特許 6427493 ＣＤ１８０への抗原標的化のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6427493

(24)【登録日】2018年11月2日

(45)【発行日】2018年11月21日

(54)【発明の名称】ＣＤ１８０への抗原標的化のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/35 20060101AFI20181112BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20181112BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20181112BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20181112BHJP

   A61K 39/29 20060101ALI20181112BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20181112BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20181112BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20181112BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20181112BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20181112BHJP

   A61P 37/08 20060101ALN20181112BHJP

   A61P 37/02 20060101ALN20181112BHJP

   A61P 31/04 20060101ALN20181112BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20181112BHJP

   A61P 1/16 20060101ALN20181112BHJP

   A61P 3/10 20060101ALN20181112BHJP

   A61P 13/12 20060101ALN20181112BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/35

   C07K16/28

   A61K39/00 H

   A61K39/12

   A61K39/29

   C12N15/62 Z

   C07K19/00

   C12P21/08

   A61P31/12

   !A61K39/395 L

   !A61P37/08

   !A61P37/02

   !A61P31/04

   !A61P35/00

   !A61P1/16

   !A61P3/10

   !A61P13/12

【請求項の数】15

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2015-532117(P2015-532117)

(86)(22)【出願日】2013年9月16日

(65)【公表番号】特表2015-529682(P2015-529682A)

(43)【公表日】2015年10月8日

(86)【国際出願番号】US2013059898

(87)【国際公開番号】WO2014046994

(87)【国際公開日】20140327

【審査請求日】2016年6月27日

(31)【優先権主張番号】61/702,368

(32)【優先日】2012年9月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512205245

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ワシントン スルー イッツ センター フォー コマーシャリゼーション

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】クラーク，エドワード

(72)【発明者】

【氏名】チャップリン，ジェイ，ウェスリー

【審査官】 深草 亜子

(56)【参考文献】

【文献】 NATURE IMMUNOLOGY，２００５年，V6 N6，P571-578

【文献】 TRENDS IN IMMUNOLOGY，２０１２年 ２月，V33 N2，P71-77

【文献】 EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY，２００９年 ４月，V39 N4，P931-938

【文献】 JOURNAL OF IMMUNOLOGY，２０１１年１０月１５日，V187 N8，P4199-4209

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ０７Ｋ １９／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

異種抗原に付加された、ＣＤ１８０に結合する抗体または抗体断片であって、
前記異種抗原がアレルゲン、病原体特異的抗原または疾患関連抗原である、
抗体または抗体断片。

【請求項2】

前記異種抗原がポリペプチド抗原である、請求項１に記載の抗体または抗体断片。

【請求項3】

前記異種抗原が疾患関連抗原であり、前記疾患関連抗原が腫瘍抗原である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。

【請求項4】

前記異種抗原が、西ナイルウイルス抗原、肝炎ウイルス抗原およびデング熱ウイルス抗原からなる群から選択される病原体特異的抗原である、請求項１に記載の抗体または抗体断片。

【請求項5】

前記ＣＤ１８０に結合する抗体または抗体断片が、ＣＤ１８０モノクローナル抗体または抗体断片であり、好ましくはヒトもしくは動物のＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂおよび／またはヒトもしくは動物の補体タンパク質への結合が損なわれた免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）ドメインに連結されたヒトまたは動物のＣＤ１８０結合ドメインである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。

【請求項6】

前記異種抗原がポリペプチドであり、前記ＣＤ１８０に結合する抗体または抗体断片と前記異種抗原が融合タンパク質として発現される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片をコードする単離核酸。

【請求項7】

請求項６に記載の単離核酸を含む、核酸ベクター。

【請求項8】

請求項７に記載の核酸ベクターを含む、組換え宿主細胞。

【請求項9】

（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片と；
（ｂ）薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。

【請求項10】

（ａ）核酸にコードされた抗体の発現に好適な条件下で請求項８に記載の組換え宿主細胞を培養することと；
（ｂ）培養された細胞から前記抗体を単離することと
を含む、抗体を産生するための方法。

【請求項11】

個体において抗原特異的免疫応答を生じさせるための医薬品の製造における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片あるいは請求項９に記載の医薬組成物の使用。

【請求項12】

前記個体が、Ｔ細胞欠損および／またはＢ細胞とＴ細胞との間の共刺激の欠陥を有する、請求項１１に記載の使用。

【請求項13】

前記個体が、新生児であるか、高齢者であるか、アレルギーを有するか、先天性または後天性の免疫不全を有するか、病原菌に曝露されているか；あるいは、前記個体が、毛細血管拡張性運動失調、高ＩｇＭ症候群、ディジョージ症候群、Ｗｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、分類不能型免疫不全症候群、正常免疫グロブリンの選択的抗体欠損（ＳＡＤＮＩ）を含む多糖応答欠陥、ウイルス感染、癌、肝炎、糖尿病、および骨髄もしくは器官移植または細胞毒性療法／骨髄破壊的療法に後続する免疫抑制からなる群から選択される１つまたは複数の病態を有するか；あるいは、妊娠している女性であるか、無脾であるか、骨髄抑制またはリンパ細胞の減少を引き起こす薬剤を服用しているか、放射線療法を受けているか、および慢性腎不全を有する、請求項１１に記載の使用。

【請求項14】

前記異種抗原が、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）抗原である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項15】

前記異種抗原が、肝炎ウイルス抗原またはデング熱ウイルス抗原である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／７０２，３６８号の優先権を主張し、その全体は参照として本明細書に援用される。
政府の権利に関する記述

【0002】

本発明は、米国立総合医科学研究所からの国立衛生研究所補助金番号Ｒ０１ ＡＩ５２２０３およびＲ３７ ＡＩ４４２５７および２Ｔ３２ ＧＭ００７２７０下で政府支援により行なわれた。政府は本発明に一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

現在のワクチン接種の戦略は、ＩｇＧクラス抗体を産生するためにＴ細胞の支援を必要とし、結果的に、この戦略は、Ｔ細胞欠損（ディジョージ症候群、ＡＩＤＳ）またはＢ細胞とＴ細胞との間の共刺激の欠陥（ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド相互作用の欠如からの高ＩｇＭ症候群）に罹患した患者では成功しない。抗原標的化とは、免疫付与物質（抗原）がモノクローナル抗体にカップルされる方法であり、注入された場合、抗原は送達され、抗体産生Ｂ細胞へ刺激シグナルをもたらす。樹状細胞上のＣＤ４０またはＤＥＣ−２０５に指向性を有する、公開された抗原標的化戦略は、ＩｇＧ産生を促進するが、この効果のためには機能的なＴ細胞をまだ必要とする。したがって、組成物および方法の改善が必要とされる。

【発明を実施するための形態】

【0004】

第１の態様において、本発明は、
（ａ）ＣＤ１８０標的化分子と；
（ｂ）ＣＤ１８０標的化分子へ付加された異種抗原と
を含む組成物を提供する。

【0005】

様々な実施形態において、異種抗原は、ポリペプチド、炭水化物、多糖または糖脂質抗原である。様々なさらなる実施形態において、抗原はアレルゲンまたは病原体特異的抗原である。具体的な実施形態において、病原体特異的抗原は、西ナイルウイルス抗原、肝炎ウイルス抗原およびデング熱ウイルス抗原からなる群から選択される抗原を含む。別の実施形態において、ＣＤ１８０標的化分子はＣＤ１８０抗体または抗体断片である。さらなる実施形態において、ＣＤ１８０標的化分子はＣＤ１８０抗体または抗体断片であり、そこで異種抗原はポリペプチドである。別の実施形態において、組成物はアジュバント（トール様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニストおよびＴＬＲ９アゴニスト等）をさらに含む。

【0006】

別の態様において、本発明は、抗原がポリペプチドである本発明の組成物をコードする単離核酸を提供する。さらなる態様において、本発明は、本発明の単離核酸を含む核酸ベクターを提供する。別の態様において、本発明は、本発明の核酸ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。なおさらなる態様において、本発明は、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせに従う組成物を含む医薬組成物、および薬学的に許容される担体を提供する。

【0007】

さらなる態様において、本発明は、核酸にコードされた抗体組成物の発現に好適な条件下で、本発明の組換え宿主細胞を培養する工程と；培養細胞から抗体組成物を単離する工程とを含む抗体を産生するための方法を提供した。

【0008】

なおさらなる態様において、本発明は、障害の発症を治療または限定するのに効果的な量の、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせに従う組成物、またはその薬学的に許容される塩を、障害のリスクがある個体または障害を有する個体へ投与する工程を含む、障害の発症を治療または限定するための方法を提供する。一実施形態において、個体は、Ｔ細胞欠損および／またはＢ細胞とＴ細胞との間の共刺激の欠陥を有する。別の実施形態において、個体は新生児または高齢者である。さらなる実施形態において、個体は、アレルギー、先天性もしくは後天性の免疫不全を有するか、病原菌に曝露されるか、毛細血管拡張性運動失調、高ＩｇＭ症候群、ディジョージ症候群、Ｗｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、分類不能型免疫不全症候群、正常免疫グロブリンの選択的抗体欠損（ＳＡＤＮＩ）が含まれる多糖応答欠陥、ウイルス感染、癌、肝炎、糖尿病、および骨髄もしくは器官移植または細胞毒性療法／骨髄破壊的療法に後続する免疫抑制からなる群から選択される１つまたは複数の病態を有するか；または妊娠している女性であるか、無脾であるか、骨髄抑制またはリンパ細胞の減少を引き起こす薬剤を服用しているか、放射線療法を受けているか、ならびに／もしくは慢性腎不全を有する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1a】ＣＤ１８０への標的化は、部分的にＴ細胞非依存性のＡｇ特異的ＩｇＧ産生を誘導する。（Ａ）野生型マウスに、ＮＰ−アイソタイプ対照モノクローナル抗体（白色の棒）の１００μｇまたは段階をつけた用量のＮＰ−αＣＤ１８０モノクローナル抗体（１０、３０または１００μｇ、それぞれ薄い灰色、中間の灰色および黒色の棒）のいずれかを静脈注射で接種した。０日目（１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０群のみ、斜線を付けた棒）または１０日目にマウスから前採血し、全血清Ｉｇ（上部）または抗ＮＰ特異的（下部）ＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３レベルをＥＬＩＳＡによって決定した。

【図1b】（Ｂ）野生型マウス、ＣＤ４０ ＫＯマウスまたはＴＣＲ ＫＯマウスに、１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０モノクローナル抗体（黒色）またはＮＰ−アイソタイプモノクローナル抗体（白色）または、αＣＤ１８０（斜線を付けた）を接種し、１０日目に採血し、ＮＰ特異的なＩｇＭ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の応答について分析した。

【図1c】（Ｃ）野生型マウスまたはＣＤ４０ ＫＯマウスを（Ｂ）中でのように処理し、０日目および１０日目に採血し、ＮＰ特異的Ａｂ（ＩｇＭおよびＩｇＧのサブクラス）のレベルについて血清を分析した。データは、３匹のマウス／群を使用する、３つの実験（Ａ）、４つの実験（Ｂ）および３つの実験（Ｃ）の代表である。

【図2a】ＣＤ１８０の標的化は、ミョウバン中のＡｇよりも高いレベルのＡｇ特異的ＩｇＧを迅速に誘導する。（Ａ）野生型マウスまたはＣＤ４０ ＫＯマウスに、１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０（円）もしくはＮＰ−アイソタイプ（上下逆さまの三角形）を静脈注射、または１００μｇのミョウバン中のＮＰ−アイソタイプ（三角形）を腹腔内投与のいずれかで接種し、示された時間ポイントで採血し、ＮＰ特異的ＩｇＧのレベルについて血清を分析した。

【図2b】（Ｂ）野生型マウスに、１００μｇのＯＶＡ−αＣＤ１８０もしくはＯＶＡ−アイソタイプを静脈注射、または１００μｇのミョウバン中のＯＶＡ−アイソタイプを腹腔内投与のいずれかで接種し、接種後７日目に採血し、ＯＶＡ特異的ＩｇＧのレベルについて血清を分析した。

【図2c】（Ｃ）野生型マウスに、１００μｇの各々の示された刺激を接種し、１０日目に採血し、ＮＰ特異的ＩｇＧ（白色カラム）またはＯＶＡ特異的ＩｇＧ（黒色カラム）のレベルについて評価した。データは３匹のマウス／群で２つの実験（Ａ）または３つの実験（Ｂ、Ｃ）の代表である。

【図3a】ＣＤ１８０標的化は、親和性成熟、ＥＦ応答、胚中心形成および免疫学的記憶を誘導する。（Ａ）１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０または１０μｇのＮＰ−αＤＣＩＲ２で免疫付与した野生型（黒色円）またはＣＤ４０ ＫＯマウス（白色円）からの血清を、接種後５日目および７日目でのＮＰへの親和性について分析した。

【図3b】（Ｂ）野生型（黒色円）に、１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０を単独で、または示されたアジュバント（５０μｇのＣｐＧ−Ａ、５０μｇのＣｐＧ−Ｂ、２０μｇのＲ８４８または４μｇのＬＰＳ）と共に接種し、次いで７および２８日目に採血し；ＮＰに対する親和性について血清を分析した。対照には、ＮＰ−アイソタイプ、ＮＰ−アイソタイプ＋ミョウバンまたはＮＰ−αＤＣＩＲ２を接種したマウスが含まれていた。

【図3c】（Ｃ）野生型マウスに、５０μｇのＮＰ−αＣＤ１８０を単独で、または（Ｂ）中で示されるようなアジュバントと共に接種し、７、１４、２１および２８日目に採血し；ＮＰ特異的ＩｇＭ Ａｂ（左側）またはＮＰ特異的ＩｇＧ Ａｂ（右側）のレベルについて血清を分析した。３つの実験の各々の代表的な実験はＡ、ＢおよびＣで示される。

【図3d】（Ｄ〜Ｆ）Ｌｙ５．１＋Ｂ１−８ｈｉマウスからの２×１０^５のＮＰ結合Ｂ細胞を、−１日目にＬｙ５．２＋野生型レシピエントへ養子移入した。０日目に、１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０（黒色）またはＮＰ−アイソタイプ（白色）のいずれかをマウスに接種し、フローサイトメトリーによる分析のために４日目または７日目のいずれかで脾臓を採取した。１脾臓あたりのＮＰ特異的Ｂ２２０＋Ｂ細胞（Ｄ）およびＮＰ特異的ＰＮＡ＋ＧＬ７＋ＧＣ Ｂ細胞（Ｅ）の数を、Ｌｙ５．１＋ＮＰ結合Ｂ細胞で連続的にゲーティングすることによって決定した。（Ｆ）１脾臓あたりのＢ２２０ｌｏＣＤ１３８＋ＡＦＣの数をプロットする。データはＤ〜Ｆについて２つの実験の代表である。

【図3e】（Ｄ〜Ｆ）Ｌｙ５．１＋Ｂ１−８ｈｉマウスからの２×１０^５のＮＰ結合Ｂ細胞を、−１日目にＬｙ５．２＋野生型レシピエントへ養子移入した。０日目に、１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０（黒色）またはＮＰ−アイソタイプ（白色）のいずれかをマウスに接種し、フローサイトメトリーによる分析のために４日目または７日目のいずれかで脾臓を採取した。１脾臓あたりのＮＰ特異的Ｂ２２０＋Ｂ細胞（Ｄ）およびＮＰ特異的ＰＮＡ＋ＧＬ７＋ＧＣ Ｂ細胞（Ｅ）の数を、Ｌｙ５．１＋ＮＰ結合Ｂ細胞で連続的にゲーティングすることによって決定した。（Ｆ）１脾臓あたりのＢ２２０ｌｏＣＤ１３８＋ＡＦＣの数をプロットする。データはＤ〜Ｆについて２つの実験の代表である。

