特許 6435295 ヒト抗−ミューラー管ホルモンＩＩ型レセプターを指向する新規な変異ヒト化１２Ｇ４抗体及びそのフラグメント

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6435295

(24)【登録日】2018年11月16日

(45)【発行日】2018年12月5日

(54)【発明の名称】ヒト抗−ミューラー管ホルモンＩＩ型レセプターを指向する新規な変異ヒト化１２Ｇ４抗体及びそのフラグメント

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20181126BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20181126BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20181126BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20181126BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20181126BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20181126BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20181126BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20181126BHJP

   G01N 33/577 20060101ALI20181126BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C12N15/13

   C12N5/10

   C12Q1/02

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   G01N33/53 N

   G01N33/574 A

   G01N33/577 B

【請求項の数】24

【全頁数】52

(21)【出願番号】特願2016-146495(P2016-146495)

(22)【出願日】2016年7月26日

(62)【分割の表示】特願2013-509591(P2013-509591)の分割

【原出願日】2011年4月1日

(65)【公開番号】特開2017-29139(P2017-29139A)

(43)【公開日】2017年2月9日

【審査請求日】2016年8月25日

(31)【優先権主張番号】1053712

(32)【優先日】2010年5月12日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】513186615

【氏名又は名称】ラボラトワール フランセ ドゥ フラクションマン エ デ バイオテクノロジーズ

【氏名又は名称原語表記】Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ Ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ Ｅｔ Ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ

(73)【特許権者】

【識別番号】506360871

【氏名又は名称】ユニベルシテ モンペリエ ファースト

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＭＯＮＴＰＥＬＬＩＥＲ １

(73)【特許権者】

【識別番号】512291019

【氏名又は名称】サントル レジオナル ド ルッテ コントル ル キャンサー

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＲＥＧＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＵＴＴＥ ＣＯＮＴＲＥ ＬＥ ＣＡＮＣＥＲ

(73)【特許権者】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル

(74)【代理人】

【識別番号】100065248

【弁理士】

【氏名又は名称】野河 信太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100159385

【弁理士】

【氏名又は名称】甲斐 伸二

(74)【代理人】

【識別番号】100163407

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 裕輔

(74)【代理人】

【識別番号】100166936

【弁理士】

【氏名又は名称】稲本 潔

(72)【発明者】

【氏名】ベーレンス，クリスチャン

(72)【発明者】

【氏名】ナヴァロ−トイロン，イザベル

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５０８８１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３３０２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１８０１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０１８８４４０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Biochem. J.，２００４年，Vol.379，pp.785-793

【文献】 CANCER IMMUNOLOGY, IMMUNOTHERAPY, 2007, Vol. 57, No. 3, pp. 367-378

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ)− 配列番号70若しくは配列番号72で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
ｂ)− 配列番号74若しくは配列番号76で表されるアミノ酸配列からなる重鎖
又は
ａ)− 配列番号78若しくは配列番号80で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖、及び
ｂ)− 配列番号58若しくは配列番号60で表されるアミノ酸配列からなる重鎖
を含んでなるか又は該両鎖からなるヒト化12G4モノクローナル抗体であって、ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプター(AMHRII)に対して、キメラ12G4モノクローナル抗体の該レセプターに対するものと少なくとも等しいK_Dを有するヒト化12G4モノクローナル抗体。

【請求項2】

ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプター(AMHRII)に対して、10^-9Ｍ〜10^-11Ｍの範囲のK_Dを有する、請求項１に記載の変異ヒト化12G4モノクローナル抗体。

【請求項3】

Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、Sc(Fv)₂、「ダイアボディ」からなるフラグメント群より選択される、請求項１又は２に記載の変異ヒト化12G4モノクローナル抗体のフラグメント。

【請求項4】

請求項１若しくは２に記載のモノクローナル抗体の軽鎖をコードする配列及び請求項１若しくは２に記載のモノクローナル抗体の重鎖をコードする配列を含んでなるか又は該配列の両方からなる核酸。

【請求項5】

軽鎖をコードする配列が、以下：
ａ)可変領域：
− 配列番号21若しくは配列番号23、又は
− 配列番号29若しくは配列番号31、又は
ｂ)定常領域
− 配列番号５
から選択される可変領域をコードする配列及び定常領域をコードする配列を含んでなるか又は該両配列からなる、請求項４に記載の核酸。

【請求項6】

重鎖をコードする配列が、以下：
ａ)可変領域：
− 配列番号25若しくは配列番号27、
ｂ)定常領域
− 配列番号11
から選択される可変領域をコードする配列及び定常領域をコードする配列を含んでなるか又は該両配列からなる、請求項４又は５に記載の核酸。

【請求項7】

軽鎖をコードする配列及び重鎖をコードする配列が以下のとおり：
ａ)軽鎖をコードする配列 配列番号69若しくは配列番号71、及び
ｂ)重鎖をコードする配列 配列番号73若しくは配列番号75
又は、
ａ)軽鎖をコードする配列 配列番号77若しくは配列番号79、及び
ｂ)重鎖をコードする配列 配列番号57若しくは配列番号59
である請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項8】

請求項４〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸を含んでなり、該核酸がその発現を可能にするエレメントの制御下にある発現ベクター。

【請求項9】

・ 以下の配列：配列番号71又は79を有する核酸から選択され、その発現を可能にするエレメントの制御下にある第１の核酸、及び
・ 以下の配列：配列番号59又は75を有する核酸から選択され、その発現を可能にするエレメントの制御下にある第２の核酸
を含んでなる請求項８に記載の発現ベクター。

【請求項10】

請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸及び/又は請求項８又は９に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞又は細胞株。

【請求項11】

少なくとも、
・ 請求項１若しくは２に記載のモノクローナル抗体、又は
・ 請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸、又は
・ 請求項８若しくは９に記載のベクター、又は
・ 前記モノクローナル抗体の請求項３に記載のフラグメント
を、医薬的に許容可能なビヒクルと共に含んでなる医薬組成物。

【請求項12】

ワクチン組成物である、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

卵巣ガン患者の治療において、同時、別途又は逐次に使用するための組合せ製剤としての、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を含んでなる第１の医薬製剤と、パクリタキセル又は白金塩である従来の抗ガン化合物を含んでなる第２の医薬製剤とを含んでなる製品。

【請求項14】

前記白金塩がオキサリプラチン、シスプラチン又はカルボプラチンから選択される、請求項１３に記載の製品。

【請求項15】

ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターと関係する病状の治療又は予防に使用する、請求項１若しくは２に記載のモノクローナル抗体、又は前記モノクローナル抗体の請求項３に記載のフラグメント、又は請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項８若しくは９に記載のベクター、又は請求項１０に記載の細胞を含んでなる医薬組成物。

【請求項16】

卵巣ガンの治療又は予防に使用する、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターと関係する病状の診断及び/又はモニタリングに使用する、請求項１若しくは２に記載のモノクローナル抗体、又は前記モノクローナル抗体の請求項３に記載のフラグメントを含んでなる医薬組成物。

【請求項18】

卵巣ガンの診断及び/又はモニタリングに使用する、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

パクリタキセル又は白金塩である従来の抗ガン薬を更に含んでなる、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記白金塩がオキサリプラチン、シスプラチン又はカルボプラチンから選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

・ 請求項１若しくは２に記載のモノクローナル抗体、又は
・ 前記モノクローナル抗体の請求項３に記載のフラグメント、又は
・ 請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸、又は
・ 請求項８若しくは９に記載のベクター、又は
・ 請求項１０に記載の細胞
を少なくとも含んでなる、ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターと関係する病状の診断に使用するキット。

【請求項22】

卵巣ガンの診断に使用する、請求項２１に記載のキット。

【請求項23】

以下の工程：
ａ．患者から事前に取り出した生検を標識する工程
ｂ．請求項１若しくは２に記載のモノクローナル抗体、又は前記モノクローナル抗体の請求項３に記載のフラグメントを用いてヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターの存在を決定する工程
を含んでなる、ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターと関係する病状の診断を補助するデータを取得する方法。

【請求項24】

卵巣ガンの診断を補助するデータを取得する、請求項２３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターを指向する新規な変異ヒト化12G4抗体及びそのフラグメントに関する。

【背景技術】

【0002】

卵巣ガンは、婦人科ガンの主要な原因であり、女性におけるガンの死亡原因の上位５番目であり、以下の３つの組織学的起源を有する：
■ 表面上皮(種々のサブタイプを有する上皮腫瘍)(これは卵巣ガンの85〜90％を占める)■ 性索/間質(顆粒膜腫瘍(卵巣ガン全体の３％))(卵巣腫瘍の約10％を占める)
■ 生殖細胞(卵巣ガンの５％を占める)。
これは、第１ステージの間は一般に無症候性であり、よってそのあだ名は「サイレントキラー」である(La Marca A., Volpe A. 抗-Mullerian hormone and ovarian cancer. Human Reproduction Update, Vol.13, No.3 pp. 265-273, 2007)。

【0003】

４つのステージ及び予後が存在する(FIGO classification: International Federation of Gynaecology and Obstetrics)。ステージ２から生存率が相当減少する：
ステージＩ：卵巣に限定した腫瘍(５年生存率：90〜70％)、
ステージII：１又は２の卵巣に腫瘍、骨盤に拡大(５年生存率：70〜40％)、
ステージIII：１又は２の卵巣に腫瘍、骨盤外に拡大(５年生存率：20％)、
ステージIV：腹膜転移を除く遠位転移(５年生存率：＜10％)、
(Fauci, Braunwaldら，Principles of internal medicine. Harrison's 17th edition / National Cancer Institute cancer.gov / CNGOF (French National Colleges of Gynaecologists and Obstetricians)。

【0004】

卵巣ガンの治療に使用する主要なストラテジは、手術、及び特に一次治療としての、カルボプラチンとパクリタキセルとの混合物のような化学療法である。
最近、セテュキマブ(cetuximab)(これは表皮成長因子レセプター(EGFR)を指向する)のようなモノクローナル抗体もまた開発された(Ozols R. F.ら，Focus on epithelial ovarian cancer, Cancer Cell. 2004, Jan; 5(1): 19-24)。
CA-125を指向するアバゴボマブ(abagovomab)、血管内皮増殖因子(VEGF-A)を指向するアバスチン(Avastin)、又は葉酸レセプターα(FRA)を指向するファーレテュツマブ(farletuzumab)のような他のモノクローナル抗体が現在、第III相である。

【0005】

ヒト抗-ミューラー管ホルモンは、TGF-βファミリーのメンバーである560アミノ酸の糖タンパク質である。これは、ミューラー管の変性を引き起こす、胎生精巣のセルトリ細胞により放出されるホルモンである。
これは、成人では、セルトリ細胞及びライディッヒ細胞(精巣)並びに顆粒膜細胞(卵巣)で発現される。
これは、濾胞形成の調節における成人卵巣の活性において役割を演じる。

【0006】

抗-ミューラー管ホルモンII型レセプター(AMHR-II)は、573アミノ酸のペプチドであり、セリン-スレオニンキナーゼ活性を有する。
これは、ヒト生殖系の発生と関係するミューラー管の退化に関与する。ミューラー管は、男性では萎縮し、前立腺小胞(prostatic vesicle)及び精巣垂を形成するに過ぎないが、女性では存続し、ファローピウス管、子宮及び膣のほとんどを生じる。
このレセプターは、しばしば、ヒト卵巣の腫瘍性上皮細胞に発現する。

【0007】

国際出願WO 2008/053330は、卵巣ガン治療用のAMHR-IIを指向するマウス12G4モノクローナル抗体を記載する。しかし、ヒトにおけるマウスモノクローナル抗体の投与が免疫応答を引き起こすことは当業者に周知である。
この国際出願は、該抗体がキメラ又はヒト化であり得るとも述べているが、それ自体を記載してはいない。
しかし、キメラ抗体もまた免疫反応を誘引する。ヒト化抗体は、僅かに免疫原性であるが、その抗原結合親和性は減少することがあり、結果として活性が弱くなるという欠点を有する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本出願によれば、ヒト化抗体中に存在するアミノ酸の変異により、特にはヒト化抗体のペプチド配列を改変するがヒドロパシー指標(すなわち、疎水性及び電荷)を維持することにより、例えば以下のアミノ酸置換：アルギニン-リジン又はグルタミン酸-アスパラギン酸又はセリン-スレオニン又はグルタミン-アスパラギン又はバリン-ロイシン-イソロイシン置換により、前記親和性を増大させることができる。

【0009】

本発明の目的の１つは、対応する非変異キメラ抗体のものと少なくとも等しい親和性及びAMHR-IIレセプターに関する特異性を有し、免疫応答を誘引しない変異ヒト化12G4抗体又はそのフラグメントを提供することである。
本発明の別の１つの目的はまた、AMHR-IIレセプターの前記特異的抗体を作製する手段を提供することである。
本発明は更に、これら抗体の卵巣ガン治療薬としての使用に関する。

【0010】

本発明は、ヒト化12G4モノクローナル抗体に関し、該抗体は、
ａ)− アミノ酸配列が配列番号２(リーダー無し)若しくは配列番号４(リーダー有り)で表される可変領域と、
− アミノ酸配列が配列番号６若しくは配列番号６と少なくとも80％の相同性を有する配列で表される定常領域と
を含んでなるか又は該両領域からなる軽鎖
ｂ)− アミノ酸配列が配列番号８(リーダー無し)若しくは配列番号10(リーダー有り)で表される可変領域と、
− アミノ酸配列が配列番号12若しくは配列番号12と少なくとも80％の相同性を有する配列で表される定常領域と
を含んでなるか又は該両領域からなる重鎖
を含んでなるか又は該両鎖からなり、該ヒト化12G4モノクローナル抗体は変異しており、軽鎖及び/又は重鎖に少なくとも１つの変異を含み、かつヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプター(AMHRII)に対して、
− アミノ酸配列が配列番号14(リーダー無し)で表される可変領域と、
− アミノ酸配列が配列番号６で表される定常領域
ｂ) − アミノ酸配列が配列番号18(リーダー無し)又は配列番号10(リーダー有り)で表される可変領域と、
− アミノ酸配列が配列番号12で表される定常領域と
からなる重鎖
を含んでなるか又は該両鎖からなるキメラ12G4モノクローナル抗体の該レセプターに対するものと少なくとも等しいK_D、好ましくは10^-7Ｍを下回る、特に10^-8Ｍを下回る、特には10^-9Ｍ〜10^-11Ｍの範囲のK_Dを有する。

