大させ５２．８℃とした。これによって、これまでで最も熱安定であるβＡＲ_{３４−４２４}が生産され、βＡＲ−ｍ２３と称する。

【0222】

【表2】

【0223】

βＡＲ_{３４−４２４}変異体を開発するために使用する熱安定性アッセイは、アンタゴニストの不在下において受容体を加熱することによって実施したが、結合したリガンドが受容体を安定化することがよく知られている。したがって、βＡＲ_{３４−４２４}及びβＡＲ−ｍ２３についての安定性アッセイは、加熱工程の間に受容体に結合したアンタゴニストを用いて繰り返した（図４）。予測されるように、インキュベーションの間に結合したアンタゴニストを含有する受容体のＴｍは、アンタゴニストの不在下における受容体のＴｍよりも高いものであった。βＡＲ_{３４−４２４}については、結合したアンタゴニストを用いて６℃高く、βＡＲ−ｍ２３については、Ｔｍが２℃増えて５５℃となった；アンタゴニストが結合した際にβＡＲ−ｍ２３について観察された熱安定性のより小さな増大は、当該受容体は既に、βＡＲ_{３４−４２４}よりも、アンタゴニストが結合した状態に類似するより安定な立体構造にあることを示唆する（下記参照）。アンタゴニストが結合したβＡＲ−ｍ２３のＴｍは、２つの独立した研究所によってその構造が解析された（非特許文献１２及び１３）、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）中の暗状態のロドプシンのＴｍに非常に似ている（非特許文献１２）。このことは、βＡＲ−ｍ２３が結晶化について十分に安定であることを示唆する。

【0224】

βＡＲ−ｍ２３の特性決定
６種の変異の効果を同定するためにβＡＲ−ｍ２３及びβＡＲ_{３４−４２４}について測定した３種の特徴的な活性は、アンタゴニスト結合の親和性、アゴニスト結合の相対的な効果、βＡＲ−ｍ２３のＧタンパク質への結合能であった。アンタゴニストである［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（図８）を使用した膜への飽和結合実験は、βＡＲ−ｍ２３に対する結合の親和性（Ｋ_Ｄ６．５±０．２ｎＭ，ｎ＝２）がβＡＲ_{３４−４２４}（Ｋ_Ｄ２．８±０．１ｎＭ，ｎ＝２）よりも僅かに低いことを示し、アンタゴニスト結合立体構造ではβＡＲｍ２３の構造に大きなゆらぎが存在することを示唆している。このことは、βＡＲ−ｍ２３における変異のいずれも、リガンド結合に関与すると解されているアミノ酸に相当するものではないことと一致する。アンタゴニスト結合と対照的に、βＡＲ−ｍ２３によるアゴニスト結合の効果は、βＡＲ_{３４−４２４}よりも３桁弱いものである（図５）。アゴニストであるイソプレナリンの有効性は、天然のアゴニストであるノルエピネフリンよりも、βＡＲ−ｍ２３及びβＡＲ_{３４−４２４}において一貫して低く、当該２つの受容体のアゴニスト結合立体構造は類似している可能性を示唆する。しかしながら、βＡＲ_{３４−４２４}と比較した際のβＡＲ−ｍ２３におけるアゴニストの効力における大きな低減は、βＡＲ−ｍ２３における６種の変異が、アンタゴニストが結合した立体構造に選択的に固定化されていることを示唆する。立体構造の予測からすると、このことは、回折に使用し得る品質の結晶の生産のために立体構造が均一なタンパク質集団を有することが重要であるため、熱安定性に予期せぬ利点を加える。

