特許 6431533 遺伝物質、特にＤＮＡ／ＲＮＡへの結合及びその放出のための新規ポリ（エチレンイミン）系コポリマー、並びに該コポリマーの製造方法及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6431533

(24)【登録日】2018年11月9日

(45)【発行日】2018年11月28日

(54)【発明の名称】遺伝物質、特にＤＮＡ／ＲＮＡへの結合及びその放出のための新規ポリ（エチレンイミン）系コポリマー、並びに該コポリマーの製造方法及び使用

(51)【国際特許分類】

   C08G 73/04 20060101AFI20181119BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20181119BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALN20181119BHJP

   A61K 48/00 20060101ALN20181119BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20181119BHJP

【ＦＩ】

   C08G73/04

   A61K47/34

   !A61K31/7088

   !A61K48/00

   !A61P43/00

【請求項の数】7

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2016-519856(P2016-519856)

(86)(22)【出願日】2014年10月2日

(65)【公表番号】特表2016-533409(P2016-533409A)

(43)【公表日】2016年10月27日

(86)【国際出願番号】DE2014000500

(87)【国際公開番号】WO2015048940

(87)【国際公開日】20150409

【審査請求日】2017年8月2日

(31)【優先権主張番号】102013016750.7

(32)【優先日】2013年10月2日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】518316594

【氏名又は名称】スマートダイリバリー ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】110002169

【氏名又は名称】彩雲国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】エングラート，クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】タウハルト，ルッツ

(72)【発明者】

【氏名】ゴットシャルク，ミハイル

(72)【発明者】

【氏名】シューベルト，ウーリッヒ エス．

【審査官】 楠 祐一郎

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５２７７２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／１０９２４８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１２３３８４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１３７７３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０５７６２８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１６２３６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Tim R.Dargaville et.al，Poly(2-oxazoline) Hydrogel Monoliths via Thiol-ene Coupling，Macromol. Rapid Commun.，２０１２年，33，1695-1700

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｇ ７３／０４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝物質、特にＤＮＡ／ＲＮＡへの結合及びその放出のための新規なポリ（エチレンイミン）系コポリマーであって、エチレンイミン単位と２−オキサゾリン単位からなり、式Ｉ：

【化1】

（式中、ａ、ｂは各モノマー単位の比率（ａ、ｂ＞０）を表し、ｄは側鎖長（１〜２０）を表し、Ｘは２−オキサゾリン単位の官能基（二重結合又は三重結合による）を表し、コポリマーの鎖長は２単位〜１，０００，０００単位である）で表される化合物であることを特徴とするコポリマー。

【請求項2】

請求項１に記載の新規なポリ（エチレンイミン）系コポリマーにおいて、式ＩＩで表される異なるオキサゾリン単位：

【化2】

（式中、ａ、ｂ、ｃは各モノマー単位の比率（ａ、ｂ、ｃ＞０）を表し、ｄは側鎖長（１〜２０）を表し、Ｘは２−オキサゾリン単位の官能基（二重結合又は三重結合による）を表し、ＲはＨ又は有機残基（例えばアルキルやアリール）を表し、コポリマーの鎖長は２単位〜１，０００，０００単位である）を含むコポリマー。

【請求項3】

遺伝物質、特にＤＮＡ／ＲＮＡへの結合及びその放出のための新規なポリ（エチレンイミン）系コポリマーであって、エチレンイミン単位と２−オキサゾリン単位からなるコポリマーの製造方法であって、式ＩＩＩの合成スキーム：

【化3】

であることを特徴とする方法。

【請求項4】

酸が−ＯＨ又は−ＮＨＳの場合、活性化剤、特にＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）又はＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）の存在下で官能基を導入する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

次式：

【化5】

で表される不飽和酸無水物又はハロゲン化物（−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）による後続の官能化を経由して官能性側鎖を導入する、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

