特許 6435334 稀な配列変異体を検出するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6435334

(24)【登録日】2018年11月16日

(45)【発行日】2018年12月5日

(54)【発明の名称】稀な配列変異体を検出するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20181126BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20181126BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20181126BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6869 ZZNA

   C12Q1/6844 Z

   C12N15/09 Z

【請求項の数】23

【全頁数】124

(21)【出願番号】特願2016-539051(P2016-539051)

(86)(22)【出願日】2014年12月11日

(65)【公表番号】特表2017-510244(P2017-510244A)

(43)【公表日】2017年4月13日

(86)【国際出願番号】US2014069848

(87)【国際公開番号】WO2015089333

(87)【国際公開日】20150618

【審査請求日】2017年12月11日

(31)【優先権主張番号】61/987,414

(32)【優先日】2014年5月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/010,975

(32)【優先日】2014年6月11日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/914,907

(32)【優先日】2013年12月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517444562

【氏名又は名称】アキュラジェン ホールディングス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】リン， シェンロン

(72)【発明者】

【氏名】サン， ザオフイ

(72)【発明者】

【氏名】ザオ， グレース チージ

(72)【発明者】

【氏名】タン， ポール リン−ファン

【審査官】 池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５１５１４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５１７２３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５３８４９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／３１９２９９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／２１７０２３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A (Nov 2013) vol.110, no.49, p.19872-19877

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８６９

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

それぞれが５’末端および３’末端を有する複数のポリヌクレオチドを含む核酸試料における配列変異体を同定する方法であって、
（ａ）前記複数の個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが前記５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記環状ポリヌクレオチドを増幅するステップと、
（ｃ）増幅されたポリヌクレオチドを配列決定して、複数の配列決定リードを生成するステップと、
（ｄ）配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、
（ｅ）異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするステップと
を含む方法。

【請求項2】

前記複数のポリヌクレオチドが一本鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

環状化が、前記複数のポリヌクレオチドをライゲーション反応に供することによってなされる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

個々の環状ポリヌクレオチドが、環状化されたポリヌクレオチドの中で独特である接合部を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記配列変異体が、一塩基多型である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記参照配列が、前記配列決定リードを互いとアラインすることによって形成されたコンセンサス配列である、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

環状化が、アダプターポリヌクレオチドを前記複数のポリヌクレオチド中のポリヌクレオチドの５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方と接合するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用することによってなされる、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

増幅が、前記環状ポリヌクレオチドを、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記増幅されたポリヌクレオチドを、富化を伴わずに前記配列決定ステップに供する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

配列決定の前に、富化ステップを実施することによって、前記増幅されたポリヌクレオチドの中で１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドを富化するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記富化ステップが、増幅されたポリヌクレオチドを、基質に付着させた複数のプローブにハイブリダイズさせることを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記富化ステップが、
（ａ）前記増幅されたポリヌクレオチド；
（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、前記標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；
（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、前記標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに
（ｄ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼ
を含む増幅反応混合物において、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列を増幅することを含み、
前記標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離が７５ｎｔまたはそれ未満である、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記試料が、対象由来の試料である、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記試料が、尿、便、血液、唾液、組織、または体液である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記試料が、腫瘍細胞を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

前記配列変異体が、がんの種類または病期に関連する、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記複数のポリヌクレオチドが、無細胞ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記無細胞ポリヌクレオチドが、循環腫瘍ＤＮＡを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

（ａ）の前記環状ポリヌクレオチドを増幅するステップが、複数のコンカテマーを形成する、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

前記配列変異体が、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満の頻度で生じる稀な配列変異体である、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記核酸試料が、５０ｎｇ未満、４５ｎｇ未満、４０ｎｇ未満、３５ｎｇ未満、３０ｎｇ未満、２５ｎｇ未満、２０ｎｇ未満、１５ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満、４ｎｇ未満、３ｎｇ未満、２ｎｇ未満、または１ｎｇ未満のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１３年１２月１１日に出願された米国仮出願第６１／９１４，９０７号；２０１４年５月１日に出願された米国仮出願第６１／９８７，４１４号；および２０１４年６月１１日に出願された米国仮出願第６２／０１０，９７５号の利益を請求し、これらのすべては参照によって本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

複雑な集団内の配列変異の同定は、特に大規模並行核酸配列決定の出現に伴い活発に成長している分野である。しかし、大規模並行配列決定には、一般に使用される技法における固有の誤差頻度が集団内の実際の配列変異の多くの頻度よりも大きいという点で、著しい限定がある。例えば、標準のハイスループットな配列決定では、０．１〜１％の誤差率が報告されている。稀な配列変異体の検出は、変異体の頻度が低い場合、例えば誤差率でまたはそれ未満でなど、偽陽性率が高い。

【0003】

稀な配列変異体を検出することに関しては多くの理由がある。例えば、稀な特有の配列の検出を使用して、細菌分類群などの有害な環境汚染物質の存在を同定および区別することができる。細菌分類群を特徴付ける一般的なやり方は、ｒＲＮＡ配列などの高度に保存された配列の差異を同定することである。しかし、これを行うための、典型的な配列決定に基づく手法は、かねてから労力を要する手順に関する複雑な問題を示す、所与の試料中の非常に多くの異なるゲノムおよびメンバー間の相同性の程度に関する難題に面している。改善された手順には、種々の設定における汚染検出を増強する潜在性がある。例えば、人工衛星および他の宇宙船の構成要素を組み立てるために使用するクリーンルームを、どんな微生物群集が存在するかを理解すること、ならびに陸生微生物が他の惑星もしくはその試料に導入されることを予防するためのより良好な汚染除去および浄化技法を開発するため、または推定上の地球外微生物から生じたデータと汚染陸生微生物から生じたデータを区別するための方法体系を開発するために、本システムおよび方法を用いて調査することができる。食品モニタリングへの適用としては、食品加工工場における生産ラインの定期検査、屠殺場の調査、レストラン、病院、学校、矯正施設および他の施設のキッチンおよび食品貯蔵場所の食品媒介性病原体に関する検査が挙げられる。水の貯蔵および加工工場も同様にモニターすることができる。

【0004】

稀な変異体の検出は、病理学的突然変異の早期検出のためにも重要であり得る。例えば、臨床試料におけるがんに関連する点突然変異の検出により、化学療法中の微小残存病変の同定を改善すること、および再発患者における腫瘍細胞の出現を検出することができる。稀な点突然変異の検出は、環境の突然変異原への曝露を評価するため、内因性ＤＮＡ修復をモニターするため、および高齢個体における体細胞突然変異の蓄積を研究するためにも重要である。さらに、稀な変異体を検出するための、より感度の高い方法により、出生前診断を増強することができ、母体の血液中に存在する胎児細胞を特徴付けることが可能になる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

前述事項を考慮して、稀な配列変異体を検出する改善された方法が必要とされている。本開示の組成物および方法は、この必要性に対処するだけでなく、追加的な利点も提供する。特に、本開示の種々の態様は、稀なまたは低頻度の核酸配列変異体（時には突然変異と称される）の感度が高い検出を提供する。これは、正常な配列のバックグラウンドにおける少量の変異体配列を含有する可能性がある試料中の低頻度の核酸変異（置換、挿入および欠失を含む）の同定および解明、ならびに配列決定誤差のバックグラウンドにおける低頻度の変異の同定を含む。

【0006】

一態様では、本開示は、例えば核酸試料においてなど、配列変異体を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドのそれぞれが５’末端および３’末端を有し、方法は、（ａ）前記複数の個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｂ）（ａ）の環状ポリヌクレオチドを増幅するステップと、（ｃ）増幅されたポリヌクレオチドを配列決定して、複数の配列決定リードを生成するステップと、（ｄ）配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、（ｅ）異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を配列変異体としてコール（ｃａｌｌ）するステップとを含む。一部の実施形態では、方法は、配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を配列変異体としてコールするステップとを含み、（ａ）配列決定リードは、少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドの増幅産物に対応し、（ｂ）少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドのそれぞれは、各々のポリヌクレオチドの５’末端と３’末端をライゲーションすることによって形成された異なる接合部を含む。

【0007】

複数のポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは一本鎖である。一部の実施形態では、環状化は、複数のポリヌクレオチドをライゲーション反応に供することによってなされる。一部の実施形態では、個々の環状ポリヌクレオチドは、環状化されたポリヌクレオチドの中で独特である接合部を有する。一部の実施形態では、配列変異体は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。一部の実施形態では、参照配列は、配列リードを互いとアラインすることによって形成されたコンセンサス配列である。一部の実施形態では、参照配列は、参照ゲノムまたはその一部などの既知の参照配列である。一部の実施形態では、環状化は、アダプターポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチド中のポリヌクレオチドの５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方と接合するステップを含む。一部の実施形態では、増幅は、例えばローリングサークル増幅（ＲＣＡ）においてなど、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用することによってなされる。一部の実施形態では、増幅は、環状ポリヌクレオチドを、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む。一部の実施形態では、増幅は、環状ポリヌクレオチドを、それぞれが異なる標的配列と配列相補性によって特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む。一部の実施形態では、コールするステップに基づいて微生物性汚染物質を同定する。

【0008】

増幅されたポリヌクレオチドは、配列決定の前に富化ステップを実施することによって増幅されたポリヌクレオチドの中で１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドを富化することなどの富化を伴ってまたは伴わずに配列決定に供することができる。一部の実施形態では、富化ステップは、増幅されたポリヌクレオチドを基質に付着させた複数のプローブにハイブリダイズさせることを含む。一部の実施形態では、富化ステップは、（ａ）増幅されたポリヌクレオチド；（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに（ｄ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼを含む増幅反応混合物において、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列を増幅することを含み、ここで、標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離は７５ｎｔまたはそれ未満である。

【0009】

一態様では、本開示は、それぞれが５’末端および３’末端を有するポリヌクレオチド５０ｎｇ未満を含む核酸試料において配列変異体を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、（ａ）リガーゼを用いて前記試料中の個々のポリヌクレオチドを環状化して複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｂ）前記リガーゼを前記環状ポリヌクレオチドから分離したら、環状ポリヌクレオチドを増幅してコンカテマーを形成するステップと、（ｃ）コンカテマーを配列決定して複数の配列決定リードを生成するステップと、（ｄ）複数の配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、（ｅ）前記５０ｎｇ未満のポリヌクレオチドの核酸試料からの前記複数のリードにおいて０．０５％またはそれ超の頻度で生じている配列の差異を配列変異体としてコールするステップとを含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは一本鎖である。一部の実施形態では、個々の環状ポリヌクレオチドは、環状化されたポリヌクレオチドの中で独特である接合部を有する。一部の実施形態では、配列変異体は、一塩基多型である。一部の実施形態では、参照配列は、配列決定リードを互いとアラインすることによって形成されたコンセンサス配列である。一部の実施形態では、参照配列は、参照ゲノムなどの既知の参照配列である。一部の実施形態では、増幅は、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用することによってなされる。一部の実施形態では、増幅は、環状ポリヌクレオチドを、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む。一部の実施形態では、増幅は、環状ポリヌクレオチドを、それぞれが異なる標的配列と配列相補性によって特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む。

【0010】

一態様では、本開示は、反応混合物において標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む複数の異なるコンカテマーを増幅する方法であって、標的配列が、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、反応混合物を核酸増幅反応に供するステップを含み、反応混合物は、（ａ）複数のコンカテマーであって、前記複数の個々のコンカテマーが、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む複数のコンカテマー；（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、配列ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに（ｄ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼを含み、標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離は７５ｎｔまたはそれ未満である。一部の実施形態では、第１のプライマーは、配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、第２のプライマーは、配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、第１のハイブリダイゼーション温度における第１の増幅相の間、配列Ｃも配列Ｄも複数のコンカテマーとハイブリダイズしない。一部の実施形態では、増幅は、第１の相および第２の相を含み、第１の相は、第１の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、プライマー伸長の前に第１および第２のプライマーがコンカテマーとハイブリダイズし、第２の相は、第１の温度よりも高い第２の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、第１および第２のプライマーが、伸長した第１もしくは第２のプライマーまたはその相補体を含む増幅産物とハイブリダイズする。一部の実施形態では、第２の温度におけるハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を５サイクル行った後、反応混合物中の増幅されたポリヌクレオチドの少なくとも５％は、標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む。

【0011】

関連する態様では、本開示は、反応混合物において、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列を含む複数の異なる環状ポリヌクレオチドを増幅する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、反応混合物を核酸増幅反応に供するステップを含み、反応混合物は、（ａ）複数の環状ポリヌクレオチドであって、前記複数の個々の環状ポリヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む、複数の環状ポリヌクレオチド；（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、配列ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに（ｄ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼを含み、配列Ａおよび配列Ｂは内因性配列であり、標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離は７５ｎｔまたはそれ未満である。一部の実施形態では、第１のプライマーは、配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、第２のプライマーは、配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、第１のハイブリダイゼーション温度における第１の増幅相の間、配列Ｃも配列Ｄも複数の環状ポリヌクレオチドとハイブリダイズしない。一部の実施形態では、増幅は、第１の相および第２の相を含み、第１の相は、第１の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、プライマー伸長の前に第１および第２のプライマーが環状ポリヌクレオチドまたはその増幅産物とハイブリダイズし、第２の相は、第１の温度よりも高い第２の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、第１および第２のプライマーが、伸長した第１もしくは第２のプライマーまたはその相補体を含む増幅産物とハイブリダイズする。

【0012】

一態様では、本開示は、本開示の方法に従って方法を実施するための反応混合物を提供する。反応混合物は、種々の方法のいずれかに関して本明細書に記載されている種々の成分のうちの１つまたは複数を含んでよい。一部の実施形態では、反応混合物は、標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む複数の異なるコンカテマーを増幅するための混合物であり、ここで、標的配列は、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含み、反応混合物は、（ａ）複数のコンカテマーであって、前記複数の個々のコンカテマーが、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む複数のコンカテマー；（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに；（ｄ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼを含み、標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離は７５ｎｔまたはそれ未満である。一部の実施形態では、第１のプライマーは、配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、第２のプライマーは、配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、増幅反応の第１の増幅ステップの間、配列Ｃも配列Ｄも２つまたはそれ超のコンカテマーとハイブリダイズしない。

【0013】

一態様では、本開示は、例えば、本開示の種々の他の態様のいずれかにおいてなど、本明細書に記載の方法において有用であるまたはそれによって生成される組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、一本鎖であり、リガーゼを実質的に含まない複数の環状化されたポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、１００００またはそれ未満の標的ポリヌクレオチドの群に対応する複数のコンカテマーを含み、さらに、複数の個々のコンカテマーは、（ａ）配列反復の２つまたはそれ超のコピーを含み、前記コピーの全てが同じ標的ポリヌクレオチドに対応すること、および（ｂ）前記組成物中の１つの個々のコンカテマーの配列反復の２つまたはそれ超のコピー間の接合部が別の個々のコンカテマーのものとは異なることを特徴とする。

【0014】

一態様では、本開示は、配列変異体を検出するためのシステムを提供する。一部の実施形態では、システムは、（ａ）試料に対する検出反応を実施するための使用者要求を受信するように構成されたコンピュータ；（ｂ）使用者要求に応答して試料またはその一部に対する核酸増幅反応を実施する増幅システムであって、増幅反応が、（ｉ）個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｉｉ）環状ポリヌクレオチドを増幅するステップとを含む増幅システム；（ｃ）増幅システムによって増幅されたポリヌクレオチドの配列決定リードを作成し、配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定し、異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を配列変異体としてコールするシークエンシングシステム；および（ｄ）受信者に報告を送信する報告作成プログラムであって、報告が、配列変異体の検出の結果を含有する報告作成プログラムを含む。一部の実施形態では、受信者は使用者である。

【0015】

一態様では、本開示は、１つまたは複数のプロセッサにより実行されると、配列変異体を検出する方法を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体を提供する。一部の実施形態では、実行される方法は、（ａ）試料に対する検出反応を実施するための顧客要求を受信するステップと、（ｂ）顧客要求に応答して試料またはその一部に対する核酸増幅反応を実施するステップであって、増幅反応が、（ｉ）個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｉｉ）環状ポリヌクレオチドを増幅するステップとを含むステップと、（ｃ）（ｉ）増幅反応において増幅されたポリヌクレオチドの配列決定リードを作成するステップと、（ｉｉ）配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、（ｉｉｉ）異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を配列変異体としてコールするステップとを含む配列決定解析を実施するステップと、（ｄ）配列変異体の検出の結果を含有する報告を作成するステップとを含む。