【0225】

βＡＲ−ｍ２３に用いた熱安定性アッセイの全ては、ＤＤＭに可溶化した受容体に対して実施した。熱安定化プロセスの目的は、ＤＤＭのみではなく各種の異なる界面活性剤中で安定である結晶学的に理想的な受容体を生産することであった。したがって、本発明者は、完全な膜タンパク質の結晶化において選択的に使用される小さな界面活性剤に集中して、各種の異なる界面活性剤中においてβＡＲ−ｍ２３及びβＡＲの安定性を試験した。βＡＲ−ｍ２３又はβＡＲ_{３４−４２４}を発現する大腸菌から調製した膜をＤＤＭ中で可溶化し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースに結合させ、次いで、ＤＤＭ、デシルマルトシド（ＤＭ）、オクチルグルコシド（ＯＧ）、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）、又はノニルグルコシド（ＮＧ）のいずれかを用いて洗浄した。安定性アッセイを異なる界面活性剤の各々中の受容体に対して実施した（図６）。βＡＲ_{３４−４２４}はＤＤＭ及びＤＭにおいてのみ安定であり、ＯＧ、ＮＧ、又はＬＤＡＯで洗浄した樹脂から溶出した活性受容体は存在しなかった。対照的に、機能的なβＡＲ−ｍ２３は全ての界面活性剤中に依然として存在し、Ｔｍを測定し得た。予測されるように、より小さな界面活性剤が、ＤＤＭ（Ｔｍ５２℃）又はＤＭ（Ｔｍ４８℃）のいずれかよりも顕著に変性させ、２５℃（ＮＧ）、２３℃（ＬＤＡＯ）、及び１７℃（ＯＧ）のＴｍであった。受容体をＤＤＭ又はＤＭのいずれに可溶化したかにかかわらず、βＡＲ−２３及びβＡＲ_{３４−４２４}の間のＴｍの差は約２０℃である；したがって、予測されるＴｍは約５℃であり、かくして、精製に使用した条件下で受容体が迅速に不活性化したため、活性βＡＲ_{３４−４２４}はＮＧ中においてさえ認められないことは驚くべきことではない。厳しさを増している界面活性剤中における安定性に関して選択するよりも利用するのがかなり単純であるため、βＡＲ−ｍ２３の生産に使用した所定の戦略は、熱安定性に基づいて意図的に選択した。しかしながら、βＡＲ_{３４−４２４}の熱安定性の増大は、完全な膜タンパク質の結晶化に理想的な小さな界面活性剤に対する耐性の増大をもたらす。

【0226】

ＧＰＣＲ変異体の結晶化
シチメンチョウβ−アドレナリン受容体の幾つかの異なる構築物を結晶化する以前の試みは失敗した。各種の条件で実験したにもかかわらず、天然の配列並びに幾つかの切断型及びループ欠失構築物の双方の使用によっては、長年に亘って、結晶が得られなかった。

【0227】

しかしながら、βＡＲ−ｍ２３に由来する安定化変異を前記構築物に転用すると、幾つかの異なる結晶が、異なる界面活性剤及び異なる条件において得られた。

【0228】

これまで最も研究された結晶は、バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞において発現させた精製β−３６構築物（以下の変化：点変異Ｃ１１６Ｌ及びＣ３５８Ａを含有するシチメンチョウβ受容体のアミノ酸残基３４−３６７；ｍ２３の６つの熱安定化点変異；配列ＡＳＫＲＫを用いたアミノ酸残基２４４−２７８の置換；Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ）を使用して、当該受容体を界面活性剤であるオクチルチオグルコシドに移した後に得られた。使用した沈殿剤は、ＰＥＧ６００又はＰＥＧ１０００であり、得られた結晶は細長いプレート状であった。

【0229】

実験を実施して、安定化受容体を使用した結晶化条件を規定して、本来の非安定化構築物を使用して結晶が得ることが可能であったか否かを確認した。同様に又はおそらく非常に小さな結晶を得ることが可能であるかもしれないが、実際には、「野生型」（すなわち、変異誘発させる出発構造）は結晶を生じなかった。