遺伝物質への結合及びその放出のための基質、特にビーズ又は粒子の表面の官能化のための、請求項１又は２に記載の新規なポリ（エチレンイミン）系コポリマーの使用。

【請求項7】

遺伝物質への結合及びその放出のためのヒドロゲル層構造体、特にビーズ又は粒子の調製のため、或いは該構造体の成分としての、請求項１又は２に記載の新規なポリ（エチレンイミン）系コポリマーの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エチレンイミン単位と２−オキサゾリン単位からなるポリ（エチレンイミン）をベースとするコポリマー（以下、ポリ（エチレンイミン）系コポリマーと称する）であって、公知のポリ（エチレンイミン）系コポリマー（ＰＥＩ）と比較して驚くべき高機能性を有する新規なポリ（エチレンイミン）系コポリマーに関する。この種のＰＥＩはＤＮＡ／ＲＮＡへ結合及びそれを放出することが知られている。本発明は更にこれらコポリマーの製造方法及び機能特異的な使用も関する。
本発明のポリ（エチレンイミン）系コポリマーは、例えば表面の官能基化や移動分析用のＤＮＡチップシステムの開発に、更にはセンサの防汚コーティング材として用いることができる。

【背景技術】

【0002】

２−（３−ブテニル）−２−オキサゾリンはモノマーとして既に知られている（Ａ．グレス、Ａ．フェルケル、Ｈ．シュラート；ポリ［２−（３−ブテニル）−２−オキサゾリン］のチオクリック修飾、マクロモレキュールズ ４０、２００７、７９２８〜７９３３）。このモノマーは、塩酸（２−クロロエチルアミン）をＮ−スクシンイミジル−４−ペンテネートで官能化した後、閉環することにより製造される。この３段階で製造されるモノマーである２−（３−ブテニル）−２−オキサゾリンを重合するとポリ（２−（３−ブテニル）−２−オキサゾリン）が得られる。このホモポリマーは時間がかかる製造プロセスによって得られるが、遺伝物質、特にＤＮＡ／ＲＮＡへの結合に必要な非結合のアミン基は含まない。

【0003】

ポリ（エチレンイミン）系コポリマーのＮ−イソプロピルアクリルアミドによる官能基化は、所謂マイケル反応によって行えることも知られている（Ｈ．ティアン、Ｆ．リ、Ｊ．チェン、Ｙ．フアン、Ｘ．チェン：効果的な遺伝子キャリアーとしてのＮ−イソプロピルアクリルアミド修飾ポリ（エチレンイミン）、マクロモレキュラー・バイオサイエンス １２、２０１２、１６８０〜１６８８）。このように合成された誘導体はプラスミドＤＮＡに対して結合親和性を示す。しかし、上述のマイケル反応によるＰＥＩの官能基化によれば、結合能を有する多重結合が存在しない側鎖が生成してしまうため、この官能基化の利用は限定的となる。特にこのような方法では、遺伝物質への結合及びその放出のための、官能化表面を有する基質や形状を有するヒドロゲル（例えばビーズ、粒子、他）を製造することができない。

【0004】

また、温和な条件下でＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）或いはやや高極性のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）がカルボキシル含有成分（例えばブタン酸）と反応して、所謂「アミノアシルエステル」を生成することも知られている（Ｄ．セーガル、Ｉ．Ｋ．ヴィジャイ：水溶性カルボジイミドを介する高効率アミド化の方法、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１８、１９９４、８７〜９１）。
このようなアミノアシルエステルを用いれば、アミノ基を官能化できるが、この官能化は１級アミノ基のみに限られる。更に、官能化側鎖のポリマーへの導入については記載されていない。上述のように、この場合にも多重結合は生成せず、遺伝物質（特にＤＮＡ／ＲＮＡ）への結合及びその放出のための、官能化表面を有する基質や形状を有するヒドロゲル（例えばビーズ、粒子、他）を製造することができない。

