特許 6429243 アンブレインの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6429243

(24)【登録日】2018年11月9日

(45)【発行日】2018年11月28日

(54)【発明の名称】アンブレインの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/02 20060101AFI20181119BHJP

   C12N 9/90 20060101ALI20181119BHJP

   C12N 15/61 20060101ALN20181119BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/02ZNA

   C12N9/90

   !C12N15/61

【請求項の数】9

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2015-535401(P2015-535401)

(86)(22)【出願日】2014年8月12日

(86)【国際出願番号】JP2014071333

(87)【国際公開番号】WO2015033746

(87)【国際公開日】20150312

【審査請求日】2017年5月15日

(31)【優先権主張番号】特願2013-184143(P2013-184143)

(32)【優先日】2013年9月5日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】304027279

【氏名又は名称】国立大学法人 新潟大学

(74)【代理人】

【識別番号】100079049

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(74)【代理人】

【識別番号】100099025

【弁理士】

【氏名又は名称】福田 浩志

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 努

(72)【発明者】

【氏名】上田 大次郎

(72)【発明者】

【氏名】星野 力

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 SATO T et al., Sesquarterpenes (C35 terpenes) biosynthesized via the cyclization of a linear C35 isoprenoid by a tetraprenyl-β-curcumene synthase and a tetraprenyl-β-curcumene cyclase: identification of a new terpene cyclase, J. Am. Chem. Soc., 2011, Vol.133, p.9734-9737 & Supporting information, <URL= https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja203779h>

【文献】 SATO T et al., Bifunctional triterpene/sesquarterpene cyclase: tetraprenyl-β-curcumene cyclase is also squalene cyclase in Bacillus megaterium, J. Am. Chem. Soc., 2011, Vol.133, p.17540-17543 & Supporting information, <URL= https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja2060319>

【文献】 VEITH B et al., Database UniProt [online], Accession No.Q65II0, 01-MAY-2013 uploaded, [retrieved on 05-NOV-2014], Definiton: SubName: Full=Squalene--hopene cyclase SqhC; EC=5.4.99.17, <URL= http://www.uniprot.org/uniprot/Q65II0.txt?version=47>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を３−デオキシアキレオールＡに反応させて、アンブレインを得ること、を含むアンブレインの製造方法。

【請求項2】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が、バチルス属細菌由来である、請求項１に記載のアンブレインの製造方法。

【請求項3】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が、バチルス・メガテリウム、バチルス・サブチリス及びバチルス・リケニフォルミスのいずれか由来である、請求項１又は請求項２に記載のアンブレインの製造方法。

【請求項4】

スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成可能な変異型スクアレン−ホペン環化酵素を、スクアレンに反応させて、３−デオキシアキレオールＡを得ること、をさらに含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のアンブレインの製造方法。

【請求項5】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素が、配列番号１で示されるアミノ酸配列における３７７位、４２０位、６０７位及び６１２位からなる群より選択される少なくとも１つの部位にアミノ酸置換を有する、請求項４に記載のアンブレインの製造方法。

【請求項6】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する、請求項４又は請求項５に記載のアンブレインの製造方法。

【請求項7】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を３−デオキシアキレオールＡに反応させてアンブレインを得ることを特徴とするアンブレインの製造方法に用いるための、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を含む組成物。

【請求項8】

前記テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が、バチルス属細菌由来であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が、バチルス・メガテリウム、バチルス・サブチリス及びバチルス・リケニフォルミスのいずれか由来であることを特徴とする、請求項７又は請求項８に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アンブレインの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

龍涎香（ambergris）は、７世紀ごろから世界各地で使用されてきた高級香料であり、漢方薬としても使用されている。龍涎香は、マッコウクジラが食物（タコ、イカ等）の不消化物を消化管分泌物により結石化させ、排泄したものと考えられているが、詳細な生成メカニズムは不明である。龍涎香の主成分はアンブレインであり、龍涎香が海上を浮遊する間に日光と酸素によって酸化分解を受け、各種の香りを持つ化合物を生成すると考えられている。

【0003】

龍涎香の主成分アンブレインは、香料又は薬剤として用いられているが、自然界から大量に入手することは不可能である。このため、種々の有機合成法が提案されている。
例えば、特開平１０−２３６９９６号公報には、（＋）−アンブレインを簡便かつ安価に効率よく製造する方法として、アンブレノリドから、新規なスルホン酸誘導体を製造し、これにγ−シクロゲラニルハライドの光学活性体をカップリングさせる工程を含む方法が開示されている。
また、Tetrahedron Asymmetry, (2006) Vol.17, pp.3037-3045には、（±）（５，５，８ａ−トリメチルオクタヒドロ−１Ｈ−スピロ［ナフタレン−２，２’−オキシラン］−１−イル）メタノールから合成した２−（（１Ｒ，２Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）−２−（メトキシメトキシ）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−１−イル）アセトアルデヒドと、（±）メチル ６−ヒドロキシ−２，２−ジメチルシクロヘキサンカルボキシレートから合成した５−（（４−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−６−メチレンシクロヘキシル）ブタン−２−イル）スルホニル）−１−フェニル−１Ｈ−テトラゾールとを、Ｊｕｌｉａカップリング反応によって収束的合成して、アンブレインを得る方法が開示されている。