【図3f】（Ｄ〜Ｆ）Ｌｙ５．１＋Ｂ１−８ｈｉマウスからの２×１０^５のＮＰ結合Ｂ細胞を、−１日目にＬｙ５．２＋野生型レシピエントへ養子移入した。０日目に、１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０（黒色）またはＮＰ−アイソタイプ（白色）のいずれかをマウスに接種し、フローサイトメトリーによる分析のために４日目または７日目のいずれかで脾臓を採取した。１脾臓あたりのＮＰ特異的Ｂ２２０＋Ｂ細胞（Ｄ）およびＮＰ特異的ＰＮＡ＋ＧＬ７＋ＧＣ Ｂ細胞（Ｅ）の数を、Ｌｙ５．１＋ＮＰ結合Ｂ細胞で連続的にゲーティングすることによって決定した。（Ｆ）１脾臓あたりのＢ２２０ｌｏＣＤ１３８＋ＡＦＣの数をプロットする。データはＤ〜Ｆについて２つの実験の代表である。

【図3g】ＮＰ−ＣＧＧ＋ミョウバンまたはＮＰ−αＣＤ１８０で４日または７日前に免疫付与したマウスからの８μｍの脾臓の凍結切片を、抗Ｂ２２０−ｅＦｌｕｏｒ４５０、ＰＮＡ−ＦＩＴＣおよびＮＰ−ＰＥにより染色した。データは、時間ポイントあたり２〜３匹のマウスから分析された複数の切片を代表する。スケールバーは１００μｍを表わす。

【図3h】（Ｈ）（Ｇ）中のマウスからの１濾胞あたりのＰＮＡ＋ＧＣの平均数（７日目の時間ポイント）。各々のドットは、４つの個々の切片が分析された１匹の動物を表わす。ＧおよびＨ中のデータは、２つの独立した実験の代表的な実験を図示する。

【図3i】（Ｉ）野生型マウスおよびＣＤ４０ ＫＯマウスを示されるようにプライミングし、１０週間安静にし、次いでＡｇ（２０μｇ）またはＰＢＳによる二次チャレンジを腹腔内に与えた。ブースト後４日目に脾臓を採取し、ＥＬＩＳＰＯＴによってＮＰ特異的ＡＦＣについて分析した。３匹のマウス／群を使用する２つの独立した実験からの組み合わせた結果が示される。各々のドットは個々の動物を表わす。統計値は、ＮＰ−αＣＤ１８０によりプライミングし、ＮＰ−アイソタイプによりチャレンジしたマウスに対して群を比較したものである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図4a】Ａｇ特異的Ｂ細胞は、ＢＣＲおよびＣＤ１８０を介する組み合わせシグナリングによって効率的にインビボで活性化される。（Ａ、Ｂ）Ｂ１−８ｈｉマウスの群（９匹のマウス／群）に１００μｇのＮＰ−アイソタイプまたはＮＰ−αＣＤ１８０のいずれかを接種し、２４時間後（ＡおよびＢ）または４８および７２時間後（データ不掲載）に脾臓を採取した。ＮＰ特異的Ｂ細胞（６〜１０％）を、ＮＰ−ＡＰＣによる染色によって全ＣＤ１９＋Ｂ細胞と弁別した。次いで、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の４群（以下に示す）を、ＣＤ６９、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩおよびＴＡＣＩの発現についてエクスビボで分析した。刺激されないＢ細胞（ＮＰ−アイソタイプ処理されたマウスからのＮＰ−Ｂ細胞、（Ａ）中で灰色）；Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）刺激Ｂ細胞（ＮＰ−アイソタイプで処理したマウスからのＮＰ＋Ｂ細胞）；ＣＤ１８０刺激Ｂ細胞（ＮＰ−αＣＤ１８０で処理したマウスからのＮＰ−Ｂ細胞）；ならびに刺激されたＢＣＲおよびＣＤ１８０の両方を介して刺激されたＢ細胞（ＮＰ−αＣＤ１８０に処理されたマウスからのＮＰ＋Ｂ細胞）。（Ａ）ヒストグラムは、示されるように刺激されたＢ２２０＋Ｂ細胞上での免疫付与２４時間後のＣＤ８６およびＴＡＣＩ発現を示す。（Ｂ）免疫付与２４時間後の平均蛍光強度を、示された表面マーカーについて、刺激なしの対照Ｂ細胞（値１．０）と比較してプロットする。免疫付与後４８および７２時間で類似したデータが得られた。３つの実験の代表的な実験を示す。

【図4b】Ａｇ特異的Ｂ細胞は、ＢＣＲおよびＣＤ１８０を介する組み合わせシグナリングによって効率的にインビボで活性化される。（Ａ、Ｂ）Ｂ１−８ｈｉマウスの群（９匹のマウス／群）に１００μｇのＮＰ−アイソタイプまたはＮＰ−αＣＤ１８０のいずれかを接種し、２４時間後（ＡおよびＢ）または４８および７２時間後（データ不掲載）に脾臓を採取した。ＮＰ特異的Ｂ細胞（６〜１０％）を、ＮＰ−ＡＰＣによる染色によって全ＣＤ１９＋Ｂ細胞と弁別した。次いで、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の４群（以下に示す）を、ＣＤ６９、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩおよびＴＡＣＩの発現についてエクスビボで分析した。刺激されないＢ細胞（ＮＰ−アイソタイプ処理されたマウスからのＮＰ−Ｂ細胞、（Ａ）中で灰色）；Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）刺激Ｂ細胞（ＮＰ−アイソタイプで処理したマウスからのＮＰ＋Ｂ細胞）；ＣＤ１８０刺激Ｂ細胞（ＮＰ−αＣＤ１８０で処理したマウスからのＮＰ−Ｂ細胞）；ならびに刺激されたＢＣＲおよびＣＤ１８０の両方を介して刺激されたＢ細胞（ＮＰ−αＣＤ１８０に処理されたマウスからのＮＰ＋Ｂ細胞）。（Ａ）ヒストグラムは、示されるように刺激されたＢ２２０＋Ｂ細胞上での免疫付与２４時間後のＣＤ８６およびＴＡＣＩ発現を示す。（Ｂ）免疫付与２４時間後の平均蛍光強度を、示された表面マーカーについて、刺激なしの対照Ｂ細胞（値１．０）と比較してプロットする。免疫付与後４８および７２時間で類似したデータが得られた。３つの実験の代表的な実験を示す。

【図5a】ＣＤ１８０ Ａｇ標的化反応は、非Ｂ細胞ではなくＢ細胞上での発現を必要とする。（Ａ）養子移入の概略図。野生型マウスまたはＣＤ１８０ ＫＯマウスのいずれかから精製した１０×１０^６Ｂ細胞を、示されるようにμＭＴレシピエントまたはＣＤ１８０ ＫＯレシピエントへ移入した。移入の２４時間後、マウスに１００μｇのＮＰ−アイソタイプまたはＮＰ−αＣＤ１８０を接種し、１０日後に採血した。

【図5b】（Ｂ）１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０（黒色）またはＮＰ−アイソタイプ（白色）による接種後の、（Ａ）中で示される群の１０日目でのＮＰ特異的ＩｇＧ応答のＥＬＩＳＡによる分析。３匹のマウス／群；２つの実験の代表である。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図5c】（Ｃ）野生型マウスに１００μｇのＯＶＡ−αＣＤ１８０またはＯＶＡ−アイソタイプを接種し、１６時間後に脾臓を採取した。Ｂ細胞およびＤＣをネガティブ選択によって精製し、次いで示された比でＣＦＳＥ標識した精製されたＯＴ−ＩＩ Ｔ細胞を示された比で培養の中へ播種した。ＣＤ４＋Ｖα２ ＴＣＲ＋細胞のＣＦＳＥ希釈を培養７２時間後に査定した。（Ｄ）（Ｃ）中でのように、しかしＣＤ８＋Ｖα２ ＴＣＲ＋ＯＴ−Ｉ細胞を用いて実行した。共培養は三重で実行され、ＣおよびＤの両方についての２つの自立した実験の代表である。

【図6a】ＭＨＣクラスＩＩは、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＩＦＮα／β、ＩＬ−４またはＯＸ４０Ｌではなく、ＣＤ１８０へのＡｇ標的化のために必要とされる。（Ａ、Ｂ）野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよび示されたＫＯマウス（Ａ）またはＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｂ）に、１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０またはＮＰ−アイソタイプを接種し、１０日目に採血した。ＮＰ特異的ＩｇＧ ＡｂのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。３匹のマウス／群；ＡおよびＢの両方についての２つの実験の代表である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、野生型対照への比較によるＢｏｎｆｅｒｏｎｎｉ後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。（Ｃ）野生型マウスの群に１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０またはＮＰ−アイソタイプで免疫付与し、脾臓のＢ細胞サブセットの分析のために接種後１および３日目に屠殺した。フローサイトメトリープロットは、濾胞Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｈｉＣＤ２１ｉｎｔ）、辺縁帯Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｌｏＣＤ２１ｈｉＣＤ９３−）およびＴ１／Ｔ２移行Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｌｏＣＤ２１ｌｏＣＤ９３＋）の列挙に使用したゲーティング戦略を示す（１日目の群を示す）。棒グラフは、各々のサブセットの脾臓中の細胞の総数（平均±ＳＥＭ）を図示する。グラフ上の数は、ＮＰ−αＣＤ１８０で免疫付与したマウスからの細胞サブセットがアイソタイプ対照と比較して何倍増加したかを示す。データは３〜４匹のマウス／群／時間ポイントを使用する１つの実験からのものである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。

【図6b】ＭＨＣクラスＩＩは、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＩＦＮα／β、ＩＬ−４またはＯＸ４０Ｌではなく、ＣＤ１８０へのＡｇ標的化のために必要とされる。（Ａ、Ｂ）野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよび示されたＫＯマウス（Ａ）またはＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｂ）に、１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０またはＮＰ−アイソタイプを接種し、１０日目に採血した。ＮＰ特異的ＩｇＧ ＡｂのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。３匹のマウス／群；ＡおよびＢの両方についての２つの実験の代表である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、野生型対照への比較によるＢｏｎｆｅｒｏｎｎｉ後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。（Ｃ）野生型マウスの群に１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０またはＮＰ−アイソタイプで免疫付与し、脾臓のＢ細胞サブセットの分析のために接種後１および３日目に屠殺した。フローサイトメトリープロットは、濾胞Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｈｉＣＤ２１ｉｎｔ）、辺縁帯Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｌｏＣＤ２１ｈｉＣＤ９３−）およびＴ１／Ｔ２移行Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｌｏＣＤ２１ｌｏＣＤ９３＋）の列挙に使用したゲーティング戦略を示す（１日目の群を示す）。棒グラフは、各々のサブセットの脾臓中の細胞の総数（平均±ＳＥＭ）を図示する。グラフ上の数は、ＮＰ−αＣＤ１８０で免疫付与したマウスからの細胞サブセットがアイソタイプ対照と比較して何倍増加したかを示す。データは３〜４匹のマウス／群／時間ポイントを使用する１つの実験からのものである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。

【図6c】ＭＨＣクラスＩＩは、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＩＦＮα／β、ＩＬ−４またはＯＸ４０Ｌではなく、ＣＤ１８０へのＡｇ標的化のために必要とされる。（Ａ、Ｂ）野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよび示されたＫＯマウス（Ａ）またはＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｂ）に、１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０またはＮＰ−アイソタイプを接種し、１０日目に採血した。ＮＰ特異的ＩｇＧ ＡｂのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。３匹のマウス／群；ＡおよびＢの両方についての２つの実験の代表である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、野生型対照への比較によるＢｏｎｆｅｒｏｎｎｉ後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。（Ｃ）野生型マウスの群に１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０またはＮＰ−アイソタイプで免疫付与し、脾臓のＢ細胞サブセットの分析のために接種後１および３日目に屠殺した。フローサイトメトリープロットは、濾胞Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｈｉＣＤ２１ｉｎｔ）、辺縁帯Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｌｏＣＤ２１ｈｉＣＤ９３−）およびＴ１／Ｔ２移行Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｌｏＣＤ２１ｌｏＣＤ９３＋）の列挙に使用したゲーティング戦略を示す（１日目の群を示す）。棒グラフは、各々のサブセットの脾臓中の細胞の総数（平均±ＳＥＭ）を図示する。グラフ上の数は、ＮＰ−αＣＤ１８０で免疫付与したマウスからの細胞サブセットがアイソタイプ対照と比較して何倍増加したかを示す。データは３〜４匹のマウス／群／時間ポイントを使用する１つの実験からのものである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｂｏｎｆｅｒｏｎｎｉ後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。

【図7a】ＯＶＡ−αＣＤ１８０コンジュゲートおよびＴＬＲ７アゴニストの組み合わせが（Ａ）ＩｇＧ抗体および（Ｂ）ＩｇＭ抗体の反応の相乗的誘導を提供することを示すグラフ。

【図7b】ＯＶＡ−αＣＤ１８０コンジュゲートおよびＴＬＲ７アゴニストの組み合わせが（Ａ）ＩｇＧ抗体および（Ｂ）ＩｇＭ抗体の反応の相乗的誘導を提供することを示すグラフ。

【図8a】精製した組換え西ナイルウイルス（ＷＮＶ）エンベロープ（Ｅ）タンパク質が付加されている（ＷＮＶＥ）抗ＣＤ１８０を接種したマウスが、（Ａ）ＷＮＶＥ特異的ＩｇＧ Ａｂおよび（Ｂ）ＷＮＶＥに対する中和Ａｂの両方を生じることを示すグラフ。

【図8b】精製した組換え西ナイルウイルス（ＷＮＶ）エンベロープ（Ｅ）タンパク質が付加されている（ＷＮＶＥ）抗ＣＤ１８０を接種したマウスが、（Ａ）ＷＮＶＥ特異的ＩｇＧ Ａｂおよび（Ｂ）ＷＮＶＥに対する中和Ａｂの両方を生じることを示すグラフ。

【図9】ＷＮＶＥ−αＣＤ１８０コンジュゲートが、ＴＬＲ７（Ｒ８４８）またはＴＬＲ９（ＣｐＧＢ）のアジュバントの添加によって中和抗体応答の促進を誘導することを示すグラフ。

【発明の概要】

【0010】

引用されたすべての参照は、それらの全体が参照として本明細書に援用される。本出願内では、特別の指示の無い限り、利用されたテクニックは、以下のような複数の周知の参照文献のいずれか中で見出すことができる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ“ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，ｅｄ．，（１９９０） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ， Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、およびＡｍｂｉｏｎ １９９８年カタログ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）。

【0011】

本明細書において使用される時、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には、文脈が明確に指示しない限り複数の指示物が含まれる。「および」は本明細書において使用される時、特別に明記しない限り、「または」と互換的に使用される。

【0012】

本発明の任意の態様のすべての実施形態は、文脈が明確に指示しない限り組み合わせで使用することができる。

【0013】

第１の態様において、本発明は、
（ａ）ＣＤ１８０標的化分子と；
（ｂ）ＣＤ１８０標的化分子へ付加された異種抗原と
を含む組成物を提供する。

【0014】

本発明の組成物は、ＣＤ１８０（Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞上で発現される表面タンパク質）へ抗原を標的化し、例えばＴ細胞共刺激の非存在（ＣＤ４０欠損等）またはＴ細胞の完全な非存在（ＴＣＲβ／δ欠損等）下において抗原特異なＩｇＧを産生する方法において使用することができる。