【0005】

更に、アセテート、ブタノエート及びヘキサノエートを用いるＥＤＡＣ／ＮＨＳによる分枝ＰＥＩの官能基化も知られている（Ａ．Ｍ．ドゥーディ、Ｊ．Ｎ．コーレイ、Ｋ．Ｐ．ダン、Ｐ．Ｎ．ザワネー、Ｄ．パットナム：インヴィトロでのＤＮＡデリバリーのための炭化水素共役分枝ポリエチレンイミンの構造／機能パラメータスペースの特性化、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １１６、２００６、２２７〜２３７）。前述のように、ここでも官能化は１級アミノ基のみに限られる。また、無水酢酸、無水プロピオン酸及び無水ブタン酸を用いるポリエチレンイミンの官能基化も知られている（Ｓ．ニメッシュ、Ａ．アッガルワル、Ｐ．クマール、Ｙ．シン、Ｋ．Ｃ．グプタ、Ｒ．チャンドラ：アシル化ＰＥＩナノ粒子が介在するトランスフェクションに及ぼすアシル鎖の鎖長の影響、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ． ３３７、２００７、２６５〜２７４）。どちらの場合もＤＮＡ／ＲＮＡ等の遺伝物質に対して結合親和性が示されたが、導入された側鎖の多重結合については記載されておらず、従って前述の使用機能性が限定的であるという問題点は依然として存在する。

【0006】

また、分解速度を調整できるポリアルキレンイミンヒドロゲルが知られている（Ｍ．カルナハン、Ｊ．Ｂｕｔｌｉｎ：分解速度を調整可能な架橋ポリアルキレンイミンヒドロゲル、ＷＯ２００９／１０２９５２Ａ２）。ここで、官能基化の様式が異なる（反応プロセスは示されず）ポリアルキレンイミン、即ち分枝ポリエチレンイミンは、活性化ポリエチレングリコールにより架橋し、ＰＥＩの当初のアミン基の一部のみが次の生化学的応用に利用される。架橋の程度は、出発ポリマーと架橋剤の量比により間接的に制御されるだけである。このプロセスにおいては、ヒドロゲルネットワークの合成に力点が置かれている。その後の、例えば遺伝物質への結合及びその放出のための、形状を有するヒドロゲルの表面に対して存在する機能の利用や、該ヒドロゲルの合成に関しては詳細に述べられていない。

【0007】

また、ポリ（Ｎ−アセチルエチレンイミン）のアルカリ部分加水分解が知られている（Ｙ．チュウジョウ、Ｙ．ヨシフジ、Ｋ．サダ、Ｔ．サエグサ：２−メチル−２−オキサゾリンからの新規なノニオン性ヒドロゲル、マクロモレキュールズ ２２、１９８９、１０７４〜１０７７）。既に記載したように、ポリマーネットワークへの後続の架橋反応は存在するエチレンイミン単位を介してのみ可能である。従って、遺伝物質への結合及び後のその放出はもはや実現しない。この調製されたヒドロゲル中の非結合のエチレンイミン単位は正確には定量できない。更に、ポリマーに導入された官能化側鎖についての記載はなく、表面官能化等の応用は除外される。加水分解プロセスにおいては、不飽和官能性を有する側鎖の導入は不可能である。

【0008】

ポリエチレンイミンのアルキル化及びアシル化、及びこれらコポリマーからのプラスミドＤＮＡの放出に関する分析についてはよく知られている（Ｍ．トーマス、Ａ．Ｍ．クリバノフ：ポリエチレンイミンによる哺乳類細胞へのプラスミドＤＮＡデリバリーの向上、ＰＮＡＳ ９９、２００２、１４６４０〜１４６４５）。ここでもまた、不飽和官能基の導入と、架橋剤によるコポリマーのヒドロゲルへの転化の可能性については記載がない。

【0009】

更に、無水酢酸を介するポリエチレンイミンの部分アセチル化については詳細に解析されている（Ｍ．Ｌ．フォレスト、Ｇ．Ｅ．マイスター、Ｊ．Ｔ．ケーバー、Ｄ．Ｗ．パックル、「ポリエチレンイミンの部分アセチル化はインヴィトロの遺伝子デリバリーを増強する」、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１、２００４、３６５〜３７１）。側鎖に多重結合がないことから、上述のように、これまでにあった使用可能性についての限定が存在するため好ましくない。