【0004】

一方、スクアレン−ホペン環化酵素の変異型酵素（D377C、D377N、Y420H、Y420W等）を用いることによって、スクアレンから、単環性トリテルペンである３−デオキシアキレオールＡを得る方法が知られている（Biosci. Biotechnol. Biochem., (1999) Vol.63, pp.2189-2198、Biosci. Biotechnol. Biochem., (2001) Vol.65, pp.2233-2242、Biosci. Biotechnol. Biochem., (2002) Vol.66, pp.1660-1670）。
また、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が、テトラプレニル−β−クルクメンから４環性のＣ_３５テルペノールを生成する反応と、スクアレンから２環性のトリテルペンを生成する反応と、の２つの反応に関与する二機能性酵素であることが報告されている（J. Am. Chem. Soc., (2011) Vol.133, pp.17540-17543）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

従来のアンブレインの有機合成法は、多くの合成段階を必要とすることから、反応系が複雑であり、事業化には至っていない。またアンブレインの生成に関与する具体的な酵素は知られていない。

【0006】

したがって、本発明の目的は、従来知られている有機合成法よりも簡便にアンブレインを製造することができるアンブレインの製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は以下のとおりである。
［１］ テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を３−デオキシアキレオールＡに反応させて、アンブレインを得ること、を含むアンブレインの製造方法。
［２］ テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が、バチルス属細菌由来である、［１］に記載のアンブレインの製造方法。
［３］ テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が、バチルス・メガテリウム、バチルス・サブチリス及びバチルス・リケニフォルミスのいずれか由来である、［１］又は［２］に記載のアンブレインの製造方法。
［４］ スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成可能な変異型スクアレン−ホペン環化酵素を、スクアレンに反応させて、３−デオキシアキレオールＡを得ること、をさらに含む、［１］〜［３］のいずれか１つに記載のアンブレインの製造方法。
［５］ 変異型スクアレン−ホペン環化酵素が、配列番号１で示されるアミノ酸配列における３７７位、４２０位、６０７位及び６１２位からなる群より選択される少なくとも１つの部位にアミノ酸置換を有する、［４］に記載のアンブレインの製造方法。
［６］ 変異型スクアレン−ホペン環化酵素が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する、［４］又は［５］に記載のアンブレインの製造方法。
［７］ テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する、［１］〜［６］のいずれか１つに記載のアンブレインの製造方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、従来知られている有機合成法よりも簡便にアンブレインを製造することができるアンブレインの製造方法が提供される。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。

【0010】

本発明において、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇｌｙ」）で表現する場合がある。
本発明において、タンパク質及びポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸残基の個数を基準とする。

【0011】

以下に、本発明の実施の形態について説明する。これらの説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。

【0012】

本発明のアンブレインの製造方法は、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を３−デオキシアキレオールＡに反応させてアンブレインを得ること、を含むアンブレインの製造方法である。
本発明では、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を３−デオキシアキレオールＡに反応させてアンブレインを製造するので、アンブレインを簡便に製造することができる。

【0013】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、Ｃ_３０の直鎖不飽和炭化水素であるスクアレンから２環性テルペノールを生成する酵素であると知られていたが、片末端に単環を有する３−デオキシアキレオールＡを基質として利用可能であることが明らかとなった。また、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、３−デオキシアキレオールＡを基質として利用すると、３−デオキシアキレオールＡの環状化されていない端を選択的に環化させて、両末端環化化合物を生成することが明らかとなった。本発明は、これらの知見に基づくものである。テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の上記活性により、片末端に単環を有する３−デオキシアキレオールＡを材料として、１種の酵素を用いて簡便にアンブレインを製造することができる。

【0014】

本発明のアンブレインの製造方法は、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を３−デオキシアキレオールＡに反応させて、アンブレインを得ること（以下、「アンブレイン生成工程」という）を含み、必要に応じて他の工程を含む。

【0015】

アンブレインは、（１Ｒ，４ａα）−１−［（Ｅ）−６−［（Ｓ）−２，２−ジメチル−６−メチレンシクロヘキシル］−４−メチル−３−ヘキセニル］デカヒドロ−２，５，５，８ａβ−テトラメチルナフタレン−２α−オールであり、組成式Ｃ_３０Ｈ_５２Ｏ、分子量４２８．７４５の両末端環化化合物であり、以下の構造を有するトリテルペンアルコールである（ＣＡＳ登録番号：４７３−０３−０）。

【0016】

【化1】

【0017】

本発明のアンブレインの製造方法では、３−デオキシアキレオールＡを、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の基質として利用する。