【0011】

本発明の抗体はまた、マウス12G4抗体のものの３分の１又は２分の１に少なくとも等しい親和性を示す。
本説明を通して、配列番号の後の括弧中の表現「リーダー有り」は、当該配列がシグナルペプチド(すなわち、当該タンパク質が分泌されることを規定するペプチド)又は該シグナルペプチドをコードする配列を含んでなることを示す。
反対に、括弧中の表現「リーダー無し」は、当該配列がシグナルペプチドも該シグナルペプチドをコードする配列も含まないことを示す。

【0012】

本発明は、本発明の変異ヒト化12G4抗体が、CDR(３つの抗原認識決定領域)中、すなわち抗原への親和性及び結合に重要であり、原則として、同じヒドロパシー指標のアミノ酸の置換のみを許容する領域中に、ヒドロパシー指標が関係しない少なくとも１つの変異((例えば、アルギニン-リジン、グルタミン酸-アスパラギン酸、セリン-スレオニン、グルタミン-アスパラギン又はバリン-ロイシン-イソロイシン)を有するにもかかわらず、依然として、以下の特性を有する：
− 対応するキメラ12G4抗体のものと少なくとも類似するか又はそれより小さくさえあるAMHR-IIレセプターに対するK_D(実施例１に従って決定)を有し、したがって対応するキメラ12G4抗体のものと、又は従来技術の抗体若しくは抗体フラグメントに関して等しいか又はそれより大きい親和性を有する
− AMHR-IIレセプターに対する特異性を有する
− 免疫応答を誘引しないか、又はマウス抗体より小さな反応を誘引する
という本発明者らの知見に基づく。

【0013】

例として、実施例１は、CHO又はYB2/0細胞において産生した本発明の抗体で得られたK_Dを提示する。
本説明を通して、用語「12G4」及び用語「LFB112」(この用語も使用する)は、同じものを指称し、同一抗体を表す。
前記抗体の親和性は、当業者に周知のBIAcoreアッセイにより決定することができる。
本発明において、用語「抗体」とは、免疫グロブリン(獲得免疫応答に関与する四本鎖からなる多量体タンパク質)をいう。
免疫グロブリンは当業者に周知であり、各々が重鎖及び軽鎖からなる２つの二量体のアセンブリからなる。この多量体の複合体は、２つのシステイン間のジスルフィド橋架けによる軽鎖及び重鎖の結合によって組み立てられ、２つの重鎖自体もまた２つのジスルフィド橋架けにより互いに結合している。

【0014】

各重鎖及び各軽鎖は、定常領域及び可変領域からなる。抗体を形成する鎖アセンブリは、特徴的なＹ字型の三次元構造を規定し得、ここで、
− Ｙの基部は、補体及びFcレセプターにより認識される定常領域Fcに相当し、
− Ｙの腕の端部は、それぞれ、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とのアセンブリに相当する。
より正確には、各軽鎖は、可変領域(V_L)及び定常領域(C_L)からなる。各重鎖は可変領域(V_H)と、３つの定常ドメインC_H1、C_H2及びC_H3からなる定常領域とからなる。ドメインC_H2及びC_H3はドメインFcを形成する。
抗体の構造を図１に模式的に示す。

【0015】

軽鎖可変領域は、４つのフレームワーク領域により囲まれた３つの抗原認識決定領域(CDR)からなる。可変領域の三次元折り畳みは、３つのCDRが当該タンパク質の同じ側に曝され、特定抗原を認識する特異的構造の形成を可能にするものである。
抗体の軽鎖又は重鎖可変領域の数珠構造を図２に示す。

【0016】

本発明に記載の抗体は、単離・精製されており、しかもヒト化されているので天然抗体とは異なる。これら抗体は成熟である。すなわち、これら抗体は、抗原の認識を可能にするアドホック(ad hoc)三次元構造を有し、抗原認識に必須の全ての翻訳後修飾(特に、グリコシル化並びに分子内及び分子間ジスルフィド橋架けの形成)を有する。
これらはモノクローナル抗体である。すなわち、これらは、抗体の混合物に相当し、したがって同一タンパク質中の幾つかの抗原決定基を認識することができるポリクローナル抗体とは対照的に、AMHR-IIレセプター中の１つの抗原決定基を唯一認識する。
「キメラモノクローナル抗体」は、本発明においては、構成する各軽鎖及び/又は各重鎖の配列が、少なくとも２つの異なる動物(又はヒト)に由来するハイブリッド配列を含んでなるか又は該配列からなる、単離された抗体を意味する。
特に、キメラ12G4抗体はマウス/ヒトハイブリッドであり、これは、軽鎖及び重鎖の配列の或る領域がマウス12G4免疫グロブリンの配列に由来し、前記重鎖及び軽鎖の残りの配列が１つ(場合によっては幾つか)のヒト免疫グロブリンの配列に由来することを示す。
図18は、キメラ12G4抗体産生用発現ベクターのマップを示す。

【0017】

「ヒト化12G4モノクローナル抗体」は、本発明においては、(特に、マウス)12G4抗体の各軽鎖及び各重鎖のCDRのみが、ヒト抗体の軽鎖及び重鎖にグラフトされている、単離された抗体を意味する。
図19は、ヒト化12G4抗体産生用発現ベクターのマップを示す。
以下では、表現「キメラ12G4抗体」及び「非変異キメラ12G4抗体」は同じ抗体を指称する。
「変異ヒト化12G4モノクローナル抗体」は、本発明においては、軽鎖可変領域及び/又は軽鎖定常領域及び/又は重鎖可変領域又は重鎖定常領域に少なくとも１つの変異がなされているヒト化12G4モノクローナル抗体を意味する。

【0018】

よって、本発明の変異ヒト化モノクローナル抗体の定義は、下記の両方を包含する：
− 上記のような変異ヒト化抗体、特にヒト/マウス抗体の前駆体、及び
− 上記のような変異ヒト化抗体、特にヒト/マウス。
１つの有利な実施形態において、本発明は、軽鎖可変領域の少なくとも１つのCDR中に少なくとも１つの変異を含んでなり、前記レセプターに対して前記キメラ12G4モノクローナル抗体のものと少なくとも等しい親和性を有する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
この実施形態においては、単一の変異が存在する場合、それはCDR1又はCDR2又はCDR3に位置する。
１より多い変異が存在する場合、第２及びその他の変異は、抗体のCDR1及び/又はCDR2及び/又はCDR3及び/又は他の任意の領域に位置することができる。

【0019】

１つの有利な実施形態において、本発明は、軽鎖(VL)のFR領域中に少なくとも１つの変異を更に含んでなる、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
本発明において、本発明者らは、少なくとも１つの変異がヒト化12G4抗体のCDR1又はCDR2又はCDR3中及び軽鎖可変領域(特にFR)中になされたとき、該少なくとも１つの変異は、アミノ酸のヒドロパシー指標が必ずしも適合しないにもかかわらず、該ヒト化抗体の活性の保持を可能にするだけでなく、非変異キメラ抗体のものと少なくとも等しい親和性を有するが免疫応答を引き起こさないか又は起こしても重大でない変異ヒト化抗体の取得をも可能にすることを見出した。

【0020】

１つの有利な実施形態において、本発明は、CDR1中に少なくとも１つの変異を、軽鎖(VL)のFR領域中に少なくとも１つの変異を含んでなる、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
本発明において、本発明者らは、少なくとも１つの変異がヒト化12G4抗体のCDR1中及び軽鎖可変領域(特にFR)中になされたとき、該少なくとも１つの変異はアミノ酸のヒドロパシー指標が必ずしも適合しないにもかかわらず、該ヒト化抗体の活性の保持を可能にするだけでなく、非変異キメラ抗体のものと少なくとも等しい親和性を有するが免疫応答を引き起こさない変異ヒト化抗体の取得をも可能にすることを見出した。

【0021】

１つの有利な実施形態において、本発明は、CDR2中に少なくとも１つの変異を、軽鎖(VL)のFR領域中に少なくとも１つの変異を含んでなる、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
本発明において、本発明者らは、少なくとも１つの変異がヒト化12G4抗体のCDR2中及び軽鎖可変領域(特にFR)中になされたとき、該少なくとも１つの変異は、アミノ酸のヒドロパシー指標が必ずしも適合しないにもかかわらず、該ヒト化抗体の活性の保持を可能にするだけでなく、非変異キメラ抗体のものと少なくとも等しい親和性を有するが免疫応答を引き起こさない変異ヒト化抗体の取得をも可能にすることを見出した。

【0022】

１つの有利な実施形態において、本発明は、CDR3中に少なくとも１つの変異を、軽鎖(VL)のFR領域中に少なくとも１つの変異を含んでなる、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
本発明において、本発明者らは、少なくとも１つの変異がヒト化12G4抗体のCDR3中及び軽鎖可変領域(特にFR)中になされたとき、該少なくとも１つの変異は、アミノ酸のヒドロパシー指標が必ずしも適合しないにもかかわらず、該ヒト化抗体の活性の保持を可能にするだけでなく、非変異キメラ抗体のものと少なくとも等しい親和性を有するが免疫応答を引き起こさない変異ヒト化抗体の取得をも可能にすることを見出した。

【0023】

１つの有利な実施形態において、本発明は、AMHR IIレセプターを発現する細胞、特にCov434、Asc 1及びMETA 2815に対してADCCを有する、特に前記非変異ヒト化12G4モノクローナル抗体の同じ細胞に対するものより大きなADCCを有する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
ADCC(抗体-依存細胞性細胞毒性)は、抗体が抗原を認識すると、抗体のFc部分が、キラー細胞のレセプターFcγに認識される(キラー細胞は、結合後、該抗原を有する細胞を殺傷し得る)機構である。
本発明において、本発明者らは、少なくとも１つの変異がヒト化12G4抗体(この抗体の親和性は、対応するキメラ又はマウス抗体に比して格段に減少している(実施例２))の１以上のCDR中でなされたとき、該少なくとも１つの変異は、CDRが抗原認識に特に重要な領域に相当するにもかかわらず、該ヒト化抗体の活性の保持を可能にするだけでなく、非変異キメラ抗体のものと少なくとも等しい親和性を有し、免疫応答を引き起こさないか又はより小さな反応を引き起こす変異ヒト化抗体の取得をも可能にすることを見出した。

【0024】

本発明に関しては、使用した番号付けは、ScFvフラグメントの番号付けに基づき、ヒト化12G4抗体について図3A及び3Bに示されるように、重鎖は１〜115と番号付けられ、軽鎖は131〜236と番号付けられる(図中、灰色影付きビーズは前記配列に存在しないアミノ酸に相当する)。
２つの鎖は、アミノ酸116〜130を含んでなるリンカーによって結合している。
１つの有利な実施形態において、本発明は、軽鎖可変領域の少なくとも１つのCDR中の前記少なくとも１つの変異が、アミノ酸配列が配列番号２で表される軽鎖可変領域のアミノ酸179〜アミノ酸184を含有するCDRに含まれる領域に位置する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
アミノ酸179〜アミノ酸184を含有する領域は、完全なCDRに相当しない。

【0025】

この実施形態において、抗体が唯一の変異を有する場合、それは、アミノ酸179〜アミノ酸184を含有する軽鎖CDRの領域中に位置する。
この抗体は、当然のことながら、他のCDR中に他の変異を有することができる。
本発明において、本発明者らは、少なくとも１つの変異がヒト化12G4抗体のCDRのアミノ酸179〜184を含む領域中でなされたとき、該少なくとも１つの変異が、該ヒト化抗体の活性の保持を可能にするだけでなく、非変異キメラ抗体のものと少なくとも等しい親和性を有し、免疫応答を引き起こさない変異ヒト化抗体の取得をも可能にすることを見出した。

【0026】

１つの有利な実施形態において、本発明は、アミノ酸179〜アミノ酸184を含有するCDR中の領域に位置する前記少なくとも１つの変異が、以下のアミノ酸置換：S179P、E184K、E184G、E184D、S182Fの少なくとも１つに相当する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
本発明で使用する表記法は、当業者に知られた一文字表記に相当する。
例えば、表記S179Pは、179位のアミノ酸セリンがプロリンで置換されていることを意味する。

【0027】

本発明において、本発明者らは、少なくとも１つの変異がヒト化12G4抗体のCDRのアミノ酸179〜184を含んでなる領域中になされたとき、該少なくとも１つの変異は、置き換わったアミノ酸のヒドロパシー指標が必ずしも適合しないにもかかわらず、該ヒト化抗体の活性の保持を可能にするだけでなく、非変異キメラ抗体のものと少なくとも等しい親和性を有する変異ヒト化抗体の取得をも可能にすることを見出した。
例として、図17は、本発明による変異ヒト化抗体の、AMHR-IIレセプターに対する結合親和性を示す。6B_78抗体は、軽鎖可変領域のCDR中に位置する唯一の変異、グルタミン酸がリジンで置換された変異(E184K)(すなわち、酸性アミノ酸の塩基性アミノ酸での置換)を有し、結果として(反対電荷であるので)全く異なる電荷を有するが、依然として活性を示し、特に、非変異ヒト化12G4抗体よりかなり良好で、非変異キメラ12G4抗体のものと等しい親和性を示し、免疫応答を引き起こさない。