【0010】

更に、単官能、２官能又は多官能成分による分枝ポリエチレンイミンの官能化と架橋についても述べられている（Ｐ．タルカ、Ｔ．メルダン、Ｅ．ワグナー、Ｊ．クレックナー；ｓｉＲＮＡデリバリーのための化学修飾ポリカチオンポリマー、ＷＯ ２００７／０８４７９７）。マイケル反応による不飽和の官能基の導入の可能性は記載されているものの、実際の導入に関する記載はない。従って、ここでも、これらのポリマーが、遺伝物質、特にＤＮＡ／ＲＮＡ等への結合及びその放出のために有用なヒドロゲル（例えば、ビーズ、粒子、他）の表面官能基化や構造化に対して応用できるか否かは述べられていない。更に、既存の結合可能なポリエチレンイミン単位は架橋剤によりコポリマーに結合される。

【0011】

長鎖酸ハロゲン化物による官能基化も知られている（Ｌ．ヤン、Ｗ．Ｔ．Ｓ．ハック、Ｘ．Ｍ．ツァオ、Ｇ．Ｍ．ホワイトサイズ：ミクロコンタクトプリンティング技法による反応性ＳＡＭ上のポリ（エチレンイミン）薄膜のパターニング、ラングミュイア １５、１９９９、１２０８〜１２１４）。しかし、側鎖に多重結合がないことや、関連する応用の可能性が失われているという問題点を依然として伴う。

【0012】

種々の組成を有する水溶性コポリマーの合成が知られている（ＷＯ２０１１／１６２３６６Ａ１）。分枝ポリエチレンイミンに多重結合を導入することが記載されてはいるものの、側鎖のエチレングリコール単位に関してのみであり、この導入の目的は水溶性ポリマーの合成にある。遺伝物質の化学結合は、特に長い側鎖の場合、正電荷密度のパーセント刻みでの減少により非常に制限される。望ましい溶解特性は非常に多数のエチレングリコール単位によって達成されるが、特にＤＮＡの場合は結合が困難となる。にもかかわらず、遺伝物質の最も高効率の結合を達成するためには、コポリマーのエチレンイミン比率をある程度まで上げる必要がある。しかし、この組成から出発しても水溶性に関しては達成不可能である。不飽和官能化コポリマーの応用（例えばヒドロゲルの形成）については述べられていない。

【0013】

更に、ポリ（２−オキサゾリン）の部分加水分解が知られている（Ｆ．ヴィースブロック、Ｆ．シュテルツァー、Ｃ．スルゴヴィッチ、Ｎ．ヌーモフィディ、Ｖ．カルテンハウザー、Ｅ．クロイツヴィースナー、Ｋ．ラメトシュタイナー：ポリ（２−置換）オキサゾリンを主成分とするコンタクト式殺生物剤の使用、ＷＯ２０１２／１４９５９１）。この反応方法からでは多重結合を有するコポリマーは合成できない。必要とされる条件下では、多重結合の官能基は加水分解によって分解される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】Ｍ．カルナハン、Ｊ．Ｂｕｔｌｉｎ：分解速度を調整可能な架橋ポリアルキレンイミンヒドロゲル、ＷＯ２００９／１０２９５２Ａ２

【特許文献2】Ｐ．タルカ、Ｔ．メルダン、Ｅ．ワグナー、Ｊ．クレックナー；ｓｉＲＮＡデリバリーのための化学修飾ポリカチオンポリマー、ＷＯ ２００７／０８４７９７

【特許文献3】ＷＯ２０１１／１６２３６６Ａ１

【特許文献4】Ｆ．ヴィースブロック、Ｆ．シュテルツァー、Ｃ．スルゴヴィッチ、Ｎ．ヌーモフィディ、Ｖ．カルテンハウザー、Ｅ．クロイツヴィースナー、Ｋ．ラメトシュタイナー：ポリ（２−置換）オキサゾリンを主成分とするコンタクト式殺生物剤の使用、ＷＯ２０１２／１４９５９１