【0230】

前記結晶は、空間群Ｃ２及び良好に回折するプレート状であり、使用した凍結条件に依存してセル寸法が変化する。

【0231】

一般的には、ＧＰＣＲが安定化されると、各種のよく知られた各種の構造決定技術に供してよい。最も一般的な膜タンパク質結晶化技術は、多くの場合には市販の機械装置を使用して設定した数千の結晶化条件をまず使用する（非特許文献２２）、蒸気拡散（非特許文献２０及び２１）によるものである。しかしながら、蒸気拡散によって形成される結晶は小さく且つ不規則である場合があるため、次いで付加的な技術を使用してよい。１つの技術は、タンパク質表面の立体構造エピトープに特異的に結合する抗体と膜タンパク質との共結晶化（蒸気拡散による）を伴う（非特許文献２３及び２４）；このことによって、タンパク質の親水性表面を増やし、且つ、強力な結晶接触を形成し得る。第二の代替的な方法は、脂質立方相又は脂質中間相のいずれかと一般的に称される結晶化マトリックスを使用することであり（非特許文献２５及び２６）、機械的なプラットホームにも開発されている（非特許文献２７）。このことは、小さな親水性表面のみを有するタンパク質、例えば、細菌ロドプシンの高品質な結晶の生産に関して成功を確実なものとする（非特許文献２８）。膜タンパク質構造は、電子線結晶学によって高分解能で測定されてもよい（非特許文献２９）。

【0232】

アラニンスキャニング変異誘発及び熱安定変異体の選択の併用によるβＡＲ_{３４−４２４}からβＡＲ−ｍ２３への進化は、結晶学に理想的なＧＰＣＲをもたらした。βＡＲ−ｍ２３のＴｍは、アンタゴニストの存在下においてβＡＲ_{３４−４２４}よりも２１℃高く、βＡＲ−ｍ２３はロドプシンと同様の安定性を有している。βＡＲ−ｍ２３のＴｍの増大は、βＡＲ_{３４−４２４}を不活化する各種の小さな界面活性剤における安定性の増大をもたらす。加えて、使用した選択戦略は、受容体の立体構造の集団は野生型のβＡＲ_{３４−４２４}よりも均一であるため、結晶を得る可能性を改善する選択的にアンタゴニストが結合した立体構造にある受容体をもたらした。かくして、本発明者は、単独の選択法において立体構造を安定化する方法を完成した。

【0233】

本発明者が導入した特定の変異が受容体の熱安定化をもたらす原因は全く明らかではない。ロドプシンにおける対応する位置は、変異したアミノ酸残基は脂質二重層を向いているか、受容体の中心を向いているか、又は２つの環境の間の界面に存在する。複雑な可溶性タンパク質の熱安定化を理解する試みにおける困難性を考慮すると（非特許文献１５）、膜タンパク質はより容易に理解されるようではない；本発明者は、変異した際に熱安定性をもたらすβＡＲにおけるアミノ酸残基に特定のパターンは存在しないことを確認した。しかしながら、生産した約５％の変異体は天然の受容体より安定であったため、アラニンスキャニング変異誘発は、迅速に熱安定性変異体を同定する効率的な戦略であることが示される。

【0234】

βＡＲ−ｍ２３の生産に本発明者が使用した手法は、界面活性剤可溶化形態における活性を検出するための簡便なアッセイを有する任意の膜タンパク質に等しく適用可能である。本発明者は、最も簡便な主要なパラメータとして、温度の関数としての安定性を選択したが、該手法は、主に安定性、例えば、厳しい界面活性剤、極端なｐＨ、又はカオトロピック塩の存在下における安定性についての試験に容易に拡張可能である。各種のヒト受容体、チャンネル、及びトランスポーターの立体構造安定化は、それらを結晶学により適したものとし、既に結晶化されている膜タンパク質についての分解能も改善するであろう。立体構造安定化が、膜タンパク質結晶化を、現在よりも迅速に成功する可能性が大きい、より扱いやすい問題とすることを可能にすることが望まれる。これによって、製薬業界におけるヒト膜タンパク質の日常的な結晶化を可能にし、薬剤開発への価値のある立体構造の洞察を可能にするはずである。