【0028】

１つの有利な実施形態において、本発明は、少なくとも１つの変異を軽鎖(VL)のFR領域中に更に含んでなる、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
本発明において、本発明者らは、少なくとも１つの変異がヒト化12G4抗体のCDRのアミノ酸179〜184を含む領域中及び軽鎖可変領域中、特にFR中になされたとき、該少なくとも１つの変異は、アミノ酸のヒドロパシー指標が必ずしも適合しないにもかかわらず、該ヒト化抗体の活性の保持を可能にするだけでなく、非変異キメラ抗体のものと少なくとも等しい親和性を有し、免疫応答を引き起こさない変異ヒト化抗体の取得をも可能にすることを見出した。

【0029】

１つの有利な実施形態において、本発明は、少なくとも１つの変異を重鎖中に更に含んでなる、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
本発明において、本発明者らは、少なくとも１つの変異がヒト化12G4抗体のCDRのアミノ酸179〜184を含む領域中、軽鎖可変領域中、特にFR中及び重鎖中になされたとき、該少なくとも１つの変異は、アミノ酸のヒドロパシー指標が必ずしも適合しないにもかかわらず、該ヒト化抗体の活性の保持を可能にするだけでなく、非変異キメラ抗体のものと少なくとも等しい親和性を有し、免疫応答を引き起こさない変異ヒト化抗体の取得をも可能にすることを見出した。

【0030】

１つの有利な実施形態において、本発明は、軽鎖(VL)のFR領域中の前記少なくとも１つの変異がアミノ酸179〜アミノ酸184を含有する領域に隣接するFR領域中に位置する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
例として、図17並びに表Ｉ及びVII(ELISAにより決定した標的AMHRII-Fcへの固定)は、本発明による変異ヒト化抗体のAMHR-IIレセプターへの結合親和性を提示する。

【0031】

よって、3C_23抗体は、以下の３つの変異：
− 軽鎖可変領域のCDR中の、セリンがプロリンで置換された変異(S179P)(すなわち、親水性アミノ酸の疎水性アミノ酸での置換)
− 軽鎖の可変領域中、特にFR中の、変異(I177T)(すなわち、親水性で、更には国際出願WO 2008/053330によればヒドロパシー指標が全く異なった値(イソロイシンについては+4.5、スレオニンについては-0.7)であるアミノ酸での疎水性アミノ酸の置換)、及び
− 重鎖中の変異(Q3R)(すなわち、グルタミンのアルギニンでの置換；ヒドロパシー指標の値は、国際出願WO 2008/053330によれば、グルタミンの-3.5からアルギニンの-4.5に変化する)
を有し、更に、非変異ヒト化12G4抗体のものよりかなり良好で、非変異キメラ12G4抗体のものより大きな親和性を有する。

【0032】

更に、3C_23K抗体は、3C_23抗体の変異とは別に、軽鎖可変領域のCDR中に、グルタミン酸がリジンで置換された第２の変異(E184K)(すなわち、酸性アミノ酸の塩基性アミノ酸での置換)もまた有し、結果として(反対の符号であるので)全く異なる電荷を有するにもかかわらず、依然として活性、特に、非変異ヒト化12G4抗体のものよりかなり良好で、非変異キメラ12G4抗体のものより大きい親和性を示し、免疫応答を引き起こさない。

【0033】

１つの有利な実施形態において、本発明は、軽鎖(VL)のFR領域中の前記少なくとも１つの変異が、以下のアミノ酸置換：I132T、A143T、T150A、S158P、L175Q、I177T、Y178H、V187A、S192T、G197D、F212Sの少なくとも１つに相当する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、重鎖中の前記少なくとも１つの変異が、以下のアミノ酸置換：Q1E、Q3E、Q3R、Q6E、A9T、V11A、K12R、K13R、K19E、V20A、A24G、A24V、A24T、Q39E、A40V、S31G、L45P、D56N、A76T、A79T、R87G、T58A、Q62R、V67M、I70N、T74A、S77P、A79T、S88P、E89D、F102S、A103T、L110P、S114Tの少なくとも１つに相当する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。

【0034】

１つの有利な実施形態において、本発明は、下記：
ａ)１つのCDR中に位置する以下のアミノ酸置換：S179P、E184K、E184G、E184D、S182Fの少なくとも１つがなされている、アミノ酸配列が配列番号２で表される可変領域、又は
１つのCDR中に位置する以下のアミノ酸置換：S179P、E184K、E184G、E184D、S182Fの少なくとも１つ、及び領域FR中に位置する以下のアミノ酸置換：I132T、A143T、T150A、S158P、L175Q、Y178H、V187A、S192T、G197D、F212Sの少なくとも１つがなされている、アミノ酸配列が配列番号２で表される可変領域
と、アミノ酸配列が配列番号６で表される定常領域とを含んでなるか若しくは該両領域からなる軽鎖
ｂ)以下のアミノ酸置換：Q1E、Q3E、Q3R、Q6E、A9T、V11A、K12R、K13R、K19E、V20A、A24G、A24V、A24T、Q39E、A40V、S31G、L45P、D56N、A76T、A79T、R87G、T58A、Q62R、V67M、I70N、T74A、S77P、A79T、S88P、E89D、F102S、A103T、L110P、S114Tの少なくとも１つがなされている、アミノ酸配列が配列番号58で表される重鎖
から選択される軽鎖及び重鎖を有する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。

【0035】

実施例３の表VIIは、得られた種々のクローン及びそれらの置換を提示する。この表はまた、ヒドロパシー指標は、変異に応じてかなり変化するが、抗原についての親和性及び/又は活性の喪失を導かず、或る種のクローンについて、対応するキメラ抗体に比して親和性の増大(１以上の比 本発明のAb/キメラ抗体)が得られることを可能にさえすることを示す。
この実施形態において、事前に得られた２つの抗体の組合せに由来し、非変異キメラ12G4抗体に比してAMHR-IIレセプターに関する親和性及び活性が更に増大した抗体を構成することが可能である。

【0036】

１つの有利な実施形態において、本発明は、下記：
ａ)アミノ酸配列が
− 配列番号22(リーダー無し)若しくは配列番号24(リーダー有り)、又は
− 配列番号30(リーダー無し)若しくは配列番号32(リーダー有り)、又は
− 配列番号34(リーダー無し)若しくは配列番号36(リーダー有り)、又は
− 配列番号46(リーダー無し)若しくは配列番号48(リーダー有り)
で表される可変領域と、アミノ酸配列が配列番号６で表される定常領域とを含んでなるか又は該両領域からなる軽鎖
ｂ)アミノ酸配列が
− 配列番号38(リーダー無し),若しくは配列番号40(リーダー有り)、
− 配列番号26(リーダー無し),若しくは配列番号28(リーダー有り)、
− 配列番号８(リーダー無し),若しくは配列番号10(リーダー有り)、
− 配列番号42(リーダー無し),若しくは配列番号44(リーダー有り)、
− 配列番号50(リーダー無し),若しくは配列番号52(リーダー有り)
で表される可変領域と、アミノ酸配列が配列番号12で表される定常領域とを含んでなるか又は該両領域からなる重鎖
から選択される軽鎖及び重鎖を有する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体に関する。

【0037】

１つの有利な実施形態において、本発明は、
ａ)− 配列番号70(リーダー無し)若しくは配列番号72(リーダー有り)で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
ｂ)− 配列番号74(リーダー無し)若しくは配列番号76(リーダー有り)で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と
を有する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体(3C_23抗体)
又は
ａ)− 配列番号78(リーダー無し)若しくは配列番号80(リーダー有り)で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
ｂ)− 配列番号58(リーダー無し)若しくは配列番号60(リーダー有り)で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と
を有する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体(6B_78抗体)
又は
ａ)− 配列番号82(リーダー無し)若しくは配列番号84(リーダー有り)で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
ｂ)− 配列番号86(リーダー無し)若しくは配列番号88(リーダー有り)で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と
を有する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体(3C_23K抗体)
又は
ａ)− 配列番号78(リーダー無し)若しくは配列番号80(リーダー有り)で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
ｂ)− 配列番号90(リーダー無し)若しくは配列番号92(リーダー有り)で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と
を有する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体(4C_35抗体)
又は
ａ)− 配列番号94(リーダー無し)若しくは配列番号96(リーダー有り)で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖と、
ｂ)− 配列番号98(リーダー無し)若しくは配列番号100(リーダー有り)で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と
を有する、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体(5B_42抗体)
に関する。

【0038】

別の１つの観点によれば、本発明は、Fv、Fab、F(ab')₂、Fab'、dsFv、scFv、Sc(Fv)₂、「ダイアボディ」からなるフラグメント群より選択される、上記のような変異ヒト化12G4モノクローナル抗体のフラグメントに関する。
別の１つの観点によれば、本発明は、上記のモノクローナル抗体の軽鎖をコードする配列、及び/又は上記のモノクローナル抗体の重鎖をコードする配列を含んでなるか若しくは該配列からなる核酸に関する。

【0039】

１つの有利な実施形態において、本発明は、軽鎖をコードする配列が、以下の配列：
ａ)１つのCDR中で以下のアミノ酸置換：S179P、E184K、E184G、E184D、S182Fの１以上を可能にする少なくとも１つのコドン置換がなされている、配列番号53で表される軽鎖可変領域をコードする配列、又は
ｂ)− １つのCDR中で以下のアミノ酸置換：S179P、E184K、E184G、E184D、S182Fの１以上を可能にする少なくとも１つのコドン置換、及び
− １つのFR中で以下のアミノ酸置換：I132T、A143T、T150A、S158P、L175Q、Y178H、V187A、S192T、G197D、F212Sの１以上を可能にする少なくとも１つのコドンの少なくとも１つの置換
がなされている、配列番号53で表される軽鎖可変領域をコードする配列
と、配列番号５で表される定常領域をコードする配列とを含んでなるか又は該両配列からなる上記核酸に関する。

【0040】

１つの有利な実施形態において、本発明は、重鎖をコードする配列が、以下の配列：
ａ)以下のアミノ酸置換：Q1E、Q3E、Q3R、Q6E、A9T、V11A、K12R、K13R、K19E、V20A、A24G、A24V、A24T、Q39E、A40V、S31G、L45P、D56N、A76T、A79T、R87G、T58A、Q62R、V67M、I70N、T74A、S77P、A79T、S88P、E89D、F102S、A103T、L110P、S114Tの１以上を可能にする少なくとも１つのコドン置換がなされている、配列番号57を含んでなるか又は該配列からなる、上記核酸に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、上記の軽鎖及び重鎖を含んでなる上記核酸に関する。

【0041】

１つの有利な実施形態において、本発明は、軽鎖をコードする配列が、以下：
ａ)可変領域：
− 配列番号21(リーダー無し)若しくは配列番号23(リーダー有り)、又は
− 配列番号29(リーダー無し)若しくは配列番号31(リーダー有り)、又は
− 配列番号33(リーダー無し)若しくは配列番号35(リーダー有り)、又は
− 配列番号45(リーダー無し)若しくは配列番号47(リーダー有り)、又は
ｂ)定常領域
− 配列番号５
から選択される 可変領域をコードする配列及び定常領域をコードする配列を含んでなるか又は該両配列からなる、上記の核酸に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、重鎖をコードする配列が、以下：
ａ)可変領域：
− 配列番号25(リーダー無し)若しくは配列番号27(リーダー有り)、又は
− 配列番号７(リーダー無し)若しくは配列番号９(リーダー有り)、又は
− 配列番号37(リーダー無し)若しくは配列番号39(リーダー有り)、又は
− 配列番号41(リーダー無し)若しくは配列番号43(リーダー有り)、又は
− 配列番号49(リーダー無し)若しくは配列番号51(リーダー有り)、
ｂ)定常領域
− 配列番号11
から選択される 可変領域をコードする配列及び定常領域をコードする配列を含んでなるか又は該両配列からなる、上記の核酸に関する。

【0042】

１つの有利な実施形態において、本発明は、軽鎖をコードする配列が以下の配列：
− 配列番号69(リーダー無し)若しくは配列番号71(リーダー有り)、又は
− 配列番号77(リーダー無し)若しくは配列番号79(リーダー有り)、又は
− 配列番号81(リーダー無し)若しくは配列番号83(リーダー有り)、又は
− 配列番号93(リーダー無し)若しくは配列番号95(リーダー有り)、
から選択され、重鎖をコードする配列が以下の配列：
− 配列番号73(リーダー無し)若しくは配列番号75(リーダー有り)、又は
− 配列番号57(リーダー無し)若しくは配列番号59(リーダー有り)、又は
− 配列番号85(リーダー無し)若しくは配列番号87(リーダー有り)、又は
− 配列番号89(リーダー無し)若しくは配列番号91(リーダー有り)、又は
− 配列番号97(リーダー無し)若しくは配列番号99(リーダー有り)、
から選択される、上記核酸に関する。

【0043】

１つの有利な実施形態において、本発明は、軽鎖をコードする配列及び重鎖をコードする配列が
ａ)軽鎖をコードする配列 配列番号69(リーダー無し)若しくは配列番号71(リーダー有り)及び
ｂ)重鎖をコードする配列 配列番号73(リーダー無し)若しくは配列番号75(リーダー有り)である上記核酸(3C_23抗体)、又は、
ａ)軽鎖をコードする配列 配列番号77(リーダー無し)若しくは配列番号79(リーダー有り)及び
ｂ)重鎖をコードする配列 配列番号57(リーダー無し)若しくは配列番号59(リーダー有り)である上記核酸(6B_78抗体)、又は、
ａ)軽鎖をコードする配列 配列番号81(リーダー無し)若しくは配列番号83(リーダー有り)及び
ｂ)重鎖をコードする配列 配列番号85(リーダー無し)若しくは配列番号87(リーダー有り)である上記核酸(3C_23K抗体)、又は、
ａ)軽鎖をコードする配列 配列番号77(リーダー無し)若しくは配列番号79(リーダー有り)及び
ｂ)重鎖をコードする配列 配列番号89(リーダー無し)若しくは配列番号91(リーダー有り)である上記核酸(4C_35抗体)、又は、
ａ)軽鎖をコードする配列 配列番号93(リーダー無し)若しくは配列番号95(リーダー有り)、及び
ｂ)重鎖をコードする配列 配列番号97(リーダー無し)若しくは配列番号99(リーダー有り)である上記核酸(5B_42抗体)
に関する。