【0018】

３−デオキシアキレオールＡは、（Ｓ）−１，１−ジメチル−３−メチレン−２−（（３Ｅ，７Ｅ，１１Ｅ）−３，８，１２，１６−テトラメチルヘプタデカ−３，７，１１，１５−テトラエン−１−イル）シクロヘンキサンであり、組成式Ｃ_３０Ｈ_５０であり、以下の構造を有する片末端環化化合物である。該化合物が、本発明においてアンブレインを生成するための材料として用いられる。３−デオキシアキレオールＡの入手方法については特に制限はなく、化学合成によって得たものであってもよく、既存化合物から酵素反応を用いて得たものであってもよい。

【0019】

【化2】

【0020】

本発明の製造方法は、変異型スクアレン−ホペン環化酵素を、スクアレンに反応させて、３−デオキシアキレオールＡを得ること（以下、「３−デオキシアキレオールＡ生成工程」という）をさらに含むことが好ましい。これにより、変異型スクアレン−ホペン環化酵素とテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素とを用いた２つの酵素反応によって、安価なスクアレンを材料としてアンブレインを効率よく簡便に製造することができる。

【0021】

［３−デオキシアキレオールＡ生成工程］
３−デオキシアキレオールＡ生成工程では、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成可能な変異型スクアレン−ホペン環化酵素を、スクアレンに反応させて、３−デオキシアキレオールＡを得る。本明細書において、「変異型スクアレン−ホペン環化酵素」とは、特に断らない限り、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成可能な変異型スクアレン−ホペン環化酵素を指す。

【0022】

本発明において、変異型スクアレン−ホペン環化酵素とは、野生型スクアレン−ホペン環化酵素を改変した酵素であり、かつ、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成可能な酵素である。野生型スクアレン−ホペン環化酵素は、スクアレンを閉環して、５環性のホペン又はホパノールを生成する酵素（ＥＣ５．４．９９．−）として知られており、アリシクロバチルス属、ザイモモナス属、ブラジリゾビウム属等の原核生物に広く存在している。野生型スクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列は既に公知であり、例えば、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）の野生型スクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列（配列番号１）（表１）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ００７００２に示されている。

【0023】

【表1】

【0024】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列に変異を有し、スクアレンから単環の３−デオキシアキレオールＡを生成可能な活性を有する酵素である。野生型スクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列に変異が含まれると、不完全な環化反応が生じ、スクアレンと反応させた場合には、野生型では五環化合物を生成するところ、単環化合物が生成可能となることが知られている。

【0025】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素としては、３−デオキシアキレオールＡの生成効率の観点から、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、３７７位、４２０位、６０７位及び６１２位からなる群より選択される少なくとも１つの部位にアミノ酸置換を有する変異型スクアレン−ホペン環化酵素が好ましく、これらの部位の１つ又は２つに変異を有する変異型スクアレン−ホペン環化酵素がより好ましく、これらの部位のいずれか１つに変異を有する変異型スクアレン−ホペン環化酵素が更に好ましい。

【0026】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素における上述した変異部位は、相対的なものであり、例えば、「３７７位」とは、３７７位よりもＮ末端側のアミノ酸残基が１つ欠失している場合には、実際には３７６位となる。また、野生型スクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列が、当該酵素を本来的に保有する生物種に応じて、スクアレン−ホペン環化酵素の本来の機能とは無関係な種固有のバリエーションを含む場合には、当業界において公知の方法でアライメントを行った後の部位に読み替えるものとする。

【0027】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素におけるアミノ酸置換は、野生型のアミノ酸残基に対して他のアミノ酸残基を置換するものである。野生型のアミノ酸残基と置換する他のアミノ酸残基としては、置換後の変異型スクアレン−ホペン環化酵素がスクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成可能なアミノ酸残基であれば、いずれのアミノ酸残基であってもよい。

【0028】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素における変異部位及び置換アミノ酸としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において下記の変異部位及び置換アミノ酸が好ましい。
（ｉ）３７７位のアスパラギン酸残基（Ｄ）がシステイン残基（Ｃ）又はアスパラギン残基（Ｎ）に置換。
（ｉｉ）４２０位のチロシン残基（Ｙ）がヒスチジン残基（Ｈ）又はトリプトファン残基（Ｗ）に置換。
（ｉｉｉ）６０７位のロイシン残基（Ｌ）がフェニルアラニン残基（Ｆ）又はトリプトファン残基（Ｗ）に置換。
（ｉｖ）６１２位のチロシン残基（Ｙ）がアラニン残基（Ａ）に置換。

【0029】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、上記（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１つの置換を有する酵素が好ましく、上記（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される１つ又は２つの置換を有する酵素がより好ましく、上記（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される１つの置換を有する酵素が更に好ましい。

【0030】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成する機能が保持されれば、野生型スクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列において、上述した変異部位以外に、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加された配列を有していてもよい。この場合、置換、欠失、挿入又は付加される１個又は数個のアミノ酸残基の数は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置、アミノ酸残基の種類等によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個である。

【0031】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、由来は特に制限されず、例えば、アリシクロバチルス属細菌、ザイモモナス属細菌、又はブラジリゾビウム属細菌に由来する変異型スクアレン−ホペン環化酵素であることが好ましい。酵素活性の観点から、変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、アリシクロバチルス属細菌に由来する変異型スクアレン−ホペン環化酵素であることがより好ましく、中でも、アリシクロバチルス・アシドカルダリウスに由来する変異型スクアレン−ホペン環化酵素であることが特に好ましい。