【0235】

方法
材料
シチメンチョウ由来の切断型のβ１アドレナリン受容体（βＡＲ_{３４−４２４}）（非特許文献９）は、Ｄｒ Ｔｏｎｙ Ｗａｒｎｅ（ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって快く提供された。３４−４２４残基をコードするβＡＲ構築物は、Ｃ１１６Ｌ変異を含有して発現を改善し（非特許文献１１）、精製のために１０ヒスチジンのＣ末端タグを含有している。１−［４，６−プロピル−^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［^３Ｈ］−ＤＨＡ）はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供され、（＋）Ｌ−ノルエピネフリン酒石酸水素塩、（−）イソプレナリン塩酸、（−）アルプレノロール酒石酸塩、及びｓ−プロプラノロール塩酸はＳｉｇｍａからのものである。

【0236】

βＡＲの変異誘発
βＡＲ ｃＤＮＡは、ｐＲＧＩＩＩにライゲートし、ＭａｌＥ融合タンパク質としての大腸菌におけるβＡＲの機能的な発現を可能にした（非特許文献１６）。変異体は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ方法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、発現プラスミドを鋳型として使用してＰＣＲによって産生した。ＰＣＲ反応物は、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、個々のクローンを完全に配列決定して、所望の変異のみが存在していることを調べた。異なる変異は、以下の変異：Ｍｕｔ４、Ｇ６７Ａ、Ｇ０６８Ａ、Ｖ２３０Ａ、Ｄ３２２Ａ、及びＦ３２７Ａ；Ｍｕｔ６、Ｒ０６８Ｓ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２３４Ｌ、Ａ２８２Ｌ、及びＡ３３４Ｌ；Ｍｕｔ７、Ｍ９０Ｖ、Ｉ１２９Ｖ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２８２Ｌ、及びＦ３３８Ｍ；Ｍｕｔ１０、Ｒ６８Ｓ、Ｍ９０Ｖ、Ｖ２３０Ａ、Ｆ３２７Ａ、及びＡ３３４Ｌを導入する全てのペアのプライマーを含めることによって、ＰＣＲによって無作為に組み合わせた。ＰＣＲ混合物を形質転換して、クローンは配列決定して変異が確かに導入されていることを測定した。

【0237】

タンパク質発現及び膜調製物
βＡＲ及び変異体の発現は、ＸＬ１０細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において実施した。５０ｍｌのアンピシリン含有（１００μｇ／ｍｌ）２×ＴＹ培地の培養物を、ＯＤ_６００＝３まで浸透しながら３７℃で増殖させ、次いで、０．４ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導した。誘導した培養物は、４時間に亘って２５℃でインキュベートし、次いで、細胞を１３，０００×ｇで１分に亘って遠心分離することによって回収し（２ｍｌの一定分量）、−２０℃で保存した。アッセイに関しては、細胞を凍結融解（５サイクル）によって破砕し、５００μｌの緩衝液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｒｏｃｈｅ）］に再懸濁した。１００μｇ／ｍｌリソザイム及びＤＮアーゼ Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を用いて４℃で１時間に亘ってインキュベートした後に、氷上で３０分に亘ってサンプルを２％ＤＤＭに可溶化した。不溶性物質を遠心分離（１５，０００×ｇ、２分、４℃）によって除去し、上清を放射リガンド結合アッセイに直接使用した。