【0044】

別の１つの観点によれば、本発明は、上記核酸の少なくとも１つを含んでなり、該核酸がその発現を可能にするエレメントの制御下にある発現ベクターに関する。
「発現ベクター」は、本発明においては、少なくとも１つの生物における複製(重複化)を可能にするエレメントを有するDNA分子を規定する。複製を可能にするこれらエレメントは、特に、酵母若しくは細菌における複製起点、又はウイルスの複製を制御するエレメントである。
本発明によるベクターは、特には、プラスミド、ファージ、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、複製可能ウイルス又は組込み型ウイルスの改変ゲノムなどである。
これらベクターは、制御するヌクレオチド配列の発現(すなわち、RNAへの転写)を可能にするヌクレオチド配列を有することから、「発現ベクター」と呼ばれる。

【0045】

本発明において、ベクター中に含有される前記核酸配列は、「その発現を可能にするエレメントの制御下」に配置される。これは、発現ベクターが、ウイルスのプロモーター(例えば、シミアンウイルスSV40若しくはサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーター又はラウス肉腫ウイルス(RSV)のプロモーター配列、特に、TATAAボックスを含んでなる配列又はプロモーター)のような転写開始配列を少なくとも１つ有することを意味する。更に、前記ベクターはまた、哺乳動物遺伝子、特にヒト遺伝子に由来する少なくとも１つの転写終止配列、特にポリアデニル化配列を有する。
ベクター中に含有されるヌクレオチド配列の発現に不可欠であるこれら配列には、前記配列の発現を調節又は改変するための他の配列を付加し得る。非限定的なリストには以下が含まれる：哺乳動物、特にヒトの遺伝子のイントロン、エンハンサータイプの転写調節配列、又は哺乳動物、特にヒトの遺伝子の、転写されているが翻訳されていない配列。

【0046】

本発明の１つの有利な実施形態は、以下の配列：配列番号59、71、75、79、83、87、91、95又は99を含んでなる核酸から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる、上記の発現ベクターに関する。
別の１つの有利な実施形態において、本発明は、
・ 以下の配列： 配列番号71、79、83又は95を有する核酸から選択され、その発現を可能にするエレメントの制御下にある第１の核酸、及び
・ 以下の配列：配列番号59、75、87、91又は99を有する核酸から選択され、その発現を可能にするエレメントの制御下にある第２の核酸
を含んでなる、上記の発現ベクターに関する。

【0047】

したがって、この発現ベクターは、２つの前記核酸配列を含んでなり、より具体的には上記モノクローナル抗体の軽鎖をコードする核酸配列及び上記モノクローナル抗体の重鎖をコードする核酸配列を含んでなる。
好ましくは、発現ベクターは、上記モノクローナル抗体の軽鎖をコードする核酸配列の発現を可能にする第１のエレメント及び上記モノクローナル抗体の重鎖をコードする核酸配列の発現を可能にする第２のエレメントを含有し、前記核酸配列の発現を可能にする第１のエレメント及び第２のエレメントは、同一であっても異なってもよいが、好ましくは同一である。これら制御エレメントは、特に、ウイルスRSVの長末端反復(LTR)配列である。

【0048】

本発明の別の１つの実施形態は、少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子を含んでなる上記発現ベクターに関する。
「少なくとも１つの耐性遺伝子」は、本発明においては、発現ベクターが１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つ又は６つの抗生物質耐性遺伝子を含有することができることを意味する。
「抗生物質耐性遺伝子」は、本発明においては、その発現産物が細胞に対して細胞分裂停止効果(増殖の阻害)又は細胞溶解効果(細胞死)を発揮する遺伝子を規定する。本発明に係る抗生物質は、特には原核細胞に対して効果を有するが、酵母、植物、昆虫、両生類又は哺乳動物にかかわらず、真核細胞に対して効果を有することもある。

【0049】

より具体的には、発現ベクターは、原核細胞に特異的な抗生物質耐性遺伝子及び真核細胞に特異的な少なくとも１つ、好ましくは２つの抗生物質耐性遺伝子を有する。
原核細胞に特異的な抗生物質としては：アンピシリン、テトラサイクリン及びその誘導体、ハイグロマイシン、カナマイシンなどが挙げられる。真核細胞に特異的な抗生物質として：G418、ジェネテシン(G418の塩)、ピューロマイシン、メトトレキサート、ブラスチシジンなどが挙げられる。

【0050】

重鎖及び軽鎖をコードする興味対象の転写単位(TU)が、cDNAの形態で、RSVプロモーターの依存性下にクローニングされる。このプロモーターは、ラウス肉腫ウイルスのLTR(長末端反復)に相当し、これは、5'領域にエンハンサーエレメントを含有する。
オルタナティブスプライシングに最適化され、5'側のヒトβ-グロビンから単離された
ドナー配列及び3'側の免疫グロブリンの重鎖可変領域の遺伝子に由来するアクセプター配列から構成された人工イントロンが、プロモーターの直ぐ3'側にクローニングされる。興味対象のTUは、重鎖についてはヒト起源(hGH)の成長ホルモン(GH)遺伝子に、軽鎖についてはウシ起源の成長ホルモン(bGH)遺伝子に由来するポリアデニル化配列で終止する。ポリＡの選択におけるこの起源の相違は、興味対象の遺伝子間の組換えを制限する目的を有する。LTRRSVプロモーター、キメライントロン、cDNA及びポリＡ配列のこの組合せは、YB2/0細胞株における高い転写及び翻訳活性を付与するので、選択した。

【0051】

発現ベクターは、興味対象のTUに加えて、化学分子に対する抵抗性のための幾つかのTUを含有する。
Bla遺伝子：この遺伝子(ベクターの制限マップ中でAmpと呼ばれる)は、細菌中の酵素β-ラクタマーゼを発現し(原核生物プロモーター)、アンピシリンに対する抵抗性を付与する。
Neo遺伝子：この遺伝子は、プロモーターSV40の制御下に酵素npt II(ネオマイシン-ホスホトランスフェラーゼII)をコードし、この遺伝子を発現するトランスフェクト哺乳動物細胞に、種々の抗生物質、例えばネオマイシン、カナマイシン又はG418に対する抵抗性を付与する。
Dhfr遺伝子：この遺伝子は、プロモーターSV40の制御下に酵素DHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)をコードし、メトトレキサート(MTX)に対する抵抗性を付与する。この方法は、MTXの濃度を増大させることによる遺伝子増幅に使用することができ、したがってトランスフェクト細胞による抗体産生の増加を生じ得る。

【0052】

図18〜22は、クローン3C_23、6B_78、3C_23K、4C_35及び5B_42を作製するために使用した発現ベクターのマップを示す。

【0053】

別の１つの観点において、本発明は、上記核酸及び/又は上記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞又は細胞株に関する。
具体的には、前記細胞又は細胞株は、
・ 25％未満のアポトーシスを示し、
・ 細胞分裂の間に安定であり、
・ 少なくとも14μg/mlの上記モノクローナル抗体を分泌する
点で特徴付けられる。
細胞安定性の概念は、本発明によるモノクローナル抗体の発現を可能にする少なくとも１つのベクターを含有する細胞に由来するクローン化細胞のクローニングから生じる細胞が、種々の分裂の間、抗生物質耐性を保存し、モノクローナル抗体を産生することができることである。

【0054】

更に別の１つの観点において、本発明は、少なくとも、
・ 上記モノクローナル抗体、又は
・ 上記核酸、又は
・ 上記ベクター、又は
・ 上記モノクローナル抗体のフラグメント
を、医薬的に許容可能なビヒクルと共に含んでなる医薬組成物、特にワクチン組成物に関する。
有利には、本発明は、少なくとも１つの上記モノクローナル抗体を医薬的に許容可能なビヒクルと共に含んでなる医薬組成物、特にワクチン組成物に関する。

【0055】

活性成分の投薬量は、特に、投与方法に依存し、当業者により容易に決定される。
「医薬的に許容可能なビヒクル」とは、細胞、細胞培養物、組織又は生物のような生物学的系と共存可能な非毒性の材料をいう。
治療有効量(単位用量)は、週１回以上の投与で数週間又は数ヶ月間の、0.01mg/kgから500mg/kgまで、好ましくは0.1mg/kgから500mg/kgまで、好ましくは0.1mg/kgから100mg/kgまで、好ましくは0.1mg/kgから20mg/kgまで、好ましくは0.1mg/kgから10mg/kg、より好ましくは1mg/kgから10mg/kgまで変化し得る。
更に、治療有効量(単位用量)は、週１回以上の投与で数週間又は数ヶ月間の、0.2mg/m²から10g/m²まで、好ましくは0.2mg/m²から１mg/m²まで、好ましくは２mg/m²から１g/m²まで、好ましくは20mg/m²から１g/m²、より好ましくは20mg/m²から0.5g/m²まで変化し得る。

【0056】

本発明の医薬組成物は、具体的には、(特に注射又は穏やかな灌流により)静脈内に、皮下に、全身に、浸潤により局所に、経口で、又はエアロゾルにより呼吸若しくは肺経路で投与することができる。
非経口投与用の調製物は、滅菌の水性又は非水性溶液、懸濁液又はエマルジョンを含むことができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油(例えばオリーブ油）、又は注射可能な有機エステル(例えばオレイン酸エチル）である。水性ビヒクルは、水、アルコール/水溶液、エマルジョン又は懸濁液を含む。

【0057】

本発明の医薬組成物の有利な医薬形態は、経口経路により投与することができ、
・ 上記モノクローナル抗体、又は
・ 上記核酸、又は
・ 上記発現ベクター、又は
・ 前記モノクローナル抗体の上記フラグメント
を賦形剤と共に、噴霧剤の存在下又は非存在下に含む。

【0058】

本発明の１つの実施形態において、エアロゾルは、変異ヒト化抗体及び賦形剤を含有する液体の形態である。賦形剤は、ほとんどの場合、アルコールであるが、当業者に公知の任意の他の賦形剤を本発明に関連して使用することができる。液体形態のエアロゾルは、噴霧剤ガス、例えばクロロフルオロカーボン(CFC)又はヒドロフルオロカーボン(HFA)と組み合わせることができる。
液体形態のエアロゾルはまた、液体微小粒子及び賦形剤からなることもできる。この場合、賦形剤は、合成ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ラクトース又はヒドロキシエチルデンプン(HES)から選択することができる。微小粒子は、その後、注入器(insufflator)を用いて投与される。

【0059】

本発明の別の１つの実施形態において、エアロゾルは粉体の形態である。粉体は、１〜10μm、好ましくは９μm未満、好ましくは５μm未満のサイズの粒子から構成される。非限定的な例として、乾燥粉末を取得するための以下の方法を使用することができる：超音波の有方向沈降(ultrasound, directed precipitation)による、凍結乾燥又は結晶化を伴う噴霧。
エアロゾルは、液体形態か又は固体形態かに依存して、空気式、超音波式若しくは篩型であり得るネブライザーを用いるか、又は液体製剤については(加圧液体型、機械式、電気流体力学的、加熱型の)計量エアロゾルを用いるか、又は固体製剤については吸入器を用いて投与される(Reychler G., Dessanges JF及びVecellio L, Rev. Mal. Respir, 2007; 24: 1013-1023)。

【0060】

別の１つの観点によれば、本発明は、ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターに関係する疾患、特には
卵巣ガン、特に転移卵巣ガン、漿液性ガン、副腎腫、類内膜、膠状上皮、
前立腺ガン、
生殖細胞ガン、
子宮内膜ガン、
子宮の悪性混合ミュラー腫瘍、
平滑筋肉腫、
子宮内膜間質性肉腫
の患者の治療において、同時、別々又は逐次に使用するための組合せ調製物として、上記モノクローナル抗体を含む第１の医薬調製物と、従来の抗ガン剤化合物、特にパクリタキセル又は白金塩、特にはオキサリプラチン、シスプラチン若しくはカルボプラチンを含む第２の医薬調製物とを含んでなる生成物に関する。

【0061】

別の１つの観点によれば、本発明は、少なくとも：
・ 上記モノクローナル抗体、又は
・ 前記モノクローナル抗体の上記フラグメント、又は
・ 上記核酸、又は
・ 上記ベクター、又は
・ 上記細胞
の、ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターに関係する疾患、特に：
卵巣ガン、特には転移卵巣ガン、漿液性ガン、副腎腫、類内膜、膠状上皮、
前立腺ガン、
生殖細胞ガン、
子宮内膜ガン、
子宮の悪性混合ミュラー腫瘍、
平滑筋肉腫、
子宮内膜間質性肉腫
の治療又は予防を意図する医薬を製造するための使用に関する。

【0062】

「治療」は、症状が認識できる発症した病状を処置することを意味する。「予防」は、前記病状の発症を防ぐことを意味する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、上記抗体又はその上記フラグメントの、卵巣ガンを診断し、及び/又はモニターするための使用に関する。
１つの有利な実施形態において、本発明は、従来の抗ガン剤薬、特にはパクリタキセル、又は白金塩、特にはオキサリプラチン、シスプラチン若しくはカルボプラチンを追加的に含んでなる上記抗体又はその上記フラグメントの使用に関する。