【0016】

本明細書に開示されている種々の態様のいずれかの一部の実施形態では、方法、組成物、およびシステムは、例えば、患者試料の特徴付けおよび場合によって対象の状態の診断においてなど、治療に適用される。一部の実施形態では、試料は、尿、便、血液、唾液、組織、または体液などの対象由来の試料である。一部の実施形態では、試料は、対象由来の腫瘍組織の試料中のものなどの腫瘍細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。一部の実施形態では、方法は、コールするステップに基づいて対象を診断するステップをさらに含む。一部の実施形態では、配列変異体は、原因遺伝子変異体である。一部の実施形態では、配列変異体は、がんの種類または病期に関連するものである。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、無細胞ＤＮＡまたは循環腫瘍ＤＮＡなどの無細胞ポリヌクレオチドを含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
それぞれが５’末端および３’末端を有する複数のポリヌクレオチドを含む核酸試料における配列変異体を同定する方法であって、
（ａ）前記複数の個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが前記５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記環状ポリヌクレオチドを増幅するステップと、
（ｃ）増幅されたポリヌクレオチドを配列決定して、複数の配列決定リードを生成するステップと、
（ｄ）配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、
（ｅ）異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするステップと
を含む方法。
（項目２）
配列変異体を同定する方法であって、配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするステップとを含み、
（ａ）前記配列決定リードが、前記少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドの増幅産物に対応し、
（ｂ）前記少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドのそれぞれが、各々のポリヌクレオチドの５’末端と３’末端をライゲーションすることによって形成された異なる接合部を含む、
方法。
（項目３）
前記複数のポリヌクレオチドが一本鎖である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
環状化が、前記複数のポリヌクレオチドをライゲーション反応に供することによってなされる、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
個々の環状ポリヌクレオチドが、環状化されたポリヌクレオチドの中で独特である接合部を有する、項目１または２に記載の方法。
（項目６）
前記配列変異体が、一塩基多型である、項目１または２に記載の方法。
（項目７）
前記参照配列が、前記配列決定リードを互いとアラインすることによって形成されたコンセンサス配列である、項目１または２に記載の方法。
（項目８）
前記参照配列が、既知の参照配列である、項目１または２に記載の方法。
（項目９）
環状化が、アダプターポリヌクレオチドを前記複数のポリヌクレオチド中のポリヌクレオチドの５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方と接合するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用することによってなされる、項目１に記載の方法。
（項目１１）
増幅が、前記環状ポリヌクレオチドを、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
増幅が、前記環状ポリヌクレオチドを、それぞれが異なる標的配列と配列相補性によって特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記増幅されたポリヌクレオチドを、富化を伴わずに前記配列決定ステップに供する、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１４）
配列決定の前に、富化ステップを実施することによって、前記増幅されたポリヌクレオチドの中で１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドを富化するステップをさらに含む、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１５）
前記富化ステップが、増幅されたポリヌクレオチドを、基質に付着させた複数のプローブにハイブリダイズさせることを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記富化ステップが、
（ａ）前記増幅されたポリヌクレオチド；
（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、前記標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；
（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、前記標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに
（ｄ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼ
を含む増幅反応混合物において、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列を増幅することを含み、
前記標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離が７５ｎｔまたはそれ未満である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記コールするステップに基づいて微生物性汚染物質を同定する、項目１または２に記載の方法。
（項目１８）
それぞれが５’末端および３’末端を有するポリヌクレオチド５０ｎｇ未満を含む核酸試料において配列変異体を同定する方法であって、
（ａ）リガーゼを用いて前記試料中の個々のポリヌクレオチドを環状化して複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、
（ｂ）前記リガーゼを前記環状ポリヌクレオチドから分離したら、前記環状ポリヌクレオチドを増幅してコンカテマーを形成するステップと、
（ｃ）前記コンカテマーを配列決定して複数の配列決定リードを生成するステップと、
（ｄ）複数の配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、
（ｅ）前記５０ｎｇ未満のポリヌクレオチドの核酸試料からの前記複数のリードにおいて０．０５％またはそれ超の頻度で生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするステップと
を含む方法。
（項目１９）
前記試料の前記ポリヌクレオチドが一本鎖である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
個々の環状ポリヌクレオチドが、環状化されたポリヌクレオチドの中で独特である接合部を有する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記配列変異体が、一塩基多型である、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記参照配列が、前記配列決定リードを互いとアラインすることによって形成されたコンセンサス配列である、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記参照配列が、既知の参照配列である、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
増幅が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用することによってなされる、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
増幅が、前記環状ポリヌクレオチドを、ランダムプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
増幅が、前記環状ポリヌクレオチドを、それぞれが異なる標的配列と配列相補性によって特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを含む増幅反応混合物に供することを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
反応混合物において、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む複数の異なるコンカテマーを増幅する方法であって、前記反応混合物を核酸増幅反応に供するステップを含み、前記反応混合物が、
（ａ）複数のコンカテマーであって、前記複数の個々のコンカテマーが、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む、複数のコンカテマー；
（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、前記標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；
（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、前記標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、配列ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに
（ｄ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼ
を含み、
前記標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離が７５ｎｔまたはそれ未満である、方法。
（項目２８）
反応混合物において、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列を含む複数の異なる環状ポリヌクレオチドを増幅する方法であって、前記反応混合物を核酸増幅反応に供するステップを含み、前記反応混合物が、
（ａ）複数の環状ポリヌクレオチドであって、前記複数の個々の環状ポリヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む、複数の環状ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、前記標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；
（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、前記標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、配列ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに
（ｄ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼ
を含み、
配列Ａおよび配列Ｂが内因性配列であり、前記標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離が７５ｎｔまたはそれ未満である、方法。
（項目２９）
前記第１のプライマーが配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、前記第２のプライマーが配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、第１のハイブリダイゼーション温度における第１の増幅相の間、配列Ｃも配列Ｄも前記複数のコンカテマーとハイブリダイズしない、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
増幅が、第１の相および第２の相を含み、前記第１の相が、第１の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、プライマー伸長の前に前記第１および第２のプライマーが前記コンカテマーとハイブリダイズし、前記第２の相が前記第１の温度よりも高い第２の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、前記第１および第２のプライマーが、伸長した第１もしくは第２のプライマーまたはその相補体を含む増幅産物とハイブリダイズする、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記第２の温度におけるハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を５サイクル行った後、前記反応混合物中の増幅されたポリヌクレオチドの少なくとも５％が前記標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第１のプライマーが配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、前記第２のプライマーが配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、第１のハイブリダイゼーション温度における第１の増幅相の間、配列Ｃも配列Ｄも前記複数の環状ポリヌクレオチドとハイブリダイズしない、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
増幅が、第１の相および第２の相を含み、前記第１の相が、第１の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、プライマー伸長の前に前記第１および第２のプライマーが前記環状ポリヌクレオチドまたはその増幅産物とハイブリダイズし、前記第２の相が、前記第１の温度よりも高い第２の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、前記第１および第２のプライマーが、伸長した第１もしくは第２のプライマーまたはその相補体を含む増幅産物とハイブリダイズする、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む複数の異なるコンカテマーを増幅するための反応混合物であって、
（ａ）複数のコンカテマーであって、前記複数の個々のコンカテマーが、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む、複数のコンカテマー；
（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、前記標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；
（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、前記標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに
（ｄ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼ
を含み、
前記標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離が７５ｎｔまたはそれ未満である、反応混合物。
（項目３５）
前記第１のプライマーが配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、前記第２のプライマーが配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、増幅反応の第１の増幅ステップの間、配列Ｃも配列Ｄも前記２つまたはそれ超のコンカテマーとハイブリダイズしない、項目３４に記載の反応混合物。
（項目３６）
一本鎖であり、リガーゼを実質的に含まない複数の環状化されたポリヌクレオチドを含む組成物。
（項目３７）
複数のコンカテマーを含む組成物であって、前記複数のコンカテマーが、１００００またはそれ未満の標的ポリヌクレオチドの群に対応し、さらに、前記複数の個々のコンカテマーが、
（ａ）配列反復の２つまたはそれ超のコピーを含み、前記コピーの全てが同じ標的ポリヌクレオチドに対応し、
（ｂ）前記組成物における１つの個々のコンカテマーの前記配列反復の前記２つまたはそれ超のコピー間の接合部が別の個々のコンカテマーのものとは異なる
ことを特徴とする、組成物。
（項目３８）
配列変異体を検出するためのシステムであって、
（ａ）試料に対する検出反応を実施するための使用者要求を受信するように構成されたコンピュータ；
（ｂ）前記使用者要求に応答して前記試料またはその一部に対する核酸増幅反応を実施する増幅システムであって、前記増幅反応が、（ｉ）個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｉｉ）前記環状ポリヌクレオチドを増幅するステップとを含む増幅システム；
（ｃ）前記増幅システムによって増幅されたポリヌクレオチドの配列決定リードを作成し、配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定し、異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするシークエンシングシステム；および
（ｄ）受信者に報告を送信する報告作成プログラムであって、前記報告が、前記配列変異体の検出の結果を含有する報告作成プログラム
を含むシステム。
（項目３９）
前記受信者が使用者である、項目３８に記載のシステム。
（項目４０）
１つまたは複数のプロセッサにより実行されると、配列変異体を検出する方法を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体であって、該方法は、
（ａ）試料に対する検出反応を実施するための顧客要求を受信するステップと、
（ｂ）前記顧客要求に応答して前記試料またはその一部に対する核酸増幅反応を実施するステップであって、前記増幅反応が、（ｉ）個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｉｉ）前記環状ポリヌクレオチドを増幅するステップとを含むステップと、
（ｃ）（ｉ）前記増幅反応において増幅されたポリヌクレオチドの配列決定リードを作成するステップと、（ｉｉ）配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、（ｉｉｉ）異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を前記配列変異体としてコールするステップとを含む配列決定解析を実施するステップと、
（ｄ）前記配列変異体の検出の結果を含有する報告を作成するステップと
を含む、コンピュータ可読媒体。
（項目４１）
前記試料が、対象由来の試料である、項目１または２に記載の方法。
（項目４２）
前記試料が、尿、便、血液、唾液、組織、または体液である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記試料が、腫瘍細胞を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記コールするステップに基づいて前記対象を診断するステップをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
前記配列変異体が原因遺伝子変異体である、項目１または２に記載の方法。
（項目４７）
前記配列変異体が、がんの種類または病期に関連する、項目１または２に記載の方法。
（項目４８）
前記複数のポリヌクレオチドが、無細胞ポリヌクレオチドを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４９）
前記無細胞ポリヌクレオチドが、循環腫瘍ＤＮＡを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記試料の前記ポリヌクレオチドが、無細胞ポリヌクレオチドを含む、項目１８に記載の方法。
（項目５１）
前記配列変異体が原因遺伝子変異体である、項目１８に記載の方法。
（項目５２）
前記ポリヌクレオチドが無細胞ＤＮＡである、項目３６に記載の組成物。

【0017】

参照による組み込み
本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個別の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個々に参照により組み込まれることが示されたのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。

【0018】

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本発明の原理が利用されている例示的な実施形態が記載されている以下の詳細な説明および付属図面を参照することにより、本発明の特徴および利点がよりよく理解される。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、本開示による方法の一実施形態の概略図である。ＤＮＡ鎖を環状化し、調査中の遺伝子に対応する標的特異的プライマーをポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液などと一緒に添加し、したがって、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が起こって鋳型ＤＮＡ（例えば、「単量体」）のコンカテマー（例えば「多量体」）が形成される。コンカテマーを処理して対応する相補鎖を合成し、次いで、アダプターを付加して配列決定ライブラリーを作出する。この結果もたらされるライブラリーは、その後に標準の技術を使用して配列決定されるが、一般に、３つの種：稀な配列変異体（例えば、突然変異）を含有しないｎＤＮＡ（「正常な」ＤＮＡ）；酵素的な配列決定誤差を含有するｎＤＮＡ、および、増幅前に試料ポリヌクレオチド中に元から存在していた「本物の」または実際の配列変異体の多量体を含有するＤＮＡを含有する。有効に稀な突然変異の多数のコピーが存在することにより、配列変異体の検出および同定が可能になる。

【0020】

【図2】図２は、図１と同様であるが、ポリヌクレオチドの環状化を容易にするためにアダプターを付加した戦略を示す図である。図２はまた、標的特異的プライマーの使用も示す。

【0021】

【図3】図３は、増幅にアダプタープライマーを使用すること以外は図２と同様の図である。

【0022】

【図4】図４は、環状化されたｃｃＤＮＡの形成に関連する３つの実施形態を示す図である。一番上は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をアダプターの不在下で環状化するものであり、中央のスキームはアダプターの使用を示し、一番下のスキームは、２種のアダプターオリゴ（各末端に異なる配列をもたらす）を利用するものであり、両方のアダプターとハイブリダイズして２つの末端を近接させる副子オリゴをさらに含んでよい。

【0023】

【図5】図５は、ライゲーションのために一本鎖ＤＮＡの２つの末端を空間的に近接させるために「分子クランプ」を使用することによって特異的な標的を環状化するための実施形態を示す図である。

【0024】

【図6】図６Ａおよび６Ｂは、核酸のブロッキング末端を使用してアダプターを付加するための２つのスキームを示す図である。

【0025】

【図7】図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を刺激するための３つの異なるやり方を示す図である。図７Ａは、標的、例えば、目的の特定の標的遺伝子または標的配列に特異的なプライマーの使用を示す。これにより、一般に、標的配列のみが増幅される。図７Ｂは、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を実施するためのランダムプライマーの使用を示し、これにより、一般に、全ての試料配列が増幅され、次いでそれをプロセシングの間にバイオインフォマティクスによって選別する。図７Ｃは、アダプターを使用する場合のアダプタープライマーの使用を示し、これは同様に、一般的な非標的特異的増幅をもたらすものである。

【0026】

【図8】図８は、ある実施形態による、両方の鎖が増幅される二本鎖ＤＮＡの環状化および増幅の例を示す。

【0027】

【図9】図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、および９Ｄは、その後の配列決定のために相補鎖合成を実現するための種々のスキームを示す。図９Ａは、標的鎖のランダムプライミングの使用、その後のライゲーションを示す。図９Ｂは、標的鎖のアダプタープライミングの使用、同様にその後のライゲーションを示す。図９Ｃは、「ループ」アダプターの使用を示し、ここで、アダプターは、相補的である配列の２つの切片を有し、したがって、これらは互いとハイブリダイズしてループ（例えば、ステムループ構造）を創出する。コンカテマーの末端とのライゲーションの際、ループの遊離末端は、相補鎖に対するプライマーとしての機能を果たす。図９Ｄは、第２の鎖合成を実現するための高分岐ランダムプライマーの使用を示す。

【0028】

【図10】図１０は、標的配列の単量体内でアラインした場合に互いと離れる方に配向された（「背中合わせ」とも称され、例えば、２方向に配向されているが、増幅されるドメインの末端上にはない）プライマー対を使用した、標的核酸配列の少なくとも２つのコピーを含有する環状ポリヌクレオチドまたは鎖の配列決定を促進する実施形態によるＰＣＲ方法を示す図である。一部の実施形態では、これらのプライマーセットを、コンカテマーを形成してアンプリコンが標的配列のより高次の多量体、例えば、二量体、三量体などになるのを促進した後に使用する。場合によって、方法は、二量体よりも小さいアンプリコンを除去するためのサイズ選択をさらに含んでよい。

【0029】

【図11】図１１は、背中合わせ（Ｂ２Ｂ）プライマーを「タッチアップ」ＰＣＲステップと共に使用し、したがって、短い産物（例えば、単量体など）の増幅が不利になる実施形態を示す。この場合、プライマーは、２つのドメイン；標的配列とハイブリダイズする第１のドメイン（灰色または黒い矢印）および元の標的配列とはハイブリダイズしない「ユニバーサルプライマー」結合性ドメイン（折り曲がった四角形；時にはアダプターとも称される）である第２のドメインを有する。一部の実施形態では、ＰＣＲの第１のラウンドを低温アニーリングステップで行い、したがって、遺伝子に特異的な配列が結合する。低温での実行により、短い産物を含めた種々の長さのＰＣＲ産物がもたらされる。少数のラウンド後、アニーリング温度を上昇させ、したがって、プライマー全体、両方のドメインのハイブリダイゼーションが有利になるようにし、示されている通り、これらは、鋳型の末端において見いだされ、一方で内部の結合は不安定になる。したがって、高温で両方のドメインを用いると、低温または単一ドメインのみの場合よりも短い産物が不利になる。

【0030】

【図12】図１２Ａおよび１２Ｂは、配列決定ライブラリー構築の２つの異なる方法を示す図である。図１２Ａは、単一のステップでＤＮＡを同時に断片化し、配列決定アダプターでタグ付けすることができるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｎｅｘｔｅｒａ試料調製システムの例を説明する。図１２Ｂでは、コンカテマーを超音波処理によって断片化し、その後、アダプターを両末端に添加し（例えば、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのキットを使用することによって）、ＰＣＲ増幅する。他の方法が利用可能である。

【0031】

【図13】図１３Ａ〜Ｃは、従来のＰＣＲプライマー設計と比較した、背中合わせ（Ｂ２Ｂ）プライマーの設計の例示的な利点の図である。従来のＰＣＲプライマー設計（左側）では、プライマー（矢印、ＡおよびＢ）は、突然変異のホットスポット（黒い星印）であり得る標的配列を挟む領域に配置され、また、一般には少なくとも６０塩基対（ｂｐ）離れており、これにより、約１００ｂｐの典型的なフットプリントがもたらされる。この図において、Ｂ２Ｂプライマーの設計（右側）では、プライマーは標的配列の片側に配置される。２つのＢ２Ｂプライマーは逆方向を向いており、いずれかは重複してよい（例えば、約１２ｂｐもしくはそれ未満、約１０ｂｐもしくはそれ未満、約５ｂｐもしくはそれ未満、またはそれ未満）。Ｂ２Ｂプライマーの長さに応じて、この図における全フットプリントは、２８〜５０ｂｐであり得る。従来の設計では、フットプリントが大きいことに起因して、断片化事象によってプライマー結合が破壊される可能性がより高く、それにより、直鎖状断片であるか（１３Ａ）、環状化されたＤＮＡであるか（１３Ｂ）、または増幅産物であるか（１３Ｃ）にかかわらず、配列情報が失われる。さらに、図１３Ｃにおいて例示されているように、Ｂ２Ｂプライマーの設計では、異なるポリヌクレオチドを区別するために使用することができる接合部の配列（「天然バーコード」とも称される）が捕捉される。

【0032】

【図14】図１４は、ある実施形態に従って配列変異体を検出するための鋳型を作製するための方法（例えば、本明細書では「Ｎｅｂｕｌａ」とも称される、環状化されたポリヌクレオチドを使用するプロセスの実行例）を説明する図である。ＤＮＡインプットを変性させてｓｓＤＮＡにし、ライゲーションによって環状化し、環状化されなかったＤＮＡをエキソヌクレアーゼ消化によって分解する。ライゲーション効率を定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって数量化し、インプットＤＮＡと環状化されたＤＮＡの量を比較し、一般には、少なくとも約８０％のライゲーション効率がもたらされる。環状化されたＤＮＡを精製して緩衝液を交換し、その後、ランダムプライマーおよびＰｈｉ２９ポリメラーゼを用いた全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を行う。ＷＧＡ産物を精製し、産物を断片化して（例えば、超音波処理によって）約４００ｂｐまたはそれ未満の短い断片にする。増幅されたＤＮＡのオンターゲット率を、同じ量の参照ゲノムＤＮＡと増幅されたＤＮＡを比較するｑＰＲＣによって数量化し、一般には、約９５％またはそれ超の平均オンターゲット率が示される。