【0238】

大規模膜調製のために、βＡＲ及びＭｕｔ２３各々の２Ｌ及び６Ｌの大腸菌培養物を上述のように増殖させた。２０分間に亘る５，０００×ｇの遠心分離によって細胞を回収し、液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。１×プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、Ｒｏｃｈｅ）を含有する１０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５にペレットを再懸濁した。１ｍｇのＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）を添加して、終容量を１００ｍｌとした。細胞をＦｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ（２ｐａｓｓａｇｅｓ、２０，０００ｐｓｉ）によって破砕し、１２，０００×ｇで４５分間に亘って４℃で遠心分離して細胞残屑を除去した。上清（膜）を２００，０００×ｇで３０分間に亘って４℃で遠心分離した；膜ペレットは１５ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５に再懸濁して、液体窒素で迅速に凍結した後に１ｍｌの一定分量で−８０℃において保存した。タンパク質濃度はアミノブラック法によって測定した（非特許文献１７）。これらのサンプルは、融解後に放射リガンド結合アッセイにおいて使用し、上述の２％ ＤＤＭに可溶化した。

【0239】

競争アッセイに関しては、異なる界面活性剤を試験することと共に、ＤＤＭ可溶化βＡＲをＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）で部分的に精製した。２００μｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールｐＨ ８中の２ｍｌの可溶化サンプル（１０ｍｇ／ｍｌの膜タンパク質）に添加し、１時間に亘って４℃でインキュベートした。インキュベート後に、サンプルを１３，０００×ｇで３０秒間に亘って遠心分離し、界面活性剤（０．１％ＤＤＭ、０．１％ＤＭ、０．１％ＬＤＡＯ、０．３％ＮＧ、又は０．７％ＯＧのいずれか）を含有する２５０μｌの緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で二回洗浄した。

【0240】

受容体は、２×１００μｌの緩衝液（０．４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭイミダゾールｐＨ８、及び関連の界面活性剤）に溶出した。半精製したβＡＲ_{３４−４２４}及びβＡＲ−ｍ２３に対する［^３Ｈ］−ＤＨＡ結合についてのＫ_Ｄは、各々３．７ｎＭ及び１２．５ｎＭであり、競争アッセイにおいて使用した［^３Ｈ］の終濃度は３倍のＫ_ＤでありβＡＲ_{３４−４２４}については１２ｎＭでありβＡＲ−ｍ２３については４０ｎＭであった。

【0241】

放射リガンド結合及び熱安定性アッセイ
単独の点の結合アッセイは、１２０μｌの終濃度において、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＤＤＭ（又は対応する界面活性剤）を５０ｎＭ［^３Ｈ］−ＤＨＡ及び２０から１００μｇの膜タンパク質と共に含有した；平衡化は１時間、４℃であった。３０分間に亘って特定の温度で［^３Ｈ］−ＤＨＡを使用して又は使用せずに、結合アッセイ混合物をインキュベートすることによって、熱安定性を評価した；反応は氷上で実施し、必要であれば［^３Ｈ］−ＤＨＡを添加して、さらに１時間平衡化した。受容体結合放射リガンド及び遊離の放射リガンドは、以前に開示されているようにゲル濾過によって分離した（非特許文献１８）。非特異的結合は、１μＭのｓ−プロプラノロールの存在下で測定した。飽和曲線は、０．４ｎＭから１００ｎＭの広範な［^３Ｈ］−ＤＨＡ濃度を使用して得られた。競争アッセイは、βＡＲ_{３４−４２４}については１２ｎＭの濃度の［^３Ｈ］−ＤＨＡを使用して実施し、βＡＲ−ｍ２３については４０ｎＭの濃度の［^３Ｈ］−ＤＨＡを使用して実施し（すなわち、３倍のＫ_Ｄ）、各種の濃度の未標識のリガンド（０から１００ｍＭ）を用いて実施した。放射活性はＢｅｃｋｍａｎ ＬＳ６０００液体シンチレーションカウンターで計測し、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して非線形回帰によってデータを分析した。