【0063】

別の１つの観点によれば、本発明は：
ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターに関係する病状、特に：
卵巣ガン、特には転移卵巣ガン、漿液性ガン、副腎腫、類内膜、膠状上皮、
前立腺ガン、
生殖細胞ガン、
子宮内膜ガン、
子宮の悪性混合ミュラー腫瘍、
平滑筋肉腫、
子宮内膜間質性肉腫
の治療又は予防に使用するための、
・ 上記モノクローナル抗体、又は
・ 前記モノクローナル抗体の上記フラグメント、又は
・ 上記核酸、又は
・ 上記ベクター、又は
・ 上記細胞,
に関する。

【0064】

１つの有利な実施形態において、上記モノクローナル抗体又はその上記フラグメントは、ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターに関係するガン、特に：
卵巣ガン、特には転移卵巣ガン、漿液性ガン、副腎腫、類内膜、膠状上皮、
前立腺ガン、
生殖細胞ガン、
子宮内膜ガン、
子宮の悪性混合ミュラー腫瘍、
平滑筋肉腫、
子宮内膜間質性肉腫
を診断し、及び/又はモニターするために使用する。
１つの有利な実施形態において、上記モノクローナル抗体若しくはその上記フラグメント、又は上記核酸又は上記ベクター又は上記細胞は、従来の抗ガン剤薬、特にはパクリタキセル、又は白金塩、特にはオキサリプラチン、シスプラチン若しくはカルボプラチンを追加的に含んでなる。

【0065】

別の１つの観点によれば、本発明は、少なくとも：
・ 上記モノクローナル抗体、又は
・ 前記モノクローナル抗体の上記フラグメント、又は
・ 上記核酸、又は
・ 上記ベクター、又は
・ 上記細胞,
を含んでなる、ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターに関係する病状、特には卵巣ガンの診断に使用するキットに関する。

【0066】

別の１つの観点によれば、本発明は、以下の工程：
ａ．患者から事前に取得した生検を標識する工程、
ｂ．ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターの存在を決定する工程
を含んでなる、ヒト生物学的サンプルについて、ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターに関係する病状、特には卵巣ガンを診断する方法に関する。

【0067】

別の１つの観点によれば、本発明は、以下の工程：
ａ．患者から生検を取得する工程、
ｂ．生検を標識する工程、
ｃ．ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターの存在を決定する工程
を含んでなる、ヒト生物学的サンプルについて、ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターに関係する病状、特には卵巣ガンを診断する方法に関する。
生検の標識は当業者に周知の技法に従って行う。
レセプターの存在は、当業者に周知の技法、例えばイムノアッセイ、結合などにより決定することができる。

【0068】

別の１つの観点によれば、本発明は、以下の工程：
ａ．患者から生検を取得する工程、
ｂ．生検を標識する工程、
ｃ．ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターの存在を決定する工程、
ｄ．ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターの存在が決定された場合、
ｉ． 上記モノクローナル抗体、又は
ii. 前記モノクローナル抗体の上記フラグメント、又は
iii. 上記核酸、又は
iv. 上記ベクター、又は
v. 上記細胞
で患者を治療する工程
を含んでなる、ヒト生物学的サンプルについて、ヒト抗-ミューラー管ホルモンII型レセプターに関係する病状、特には卵巣ガンを治療する方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0069】

【図1】図１は、抗体の模式図に相当する。黒色の部分は重鎖定常部分に相当し、濃灰色の部分は軽鎖定常部分に相当し、淡灰色の部分は重鎖可変部分に相当し、白色の部分は軽鎖可変部分に相当する。-S-S-は、２つのシステイン間に樹立されたジスルフィド橋架けを表す。CDR及びフレームワーク領域を矢印で示す。Fab及びFcフラグメントも示す。

【図2】図２は、免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖の可変部分のアミノ酸配列の数珠様模式図に相当する。黒色のビーズはフレームワーク領域を形成するアミノ酸に相当し、灰色のビーズはCDRを表すアミノ酸に相当する。

【図3】図３は、ヒト化12G4抗体の重鎖可変部分のアミノ酸配列(図3A：アミノ酸１〜115、配列番号８)及び軽鎖可変部分のアミノ酸配列(図3B：アミノ酸131〜236、配列番号２)の数珠様模式図に相当し、番号付けは変異の位置を規定するために採用した。灰色影付きビーズは、配列中に存在しないため番号付けでカウントされないアミノ酸に相当する。

【図4】図４は、キメラ12G4抗体の重鎖可変部分のアミノ酸配列(配列番号66)の数珠様模式図に相当する。

【図5】図５は、キメラ12G4抗体の軽鎖可変部分のアミノ酸配列(配列番号62)の数珠様模式図に相当する。

【図6】図６は、非変異ヒト化12G4抗体及び変異ヒト化12G4抗体(6B_78)の重鎖可変部分のアミノ酸配列(それぞれ配列番号58及び配列番号58)の数珠様模式図に相当する。

【図7】図７は、非変異ヒト化12G4抗体の軽鎖可変部分のアミノ酸配列(配列番号54)の数珠様模式図に相当する。

【図8】図８は、変異ヒト化12G4抗体(3C_23)の重鎖可変部分のアミノ酸配列(配列番号74)の数珠様模式図に相当する。

【図9】図９は、変異ヒト化12G4抗体(3C_23)の軽鎖可変部分のアミノ酸配列(配列番号70)の数珠様模式図に相当する。

【図10】図10は、変異ヒト化12G4抗体の軽鎖可変部分(6B_78)のアミノ酸配列(配列番号78)の数珠様模式図に相当する。

【図11】図11は、変異ヒト化12G4抗体(3C_23K)の重鎖可変部分のアミノ酸配列(配列番号86)の数珠様模式図に相当する。

【図12】図12は、変異ヒト化12G4抗体(3C_23K)の軽鎖可変部分のアミノ酸配列(配列番号82)の数珠様模式図に相当する。

【図13】図13は、変異ヒト化12G4抗体(4C_35)の重鎖可変部分のアミノ酸配列(配列番号90)の数珠様模式図に相当する。

【図14】図14は、変異ヒト化12G4抗体(4C_35)の軽鎖可変部分のアミノ酸配列(配列番号78)の数珠様模式図に相当する。

【図15】図15は、変異ヒト化12G4抗体(5B_42)の重鎖可変部分のアミノ酸配列(配列番号98)の数珠様模式図に相当する。

【図16】図16は、変異ヒト化12G4抗体(5B_42)の軽鎖可変部分のアミノ酸配列(配列番号94)の数珠様模式図に相当する。

【図17】図17は、本発明による変異抗体(Fab)で得られた、従来のELISAアッセイにおけるAMHR-IIレセプターに対する抗体結合親和性の測定を表す。Ｘ軸は(Fab)の濃度をμg/mlで示し、Ｙ軸は450nmのODを示す。中抜き白丸印で示す点線曲線は非変異ヒト化12G4抗体の結合を表す。黒塗り三角印で示す曲線は、軽鎖可変領域のCDR中に変異(E184K)を有する変異ヒト化12G4抗体(6B_78抗体)の結合を表す。中抜き白三角印で示す曲線は、軽鎖可変領域のCDR中に変異(S179P)を、軽鎖可変領域のFR領域中に変異(I177T)を、重鎖可変領域中に変異(Q3R)を有する変異ヒト化12G4抗体(3C_23抗体)の結合を表す。中抜き白丸印で示す曲線は、軽鎖可変領域のCDR中に変異(E184K)を、軽鎖可変領域のCDR中に変異(S179P)を、軽鎖可変領域のFR領域中に変異(I177T)を、重鎖可変領域中に変異(Q3R)を有する変異ヒト化12G4抗体(3C_23K抗体)の結合を表す。黒塗り丸印で示す曲線は非変異キメラ12G4抗体の結合を表す。

【図18】図18は、リーダーVH AMHR-IIが重鎖可変領域(VH AMHR-II)に融合し、重鎖可変領域自体はヒト免疫グロブリンの定常領域(CH T125)に融合している重鎖と、リーダーVK AMHR-IIが軽鎖可変領域(VK AMHR-II)に融合し、軽鎖可変領域自体はヒト免疫グロブリンの定常領域(CK T125)に融合している軽鎖とを含有するキメラ12G4抗体のためのH622-14クローニングベクターの模式図に相当する。種々の調節エレメント(プロモーター、キメライントロン、ポリアデニル化部位など)並びに抗生物質耐性遺伝子及び複製起点もまた示されている。

【図19】図19は、ヒト化リーダーVH AMHR-IIが重鎖可変領域(ヒト化VH AMHR-II)に融合し、重鎖可変領域自体はヒト免疫グロブリンの定常領域(CH T125)に融合している重鎖と、リーダーVK AMHR-IIが軽鎖可変領域(ヒト化VK AMHR-II)に融合し、軽鎖可変領域自体はヒト免疫グロブリンの定常領域(CK T125)に融合している軽鎖とを含有する非変異ヒト化12G4抗体のためのH622-18クローニングベクターの模式図に相当する。種々の調節エレメント(プロモーター、キメライントロン、ポリアデニル化部位など)並びに抗生物質耐性遺伝子及び複製起点もまた示されている。

【図20】図20は、リーダーVH 3C_23が重鎖可変領域(VH 3C_23)に融合し、重鎖可変領域自体はヒト免疫グロブリンの定常領域(CH T125)に融合している重鎖と、リーダーVK 3C_23が軽鎖可変領域(VK 3C_23)に融合し、軽鎖可変領域自体はヒト免疫グロブリンの定常領域(CK T125)に融合している軽鎖とを含有する変異ヒト化12G4抗体3C_23のためのH622-18クローニングベクターMAO 3C23の模式図に相当する。種々の調節エレメント(プロモーター、キメライントロン、ポリアデニル化部位など)並びに抗生物質耐性遺伝子及び複製起点もまた示されている。

【図21】図21は、ヒト化リーダーVH AMHR-IIが重鎖可変領域(ヒト化VH AMHR-II)に融合し、重鎖可変領域自体はヒト免疫グロブリンの定常領域(CH T125)に融合している重鎖と、リーダーVK 6B_78が軽鎖可変領域(VK 6B_78)に融合し、軽鎖可変領域自体はヒト免疫グロブリンの定常領域(CK T125)に融合している軽鎖とを含有する変異ヒト化12G4抗体6B_78のためのH622-18クローニングベクターMAO 6B_78の模式図に相当する。種々の調節エレメント(プロモーター、キメライントロン、ポリアデニル化部位など)並びに抗生物質耐性遺伝子及び複製起点もまた示されている。

【図22】図22は、リーダーVH 3C_23Kが重鎖可変領域(VH 3C_23K)に融合し、重鎖可変領域自体はヒト免疫グロブリンの定常領域(CH T125)に融合している重鎖と、リーダーVK 3C_23Kが軽鎖可変領域(VK 3C_23K)に融合し、軽鎖可変領域自体はヒト免疫グロブリンの定常領域(CK T125)に融合している軽鎖とを含有する変異ヒト化12G4抗体3C_23KのためのH622-18クローニングベクターMAO 3C_23Kの模式図に相当する。種々の調節エレメント(プロモーター、キメライントロン、ポリアデニル化部位など)並びに抗生物質耐性遺伝子及び複製起点もまた示されている。

【図23】図23は、scFvフラグメントの構築のための模式的プロトコルを表す。VHの領域2/3の下方の黒矢印は、ペプチド結合のＮ-末端側2/3をコードする配列を示す。VLの領域2/3の下方の黒矢印は、ペプチド結合のＣ-末端側2/3をコードする配列を示す。

【図24】図24A及び24Bは、pMG62-Fab発現ベクター中への、mLFB112及びhuLFB112抗体の軽鎖VL-CL及び重鎖VH-CH1のヌクレオチド配列のサブクローニングを示す。図24A：mLFB112。図24B：huLFB112。

【図25】図25は、非変異ヒト化12G4抗体のものと比較した本発明のヒト化抗-AMHRII抗体のADCC活性を提示する。結果は、加えた抗体の量(ng/ml)(Ｘ軸)の関数としてのASC1細胞のパーセンテージ溶解(Ｙ軸)として表す。平均±SEM。菱形印で示す曲線は抗-AMHRII抗体3C_23(R901 3C_23)を表し、上向き三角印で示す曲線は抗-AMHRII抗体6B_78(R901 6B_78)を表し、下向き三角印で示す曲線は抗-AMHRII抗体3C_23K(R901 3C_23K)を表し、丸印で示す曲線は非変異ヒト化抗-AMHRII抗体12G4を表す。

【図26】図26は、cov434-AMHRII株の作製に使用したpIRES-neoプラスミド発現ベクターのマップを示す。

【図27】図27A及び27Bは、YB2/0細胞(図27A)及びCHO細胞(図27B)中で産生されたキメラ及びヒト化抗-AMHRII抗体の、COV434-AMHRII株に対するADCC活性を提示する。結果は、加えた抗体の量(ng/ml)(Ｘ軸)の関数としてのCOV434-AMHRII細胞のパーセンテージ溶解(Ｙ軸)として表す。３アッセイの平均±SEM。図27A：菱形印で示す曲線は非変異キメラ12G4抗-AMHRII抗体を表し、塗りつぶし四角印で示す曲線は抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23(R901 3C_23)を表し、下向き三角印で示す曲線は抗-AMHRII抗体YB2/0 6B_78(R901 6B_78)を表し、上向き三角印で示す曲線は抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K(R901 3C_23K)を表し、中抜き四角印で示す曲線はネガティブコントロールとして使用した抗-CD20抗体を表す。図27B：菱形印で示す曲線は非変異キメラ12G4抗-AMHRII抗体を表し、上向き三角印で示す曲線は抗-AMHRII抗体CHO 3C_23(R901 3C_23)を表し、下向き三角印で示す曲線は抗-AMHRII抗体CHO 3C_23K (R901 3C_23K)を表し、丸印で示す曲線は抗-AMHRII抗体CHO 6B_78(R901 6B_78)を表し、中抜き四角印で示す曲線はネガティブコントロールとして使用した抗-CD20抗体を表す。