【0033】

【図15】図１５は、有尾Ｂ２Ｂプライマーを用いた増幅の別の実行、および高温でのＰＣＲの「タッチアップ」第２相の実行を説明する図である。Ｂ２Ｂプライマーは、配列に特異的な領域（太い黒い線）およびアダプター配列（白い四角）を含有する。より低い、第１相アニーリング温度を用いると、標的特異的配列が鋳型とアニーリングして、最初の単量体がもたらされ、ＰＣＲ産物は縦列反復を含有する（１５Ａ）。高温の第２の増幅相では、標的特異的配列とアダプター配列の両方のハイブリダイゼーションが、標的特異的配列が単独でハイブリダイズするよりも有利であり、これにより、短い産物が優先的に生成する程度が低下する（１５Ｂ）。全プライマーに有利でなく、標的特異的配列との内部アニーリングにより、単量体の画分が急速に増加する（１５Ｃ、左側）。

【0034】

【図16】図１６は、変異体として計数される２つの異なるポリヌクレオチド（例えば、異なる接合部によって同定されたもの）に配列の差異が生じていることを要求して（下の線）、および要求せずに（上の線）、Ｑ３０フィルターを使用して標的配列決定方法によって検出されたバックグラウンドノイズ（変異体の頻度）間の比較を説明する図である。この検証フィルターの適用は、本明細書では、「Ｆｉｒｅｆｌｙ」とも称される。ヒトゲノムＤＮＡ（１２８７８、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は１００〜２００ｂｐに断片化され、公知のＳＮＰ（ＣＹＰ２Ｃ１９）を含有するゲノムＤＮＡの２％スパイクイン（１９２４０、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を含んだ。真の変異体シグナル（顕著なピーク）は有意にはバックグラウンドを超えなかった（上、薄い灰色のプロット）。バックグラウンドノイズは検証フィルターを適用することによって約０．１まで減少した（下、黒のプロット）。

【0035】

【図17】図１７は、ポリヌクレオチドの集団において種々の低頻度（２％、０．２％、および０．０２％）でスパイクされ、それにもかかわらず、本開示の方法を適用すると有意にバックグラウンドを超えた配列変異体の検出を説明する図である。

【0036】

【図18】図１８は、本開示のある実施形態のライゲーション効率およびオンターゲット率の解析結果を説明する図である。

【0037】

【図19】図１９は、本開示のある実施形態による方法における対立遺伝子頻度の保存、および偏りが実質的に存在しないことを説明する図である。

【0038】

【図20】図２０は、ある実施形態による、小さなインプット試料における配列変異体の検出の結果を説明する図である。

【0039】

【図21】図２１は、標準の配列決定方法に従って、２つの異なるポリヌクレオチドにおいて配列の差異が生じていることを要求せずに得られた配列変異体の検出の結果における高バックグラウンドの例を説明する図である。

【0040】

【図22】図２２は、ゲノムのＧＣ含量分布と、本開示のある実施形態による方法（「Ｎｅｂｕｌａ−Ｆｉｒｅｆｌｙ」；左側）に従って生じた配列決定結果のＧＣ含量分布、代替配列決定ライブラリー構築キット（Ｒｕｂｉｃｏｎ、Ｒｕｂｉｃｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；中央）を使用した配列決定結果のＧＣ含量分布、および一般に、３２ｎｇであると文献において報告されている無細胞ＤＮＡのＧＣ含量分布（ｃｆＤＮＡ）（右側）の比較を説明するグラフである。

【0041】

【図23】図２３は、ある実施形態による方法の配列決定リードから得たインプットＤＮＡのサイズ分布を説明するグラフである。

【0042】

【図24】図２４は、ある実施形態に従うランダムプライミング法による多数の標的にわたって均一な増幅を説明するグラフである。

【0043】

【図25】図２５は、環状化の不在下で同定可能な接合部を有するポリヌクレオチド多量体の形成に関する実施形態を説明する図である。ポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド断片、または無細胞ＤＮＡなど）を接合して、本開示の実施形態による独立したポリヌクレオチドを区別するのに有用な非天然接合部（本明細書では「自己タグ」とも称される）を有する多量体を形成する。図２５Ａでは、ポリヌクレオチドを、平滑末端ライゲーションによって互いと直接接合する。図２５Ｂでは、ポリヌクレオチドを１つまたは複数の介在アダプターオリゴヌクレオチドを介して接合し、介在アダプターオリゴヌクレオチドは、バーコード配列をさらに含んでよい。次いで、多量体を、種々の方法のいずれかによる、例えば、ランダムプライマー（全ゲノム増幅）、アダプタープライマー、または１つもしくは複数の標的特異的プライマーもしくはプライマー対によるものなどの増幅に供する。複数の別々のポリヌクレオチドから同定可能な接合部を有する多量体を形成するためのプロセスは、本明細書では「Ｅｃｌｉｐｓｅ」とも称される。

【0044】

【図26】図２６は、図２５のプロセスにおける変異例を説明する図である。ポリヌクレオチド（例えば、ｃｆＤＮＡ、または他のポリヌクレオチド断片）を末端修復し、Ａ尾部付加し、アダプターライゲーションする（例えば、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのキットなどの標準のキットを使用して）。内部ウラシル（Ｕ）で標識した担体ＤＮＡを補充して、総ＤＮＡインプットを所望のレベルまで（例えば、約２０ｎｇまたはそれ超まで）生じさせることができる。検出される配列変異体は「星印」によって示される。ライゲーションが完了したら、担体ＤＮＡは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの混合物であるウラシル特異的切除試薬（ＵＳＥＲ）酵素を添加することによって分解することができる。産物を精製して、担体ＤＮＡの断片を排除する。精製された産物を増幅する（例えば、ＰＣＲによって、アダプター配列を対象とするプライマーを使用して）。残留している担体ＤＮＡはいずれも、分解、および少なくとも一方の末端のアダプターからの分離に起因して、増幅される可能性が低い。増幅産物を精製して短いＤＮＡ断片を除去することができる。

【0045】

【図27】図２７は、図２５のプロセスにおける変異例を説明する図である。標的特異的増幅プライマーは、アダプターとして機能する共通の５’「尾部」（灰色の矢印）を含む。最初の増幅（例えば、ＰＣＲによる）は、数サイクル（例えば、少なくとも約５、１０、またはそれ超のサイクル）にわたって進行する。ＰＣＲ産物は、同様にプライマーとしての機能を果たし得、他のＰＣＲ産物とアニーリングして（例えば、第２の相においてアニーリング温度を低下させた場合）、同定可能な接合部を有するコンカテマーが生成する。第２の相は、いくつかのサイクル（例えば、５、１０、１５、２０、またはそれ超のサイクル）を含んでよく、また、コンカテマーの形成および増幅に有利な条件の選択または変異を含んでよい。この概略図に従った方法は、「Ｒｅｌａｙ Ａｍｐ Ｓｅｑ」とも称され、区分された状況（例えば、液滴）において特定の使用を見いだすことができる。

【0046】

【図28】図２８Ａ〜Ｅは、ポリヌクレオチドを環状化するための方法の非限定的な例を説明する図である。図２８Ａでは、二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｄｓＤＮＡ）を変性させて一本鎖にし、その後、直接環状化（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅによる自己接合ライゲーション）を行う。図２８Ｂでは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ断片）を、ライゲーション効率を改善するために末端修復およびＡ尾部付加（３’末端へのアデノシンの一塩基伸長の付加）し、その後、変性させて一本鎖にし、環状化を行う。図２８Ｃでは、ポリヌクレオチドを、末端修復およびＡ尾部付加し（二本鎖の場合）、チミジン（Ｔ）伸長を有するアダプターに接合し、変性させて一本鎖にし、環状化する。図２８Ｄでは、ポリヌクレオチドを、末端修復およびＡ尾部付加し（二本鎖の場合）、両末端を、３つの要素（ライゲーションのためのＴ伸長、アダプター間の相補性、および３’尾部）を有するアダプターとライゲーションし、鎖を変性させ、一本鎖ポリヌクレオチドを環状化する（アダプター配列間の相補性によって容易になる）。図２８Ｅでは、二本鎖ポリヌクレオチドを変性させて一本鎖の形態にし、ポリヌクレオチドの末端を近づけて接合を容易にする分子クランプの存在下で環状化する。

【0047】

【図29】図２９は、特に、環状化されたポリヌクレオチドに関して、本開示の方法に従って配列変異体を同定するための増幅システムのワークフロー設計の例を説明する図である。

【0048】

【図30】図３０は、特に、環状化ステップを伴わない直鎖状ポリヌクレオチドインプットに関して、本開示の方法に従って配列変異体を同定するための増幅システムのワークフロー設計の例を説明する図である。

【0049】

【図31】図３１は、本開示の方法に従って配列変異体を同定するためのワークフローの例の概要図である。「Ｅｃｌｉｐｓｅ」（直鎖状ポリヌクレオチド解析）の枝に沿って、解析は、デジタルＰＣＲ（例えば、デジタルドロップレットＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、接合部の配列の解析（ａｕｔｏ ｔａｇ）を用いたプローブ捕捉による富化（ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｑ）、挿入したアダプター配列（ｂａｒｃｏｄｅｄ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）に基づく配列決定、またはＲｅｌａｙ Ａｍｐ配列決定を含み得る。「Ｎｅｂｕｌａ」（環状化されたポリヌクレオチド解析）に沿って、解析は、デジタルＰＣＲ（例えば、デジタルドロップレットＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、接合部の配列の解析（ｎａｔｕｒａｌ ｂａｒｃｏｄｅ）を用いたプローブ捕捉による富化（ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｑ）、プローブ捕捉による富化または標的化増幅（例えば、Ｂ２Ｂ増幅）、および配列変異体を２つの異なるポリヌクレオチド（例えば、異なる接合部を有するポリヌクレオチド）において生じている差異として同定する検証ステップを伴う配列解析を含み得る。

【0050】

【図32】図３２は、ある実施形態によるシステムの図である。

【0051】

【図33】図３３は、ある例による、標的領域に沿った捕捉の効率およびカバレッジを説明する図である。標的とされる塩基の９０％超が２０×超カバーされ、標的とされる塩基の５０％超が５０×超のカバレッジを有する。

【発明を実施するための形態】

【0052】

本明細書に開示されている一部の実施形態の実施では、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内に入る、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技法を使用する。例えば、SambrookおよびGreen、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第４版（２０１２年）；the series Current Protocols in Molecular Biology（F. M. Ausubelら編）；the series Methods In Enzymology（Academic Press, Inc.）、PCR 2: A Practical Approach（M.J. MacPherson、B.D. HamesおよびG.R. Taylor編（１９９５年））、HarlowおよびLane編（１９８８年）Antibodies, A Laboratory Manual, and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications、第６版（R.I. Freshney編（２０１０年））を参照されたい。

【0053】

「約」または「およそ」という用語は、当業者よって決定される、特定の値についての許容される誤差範囲内を意味し、これは、当該値をどのように測定または決定するか、すなわち、測定システムの限定に一部左右される。例えば、「約」とは、当技術分野の慣習に従って、１または１超の標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」とは、所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁分以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、別段に述べられていない限り、特定の値について許容される誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。

【0054】

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態、またはその類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有するものであってよく、また、既知または未知の任意の機能を果たすものであってよい。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析により定義された遺伝子座（複数または単数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集合の前、またはその後に与えられてよい。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド成分が割り込んでいてよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識成分とのコンジュゲーションなどによってさらに修飾することができる。

【0055】

一般に、「標的ポリヌクレオチド」という用語は、その存在、量、および／もしくはヌクレオチド配列、またはこれらのうちの１つもしくは複数の変化を決定することが望まれる標的配列を有する核酸分子の出発集団内の核酸分子またはポリヌクレオチドを指す。一般に、「標的配列」という用語は、核酸の単一の鎖上の核酸配列を指す。標的配列は、遺伝子、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡを含めたＲＮＡ、または他のものの一部であってよい。標的配列は、試料由来の標的配列または増幅反応の産物などの二次的な標的であってよい。

【0056】

一般に、「ヌクレオチドプローブ」、「プローブ」または「タグオリゴヌクレオチド」とは、ハイブリダイゼーション反応におけるその対応する標的ポリヌクレオチドを、対応する標的配列とのハイブリダイゼーションによって検出または同定するために使用されるポリヌクレオチドを指す。したがって、ヌクレオチドプローブは、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能である。タグオリゴヌクレオチドは、試料中の１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドと完全に相補的であってもよく、または、試料中の１つまたは複数の標的ポリヌクレオチド内の対応するヌクレオチドと相補的でない１つまたは複数のヌクレオチドを含有してもよい。

【0057】

「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、塩基相補性に応じて、ワトソン・クリック塩基対合によって、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的な様式で生じるものであってよい。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多鎖複合体を形成する３つもしくはそれ超の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、またはポリヌクレオチドのエンドヌクレアーゼによる酵素的切断など、より広範囲にわたるプロセスにおけるステップを構成するものであってよい。第１の配列と相補的である第２の配列は、第１の配列の「相補体」と称される。「ハイブリダイズ可能」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがハイブリダイゼーション反応においてヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体を形成する能力を指す。

【0058】

「相補性」とは、核酸が従来のワトソン・クリックまたは他の従来のものでない型のいずれかによって別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子内の残基の百分率を示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０はそれぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の連続した残基の全てが、第２の核酸配列内の同じ数の連続した残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ超のヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である相補性の程度を指す、または、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。配列同一性は、例えばパーセント相補性を評価する目的などで、これらに限定されないが、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.htmlにおいて入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ ａｌｉｇｎｅｒを参照されたい、場合によって初期設定で）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにおいて入手可能なＢＬＡＳＴ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｏｏｌを参照されたい、場合によって初期設定で）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.htmlにおいて入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒ ａｌｉｇｎｅｒを参照されたい、場合によって初期設定で）を含めた任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって測定することができる。最適なアラインメントは、初期パラメータを含めた、選択したアルゴリズムの任意の適切なパラメータを使用して評価することができる。

【0059】

一般に、ハイブリダイゼーションについての「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対する相補性を有する核酸が主に標的配列とハイブリダイズし、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存性であり、いくつかの因子に応じて変動する。一般に、配列が長いほど、その標的配列と配列特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Tijssen（１９９３年）、Laboratory Technniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、Second Chapter 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」、Elsevier、N.Yに詳しく記載されている。

【0060】

一態様では、本開示は、例えば核酸試料においてなど、配列変異体を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドのそれぞれが５’末端および３’末端を有し、方法は、（ａ）前記複数の個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｂ）（ａ）の環状ポリヌクレオチドを増幅するステップと、（ｃ）増幅されたポリヌクレオチドを配列決定して、複数の配列決定リードを生成するステップと、（ｄ）配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、（ｅ）異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を配列変異体としてコールするステップとを含む。一部の実施形態では、方法は、配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を配列変異体としてコールするステップとを含み、（ａ）配列決定リードは、少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドの増幅産物に対応し、（ｂ）少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドのそれぞれは、各々のポリヌクレオチドの５’末端と３’末端をライゲーションすることによって形成された異なる接合部を含む。

【0061】

一般に、「配列変異体」という用語は、１つまたは複数の参照配列と相対的な配列内の任意の変異を指す。一般には、配列変異体は、参照配列が既知である個体の所与の集団についての参照配列よりも低い頻度で生じている。例えば、特定の細菌属は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関してコンセンサス参照配列を有し得るが、その属内の個々の種は、細菌の集団内の種を同定するのに有用である遺伝子（またはその一部）内の１つまたは複数の配列変異体を有し得る。別の例として、同じ種の多数の個体に関する配列（または同じ個体に関する多数の配列決定リード）から、最適にアラインした場合にコンセンサス配列が生じ得、そのコンセンサスに対する配列変異体を使用して、危険な汚染を示す、集団内の突然変異体を同定することができる。一般に、「コンセンサス配列」とは、一連の関連する核酸が、種々の配列アラインメントアルゴリズムのいずれかに応じて最適な配列アラインメントなどの集中的な数学的および／または配列解析に供された場合に、配列内の各位置における塩基の最も一般的な選択を反映するヌクレオチド配列を指す。種々のアラインメントアルゴリズムが利用可能であり、そのいくつかは本明細書に記載されている。一部の実施形態では、参照配列は、単一の個体のゲノム配列などの単一の既知の参照配列である。一部の実施形態では、参照配列は、参照集団としての機能を果たす多数の個体のゲノム配列、または同じ個体からのポリヌクレオチドの多数の配列決定リードなどの多数の既知の配列をアラインすることによって形成されるコンセンサス配列である。一部の実施形態では、参照配列は、解析中の試料からの配列を最適にアラインすることによって形成されるコンセンサス配列であり、したがって、配列変異体は、同じ試料中の対応する配列に相対的な変異を表す。一部の実施形態では、配列変異体は、集団内に低頻度で生じている（「稀な」配列変異体とも称される）。例えば、配列変異体は、約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１．５％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．７５％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．２５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０７５％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０４％もしくはそれ未満、約０．０３％もしくはそれ未満、約０．０２％もしくはそれ未満、約０．０１％もしくはそれ未満、約０．００５％もしくはそれ未満、約０．００１％もしくはそれ未満、またはそれ未満の頻度で生じ得る。一部の実施形態では、配列変異体は、約０．１％またはそれ未満の頻度で生じている。