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Ａ．グレス、Ａ．フェルケル、Ｈ．シュラート；ポリ［２−（３−ブテニル）−２−オキサゾリン］のチオクリック修飾、マクロモレキュールズ ４０、２００７、７９２８〜７９３３

【非特許文献2】Ｈ．ティアン、Ｆ．リ、Ｊ．チェン、Ｙ．フアン、Ｘ．チェン：効果的な遺伝子キャリアーとしてのＮ−イソプロピルアクリルアミド修飾ポリ（エチレンイミン）、マクロモレキュラー・バイオサイエンス １２、２０１２、１６８０〜１６８８

【非特許文献3】Ｄ．セーガル、Ｉ．Ｋ．ヴィジャイ：水溶性カルボジイミドを介する高効率アミド化の方法、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１８、１９９４、８７〜９１

【非特許文献4】Ａ．Ｍ．ドゥーディ、Ｊ．Ｎ．コーレイ、Ｋ．Ｐ．ダン、Ｐ．Ｎ．ザワネー、Ｄ．パットナム：インヴィトロでのＤＮＡデリバリーのための炭化水素共役分枝ポリエチレンイミンの構造／機能パラメータスペースの特性化、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １１６、２００６、２２７〜２３７

【非特許文献5】Ｓ．ニメッシュ、Ａ．アッガルワル、Ｐ．クマール、Ｙ．シン、Ｋ．Ｃ．グプタ、Ｒ．チャンドラ：アシル化ＰＥＩナノ粒子が介在するトランスフェクションに及ぼすアシル鎖の鎖長の影響、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ． ３３７、２００７、２６５〜２７４

【非特許文献6】Ｙ．チュウジョウ、Ｙ．ヨシフジ、Ｋ．サダ、Ｔ．サエグサ：２−メチル−２−オキサゾリンからの新規なノニオン性ヒドロゲル、マクロモレキュールズ ２２、１９８９、１０７４〜１０７７

【非特許文献7】Ｍ．トーマス、Ａ．Ｍ．クリバノフ：ポリエチレンイミンによる哺乳類細胞へのプラスミドＤＮＡデリバリーの向上、ＰＮＡＳ ９９、２００２、１４６４０〜１４６４５

【非特許文献8】Ｍ．Ｌ．フォレスト、Ｇ．Ｅ．マイスター、Ｊ．Ｔ．ケーバー、Ｄ．Ｗ．パックル、「ポリエチレンイミンの部分アセチル化はインヴィトロの遺伝子デリバリーを増強する」、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１、２００４、３６５〜３７１

【非特許文献9】Ｌ．ヤン、Ｗ．Ｔ．Ｓ．ハック、Ｘ．Ｍ．ツァオ、Ｇ．Ｍ．ホワイトサイズ：ミクロコンタクトプリンティング技法による反応性ＳＡＭ上のポリ（エチレンイミン）薄膜のパターニング、ラングミュイア １５、１９９９、１２０８〜１２１４

【非特許文献10】Ｔ．Ｒ．ダガヴィユら、「チオール−エンカップリングによるポリ（２−オキサゾリン）ヒドロゲルモノリス」、Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．、３３、２０１２、１６９５〜７００

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

従って、本発明の目的は、低コスト且つ短時間で製造可能で、目的にかなっており、広範囲に有効な使用のための高度な官能性を有する新規なポリ（エチレンイミン）系コポリマーを製造することにある。遺伝物質、特にＤＮＡ／ＲＮＡへの本コポリマーの結合能は特に限定されない。

【0017】

例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡへの高い結合親和性を有するポリ（エチレンイミン）系コポリマーからヒドロゲルを製造することが可能である。

【課題を解決するための手段】

【0018】

上の目的は、遺伝物質、特にＤＮＡ／ＲＮＡへの結合及びその放出のための新規なポリ（エチレンイミン）系コポリマーにより達成される。本コポリマーは、エチレンイミン単位と２−オキサゾリン単位からなり、式Ｉ：