【0032】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素としては、酵素活性の観点から、以下に記載のポリペプチドＡ〜Ｇ（配列番号２〜８）が好ましい。表２中、「mutation」で示された変異以外のアミノ酸残基は、配列番号１で示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基と同一である。

【0033】

【表2】

【0034】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素を構成するポリペプチドＡ〜Ｇには、それぞれ、配列番号２〜８で示される各アミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成する機能が保持されたポリペプチドが包含される。配列番号２〜８で示される各アミノ酸配列において置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸残基の数は、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個である。

【0035】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素を構成するポリペプチドＡ〜Ｇには、それぞれ、配列番号２〜８で示される各アミノ酸配列全体に対して、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成する機能が保持されたポリペプチドが包含される。

【0036】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素を発現可能なポリヌクレオチドは、野生型の配列情報に基づいて入手可能である。変異型スクアレン−ホペン環化酵素を発現可能なポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号９〜１５で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドＡ〜Ｇが挙げられる（表３）。表３中、「mutation site」で示された部位以外は、アリシクロバチルス・アシドカルダリウスの野生型スクアレン−ホペン環化酵素遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ００７００２）と同一である。

【0037】

【表3】

【0038】

ポリヌクレオチドＡ〜Ｇには、それぞれ、配列番号９〜１５で示される各塩基配列において１個又は数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列を有し、かつ、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成する機能が保持されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが包含される。配列番号９〜１５で示される各塩基配列において置換、欠失、挿入又は付加される塩基の数は、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個である。

【0039】

ポリヌクレオチドＡ〜Ｇには、それぞれ、配列番号９〜１５で示される各塩基配列全体に対して、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成する機能が保持されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが包含される。

【0040】

ポリヌクレオチドＡ〜Ｇには、それぞれ、配列番号９〜１５で示される塩基配列の各相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成する機能が保持されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが包含される。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法又は公知の方法に準じる方法、例えば、Molecular Cloning 3rd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001) に記載の方法等に従って行うことができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件としては、例えば、カリウム濃度約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭが挙げられる。本発明の条件の１例として、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が挙げられるが、これに限定されるものではない。他のストリンジェントな条件としては、Molecular Cloning 3rd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001) に記載されている。当業者は、ハイブリダイゼーション反応の条件、即ちハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、ストリンジェントな条件を容易に選択することができる。

【0041】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるために用いられる組換えベクターとしては、特に制限はなく、ｐＥＴ−３ａ等の大腸菌で発現可能なベクター、ｐＨＴ０１等の枯草菌で発現可能なベクター、ｐＹＥＳ２等の酵母で発現可能なベクターなどが挙げられる。変異型スクアレン−ホペン環化酵素をコードするポリヌクレオチドをこれらのベクターに導入することにより、酵素発現用ベクターを得ることができる。酵素発現用ベクターの導入対象となる宿主細菌としては、用いられる組換えベクターの種類に応じて適宜選択可能であり、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）等の大腸菌、１６８株等の枯草菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母などが挙げられる。

【0042】

組換えベクターは、必要に応じて、プロモーター、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＮＯＳなどのターミネーター等を有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子などの公知のものが、特に制限なく用いられる。
組換えベクターは、目的とする遺伝子の導入を確認するためのレポーター遺伝子を含んでいてもよい。このようなレポーター遺伝子としては、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子等が挙げられる。

【0043】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、酵素発現用ベクターを細菌等に導入することによって得られた形質転換体を培養することにより生成される。形質転換体の培養に用いられる培地は、通常用いられる培地でよく、宿主の種類に応じて適宜選択される。例えば、大腸菌を培養する場合には、ＬＢ培地等が用いられる。培地には、選択マーカーの種類に応じた抗生物質が添加されていてもよい。

【0044】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、当該酵素を発現可能な形質転換体を培養することにより得られた培養液から酵素を抽出し精製したものであってもよい。また、培養液中の形質転換体から抽出された酵素を含む抽出液をそのまま用いてもよい。形質転換体からの酵素の抽出方法は、公知の方法を適用してよい。酵素の抽出工程は、例えば、形質転換体を抽出溶媒中で破砕し、細胞内容物を形質転換体の破砕片と分離することを含んでよい。得られた細胞内容物には、目的とする変異型スクアレン−ホペン環化酵素が含まれている。本明細書では、細胞から抽出し細胞の破砕片と分離した細胞内容物を「無細胞抽出液」と称する。

【0045】

形質転換体の破砕方法、細胞内容物と微生物体の破砕片との分離方法、抽出溶媒の組成及びｐＨ条件については、後述するアンブレイン生成工程での記載事項と同一の事項が、そのまま適用される。