【0015】

本明細書において開示されるように、本発明者は、本発明の組成物が抗原（Ａｇ）特異的Ｂ細胞の迅速な活性化を誘導し、７日以内の有意な抗原特異的なＩｇＧおよびＩｇＭの産生をもたらすことを意外にも見出した。顕著なことには、追加のアジュバントなしのＡｇ−ＣＤ１８０抗体（αＣＤ１８０）の単回注射は、抗体（Ａｂ）親和性成熟および免疫学的記憶の両方の発達ももたらした。

【0016】

ＣＤ１８０標的化分子は、Ｂ細胞、マクロファージまたは樹状細胞の表面において存在するＣＤ１８０へ直接結合する任意の分子であり得る。様々な非限定的実施形態において、ＣＤ１８０標的化分子は、ポリペプチド（ペプチド模倣物、抗体など等）、核酸（アプタマー等）、炭水化物、有機分子などであり得る。特定の実施形態において、ＣＤ１８０標的化分子はポリペプチドを含み；１つの非限定的実施形態において、ポリペプチドは抗体または抗体断片である。本明細書において使用される時、「抗体」には、ヒトＣＤ１８０と免疫学的に反応性の（好ましくはＣＤ１８０について選択的な）免疫グロブリン分子への参照が含まれ、モノクローナル抗体が含まれる。抗体の様々なアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、および他のＩｇ、例えばＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥアイソタイプが存在する。この用語には、遺伝子操作形態（キメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば二重特異性抗体）、完全ヒト化抗体およびヒト抗体等）も含まれる。出願を通して使用されるように、「抗体」という用語には、抗原結合能力を備えた断片（例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧ）が含まれる。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．およびＲｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）も参照されたい。例えばＫｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）も参照されたい。この用語は組換え単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）も指す。この用語には、抗体は二価分子または二重特異性分子、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディも含まれる。二価分子および二重特異性分子は、例えばＫｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．．（１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１５４７、Ｐａｃｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９、前出、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ：５３６８、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ６：７８１、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：４０２６、ＭｃＣａｒｔｎｅｙ， ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：３０１中で述べられる。様々な抗原結合ドメイン−融合タンパク質は、例えば米国特許出願第２００３／０１１８５９２号および第２００３／０１３３９３９号中で開示され、本出願において使用されるような「抗体」という用語内に包含される。

【0017】

ヒトＣＤ１８０と免疫学的に反応性のある抗体は、組換え法（ファージまたは類似のベクターの組換え抗体のライブラリーの選択等）によって（例えばＨｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６（１９８９）；およびＶａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９−３１４（１９９６）を参照）、または抗原もしくは抗原をコードするＤＮＡによる動物の免疫付与によって、生成することができる。

【0018】

一実施形態において、抗体は、多数のソース（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈなど）から商業的に入手可能なモノクローナル抗体Ｇ２８−８、またはモノクローナル抗体Ｇ２８−８のＦ（ａｂ’）２断片を含むか、またはそれらからなる。特定の実施形態において、抗体は、ヒトもしくは動物のＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂおよび／またはヒトもしくは動物の補体タンパク質への結合が損なわれた免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）ドメインに連結されたヒトまたは動物のＣＤ１８０結合ドメインを含む。例えば、抗体またはその断片は、米国特許出願第２０１２００２０９６５号（その全体は参照として本明細書に援用される）中で記載されているもの等であり得る。例えば、抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列（モノクローナル抗体Ｇ２８−８のクローン化した可変領域から構築されたｓｃＦｖ−Ｆｃ分子）を含むか、またはそれからなり得る。組換え分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体およびＣ１ｑへの分子の結合を減少させる３つのアミノ酸変化（Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｋ３２２Ｓ）により改変されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。

【0019】

組成物はＣＤ１８０標的化分子中の抗原が天然にないということにおいて、「異種」抗原を含む。したがって、組成物はＣＤ１８０標的化分子および異種抗原のコンジュゲートを含む。ＣＤ１８０標的化分子および異種抗原は、任意の適切な様式（共有結合および非共有結合が含まれる）でのコンジュゲートであり得る。抗ＣＤ１８０へ異種Ａｇを不可逆的に連結するいかなる様式も作動するだろう。特異的組成物のために最も適切な結合の特異的様式は、利用した成分に依存し、当業者によって決定することができる。いくつかの実施形態において、標的化分子および抗原は、１つまたは複数のリンカー部分経由でコンジュゲートすることができる。標的化分子および抗原の両方がポリペプチドである複数の実施形態において、組成物はキメラとして組換えにより発現させることができる。非組換えにより発現される実施形態については、任意の適切な結合テクニック（操作されたジスルフィド連結、ホルマリン／グルタルアルデヒド架橋、選択的な連結（後続する例において開示されるもの等）、ストレプトアビジン／ビオチンに基づく結合が含まれるがこれらに限定されない）を使用することができ、ＣＤ１８０およびタグ（ＦＬＡＧ、Ｈｉｓなど）を結合する能力を備えた二重特異物を生成し、タグ付加Ａｇと混合すること、またはＡｇに対する直接的親和性を有することなどが可能である。

【0020】

ＣＤ１８０へ抗原を標的化して、Ｔ細胞共刺激の非存在またはＴ細胞の完全な非存在下において抗原特異的ＩｇＧを産生する方法で組成物を使用することができるので、組成物中で任意の適切な抗原を使用できることは当業者に明らかだろう。異種抗原は、任意の化合物タイプ（ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、糖脂質などが含まれるがこれらに限定されない）であり得る。一実施形態において、異種抗原はポリペプチドを含む。他の実施形態において、異種抗原は多糖または糖脂質抗原を含む。

【0021】

一実施形態において、異種抗原は病原体特異的抗原を含むか、またはそれからなり；抗原は与えられた状況における対象となる任意の病原体からのものであり得る。非限定的実施形態において、病原体特異的抗原には、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅなど）ウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、腸内ウイルス、はしかウイルス、おたふくかぜウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス属、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エボラウイルス、サイトメガロウイルス、マールブルグウイルス、ノロウイルス、痘瘡ウイルス、任意のフラビウイルス（西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスおよび日本脳炎ウイルスが含まれるがこれらに限定されない）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔａｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌａｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅおよびＰ．ｖｉｖａｘ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓ． ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ａ群およびＢ群）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔ．ｃｒｕｚｉならびにＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからの抗原が含まれる。

【0022】

１つの非限定的例において、異種抗原は、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）からの抗原であり、これには記述されたもの（Ｔ．Ｊ Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：２３７５−２３８０，１９９８）またはその抗原性断片に類似もしくは同一のアミノ酸配列を持つＷＮＶエンベロープタンパク質Ｅ、またはＷＮＶの非構造的（ＮＳ）タンパク質（ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂまたはＮＳ５等）が含まれるが、これらに限定されない。後続する例において示されるように、精製した組換え西ナイルウイルス（ＷＮＶ）エンベロープ（Ｅ）タンパク質が付加されている（ＷＮＶＥ）ＣＤ１８０の標的化分子を接種したマウスは、ＷＮＶＥ特異的ＩｇＧ ＡｂおよびＷＮＶＥに対する中和抗体の両方を発達させ、ＷＮＶを頭蓋内チャレンジしたことよって誘導される死亡から、ＷＮＶＥ−ＣＤ１８０コンジュゲートで免疫付与したそのマウスを保護する。これらのデータは、ＣＤ１８０標的化分子へコンジュゲートされた任意の抗原に対する抗原（Ａｇ）特異的Ｂ細胞およびＴ細胞の迅速な活性化を誘導し、有意なＩｇＧおよびＩｇＭ産生、Ａｂ親和性成熟、ならびに免疫学的記憶を引き起こすのに、どのように本発明の組成物を使用することができるかの単なる例示である。

【0023】

別の実施形態において、異種抗原は、別のフラビウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはデング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）等）からの抗原である。ＨＣＶからの抗原は、ＨＣＶカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２、ならびに非構造的なタンパク質ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂ（Ｃ．Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７：１３８５，１９９３）またはその抗原フラグメントが含まれるがこれらに限定されない、抗原である。ＨＣＶ Ｅ２タンパク質の事例において、配列は、例えばＱＬ Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ ８８：２４５１−２４５８，１９９１）中で記載されるようなものであり得る。ＤＥＮＶからの抗原は、４つのＤＥＮＶセロタイプのうちの１つまたは複数からのエンベロープ（Ｅ）タンパク質またはその抗原性断片を含むがこれらに限定されない、抗原である。

【0024】

別の実施形態において、異種抗原は、Ｐ Ｃｈａｒｎａｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ７：３３５−３４６，１９７９）もしくはＤ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２５７：１０４１４−１０４２０，１９８２）によって記述されたもの等のアミノ酸配列を持つＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、またはＨＢｓＡｇバリアント（Ｊ．Ｎ Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｊ Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ ６０：７５−７８，２００３）である。

【0025】

別の実施形態において、異種抗原は、アレルゲン（すなわちアレルギーを引き起こし得る任意の物質）を含むか、またはそれからなり、それには、動物産物（毛皮および鱗屑；羊毛、イエダニ排泄物など）中で見出されるアレルゲン；薬剤（ペニシリン、スルホンアミド、サリチレートなど）；食品（セロリ、トウモロコシ、卵／アルブミン、果実、ミルク／ラクトース、シーフード、ゴマ、マメ科植物（マメ、エンドウ、ピーナッツ、ダイズなど）； ダイズ、樹木の木の実（ピーカン、アーモンドなど））；昆虫刺傷（ハチ針毒、スズメバチ針毒、蚊針など）；カビ胞子および植物花粉（草、雑草、ブタクサ、樹木など）が含まれるがこれらに限定されない。

【0026】

さらなる実施形態において、異種抗原は、免疫応答を生成することが有益な他のタイプの疾患関連抗原を含むか、またはそれらからなり、それらには、腫瘍／腫瘍細胞中でまたは表面上で発現される抗原（ｐ５３（結腸直腸癌）、アルファフェトプロテイン（胚細胞腫瘍；肝細胞癌）、癌胎児性抗原（腸癌）、ＣＡ−１２５（卵巣癌）、ヒト表皮増殖因子受容体−２（ＨＥＲ−２、乳癌）、ＭＵＣ−１（乳癌）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（食道癌、非小細胞肺癌）、上皮腫瘍抗原（乳癌）、チロシナーゼ（悪性メラノーマ）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２、神経芽細胞腫）、メラノーマ関連抗原遺伝子−１（ＭＡＧＥ−１（悪性メラノーマ））が含まれるがこれらに限定されない）、ならびにβアミロイド（アルツハイマー病および他のアミロイドに基づく疾患についてのもの）などが含まれるが、これらに限定されない。

【0027】

別の実施形態において、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの組成物は、アジュバントをさらに含む。以下の例は、Ａｇ特異的Ｂ細胞の迅速な活性化を誘導し、７日以内の有意なＩｇＧおよびＩｇＭ産生、両方のＡｂ親和性成熟の発達、ならびに免疫学的記憶をもたらすのには、アジュバントが必要とされないことを実証するが、この例は、組成物が本発明の方法において使用される場合、組成物へのアジュバントの添加が免疫応答の追加の促進を生じ得ることをさらに示す。任意の適切なアジュバント（無機化合物（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム水酸化物、ベリリウムなど）、鉱油、洗浄剤、サイトカイン、トール様受容体アゴニスト、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、スクワレンなどが含まれるがこれらに限定されない）も使用することができる。好ましい実施形態において、アジュバントは、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、より好ましくはＴＬＲ７（合成低分子イミダゾキノリン（イミキモドまたはレジキモド（Ｒ８４８）等）が含まれるがこれらに限定されない；ＣＡＳ番号：１４４８７５−４８−９；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手可能）および／またはＴＬＲ９アゴニスト（Ａ、ＢまたはＣタイプのＣｐＧオリゴヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手可能）を含むか、またはそれらからなる。後続する例において示されるように、ＴＬＲ７アゴニストおよび／またはＴＬＲ９アゴニストと組み合わせた本発明の組成物の使用は、ＩｇＧおよびＩｇＭ応答の相乗的な誘導を提供し、ＷＮＶＥ−αＣＤ１８０コンジュゲート投与後にＷＮＶＥ抗原に対する中和Ａｂ応答を促進し、細胞障害性Ｔ細胞応答の活性化および増殖を促進する。

【0028】

使用されるアジュバントおよびコンジュゲートに依存して、アジュバントは連結していない成分として組成物中に存在することができるか、または抗原−ＣＤ１８０標的化分子コンジュゲートへ連結することができる。様々な非限定的実施形態において、組成物中のアジュバントはフラジェリン（ＴＬＲ５アゴニスト）または修飾塩基により合成され得るＴＬＲ７およびＴＬＲ９の核酸アゴニストを含むことができ、抗ＣＤ１８０への連結（リラミン（ｌｌｙｌａｍｉｎｅ）連結経由で等）を可能にする。

【0029】

別の実施形態において、本発明の組成物は、血清中の半減期の延長のために、少なくとも１つの分子（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分またはその組み合わせが含まれるがこれらに限定されない）の組成物への付加等によって、半減期を延長するように修飾することができる。本明細書において使用される時、「付加された」という単語は共有結合でまたは非共有結合でコンジュゲートされた物質を指す。結合は遺伝子操作または化学的手段によるものであり得る。

【0030】

本発明の組成物は任意の適切な緩衝液中で保存することができる。

【0031】

第２の態様において、本発明は、標的化分子および抗原がポリペプチドである本発明の第１の態様の任意の実施形態の組成物をコードする単離核酸を提供する。単離核酸配列はＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。かかる単離核酸配列は、コードされたタンパク質の発現および／または精製の促進に有用な追加の配列（ポリＡ配列、修飾コザック配列、ならびにエピトープタグ、エクスポートシグナル、分泌シグナル、核移行シグナルおよび原形質膜局所化シグナルをコードする配列が含まれるがこれらに限定されない）を含むことができる。

【0032】

第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様の単離核酸を含む核酸ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」には、核酸コーディング領域または遺伝子を遺伝子産物の発現を達成できる任意のプロモーターへ作動可能に連結するベクターが含まれる。哺乳類システムにおいて開示される核酸配列の発現の駆動に使用されるプロモーター配列は、構成的であり得るか（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含むがこれらに限定されない任意の多様なプロモーターによって駆動される）、または誘導可能であり得る（テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド反応性が含まれるがこれらに限定されない任意の多数の誘導可能プロモーターによって駆動される）。原核生物細胞のトランスフェクションで使用される発現ベクターの構築も当技術分野において周知であり、したがって標準的なテクニック経由で遂行することができる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．およびＡｍｂｉｏｎ １９９８年カタログ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を参照されたい。）発現ベクターは、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡへの組込みによって、宿主生物中で複製可能でなくてはならない。好ましい実施形態において、発現ベクターはプラスミドを含む。しかしながら、本発明には同等の機能を果たす他の発現ベクター（ウイルスベクター等）が含まれるように意図される。