【0062】

配列変異体は、参照配列に対する任意の変異であってよい。配列変異は、単一ヌクレオチド、または複数のヌクレオチド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超のヌクレオチド）の変化、挿入、または欠失からなってよい。配列変異体が２つまたはそれ超のヌクレオチドの差異を含む場合、異なるヌクレオチドは、互いと連続していてもよく、連続していなくてもよい。配列変異体の型の非限定的な例としては、一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失／挿入多型（ＤＩＰ）、コピー数変異体（ＣＮＶ）、短い縦列反復（ＳＴＲ）、単純配列反復（ＳＳＲ）、可変数縦列反復（ＶＮＴＲ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、レトロトランスポゾンに基づく挿入多型、配列特異的増幅多型、および配列変異体として検出することができるエピジェネティックマークの差異（例えば、メチル化の差異）が挙げられる。

【0063】

本明細書に記載の方法に供することができる核酸試料は、任意の適切な供給源に由来し得る。一部の実施形態では、使用する試料は環境試料である。環境試料は、任意の環境供給源、例えば、自然もしくは人工雰囲気、水系、土壌、または任意の他の目的の試料に由来するものであってよい。一部の実施形態では、環境試料は、例えば、大気病原体収集システム、表面下沈渣、地下水、地中深くの古代の水、草地の植物の根−土壌界面、沿岸水および下水処理場から得ることができる。

【0064】

試料由来のポリヌクレオチドは、これらに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、これらのいずれかの断片、またはこれらの任意の２つもしくはそれ超の組合せを含めた種々のポリヌクレオチドのいずれであってもよい。一部の実施形態では、試料は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、試料は、ゲノムＤＮＡを含む。一部の実施形態では、試料は、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、細菌人工染色体、酵母の人工染色体、オリゴヌクレオチドタグ、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、試料は、例えば、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写、およびこれらの組合せを含めた、プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼの任意の適切な組合せを使用したプライマー伸長反応などの増幅によって作製されたＤＮＡを含む。プライマー伸長反応の鋳型がＲＮＡである場合、逆転写の産物は、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と称される。プライマー伸長反応において有用なプライマーは、１つまたは複数の標的、ランダムな配列、部分的にランダムな配列、およびこれらの組合せに特異的な配列を含んでよい。一般に、試料ポリヌクレオチドは、試料中に存在する任意のポリヌクレオチドを含み、これは、標的ポリヌクレオチドを含む場合もあり含まない場合もある。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、またはこれらの組合せであってよい。一部の実施形態では、本開示の方法に供するポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであり、これは、二本鎖ポリヌクレオチドの存在下である場合もあり存在下でない場合もある。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、一本鎖の形態で単離されるｓｓＤＮＡであってもよく、または二本鎖の形態で単離され、その後、本開示の方法における１つまたは複数のステップのために一本鎖にされるＤＮＡであってもよい。

【0065】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを、抽出ステップを伴わずに、かつ／または精製ステップを伴わずに、その後のステップ（例えば、環状化および増幅）に供する。例えば、流体試料を、抽出ステップを伴わずに処理して細胞を除去して精製された液体試料および細胞試料を生じさせ、その後、精製された流体試料からＤＮＡを単離することができる。沈殿または基質への非特異的な結合、その後、基質を洗浄して結合したポリヌクレオチドを放出させることによるものなど、ポリヌクレオチドを単離するための種々の手順が利用可能である。ポリヌクレオチドを、細胞抽出ステップを伴わずに試料から単離する場合、ポリヌクレオチドは大部分が細胞外または「無細胞」ポリヌクレオチドになり、これは、死細胞または損傷を受けた細胞に対応する可能性がある。そのような細胞の同一性を使用して、それらが由来する細胞もしくは細胞の集団、例えば、腫瘍細胞（例えば、がんの検出において）、胎児細胞（例えば、出生前診断において）、移植された組織由来の細胞（例えば、移植不全の早期検出において）など、または微生物の群集のメンバーを特徴付けることができる。

【0066】

試料を、例えば試料中の細胞からポリヌクレオチドを抽出するために処理する場合、種々の抽出方法が利用可能である。例えば、核酸は、フェノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、またはＴＲＩｚｏｌおよびＴｒｉＲｅａｇｅｎｔを含めた同様の製剤を用いた有機抽出によって精製することができる。抽出技法の他の非限定的な例としては、以下が挙げられる。（１）例えば、自動核酸抽出器、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なＭｏｄｅｌ ３４１ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒを使用するまたは使用しない、フェノール／クロロホルム有機試薬を使用した有機抽出、その後エタノール沈殿（Ausubelら、１９９３年）；（２）固定相吸着方法（米国特許第５，２３４，８０９号；Walshら、１９９１年）；および（３）塩誘導性核酸沈殿方法（Millerら、（１９８８年）、そのような沈殿方法は一般には「塩析」方法と称される。核酸の単離および／または精製の別の例としては、核酸を特異的にまたは非特異的に結合させることができる磁気粒子を使用し、その後、磁石を使用してビーズを単離し、洗浄し、ビーズから核酸を溶出することが挙げられる（例えば、米国特許第５，７０５，６２８号を参照されたい）。一部の実施形態では、上記の単離方法の前に、望ましくないタンパク質の試料からの排除を補助するために、酵素消化ステップ、例えば、プロテイナーゼＫ、または他の同様のプロテアーゼを用いた消化を行うことができる。例えば、米国特許第７，００１，７２４号を参照されたい。所望であれば、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を溶解緩衝液に添加することができる。ある特定の細胞または試料の種類については、タンパク質の変性／消化ステップをプロトコールに加えることが望ましいことがある。精製方法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方の分離を対象とし得る。抽出手順の間またはその後にＤＮＡとＲＮＡの両方を一緒に単離する場合、一方または両方を他から別々に精製するために、さらなるステップを使用することができる。抽出された核酸の細分画も、例えば、サイズ、配列、または他の物理的もしくは化学的特性による精製により作製することができる。最初の核酸の単離ステップに加えて、核酸の精製を、例えば過剰なまたは望ましくない試薬、反応物、または産物を除去するためになど、開示されている方法における任意のステップの後に実施することができる。試料中の核酸の量および／または純度を決定するための種々の方法、例えば吸光度（例えば、２６０ｎｍ、２８０ｎｍにおける光の吸光度、およびこれらの比）によるもの、および標識（例えば、蛍光色素および挿入剤、例えば、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム（propidium iodine）、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウムなど）の検出によるものなどが利用可能である。

【0067】

所望であれば、試料由来のポリヌクレオチドを、さらなる処理の前に断片化することができる。断片化は、化学的、酵素的、および機械的断片化を含めた種々の方法のいずれによっても実現することができる。一部の実施形態では、断片の長さの平均または中央値は、１０〜８００、１０〜５００、５０〜５００、９０〜２００、または５０〜１５０ヌクレオチドなどの約１０〜約１，０００ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、断片の長さの平均または中央値は、約１００もしくはそれ未満、約２００もしくはそれ未満、約３００もしくはそれ未満、約５００もしくはそれ未満、約６００もしくはそれ未満、約８００もしくはそれ未満、約１０００もしくはそれ未満、または約１５００ヌクレオチドもしくはそれ未満である。一部の実施形態では、断片は、約９０〜２００ヌクレオチドにわたり、かつ／または、平均長が約１５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、断片化は、試料ポリヌクレオチドを超音波処理に供することを含んで機械的に実現される。一部の実施形態では、断片化は、試料ポリヌクレオチドを、１種または複数種の酵素を用い、１種または複数種の酵素が二本鎖核酸切断を発生させるのに適した条件下で処理することを含む。ポリヌクレオチド断片の作製に有用な酵素の例としては、配列特異的および非配列特異的ヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＤＮａｓｅＩ、Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ、制限エンドヌクレアーゼ、その変異体、およびこれらの組合せが挙げられる。例えば、ＤＮａｓｅＩを用いた消化により、Ｍｇ＋＋の不在下およびＭｎ＋＋の存在下でＤＮＡのランダム二本鎖切断を誘導することができる。一部の実施形態では、断片化は、試料ポリヌクレオチドを、１種または複数種の制限エンドヌクレアーゼを用いて処理することを含む。断片化により、５’突出部、３’突出部、平滑末端、またはこれらの組合せを有する断片を生成することができる。断片化が１種または複数種の制限エンドヌクレアーゼの使用を含む場合などの一部の実施形態では、試料ポリヌクレオチドの切断により、予測可能な配列を有する突出部が残る。断片化されたポリヌクレオチドを、カラム精製またはアガロースゲルからの単離などの標準の方法によって断片をサイズ選択するステップに供することができる。

【0068】

一部の実施形態によると、試料由来の複数のポリヌクレオチド中のポリヌクレオチドを環状化する。環状化は、ポリヌクレオチドの５’末端を、同じポリヌクレオチドの３’末端と、試料中の別のポリヌクレオチドの３’末端と、または異なる供給源からのポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドアダプターなどの人工ポリヌクレオチド）の３’末端と接合することを含んでよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの５’末端を同じポリヌクレオチドの３’末端と接合する（「自己接合」とも称される）。一部の実施形態では、環状化反応の条件を、特定の平均長の環状化されたポリヌクレオチドの集団を生成するために、特定の範囲内の長さのポリヌクレオチドの自己接合が有利になるように選択する。例えば、環状化反応条件は、約５０００、２５００、１０００、７５０、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、またはそれ未満のヌクレオチドの長さよりも短いポリヌクレオチドの自己接合が有利になるように選択することができる。一部の実施形態では、長さが５０〜５０００ヌクレオチド、１００〜２５００ヌクレオチド、または１５０〜５００ヌクレオチドの断片が有利であり、したがって、環状化されたポリヌクレオチドの平均長はそれぞれの範囲に入る。一部の実施形態では、環状化された断片の８０％またはそれ超は５０〜５００ヌクレオチドの長さ、例えば、５０〜２００ヌクレオチドの長さである。最適化することができる反応条件としては、接合反応に充てる時間の長さ、種々の試薬の濃度、および接合するポリヌクレオチドの濃度が挙げられる。一部の実施形態では、環状化反応では、環状化の前に試料中に存在する断片の長さの分布が保存される。例えば、環状化前のポリヌクレオチドと環状化されたポリヌクレオチドの試料中の断片の長さの平均、中央値、最頻値、および標準偏差のうちの１つまたは複数は、互いの７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ超以内である。

【0069】

自己接合環状化産物を優先的に形成するのではなく、１つまたは複数のアダプターオリゴヌクレオチドを使用し、したがって、試料中のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端が１つまたは複数の介在アダプターオリゴヌクレオチドによって接合して環状ポリヌクレオチドを形成する。例えば、ポリヌクレオチドの５’末端をアダプターの３’末端と接合することができ、同じアダプターの５’末端を同じポリヌクレオチドの３’末端と接合することができる。アダプターオリゴヌクレオチドは、試料ポリヌクレオチドと接合することができる、少なくとも一部分が既知である配列を有する任意のオリゴヌクレオチドを含む。アダプターオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似体、非標準ヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、またはこれらの組合せを含んでよい。アダプターオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、または部分的二重鎖であってよい。一般に、部分的二重鎖アダプターは、１つまたは複数の一本鎖領域と１つまたは複数の二本鎖領域とを含む。二本鎖アダプターは、互いとハイブリダイズした２つの別々のオリゴヌクレオチドを含んでよく（「オリゴヌクレオチド二重鎖」とも称される）、ハイブリダイゼーションにより、ミスマッチおよび／または対応のないヌクレオチドによって生じる１つもしくは複数の平滑末端、１つもしくは複数の３’突出部、１つもしくは複数の５’突出部、１つもしくは複数のバルジ、またはこれらの任意の組合せが残り得る。アダプターの２つのハイブリダイズした領域がハイブリダイズしていない領域によって互いと分離されている場合、「バブル」構造がもたらされる。配列が異なるアダプターなどの、異なる種類のアダプターを組み合わせて使用することができる。異なるアダプターは、逐次的な反応でまたは同時に試料ポリヌクレオチドと接合することができる。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの両末端に同一のアダプターを付加する。例えば、第１および第２のアダプターを同じ反応に付加することができる。アダプターは、試料ポリヌクレオチドと組み合わせる前に操作することができる。例えば、末端リン酸を付加または除去することができる。

【0070】

アダプターオリゴヌクレオチドを使用する場合、アダプターオリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、１つもしくは複数の増幅プライマーアニーリング配列またはその相補体、１つもしくは複数の配列決定プライマーアニーリング配列またはその相補体、１つまたは複数のバーコード配列、多数の異なるアダプターまたは異なるアダプターのサブセットの間で共有される１つまたは複数の共通配列、１つまたは複数の制限酵素認識部位、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチド突出部と相補的な１つまたは複数の突出部、１つまたは複数のプローブ結合部位（例えば、配列決定プラットフォーム、例えば、大規模並列配列決定用のフローセルなど、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．により開発されたフローセルなどに付着させるため）、１つもしくは複数のランダムなまたはほぼランダムな配列（例えば、１つまたは複数の位置において２つまたはそれ超の異なるヌクレオチドのセットからランダムに選択された１つまたは複数のヌクレオチドであり、１つまたは複数の位置において選択された異なるヌクレオチドのそれぞれが、ランダムな配列を含むアダプターのプールで表される）、およびこれらの組合せを含めた、種々の配列エレメントのうちの１つまたは複数を含有してよい。いくつかの場合には、アダプターを使用して、例えば、正確なアダプターを用い、閉じた環とのハイブリダイゼーションによって閉じた環を「捕捉」することができる、アダプターに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチドでコーティングしたビーズ（特に、取扱いの容易さに関して磁気ビーズ）を使用することによってアダプターを含有する環を精製し、アダプターを含有しない環およびあらゆるライゲーションしていない成分を洗い流し、次いで、捕捉された環をビーズから放出させることができる。さらに、いくつかの場合には、ハイブリダイズした捕捉プローブと標的環の複合体を直接使用して、例えば、直接ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などによって、コンカテマーを作製することができる。一部の実施形態では、環内のアダプターを配列決定プライマーとして使用することもできる。２つまたはそれ超の配列エレメントは、互いと隣接していなくてもよく（例えば、１つまたは複数のヌクレオチドによって分離されている）、互いと隣接していてもよく、部分的に重複していてもよく、完全に重複していてもよい。例えば、増幅プライマーアニーリング配列は、配列決定プライマーアニーリング配列としての機能も果たし得る。配列エレメントは、３’末端またはその付近、５’末端またはその付近に位置していてもよく、アダプターオリゴヌクレオチドの内部に位置していてもよい。配列エレメントは、約３もしくはそれ未満、約４もしくはそれ未満、約５もしくはそれ未満、約６もしくはそれ未満、約７もしくはそれ未満、約８もしくはそれ未満、約９もしくはそれ未満、約１０もしくはそれ未満、約１５もしくはそれ未満、約２０もしくはそれ未満、約２５もしくはそれ未満、約３０もしくはそれ未満、約３５もしくはそれ未満、約４０もしくはそれ未満、約４５もしくはそれ未満、約５０もしくはそれ未満またはそれ超のヌクレオチドの長さなどの任意の適切な長さであってよい。アダプターオリゴヌクレオチドは、少なくとも、それらが含まれる１つまたは複数の配列エレメントに適応させるのに十分な任意の適切な長さであってよい。一部の実施形態では、アダプターは、約１０もしくはそれ未満、約１５もしくはそれ未満、約２０もしくはそれ未満、約２５もしくはそれ未満、約３０もしくはそれ未満、約３５もしくはそれ未満、約４０もしくはそれ未満、約４５もしくはそれ未満、約５０もしくはそれ未満、約５５もしくはそれ未満、約６０もしくはそれ未満、約６５もしくはそれ未満、約７０もしくはそれ未満、約７５もしくはそれ未満、約８０もしくはそれ未満、約９０もしくはそれ未満、約１００もしくはそれ未満、約２００もしくはそれ未満、またはそれ超のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、約１２〜４０ヌクレオチドの長さの範囲、例えば、約１５〜３５ヌクレオチドの長さなどである。

【0071】

一部の実施形態では、１つの試料由来の断片化されたポリヌクレオチドと接合するアダプターオリゴヌクレオチドは、全てのアダプターオリゴヌクレオチドに共通する１つまたは複数の配列と、その特定の試料のポリヌクレオチドと接合するアダプターに独特であるバーコードとを含み、したがって、バーコード配列を使用して、１つの試料またはアダプター接合反応に由来するポリヌクレオチドと別の試料またはアダプター接合反応に由来するポリヌクレオチドを区別することができる。一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチド突出部と相補的である５’突出部、３’突出部、またはその両方を含む。相補的な突出部は、これらに限定されないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ超のヌクレオチドの長さを含めた、１ヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの長さであってよい。相補的な突出部は、固定された配列を含んでよい。アダプターオリゴヌクレオチドの相補的な突出部は、１つまたは複数のヌクレオチドのランダムな配列を含んでよく、したがって、１つまたは複数のヌクレオチドは、１つまたは複数の位置において２つまたはそれ超の異なるヌクレオチドのセットからランダムに選択され、１つまたは複数の位置において選択された異なるヌクレオチドのそれぞれが、ランダムな配列を含む相補的な突出部を有するアダプターのプールで表される。一部の実施形態では、アダプター突出部は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成する標的ポリヌクレオチド突出部と相補的である。一部の実施形態では、アダプター突出部は、アデニンまたはチミンからなる。