【0046】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
変異型スクアレン−ホペン環化酵素とスクアレンとの反応の条件は、酵素反応が進行可能な条件であれば特に制限はない。例えば、反応温度及び反応時間は、変異型スクアレン−ホペン環化酵素の活性等に基づいて適宜選択することができる。反応温度及び反応時間は、反応効率の観点から、例えば４℃〜１００℃及び０．１時間〜４８時間であり、３０℃〜６０℃及び１６時間〜２４時間が好ましい。ｐＨ条件は、反応効率の観点から、例えば３〜１０であり、６〜８が好ましい。

【0047】

反応溶媒は、酵素反応を阻害しないものであれば特に制限はなく、通常用いられる緩衝液等を用いることができる。また、例えば、酵素の抽出工程で使用する抽出溶媒と同一のものを用いることができる。また、変異型スクアレン−ホペン環化酵素を含む抽出液（例えば、無細胞抽出液）を酵素液としてそのまま反応に用いてもよい。

【0048】

３−デオキシアキレオールＡ生成反応における変異型スクアレン−ホペン環化酵素と、その基質であるスクアレンとの濃度比は、反応効率の観点から、酵素に対する基質のモル濃度比（基質／酵素）として、１０〜１００００が好ましく、１００〜５０００がより好ましく、１０００〜３０００がより好ましく、１０００〜２０００が更に好ましい。
酵素反応に用いるスクアレンの濃度は、反応効率の観点から、反応溶媒の全質量に対して０．０００００１質量％〜０．００２質量％が好ましく、０．００００１質量％〜０．０００２質量％がより好ましい。

【0049】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素を用いた反応により得られる３−デオキシアキレオールＡは、公知の方法で精製した後に、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素との反応に供することができる。
３−デオキシアキレオールＡの精製方法としては、反応液中の３−デオキシアキレオールＡを取り出すことができれば特に制限されず、通常用いられる精製方法から適宜選択してよい。精製方法として具体的には、溶媒抽出、再結晶、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等が挙げられる。

【0050】

変異型スクアレン−ホペン環化酵素とスクアレンとが反応する反応工程は、複数回繰り返してもよい。これにより、３−デオキシアキレオールＡの収率を高めることができる。反応工程を複数回繰り返す場合には、基質となるスクアレンを反応系に再投入する工程、公知の方法により酵素を失活させた後、反応液中の反応生成物を回収及び精製する工程等を含むものであってもよい。スクアレンの再投入を行う場合には、反応液中の変異型スクアレン−ホペン環化酵素の濃度、反応液中に残存する基質量等によって、投入する時期、投入量を適宜設定することができる。

【0051】

［アンブレイン生成工程］
アンブレイン生成工程では、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を３−デオキシアキレオールＡに反応させて、アンブレインを得る。

【0052】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、ＥＣ４．２．１．１２９に分類され、水とテトラプレニル−β−クルクメンからバチテルペノールＡを生成する反応、又は、スクアレンから８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンを生成する反応を触媒し得る酵素である。

【0053】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、バチルス属細菌等の細菌が生成する酵素として知られている。反応効率の観点から、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、バチルス属細菌に由来のものが好ましい。

【0054】

バチルス属細菌由来のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）等に由来する酵素が好ましく、反応効率の観点から、バチルス・メガテリウム又はバチルス・サブチリスに由来する酵素がより好ましく、バチルス・メガテリウムに由来する酵素が特に好ましい。

【0055】

バチルス属細菌のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列は公知である。
バチルス・メガテリウム由来のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＤＦ３８９８７に示されている（配列番号１６）（表４）。
バチルス・サブチリス由来のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ６１８２０６に示されている（配列番号１７）（表５）。
バチルス・リケニフォルミス由来のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＵ４１１３４に示されている（配列番号１８）（表６）。

【0056】

反応効率の観点から、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素としては、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が好ましく、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素がより好ましい。

【0057】

【表4】

【0058】

【表5】

【0059】

【表6】

【0060】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素には、配列番号１６〜１８で示される各アミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、３−デオキシアキレオールＡからアンブレインを生成する機能が保持されたポリペプチドが包含される。配列番号１６〜１８で示される各アミノ酸配列において置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸残基の数は、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個である。

【0061】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素には、配列番号１６〜１８で示される各アミノ酸配列全体に対して、それぞれ、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ、３−デオキシアキレオールＡからアンブレインを生成する機能が保持されたポリペプチドが包含される。

【0062】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、バチルス属細菌が作るテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列、及び／又は、バチルス属細菌が保有するテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子の塩基配列に基づいて、遺伝子工学的に得られたものであってもよい。テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を遺伝子工学的に製造する際に用いるテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子としては、バチルス属細菌が保有する野生型遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は、当該野生型遺伝子の塩基配列に基づいて合成されたポリヌクレオチドが挙げられる。

【0063】

バチルス属細菌が保有するテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子の塩基配列は、公知である。
バチルス・メガテリウムについては、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００１９８２．１のゲノム配列の２１３０７８１番〜２１３２６５８番のポリヌクレオチド（配列番号１９、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００１９８２．１のゲノム配列の第２１３０７８１番目の塩基を第１番目の塩基とする塩基配列）が知られている。
バチルス・サブチリスについては、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ６１８２０６に記載のポリヌクレオチド（配列番号２０）が知られている。
バチルス・リケニフォルミスについては、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０００００２．３のゲノム配列の２２０９５３９番〜２２１１４２８番のポリヌクレオチド（配列番号２１、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０００００２．３のゲノム配列の第２２０９５３９番目の塩基を第１番目の塩基とする塩基配列）が知られている。