【0033】

第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様の核酸ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核生物または真核生物であり得る。細胞は一過性または安定的にトランスフェクションすることができる。原核生物および真核細胞（チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞が含まれるがこれらに限定されない）への発現ベクターのかかるトランスフェクションは、当技術分野において公知の任意のテクニック（標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔、またはリポソーム媒介性、ＤＥＡＥデキストラン媒介性、ポリカチオン媒介性もしくはウイルス媒介性のトランスフェクションが含まれるがこれらに限定されない）によって遂行することができる。（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照されたい。）

【0034】

組換え宿主細胞は、例えば、
（ａ）核酸にコードされた抗体組成物の発現に好適な条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養する工程と；
（ｂ）培養細胞から抗体組成物を単離する工程と
を含む、抗体を産生するための方法（標的化分子が抗体である場合）において使用することができる。

【0035】

核酸にコードされた抗体組成物の発現に好適な条件は、本明細書における教示、使用される特異的宿主細胞およびベクター、ならびに当技術分野における当業者の一般知識に基づいて、当業者によって決定することができる。

【0036】

「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質もしくはベクターへの参照と共に使用された場合に、異種の核酸もしくはタンパク質の導入または生来の核酸もしくはタンパク質の変更によって、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが修飾されたこと、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することを指す。したがって、例えば組換え細胞は、細胞の生来（非組換え）の形態内で見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ、生来の遺伝子を、異常発現、低発現もしくは無発現で発現する。本明細書における「組換え核酸」という用語によって、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用する核酸の操作によって一般にインビトロでもともと形成された通常天然で見出されない形態の核酸が意味される。この様式において、異なる配列の操作可能な連結が達成される。したがって、直鎖状形態における単離核酸、または通常接合されないＤＮＡ分子のライゲーションによってインビトロで形成された発現ベクターは両方とも、本明細書において開示される目的のための組換え体と判断される。一旦組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物の中へ再導入されたならば、非組換えにより、すなわちインビトロの操作ではなく宿主細胞のインビボの細胞機構を使用して、複製するであろうことは理解される。しかしながら、一旦組換えにより産生され、続いて非組換えにより複製されたかかる核酸も、まだ本明細書において開示される目的のための組換え体と判断される。

【0037】

第５の態様において、本発明は、
（ａ）本明細書において開示される実施形態または実施形態の組み合わせの組成物と；
（ｂ）薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物を提供する。

【0038】

この実施形態において、本発明の組成物は医薬品製剤中に存在する。この実施形態において、組成物は薬学的に許容される担体と組み合わされる。かかる塩を形成することができる適切な酸には、無機酸（塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸および同種のもの等）；および有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸および同種のもの等）が含まれる。かかる塩を形成することができる適切な塩基には、無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムおよび同種のもの等）；および有機塩基（モノ−、ジ−およびトリ−アルキルおよびアリールアミン（例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンおよび同種のもの）および任意に置換されたエタノール−アミン（例えばエタノールアミン、ジエタノールアミンおよび同種のもの）等）が含まれる。

【0039】

医薬品組成物は、本発明の組成物に加えて、（ａ）溶解保護剤；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）充填剤；（ｄ）等張性調整剤；（ｅ）安定剤；（ｆ）防腐剤および／または（ｇ）緩衝液を含むことができるむことができる。いくつかの実施形態において、医薬品組成物中の緩衝液は、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸塩緩衝液または酢酸緩衝液である。医薬品組成物は溶解保護剤（例えばショ糖、ソルビトール、トレハロース）も含むことができる。特定の実施形態において、医薬品組成物は、防腐剤（例えば塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸および様々なその混合物）を含む。他の実施形態において、医薬品組成物はグリシンのような充填剤を含む。さらに他の実施形態において、医薬品組成物は、界面活性剤（例えばポリソルベート−２０、ポリソルベート−４０、ポリソルベート−６０、ポリソルベート−６５、ポリソルベート−８０、ポリソルベート−８５、ポロキサマー−１８８、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、トリラウリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタンまたはその組み合わせ）を含む。医薬品組成物は、等張性調整剤（例えば製剤をヒト血液と実質的に等張または等浸透圧にする化合物）も含むことができる。例示的な等張性調整剤には、ショ糖、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよび塩酸アルギニンが含まれる。他の実施形態において、医薬品組成物は加えて、安定剤（例えば対象となるタンパク質と組み合わせた場合、凍結乾燥形態または液体形態の対象となるタンパク質の化学的および／または物理的な不安定性を実質的に防止または減少させる分子）を含む。例示的な安定剤には、ショ糖、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニンおよび塩酸アルギニンが含まれる。

【0040】

本発明の医薬組成物は、任意の適切な製剤中で、好ましくは注射による投与に好適な製剤中で作製することができる。かかる医薬組成物は、例えばワクチン、予防剤または治療剤として使用する方法において使用することができる。

【0041】

医薬組成物は、既定の使用に適切であると考えられるような任意の他の成分（追加の治療剤またはワクチン成分等）を含有することができる。一実施形態において、医薬組成物は、トール様受容体アゴニスト（Ｒｉｂｉ、ＴＬＲ７アゴニスト（Ｒ８４８が含まれるがこれらに限定されない）および／またはＴＬＲ９アゴニスト（Ａ、ＢまたはＣタイプＣｐＧオリゴヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない）が含まれるがこれらに限定されない）をさらに含む。

【0042】

第６の態様において、本発明は、障害の発症を治療または限定するのに効果的な量の、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの組成物または医薬組成物またはその薬学的塩を、障害のリスクのある個体へ投与する工程を含む、障害の発症を治療または限定するための方法を提供する。一実施形態において、組成物をワクチンとして予防的に使用して、病原菌に曝露されていないが、かかる曝露のリスクがある個体等において、感染性疾患／感染性疾患の重症度を限定する。他の実施形態において、組成物を治療的に使用して、病原体に曝露されるかまたは慢性的に感染した人を治療することができる。さらなる実施形態において、組成物を癌ワクチンとして使用して腫瘍に罹患する個体を治療する。当業者によって理解されるように、使用される特異的抗原／組成物は治療または限定される特異的障害に依存するだろう。

【0043】

薬学的に許容される塩を形成することができる適切な酸には、無機酸（塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸および同種のもの等）；および有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸および同種のもの等）が含まれる。薬学的に許容される塩を形成することができる適切な塩基には、無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムおよび同種のもの等）；および有機塩基（モノ−、ジ−およびトリ−アルキルおよびアリールアミン（例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンおよび同種のもの）および任意に置換されたエタノール−アミン（例えばエタノールアミン、ジエタノールアミンおよび同種のもの）等）が含まれる。

【0044】

本発明の方法は、ＣＤ１８０（Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞上で発現される表面タンパク質）へ抗原を標的化し、Ｔ細胞共刺激の非存在（ＣＤ４０欠損等）またはＴ細胞の完全な非存在（ＴＣＲβ／δ欠損等）下において抗原特異なＩｇＧを産生する。したがって、本方法は適切な抗原が入手可能な任意の療法的または予防的な治療において使用することができる。後続する例において示されるように、抗ＣＤ１８０のコンジュゲートによる、抗原特異的ＩｇＧおよびＩｇＭの誘導は迅速であり（最も慣習的な免疫付与系については１４日以上であるのとは対照的に７日以内）、追加の炎症誘導アジュバントを必要としない。顕著なことには、追加のアジュバントなしのＡｇ−ＣＤ１８０抗体（αＣＤ１８０）の単回注射は、抗体（Ａｂ）親和性成熟および免疫学的記憶の両方の発達ももたらした。さらに、後続する例において示されるように、精製した組換え西ナイルウイルス（ＷＮＶ）エンベロープ（Ｅ）タンパク質が付加されている（ＷＮＶＥ）ＣＤ１８０の標的化分子を接種したマウスは、ＷＮＶＥ特異的ＩｇＧ ＡｂおよびＷＮＶＥに対する中和抗体の両方を発達させ、ＷＮＶを頭蓋内チャレンジしたことよって誘導される死亡から、ＷＮＶＥ−ＣＤ１８０コンジュゲートで免疫付与したそのマウスを保護する。これらのデータは、疾患の発生を治療または限定するのに、どのように本発明の方法を使用することができるかの単なる例示である。

【0045】

したがって、ＣＤ１８０へ抗原を標的化するアプローチは、従来の（例えばミョウバン中のＩＭ抗原）免疫付与アプローチと比較して両方の有意な長所を生じ、以前は治療できない集団のワクチン接種を可能にする。このアプローチから、発達不十分またはそうでなければ不完全な免疫系において濃縮される細胞集団を特異的に標的化すること、および連結された認識部（炭水化物エピトープなど）を必要とする抗原への応答を改善することの両方で、例えば新生児、高齢者および免疫不全のための用途も見出される。

【0046】

本明細書において使用される時、「治療する」または「治療すること」は、障害を既に有するか、または障害を引き起こす物質／病原体に既に曝露された個体において以下のもののうちの１つまたは複数を遂行することを意味する。（ａ）障害の重症度を低下させること；（ｂ）治療されている障害（複数可）の特徴的な症状（例えば、化学療法および／または放射線療法を受ける癌患者または他の患者における免疫不全）の発症を限定または防止すること；（ｃ）治療されている障害（複数可）の特徴的な症状の悪化を阻害すること；（ｄ）以前に障害（複数可）を有していた患者における障害（複数可）の再発を限定または防止すること；および（ｅ）以前に障害について症状を示した患者における症状の再発を限定または防止すること。

【0047】

本明細書において使用される時、「限定すること」または「〜の発症を限定すること」は、限定される障害を有していない個体において以下のもののうちの１つまたは複数を遂行することを意味する。（ａ）障害を防止すること；（ｂ）障害の重症度を低下させること；および（ｃ）障害の特徴的な症状の発生を限定または防止すること。

【0048】

本明細書において使用される時、「効果的な量」は、関連する障害を治療および／または限定するのに効果的な組成物の量を指す。

【0049】

以下の例は、Ａｇ特異的Ｂ細胞の迅速な活性化を誘導し、７日以内の有意なＩｇＧおよびＩｇＭ産生、両方のＡｂ親和性成熟の発達、ならびに免疫学的記憶をもたらすのには、アジュバントが必要とされないことを実証するが、この例は、組成物が本発明の方法において使用される場合、組成物へのアジュバントの添加が免疫応答の追加の促進を生じ得ることをさらに示す。したがって、さらなる実施形態において、本方法は個体へのアジュバントの投与をさらに含むことができる。任意の適切なアジュバント（無機化合物（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム水酸化物、ベリリウムなど）、鉱油、洗浄剤、サイトカイン、トール様受容体アゴニスト、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、スクワレンなどが含まれるがこれらに限定されない）も使用することができる。好ましい実施形態において、アジュバントは、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、より好ましくはＴＬＲ７（合成低分子イミダゾキノリン（イミキモドまたはレジキモド（Ｒ８４８）等）が含まれるがこれらに限定されない；ＣＡＳ番号：１４４８７５−４８−９；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手可能）および／またはＴＬＲ９アゴニスト（Ａ、ＢまたはＣタイプのＣｐＧオリゴヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手可能）を含むか、またはそれらからなる。後続する例において示されるように、ＴＬＲ７アゴニストおよび／またはＴＬＲ９アゴニストと組み合わせた本発明の組成物の使用は、ＩｇＧおよびＩｇＭ応答の相乗的な誘導を提供し、ＷＮＶＥ−αＣＤ１８０コンジュゲート投与後にＷＮＶＥ抗原に対する中和Ａｂ応答を促進し、ＣＤ４ Ｔ細胞応答または細胞障害性Ｔ細胞応答の活性化および増幅を促進する。

【0050】

個体は、哺乳類が含まれるがこれらに限定されない任意の適切な個体であり得る。好ましくは、個体はヒトである。一実施形態において、個体は、Ｔ細胞欠損および／もしくはＢ細胞とＴ細胞との間の共刺激の欠陥を有するか、または慢性感染症によって免疫無防備であるか、または自己免疫疾患の治療のための免疫抑制薬を急性もしくは慢性的に服用しているか、または他の炎症性疾患である。別の実施形態において、個体は新生児または高齢者（すなわち、少なくとも６５歳）である。

【0051】

様々な他の実施形態において、個体はアレルギーを有するか、先天性もしくは後天性の免疫不全を有するか、または病原菌に曝露されている。

【0052】

様々なさらなる実施形態において、個体は、毛細血管拡張性運動失調、高ＩｇＭ症候群、ディジョージ症候群、Ｗｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、分類不能型免疫不全症候群、正常免疫グロブリンの選択的抗体欠損（ＳＡＤＮＩ）が含まれる多糖応答欠陥、ウイルス感染、癌、肝炎、糖尿病、および骨髄もしくは器官移植または細胞毒性療法／骨髄破壊的療法に後続する免疫抑制のうちの１つまたは複数を患う。または妊娠している女性であるか、無脾であるか、骨髄抑制またはリンパ細胞の減少を引き起こす薬剤（コルチコステロイド、シクロスポリン、アンフォテリシンＢ、クロラムフェニコール、様々な癌化学療法剤、金化合物、メトトレキサートなどが含まれるがこれらに限定されない）を服用しているか、放射線療法を受けているか、および／もしくは慢性腎不全を有する。

【0053】

当業者によって理解されるように、本方法を使用して病原体またはアレルゲンによって媒介される任意の障害の発症を治療または限定することができ、そのための適切な抗原は組成物中で提供することができ、この抗原には、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅなど）ウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、腸内ウイルス、はしかウイルス、おたふくかぜウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス属、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エボラウイルス、サイトメガロウイルス、マールブルグウイルス、ノロウイルス、痘瘡ウイルス、任意のフラビウイルス（西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスおよび日本脳炎ウイルスが含まれるが、これらに限定されない）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔａｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌａｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ． ｏｖａｌｅ、Ｐ． ｍａｌａｒｉａｅおよびＰ． ｖｉｖａｘ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓ． ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ａ群およびＢ群）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔ．ｃｒｕｚｉおよびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ；動物産物（毛皮および鱗屑；羊毛、イエダニ排泄物など）中で見出されるアレルゲン；薬剤（ペニシリン、スルホンアミド、サリチレートなど）；食品（セロリ、トウモロコシ、卵／アルブミン、果実、ミルク／ラクトース、シーフード、ゴマ、マメ科植物（マメ、エンドウ、ピーナッツ、ダイズなど）； ダイズ、樹木の木の実（ピーカン、アーモンドなど））；昆虫刺傷（ハチ針毒、スズメバチ針毒、蚊針など）；カビ胞子および植物花粉（草、雑草、ブタクサ、樹木など）；腫瘍／腫瘍細胞中でまたは表面上の発現される抗原（ｐ５３（結腸直腸癌）、アルファフェトプロテイン（胚細胞腫瘍；肝細胞癌）、癌胎児性抗原（腸癌）、ＣＡ−１２５（卵巣癌）、ヒト表皮増殖因子受容体−２（ＨＥＲ−２、乳癌）、ＭＵＣ−１（乳癌）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（食道癌、非小細胞肺癌）、上皮腫瘍抗原（乳癌）、チロシナーゼ（悪性メラノーマ）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２、神経芽細胞腫）、メラノーマ関連抗原遺伝子−１（ＭＡＧＥ−１（悪性メラノーマ））が含まれるがこれらに限定されない）、ならびにβアミロイド（アルツハイマー病および他のアミロイドに基づく疾患についてのもの）などが含まれるが、これらに限定されない。