【0072】

ポリヌクレオチドを環状化するための種々の方法が利用可能である。一部の実施形態では、環状化は、リガーゼ（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡリガーゼ）の使用などの酵素反応を含む。これらに限定されないが、Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（ＤＮＡとＲＮＡの両方に対して働くｓｓＲＮＡリガーゼ）を含めた種々のリガーゼが利用可能である。さらに、ｄｓＤＮＡ鋳型が存在しない場合にはＴ４ ＤＮＡリガーゼによりｓｓＤＮＡもライゲーションすることができるが、これは一般に遅い反応である。リガーゼの他の非限定的な例としては、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ＤＮＡリガーゼ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＤＮＡリガーゼ（ＩおよびＩＩ）、熱安定性リガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ熱安定性ＤＮＡリガーゼ、ＶａｎＣ型リガーゼ、９°Ｎ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｓｐ ＤＮＡリガーゼ、およびバイオプロスペクティングにより発見された新規のリガーゼを含めたＮＡＤ依存性リガーゼ；Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ１、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、およびバイオプロスペクティングにより発見された新規のリガーゼを含めたＡＴＰ依存性リガーゼ；ならびに野生型、突然変異体アイソフォーム、および遺伝子操作されたその変異体が挙げられる。自己接合が望まれる場合には、ポリヌクレオチドおよび酵素の濃度を調整して、分子間構造ではなく分子内環の形成を容易にすることができる。反応温度および時間も調整することができる。一部の実施形態では、６０℃を使用して、分子内環を容易にする。一部の実施形態では、反応時間は１２〜１６時間である。反応条件は、選択した酵素の製造業者によって指定された条件であってよい。一部の実施形態では、環状化反応後に、あらゆるライゲーションしていない核酸を消化するためにエキソヌクレアーゼステップを含めることができる。すなわち、閉じた環は遊離の５’末端も３’末端も含有せず、したがって、５’または３’エキソヌクレアーゼの導入により、閉じた環は消化されないが、ライゲーションしていない成分は消化される。これは、マルチプレックスシステムにおいて特定の使用を見いだすことができる。

【0073】

一般に、ポリヌクレオチドの末端を互いと接合して、環状ポリヌクレオチドを形成し（直接、または１つもしくは複数の中間のアダプターオリゴヌクレオチドを用いて）、接合部の配列を有する接合部を生じさせる。アダプターポリヌクレオチドを介してポリヌクレオチドの５’末端と３’末端を接合する場合、「接合部」という用語は、ポリヌクレオチドとアダプター（例えば、５’末端接合部または３’末端接合部の一方）の接合部、またはアダプターポリヌクレオチドによって形成され、それを含むポリヌクレオチドの５’末端と３’末端の間の接合部を指し得る。ポリヌクレオチドの５’末端と３’末端を、介在アダプターを用いずに接合する場合（例えば、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端）、「接合部」という用語は、これらの２つの末端が接合する点を指す。接合部は、接合部を含むヌクレオチドの配列（「接合部の配列」とも称される）によって同定することができる。一部の実施形態では、試料は、天然の分解プロセス（例えば、細胞溶解、細胞死、および、無細胞ポリヌクレオチドなどの、ＤＮＡが細胞からその周囲のさらに分解される可能性がある環境に放出される他のプロセスなど）、試料処理（例えば、固定、染色、および／または保管手順など）の副産物である断片化、および特定の標的配列への制限なしにＤＮＡを切断する方法による断片化（例えば、超音波処理によるものなどの機械的な断片化；ＤＮａｓｅＩ、ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅなどの非配列特異的ヌクレアーゼ処理）によって形成された末端の混合物を有するポリヌクレオチドを含む。試料が、末端の混合物を有するポリヌクレオチドを含む場合、２つのポリヌクレオチドが同じ５’末端または３’末端を有する可能性は低く、２つのポリヌクレオチドが同じ５’末端と３’末端の両方を独立に有する可能性は非常に低い。したがって、一部の実施形態では、２つのポリヌクレオチドが同じ標的配列を有する部分を含む場合であっても、接合部を使用して異なるポリヌクレオチドを区別することができる。介在アダプターを用いずにポリヌクレオチド末端を接合する場合、接合部の配列は、参照配列とアラインすることによって同定することができる。例えば、２つの成分配列の順序が参照配列と逆であると思われる場合、その逆になっていると思われる点が、その点において接合部を示し得る。１つまたは複数のアダプター配列を介してポリヌクレオチド末端を接合する場合、接合部は、公知のアダプター配列に近接していることによって、または、配列決定リードが、環状化されたポリヌクレオチドの５’末端と３’末端の両方から配列を得るのに十分な長さである場合には上記の通りアラインすることによって同定することができる。一部の実施形態では、特定の接合部の形成は、十分に稀な事象であり、したがって、試料の環状化されたポリヌクレオチドの中で独特なものである。

【0074】

図４は、ポリヌクレオチドを環状化する方法の３つの非限定的な例を説明する。一番上ではポリヌクレオチドをアダプターの不在下で環状化し、中央のスキームはアダプターの使用を示し、一番下のスキームは２種のアダプターを利用するものである。２種のアダプターを使用する場合、一方をポリヌクレオチドの５’末端に接合することができ、第２のアダプターを同じポリヌクレオチドの３’末端に接合することができる。一部の実施形態では、アダプターライゲーションは、２種の異なるアダプターを、ライゲーションを容易にするために２種のアダプターと相補的である「副子」核酸と一緒に使用することを含んでよい。分岐または「Ｙ」アダプターも使用することができる。２種のアダプターを使用する場合、両末端に同じアダプターを有するポリヌクレオチドは、その後のステップにおいて自己アニーリングに起因して除去され得る。

【0075】

図６は、一本鎖ＤＮＡなどのポリヌクレオチドを環状化する方法の別の非限定的な例を説明する。アダプターは、ポリヌクレオチドの５’または３’末端のいずれかに非対称に付加することができる。図６Ａに示されている通り、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、３’末端に遊離のヒドロキシル基を有し、アダプターは、ブロッキングされた３’末端を有し、したがって、リガーゼの存在下で、好ましい反応によりｓｓＤＮＡの３’末端とアダプターの５’末端が接合する。この実施形態では、環を形成するための分子内ライゲーションの前に、単一のｓｓＤＮＡ断片と単一のアダプターの分子間ライゲーションを駆動するためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの薬剤を使用することが有用であり得る。末端の順序を逆にして行うこともできる（ブロッキングされた３’、遊離の５’など）。直鎖状ライゲーションが実現されたら、ライゲーションした部分を、キナーゼまたは他の適切な酵素もしくは化学を使用することによってなど、酵素を用いて処理して、ブロッキング部分を除去することができる。ブロッキング部分を除去したら、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅなどの環状化酵素を添加することにより、環状化されたポリヌクレオチドが形成される分子内の反応を可能にする。図６Ｂに示されている通り、一方の鎖がブロッキングされた５’または３’末端を有する二本鎖アダプターを使用することによって、二本鎖構造を形成することができ、これをライゲーションすると、ニックを有する二本鎖断片が生じる。次いで、２つの鎖を分離し、クロッキング部分を除去し、一本鎖の断片を環状化して、環状化されたポリヌクレオチドを形成することができる。

【0076】

一部の実施形態では、分子内環状化の速度を増強するために、分子クランプを使用してポリヌクレオチドの２つの末端（例えば、一本鎖ＤＮＡ）をひとつにする。１つのそのようなプロセスの図の例が図５において説明されている。これは、アダプターを用いて行うこともでき、アダプターを用いずに行うこともできる。分子クランプの使用は、平均ポリヌクレオチド断片が約１００ヌクレオチドを超える長さである場合に特に有用であり得る。一部の実施形態では、分子クランププローブは、３つのドメイン：第１のドメイン、介在ドメイン、および第２のドメインを含む。第１および第２のドメインをまず標的ポリヌクレオチドの対応する配列と配列相補性によってハイブリダイズする。分子クランププローブの介在ドメインは標的配列と有意にはハイブリダイズしない。したがって、クランプと標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、標的配列の２つの末端が極めて近接し、それにより、環状化酵素の存在下での標的配列の分子内環状化が容易になる。一部の実施形態では、分子クランプが増幅プライマーとしての機能も果たし得るので、これはさらに有用である。

【0077】

環状化後、反応生成物を、サブシークエンスステップへの関与に利用可能な環状化されたポリヌクレオチドの相対的な濃度または純度を上昇させるために（例えば、環状ポリヌクレオチドの単離または反応物中の１つもしくは複数の他の分子の除去によって）、増幅または配列決定の前に精製することができる。例えば、環状化反応またはその成分を、例えば、エキソヌクレアーゼでの処理により、一本鎖（環状化されていない）ポリヌクレオチドが除去されるように処理することができる。別の例として、環状化反応またはその一部をサイズ排除クロマトグラフィーに供してもよく、それにより、少ない試薬を保持および廃棄する（例えば、未反応のアダプター）、または環状化産物を保持し、別々の体積に放出する。Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製のＺｙｍｏオリゴ精製キットによって提供されるキットなどの、ライゲーション反応物を浄化するための種々のキットが利用可能である。一部の実施形態では、精製は、環状化反応に使用したリガーゼを除去もしくは分解するための処理、および／または環状化されたポリヌクレオチドをそのようなリガーゼから精製するための処理を含む。一部の実施形態では、リガーゼを分解するための処理は、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼを用いた処理を含む。プロテイナーゼＫ処理は、製造業者のプロトコールに従ってもよく、標準のプロトコール（例えば、SambrookおよびGreen、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第４版（２０１２年）において提供される）に従ってもよい。プロテアーゼ処理の後に、抽出および沈殿を行うこともできる。一例では、環状化されたポリヌクレオチドを、０．１％ＳＤＳおよび２０ｍＭのＥＤＴＡの存在下でプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ）処理によって精製し、１：１フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムを用いて抽出し、エタノールまたはイソプロパノールを用いて沈殿させる。一部の実施形態では、沈殿はエタノール中で行う。

【0078】

環状化の後に、環状化されたポリヌクレオチドの配列決定を直接続けることができる。あるいは、配列決定の前に１つまたは複数の増幅反応を行うことができる。一般に、「増幅」とは、標的ポリヌクレオチドまたはその一部の１つまたは複数のコピーを作出するプロセスを指す。ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を増幅する種々の方法が利用可能である。増幅は、直線的なものであってもよく、指数関数的なものであってもよく、多相増幅プロセスにおいて直線位相と指数関数位相の両方を伴うものであってもよい。増幅方法は、熱変性ステップなどの温度の変化を伴ってもよく、熱変性を必要としない等温プロセスであってもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、標的配列のコピー数を指数関数的に増加させるために、変性、プライマー対と逆の鎖のアニーリング、およびプライマー伸長の多数のサイクルを使用する。アニーリングした核酸鎖の変性は、熱の適用、局所的な金属イオン濃度の上昇（例えば、米国特許第６，２７７，６０５号）、超音波照射（例えば、ＷＯ／２０００／０４９１７６）、電圧の印加（例えば、米国特許第５，５２７，６７０号、米国特許第６，０３３，８５０号、米国特許第５，９３９，２９１号、および米国特許第６，３３３，１５７号）、および磁気応答性材料に結合させたプライマーと組み合わせた電磁場の印加（例えば、米国特許第５，５４５，５４０号）によって実現することができる。ＲＴ−ＰＣＲと称される変形では、逆転写酵素（ＲＴ）を使用してＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作出し、次いで、ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅してＤＮＡの多数のコピーを生成させる（例えば、米国特許第５，３２２，７７０号および米国特許第５，３１０，６５２号）。等温増幅方法の１つの例は、一般にＳＤＡと称される鎖置換増幅であり、この方法では、プライマー配列の対と標的配列の逆の鎖のアニーリング、二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を生成させるためのｄＮＴＰの存在下でのプライマー伸長、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介性ニッキング、および現存する鎖を置き換え、次のプライマーのアニーリング、ニッキングおよび鎖置換のラウンドのための鎖を生成させるための、ニックの３’末端からのポリメラーゼ媒介性プライマー伸長のサイクルを使用し、その結果、産物の幾何的増幅をもたらす（例えば、米国特許第５，２７０，１８４号および米国特許第５，４５５，１６６号）。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）では、基本的に同じ方法において、好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを高温で使用する（欧州特許第０ ６８４ ３１５号）。他の増幅方法としては、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、Lizardi、「Rolling Circle Replication Reporter Systems」、米国特許第５，８５４，０３３号）；ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）（例えば、Kongら、「Helicase Dependent Amplification Nucleic Acids」、米国特許出願公開第ＵＳ２００４−００５８３７８Ａ１号）；およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）（例えば、Notomiら、「Process for Synthesizing Nucleic Acid」、米国特許第６，４１０，２７８号）が挙げられる。いくつかの場合には、等温増幅では、オリゴヌクレオチドプライマーに組み入れることができるものなどのプロモーター配列からのＲＮＡポリメラーゼによる転写を利用する。転写に基づく増幅方法としては、ＮＡＳＢＡとも称される核酸配列に基づく増幅（例えば、米国特許第５，１３０，２３８号）；一般にＱβレプリカーゼと称されるＲＮＡレプリカーゼの使用に依拠してプローブ分子自体を増幅する方法（例えば、Lizardi, P.ら（１９８８年）BioTechnol. ６巻、１１９７〜１２０２頁）；自家持続配列複製（例えば、Guatelli, J.ら（１９９０年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７巻、１８７４〜１８７８頁；Landgren（１９９３年）Trends in Genetics ９巻、１９９〜２０２頁；およびHELEN H. LEEら、NUCLEIC ACID AMPLIFICATION T ECHNOLOGIES（１９９７年））；および、追加的な転写鋳型を作製するための方法（例えば、米国特許第５，４８０，７８４号および米国特許第５，３９９，４９１号）が挙げられる。等温性の核酸増幅の別の方法としては、非標準ヌクレオチド（例えば、ウラシルまたはＲＮＡヌクレオチド）を含有するプライマーを、非標準ヌクレオチドにおいて核酸を切断して結合部位を追加的なプライマーに曝露する酵素（例えば、ＤＮＡグリコシラーゼまたはＲＮＡ分解酵素Ｈ）と組み合わせて使用することが挙げられる（例えば、米国特許第６，２５１，６３９号、米国特許第６，９４６，２５１号、および米国特許第７，８２４，８９０号）。等温増幅プロセスは直線的なものであっても指数関数的なものであってもよい。

【0079】

一部の実施形態では、増幅は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む。典型的なＲＣＡ反応混合物は、１つまたは複数のプライマー、ポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを含み、コンカテマーを生成する。一般には、ＲＣＡ反応におけるポリメラーゼは、鎖置換活性を有するポリメラーゼである。種々のそのようなポリメラーゼが利用可能であり、その非限定的な例としては、エキソヌクレアーゼのないＤＮＡポリメラーゼＩの大きな（クレノウ）断片、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。一般に、コンカテマーは、鋳型ポリヌクレオチド由来の標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含むポリヌクレオチド増幅産物である（例えば、標的配列の約２もしくはそれ超、約３もしくはそれ超、約４もしくはそれ超、約５もしくはそれ超、約６もしくはそれ超、約７もしくはそれ超、約８もしくはそれ超、約９もしくはそれ超、約１０もしくはそれ超、またはそれ超のコピー；一部の実施形態では、約２またはそれ超のコピー）。増幅プライマーは、約もしくは少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、またはそれ超のヌクレオチドなどの任意の適切な長さであってよく、その任意の部分または全てが、プライマーがハイブリダイズする対応する標的配列と相補的であってよい（例えば、約もしくは少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ超のヌクレオチド）。図７は、適切なプライマーの３つの非限定的な例を示す。図７Ａは、特定の標的配列内の配列変異体の有無を検出するために使用することができるアダプターおよび標的特異的プライマーの不使用を示す。一部の実施形態では、複数の標的に対する多数の標的特異的プライマーを同じ反応において使用する。例えば、約もしくは少なくとも約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、２５００、５０００、１００００、１５０００、またはそれ超の異なる標的配列に対する標的特異的プライマーを、対応する数の標的配列（存在する場合）を並行して増幅するために単一の増幅反応において使用することができる。多数の標的配列が同じ遺伝子の異なる部分、異なる遺伝子、または非遺伝子配列に対応する可能性がある。多数のプライマーが単一の遺伝子内の多数の標的配列を標的とする場合、プライマーは、標的遺伝子の全てまたは指定の部分を網羅するために、遺伝子配列に沿って間隔を空けることができる（例えば、約もしくは少なくとも約５０ヌクレオチド、５０〜１５０ヌクレオチドごと、または５０〜１００ヌクレオチドごとの間隔を空ける）。図７Ｃでは、アダプター配列とハイブリダイズするプライマー（いくつかの場合には、アダプターオリゴヌクレオチド自体であってよい）の使用を説明している。

【0080】

図７Ｂは、ランダムプライマーによる増幅の例を説明する。一般に、ランダムなプライマーは、１つまたは複数のランダムなまたはほぼランダムな配列を含む（例えば、１つまたは複数の位置において２つまたはそれ超の異なるヌクレオチドのセットからランダムに選択された１つまたは複数のヌクレオチドであり、１つまたは複数の位置において選択された異なるヌクレオチドのそれぞれが、ランダムな配列を含むアダプターのプールで表される）。このように、ポリヌクレオチド（例えば、全てまたは実質的に全て環状化されたポリヌクレオチド）を配列非特異的に増幅することができる。そのような手順は、「全ゲノム増幅」（ＷＧＡ）と称することができる；しかし、典型的なＷＧＡプロトコール（環状化ステップを伴わない）では、本開示で意図されるポリヌクレオチド断片などの短いポリヌクレオチドは効率的に増幅されない。ＷＧＡ手順に関するさらなる例示的な考察については、例えば、Liら（２００６年）J Mol. Diagn. ８巻（１号）：２２〜３０頁を参照されたい。