【図28】図28は、YB2/0及びCHO細胞中で産生したヒト化抗-AMHRII抗体の、Asc 1株に対するADCC活性を示す。結果は、加えた抗体の量(ng/ml)(Ｘ軸)の関数としてのAsc 1細胞のパーセンテージ溶解(Ｙ軸)として表す。３テストの平均±SEM。菱形印で示す曲線は抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23Kを表し、上向き三角印で示す曲線は抗-AMHRII抗体CHO 3C_23Kを表す。

【図29】図29は、YB2/0及びCHO中で産生したヒト化抗-AMHRII抗体の、META 2815株に対するADCC活性を示す。結果は、加えた抗体の量(ng/ml)(Ｘ軸)の関数としてのMETA 2815細胞のパーセンテージ溶解(Ｙ軸)として表す。３テストの平均±SEM。菱形印で示す曲線は抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23Kを表し、上向き三角印で示す曲線は抗-AMHRII抗体CHO 3C_23Kを表し、丸印で示す曲線はネガティブコントロールとして使用した抗-CD20抗体(抗-CD20 A/R603 09/045)を表す。

【図30】図30は、COV434-AMHRII細胞の増殖に対する抗-AMHRII抗体3C_23Kの効果を示す。値100％は、抗体なしで観察されたCOV434-AMHRII細胞の増殖に相当する(３テストの平均±SD)。左から右へ、ヒストグラムは：抗体なしコントロール、抗P24抗体、抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K、抗-AMHRII抗体CHO 3C_23K、架橋剤(CK)の存在下での抗P24抗体、CKの存在下での抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K、CKの存在下での抗-AMHRII抗体CHO 3C_23K、１μg/mlのコルヒチンを示す。

【図31】図31は、META 2815細胞の増殖に対する抗-AMHRII抗体3C_23Kの効果を示す。値100％は、抗体なしで観察されたMETA 2815細胞の増殖に相当する(３テストの平均±SD)。左から右へ、ヒストグラムは：抗体なしのコントロール、抗P24抗体、抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K、抗-AMHRII抗体CHO 3C_23K、架橋剤単独、架橋剤(CK)の存在下での抗P24抗体、CKの存在下での抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K、CKの存在下での抗-AMHRII抗体CHO 3C_23K、１μg/mlのコルヒチンを示す。

【図32】図32A及び32Bは、cov434-AMHRIIモデルにおいて、合計18回の注射(黒矢印)について２〜３日間隔にて10mg/kg/注射の用量で実施した抗体の腹腔内注射による3C23K-YB2/0での処置の効果の下での腫瘍体積(図32A)及び生存曲線(図32B)の変動を示す。図32A：Ｙ軸：腫瘍体積(mm³)、Ｘ軸：腫瘍細胞注射後の日数、菱形印で示す曲線：ビヒクル、四角印で示す曲線：抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K。図32B：Ｙ軸：パーセンテージ生存率、Ｘ軸：腫瘍細胞注射後の日数、菱形印で示す曲線：ビヒクル、四角印で示す曲線：抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K。

【図33】図33A及び33Bは、Asc1a5モデルにおいて、合計18回の注射(黒矢印)について２〜３日間隔にて10mg/kg/注射の用量で実施した抗体の腹腔内注射による3C_23K-YB2/0での処置の効果の下での腫瘍体積(図33A)及び生存曲線(図33B)の変動を示す。図33A：Ｙ軸：腫瘍体積(mm³)、Ｘ軸：腫瘍細胞注射後の日数、菱形印で示す曲線：ビヒクル、四角印で示す曲線：抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K。図33B：Ｙ軸：パーセンテージ生存率、Ｘ軸：腫瘍細胞注射後の日数、菱形印で示す曲線：ビヒクル、四角印で示す曲線：抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K。

【図34】図34A及び34Bは、META 2815モデルにおいて、合計18回の注射(黒矢印)について２〜３日間隔にて10mg/kg/注射の用量で実施した抗体の腹腔内注射による3C_23K-YB2/0での処置の効果の下での腫瘍体積(図34A)及び生存曲線(図34B)の変動を示す。図34A：Ｙ軸：腫瘍体積(mm³)、Ｘ軸：腫瘍細胞注射後の日数、菱形印で示す曲線：ビヒクル、四角印で示す曲線：抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K。図34B：Ｙ軸：パーセンテージ生存率、Ｘ軸：腫瘍細胞注射後の日数、菱形印で示す曲線：ビヒクル、四角印で示す曲線：抗-AMHRII抗体YB2/0 3C_23K。

【実施例】

【0070】

実施例
実施例１：抗-AMHR-II抗体の親和性の測定
抗体のその抗原AMHR-IIについての親和性は、BIACore X100(BIACore，GE Healthcare)でのSPR(表面プラズモン共鳴)技法により測定する。領域Fcとの融合タンパク質の形態で発現させたAMHR-II組換えレセプターを、そのアミン官能基と、タイプCM5センサチップの表面に存在するスクシンイミドエステル中で活性化されたデキストランのカルボキシル基との間を共有結合することにより固定化する。センサチップのCOOH基は、EDC/NHS混合物(0.1ＭのN-ヒドロキシスクシンイミド及び0.1Ｍの3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル-N-エチルカルボジイミド)で10μl/分の流量にて７分間活性化し、次いで10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)中５μg/mlに希釈したAMHR-II/Fc融合タンパク質を、300RUに達するように、センサチップのトラック２に５μl/分にて注入する。融合タンパク質のアミンと反応しなかったエステル基は、エタノールアミン-HCl(１Ｍ, pH8.5)の溶液の10μl:分のフローにて７分間の注入により不活化させる。(ネガティブコントロールとして用いる)トラック１を、トラック２と同様に活性化し、不活化した。

【0071】

全ての測定は25℃にて行う。分析すべき抗体は、HBS-EPランニング緩衝液(BIACore, GE Healthcare)中で6.25〜3333nMの濃度に希釈し、30μl/分のフローで２分間センサチップに注入する。解離工程を10分間モニターした後、10mMグリシン緩衝液(pH1.5)の10μl/分での30秒間の注入により表面を再生する。
BIAevaluation 3.1ソフトウェアの１:２動力学モデルを用いて、得られたセンサグラム(sensorgram)を分析する。

【0072】

結果
抗体をCHO又はYB 2/0細胞中で産生した(表Ｉ)。

【表1】

【0073】

6B_78及び3C_23抗体に導入した変異は、AMHR-II抗原に関する親和性に、キメラ抗体(12G4−キメラ)に比して2.3〜2.6倍の増大を誘導する。
２つの抗体6B_78及び3C_23の変異は相乗効果を有し；6B_78抗体の変異の3C_23抗体への導入は、親和性に10倍の増大を引き起こす。

【0074】

実施例２：cov434-AMHR-II細胞に対するキメラ又はヒト化マウス12G4抗体の親和性測定
(配列：GGGGNLTQDRAQVEMQGSR(配列番号101)及びGGGGNLTQARGQVEMQGSR(配列番号102)(ネガティブコントロールペプチド用)のエピトープペプチド)

【表2】

AMHR-IIヒトレセプターについて測定したキメラ抗体の親和性は、約10^-8Ｍである。

【0075】

実施例３：変異ヒト化12G4抗体の作製
マウス抗体はキメラ抗体と実質的に等価であり、強い親和性を示す。
ヒト化12G4抗体(huLFB112)は、マウス12G4抗体(mLFB112)の超可変CDRループを、ヒト性フレームワークタンパク質にグラフトすること(「CDRグラフティング」)によって取得した。
ヒト化抗体は、マウス抗体と比較して親和性をかなり喪失している。
したがって、最終目的は、マウス抗体の当初の結合特性を回復するように、ヒト化抗体の親和性を増大させることである。この最適化は、Millegen社が保有するMutaGen技術による分子進化のサイクルを用いることによって実施する。

【0076】

3.1 分子ツールの構築及び検証
3.1.1．scFvフラグメントの構築
マウス及びヒト化抗体の軽鎖及び重鎖可変領域(それぞれ、VL及びVH)をコードするヌクレオチド配列を、適切なプライマーを用いるPCRにより増幅した。scFvタイプの組換え抗体フラグメントを作製するために、増幅配列を組み合わせた。この方法で幾つかの構築を行った：VH-VL又はVL-VH方向及び２つの異なるペプチド結合(15又は18アミノ酸のペプチド結合)の使用。マウス抗体について４つ、ヒト化抗体について４つの、合計８つの構築を行った。scFvフラグメントの構築の原理を、下記で説明する(スキームＩ)。次いで、これらscFvをコードする配列を、MilleGenファージミド発現ベクター(pMG58)中にサブクローニングした。このベクターにより、scFvタイプの抗体フラグメントの発現が可能になり、それらフラグメントの、タイプM13バクテリオファージの表面への提示が可能になる(ファージ-scFv)。
マウス及びヒト化抗体のVH及びVLドメインのヌクレオチド配列は、DNA配列決定によって検証した。
プロトコルを図23にまとめる。

【0077】

3.1.2．ファージ表面へのscFvの発現及びELISAによる特徴決定
供給した標的の量(80μg)では、なされた８つ全ての構築を試験することはできなかった。以下では、scFvの形態で発現したマウス抗体mLFB112をmVH-VLと呼び、ヒト化抗体huLFB112はhuVH-VLと呼ぶ。

【0078】

3.1.2.1．ファージ-scFvの作製
一方ではscFv mVH-VLをコードするDNAを含有するpMG58ベクターにより、他方ではscFv huVH-VLをコードするDNAを含有するpMG58ベクターにより形質転換したXL1-Blue細菌を、30℃にて0.5〜0.6のOD600nmまで培養する。IPTGの添加及び細菌の補助ファージ(M13KO7, New England Biolabs)での感染後、培養物を26℃にて一晩培養する。翌日、ファージ粒子(ファージ-scFv)を培養上清から回収し、PEG/NaCl溶液を用いて沈降させ、濃縮し(100×)、定量する。
この場合、２つのscFvについて、８×10¹¹ファージ/mlのオーダーの濃縮が得られる。

【0079】

3.1.2.2．ELISA-ファージアッセイ
ファージ表面に産生されたscFv mVH-VL及びhuVH-VLの機能性を、直接ELISAアッセイにより検証した。
プロトコル：
１)標的の固定：PBS1×中５μg/mlに希釈した100μl/ウェル(すなわち、500ng/ウェル)の組換え標的を、４°にて一晩。Nunc-Immuno Plate Maxisorpマイクロタイタープレートの使用。
２)飽和：200μl/ウェルのPBS1×-スキムミルク４％、37℃にて２時間のインキュベーション。
３)結合：100μl/ウェルの、PBS1×-ミルク２％-Tween20 0.05％中に希釈したファージ-マウス及びヒト化scFv溶液(２倍希釈系列)、37℃にて２時間のインキュベーション。
４)検出：100μl/ウェルの、ペルオキシダーゼにカップリングした抗-ファージM13抗体(希釈率1/10000、GE Healthcare)、37℃にて２時間のインキュベーション。
５)検出：100μl/ウェルのTMB
６)中和：100μl/ウェルの H₂SO₄
７)450nmでのOD測定

【0080】

結果(表II)：

【表3】

【0081】

3.1.3：Fabフラグメントの構築
抗体mLFB112及びhuLFB112の軽鎖VL-CL及び重鎖VH-CH1のヌクレオチド配列を、pMG62-Fab発現ベクター中にサブクローニングした(図24A及び24B)。
pMG62-Fab発現ベクター
Ａ)２つの鎖VL-CL及びVH-CH1は、軽鎖上流のpLacプロモーターから始まるように発現させ、重鎖VH-CH1は、検出用タグ(ペプチドV5)及びIMACでの精製用タグ(６×His)に融合させる。
Ｂ)軽鎖及び重鎖の各々はプロモーターに依存性である。RBS：リボソーム結合部位。

【0082】

3.2 分子ツールの構築及び検証
MutaGen^TMによるライブラリの構築
この工程のための目的は、scFvあたり１〜２アミノ酸変異を有する５×10⁶変形体のデータベースを取得することであった。
変異を、MutaGen^TM技術によりヒト化抗体huLFB112のドメインVL及びVHに導入した。最終的に、scFvあたり１〜５アミノ酸変異を有する約５×10⁷の変異クローンから構成される大きなデータベースが得られた。すなわち、当初に想定したものの10倍の多様性が得られた。
このため、異なる実験条件に従って幾つかのサブデータベースを構築した：異なるヌクレオチドプライマー、使用するムターゼ酵素、及び複製数により規定される条件Ｕ、Ｍ、US及びUE。これらサブデータベースは数が４であり、R20U、45M、R20US及びR20UEと名付けられた。これら全てのサブデータベースで合計295配列について、異なる変異誘発特性を正確に規定した。下記の表IIIは、配列決定操作の分析から得られた基本データの概念を示す。

【0083】

【表4-1】

【表4-2】

【0084】

3.2．選択条件の樹立
異なる選択ストラテジーを評価するために、ファージ-マウスscFvとファージ-ヒト化scFvとの人工的混合物を調製した(1/200混合物、mLFB112/huLFB112)。この目的はデータベースのスクリーニングをシミュレートすることである。このスクリーニングシミュレーションにより、この人工混合物内の最近縁クローン(most affine clone)(すなわち、この場合にはマウスクローンmLFB112)を迅速に増幅するという目的を有する種々の選択条件の検証が可能にならなければならない。