【0064】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドには、配列番号１９〜２１で示される各塩基配列において１個又は数個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列を有し、かつ、３−デオキシアキレオールＡからアンブレインを生成する機能が保持されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが包含される。配列番号１９〜２１で示される各塩基配列において置換、欠失、挿入又は付加される塩基の数は、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個である。

【0065】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドには、配列番号１９〜２１で示される各塩基配列全体に対して、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ、３−デオキシアキレオールＡからアンブレインを生成する機能が保持されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが包含される。

【0066】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドには、配列番号１９〜２１で示される塩基配列の各相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、３−デオキシアキレオールＡからアンブレインを生成する機能が保持されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが包含される。ハイブリダイゼーションの条件及びストリンジェントな条件は、変異型スクアレン−ホペン環化酵素について記述した条件と同一である。

【0067】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素として、例えば、配列番号１９〜２１のいずれかで示される塩基配列がコードするポリペプチドが挙げられ、配列番号１９又は配列番号２０で示される塩基配列がコードするポリペプチドが挙げられ、配列番号１９で示される塩基配列がコードするポリペプチドが挙げられる。

【0068】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるために用いられる組換えベクターとしては、特に制限はなく、ｐＣｏｌｄＴＦ等の大腸菌で発現可能なベクター、ｐＨＴ０１等の枯草菌で発現可能なベクター、ｐＹＥＳ２等の酵母で発現可能なベクターなどが挙げられる。テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドをこれらのベクターに導入することにより、酵素発現用ベクターを得ることができる。酵素発現用ベクターの導入対象となる宿主細菌としては、用いられる組換えベクターの種類に応じて適宜選択可能であり、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）等の大腸菌、１６８株等の枯草菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母などが挙げられる。

【0069】

組換えベクターは、必要に応じて、プロモーター、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＮＯＳなどのターミネーター等を有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子などの公知のものが、特に制限なく用いられる。
組換えベクターは、目的とする遺伝子の導入を確認するためのレポーター遺伝子を含んでいてもよい。このようなレポーター遺伝子としては、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子等が挙げられる。

【0070】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、酵素発現用ベクターを細菌等に導入することによって得られた形質転換体を培養することにより生成される。形質転換体の培養に用いられる培地は、通常用いられる培地でよく、宿主の種類に応じて適宜選択される。例えば、大腸菌を培養する場合には、ＬＢ培地等が用いられる。培地には、選択マーカーの種類に応じた抗生物質が添加されていてもよい。

【0071】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、当該酵素を発現可能な形質転換体を培養することにより得られた培養液から酵素を抽出し精製したものであってもよい。また、培養液中の形質転換体から抽出された酵素を含む抽出液をそのまま用いてもよい。形質転換体からの酵素の抽出方法は、公知の方法を適用してよい。酵素の抽出工程は、例えば、形質転換体を抽出溶媒中で破砕し、細胞内容物を形質転換体の破砕片と分離することを含んでよい。得られた細胞内容物には、目的とするテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が含まれている。

【0072】

形質転換体の破砕方法としては、形質転換体を破砕して、酵素液を回収可能な公知の方法を適用してよく、例えば、超音波破砕、ガラスビーズ破砕等が挙げられる。破砕の条件は、特に制限はなく、１０℃以下及び１５分間などの、酵素が失活しない条件であればよい。
細胞内容物と微生物体の破砕片との分離方法としては、沈降分離、遠心分離、濾過分離及びこれらの２つ以上の分離方法の組み合わせ等が挙げられる。これらの方法を用いた分離条件は当業者には公知であり、遠心分離の場合には例えば、８，０００×ｇ〜１５，０００×ｇ及び１０分間〜２０分間である。

【0073】

抽出溶媒としては、酵素抽出の溶媒として通常用いられるものでよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等が挙げられる。抽出溶媒のｐＨは、酵素の安定性の点で、３〜１０が好ましく、６〜８がより好ましい。

【0074】

抽出溶媒には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性等が挙げられる。非イオン界面活性剤としては、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80）等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコシド等のアルキルグルコシド、ショ糖ステアリン酸エステル等のショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリンステアリン酸エステル等のポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、アルキルベタインであるＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ドデシルグリシンベタイン等が挙げられる。これら以外にも、トライトンＸ−１００（Triton X-100）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Brij-58）、ノニルフェノールエトキシレート（Tergitol NP-40）等の当技術分野で一般的に用いられる界面活性剤が利用可能である。
抽出溶媒中の界面活性剤の濃度は、酵素の安定性の観点から、０．００１質量％〜１０質量％が好ましく、０．１０質量％〜３．０質量％がより好ましく、０．１０質量％〜１．０質量％が更に好ましい。