【0081】

環状化されたポリヌクレオチドを、配列決定の前に増幅する場合、増幅産物を、富化を伴わずに直接配列決定に供することもでき、１つまたは複数の富化ステップの後で配列決定に供することもできる。富化は、増幅産物の保持または１種もしくは複数種の試薬の除去によるものなどの、１種または複数種の反応成分の精製を含んでよい。例えば、増幅産物は、基質に付着させた複数のプローブとのハイブリダイゼーション、続いて、洗浄ステップによるものなどの、捕捉されたポリヌクレオチドの放出によって精製することができる。あるいは、増幅産物を結合対のメンバーで標識し、その後、基質に付着させた結合対の他方のメンバーと結合させ、洗浄して増幅産物を放出させることができる。可能性のある基質としては、これらに限定されないが、ガラスおよび改質または機能化したガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）など）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、セラミックス、樹脂、シリコンおよび改質シリコンを含めたシリカまたはシリカに基づく材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束、および種々の他のポリマーが挙げられる。一部の実施形態では、基質は、ビーズまたは他の小さな別個の粒子の形態であり、それは、磁場を印加することによって単離を容易にするための磁気または常磁性ビーズであってよい。一般に、「結合対」とは、第１および第２の部分の１つを指し、第１および第２の部分は、互いに対して特異的な結合親和性を有する。適切な結合対としては、これらに限定されないが、抗原／抗体（例えば、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ−抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファーイエロー／抗ルシファーイエロー、およびローダミン抗ローダミン）；ビオチン／アビジン（またはビオチン／ストレプトアビジン）；カルモジュリン結合性タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリン；ホルモン／ホルモン受容体；レクチン／炭水化物；ペプチド／細胞膜受容体；プロテインＡ／抗体；ハプテン／抗ハプテン；酵素／補因子；および酵素／基質が挙げられる。

【0082】

一部の実施形態では、環状化されたポリヌクレオチドの増幅後の富化は、１つまたは複数の追加的な増幅反応を含む。一部の実施形態では、富化は、（ａ）増幅されたポリヌクレオチド；（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに（ｄ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼを含む増幅反応混合物において、配列Ａおよび配列Ｂ（５’から３’の方向に配向された）を含む標的配列を増幅することを含み、標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離は７５ｎｔまたはそれ未満である。図１０は、単一の反復（一般には環状でなければ増幅されない）、および標的配列の多数のコピーを含むコンカテマーに関して、標的配列に対する第１および第２のプライマーの配置の例を説明する。標的配列の単量体に対するプライマーの方向を考慮すると、この配置は、「背中合わせ」（Ｂ２Ｂ）または「逆方向」プライマーと称することができる。Ｂ２Ｂプライマーを用いた増幅により、環状および／またはコンカテマー増幅産物の富化が容易になる。さらに、この方向を比較的小さなフットプリント（プライマー対が及ぶ総距離）と組み合わせることにより、接合部が、典型的な増幅反応において見いだされるプライマーの配置（互いに面し、標的配列に及ぶ）におけるものよりも、プライマー間に生じている可能性が低いので、標的配列の周囲の様々な断片化事象の増幅が可能になる。一部の実施形態では、配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離は、約２００もしくはそれ未満、約１５０もしくはそれ未満、約１００もしくはそれ未満、約７５もしくはそれ未満、約５０もしくはそれ未満、約４０もしくはそれ未満、約３０もしくはそれ未満、約２５もしくはそれ未満、約２０もしくはそれ未満、約１５もしくはそれ未満、またはそれ未満のヌクレオチドである。一部の実施形態では、配列Ａは配列Ｂの相補体である。一部の実施形態では、複数の異なる標的配列を対象とする多数のＢ２Ｂプライマー対を同じ反応において使用して、複数の異なる標的配列を並行して増幅する（例えば、約もしくは少なくとも約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、２５００、５０００、１００００、１５０００、またはそれ超の異なる標的配列）。プライマーは、本明細書の他の箇所に記載されているものなどの任意の適切な長さであってよい。増幅は、本明細書に記載の増幅反応などの、適切な条件下での任意の適切な増幅反応を含んでよい。一部の実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応である。

【0083】

一部の実施形態では、Ｂ２Ｂプライマーは、少なくとも２つの配列エレメント、標的配列と配列相補性によってハイブリダイズする第１のエレメント、および、第１のエレメントがハイブリダイズする第１のハイブリダイゼーション温度における第１の増幅相の間に標的配列とハイブリダイズしない（例えば、尾部と、第１のエレメントが結合する場所に対してすぐ３’側の標的配列の部分の間の配列相補性の欠如に起因して）、５’「尾部」を含む。例えば、第１のプライマーは、配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、第２のプライマーは、配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、第１のハイブリダイゼーション温度における第１の増幅相の間、配列Ｃも配列Ｄも複数のコンカテマーとハイブリダイズしない。そのような有尾プライマーを使用する一部の実施形態では、増幅は、第１の相および第２の相を含んでよく、第１の相は、第１の温度におけるハイブリダイゼーションステップであって、その間に第１および第２のプライマーがコンカテマー（または環状化されたポリヌクレオチド）とハイブリダイズするハイブリダイゼーションステップ、およびプライマー伸長を含み、第２の相は、第１の温度よりも高い第２の温度におけるハイブリダイゼーションステップであって、その間に、第１および第２のプライマーが伸長した第１もしくは第２のプライマー、またはその相補体を含む増幅産物とハイブリダイズするハイブリダイゼーションステップ、およびプライマー伸長を含む。高温では、第１のエレメントとプライマー伸長産物におけるプライマーの尾部エレメントの間のハイブリダイゼーションが、プライマー内の第１のエレメントのみとコンカテマー内の内部標的配列とのハイブリダイゼーションによって形成される短い断片よりも有利である。したがって、二相増幅を使用して、そうでなければ短い増幅産物が有利になり得る程度を低下させ、それにより、標的配列の２つまたはそれ超のコピーを有する増幅産物の比較的高い割合を維持することができる。例えば、第２の温度におけるハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を５サイクル（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ超のサイクル）行った後に、反応混合物中の増幅されたポリヌクレオチドの少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ超）が、標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む。この二相の有尾Ｂ２Ｂプライマー増幅プロセスに従ったある実施形態の図が図１１において説明されている。

【0084】

一部の実施形態では、富化は、コンカテマー由来のアンプリコンの長さが増大するように偏った条件下での増幅を含む。例えば、プライマー濃度を低下させることができ、したがって、全てではないプライミング部位がプライマーとハイブリダイズし、したがってＰＣＲ産物がより長くなる。同様に、サイクル中のプライマーハイブリダイゼーション時間を減少させることにより、同様に、より少ないプライマーがハイブリダイズすることが可能になり、したがって、平均ＰＣＲアンプリコンサイズも増加する。さらに、サイクルの温度および／または伸長時間を増大させることにより、同様に、ＰＣＲアンプリコンの平均長が増加する。これらの技法の任意の組合せを使用することができる。

【0085】

一部の実施形態では、特に、Ｂ２Ｂプライマーを用いた増幅を実施した場合には、増幅産物を、生じたアンプリコンがサイズに基づいて選別されるように処理して、コンカテマーを含む単量体混合物の数を減少させ、かつ／または排除する。これは、これらに限定されないが、ゲルからの断片の切り出しおよびゲル濾過（例えば、約３００、４００、５００、またはそれ超のヌクレオチドの長さよりも大きな断片を富化するため）；ならびに結合緩衝液の濃度を細かく調整することによってサイズ選択するためのＳＰＲＩビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ）を含めた種々の利用可能な技法を使用して行うことができる。例えば、ＤＮＡ断片との混合の間に０．６×結合緩衝液の使用を使用して、約５００塩基対（ｂｐ）よりも大きなＤＮＡ断片を優先的に結合させることができる。

【0086】

増幅により一本鎖コンカテマーが生じる一部の実施形態では、単一の鎖を、配列決定反応のために作製される配列決定ライブラリーの形成の前に、またはその一部として、二本鎖構築物に変換する。一本鎖核酸から二本鎖構築物を作製するための種々の適切な方法が利用可能である。いくつかの可能性のある方法が図９に示されているが、いくつかの他の方法も使用することができる。図９Ａに示されている通り、例えば、ランダムプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびリガーゼの使用により、二本鎖が生じる。図９Ｂは、コンカテマーが、反応においてプライマーとして使用することができるアダプター配列を含有する場合の第２の鎖合成を示す。図９Ｃは、「ループ」の使用を示し、この場合、ループアダプターの一方の末端をコンカテマーの末端に付加し、ループアダプターは自己ハイブリダイズ性核酸の小さな切片を有する。この場合、ループアダプターのライゲーションにより、自己ハイブリダイズし、ポリメラーゼプライマー鋳型としての機能を果たすループが生じる。図９Ｄは、高分岐プライマーの使用、一般に、標的配列が既知である場合、特に、強力な鎖置換機能を有するポリメラーゼを使用した場合に多数の鎖が形成される場合の大多数の使用を示す。

【0087】

一部の実施形態によると、環状化されたポリヌクレオチド（またはその増幅産物、場合によって富化されていてよい）を配列決定反応に供して配列決定リードを作成する。そのような方法によって生成する配列決定リードは、本明細書に開示されている他の方法に従って使用することができる。種々の配列決定方法体系、特に、ハイスループットな配列決定方法体系が利用可能である。例としては、限定することなく、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のシークエンシングシステム（ＨｉＳｅｑ（登録商標）およびＭｉＳｅｑ（登録商標）などのシークエンシングシステム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のシークエンシングシステム（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）、ＳＯＬｉＤ（登録商標）など）、Ｒｏｃｈｅ’ｓ ４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｓｙｓｔｅｍｓ製のシークエンシングシステム、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｓｙｓｔｅｍｓ製のシークエンシングシステムなどが挙げられる。一部の実施形態では、配列決定は、ＨｉＳｅｑ（登録商標）およびＭｉＳｅｑ（登録商標）システムを使用して約５０もしくはそれ超、約７５もしくはそれ超、約１００もしくはそれ超、約１２５もしくはそれ超、約１５０もしくはそれ超、約１７５もしくはそれ超、約２００もしくはそれ超、約２５０もしくはそれ超、約３００もしくはそれ超、またはそれ超のヌクレオチドの長さのリードを生成することを含む。一部の実施形態では、配列決定は、個々のヌクレオチドを、成長しているプライマー伸長産物に添加するにつれ繰り返し同定する、合成プロセスによる配列決定を含む。パイロシークエンシングは、生じた合成混合物を、配列決定反応の副産物、すなわち、ピロリン酸の存在についてアッセイすることによってヌクレオチドの組み入れを同定する、合成プロセスによる配列決定の例である。具体的には、プライマー／鋳型／ポリメラーゼ複合体を単一の種類のヌクレオチドと接触させる。そのヌクレオチドが組み入れられると、重合反応により三リン酸鎖のαリン酸とβリン酸の間のヌクレオシド三リン酸が切断され、ピロリン酸が放出される。次いで、放出されたピロリン酸の存在を、ＡＭＰを用いてピロリン酸をＡＴＰに変換する化学発光酵素レポーター系を使用して同定し、次いで、ルシフェラーゼ酵素を使用してＡＴＰを測定して、測定可能な光信号を生成する。光が検出される場合には塩基が組み入れられており、光が検出されない場合には、塩基は組み入れられていない。適切な洗浄ステップの後、種々の塩基を周期的に複合体と接触させて、鋳型配列内のその後の塩基を逐次的に同定する。例えば、米国特許第６，２１０，８９１号を参照されたい。

【0088】

関連する配列決定プロセスでは、プライマー／鋳型／ポリメラーゼ複合体を基質に固定化し、複合体を標識されたヌクレオチドと接触させる。複合体の固定化は、プライマー配列、鋳型配列および／またはポリメラーゼ酵素によるものであってよく、また、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。例えば、複合体の固定化は、ポリメラーゼまたはプライマーと基質表面の連結を介したものであってよい。代替の立体配置では、ヌクレオチドは、除去可能なターミネーター基を伴ってまたは伴わずにもたらされる。組み入れられると、標識が複合体とカップリングし、したがって、検出可能になる。ターミネーターを担持するヌクレオチドの場合では、個々に同定可能な標識を担持する４つの異なるヌクレオチドの全てを複合体と接触させる。標識したヌクレオチドの組み入れにより、ターミネーターが存在することによって伸長が停止し、標識が複合体に付加され、それにより、組み入れられたヌクレオチドの同定が可能になる。次いで、組み入れられたヌクレオチドから標識およびターミネーターを除去し、適切な洗浄ステップの後、プロセスを繰り返す。ターミネーターを有さない（ｎｏｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）ヌクレオチドの場合では、パイロシークエンシングと同様に、単一の種類の標識されたヌクレオチドを複合体に付加して、それが組み入れられるかどうかを決定する。ヌクレオチド上の標識基の除去および適切な洗浄ステップの後、種々の異なるヌクレオチドを、反応混合物を通じて同じプロセスでサイクルにかける。例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８３３，２４６号を参照されたい。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍは、ＷＯ９８／４４１５１に記載されている技術に基づき、ＤＮＡ分子を配列決定プラットフォーム（フローセル）にアンカープローブ結合部位（他の点ではフローセル結合部位と称される）を介して結合させ、ガラススライド上でｉｎ ｓｉｔｕで増幅する。ＤＮＡ分子の増幅が行われる固体表面は、一般には、複数の第１および第２の結合したオリゴヌクレオチドを含み、第１の結合したオリゴヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドの一方の末端またはその付近の配列と相補的であり、第２の結合したオリゴヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドの他方の末端またはその付近の配列と相補的である。この配置により、ＵＳ２０１４０１２１１１６に記載されているものなどの橋増幅が可能になる。次いで、ＤＮＡ分子を配列決定プライマーとアニーリングさせ、可逆的なターミネーター手法を使用して、塩基ごとに並行して配列決定する。配列決定プライマーのハイブリダイゼーションの前に、橋を係留する結合したオリゴヌクレオチドの１つの切断部位において二本鎖橋ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を行い、したがって、１つの一本鎖は変性によって除去することができる固体基質に結合しないまま残し、他方の鎖は結合し、配列決定プライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能にすることができる。一般には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍでは８チャネルのフローセルを利用し、それにより、１８〜３６塩基の長さの配列決定リードが生じ、実行ごとに＞１．３Ｇｂｐの高品質データが生じる（www.illumina.comを参照されたい）。

【0089】

合成プロセスによるさらに別の配列では、違うように標識したヌクレオチドの組み入れがリアルタイムで鋳型依存性合成を行ったように観察される。具体的には、蛍光標識したヌクレオチドが組み入れられると個々の固定化したプライマー／鋳型／ポリメラーゼ複合体が観察され、これにより、付加された塩基のそれぞれの付加されるにつれたリアルタイム同定が可能になる。このプロセスでは、標識基は組み入れの間に切断されるヌクレオチドの一部に付着している。例えば、組み入れの間に除去されるリン酸鎖、すなわち、ヌクレオシドポリリン酸上のβ、γ、または他の末端リン酸基の一部に標識基を付着させることにより、標識は新生鎖には組み入れられず、その代わりに、天然ＤＮＡが生成する。個々の分子の観察は、一般には、非常に小さな照明体積内への複合体の光学的拘束を伴う。複合体を光学的に拘束することにより、ランダムに拡散しているヌクレオチドは非常に短い期間存在するが、組み入れられたヌクレオチドは、組み入れられているので観察体積内により長く保持される、モニター領域が創出される。これにより、組み入れ事象に伴う特徴的なシグナルがもたらされ、これは、付加された塩基の特性であるシグナルプロファイルによっても特徴付けられる。関連する態様では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）色素対などの、相互作用する標識成分がポリメラーゼまたは複合体の他の部分および組み入れるヌクレオチド上にもたらされ、したがって、組み入れ事象により、標識成分が相互作用的に近接し、再度、組み入れられた塩基の特性でもある特徴的なシグナルがもたらされる（例えば、米国特許第６，９１７，７２６号、同第７，０３３，７６４号、同第７，０５２，８４７号、同第７，０５６，６７６号、同第７，１７０，０５０号、同第７，３６１，４６６号、および同第７，４１６，８４４号；ならびにＵＳ２００７０１３４１２８を参照されたい）。

【0090】

一部の実施形態では、試料中の核酸について、ライゲーションによって配列決定することができる。この方法では、一般には、例えば、ｐｏｌｏｎｙ法およびＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、現在はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において使用される通り、ＤＮＡリガーゼ酵素を使用して標的配列を同定する。一般に、固定された長さの全ての可能性のあるオリゴヌクレオチドのプールが、配列決定された位置に応じて標識されてもたらされる。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、ライゲーションする；マッチする配列に対するＤＮＡリガーゼによる優先的なライゲーションにより、その位置における相補配列に対応するシグナルがもたらされる。

【0091】

一部の実施形態によると、配列決定リードと参照配列の間の配列の差異は、少なくとも２つの異なるポリヌクレオチド（例えば、異なる接合部を有する結果として区別することができる２つの異なる環状ポリヌクレオチド）において生じている場合、真性配列変異体としてコールされる（例えば、増幅または配列決定の前に試料中に存在し、これらのプロセスのいずれの結果でもない）。増幅または配列決定誤差の結果である配列変異体は、同じ標的配列を含む２つの異なるポリヌクレオチドにおいて正確に重複する可能性は低いので（例えば、位置および種類）、この検証パラメータを追加することにより、誤った配列変異体のバックグラウンドが著しく低下し、同時に、試料中の実際の配列変異を検出する感度および正確度が上昇する。一部の実施形態では、頻度が約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１．５％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．７５％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．２５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０７５％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０４％もしくはそれ未満、約０．０３％もしくはそれ未満、約０．０２％もしくはそれ未満、約０．０１％もしくはそれ未満、約０．００５％もしくはそれ未満、約０．００１％もしくはそれ未満、またはそれ未満である配列変異体は、正確なコールを許容するためのバックグラウンドを十分に超える。一部の実施形態では、配列変異体は、約０．１％またはそれ未満の頻度で生じている。一部の実施形態では、配列変異体の頻度は、そのような頻度が、バックグラウンド誤差率を統計的に有意に上回る場合（例えば、約０．０５もしくはそれ未満、約０．０１もしくはそれ未満、約０．００１もしくはそれ未満、約０．０００１もしくはそれ未満、またはそれ未満のｐ値）、バックグラウンドを十分に超える。一部の実施形態では、配列変異体の頻度は、そのような頻度が、バックグラウンド誤差率を約もしくは少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、またはそれ超上回る（例えば、少なくとも５倍高い）場合、バックグラウンドを十分に超える。一部の実施形態では、所与の位置における配列を正確に決定することにおけるバックグラウンド誤差率は、約１％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０１％もしくはそれ未満、約０．００５％もしくはそれ未満、約０．００１％もしくはそれ未満、約０．０００５％もしくはそれ未満、またはそれ未満である。一部の実施形態では、誤差率は０．００１％未満である。