【0019】

【化1】

【0020】

（式中、ａ、ｂは各モノマー単位の比率（ａ、ｂ＞０）を表し、ｄは側鎖長（１〜２０）を表し、Ｘは２−オキサゾリン単位の官能基（二重結合又は三重結合による）を表し、コポリマーの鎖長は２単位〜１，０００，０００単位である）で表される化合物である。

【0021】

ここで好ましくは、前記の新規なポリ（エチレンイミン）系コポリマーは、式ＩＩで表される異なるオキサゾリン単位：

【0022】

【化2】

【0023】

（式中、ａ、ｂ、ｃは各モノマー単位の比率（ａ、ｂ、ｃ＞０）を表し、ｄは側鎖長（１〜２０）を表し、Ｘは２−オキサゾリン単位の官能基（二重結合又は三重結合による）を表し、ＲはＨ又は有機残基（例えばアルキルやアリール）を表し、コポリマーの鎖長は２単位〜１，０００，０００単位である）を含む。

【0024】

目的に叶うような前述のコポリマーの組成は核磁気共鳴スペクトルにより簡便且つ迅速に決定できる。本発明のコポリマーの構造は、コポリマー主鎖に多重結合の導入を可能とし、もって従来技術と比較した場合に結合親和性を遺伝物質に限定することないような官能性のための条件を生み出す。従って、この官能性は、遺伝物質、特にＤＮＡ／ＲＮＡへの結合及びその放出のための応用を可能とするものであることは明らかに示される。例えば、自体公知のクリックケミストリー（チオール−エンの光付加、アジドクリック）によって、前記コポリマーへの追加成分の付加が可能である。本発明で製造されるコポリマーの最大の利点は、存在するアミノ基の正確な定量に反応が影響を及ぼさないことである。従って、遺伝物質への結合及びその放出に対する本発明のコポリマーの親和性も、何ら影響を受けず、この親和性はコポリマーのＰＥＩ含有量を調整すれば変更できる。この観点は、単純な短い側鎖であって、生物学的応用に影響を及ぼさず、遺伝物質への結合に関する定量的な見解を可能とする側鎖の導入についても同様である。

【0025】

従属請求項においては、上述の官能性に基づく本発明のコポリマーの具体的利用が示されている。例えば、本発明のコポリマーは官能化表面に適用でき、このような表面における遺伝物質への結合及びその放出を可能とすることができる。表面での結合が不完全であれば、未結合の多重結合が存在することとなり、これらは目的とする表面にヒドロゲル層を徐々に形成するために用いられる。更なる利点は、三次元ポリマーネットワーク（所謂ヒドロゲル）を構築できることである。２官能リンカー（ジチオール）を用いると、本コポリマーはこのようなヒドロゲルに架橋することができる。この種のポリマーネットワークの決定的な問題点は、全ての溶媒に対して絶対的溶解度に欠けることである。従って、ゲル構造体のＰＥＩ含有量を（溶液）核磁気共鳴スペクトル（コポリマーと同様）によって正確に決定することができない。しかし、上述のコポリマーの特性化と、不飽和官能基（アミノ基は影響を受けないまま）を経由する後続の架橋反応に基づけば、ヒドロゲルに含まれるＰＥＩの比率を正確に知ることができる。

【0026】

例えば、試料にＵＶ光（３６５ｎｍ）を照射するチオール−エン光付加反応を簡単且つ迅速に行うことによっても、その場で所望のヒドロゲルビーズを製造することができる。この場合でも、遺伝物質は選択的に結合又は放出される。

【0027】

本発明によれば、新規ポリ（エチレンイミン）系コポリマーは式ＩＩＩの合成スキームによって製造される。

【0028】

【化3】

【0029】

酸が−ＯＨ又は−ＮＨＳの場合、活性化剤、特にＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）又はＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）の存在下で官能基を導入することが好ましい。

【0030】

しかし、不飽和酸無水物又はハロゲン化物（−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）による後続の官能化を経由して官能性側鎖を導入することもできる。