【0075】

抽出溶媒には、酵素活性の観点から、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール等の還元剤が含まれていることが好ましい。還元剤としては、ジチオスレイトールが好ましい。抽出溶媒中のジチオスレイトールの濃度は、０．１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、１ｍＭ〜１０ｍＭがより好ましい。抽出溶媒中にジチオスレイトールが存在することによって、酵素におけるジスルフィド結合等の構造が保持されやすくなり、酵素活性がより上昇する傾向がある。

【0076】

抽出溶媒には、酵素活性の観点から、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤が含まれていることが好ましい。抽出溶媒中のＥＤＴＡの濃度は、０．０１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭがより好ましい。抽出溶媒中にＥＤＴＡが存在することによって、酵素活性を低下させ得る金属イオンがキレートされるため、酵素活性がより上昇する傾向がある。

【0077】

抽出溶媒には、上記の成分以外に、酵素抽出溶媒に添加可能な公知の成分が含まれていてよい。

【0078】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素と３−デオキシアキレオールＡとの反応の条件は、酵素反応が進行可能な条件であれば特に制限はない。例えば、反応温度及び反応時間は、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の活性等に基づいて適宜選択することができる。反応温度及び反応時間は、反応効率の観点から、例えば４℃〜１００℃及び０．１時間〜４８時間であり、３０℃〜６０℃及び１６時間〜２４時間が好ましい。ｐＨ条件は、反応効率の観点から、例えば３〜１０であり、６〜８が好ましい。

【0079】

反応溶媒は、酵素反応を阻害しないものであれば特に制限はなく、通常用いられる緩衝液等を用いることができる。また、例えば、酵素の抽出工程で使用する抽出溶媒と同一のものを用いることができる。また、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を含む抽出液（例えば、無細胞抽出液）を酵素液としてそのまま反応に用いてもよい。

【0080】

アンブレイン生成反応におけるテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素と、その基質である３−デオキシアキレオールＡとの濃度比は、反応効率の観点から、酵素に対する基質のモル濃度比（基質／酵素）として、１０〜１００００が好ましく、１００〜５０００がより好ましく、１０００〜３０００がより好ましく、１０００〜２０００が更に好ましい。
酵素反応に用いる３−デオキシアキレオールＡの濃度は、反応効率の観点から、反応溶媒の全質量に対して０．０００００１質量％〜０．００２質量％が好ましく、０．００００１質量％〜０．０００２質量％がより好ましい。

【0081】

テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素と３−デオキシアキレオールＡとが反応する反応工程は、複数回繰り返してもよい。これにより、アンブレインの収率を高めることができる。反応工程を複数回繰り返す場合には、基質となる３−デオキシアキレオールＡを反応系に再投入する工程、公知の方法により酵素を失活させた後、反応液中の反応生成物を回収及び精製する工程等を含むものであってもよい。３−デオキシアキレオールＡの再投入を行う場合には、反応液中のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の濃度、反応液中に残存する基質量等によって、投入する時期、投入量を適宜設定することができる。

【0082】

本発明のアンブレインの製造方法は、３−デオキシアキレオールＡ生成工程とアンブレイン生成工程とを含む場合、アンブレインの生成効率及び製造方法の簡便性の観点から、アリシクロバチルス属細菌に由来する変異型スクアレン−ホペン環化酵素とスクアレンとの反応により得られた３−デオキシアキレオールＡに、バチルス属細菌に由来するテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を反応させて、アンブレインを生成することを含む方法であることが好ましい。より好ましくは、アリシクロバチルス・アシドカルダリウスに由来する変異型スクアレン−ホペン環化酵素とスクアレンとの反応により得られた３−デオキシアキレオールＡに、バチルス・メガテリウム又はバチルス・サブチリスに由来するテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を反応させて、アンブレインを生成することを含む方法である。

【0083】

［その他の工程］
本発明のアンブレインの製造方法は、生成されたアンブレインを精製する精製工程をさらに含んでもよい。アンブレインの精製方法としては、反応液中のアンブレインを取り出すことができれば特に制限されず、通常用いられる精製方法から適宜選択してよい。精製方法として具体的には、溶媒抽出、再結晶、蒸留、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等が挙げられる。

【0084】

得られた生成物がアンブレインであることは、ガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）及び核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）を用いて常法により確認できる。

【実施例】

【0085】

以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。

【0086】

［実施例１］
スクアレンを材料とし、変異型スクアレン−ホペン環化酵素をスクアレンに反応させる工程と、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を３−デオキシアキレオールＡに反応させる工程と、の２工程によりアンブレインを得た。当該２工程の反応スキームを以下に示す。

【0087】

【化3】

【0088】

（１）３−デオキシアキレオールＡの合成
変異型スクアレンーホペン環化酵素（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９）を含む組換えベクターで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Biosci. Biotechnol. Biochem., (1999) Vol.63, pp.2189-2198）を用意した。この形質転換体を、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢ培地（６Ｌ）に植菌し、３７℃で１６時間振とう培養した。培養後、遠心（６，０００×ｇ、１０分間）によって集菌した。菌体を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、３００ｍＬの緩衝液Ａ［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０），１ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有。］で懸濁し、ＵＰ２００５ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany）を用いて超音波破砕（４℃、１５分間）した。破砕処理後の試料を遠心（１２，０００×ｇ、１５分間）し、遠心後に得られた上清を無細胞抽出液Ａとした。