【0092】

一部の実施形態では、真性配列変異体の同定（「コール」または「コールを行う」とも称される）は、１つまたは複数の配列決定リードを参照配列と最適にアラインして、２つの間の差異を同定すると共に、接合部を同定することを含む。一般に、アラインメントは、１つの配列を別の配列に沿って置き、各配列に沿ってギャップを繰り返し導入し、２つの配列がどれくらいよくマッチするかをスコアリングし、好ましくは様々な位置に関して参照に沿って反復することを伴う。最も良いスコアリングのマッチが、アラインされたとみなされ、配列間の関係のおよその程度の推測を表す。一部の実施形態では、配列決定リードと比較する参照配列は、対象と同じ種のメンバーのゲノムなどの参照ゲノムである。参照ゲノムは、完全であっても不完全であってもよい。一部の実施形態では、参照ゲノムは、参照ゲノムに由来するものまたは解析中の配列決定リードから作製したコンセンサスに由来するものなどの、標的ポリヌクレオチドを含有する領域のみからなる。一部の実施形態では、参照配列は、１つもしくは複数の細菌、古細菌、ウイルス、原生生物、真菌、または他の生物体に由来する配列などの、１つまたは複数の生物体のポリヌクレオチドの配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、参照配列は、解析中の１つまたは複数の標的配列（例えば、１つもしくは複数の遺伝子、またはその一部）に対応する領域などの、参照ゲノムの一部のみからなる。例えば、病原体の検出（例えば、汚染検出の場合など）に関しては、参照ゲノムは、病原体（例えば、ＨＩＶ、ＨＰＶ、または有害な細菌株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノム全体、または、特定の株もしくは血清型などの、同定において有用なその一部である。一部の実施形態では、例えば、多数の異なる生物体または株をスクリーニングするためになど、配列決定リードを多数の異なる参照配列とアラインする。

【0093】

典型的なアラインメントでは、配列決定リード内の塩基が参照内のマッチしない塩基と並んでいることは、その点において置換突然変異が生じていることを示す。同様に、１つの配列が他の配列内の塩基と並んでギャップを含む場合、挿入または欠失突然変異（「インデル」）が生じたことが推定される。１つの配列が１つの他の配列とアラインしていることを明示することが望まれる場合、アラインメントは、時にはペアワイズアラインメントと称される。多数の配列アラインメントとは、一般に、例えば、一連のペアワイズアラインメントによるものを含めた、２つまたはそれ超の配列のアラインメントを指す。一部の実施形態では、アラインメントのスコアリングは、置換およびインデルの確率についての値を設定することを含む。個々の塩基をアラインすると、マッチまたはミスマッチは置換確率によってアラインメントスコアに寄与し、これは、例えば、マッチに関しては１、ミスマッチに関しては０．３３であってよい。インデルはアラインメントスコアからギャップペナルティを差し引き、これは、例えば、−１であってよい。ギャップペナルティおよび置換確率は、配列がどのように突然変異するかに関する経験的な知見または事前仮定に基づいてよい。それらの値は、生じたアラインメントに影響を及ぼす。アラインメントを実施するためのアルゴリズムの例としては、限定することなく、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（ＳＷ）アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ（ＮＷ）アルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（ＢＷＴ）に基づくアルゴリズム、ならびにＮｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；www.novocraft.comにおいて入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（soap.genomics.org.cnにおいて入手可能）、およびＭａｑ（maq.sourceforge.netにおいて入手可能）などのハッシュ関数アライナーが挙げられる。ＢＷＴ手法を実行する１つの例示的なアラインメントプログラムは、Ｇｅｅｋｎｅｔ（Ｆａｉｒｆａｘ、Ｖａ．）によって維持されているＳｏｕｒｃｅＦｏｒｇｅウェブサイトから入手可能なＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）である。ＢＷＴは、一般には、ヌクレオチドごとに占有するメモリが２ビットであり、これにより、典型的なデスクトップまたはラップトップコンピュータを用いて４Ｇ塩基対ものヌクレオチド配列に索引を付けることが可能になる。前処理は、ＢＷＴの構築（すなわち、参照に索引を付けること）および補助的なデータ構造の支持を含む。ＢＷＡは、どちらもＢＷＴに基づく２つの異なるアルゴリズムを含む。ＢＷＡによるアラインメントは、低誤差率（＜３％）を伴う最大約２００までの短いクエリ用に設計されたアルゴリズムｂｗａ−ｓｈｏｒｔを使用して進行させることができる（Li H.およびDurbin R. Bioinformatics、２５巻：１７５４〜６０頁（２００９年））。第２のアルゴリズム、ＢＷＡ−ＳＷは、誤差の多い長いリード用に設計されたものである（Li H.およびDurbin R.（２０１０年）。Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics、Epub.）。ｂｗａ−ｓｗアライナーは、時には、「ｂｗａ−ｌｏｎｇ」、「ｂｗａ ｌｏｎｇアルゴリズム」などと称される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムのバージョンを実行するアラインメントプログラムは、Ｇｅｅｋｎｅｔ（Ｆａｉｒｆａｘ、Ｖａ．）によって維持されているＳｏｕｒｃｅＦｏｒｇｅウェブサイトから入手可能なＭＵＭｍｅｒである。ＭＵＭｍｅｒは、完全な形態であるかまたはドラフト形態であるかにかかわらず、ゲノム全体を迅速にアラインするシステムである（Kurtz, S.ら、Genome Biology、５巻：Ｒ１２頁（２００４年）；Delcher, A. L.ら、Nucl. Acids Res.、２７巻：１１頁（１９９９年））。例えば、ＭＵＭｍｅｒ３．０では、２．４ＧＨｚのＬｉｎｕｘ（登録商標）デスクトップコンピュータにおいて７８ＭＢのメモリを使用して、５メガベースゲノムの対間の２０塩基対またはそれ超の正確なマッチの全てを１３．７秒で見いだすことができる。ＭＵＭｍｅｒでは、不完全なゲノムをアラインすることもできる；ＭＵＭｍｅｒでは、ショットガン配列決定プロジェクトからの１００ｓまたは１０００ｓのコンティグを容易に取り扱うことができ、また、当該システムに含まれるＮＵＣｍｅｒプログラムを使用してそれらを別のコンティグまたはゲノムのセットとアラインする。アラインメントプログラムの他の非限定的な例としては、Ｋｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆ．）からのＢＬＡＴ（Kent, W. J.、Genome Research ４巻：６５６〜６６４頁（２００２年））；Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｏｎｎ．）またはＢＧＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）からのＳＯＡＰ２；Ｂｏｗｔｉｅ（Langmeadら、Genome Biology、１０巻：Ｒ２５頁（２００９年））；Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（ＥＬＡＮＤ）またはＣｏｎｓｅｎｓｕｓ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ（ＣＡＳＡＶＡ）ｓｏｆｔｗａｒｅのＥＬＡＮＤｖ２コンポーネント（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）；Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）からのＲＴＧ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ；Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ（Ｓｅｌａｎｇｏｒ、Ｍａｌａｙｓｉａ）からのＮｏｖｏａｌｉｇｎ；Ｅｘｏｎｅｒａｔｅ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｉｎｘｔｏｎ、ＵＫ）（Slater, G.、およびBirney, E.、BMC Bioinformatics ６巻：３１頁（２００５年））、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎ（Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）からのＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Sievers F.ら、Mol Syst Biol ７巻、論文番号５３９（２０１１年））；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎ（Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）からのＣｌｕｓｔａｌＷまたはＣｌｕｓｔａｌＸ（Larkin M. A.ら、Bioinformatics、２３巻、２９４７〜２９４８頁（２００７年））；およびＦＡＳＴＡ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｉｎｘｔｏｎ、ＵＫ）（Pearson W. R.ら、PNAS ８５巻（８号）：２４４４〜８頁（１９８８年）；Lipman, D. J.、Science ２２７巻（４６９３号）：１４３５〜４１頁（１９８５年））が挙げられる。

【0094】

一般には、配列決定データは、大規模並行配列決定反応から得られる。次世代ハイスループットシークエンシングシステムの多くでは、データはＦＡＳＴＱファイルとしてエクスポートされるが、他の形式も使用することができる。一部の実施形態では、配列を解析して繰り返し単位長（例えば、単量体の長さ）、環状化によって形成される接合部、および参照配列に対するあらゆる真の変異を、一般には配列アラインメントによって同定する。繰り返し単位長の同定は、繰り返し単位の領域を計算すること、配列の参照遺伝子座（例えば、増幅、富化、および／または配列決定のために１つまたは複数の配列を特に標的とする場合）、各繰り返し領域の境界、および／または各配列決定の実行内の反復の数を見いだすことを含んでよい。配列解析は、二重鎖の両方の鎖について配列データを解析することを含んでよい。上記の通り、一部の実施形態では、試料由来の異なるポリヌクレオチドからのリードの配列と思われる同一の変異体（例えば、異なる接合部を有する環状化されたポリヌクレオチド）は、確認された変異体とみなされる。一部の実施形態では、配列変異体は、同じポリヌクレオチドの２つ以上の繰り返し単位において生じている場合、同じ配列変異が同様に、同じコンカテマー内の繰り返される標的配列の同じ位置において生じている可能性は低いので、確認されたまたは真性の変異体とみなすこともできる。変異体および確認された変異体の同定において、配列の品質スコアを考慮することができ、例えば、品質スコアが閾値よりも低い配列および塩基を除外することができる。変異体コールの感度および特異度をさらに増大させるために他のバイオインフォマティクス方法を使用することができる。

【0095】

一部の実施形態では、変異体（突然変異）の決定に統計解析を適用し、総ＤＮＡ試料中の変異体の比を定量化することができる。配列決定データを使用して特定の塩基の総測定値を算出することができる。例えば、以前のステップにおいて算出されたアラインメント結果から、各遺伝子座について「有効なリード」の数、すなわち、確認されたリードの数を算出することができる。変異体の対立遺伝子頻度を遺伝子座についての有効なリード数によって正規化することができる。遺伝子座全てにわたって観察される変異体の平均率である全体的なノイズレベルを計算することができる。変異体の頻度および全体的なノイズレベルを他の因子と組み合わせて使用して、変異体コールの信頼区間を決定することができる。ポアソン分布などの統計学的モデルを使用して変異体コールの信頼区間を評価することができる。変異体の対立遺伝子頻度は、全試料中の変異体の相対的な数量の指標としても使用することができる。

【0096】

一部の実施形態では、コールするステップに基づいて微生物性汚染物質を同定する。例えば、特定の配列変異体は、潜在的に感染性である微生物による汚染を示し得る。微生物を同定する目的で、高度に保存されたポリヌクレオチド内の配列変異体を同定することができる。系統学的な特徴付けおよび微生物の同定において有用な、高度に保存されたポリヌクレオチドの例は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、ｆｕｓＡ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、ｃｏｘｌ遺伝子およびｎｉｆＤ遺伝子において見いだされるヌクレオチド配列を含む。真核生物では、ｒＲＮＡ遺伝子は核のｒＲＮＡ遺伝子、ミトコンドリアのｒＲＮＡ遺伝子、またはその両方であってもよい。一部の実施形態では、１６Ｓ〜２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内部転写スペーサー（ＩＴＳ）内の配列変異体を、他のｒＲＮＡ遺伝子の使用を伴ってまたは伴わずに、密接に関連する分類群を弁別し、同定するために使用することができる。１６Ｓ ｒＲＮＡの構造的な制約に起因して、遺伝子全体を通して、特定の領域は、高度に保存されたポリヌクレオチド配列を有するが、非構造的セグメントの変動性の程度は高い可能性がある。配列変異体の同定を使用して、亜属、属、亜科、科、亜目、目、亜綱、綱、亜門、門、亜界、または界を表す操作的分類単位（ＯＴＵ）を同定すること、および場合によって、集団におけるそれらの頻度を決定することができる。汚染を示す微生物の存在、および場合によって量（相対的なまたは絶対的な）の検出において特定の配列変異体の検出を使用することができる。適用例としては、糞便または他の汚染に関する水の品質検査、動物またはヒト病原体に関する検査、水の汚染の原因を正確に示すこと、再生または再利用水の検査、海への排出プルームを含めた下水排水の流れの検査、水産養殖施設の病原体に関するモニタリング、ビーチ、遊泳領域または他の水に関連する娯楽施設のモニタリング、および毒性藻類異常発生の予測が挙げられる。食品モニタリングへの適用としては、食品加工工場における生産ラインの定期検査、屠殺場の調査、レストラン、病院、学校、矯正施設および他の施設のキッチンおよび食品貯蔵場所の、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｏ１５７：Ｈ７もしくはＯ１１１：Ｂ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓなどの食品媒介性病原体に関する検査が挙げられる。甲殻類および甲殻類から生じる水を、麻痺性貝中毒、神経毒性貝中毒、下痢性貝中毒および健忘性貝中毒の原因である藻類について調査することができる。さらに、輸入された食糧を、放出される前に税関において同時にスクリーニングして、食品の安全を確実にすることができる。植物病原体のモニタリングへの適用としては、園芸および苗床のモニタリング、例えば、オーク突然死病の原因である微生物であるＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｒａｍｏｒｕｍに関するモニタリング、作物病原体のサーベイランスおよび疾患管理、ならびに森林病原体のサーベイランスおよび疾患管理が挙げられる。微生物汚染が主要な安全性の懸念である医薬品、医療機器、および他の消耗品または重要な成分の製造環境を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのような特定の病原体の存在、より一般的なヒトに関連する微生物、水またはその特定の環境もしくは同様の環境において以前同定されたバイオバーデンを表す他のものの存在に関連する微生物の存在について調査することができる。同様に、宇宙船を含めた感受性の高い設備の構築および組み立ての領域を、そのような環境に生息するまたは最も一般的に導入されることが公知の以前同定された微生物についてモニターすることができる。

【0097】

一態様では、本開示は、それぞれが５’末端および３’末端を有するポリヌクレオチド５０ｎｇ未満を含む核酸試料において配列変異体を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、（ａ）リガーゼを用いて前記試料中の個々のポリヌクレオチドを環状化して複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｂ）前記リガーゼを前記環状ポリヌクレオチドから分離したら、環状ポリヌクレオチドを増幅してコンカテマーを形成するステップと、（ｃ）コンカテマーを配列決定して複数の配列決定リードを生成するステップと、（ｄ）複数の配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、（ｅ）前記５０ｎｇ未満のポリヌクレオチドの核酸試料からの前記複数のリードにおいて０．０５％またはそれ超の頻度で生じている配列の差異を配列変異体としてコールするステップとを含む。

【0098】

試料中のポリヌクレオチドの出発量は少なくてよい。一部の実施形態では、出発ポリヌクレオチドの量は、５０ｎｇ未満、例えば、４５ｎｇ未満、４０ｎｇ未満、３５ｎｇ未満、３０ｎｇ未満、２５ｎｇ未満、２０ｎｇ未満、１５ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満、４ｎｇ未満、３ｎｇ未満、２ｎｇ未満、１ｎｇ未満、０．５ｎｇ未満、０．１ｎｇ未満、またはそれ未満などである。一部の実施形態では、出発ポリヌクレオチドの量は、０．１〜１００ｎｇの範囲、例えば、１〜７５ｎｇ、５〜５０ｎｇ、または１０〜２０ｎｇである。一般に、出発材料が少ないほど、種々の処理ステップからの回収率を上昇させる重要性が増す。その後の反応に関与する試料中のポリヌクレオチドの量が減少するプロセスにより、稀な突然変異を検出することができる感度が低下する。例えば、Louら（PNAS、２０１３年、１１０巻（４９号））に記載されている方法では、出発材料の回収率がたった１０〜２０％であることが予測される。大量の出発材料（例えば、実験室で培養された細菌から精製されたもの）に関しては、これは実質的な障害物にはならない可能性がある。しかし、出発材料が実質的に少ない試料に関しては、この低範囲の回収率は、十分に稀な変異体の検出に対する実質的な障害物になる可能性がある。したがって、一部の実施形態では、本開示の方法の１つのステップから別のステップへの試料の回収率（例えば、環状化ステップへのインプットの、その後の増幅ステップまたは配列決定ステップにインプットするために利用可能な質量分率）は、約５０％もしくはそれ超、約６０％もしくはそれ超、約７５％もしくはそれ超、約８０％もしくはそれ超、約８５％もしくはそれ超、約９０％もしくはそれ超、約９５％もしくはそれ超、またはそれ超である。特定のステップからの回収率は、ほぼ１００％であり得る。回収率は、非環状ポリヌクレオチドのインプットからの環状ポリヌクレオチドの回収率などの、特定の形態に関するものであってよい。