【0031】

この合成プロセスによって、本発明のコポリマーは不飽和の官能基と非結合のアミノ基の両者を有する。本発明によれば、例えば式Ｉ又はＩＩのコポリマーの合成は、後続のポリエチレンイミンホモポリマー（式ＩＩＩ）の官能化に基づく。
この合成法は、時間がかからず、技術的に簡単なプロセスにより低コストで実施でき、小スケール、高スループット技術にも適用可能である。目的に叶うコポリマーを生産することにより、特定の用途に適合するよう正確に調整された組成を有する材料を得ることができる。この組成は核磁気共鳴スペクトルにより簡便且つ迅速に決定できる。このように、前駆体の量を調節するだけで、組成の異なる様々なコポリマーを製造することができる。

【発明を実施するための形態】

【0032】

本発明実施形態により更に詳細に説明する。

【実施例1】

【0033】

（ニシンのゲノムＤＮＡへの結合及びその放出のための）正確に調整可能なＰＥＩ比率を有するヒドロゲルの合成。コポリマーは、ダガヴィユ（Ｔ．Ｒ．ダガヴィユら、「チオール−エンカップリングによるポリ（２−オキサゾリン）ヒドロゲルモノリス」、Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．、３３、２０１２、１６９５〜７００）に類似する光開始剤によるチオール−エン光付加技法で架橋させている。

【0034】

触媒ＤＭＰＡ存在下、ＵＶ光（３６５ｎｍ）照射下でのＰ（ＢｕｔＥｎＯｘ−ｃｏ−ＥＩ）と２，２’−（エチレンジオキシ）ジエタンチオールとのチオール−エン光付加反応を次のスキームに示す。

【0035】

【化4】

【0036】

ポリ［２−（３−ブテニル）−２−オキサゾリン−ｃｏ−エチレンイミン］系ヒドロゲル
コポリマーＰ（ＢｕｔＥｎＯｘ−ｃｏ−ＥＩ）をマイクロ波用ガラス瓶中、エタノールに溶解した。これとは別のガラス瓶に光開始剤の２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノンと２官能チオールの２，２’−（エチレンジオキシ）ジエタンチオールを入れ、これらもエタノールに溶解した（０．９：１．０、チオール：二重結合）。これら２液を合一した清澄な溶液（１０ｗｔ％）を窒素で３０分間脱気した後、ＵＶ光（３６５ｎｍ）を約２４時間照射した。初期のゲル生成の様子からヒドロゲルが合成できたことがわかった。得られたゲルをメタノールと水で繰り返し洗浄した。その後凍結乾燥に付した。

【0037】

適切なコポリマーから種々のヒドロゲルのライブラリーを作ることができた。合成された物質の各種特性化（膨潤度、ベーパーＴＧＡ、ＦＴ−ＩＲ、ＥＡ、固体^１Ｈ−／^１３Ｃ−ＮＭＲ、ＳＥＭ）もできた。

【0038】

ＤＮＡ研究 − Ｐ（ＢｕｔＥｎＯｘ−ｃｏ−ＥＩ）系ヒドロゲルのエチジウムブロミド試験
各ヒドロゲルをＨＢＧバッファー（ｐＨ：７）中、２４時間かけて膨潤させた。次いで、ゲノムＤＮＡエチジウムブロミドを加えた。一定の時間が経過した各時点で試料の一部を取り出し、その蛍光を測定し、ピペットで元に戻した。ヘパリン溶液を添加し、温度を７０℃に上げることにより、結合していたＤＮＡの目的とする放出を短時間で達成できた。

【0039】

【表1】

【0040】

結果：
ＰＥＩ含有量が７５％を下回る場合のみゲル化が起こる。
予想される不溶性とは異なり、これらヒドロゲルは水中で典型的な膨潤挙動を示す。この膨潤挙動はＰＥＩ含有量とゲルの架橋度（ジチオール量）に強く依存する。ＤＮＡの結合／放出能はヒドロゲル構造体中のＰＥＩ比率に依存する。放出のコントロールには、温度を上げることとヘパリンの存在も必要となる。ＤＮＡは非常に短い時間（＜６０分）内にほぼ完全に再放出される。