【0054】

したがって、本方法を使用して、例えば上でリストした抗原と関連した任意の障害（すなわち、関連するウイルス性および細菌性の感染、水痘、子宮頸癌、陰部疣贅、胃腸炎、天然痘、炭疽菌、百日咳、破傷風、ジフテリア、脳膜炎、ウイルス脳炎、マラリア、下痢、肺炎、後天性免疫不全症候群、結核、コレラ、腸チフス、癌、アルツハイマー病など）の発症を治療または限定することができる。

【0055】

１つの非限定的実施形態において、本方法を使用して、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）感染によって引き起こされる疾患の発症を治療または限定する。この実施形態において、異種抗原は、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）からの抗原であり、これには、記述されたもの（Ｔ．Ｊ Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：２３７５−２３８０，１９９８）またはその抗原性断片に類似または同一のアミノ酸配列を持つＷＮＶエンベロープタンパク質Ｅ、もしくはＷＮＶの非構造的（ＮＳ）タンパク質（ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂまたはＮＳ５等）、またはその抗原性断片が含まれるがこれらに限定されない。後続する例において示されるように、精製した組換え西ナイルウイルス（ＷＮＶ）エンベロープ（Ｅ）タンパク質が付加されている（ＷＮＶＥ）ＣＤ１８０の標的化分子を接種したマウスは、ＷＮＶＥ特異的ＩｇＧ ＡｂおよびＷＮＶＥに対する中和抗体の両方を生じ、ＷＮＶを頭蓋内チャレンジしたことよって誘導される死亡から、ＷＮＶＥ−ＣＤ１８０コンジュゲートで免疫付与したそのマウスを保護する。これらのデータは、適切な抗原が免疫応答の生成のために入手可能な障害の発症を治療または限定するのに、どのように本発明の方法を使用することができるかの単なる例示である。

【0056】

ＷＮＶによって引き起こされる疾患の特徴的な症状には、頭痛、熱、発疹、神経侵襲性疾患、脳炎、脳膜炎、髄膜脳炎および小児麻痺が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本発明の方法は、例えば、これらの症状の発症を療法的に治療または限定する、および／または本方法の前にＷＮＶに曝露された者におけるＷＮＶ複製を限定する、またはこれらの症状の発症を予防的に限定する、および／または本発明の方法後のみにＷＮＶに曝露された者におけるＷＮＶ複製を限定する役目を果たすことができる。

【0057】

別の実施形態において、本方法を使用して、別のフラビウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはデング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）等）によって引き起こされる疾患の発症を治療または限定する。この実施形態において、ＨＣＶからの異種抗原は、ＨＣＶカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２、ならびに非構造的なタンパク質ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂ（Ｃ．Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７：１３８５，１９９３）またはその抗原フラグメントが含まれるがこれらに限定されない、抗原であり得る。ＨＣＶ Ｅ２タンパク質の事例において、配列は、例えばＱＬ Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ ８８：２４５１−２４５８，１９９１）中で記載されるようなものであり得る。ＤＥＮＶからの抗原は、４つのＤＥＮＶセロタイプのうちの１つまたは複数からのエンベロープ（Ｅ）タンパク質またはその抗原性断片を含むがこれらに限定されない、抗原であり得る。

【0058】

別の実施形態において、本方法を使用して、Ｂ型肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患の発症を治療または限定し、そこで抗原は、例えば、Ｐ Ｃｈａｒｎａｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ７：３３５−３４６，１９７９）もしくはＤ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２５７：１０４１４−１０４２０，１９８２）によって記述されたもの等のアミノ酸配列を持つ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、またはＨＢｓＡｇバリアント（Ｊ．Ｎ Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｊ Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ ６０：７５−７８，２００３）であり得る。

【0059】

組成物は、医薬組成物（上で開示したもの等）として典型的には製剤化され、従来の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび賦形剤を含有する投薬量単位製剤中で、任意の適切な経路（経口的、非経口的、吸入スプレーによる、経直腸的、または局所的なものが含まれる）を経由して投与することができる。好ましくは、組成物は非経口で投与される。本明細書において使用される時、非経口的という用語には、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、点滴テクニックまたは腹腔内が含まれる。投薬量レジメンは、至適の所望される応答（例えば療法的または予防的な応答）を提供するように調整することができる。適切な投薬量範囲は、例えば０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重；あるいは０．５μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ；１μｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。組成物は単一ボーラス中で送達することができるか、または担当医によって決定されるように二回以上（例えば２、３、４、５回、または以上）投与することができる。

【0060】

文脈が明らかに要求しない限り、明細書および請求項を通して、「含む」、「含むこと」という単語、および同種のものは、排他的または網羅的な意味に対立するような包括的な意味；すなわち「含むが、これらに限定されない」という意味で解釈されるべきである。単数または複数を使用する単語には、それぞれ複数または単数も含まれる。加えて、「本明細書において」、「上記の」、および「下記の」という単語、ならびに類似の主旨の単語は、本出願中で使用された場合、本出願の任意の特定の部分に対してではなく全体として本出願を指すものとする。本明細書において使用される時、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には、文脈が明確に指示しない限り複数の指示物が含まれる。「および」は本明細書において使用される時、特別に明記しない限り、「または」と互換的に使用される。

【0061】

本開示の実施形態の記述は、網羅的であるとか、または開示された正確な形態へ本開示を限定するとは意図されない。本開示の具体的な実施形態および例は、例示の目的のために本明細書において記載されるが、当業者が認識するように、様々な同等の修飾は本開示の範囲内で可能である。例えば、方法の工程または機能は既定の順において提示されているが、代替の実施形態は異なる順序で機能を実行することができるか、または機能を実質的に同時に実行することができる。本明細書において提供された本開示の教示は、他の手順または方法に必要に応じて適用することができる。本明細書において記述された様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。

【0062】

本明細書において引用されたすべての参照文献は参照として援用される。本開示の態様は、上記の参照および出願の組成物、機能および概念を用いるために必要であるならば修飾して、本開示のいっそうさらなる実施形態を提供することができる。これらおよび他の変化は詳細な記述を考慮して本開示に対して行なうことができる。

【0063】

以下の記述は、本開示の実施形態の充分な理解のために、および記述を可能にするために具体的な詳細を提供する。しかしながら、当業者は、本開示がこれらの詳細なしに実践できることを理解するだろう。他の実例において、周知の構造および機能は本開示の実施形態の記述を不必要に不明瞭にしないようにするために、詳細は示されず記述されなかった。

【0064】

実施例：ＣＤ１８０への抗原の標的化は、抗原特異的ＩｇＧ、親和性成熟および免疫学的記憶を迅速に誘導する。

【0065】

要約
アジュバントの非存在下において、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）の両方上で発現される受容体（ＴＬＲオーファン受容体ＣＤ１８０）へ抗原（Ａｇ）を標的化することにより、ミョウバン中のＡｇによって誘導されたものよりも強いＩｇＧ応答が迅速に誘導されたことを以下に報告する。Ａｇ特異的ＩｇＧがＣＤ４０欠損マウスおよびＴ細胞欠損マウスにおいて生成されたので、抗ＣＤ１８０へコンジュゲートされたＡｇ（Ａｇ−αＣＤ１８０）は部分的にＴ細胞非依存性に親和性成熟および抗体（Ａｂ）の応答を誘導した。Ａｇ−αＣＤ１８０による前免疫付与および可溶性Ａｇによるブースト後に、野生型マウスおよびＣＤ４０ ＫＯマウスの両方はＡｇ特異的ＩｇＧ形成細胞を迅速に産生し、Ａｇ−抗ＣＤ１８０が免疫学的記憶を誘導することを実証した。Ａｇ−αＣＤ１８０の強力なアジュバント効果は、Ａｇが抗ＣＤ１８０にカップルされること、ならびに応答性のＢ細胞がＣＤ１８０特異的Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）およびＡｇ特異的Ｂ細胞受容体の両方を発現することを必要とした。意外にも、ＣＤ１８０ Ａｇ標的化は、成熟Ｂ細胞が欠如するＢＡＦＦ−Ｒ ＫＯマウスおよびインターフェロンシグナリングが欠損したマウスにおいてもＩｇＧ Ａｂを誘導した。したがって、ＣＤ１８０へＡｇの標的化は、療法的なワクチン接種および免疫無防備な者のワクチン接種に有用である。

【0066】

結果
ＣＤ１８０へ抗原の標的化は強いＡｇ特異的ＩｇＧ応答を迅速に誘導する。
抗ＣＤ１８０にカップルされたＡｇが正常マウスおよび免疫不全マウスにおいてＡｇ特異的ＩｇＧ応答を誘導できるかどうかを調査した。最初に、ハプテン（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル）アセチル（ＮＰ）を、抗ＣＤ１８０モノクローナル抗体（ＮＰ−αＣＤ１８０）または非結合性のラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照モノクローナル抗体（ＮＰ−アイソタイプ）へコンジュゲートし、段階をつけた用量で静脈注射で野生型マウスへ投与した。１０〜１００μｇの範囲の用量のＮＰ−αＣＤ１８０は、用量依存的様式で有意なＮＰ特異的ＩｇＧ応答を誘導し（図１Ａ、下部）、非免疫付与マウス（１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０群での前採血）または１００μｇのＮＰ−アイソタイプを注射したマウスと比較してポリクローナルＩｇ産生は少ないかまたは無い（図１Ａ、上部）。抗ＮＰＡ ｂは、抗ＣＤ１８０モノクローナル抗体を単独で免疫付与したマウスにおいて観察されなかった（図１Ｂ）。したがって、ＮＰ−αＣＤ１８０へのＡｇ特異的Ａｂ応答は、ポリクローナルＩｇ産生の産物からではなくＡｇの標的化に起因するものであった。コンジュゲートが腹腔内接種された場合も、ＮＰ−αＣＤ１８０への強いＡｇ特異的Ａｂ応答が誘導された（データ不掲載）。後続する研究では静脈注射経路を経由してマウスを接種した。

【0067】

ＣＤ１８０へのＡｇの標的化は、ＣＤ４０ ＫＯマウスおよびＴ細胞欠損（ＴＣＲβ／δＫＯ）マウスの両方においてもＡｇ特異的なＩｇＭおよびＩｇＧの産生を誘導した（図１Ｂ）。Ａｇ特異的ＩｇＭレベルは野生型マウスおよび免疫不全マウスにおいて類似していたが、Ａｇ特異的ＩｇＧレベルはＣＤ４０ ＫＯマウスおよびＴＣＲβ／δＫＯマウスの両方において有意に低かった。免疫不全マウスにおけるＡｇ特異的ＩｇＧの全体的な減少にもかかわらず、広範囲のＩｇＧサブクラス分布は維持され、野生型マウスにおけるものに類似していた（図１Ｃ）。ＮＰ−αＣＤ１８０は、Ａｇ特異的ＩｇＧに加えてＡｇ特異的ＩｇＡ Ａｂも誘導したが、ＩｇＥ Ａｂは誘導しなかった（データ不掲載）。ＣＤ１８０へのＡｇの標的化が胸腺依存性および胸腺非依存性のＩｇＧ抗体反応の両方を誘導すると結論される。

【0068】

ＣＤ１８０標的化は、Ａｇがミョウバン中で接種したよりも高いレベルのＡｇ特異的ＩｇＧを迅速に誘導する。
次いでＮＰ−αＣＤ１８０接種に後続するＡｇ特異的ＩｇＧ産生の動態を決定した。ＮＰ−αＣＤ１８０もしくはＮＰ−アイソタイプのいずれかを静脈注射、またはミョウバン中で沈殿させたＮＰ−アイソタイプＡｇを腹腔内投与して、野生型マウスまたはＣＤ４０ ＫＯマウスに免疫付与した。野生型マウスにおいて、ＮＰ−αＣＤ１８０は、ミョウバン中のＡｇ（２１日目にピークに達する）と比較して、接種後１０日目にピークに達する迅速な抗ＮＰ ＩｇＧ応答を誘導した。ＮＰ−アイソタイプを単独で接種したマウスは、どの時間ポイントでも２μｇ／ｍＬより多い抗ＮＰ Ａｂを生産しなかった（図２Ａ、左側）。予想されるように、ミョウバン中のＡｇで免疫付与したＣＤ４０ ＫＯマウスはＮＰ特異的ＩｇＧ応答を生じなかった。しかしながら、ＣＤ４０ ＫＯマウスはＣＤ１８０標的化後に有意に継続的に増加する量のＮＰ特異的ＩｇＧを生じた（図２Ａ、右側）。

【0069】

ＣＤ１８０への標的化は抗タンパク質ＩｇＧ応答を誘導し、共有結合で連結されるＡｇを必要とする。
次いでＣＤ１８０へタンパク質抗原を標的化した場合ＮＰ−αＣＤ１８０への強いＡｂ応答も誘導されるかどうか決定した。ＯＶＡ全体を抗ＣＤ１８０（ＯＶＡ−αＣＤ１８０）およびアイソタイプモノクローナル抗体（ＯＶＡ−アイソタイプ）へカップリングし、これらの抗原のうちの１つを静脈注射、またはミョウバン中のＯＶＡ−アイソタイプを腹腔内投与して、野生型マウスに免疫付与する（図２Ｂ）。ＮＰ−αＣＤ１８０でのように、ＯＶＡ−αＣＤ１８０は、接種後１４日目で約２ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ抗ＯＶＡの濃度で強いＡｇ特異的ＩｇＧ応答を誘導した。

【0070】

抗ＣＤ１８０は単独でＢ細胞を刺激し、したがってＢ細胞を効果的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）へと転換し、そのため連結していない様式で投与されたとしても、細胞がＡｇを提示できる可能性がある。この可能性を試験するために、２つの異なるＡｇをマウスに接種し、１つのＡｇのみをαＣＤ１８０にカップルした。それらはＮＰ−αＣＤ１８０＋可溶性ＯＶＡまたはＯＶＡ−αＣＤ１８０＋可溶性ＮＰ−アイソタイプである。予想されるように、ミョウバン中のＮＰ−アイソタイプまたはミョウバン中のＯＶＡのみを接種されたマウスは、それぞれＮＰまたはＯＶＡに対するＩｇＧのみを産生した（図２Ｃ）。可溶性ＯＶＡまたは可溶性ＮＰ−アイソタイプと一緒に抗ＣＤ１８０にカップルされたＮＰまたはＯＶＡを接種したマウスは、抗ＣＤ１８０にカップルされたＡｇに対するＡｂのみを生じ、可溶性で連結されなかったＡｇには生じなかった。ＣＤ１８０へのＡｇ標的化の間に、抗ＣＤ１８０へ付加されたＡｇについて特異的なＢ細胞のみがＡｂを産生するようにされると結論される。