【0242】

ロドプシン構造におけるβＡＲ−ｍ２３熱安定変異の位置
登録コードが１ＧＺＭ［１４］であるロドプシン構造のｐｄｂファイルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔｅ Ｂａｎｋウェブサイト（www.pdb.org）からダウンロードし、ＰｙＭＯＬＸ１１Ｈｙｂｒｉｄ（ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プログラムに表示した。βＡＲにおける熱安定変異についての、ロドプシンの対応するアミノ酸残基は、本発明者のよく知っている４つのＧＰＣＲ、すなわち、ロドプシン、β１アドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、及びアデノシンＡ_２ａ受容体の間のアラインメントに基づいてロドプシン構造に配置した（非特許文献１９）。

【0243】

（実施例２）
増大した熱安定性を有するアデノシンＡ_２ａ受容体（Ａ_２ａＲ）の変異体
１．３１５の部位特異的変異体を、Ａ_２ａＲの２から３１６残基の間に作製した。
２．これらの変異体の全てを、加熱工程後のアゴニスト及びアンタゴニスト結合測定アッセイを使用して熱安定性についてアッセイした（図１２に記載のリガンド（−）フォーマット）。
ａ．^３Ｈ−ＮＥＣＡ（アゴニスト）と共に測定した際に、２６の変異体が改善された熱安定性を示した：G114 A, G118A, L167A, A184L, R199A, A203L, L208A, Q210A, S213A, E219A, R220A, S223A, T224A, Q226A, K227A, H230A, L241A, P260A, S263A, L267A, L272A, T279A, N284A, Q311A, P313A, K315A。
ｂ．^３Ｈ−ＺＭ２４１３８５（アンタゴニスト）と共にアッセイした際に、１８の変異体が改善された熱安定性を示した：A54L, V57A, H75A, T88A, G114A, G118A, T119A, K122A, G123A, P149A, E151A, G152A, A203L, A204L, A231L, L235A, V239A。
３．変異を組み合わせて、推定上のアンタゴニストの立体構造において変異体を産生した。野生型Ａ_２ａＲはＺＭ２４１３８５が結合した状態で３１℃のＴｍを有する。
a.Rant17 A54L+K122A+L235A Tm 48°C (ZM241385 bound)
b.Rant19 A54L,T88A,V239A+A204L Tm 47°C (ZM241385 bound)
c.Rant21 A54L,T88A,V239A+K122A Tm 49°C (ZM241385 bound)
４．アゴニストスクリーニングよる変異を組み合わせたが、＋２℃のＴｍという非常に低レベルの改善のみをもたらした。

【0244】

【表3】

【0245】

【表4】

【0246】

【表5】

【0247】

【表6】

【0248】

【表7】

【0249】

（実施例３）
増大した熱安定性を有するニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）の変異体
１．３４０部位特異的変異体を、ＮＴＲの６１から４００残基の間に作製した。
２．まず、これらの変異体の全てを、加熱工程後に^３Ｈ−ニューロテンシン（アゴニスト）結合を測定するアッセイを使用して熱安定性についてアッセイした。２４の変異体は、熱安定性おける小さいが顕著な増大をもたらした：A356L, H103A, D345A, A86L, A385L, Y349A, C386A, K397A, H393A, I116A, F358A, S108A, M181A, R392A, D113A, G209A, L205A, L72A, A120L, P399A, Y351A, V268A, T207A, A155L, S362A, F189A, N262A, L109A, W391A, T179A, S182A, M293A, L256A, F147A, D139A, S100A, K176A, L111A, A90L, N270A。
３．アゴニストの非存在下における加熱によって熱安定性について試験した変異体を、変異体を^３Ｈ−ニューロテンシンの存在下で加熱する僅かに異なるアッセイを使用して再試験した（図１２におけるリガンド（＋）フォーマット）。改善された熱安定性を有する変異体は：A69L, A73L, A86L, A90L, H103A, V165A, E166A, G215A, V229A, M250A, I253A, A177L, R183A, I260A, T279A, T294A, G306A, L308A, V309A, L310A, V313A, F342A, F358A, V360A, S362A, N370A, S373A, F380A, A385L, P389A, G390A, R395A。
４．野生型の受容体と比較して顕著に向上した発現レベルを有する変異体も存在し、結晶化のための受容体生産レベルを促進するために使用し得る：A86L, H103A, F358A, S362A, N370A, A385L, G390A。これら全てが熱安定性を増大させた。
５．好ましい組み合わせは、
a. Nag7m F358A+A86L+I260A+F342A Tm 51°C (ニューロテンシン結合)
b. Nag7n F358A+H103A+I260A+F342A Tm 51°C (ニューロテンシン結合)
野生型のＮＴＲは、ニューロテンシンが結合した状態で３５℃のＴｍを有する。