【実施例2】

【0041】

懸濁重合に類似するチオール−エン光付加を経由するヒドロゲルビーズの調製

【0042】

本発明の新規コポリマーをヒドロゲルビーズとして作成すると、非常に表面積が増大するため、より効果的なＤＮＡ結合が達成される。更に、反応条件を変えることにより、ビーズのサイズを正確に一定の値に調節できる。

【0043】

Ｐ（ＢｕｔＥｎＯｘ−ｃｏ−ＥＩ）系ヒドロゲルのビーズ
コポリマーＰ（ＢｕｔＥｎＯｘ−ｃｏ−ＥＩ_５０％）を出発物質とした。このコポリマーと適量の触媒ＤＭＰＡをエタノールに溶解し（８ｗｔ％）した後、ジチオール２，２’−（エチレンジオキシ）ジエタンチオールを加えた。パラフィン油と安定剤（Ｓｐａｎ^(R)８０）を加えて二相混合物を形成した。Ｎ_２で２５分間脱気した後、室温でＵＶ光（３６５ｎｍ）照射下攪拌（３７５ｒｐｍ）することによりチオール−エン光付加を行った。２．５時間後、得られたヒドロゲルを分離し、エタノールと水で丁寧に洗浄した。その後、ゲルを水中で６時間かけて膨潤させ、凍結乾燥した。

【実施例3】

【0044】

チオール−エン光付加を経由する、官能化ガラス上への単層の付加及び、共有結合性ヒドロゲル層の段階的生成

【0045】

本発明の新規コポリマーをチオール官能化表面へ共有結合させることにより、この表面へのＤＮＡの結合と、そこからの放出を効果的に行うことができる。上述のジチオールを導入することにより、層厚に応じてＤＮＡ親和性の異なる各ヒドロゲル層を段階的に形成することができる（概略図１を参照）。この表面に関する遺伝子物質、特にＤＮＡ／ＲＮＡへの結合及びその放出は、例えばモバイル分析（チップ診断）に応用することができる。

【0046】

マイクロ波用三角ガラス瓶に、コポリマーＰ（ＢｕｔＥｎＯｘ−ｃｏ−ＥＩ_５０％）と光開始剤としての２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノンを添加し、エタノールに溶解した。予めプラズマ炉で焼成し且つ３−（トリメトキシシリル）−１−プロパンチオールで官能化しておいたガラスプレート（１ｘ１ｃｍ^２）を、そのガラスプレートが磁気スターラーバーで攪拌できるよう設置した。このガラス瓶を３０分間窒素で脱気した後、室温でＵＶ光（３６５ｎｍ）を約２４時間照射した。このコーティングされたガラス表面（第１クリック）をエタノールと水で繰り返し洗浄した。第２のクリックは、該コポリマーに代えて架橋剤である２，２’−（エチレンジオキシ）ジエタンチオールを添加した以外は同様に行った。上述の洗浄ステップは再度行った。上述のコポリマーとの繰り返しの反応（第３クリック）により、形式としてはヒドロゲル層が生成する。未結合の二重結合が存在することにより、層構造が段階的に第７クリックまで積層された。無論、更に多くの積層も可能である。

【0047】

【表2】

【0048】

ガラス表面におけるコーティングの形成は蛍光顕微鏡で確認した。このために、上述のコポリマーをフルオレセイン色素（約１％）でマークした。次いで、マークしたコポリマーを検出対象の表面に添加した（クリック段階）。このように処理した表面では、十分に洗浄した後であっても、共有結合が検出された。これは、色素フリーのコーティングと比較したマーク試料の蛍光増強から確認した。コート表面のスクラッチをＡＦＭで確認したところ、第１層（第１クリック）の厚さは１５ｎｍであった。ヒドロゲル層（第３クリック）厚さ（高さ）は３５ｎｍと決定された。更に、結合の完成はＩＲスペクトルから確認した。