【0071】

ＣＤ１８０標的化は、親和性成熟、ＥＦ応答、胚中心（ＧＣ）形成および免疫学的記憶を誘導する。
ＣＤ１８０標的化が単独でまたはアジュバントの添加によりＡｂの親和性成熟を誘導できるかどうかを査定するために、ＮＰ−αＣＤ１８０を単独で（５０μｇを静脈注射）接種するか、またはＴＬＲに基づくアジュバント（ＣｐＧ ＡまたはＣｐＧ Ｂ（ＴＬＲ９）、Ｒ８４８（ＴＬＲ７）またはＬＰＳ（ＴＬＲ４）が含まれる）を共投与し、５、７、または２８日後に血清を得た。相対的親和性の変化を測定するために、低レベルのＮＰ結合（ＮＰ２）によるＢＳＡへの抗血清の相対的結合ｖｓ高レベルのＮＰ結合（ＮＰ２０）によるＢＳＡへの抗血清の相対的結合を測定した。陰性対照のために、マウスにＮＰ−αＤＣＩＲ２で免疫付与した（これは以前に親和性成熟を誘導しないことが示されている）（Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＮＰ−αＣＤ１８０による免疫付与後に、Ａｂ親和性は、ＮＰ−αＤＣＩＲ２による免疫付与後に５〜７日目（図３Ａ）から有意に上の親和性レベルへ増加し、この差は２８日目でまだ明白であった（図３Ｂ、下部）。コンジュゲートされていないαＣＤ１８０プラスＴＬＲアゴニストによるマウスへの免疫付与は抗ＮＰ Ａｂレベルに効果がなかった（データ不掲載）。ＮＰ−αＣＤ１８０に加えたアジュバントの添加はＮＰ特異的なＩｇＭおよびＩｇＧの産生を４〜７倍増加させたにもかかわらず（図３Ｃ）、７日目でＡｂ親和性を変化させなかった（図３Ｂ、上部）。免疫付与後２８日目まで、ＣｐＧアジュバントの添加は有意に親和性を増加させたが、他のアジュバントは増加させなかった（図３Ｂ、下部）。野生型マウスでの場合と異なり、ＣＤ４０ ＫＯマウスにおいて誘導されたＩｇＧ Ａｂの親和性は、陰性対照のレベルの上に増加しなかった（図３Ａ）。

【0072】

ＮＰ−αＣＤ１８０による免疫付与後のＡｇ特異的Ｂ細胞の増殖および分化を追跡するために、Ｌｙ５．１＋Ｂ１−８ｈｉマウス（Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，２００２）からのＮＰ特異的Ｂ細胞を含有する脾細胞をＬｙ５．２＋野生型宿主の中へ養子移入した。ＮＰ−αＣＤ１８０またはＮＰ−アイソタイプ対照による接種後４日目または７日目に脾臓を採取し、Ｂ２２０＋、Ｌｙ５．１＋、およびＮＰ−ＡＰＣの結合のために連続的なゲーティングを使用してフローサイトメトリーによって分析した。ＮＰ−アイソタイプ処理マウスは、Ａｇ特異的Ｂ２２０ｈｉ Ｂ細胞の増殖を示さず、一方ＮＰ−αＣＤ１８０処理マウスは両方の時間ポイントでおよそ２０倍の増殖を示した（図３Ｄ）。この増殖はＧＬ７＋ＰＮＡ＋ＧＣのＢ細胞を含み、その数は７日目まで増加した（図３Ｅ）。７日目まで、ＮＰ−αＣＤ１８０処理マウスは有意な数の脾臓中のＣＤ１３８＋抗体産生細胞（ＡＦＣ）も有していた（図３Ｆ）。これらの結果は、ＮＰ−αＣＤ１８０はＥＦ Ａｂ応答およびＧＣの形成の両方を誘導することを示唆した。実際、４日目までＮＰ−αＣＤ１８０処理マウスの脾臓はＥＦ部位中に多数のＡｇ特異的Ｂ細胞を有し、７日目までＰＮＡ＋ＧＣは明らかだった（図３Ｇ）。比較すると、ＮＰ−αＣＤ１８０によって誘導されたＧＣは一般的にはより小さく（図３Ｇ）、ＮＰ−ＣＧＧプラスミョウバンによって誘導されたものよりも少ない数で存在した（図３Ｈ）。

【0073】

ＮＰ−αＣＤ１８０処理マウスにおけるＧＣの存在から、Ａｇ−αＣＤ１８０によって誘導されたＡｇ特異的Ｂ細胞増殖が免疫学的記憶（それは可溶性Ａｇの再チャレンジに応答してＡｇ特異的ＡＦＣを迅速に生成する能力を特徴とする）の発達をもたらすことが示唆された。これを試験するために、野生型マウスおよびＣＤ４０ ＫＯマウスの群に、上記のようにＮＰにコンジュゲートされたモノクローナル抗体、または陽性対照としてのミョウバン中のＮＰ−トリγグロブリン（ＣＧＧ）で免疫付与した。１０週間後に、マウスは、マッチさせた可溶性Ａｇ（ＮＰ−アイソタイプまたはＮＰ−ＣＧＧ）、または陰性対照としてのＰＢＳによりブーストされた。ブースト後４日目に、脾臓を採取し、ＮＰ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＰＯＴ（商標）アッセイを使用してＩｇＧ産生ＡＦＣの数を査定した。予想されるように、可溶性Ａｇによりブーストされた場合、ミョウバン中のＮＰ−ＣＧＧによりプライミングされた野生型マウスは有意な数のＩｇＧ産生ＡＦＣを産生した（図３Ｉ、左側）。ＮＰ−アイソタイプによりプライミングされたマウスとは対照的に、ＮＰ−αＣＤ１８０によりプライミングされたマウスは、免疫付与１０週間後の脾臓においてＡｇ特異的な長命のプラズマ細胞（ＬＬＰＣ）の低いが検出可能な数を含有していた（１０^６の脾細胞あたり０．０ｖｓ５．７±０．８ＳＥＭ）。Ａｇ特異的ＡＦＣのレベルは可溶性Ａｇによる再チャレンジに際しておよそ１０倍増加した（１０^６の脾細胞あたり５６±８．７ＳＥＭ）。アジュバントの非存在下においてＮＰ−αＣＤ１８０によりプライミングされたマウスにおいて生成されたＡＦＣの数は、ミョウバンでプライミングされたマウスにおけるＮＰ−ＣＧＧのものの大まかに３分の１であった。この結果は、ＮＰ−ＣＧＧプラスミョウバンと比較して、ＮＰ−αＣＤ１８０による小さなＧＣの誘導と一致する（図３Ｇおよび３Ｈ）。しかしながら、スポットサイズはＮＰ−ＣＧＧによりプライミングされたマウスからのスポットより３倍大きく（データ不掲載）、ＡＦＣあたり産生されたＮＰ特異的ＩｇＧの量がより多かったことを示唆した。ＮＰ−αＣＤ１８０による一次免疫付与の間のアジュバントＲ８４８の添加は、ＮＰ−αＣＤ１８０により単独でプライミングされたマウスに比較して、Ａｇ再チャレンジに際してスポット数およびスポットサイズのどちらも増加させなかった。

【0074】

意外にも、可溶性Ａｇによる再チャレンジ後に、ＮＰ−αＣＤ１８０によりプライミングされたＣＤ４０ ＫＯマウスにおいてもいくつかのＮＰ特異的ＩｇＧを分泌するＡＦＣを検出した（図３Ｉ、右側）。ＣＤ４０ ＫＯマウスにおけるＮＰ特異的ＩｇＧを分泌するＡＦＣの数は、野生型マウスにおける数の大まかに１／１５であったが、この数は、ＰＢＳによりブーストされたＣＤ４０ ＫＯマウス、またはミョウバン中のＡｇによりプライミングされたＣＤ４０ ＫＯマウスにおいてよりも有意に高かった。したがって、ＣＤ１８０標的化は、野生型マウスにおいて、そしてより少ない程度であるがＣＤ４０の非存在下においてでさえ、免疫学的記憶のために効果的にプライミングする。

【0075】

Ａｇ特異的Ｂ細胞は、ＢＣＲおよびＣＤ１８０の刺激の連結によって効率的に活性化される。
特異的ＡｇがＩｇＧ Ａｂ応答を誘導するためには抗ＣＤ１８０に連結されなくてはならないという事実（図２Ｃ）から、特異的Ａｂが産生されるためには同じ細胞上でＢＣＲおよびＣＤ１８０の両方のライゲーションが必要とされることが示唆された。この可能性を試験するために、最初に、ＢＣＲ、ＣＤ１８０のいずれか、または両方の受容体を介するインビボの刺激後のＢ細胞の活性化を比較した。ＮＰ特異的Ｂ細胞を含有するＢ１−８ｈｉマウス（Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，２００２）を使用した。これらの群のマウスに１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０またはＮＰ−アイソタイプのいずれかを注射し、脾臓を２４時間後に採取した。ＮＰ特異的Ｂ細胞（６〜１０％）を、ＮＰ−ＡＰＣによる染色によって全ＣＤ１９＋Ｂ細胞と弁別した。次いで、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の４群（以下に示す）を、ＣＤ６９、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩおよび受容体（膜貫通性活性化因子／カルシウムモジュレーター／シクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ））のの発現についてエクスビボで分析した。刺激されないＢ細胞（ＮＰ−アイソタイプ処理されたマウスからのＮＰ−Ｂ細胞）、ＢＣＲ刺激Ｂ細胞（ＮＰ−アイソタイプで処理したマウスからのＮＰ＋Ｂ細胞）、ＣＤ１８０刺激Ｂ細胞（ＮＰ−αＣＤ１８０で処理したマウスからのＮＰ−Ｂ細胞）、ならびに刺激されたＢＣＲおよびＣＤ１８０の両方を介して刺激されたＢ細胞（ＮＰ−αＣＤ１８０に処理されたマウスからのＮＰ＋Ｂ細胞）。刺激されていないＢ細胞に比較して、ＡｇまたはαＣＤ１８０のいずれかを経由して刺激されたＢ細胞は、ＣＤ８６およびＴＡＣＩの発現増加を有していた（図４Ａ）。しかしながら、１シリーズの実験に関して、ＣＤ６９、ＣＤ８６およびＴＡＣＩのレベルは、２４時間（図４ＡおよびＢ）および後の時間ポイント（データ不掲載）で、ＢＣＲおよびＣＤ１８０の両方を介して刺激されたＢ細胞で有意により高かった。したがって、インビボのＢＣＲおよびＣＤ１８０シグナリングの組み合わせは、いずれかのシグナル単独よりもＢ細胞の活性化により効果的であると思われる。

【0076】

ＣＤ１８０のＢ細胞での発現はＡｇ−αＣＤ１８０駆動性Ａｂ応答のために必要且つ十分である。
図４中のデータは、Ｂ細胞のＢＣＲおよびＣＤ１８０シグナリングの組み合わせによってＡｇ−αＣＤ１８０の強力なアジュバント効果が媒介され得ることを示唆する。しかしながら、ＣＤ１８０がＢ細胞および非Ｂ細胞の両方上で発現されるので、ＣＤ１８０標的化によって誘導されたＡｂ応答は、Ａｇ特異的Ｂ細胞へのＣＤ１８０シグナルと共にＡｇ媒介性ＢＣＲシグナリングの両方を送達すること、ならびに／または非Ｂ細胞へのＣＤ１８０送達およびシグナリングが起こり、次いで今度はＡｇ特異的Ｂ細胞およびＴ細胞応答を刺激することのいずれかによって媒介され得る。これらの可能性を区別するために、養子移入を実行して、Ｂ細胞上のみ、非Ｂ細胞上のみ、またはＢ細胞および非Ｂ細胞の両方上でＣＤ１８０を発現するマウスを確立した（図５Ａ）。Ｂ細胞欠損μＭＴマウスにＣＤ１８０ ＫＯ Ｂ細胞を接種して、ＣＤ１８０が非Ｂ細胞上でのみ発現されるマウスを作成した。これらのマウスはＮＰ−αＣＤ１８０による接種後にＡｇ特異的ＩｇＧを生じず（図５Ｂ）、Ｂ細胞上のＣＤ１８０発現はＣＤ１８０標的化後にＡｂ応答を生成するのに必要であることが実証された。精製したＣＤ１８０＋Ｂ細胞を移入したＣＤ１８０ ＫＯレシピエントは、非Ｂ細胞上でではなくＢ細胞上でのみＣＤ１８０を発現した。ＮＰ−αＣＤ１８０による免疫付与に後続して、これらのマウスは高レベルのＡｇ特異的ＩｇＧを産生した。これらのデータは、Ｂ細胞上のＣＤ１８０発現がＣＤ１８０に基づく標的化のために十分であることを示す。ＣＤ１８０がＢ細胞および非Ｂ細胞の両方で発現されるようにＣＤ１８０＋Ｂ細胞を移入したＢ細胞欠損（μＭＴ）マウスは、非Ｂ細胞上でＣＤ１８０を発現しないマウスよりも多少多くのＮＰにより特異的なＩｇＧを生じた（図５Ｂ）。このことは、非Ｂ細胞（ＤＣ等）上のＣＤ１８０発現は、Ａｇ標的化のために十分でもなく必須でもないが、ＩｇＧ産生の程度に影響を及ぼすことを示唆する。

【0077】

抗ＣＤ１８０モノクローナル抗体がマウスへ静脈注射で接種される場合、抗ＣＤ１８０モノクローナル抗体は、ＣＤ１８０＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞および脾臓中の他のＣＤ１８０＋細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよびＦ４／８０＋マクロファージが含まれる）へ結合するが、ＣＤ３＋Ｔ細胞（それはＣＤ１８０を発現しない）へは結合しない（データ不掲載）。どのＡＰＣが、Ｔ細胞のプライミング後のＣＤ１８０への標的化で最も効果的だったかを決定するために、野生型マウスにＯＶＡ−アイソタイプまたはＯＶＡ−αＣＤ１８０のいずれかを接種し；１６時間後にＢ細胞およびＤＣをネガティブ選択によって精製し、ＣＦＳＥ標識のＯＶＡ特異的ＯＴ−ＩＩ ＣＤ４ Ｔ細胞またはＯＴ−Ｉ ＣＤ８ Ｔ細胞と共培養した。７２時間後に、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞中のＣＦＳＥのレベルを、フローサイトメトリーによって測定した（図５Ｃおよび５Ｄ）。ＯＶＡ−αＣＤ１８０標的化Ｂ細胞は、ＯＶＡ−アイソタイプ処理の対照マウスからのＢ細胞とは異なって、明らかにＡｇ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を誘導した。しかしながら、ＯＶＡ−αＣＤ１８０標的化ＤＣは、ＯＴ−ＩＩ増殖の刺激について細胞ベースあたりではるかにより効果的であった。ＯＶＡ−αＣＤ１８０標的化Ｂ細胞は、ＯＶＡ−αＣＤ１８０標的化ＤＣとは異なって、ＯＶＡ特異的ＯＴ−Ｉ ＣＤ８ Ｔ細胞のいかなる増殖を誘導せず（図５Ｄ）、ＤＣと比較してＢ細胞によるＡｇの不良な交差提示と一致している。したがって、ＤＣは、Ａｇ−αＣＤ１８０によって誘導されるＡｇ特異的Ａｂ応答のために必要とされないが、最適なＩｇＧ産生のために必要とされるＡｇ特異的ＣＤ４ヘルパーＴ細胞を刺激するように機能し得る。