【0089】

スクアレン（５０ｍｇ）をＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１ｇ）に混合して可溶化した後に緩衝液Ａ（５ｍＬ）に添加してスクアレン液を調製した。このスクアレン液全量を無細胞抽出液Ａに加えて反応液とし、６０℃で１６時間インキュベートした。反応液において、スクアレン（基質）と変異型スクアレン−ホペン環化酵素（酵素）とのモル比（基質／酵素）は、約１０００であった。

【0090】

インキュベート後に、１５質量％水酸化カリウム含有エタノール溶液（ＫＯＨ／ＭｅＯＨ，４５０ｍＬ）を反応液へ添加して、酵素反応を停止させた。その後、反応液へｎ−ヘキサン（７５０ｍＬ）を添加して、反応生成物の抽出を３回行った。得られた抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：ｎ−ヘキサン）に供し、純粋な３−デオキシアキレオールＡ（４２．２ｍｇ）を得た。３−デオキシアキレオールＡの構造は、ガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）及び核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）によって確認した。

【0091】

（２）アンブレインの合成
バチルス・メガテリウム由来のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素（配列番号１６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１９）を組み込んだ組換えベクターで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（J. Am. Chem. Soc., (2011) Vol.133, pp.17540-17543）を用意した。この形質転換体をＬＢ培地（１８Ｌ）に植菌し、３７℃で３時間振とう培養した。培養後、０．１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、１５℃で２４時間振とうを行い、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の発現を誘導した。

【0092】

その後、遠心（６，０００×ｇ、１０分間）によって集菌した菌体を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、５４０ｍＬの緩衝液Ｂ［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２．５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＥＤＴＡを含有。］で懸濁し、ＵＰ２００５ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany）を用いて超音波破砕（４℃、２０分間）した。破砕処理後の試料を遠心（１２，３００×ｇ、２０分間）し、遠心後に得られた上清を無細胞抽出液Ｂとした。

【0093】

前記工程（１）で得られた３−デオキシアキレオールＡ（３５ｍｇ）をＴｒｉｔｏｎＸ−１００（７００ｍｇ）に混合して可溶化した後に緩衝液Ｂ（５ｍＬ）に添加して３−デオキシアキレオールＡ液を調製した。この３−デオキシアキレオールＡ液の全量を無細胞抽出液Ｂ（１８０ｍＬ）に加えて反応液とし、３０℃で１６時間インキュベートした。反応液において、３−デオキシアキレオールＡ（基質）とテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素（酵素）とのモル比（基質／酵素）は、約１０００であった。

【0094】

インキュベート後に、１５質量％水酸化カリウム含有エタノール溶液（ＫＯＨ／ＭｅＯＨ、２２０ｍＬ）を反応液へ添加し、さらに７０℃で３０分加熱処理して、酵素反応を停止させた。その後、反応液へｎ−ヘキサン（４００ｍＬ）を添加して、反応生成物の抽出を３回行った。得られた抽出物を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（４７０ｍｇ）に添加して可溶化し、緩衝液Ｂ（５ｍＬ）に添加した後、無細胞抽出液Ｂ（１８０ｍＬ）に加え、上記同様にインキュベート、反応停止、及びｎ−ヘキサン抽出を行った。次いでさらに１回、上記同様に、抽出物の可溶化、無細胞抽出液Ｂへの添加、インキュベート、反応停止、及びｎ−ヘキサン抽出を行った。

【0095】

得られた抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０、容量比）に供し、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０画分を得た。得られた画分を濃縮し、ＨＰＬＣ（溶媒：ｎ−ヘキサン：ＴＨＦ＝１００：２０）に供し、純粋なアンブレイン（０．４ｍｇ）を得た。アンブレインの構造は、ガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）及び核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）によって確認した。また旋光度も文献値とほぼ一致した。

【0096】

［実施例２］
テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を、バチルス・メガテリウム由来の酵素からバチルス・サブチリス由来の酵素に変更した以外は、実施例１と同様にして前記工程（１）及び（２）を行い、アンブレインの合成を行った。実施例２で使用したテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、配列番号２０で示されるポリヌクレオチドでコードされる酵素であり、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する。

【0097】

その結果、実施例１と同様に、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを経てアンブレインを合成できた。合成されたアンブレインの収量は、バチルス・メガテリウム由来のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を用いた場合（実施例１）の１０％程度であった。

【0098】

本発明によれば、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を用いることによって、３−デオキシアキレオールＡからアンブレインを簡便に製造することができる。
本発明によれば、変異型スクアレン−ホペン環化酵素とテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素とを用いることによって、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを経てアンブレインを簡便に製造することができる。

【0099】

２０１３年９月５日に出願された日本国特許出願２０１３−１８４１４３号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]