【0085】

評価した種々のストラテジー：
ｉ)選択サイクルの経過中における一定量の固定標的の使用(Cond 1)
ii)選択サイクルの経過中における固定標的の量の減少(Cond 2)
ii)「k_off」条件についての試験：ファージ-scFvと標的との長いインキュベーション時間(Cond 3)
これら種々の条件を３回の選択サイクルで行った。各選択サイクル後に保持されたクローンについて。配列決定を行った。結果を下記の表IVに示す。

【0086】

【表5】

【0087】

これら結果からは、条件１(固定量の標的)が、より良好な親和性を有するクローン(mLFB112)の増幅について最高性能(10中９クローン)を示すようにみえる。より少量の標的(100ng/ウェル)を用いると、適切性が減少するようである；３回の選択サイクル後、10中僅か３クローンが、より良好な親和性を有するクローンに相当する。同じことが、長いインキュベーション時間に基づく条件３(「k_off選択」)にも言え、この条件は、クローンmLFB112の十分な増幅を可能にしない。更に、この最後に言及した条件について３サイクル後に回収したファージの数は高くない(２×10⁴ファージ)。したがって、このプロジェクトに関して構築されたデータベースのように、より多様化したクローン混合物については、、条件２及び３の使用は推奨できないようである。

【0088】

3.3．一次スクリーニング(選択サイクル)
したがって、スクリーニング条件の樹立後、２つのスクリーニング条件の使用を決定した：
Cond A：１μg/ウェルの標的で４回の選択サイクル、次いで0.5μg/ウェルで３回の選択サイクル
Cond B：0.5μg/ウェルで６回の選択サイクル
得られた結果を下記表Ｖに示す。

【0089】

【表6】

【0090】

これらの選択後、３回目の選択サイクルから始まる取得クローンを配列決定した。得られた結果を、出発データベースについて得られたものと比較した(表VI)。

【表7】

これら配列決定操作の分析により、冗長なクローンの存在が明らかとなった。まとめると、配列決定したクローンの全てから、113の独特な変異クローンが得られた。

【0091】

3.4．二次スクリーニング(ELISA-ファージ)
二次スクリーニングは、一次スクリーニングの終時に選択したクローンを個々に解析することからなる。このために、113の独特な変異クローンを培養プレートに移した(96ウェル-1.2ml)。
ファージ粒子の産生後、ファージ-scFvを含有する培養上清を、ELISA結合アッセイを実施するために使用した。変異クローンの結合を２つの希釈物で評価した(scFv-ファージを含有する上清の1/2及び1/4)。scFv-ファージ形式で構築したマウスクローン(mLFB112)及びヒト化クローン(huLFB112)を、アッセイプレートの各々で参照として使用した。変異クローンの各々を少なくとも２回試験した。
結果を、変異クローンと参照huLFB112及びmLFB112との間の結合比、すなわち差(OD405nm)として表す。
− ヒト化scFv huLFB112に対する比(比/huLFB112)
− マウスscFv mLFB112に対する比(比/mLFB112)

【0092】

試験した113クローンのうち、最良のクローンのみを下記で示す。
下記の表VIIは、得られた種々のクローン、及び軽鎖及び/又は重鎖に存在する変異(アミノ酸の位置及び置換)、並びにELISAにより決定したクローンの結合親和性を示す。
置換の後に示した値は、種々の置換に応じたヒドロパシー指標の値の変化に相当する。
結合親和性の値は、AMHRR-IIレセプターについての、非変異ヒト化12G4抗体の結合親和性又は非変異キメラ12G4抗体の結合親和性に対する本発明の抗体の結合親和性の比に相当する。
示された結合親和性の値は、少なくとも４つの値の平均値であり、括弧内の数字は標準偏差に相当する。
表VIIは、行った置換と共に、置換が、ヒドロパシー指標の大きな変化を導くにもかかわらず、該レセプターに対する抗体の結合親和性は、非変異ヒト化12G4抗体のものより遥かに大きく、非変異キメラ12G4抗体のものと少なくとも等しい：１に等しいか又は１より大きい比 本発明のAB/キメラ12G4。
変異ヒト化抗体は、キメラ若しくはマウス抗体のものに回復している親和性、又はキメラ若しくはマウス抗体のものより大きくさえある親和性を示す。

【0093】

【表8-1】

【表8-2】

【0094】

実施例４：親和性が改善されたクローンの比較
本発明による可溶性変異抗体(Fab)で得られた従来のELISAアッセイにおけるAMHR-IIレセプターに対する抗体の結合親和性を決定することによって、ポジティブクローン3C_23K、3C_23及び6B_78を互いに比較した。
得られた結果を図17に示す。

【0095】

実施例５：トランスフェクト株AMHRII cov434-AMHRIIの樹立
顆粒膜腫瘍株cov434(van den Berg-Bakker, C.ら，1993. Establishment and characterization of 7 ovarian carcinoma cell lines and one granulosa tumour cell line: Growth features and cytogenetics. International Journal of Cancer 53: 613；Zhang, H.ら，2000. Characterization of an immortalized human granulosa cell line (COV434). Molecular Human Reproduction 6: 146)のAMHRIIをコードするcDNAを発現するがAMHRIIを発現しないプラスミドのトランスフェクションにより、cov434-AMHRII株を作製した。
簡潔には、AMHRIIのcDNAを市販のプラスミドpIRES-neo(Clontech - Takara Bio Europe, France；references 6060-1)中にクローニングした。IRES配列に起因して、AMHRII及びneoは、同じ１つのプロモーターCMVの制御下に発現する(図26)。
この構築物を顆粒膜ガン株cov434(トランスフェクション剤Fugene, Roche)中に安定的にトランスフェクトした。次いで、得られたトランスフェクタントを、サイトメトリ及びウェスタンブロッティングによりAMHRIIレセプターの発現についてスクリーニングした。サブクローニング後、pIRES-neoタイプのベクターを含有する細胞クローンcov434-AMHRII-1F3をインビトロ及びインビボ研究のために維持した。以下で、この株をcov434-AMHRIIと指称する。

【0096】

実施例６：子宮上皮ガン腫患者の腹水又は生検からの一次細胞株の樹立
腹水サンプルに由来する株(Asc 1株)の樹立における主要工程は以下のとおりである：
− D0：腹水を与え、直後にサンプル培養開始。サンプルを1000 rev/分にて５分間遠心分離し、ペレットを２mLのT25フラスコ播種用培地(RPMI 10％FCS培地)中に採取する。
− D2〜D46：定期的な顕微鏡観察を伴う培養。この間、新鮮培地を定期的に添加する。混入した赤血球及び線維芽細胞を除去するため、PBSで洗浄もまた一日おきに行う。
D13付近で、全ての混入細胞が見られなくなり、依然として不均質なコンフルーエントな細胞ローンが観察される(２つの異なるタイプ)。
− D46：トランスファー：D46に均質な腫瘍細胞ローンが観察される。その後、細胞を洗浄し、スクレーピングによりトランスファーして２つのT75フラスコに再播種する。
− D61：FACSによるAMHRII発現の評価：PBSでの洗浄後、細胞をスクレーパーから脱着させ、フローサイトメトリにより分析する(標識AcM 12G4 10μg/mL、AcII抗-マウスFITC)。この段階でデータベースを構築する。AMHRIIレセプター発現を確証するために、ポジティブAMHRII株を更に10日間培養する。
− D71：FACSによるAMHRII発現の確証

【0097】

このように樹立された株をRPMI 10％FCS培地中に、１週間あたり１継代で維持する(1/15希釈)。
生検の場合(META 2815株)、初代腫瘍を先ずヌードマウスで維持し(肩甲骨間空間にサンプル移植、マウスで連続２継代)、次いで腫瘍を取り出し、二分した後、培養培地に採取する。その後は、腹水サンプルのものと同一のプロトコルを適用する。

【0098】

実施例７：種々の候補ヒト化抗体の親和性の評価
本研究は、元のマウス12G4抗体並びにYB2/0で産生した候補のヒト化抗体3C23、6B78及び3C23K(それぞれ配列3C_23、6B_78及び3C_23Kのもの)について行った。これら抗体の親和性はcov434-AMHRII細胞で評価した。
簡潔には、K_Dは、一定数のcov434-AMHRII細胞に漸増量の放射活性標識抗体を添加することによって飽和法により決定した。細胞(50μl PBS/BSA 0.5％中１×10⁶)を、ヨウ素125(¹²⁵I)で事前に標識した漸増量の抗体の存在下で、４℃にて１時間インキュベートした(最終容量150μl)。各抗体について、標識及び未標識抗体(84.4μg/ml)の溶液からPBS/BSA 0.5％中４倍希釈を行った。細胞を100倍モル過剰の未標識抗体の存在下でインキュベートすることにより、非特異的固定を評価した。
インキュベーション後、サンプルを液体窒素中で凍結した後、ガンマカウンターで分析した。特異的固定は、過剰の未標識抗体の存在下で得られた固定を減算することにより決定した。
PRISMソフトウェアで行ったスキャッチャード分析により、表VIIIに示した親和性定数の決定が可能になった。

【0099】

【表9】

本研究によれば、ヒト化抗-AMHRII抗体3C23Kは、他の２つの候補抗体6B78及び3C23と比較して、最良の親和性(K_D＝5.3nM)を有しているようである。3C23K抗体もまた、元のマウス12G4抗体のもの(K_D＝15.4nM)より約３倍大きい親和性を有している。

【0100】

実施例８：本発明の抗体のADCC活性 対 非変異ヒト化12G4抗体のADCC活性の比較
１ 材料及び方法
1.1 方法の原理
ADCC
患者から得られたASC1標的細胞は、接着性であり、アッセイ前日に調製する。これらをトリプシンで脱着させ、平底プレートにおいてEMS＋５％FCS中、50μl/ウェルの割合にて６×10⁵細胞/mlの濃度でインキュベートする。プレートを37℃、７％CO₂にて一晩インキュベートする。
翌日、細胞はウェルの底に付着している。上清を吸引し、NK及び抗体の存在下でアッセイを行うためにウェルあたり必要な容量の緩衝液を加える。
キラー細胞(NK細胞)は、Miltenyi社により開発されたネガティブ涸渇技法(Miltenyi Biotec - NK cell isolation kit human ref 130-092-657)により、健常ドナーの末梢血から事前に精製する。ADCC技法は、NK細胞をASC1標的細胞と種々の濃度のヒト化抗-AMHRII抗体(0.005〜5000ng/ml)の存在下、10/1のE/T比でインキュベートすることからなる。４時間のインキュベーション後、抗-AMHRII抗体により誘導される細胞傷害活性は、上清中、溶解した標的細胞が放出する乳酸脱水素酵素(LDH)と呼ばれる細胞内酵素を測定することで比色法により測定する(Roche Diagnostics - Cytotoxicity Detection Kit LDH ref 11644793001)。

【0101】

1.2 調べたエレメント
− 抗-AMHRII抗体：
・ 829 10 054，ヒト化YB2/0，R901 3C23K
・ 829 10 050，ヒト化YB2/0，R901 3C23
・ 829 10 051，ヒト化YB2/0，R901 6B78
・ 632 07 107，非変異ヒト化抗-AMHRII 12G4
− ASC1細胞培養物 871 10 063
結果を図25に示す。

【0102】

表IXは、図25に対応する生データを示す。

【表10】

【0103】

表Ｘは、種々の抗体で得られたEmax及びEC50を示す。

【表11】

【0104】

実施例９：本発明の抗体のADCC活性 対 キメラ12G4抗体のADCC活性の比較
ヒト化候補抗体3C_23K(配列3C_23Kのha12G4：変異VHQ3R(配列番号82(リーダー無し)若しくは配列番号84(リーダー有り))及びVLI177T/S179P/E184K(配列番号86(リーダー無し)若しくは配列番号88(リーダー有り))のADCC活性を評価した。
簡潔には、エフェクター細胞(NKキラー細胞；NK：ナチュラルキラー)は、健常ドナーの末梢血から、フィコールでの単核細胞精製の第１工程後に、Miltenyi社により開発されたネガティブ涸渇技法(Miltenyi Biotec - NK cell isolation kit human ref 130-092-657)で事前に精製する。ADCC活性のインビトロアッセイは、NK細胞を標的細胞(cov434-AMHRII、Asc 1及びMETA 2815株)と種々の濃度の抗-AMHRII抗体(キメラ抗体ch12G4、YB2/0で産生したヒト化3C_23K-YB2/0抗体及びCHOで産生した3C_23K-CHO)の存在下でインキュベートすることからなる。適用したエフェクター/標的比は15/1である。抗体は0.005〜5000ng/mlの濃度で培養培地中で希釈する。

【0105】

４時間のインキュベーション後、抗-AMHRII抗体により誘導される細胞傷害活性は、上清中、溶解した標的細胞が放出する乳酸脱水素酵素(LDH)と呼ばれる細胞内酵素を測定することで比色法により測定する(Roche Diagnostics - Cytotoxicity Detection Kit LDH ref 11644793001)。
パーセンテージ溶解は以下の式から算出する：
％溶解＝[(ER−SR)/(100−SR)]−[(NC−SR)/(100−SR)
式中、
ER＝抗体及びNK細胞の存在下でのLDHの放出
SR＝標的細胞単独からのLDHの自然放出
NC＝NK細胞の存在下且つ抗体の非存在下でのLDHの放出
結果は、抗体の量の関数としてのパーセンテージ溶解で表す。Emax及びEC50値は、PRISMソフトウェアで算出する。