【0078】

ＩＬ４、ＩＦＮ−α／βシグナリングおよび成熟Ｂ細胞はＣＤ１８０へのＡｇ標的化のために必要とされない。
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）はＢ細胞に直接作用し、Ａｂ応答を促進することが示されている（ＬｅＢｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｆｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）。したがって、ＮＰ−αＣＤ１８０の接種後に１型ＩＦＮα／β受容体（ＩＦＮα／βＲ）ＫＯマウスおよび野生型マウスのＩｇＧ応答を比較した。抗ＮＰのＩｇＧ産生が増加したならば、ＩＦＮα／βＲを介するシグナリングは無効であり、１型ＩＦＮはＣＤ１８０経由で誘導されるＡｂ応答を通常は制止し得ることを示唆する。ＮＰ−αＣＤ１８０による免疫付与後のＭＨＣクラスＩＩが欠損したマウス（ＭＨＣ ＩＩ ＫＯ）は、ＣＤ４０ ＫＯマウスまたはＴＣＲ ＫＯマウスのいずれかよりも抗ＮＰ ＩｇＧ産生においてより重度の減少を有していた（図６Ａ）。Ｂ細胞レベルがＭＨＣ ＩＩ ＫＯマウスにおいて正常であり、ＭＨＣ ＩＩ Ｂ細胞は胸腺非依存性Ａｇへ正常に反応するので（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、これについての理由は明らかではない。別のＴ細胞依存性Ｂ細胞活性化因子（αＩｇＤ）は、ＩＬ−４の作用を必要とし（Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）、従って、ＮＰ−αＣＤ１８０により接種した野生型マウス、ＩＬ４ ＫＯマウスおよびＯＸ４０Ｌ ＫＯマウスのＡｂ応答を比較した。ＣＤ１８０標的化後に、ＩＬ−４ ＫＯマウスおよびＯＸ４０Ｌ ＫＯマウスの両方は野生型対照に類似するレベルで抗ＮＰのＩｇＧを産生し（図６Ａ、Ｂ）、ＩＬ−４−Ｔｈ２経路がＣＤ１８０標的化の間に必要とされないことを実証する。

【0079】

ＣＤ１８０標的化におけるサイトカインＢＡＦＦについての可能な役割を査定するために、ＢＡＦＦ−Ｒ ＫＯマウス（成熟Ｂ細胞の発生がほぼ完全に遮断される（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４））に免疫付与した。意外にも、ＢＡＦＦ−Ｒ ＫＯマウスは、ＣＤ１８０への標的化後に正常レベルのＮＰ特異的ＩｇＧ Ａｂを産生した（図６Ａ）。このことは、ＣＤ１８０＋Ｂ細胞がＡｇ−αＣＤ１８０標的化のために必要とされるが、成熟Ｂ細胞が必要ではないかもしれないことを示唆する。実際、ＮＰ−αＣＤ１８０による免疫付与後の１および３日目に、ＮＰ−アイソタイプを注射した動物に比較して、濾胞Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｈｉ ＣＤ２１ｉｎｔ）およびＴ１／Ｔ２移行Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｌｏ ＣＤ２１ｌｏ ＣＤ９３＋）の両方において有意な増加が観察された（図６Ｃ）。これとは対照的に、辺縁帯表現型（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｌｏ ＣＤ２１ｈｉ ＣＤ９３−）を持つＢ細胞は、ＮＰ−αＣＤ１８０投与後に顕著な減少を示した。これらの結果は、ＮＰ−αＣＤ１８０がすべての脾臓のＢ細胞サブセットではなく、いくつかのものを増殖させることを実証する。ＢＡＦＦはＢＡＦＦ−Ｒに加えてＴＡＣＩおよびＢＣＭＡへも結合することができるので（Ｒｉｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡを介するシグナリングがＡｇ−αＣＤ１８０駆動性ＩｇＧ応答に寄与する可能性が残る。

【0080】

考察
まとめると、本データは、ＣＤ１８０への標的化Ａｇが、Ａｇ特異的Ｂ細胞の迅速な活性化を誘導し、７日以内の有意なＩｇＧ産生をもたらすことを指摘する。顕著なことには、追加のアジュバントなしのＡｇ−αＣＤ１８０の単回注射は、Ａｂ親和性成熟および免疫学的記憶の両方の発達ももたらした（図３）。さらに、たとえ、以前に報告されたように、ＣＤ４０ ＫＯマウスがＡｇ特異的ＩｇＧを生じないか、またはミョウバン中のＡｇに応答して記憶Ａｂ産生細胞を発生させなかったとしても（Ｋａｗａｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、著しく損なわれたが、Ａｇ特異的ＩｇＧ産生および二次免疫付与への応答はＣＤ４０ ＫＯマウスにおいて保持された（図３Ｈ）。誘導されたＡｂ応答は、Ａｇが抗ＣＤ１８０への付加されることを必要とし、ハプテンおよびタンパク質Ａｇの両方に対して誘導することができた。

【0081】

免疫付与のこのモードは、ＩｇＧ Ａｂ応答を迅速に生じるのになぜそれほど効果的であるのか。さまざまな方向からの証拠は、迅速なＡｂ応答を促進するのは、Ｂ細胞上のＢＣＲおよびＣＤ１８０の両方を介するＡｇ−αＣＤ１８０の同時のシグナリングの組み合わせであることを示唆する。第一に、Ａｇ−αＣＤ１８０によるＩｇＧの効果的な誘導は、ＣＤ１８０が他の細胞上ではなくＢ細胞上で発現されることを必要とした。第二に、連結されたＡｇへのＡｂ応答は、ＮＰ−αＣＤ１８０およびＯＶＡ−αＣＤ１８０の両方により起こったが、同時に共投与された可溶性Ａｇへの応答はほとんどまたはまったくなかった。第三に、Ａｇ受容体およびＣＤ１８０を共に刺激することによってインビボで活性化されたＢ細胞は、いずれかの刺激によって単独で引き起こされたＢ細胞よりも高いレベルの活性化マーカーを発現した（図４）。実際、ＣＤ８６がアジュバントを添加していないＡｇへのＩｇＧ応答のために必要なので（Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、ＢＣＲおよびＣＤ１８０の共ライゲーション後のＣＤ８６発現のより高い誘導は、ＣＤ１８０へのＡｇの標的化の特色であろう。ＴＡＣＩ受容体もＣＤ１８０標的化後により高いレベルへ誘導され、ＴＡＣＩはクラススイッチおよびＩｇＧ産生における役割を果たす（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0082】

ＣＤ１８０へのＡｇ標的化は、Ｂ細胞を必要とするが、以下のことから成熟Ｂ細胞を必要とするとは思われない。ＢＡＦＦ−Ｒ ＫＯマウスは主に１型移行（Ｔ１）Ｂ細胞を有し；このマウスは、２型移行Ｂ細胞では５倍減少しており、成熟濾胞Ｂ細胞および辺縁帯Ｂ細胞をほとんど完全に欠損している（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。しかしながら、ＢＡＦＦ−Ｒ ＫＯマウスへのＡｇ−αＣＤ１８０の接種は野生型マウスと同じくらいのＡｇ特異的ＩｇＧを産生させた。このことは、Ｔ１ Ｂ細胞がＡｇ−抗ＣＤ１８０についての主要な標的であることを示唆する。ＢＣＲ単独刺激後にＴ１ Ｂ細胞は容易にアポトーシスするが、ＢＣＲおよび第２のシグナル経由でシグナル伝達された場合それらは死滅せず（Ｋｏｖｅｓｄｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）、Ｔ１ Ｂ細胞は活性化誘導性デアミナーゼ（ＡＩＤ）も構成的に発現し（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ，２００７、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｋｕｒａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９）、迅速に大量のＩｇＧを産生し、ＢＣＲおよびＴＬＲの刺激の組み合わせにより引き起こされた場合に体細胞変異を行うことができる（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｃａｐｏｌｕｎｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ａｒａｎｂｕｒｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｋｕｒａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。したがって、ＢＣＲおよびＣＤ１８０の両方を介してシグナル伝達されたＡＩＤ＋Ｔ１ Ｂ細胞は、ＩｇＧ産生プラズマ細胞へと迅速にスイッチし成熟することができる。

【0083】

本結果から、Ａｇ−αＣＤ１８０標的化が野生型マウスおよびＣＤ４０ ＫＯマウスの両方における長命のプラズマ細胞およびスイッチした記憶Ｂ細胞を生成することが指摘される。第一に、免疫付与した野生型マウスにおけるＡｇ特異的ＩｇＧのｔ１／２はおよそ３８日（図２Ａ中の動態に基づいて）であり、その一方で短命なＡＦＣの反応からのＩｇＧの分離したバーストの異化作用は２１日のｔ１／２を有する。加えて、ＣＤ４０ ＫＯマウスにおけるＡｇ特異的ＩｇＧレベルは経時的に上昇し続ける。これらの両方の結果は、ＩｇＧの持続的な排出を遅くするかまたは相殺する継続的なＩｇＧ産生を必要とし、ある程度のＡｂ産生細胞が保持されることを暗示する。第二に、Ａｇ特異的なＧＬ７＋ＰＮＡ＋ＧＣ Ｂ細胞はＮＰ−αＣＤ１８０による免疫付与後７日目まで明らかであった。このＧＣの表現型は、記憶Ｂ前駆細胞が生成されていたことを示唆する。第三に、野生型マウスおよびＣＤ４０ ＫＯマウスの両方は、Ａｇの追加接種後に、Ａｇ−アイソタイプによりプライミングされたマウスまたはブーストされないマウスよりも有意に多くのＡＦＣを有していた（図３Ｉ）。ＣＤ４０が胸腺依存性Ａｇまたは胸腺非依存性−２Ａｇによる記憶Ｂ細胞の誘導においてシグナル伝達することを多くの研究が暗示しており（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｋａｊｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、実際はるかに強い記憶応答はＣＤ４０ ＫＯマウスよりも野生型マウスにおいてＮＰ−αＣＤ１８０によって誘導された。しかしながら、ＮＰ−αＣＤ１８０は明らかにある程度のＣＤ４０非依存性Ｂ細胞記憶を誘導した。胸腺非依存性Ａｇは、Ｔ細胞非依存性のＧＣ非依存性記憶Ｂ細胞反応を誘導することができる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｄｅｆｒａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｂｅｒｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。したがって、強いＥＦ応答の生成に加えて、ＣＤ１８０を介する刺激は、ＢＣＲシグナリングと組み合わせた場合、Ｔ非依存性の記憶Ｂ細胞分化の新規の経路であり得る。

【0084】

ＣＤ４０ ＫＯマウスおよびＴＣＲ欠損マウスはまだＣＤ１８０標的化後にＩｇＧを生じることができるが、Ａｇ特異的ＩｇＧの量は野生型マウスにおけるもののわずか約１０％である。したがって、Ｔ細胞は、明らかに大部分のＩｇＧ応答のために必要とされる。ＣＤ１８０がＢ細胞およびＤＣの両方上で発現され、モノクローナル抗体によるライゲーション後に内部移行するので（データ不掲載）、ＣＤ１８０標的化により、恐らくＡｇ特異的Ｂ細胞に加えてＡｇを結合しないＤＣの両方へＡｇを送達することができた。実際、αＣＤ１８０経由でインビボで標的化されたＤＣは、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖の刺激において、標的化Ｂ細胞よりもより効果的であるということが、このような事例である。αＣＤ１８０によって誘導されるＡｂ応答はＢ細胞上でのＣＤ１８０発現のみを必要としたが、ＤＣ媒介性Ｔ細胞プライミングは、Ａｇが単にＢ細胞へ指向されたよりも、野生型マウスにおけるＣＤ１８０標的化に対するより高い応答の促進を支援するように思われる（図５Ｂ）。

【0085】

ここで記述された組み合わせたＡｇ標的化／アジュバント方法は、ヒトワクチンのために使用することができる。大部分のワクチンは、すべての個体において防御免疫を誘導せず、大部分のワクチンは永続する免疫を誘導しない。さらに、免疫無防備個体のワクチン接種は特別な考察およびアプローチを必要とする（Ｒａｐｐｕｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒａｔｈｏｒｅ，２０１２）。ＣＤ１８０への標的化はＣＤ４０ ＫＯマウスにおいてでさえＩｇＧ応答およびある程度の免疫学的記憶を誘導し、顕著なことには、成熟Ｂ細胞欠損ＢＡＦＦ−Ｒ ＫＯマウスおよびＩＦＮシグナリング欠損ＩＦＮα／βＲ ＫＯマウスにおいてでさえ高レベルのＩｇＧ Ａｂを誘導する。したがって、ＣＤ１８０に基づくワクチンプラットフォームは、高齢者が含まれる免疫無防備の人の免疫付与のために使用することができる。加えて、大部分のワクチン戦略は保護的Ａｂの十分な血中循環レベルの産生に２回以上の注射を必要とする。単一用量ワクチンは多数の長所を提供し（Ｂｏｗｉｃｋ ａｎｄ ＭｃＡｕｌｅｙ，２０１１、Ｌｅｖｉｎｅ，２０１１）、抗ＣＤ１８０へ付加されたＡｇの１回の注射は迅速で強いＩｇＧ応答を誘導する。したがって、ＣＤ１８０に基づくワクチンの単一接種は保護的液性免疫を産生し、病原体への曝露の直後の治療的ワクチン接種のための特に魅力的なアプローチになり得る。

【0086】

材料および方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＣＤ４０ ＫＯマウス、ＯＴ−Ｉ ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ＴＣＲトランスジェニックマウス、ＯＴ−ＩＩ ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋ＴＣＲトランスジェニックマウス、Ｂ細胞欠損（μＭＴ）マウス、およびＴ細胞欠損（ＴＣＲβ／δＫＯ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。特に断りのない限り、すべての系統はＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドであった。ＣＤ１８０ ＫＯマウス、ＭＨＣ ＩＩ ＫＯマウスおよびＩＦＮα／βＲ ＫＯマウスは、それぞれＳ．Ｓｋｅｒｒｅｔｔ、Ｐ．ＦｉｎｋおよびＫ．Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）からの寄贈であった。ＯＸ４０Ｌ ＫＯマウスはＡ．Ｈ．Ｓｈａｒｐｅ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）からの寄贈であった。ＢＡＦＦ−Ｒ ＫＯマウスはＫ．Ｒａｊｅｗｓｋｙ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）からの寄贈であった。Ｂ６．ＳＪＬ−Ｂ１−８ｈｉノックインＬｙ５．１マウスはＭ．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）からの寄贈であった。ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド上のＩＬ−４ ＫＯマウスはＳ．Ｚｉｅｇｌｅｒ（Ｂｅｎａｒｏｙａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）からの寄贈であり、野生型対照ＢＡＬＢ／ｃマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。すべてのマウスは性別および年齢をマッチさせ、６〜１０週齢で使用した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、動物業務をすべて承認した。

【0087】

細胞調製および養子移入
全脾細胞を機械的破砕によって処理し、Ｇｅｙの溶解液によって赤血球を枯渇させた。図３中の養子移入実験のために、Ｂ１−８ｈｉ ＩｇＨトランスジェニックマウスからの脾細胞をＰＥをコンジュゲートしたＮＰおよび抗Ｂ２２０−ＦＩＴＣにより標識して、フローサイトメトリーによってＡｇ特異的Ｂ細胞の頻度を決定した。２×１０^５のＮＰ結合Ｂ細胞を含有する全脾細胞を、免疫付与の２４時間前に個々のＢ６レシピエントへ静脈注射で移入した。図５ＡおよびＢ中の実験のために、野生型マウスまたはＣＤ１８０欠損マウスからの脾臓のＢ細胞を、３ラウンドのネガティブ選択濃縮（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、カナダ）によって単離した。１０×１０^６の適切な遺伝子型の精製Ｂ細胞を、免疫付与の２４時間前に、示されるようなレシピエントへ静脈注射で移入した。図５Ｃ中の実験のために、ＯＴＩＩ−Ｉ ＴＣＲトランスジェニックマウおよびＯＴ−Ｉ ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞のそれぞれ、ならびに免疫付与したＣ５７ＢＬ／６マウスからのＤＣまたはＢ細胞を、適切なキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、カナダ）を使用して、３ラウンドのネガティブ選択濃縮によって単離した。ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ４もしくはＣＤ８（Ｔ細胞）、またはＣＤ１１ｃ（ＤＣ）についてのフローサイトメトリーによって決定されるように、すべての細胞濃縮の純度は＞９９％であった。ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞およびＯＴ−ＩＩ Ｔ細胞の頻度をＶα２についての染色によってＣＤ３＋Ｔ細胞集団内で決定し、細胞培養の最終的な数を決定するために使用した。