【0250】

（実施例４）
安定化ＧＰＣＲ変異が存在する構造モチーフの同定
β２アドレナリン受容体の構造を決定した（非特許文献２０及び２１）。それはシチメンチョウβ１受容体と５９％同一であったが、はっきりと異なる薬理学的プロフィールを有していた（非特許文献２２及び２３）。シチメンチョウβ１受容体の安定化変異が存在する構造モチーフを決定するために、本発明者は、ヒトβ２構造に変異をマッピングした（非特許文献２１）。

【0251】

ＭａｃＶｅｃｔｏｒパッケージにおいてＣｌｕｓｔａｌＷを使用して、βアドレナリン受容体を最初に整列（アライン）した；シチメンチョウβ１における熱安定化変異を、ヒトβ２配列における対応する残基と同様にハイライトした。ヒトβ２モデル（ｐｄｂ登録コード２ＲＨ１）はＰｙｍｏｌで可視化し、所望のアミノ酸を、当該技術分野において既知の標準的な手法によって空間充填モデルとして示した。安定化変異が存在する構造モチーフは、目視検査によって決定した。

【0252】

表（ｖｉ）は、βＡＲ−ｍ２３の熱安定化変異に対応するβ２受容体における対応する位置及びそれらが存在する構造モチーフの一覧である。

【0253】

表（ｖｉ）から認められるように、変異体は、多数の異なる位置に存在している。３つの変異は、水性溶媒に接近可能であることが予測されるループ領域に存在する（ループ）。８の変異は、膜貫通α−ヘリックスに存在し、脂質二重層を示す（脂質）；これらの変異の３つはヘリックスの末端付近に存在し、親水性境界層に存在していると解されてよい（脂質境界）。８の変異は膜貫通α−ヘリックスの間の界面に存在することが認められ（ヘリックス−ヘリックス界面）、そのうち３つはヘリックスのねじれた又は曲がった領域内のいずれかに存在し（ねじれ）、他の２つの変異は一つのヘリックスで生じているが、変異した残基に対して空間をあけて近接するねじれを含有する1つ又は複数の他のヘリックスと近接している（反対側のねじれ）。これらの後者の変異は、ねじれた領域内のアミノ酸のパッケージングに影響を与え、熱安定化をもたらし得る。他の変異は、基質結合ポケットに存在する（ポケット）。

【0254】

【表8】

【0255】

その様な構造モチーフは、それらが安定化変異を含有するために、タンパク質安定性の測定において重要である。したがって、これらのモチーフを変異の標的とすることは、安定化したＧＰＣＲ変異体の産生を容易にする。事実、２以上の変異を同一の構造モチーフにマッピングした幾つかの例が存在する。例えば、Ｙ２２７Ａ、Ｖ２３０Ａ、及びＡ２３４Ｌといったシチメンチョウβ１アドレナリン受容体における変異は全て、同一のヘリックス界面にマッピングされ、Ｖ８９Ｌ及びＭ９０Ｖといった変異は同一のヘリックスのねじれにマッピングされ、Ｆ３２７Ａ及びＡ３３４Ｌといった変異は脂質二重層を示す同一のヘリックス表面にマッピングされた（表（ｖｉ））。かくして、1つの安定化変異が同定された際における、変異が存在する構造モチーフの決定は、更なる安定化変異の同定を可能にするであろう。
[参考文献]

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【配列表】

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