【0106】

cov434-AMHRII株について得られた結果を図27に示す。3C_23K-CHO抗体の低い活性のため、本アッセイ条件下でプラトーは得ることができない。抗体の効力を比較するために、このケースでは、キメラ抗体のプラトーの50％に達するに必要な3C_23K-CHO抗体の量を表す相対50％(50% relative)の計算を行う(キメラ抗体の相対50％＝１)。この評価によれば、COV434-AMRHII株について最良のADCC活性を有するヒト化抗体は、YB2/0で産生した3C_23K抗体(相対50％：0.84)である。配列3C_23及び6B_78のヒト化抗体は、それぞれ6.41及び36.92に等しい相対50％の値を有する。
Asc 1株について得られた結果を図28に示す。3C_23K-YB2/0抗体は、Asc 1細胞に対して用量依存性の細胞傷害活性を有し、EC50は2.24ng/mlと見積もられる。3C_23K-CHO抗体の低い活性のため、本アッセイ条件下でプラトーは得ることができない。２つの抗体の効力を比較するために、このケースでは、3C_23K-YB2/0抗体のプラトーの50％に達するに必要な3C_23K-CHO抗体の量を表す相対50％の計算を行う(3C_23K-YB2/0抗体の相対50％＝１)。この評価によれば、3C_23K-YB2/0抗体の細胞傷害活性は、CHOで産生した抗体のもの(相対50％＝39.4)より約40倍大きい。

【0107】

同様に、図29に提示した結果は、抗体3C_23K-YB2/0及び3C_23K-CHOが、META 2815細胞に対する用量依存性溶解を誘導することを示す。3C_23K-YB2/0抗体の細胞傷害活性(EC50＝30.5ng/ml)は、3C_23K-CHO抗体のもの(EC50＝466.9ng/ml)より約146倍大きい。
まとめると、これら結果は、YB2/0で産生した3C_23K抗-AMHRII抗体が、AMHRII抗原を発現する細胞の溶解を誘導する能力を有することを示す。抗-AMHRII-YB2/0と抗-AMHRII-CHO抗体との間でのEC50の相違は、低い抗原発現条件下又は腫瘍への抗体の低い浸透条件下での抗-AMHRII-YB2/0抗体に関する或る利点を示唆している。

【0108】

実施例10：細胞増殖の研究
細胞増殖の阻害は、試験する抗-AMHRII抗体の存在下又は非存在下で経時的に細胞増殖を測定することにより証明した。
簡潔には、標的細胞(cov434-AMHRII、Asc 1、META2815)を、P6プレート中(１×10⁵細胞/ウェル)、CHO又はYB2/0で発現させた抗-AMHRII抗体(10μg/ml)の存在下に、架橋剤(AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG，Fcγ Fragment Specific ref: 109-006-008, Jackson Immunoresearch, France)有り又は無しで、72時間37℃にて培養する。細胞をトリプシンで５分間処理した後、細胞の生存能(トリパンブルー)に基づく自動細胞計数器であるCEDEXで計数する。増殖阻害のポジティブコントロールを、１μg/mlのコルヒチン(Ref: C3915, Sigma-Aldrich, France)の存在下に確立する。ネガティブコントロールを、無関係の抗体(抗-P24)の存在下に確立する。全ての希釈物は培養培地(RPMI, 10％ FCS)中に調製する。結果は、値100％が抗体の非存在下で観察された細胞増殖に対応する、パーセンテージ増殖として表す。

【0109】

cov434-AMHRII株で得られた結果を図30に示す。
これらの観察によれば、抗体3C_23K-YB2/0及び3C_23K-CHOは、架橋剤(CK)の存在下で、cov434-AMHRII細胞の細胞増殖の約40％阻害を誘導する。この細胞増殖停止効果は、無関係の抗体(抗体p24)の存在下では観察されない一方、コルヒチンポジティブコントロール(10μg/ml)は88％阻害を誘導する。
同様に、図31に提示された結果は、抗体3C_23K-YB2/0及び3C_23K-CHOが、架橋剤(CK)の存在下で、META 2815株に対して、細胞増殖の約40％阻害を誘導することを示す。
この細胞増殖阻害は、cov434-AMHRII及びMETA 2815株に対して抗-AMHRII抗体が誘導する細胞シグナリングの結果であるのかもしれない。

【0110】

実施例11：COV434-AMHRII腫瘍に対する3C_23K-YB2/0抗体のインビボ効果
3C_23K-YB2/0抗体の抗腫瘍効力を、COV434-AMHRII腫瘍細胞の皮下注射(s.c.)後の雌性スイスヌードマウスに対する遅発処理で評価した。抗体の腹腔内(i.p.)注射(inj)は、２〜３日の間隔にて10mg/kg/injの用量で計18回行った。3C_23K-YB2/0抗体で処理した群をビヒクル(PBS)で処理した群と比較した。

【0111】

− 材料及び方法
雌性スイスヌードマウスを使用した(Harlan)。実験の０日目に、マウスに、Matrigelと混合した7.10⁶のCOV434-AMHRII腫瘍細胞(比１:１)の皮下注射を行った。次いで、これら動物を、16日目(腫瘍体積84〜270mm³)から始まるPBS又は3C_23K-YB2/0(10mg/kg/inj)のi.p.注射により処理した(週あたり３回の注射を６週間(計18注射))。
腫瘍体積は週あたり２〜３回測定した。腫瘍体積(TV)は以下の式を用いて算出した：
TV (mm³)＝(長さ×幅×高さ)/２ 式中、長さは腫瘍の最長径に相当し、幅は腫瘍の最短径に相当する。
平均腫瘍体積(MTV)を用いて腫瘍増殖曲線をプロットした。個々の腫瘍体積が2000mm³に達したときに動物を安楽死させた。各群において、群中の動物の30％を安楽死させたときに曲線を止めた。

【0112】

腫瘍増殖阻害(T/C)(ビヒクルで処理したコントロール群のメジアン腫瘍体積に対する処理群のメジアン腫瘍体積の比として規定)は、以下のとおり算出した：T/C＝(処理群のメジアンTV/ビヒクル群のメジアンTV)×100
− 42％を上回るT/C、この物は効果なしと考えられる。
− 42％〜10％のT/C、この物は抗-腫瘍効果を有する
− 10％を下回るT/C、この物は真に効果的である。
種々の群間の統計学的差を、ANOVA比較を用いるKruskal-Wallis検定で得た(Statgraphics centurion XVソフトウェア)。Ｐ＜0.05であれば、差を有意と見做した。本研究の生存パラメータの比較のためのログランク検定もまたANOVAにより行った(Statgraphics centurion XVソフトウェア)。Ｐ＜0.05であれば、差を有意と見做した。

【0113】

− 結果
COV434-AMHRIIにおいて遅延が観察された(図32A及び32B)ので、3C_23K-YB2/0抗体は抗-腫瘍活性を示す。
一旦処理が開始された後の各測定点での腫瘍体積の統計学的比較は、3C_23K-YB2/0抗体が腫瘍増殖を遅延させることを示す(Kruskal-Wallis、ANOVAによる)。3C_23K-YB2/0処理群とビヒクル処理群との間で算出したT/C比は、一旦処理が開始された後の全ての測定点で有意差を示す。ログランク検定もまた、生存に関して、3C_23K-YB2/0処理群がビヒクル処理群とは統計学的に異なることを示す。

【0114】

下記の表XIは、cov434-AMHRIIモデルにおける3C_23K-YB2/0処理の効果の下での腫瘍体積(処理/コントロール比T/C(％))の進展を示す。

【表12】

【0115】

下記の表XIIは、cov434-AMHRIIモデルで得られた統計学的分析を示す。

【表13】

【0116】

実施例12：Asc1A5腫瘍に対する3C_23K-YB2/0抗体のインビボ効果
3C_23K-YB2/0抗体の抗腫瘍効力を、Asc1A5腫瘍細胞(元のAsc 1株のクローン)の皮下注射(s.c.)後の雌性スイスヌードマウスに対する遅発処理で評価した。抗体の腹腔内(i.p.)注射(inj)は、２〜３日の間隔にて10mg/kg/injの用量で計18回行った。3C_23K-YB2/0抗体で処理した群をビヒクル(PBS)で処理した群と比較した。

【0117】

− 材料及び方法
雌性スイスヌードマウスを使用した(Harlan)。実験の０日目に、マウスに、Matrigelと混合した7.10⁶のAsc1A5腫瘍細胞(比１:１)の皮下注射を行った。次いで、これら動物を、12日目(腫瘍体積40〜160mm³)から始まるPBS又は3C_23K-YB2/0(10mg/kg/inj)のi.p.注射により処理した(週あたり３回の注射を６週間(計18注射))。
腫瘍体積は週あたり２〜３回測定した。腫瘍体積(TV)は以下の式を用いて算出した：
TV (mm³)＝(長さ×幅×高さ)/２ 式中、長さは腫瘍の最長径に相当し、幅は腫瘍の最短径に相当する。
平均腫瘍体積(MTV)を用いて腫瘍増殖曲線をプロットした。個々の腫瘍体積が2000mm³に達したときに動物を安楽死させた。各群において、群中の動物の30％を安楽死させたときに曲線を止めた。

【0118】

腫瘍増殖阻害(T/C)(ビヒクルで処理したコントロール群のメジアン腫瘍体積に対する処理群のメジアン腫瘍体積の比として規定)は、以下のとおり算出した：T/C＝(処理群のメジアンTV/ビヒクル群のメジアンTV)×100
− 42％を上回るT/C、この物は効果なしと考えられる。
− 42％〜10％のT/C、この物は抗-腫瘍効果を有する
− 10％を下回るT/C、この物は真に効果的である。
種々の群間の統計学的差を、ANOVA比較を用いるKruskal-Wallis検定で得た(Statgraphics centurion XVソフトウェア)。Ｐ＜0.05であれば、差を有意と見做した。本研究の生存パラメータの比較のためのログランク検定もまたANOVAにより行った(Statgraphics centurion XVソフトウェア)。Ｐ＜0.05であれば、差を有意と見做した。

【0119】

− 結果
Asc1A5モデルにおいてビヒクル処理群と比較して腫瘍増殖に遅延が観察された(図33A及び33B)ので、3C_23K-YB2/0抗体は抗-腫瘍活性を示す。
一旦処理が開始された後の各測定点での腫瘍体積の統計学的比較は、3C_23K-YB2/0抗体が腫瘍増殖を遅延させることを示す(Kruskal-Wallis、ANOVAによる)。3C_23K-YB2/0処理群とビヒクル処理群との間で算出したT/C比は、一旦処理が開始された後の全ての測定点での有意差を示す。ログランク検定もまた、生存に関して、3C_23K-YB2/0処理群がビヒクル処理群とは統計学的に異なることを示す。

【0120】

下記の表XIIIは、Asc1a5モデルで得られた3C_23K-YB2/0処理の効果の下での腫瘍体積(処理/コントロール比T/C(％))の進展を示す。

【表14】

【0121】

下記の表XIVは、Asc1a5モデルで得られた統計学的分析を示す。

【表15】

【0122】

実施例13：Meta2815腫瘍に対する3C_23K-YB2/0抗体のインビボ効果
3C_23K-YB2/0抗体の抗腫瘍効力を、Meta 2815腫瘍細胞の皮下注射(s.c.)後の雌性スイスヌードマウスに対する遅発処理で評価した。抗体の腹腔内(i.p.)注射(inj)は、２〜３日の間隔にて10mg/kg/injの用量で計18回行った。3C_23K-YB2/0抗体で処理した群をビヒクル(PBS)で処理した群と比較した。

【0123】

− 材料及び方法
雌性スイスヌードマウスを使用した(Harlan)。実験の０日目に、マウスに、8.10⁶のMeta2815腫瘍細胞の皮下注射を行った。次いで、これら動物を、33日目(腫瘍体積45〜240mm³)から始まるPBS又は3C_23K-YB2/0(10mg/kg/inj)のi.p.注射により処理した(週あたり３回の注射を６週間(計18注射))。
腫瘍体積は週あたり２〜３回測定した。腫瘍体積(TV)は以下の式を用いて算出した：
TV (mm³)＝(長さ×幅×高さ)/２ 式中、長さは腫瘍の最長径に相当し、幅は腫瘍の最短径に相当する。
平均腫瘍体積(MTV)を用いて腫瘍増殖曲線をプロットした。個々の腫瘍体積が2000mm³に達したときに動物を安楽死させた。各群において、群中の動物の30％を安楽死させたときに曲線を止めた。

【0124】

腫瘍増殖阻害(T/C)(ビヒクルで処理したコントロール群のメジアン腫瘍体積に対する処理群のメジアン腫瘍体積の比として規定)は、以下のとおり算出した：T/C＝(処理群のメジアンTV/ビヒクル群のメジアンTV)×100
− 42％を上回るT/C、この物は効果なしと考えられる。
− 42％〜10％のT/C、この物は抗-腫瘍効果を有する
− 10％を下回るT/C、この物は真に効果的である。
種々の群間の統計学的差を、ANOVA比較を用いるKruskal-Wallis検定で得た(Statgraphics centurion XVソフトウェア)。Ｐ＜0.05であれば、差を有意と見做した。本研究の生存パラメータの比較のためのログランク検定もまたANOVAにより行った(Statgraphics centurion XVソフトウェア)。Ｐ＜0.05であれば、差を有意と見做した。

【0125】

− 結果
Meta2815モデルにおいてビヒクル処理群と比較して腫瘍増殖に遅延が観察された(図34A及び34B)ので、3C_23K-YB2/0抗体は抗-腫瘍活性を示す。
一旦処理が開始された後の各測定点での腫瘍体積の統計学的比較は、3C_23K-YB2/0抗体が腫瘍増殖を遅延させることを示す(Kruskal-Wallis、ANOVAによる)。3C_23K-YB2/0処理群とビヒクル処理群との間で算出したT/C比は、一旦処理が開始された後の全ての測定点での有意差を示す。ログランク検定もまた、生存に関して、3C_23K-YB2/0処理群がビヒクル処理群とは統計学的に異なることを示す。

【0126】

下記の表XVは、META 2815モデルにおける3C_23K-YB2/0処理の効果の下での腫瘍体積(処理/コントロール比T/C(％))の進展を示す。

【表16】

【0127】

下記の表XVIは、META 2815モデルで得られた統計学的分析を示す。

【表17】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]