【0088】

インビトロのＣＦＳＥ増殖分析
免疫付与したマウスからの５×１０^４のＢ細胞またはＤＣを上述のように濃縮し、以前に記述されるように、３７℃、５％ＣＯ_２で３日間９６ウェル丸底プレート中で、漸増数のＣＦＳＥ標識したＶα２＋のＯＴ−Ｉ Ｔ細胞またはＯＴ−ＩＩ Ｔ細胞と共培養した（Ｃｈａｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）標識を以前に記述されるように実行した（Ｃｈａｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0089】

ＥＬＩＳＡアッセイおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイのために、ポリスチレンプレートを、全Ｉｇのために２μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）、ＮＰ特異的Ａｂのために２０μｇ／ｍＬのＮｉＰ−ＢＳＡ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）、または２０μｇ／ｍＬのＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかによりコーティングした。製造者の使用説明書に従ってＮｉＰのスクシンイミジルエステル（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へのコンジュゲーションによって調製されたカスタムＮｉＰ２−ＢＳＡおよびＮｉＰ２０−ＢＳＡを使用して、以前に記述されるように（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８０、Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、親和性決定を実行した。検出および分析を以前に記述されるように実行した（Ｃｈａｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを以前に記述されるように実行した（Ｇｏｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。スポットの数およびサイズは、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（商標）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｖ５．０ソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．、Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ）によりＣＴＬ−ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（商標）Ｓ５ Ｃｏｒｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＥＬＩＳＰＯＴ（商標）リーダーを使用して定量化した。

【0090】

フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で実行した。最小で３０，０００細胞の最終的なゲート集団をすべての分析について使用した。データ分析をＦｌｏｗＪｏ（商標）（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）ソフトウェアにより実行した。染色を以下のものについて実行した。ＣＤ３、ＣＤ８０およびＣＤ９５（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、モノクローナル抗体、それぞれ１４５−２Ｃ１１、１６−１０Ａ１およびＪｏ２）；ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＴＣＲ Ｖα２、ＣＤ１９、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０およびＣＤ６９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、モノクローナル抗体、それぞれＲＭ４−５、５３−６．７、Ｂ２０．１、６Ｄ５、ＧＬ−１、Ｍ１／７０、Ｎ４１８、ＢＭ８およびＨ１．２Ｆ３）；Ｂ２２０、ＧＬ７、Ｌｙ５．１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、モノクローナル抗体、それぞれＲＡ３−６Ｂ２、ＧＬ−７およびＡ２０）；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から得たＦＩＴＣ標識ピーナッツ凝集素（ＦＩＴＣ−ＰＮＡ）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）からの抗ＭＨＣ ＩＩ（ＮＩＭＲ−４）；およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）からの抗ＴＡＣＩ／ＴＮＦＳＦ１３ｂ（モノクローナル抗体１６６０１０）。ＮＰ−ＡＰＣおよびＮＰＰＥは、上記のＮＰ２−ＢＳＡについて記述されるようにアロフィコシアニンまたはフィコエリトリン（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）へのＮＰ−Ｏｓｕ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）のコンジュゲーションによって調製した。すべてのアイソタイプ対照モノクローナル抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。

【0091】

他の抗体および試薬
抗ＣＤ１８０（ＲＰ／１４）のハイブリドーマはＫ．Ｍｉｙａｋｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｋｙｏ、Ｔｏｋｙｏ、日本）からの好意による寄贈であり、ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（９Ｄ６）ハイブリドーマはＲ．Ｍｉｔｔｌｅｒ（Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）からの寄贈であった。同等性を保証するために、これらのモノクローナル抗体を同じプロテインＧカラム上で連続して精製し、ＧｌｕｃａＳｈｉｅｌｄ（商標）緩衝液（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ、Ｅａｓｔ Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ）中でＬＡＬゲル化アッセイによってエンドトキシンについて試験した。エンドトキシンレベルが０．０２５ＥＵ／ｍｇを超えるタンパク質だったならば、サンプルを廃棄した。モノクローナル抗体を上記のＮＰ２−ＢＳＡについて記述されるようにＮＰへコンジュゲートした。最終的なＮＰ−モノクローナル抗体コンジュゲーション比は、分光測光法によって決定されるようにＮＰ６〜ＮＰ１９の範囲であった。すべての接種において、ＮＰ比は、胸腺非依存性−２ Ａｇシグナリングに起因する任意の可能性のある効果のために対照への抗ＣＤ１８０よりもペアにしたアイソタイプについて常により高かった。トリＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、電気泳動によって決定されるように、モノクローナル抗体あたり２つのＯＶＡの平均コンジュゲーション比で以前に記述される通り（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６）モノクローナル抗体へコンジュゲートした。投与されたコンジュゲートの量はモノクローナル抗体成分を指す。すなわち、１００μｇのＯＶＡ−αＣＤ１８０は、１００μｇのαＣＤ１８０に対する５６μｇのＯＶＡの添加に起因して１５６μｇのＯＶＡ−αＣＤ１８０の総質量を含有する。マウスは、ミョウバン中のＡｇによる免疫付与（腹腔内投与した）以外は、ＰＢＳ中での２００μｌの固定した体積を静脈注射で接種した。ミョウバン沈殿抗原は製造者の使用説明書に従ってＩｍｊｅｃｔ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により調製された。ＬＰＳ（Ｌ２１４３）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのものであった。合成ＴＬＲアゴニストＲ８４８、およびＣｐＧ ＯＤＮ１５８５（タイプＡ）／ＯＤＮ１８２６（タイプＢ）は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのものであった。使用時に、アゴニストを免疫原と混合し、２００μＬの静脈注射ボーラスで投与した。

【0092】

免疫組織化学
１００μｇのＮＰ−αＣＤ１８０、ＮＰ−アイソタイプ、またはＮＰ−ＣＧＧプラスミョウバンで４日または７日前に免疫付与したマウスから得た８μＭの凍結脾臓切片を、以前に記述されるように、抗Ｂ２２０−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＮＡ−ＦＩＴＣ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）およびＮＰ−ＰＥにより染色した（Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。イメージは、１０×対物レンズを使用して、ＬＳＭ ５１０（ｖ４．２）ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）によりＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ（商標）共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で室温で収集した。イメージは、ＩｍａｇｅＪ（商標）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）およびＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）（Ａｄｏｂｅ）ソフトウェアを使用して処理した。

【0093】

統計分析
実験群の生データを、一元配置ＡＮＯＶＡに続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈのためのバージョン４．０ａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって、または個々のペアにしたカラムについては両側タイプ２のＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって、のいずれかで分析した。カラムのデータは平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表現される。ｐ＜０．０５の値は統計的に有意であると判断され、＊が割り当てられ、一方ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１はそれぞれ＊＊および＊＊＊が割り当てられた。

【0094】

実施例１のための参照文献
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【0095】

実施例２
図７中で示されるような量で、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＯＶＡ−αＣＤ１８０コンジュゲートプラスＴＬＲ７アゴニストＲ８４８（示される場合）で免疫付与（静脈注射）するか、または無処理で残した（ナイーブ）。示された時間ポイントで血清を収集し、ＩｇＧ（図７Ａ）およびＩｇＭ（図７Ｂ）の特異的レベルをＥＬＩＳＡによって決定した。データは１つの群あたり３匹のマウスの平均＋ＳＥＭを示す。これらのデータは、わずか１７．５μｇのＯＶＡ−αＣＤ１８０が強いＩｇＧ Ａｂ応答を誘導できることを示す。しかしながら、ＴＬＲ７アゴニスト（Ｒ８４８）が添加される場合、１．７５μｇのＯＶＡ−αＣＤ１８０のみが、１７．５μｇのＯＶＡ−αＣＤ１８０のみにより誘導されたものを超えるＡｇ特異的応答の誘導に必要とされる。したがって、コンジュゲートおよびＴＬＲ７アゴニストの組み合わせは、ＩｇＧおよびＩｇＭの抗体反応の相乗的な誘導を提供した。

【0096】

実施例３
図８中で示されるような量で、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＷＮＶＥ−αＣＤ１８０コンジュゲート（静脈注射）（ＯＶＡによるものと同じコンジュゲーションテクニックを使用して）、または生存ＷＮＶテキサス系統（Ｔｘ）（足蹠）で免疫付与した。対照として、マウスにＮＰ／ＣＤ１８０コンジュゲート（３０μｇまたは１５μｇ＋Ｒ８４８）で免疫付与した（静脈注射）。示された時間ポイントで、血清を収集し、ＩｇＧの特異的力価（図８Ａ）および中和力価（図８Ｂ）を、それぞれＥＬＩＳＡ、およびＷＮＶに適合させたプラーク減少中和力価（ＰＲＮＴ）ウイルス中和アッセイ（Ｂ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｌａｙ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ｏｆ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ．Ｄｉａｍｏｎｄ ＭＳ，Ｓｈｒｅｓｔｈａ Ｂ，Ｍａｒｒｉ Ａ， Ｍａｈａｎ Ｄ，Ｅｎｇｌｅ Ｍ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３ Ｆｅｂ；７７（４）：２５７８−８６．）によって決定した。データは１つの群あたり２匹のマウスの平均＋ＳＥＭである。ＰＲＮＴ_５０は、対照と比較して、プラークの数を５０％減少させる血清の最小濃度を示す。３０μｇまたは１５μｇのＮＰ／ＣＤ１８０コンジュゲート＋Ｒ８４８で免疫付与した対照マウスの間の差はなかった（図示せず）。これらのデータは、精製した組換え西ナイルウイルス（ＷＮＶ）エンベロープＩタンパク質が付加されている（ＷＮＶＥ）抗ＣＤ１８０を接種されたマウスが、ＷＮＶＥ特異的ＩｇＧ Ａｂ（図８Ａ）およびＷＮＶＥへの中和Ａｂ（図８Ｂ）の両方を生じることを示す。

【0097】

実施例４
図９中で示されるような量で、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＷＮＶＥタンパク質／αＣＤ１８０コンジュゲート（Ｅ／ＣＤ１８０）（実施例３中と同じ）（静脈注射）、プラス２０μｇのＲ８４８もしくは５０μｇのＣｐＧＢ（示された場合）で免疫付与したか、または１０００ｐｆｕの生存ＷＮＶ−Ｔｘ（足蹠）を感染させた。対照として、マウスに、ＮＰ／ＣＤ１８０コンジュゲート（３０μｇまたは１５μｇ＋Ｒ８４８またはＣｐＧＢ）で免疫付与した（静脈注射）。２８日後に、血清を収集し、中和力価をＰＲＮＴアッセイによって決定した。データは１つの群あたり３匹のマウスの平均＋ＳＥＭを示す。３０μｇまたは１５μｇのＮＰ／ＣＤ１８０コンジュゲートプラスＲ８４８またはＣｐＧｂで免疫付与した対照マウスの間の差はなかった（図示せず）。これらのデータは、ＷＮＶＥ−αＣＤ１８０コンジュゲートがＴＬＲ７（Ｒ８４８）またはＴＬＲ９（ＣｐＧＢ）のアジュバントの添加によって促進される中和Ａｂ応答を誘導することを明らかに示す。ＷＮＶに感染したマウスはより高い中和Ａｂ力価を有するが、その時これらのマウスはウイルスを複製しており、単回注射（ＷＮＶＥ−αＣＤ１８０コンジュゲート注射でのように）だけでなく２、３週間ウイルスに曝露される。

【0098】

実施例５
図９中で示されるように、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１５μｇのＷＮＶＥタンパク質／αＣＤ１８０コンジュゲート（Ｅ／ＣＤ１８０）プラス２０μｇのＲ８４８もしくは５０μｇのＣｐＧＢ（静脈注射）で免疫付与したか、または１０００ｐｆｕの生存ＷＮＶテキサス（足蹠）を感染させた。対照として、マウスに、１５μｇのＮＰ／ＣＤ１８０コンジュゲートプラス５０μｇのＣｐＧＢで免疫付与した（静脈注射）。３２日後（３２日目）に、５０ｐｆｕのＷＮＶテキサスを頭蓋内（ｉ．ｃ．）注射でマウスにチャレンジした。マウスは死亡率について２１日間モニターした。データは１群あたり２匹のマウスの生存／死亡率を示す。これらのデータ（表１を参照）は、ＷＮＶＥ−ＣＤ１８０コンジュゲートで免疫付与したＢ６マウスが、５０ｐｆｕのＷＮＶテキサス系統（ＷＮＶ−ＴＸ）の頭蓋内（ｉ．ｃ．）注射によって誘導される死亡から保護されることを示す。これとは対照的に、陰性対照としてＮＰ／ＣＤ１８０＋ＣｐＧＢで免疫付与したマウスはすべて、６日目までに死亡した。

【0099】

【表1】

【0100】

実施例６
ＯＴ−Ｉ ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスへと移入し、次いでこのマウスに、２０μｇのαＣＤ１８０／ＯＶＡコンジュゲート（静脈注射）を単独でまたは５０μｇのポリＩ：Ｃ（ＴＬＲ７アゴニスト）もしくはＣｐＧＢ（ＴＬＲ９アゴニスト）と共に、または２０μｇの陰性対照としてアイソタイプ／ＯＶＡコンジュゲートを、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を接種した。３、７および２０日目で、末梢血からのＯＴ−Ｉ Ｔ細胞はＣＤ８＋細胞でのゲーティング、Ｖα２およびＶβ５．１／５．２によって分析した。データ（図示せず）は、Ａｇ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞および次いでαＣＤ１８０／ＯＶＡ（アジュバントなしの）を接種したマウスで、３日後にＡｇ特異的Ｔ細胞の頻度が増幅し、次いでレベルが減少することを実証する。アジュバントが添加されるならば、多くのＣＤ８ Ｔ細胞は増殖しより長い間生存する（アジュバントとしてＣｐＧＢと共に、表２を参照されたい）。このことは、Ａｇ−抗ＣＤ１８０が細胞障害性Ｔ細胞応答を活性化し増幅させることができ、アジュバントとの組み合わせは細胞障害性Ｔ細胞応答のさらに良好な活性化および増幅を提供することを実証する。

【0101】

【表2】

【0102】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５００，０００のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ Ｔｇ Ｔ細胞）を１日目に接種し、０日目に、以下のいずれかを静脈注射で接種した。１）ＰＢＳ；２）２０ｍｇのＧ２８−１アイソタイプ対照モノクローナル抗体へ付加されたＯＶＡ；３）２０ｍｇのａＣＤ１８０へ付加されたＯＶＡ；または４）２０ｍｇのａＣＤ１８０へ付加されたＯＶＡ＋５０ｍｇのＣｐＧＢアジュバント。平均は各々の時間ポイントにつき３匹のマウス／群について示される。太字の数は対照に比べて統計的に有意に異なる。ＯＶＡ−ａＣＤ１８０免疫付与はインビボでＣＤ８ Ｔ細胞数を増幅する。増殖は永続的ではないが、アジュバントの添加によって延長することができる。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図3e】

【図3f】

【図3g】

【図3h】

【図3i】

【図4a】

【図4b】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図9】