【0099】

ポリヌクレオチドは、本開示の種々の態様に関して本明細書に記載されている試料などの、任意の適切な試料に由来するものであってよい。試料由来のポリヌクレオチドは、これらに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、これらのいずれかの断片、またはこれらの任意の２つもしくはそれ超の組合せを含めた種々のポリヌクレオチドのいずれであってもよい。一部の実施形態では、試料はＤＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、得られたままか、処理（例えば、変性）されたものかのいずれにせよ、一本鎖である。適切なポリヌクレオチドのさらなる例は、例えば、本開示の種々の態様のいずれかに関してなど本明細書に記載されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを、抽出ステップを伴わずに、かつ／または精製ステップを伴わずに、その後のステップ（例えば、環状化および増幅）に供する。例えば、流体試料を、抽出ステップを伴わずに処理して細胞を除去して精製された液体試料および細胞試料を生じさせ、その後、精製された流体試料からＤＮＡを単離することができる。沈殿または基質への非特異的な結合、その後、基質を洗浄して結合したポリヌクレオチドを放出させることによるものなど、ポリヌクレオチドを単離するための種々の手順が利用可能である。ポリヌクレオチドを、細胞抽出ステップを伴わずに試料から単離する場合、ポリヌクレオチドは大部分が細胞外または「無細胞」ポリヌクレオチドになり、これは、死細胞または損傷を受けた細胞に対応する可能性がある。そのような細胞の同一性を使用して、例えば微生物の群集においてなど、それらが由来する細胞または細胞の集団を特徴付けることができる。試料を、例えば試料中の細胞からポリヌクレオチドを抽出するために処理する場合、種々の抽出方法が利用可能であり、その例は本明細書において提供される（例えば、本開示の種々の態様のいずれかに関して）。

【0100】

核酸試料中の配列変異体は、様々な配列変異体のいずれであってもよい。配列変異体の非限定的な多数の例は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されている。一部の実施形態では配列変異体は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。一部の実施形態では、配列変異体は、集団内に低頻度で生じている（「稀な」配列変異体とも称される）。例えば、配列変異体は、約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１．５％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．７５％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．２５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０７５％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０４％もしくはそれ未満、約０．０３％もしくはそれ未満、約０．０２％もしくはそれ未満、約０．０１％もしくはそれ未満、約０．００５％もしくはそれ未満、約０．００１％もしくはそれ未満、またはそれ未満の頻度で生じ得る。一部の実施形態では、配列変異体は、約０．１％またはそれ未満の頻度で生じている。

【0101】

一部の実施形態によると、試料のポリヌクレオチドを、例えばリガーゼを使用することなどによって環状化する。環状化は、ポリヌクレオチドの５’末端を、同じポリヌクレオチドの３’末端と、試料中の別のポリヌクレオチドの３’末端と、または異なる供給源からのポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドアダプターなどの人工ポリヌクレオチド）の３’末端と接合することを含んでよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの５’末端を同じポリヌクレオチドの３’末端と接合する（「自己接合」とも称される）。環状化プロセス（例えば、アダプターオリゴヌクレオチドを用いるまたは用いない）、試薬（例えば、アダプターの種類、リガーゼの使用）、反応条件（例えば、有利な自己接合）、および任意選択の追加的な処理（例えば、反応後精製）の非限定的な例は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書において提供される。

【0102】

一般に、ポリヌクレオチドの末端を互いと接合して、環状ポリヌクレオチドを形成し（直接、または１つもしくは複数の中間のアダプターオリゴヌクレオチドを用いて）、接合部の配列を有する接合部を生じさせる。アダプターポリヌクレオチドを介してポリヌクレオチドの５’末端と３’末端を接合する場合、「接合部」という用語は、ポリヌクレオチドとアダプター（例えば、５’末端接合部または３’末端接合部の一方）の接合部、またはアダプターポリヌクレオチドによって形成され、それを含むポリヌクレオチドの５’末端と３’末端の間の接合部を指し得る。ポリヌクレオチドの５’末端と３’末端を、介在アダプターを用いずに接合する場合（例えば、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端）、「接合部」という用語は、これらの２つの末端が接合する点を指す。接合部は、接合部を含むヌクレオチドの配列（「接合部の配列」とも称される）によって同定することができる。一部の実施形態では、試料は、天然の分解プロセス（例えば、細胞溶解、細胞死、および、無細胞ポリヌクレオチドなどの、ＤＮＡが細胞からその周囲のさらに分解される可能性がある環境に放出される他のプロセスなど）、試料処理（例えば、固定、染色、および／または保管手順など）の副産物である断片化、および特定の標的配列への制限なしにＤＮＡを切断する方法による断片化（例えば、超音波処理によるものなどの機械的な断片化；ＤＮａｓｅＩ、ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅなどの非配列特異的ヌクレアーゼ処理）によって形成された末端の混合物を有するポリヌクレオチドを含む。試料が、末端の混合物を有するポリヌクレオチドを含む場合、２つのポリヌクレオチドが同じ５’末端または３’末端を有する可能性は低く、２つのポリヌクレオチドが同じ５’末端と３’末端の両方を独立に有する可能性は非常に低い。したがって、一部の実施形態では、２つのポリヌクレオチドが同じ標的配列を有する部分を含む場合であっても、接合部を使用して異なるポリヌクレオチドを区別することができる。介在アダプターを用いずにポリヌクレオチド末端を接合する場合、接合部の配列は、参照配列とアラインすることによって同定することができる。例えば、２つの成分配列の順序が参照配列と逆であると思われる場合、その逆になっていると思われる点が、その点において接合部を示し得る。１つまたは複数のアダプター配列を介してポリヌクレオチド末端を接合する場合、接合部は、公知のアダプター配列に近接していることによって、または、配列決定リードが、環状化されたポリヌクレオチドの５’末端と３’末端の両方から配列を得るのに十分な長さである場合には上記の通りアラインすることによって同定することができる。一部の実施形態では、特定の接合部の形成は、十分に稀な事象であり、したがって、試料の環状化されたポリヌクレオチドの中で独特なものである。

【0103】

環状化後、反応生成物を、サブシークエンスステップへの関与に利用可能な環状化されたポリヌクレオチドの相対的な濃度または純度を上昇させるために（例えば、環状ポリヌクレオチドの単離または反応物中の１つもしくは複数の他の分子の除去によって）、増幅または配列決定の前に精製することができる。例えば、環状化反応またはその成分を、例えば、エキソヌクレアーゼでの処理により、一本鎖（環状化されていない）ポリヌクレオチドが除去されるように処理することができる。別の例として、環状化反応またはその一部をサイズ排除クロマトグラフィーに供してもよく、それにより、少ない試薬を保持および廃棄する（例えば、未反応のアダプター）、または環状化産物を保持し、別々の体積に放出する。Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製のＺｙｍｏオリゴ精製キットによって提供されるキットなどの、ライゲーション反応物を浄化するための種々のキットが利用可能である。一部の実施形態では、精製は、環状化反応に使用したリガーゼを除去もしくは分解するための処理、および／または環状化されたポリヌクレオチドをそのようなリガーゼから精製するための処理を含む。一部の実施形態では、リガーゼを分解するための処理は、プロテアーゼを用いた処理を含む。適切なプロテアーゼは、原核生物、ウイルス、および真核生物から入手可能である。プロテアーゼの例としては、プロテイナーゼＫ（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍに由来する）、プロナーゼＥ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓに由来する）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａプロテアーゼ、サーモリシン（theromolysin）（好熱細菌に由来する）、トリプシン、スブチリシン、フューリンなどが挙げられる。一部の実施形態では、プロテアーゼはプロテイナーゼＫである。プロテアーゼ処理は、製造業者のプロトコールに従ってもよく、標準の条件（例えば、SambrookおよびGreen、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第４版（２０１２年）において提供される）に供してもよい。プロテアーゼ処理の後に、抽出および沈殿を行うこともできる。一実施例では、環状化されたポリヌクレオチドを、０．１％ＳＤＳおよび２０ｍＭのＥＤＴＡの存在下でプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ）処理によって精製し、１：１フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムを用いて抽出し、エタノールまたはイソプロパノールを用いて沈殿させる。一部の実施形態では、沈殿はエタノール中で行う。

【0104】

本開示の他の態様に関して記載されている通り、環状化の後に、環状化されたポリヌクレオチドの配列決定を直接続けることができる。あるいは、配列決定の前に１つまたは複数の増幅反応を行うことができる。ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を増幅する種々の方法が利用可能である。増幅は、直線的なものであってもよく、指数関数的なものであってもよく、多相増幅プロセスにおいて直線位相と指数関数位相の両方を伴うものであってもよい。増幅方法は、熱変性ステップなどの温度の変化を伴ってもよく、熱変性を必要としない等温プロセスであってもよい。適切な増幅プロセスの非限定的な例は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、増幅は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む。本明細書の他の箇所に記載の通り、典型的なＲＣＡ反応混合物は、１つまたは複数のプライマー、ポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを含み、コンカテマーを生成する。一般には、ＲＣＡ反応におけるポリメラーゼは、鎖置換活性を有するポリメラーゼである。種々のそのようなポリメラーゼが利用可能であり、その非限定的な例としては、エキソヌクレアーゼのないＤＮＡポリメラーゼＩの大きな（クレノウ）断片、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。一般に、コンカテマーは、鋳型ポリヌクレオチド由来の標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含むポリヌクレオチド増幅産物である（例えば、標的配列の約２もしくはそれ超、約３もしくはそれ超、約４もしくはそれ超、約５もしくはそれ超、約６もしくはそれ超、約７もしくはそれ超、約８もしくはそれ超、約９もしくはそれ超、約１０もしくはそれ超、またはそれ超のコピー；一部の実施形態では、約２またはそれ超のコピー）。増幅プライマーは、約もしくは少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、またはそれ超のヌクレオチドなどの任意の適切な長さであってよく、その任意の部分または全てが、プライマーがハイブリダイズする対応する標的配列と相補的であってよい（例えば、約もしくは少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ超のヌクレオチド）。種々のＲＣＡプロセスの例は、例えば、ランダムプライマー、標的特異的プライマー、およびアダプター標的化プライマーの使用など、本明細書に記載されており、そのいくつかは図７において説明されている。

【0105】

環状化されたポリヌクレオチドを、配列決定の前に増幅する場合（例えば、コンカテマーを生成するために）、増幅産物を、富化を伴わずに直接配列決定に供することもでき、１つまたは複数の富化ステップの後で配列決定に供することもできる。適切な富化プロセスの非限定的な例は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されている（例えば、第２の増幅ステップにＢ２Ｂプライマーを使用すること）。一部の実施形態によると、環状化されたポリヌクレオチド（またはその増幅産物、場合によって富化されていてよい）を配列決定反応に供して配列決定リードを作成する。そのような方法によって生成する配列決定リードは、本明細書に開示されている他の方法に従って使用することができる。種々の配列決定方法体系、特に、ハイスループットな配列決定方法体系が利用可能である。例としては、限定することなく、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のシークエンシングシステム（ＨｉＳｅｑ（登録商標）およびＭｉＳｅｑ（登録商標）などのシークエンシングシステム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のシークエンシングシステム（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）、ＳＯＬｉＤ（登録商標）など）、Ｒｏｃｈｅ’ｓ ４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｓｙｓｔｅｍｓ製のシークエンシングシステム、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｓｙｓｔｅｍｓ製のシークエンシングシステムなどが挙げられる。一部の実施形態では、配列決定は、ＨｉＳｅｑ（登録商標）およびＭｉＳｅｑ（登録商標）システムを使用して約５０もしくはそれ超、約７５もしくはそれ超、約１００もしくはそれ超、約１２５もしくはそれ超、約１５０もしくはそれ超、約１７５もしくはそれ超、約２００もしくはそれ超、約２５０もしくはそれ超、約３００もしくはそれ超、またはそれ超のヌクレオチドの長さのリードを生成することを含む。増幅プラットフォームおよび方法体系のさらなる非限定的な例は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されている。

【0106】

一部の実施形態によると、配列決定リードと参照配列の間の配列の差異は、少なくとも２つの異なるポリヌクレオチド（例えば、異なる接合部を有する結果として区別することができる２つの異なる環状ポリヌクレオチド）において生じている場合、真性配列変異体としてコールされる（例えば、増幅または配列決定の前に試料中に存在し、これらのプロセスのいずれの結果でもない）。増幅または配列決定誤差の結果である配列変異体は、同じ標的配列を含む２つの異なるポリヌクレオチドにおいて正確に重複する可能性は低いので（例えば、位置および種類）、この検証パラメータを追加することにより、誤った配列変異体のバックグラウンドが著しく低下し、同時に、試料中の実際の配列変異を検出する感度および正確度が上昇する。一部の実施形態では、頻度が約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１．５％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．７５％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．２５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０７５％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０４％もしくはそれ未満、約０．０３％もしくはそれ未満、約０．０２％もしくはそれ未満、約０．０１％もしくはそれ未満、約０．００５％もしくはそれ未満、約０．００１％もしくはそれ未満、またはそれ未満である配列変異体は、正確なコールを許容するためのバックグラウンドを十分に超える。一部の実施形態では、配列変異体は、約０．１％またはそれ未満の頻度で生じている。一部の実施形態では、方法は、頻度が約０．０００５％〜約３％の範囲、例えば、０．００１％〜２％、または０．０１％〜１％である配列の差異を真性配列変異体としてコールするステップを含む。一部の実施形態では、配列変異体の頻度は、そのような頻度が、バックグラウンド誤差率を統計的に有意に上回る場合（例えば、約０．０５もしくはそれ未満、約０．０１もしくはそれ未満、約０．００１もしくはそれ未満、約０．０００１もしくはそれ未満、またはそれ未満のｐ値）、バックグラウンドを十分に超える。一部の実施形態では、配列変異体の頻度は、そのような頻度が、バックグラウンド誤差率を約もしくは少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、またはそれ超上回る（例えば、少なくとも５倍高い）場合、バックグラウンドを十分に超える。一部の実施形態では、所与の位置における配列を正確に決定することにおけるバックグラウンド誤差率は、約１％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０１％もしくはそれ未満、約０．００５％もしくはそれ未満、約０．００１％もしくはそれ未満、約０．０００５％もしくはそれ未満、またはそれ未満である。一部の実施形態では、誤差率は０．００１％未満である。頻度および誤差率を決定するための方法は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されている。

【0107】

一部の実施形態では、真性配列変異体の同定（「コール」または「コールを行う」とも称される）は、１つまたは複数の配列決定リードを参照配列と最適にアラインして、２つの間の差異を同定すると共に、接合部を同定することを含む。一般に、アラインメントは、１つの配列を別の配列に沿って置き、各配列に沿ってギャップを繰り返し導入し、２つの配列がどれくらいよくマッチするかをスコアリングし、好ましくは様々な位置に関して参照に沿って反復することを伴う。最も良いスコアリングのマッチが、アラインされたとみなされ、配列間の関係のおよその程度の推測を表す。それらを実行する種々のアラインメントアルゴリズムおよびアライナーが利用可能であり、その非限定的な例は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、配列決定リードを比較する参照配列は、参照ゲノムなどの既知の参照配列である（例えば、対象と同じ種のメンバーのゲノム）。参照ゲノムは、完全であっても不完全であってもよい。一部の実施形態では、参照ゲノムは、参照ゲノムに由来するものまたは解析中の配列決定リードから作製したコンセンサスに由来するものなどの、標的ポリヌクレオチドを含有する領域のみからなる。一部の実施形態では、参照配列は、１つもしくは複数の細菌、古細菌、ウイルス、原生生物、真菌、または他の生物体に由来する配列などの、１つまたは複数の生物体のポリヌクレオチドの配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、参照配列は、解析中の１つまたは複数の標的配列（例えば、１つもしくは複数の遺伝子、またはその一部）に対応する領域などの、参照ゲノムの一部のみからなる。例えば、病原体の検出（例えば、汚染検出の場合など）に関しては、参照ゲノムは、病原体（例えば、ＨＩＶ、ＨＰＶ、または有害な細菌株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノム全体、または、特定の株もしくは血清型などの、同定において有用なその一部である。一部の実施形態では、例えば、多数の異なる生物体または株をスクリーニングするためになど、配列決定リードを多数の異なる参照配列とアラインする。比較して配列の差異を同定すること（および配列変異体をコールすること）ができる参照配列のさらなる非限定的な例は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されている。

【0108】

一態様では、本開示は、反応混合物において標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む複数の異なるコンカテマーを増幅する方法であって、標的配列が、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、反応混合物を核酸増幅反応に供するステップを含み、反応混合物は、（ａ）複数のコンカテマーであって、前記複数の個々のコンカテマーが、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む複数のコンカテマー；（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、配列ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに（ｄ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼを含み、標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離は７５ｎｔまたはそれ未満である。

【0109】

関連する態様では、本開示は、反応混合物において、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含む標的配列を含む複数の異なる環状ポリヌクレオチドを増幅する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、反応混合物を核酸増幅反応に供するステップを含み、反応混合物は、（ａ）複数の環状ポリヌクレオチドであって、前記複数の個々の環状ポリヌクレオチドが、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む複数の環状ポリヌクレオチド；（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、配列ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに（ｄ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼを含み、配列Ａおよび配列Ｂは内因性配列であり、標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離は７５ｎｔまたはそれ未満である。

【0110】

環状ポリヌクレオチドまたはコンカテマーのいずれを増幅するかにかかわらず、そのようなポリヌクレオチドは、任意の適切な試料供給源に由来するものであってよい（直接、または増幅によるなどの間接的のいずれか）。種々の適切な試料供給源、任意選択の抽出プロセス、ポリヌクレオチドの種類、および配列変異体の種類は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されている。環状ポリヌクレオチドは、非環状ポリヌクレオチドの環状化に由来するものであってよい。環状化プロセス（例えば、アダプターオリゴヌクレオチドを用いる、および用いない）、試薬（例えば、アダプターの種類、リガーゼの使用）、反応条件（例えば、有利な自己接合）、任意選択の追加的な処理（例えば、反応後精製）、およびそれにより形成される接合部の非限定的な例は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書において提供される。コンカテマーは、環状ポリヌクレオチドの増幅に由来するものであってよい。ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を増幅する種々の方法が利用可能であり、その非限定的な例は本明細書にも記載されている。一部の実施形態では、コンカテマーは、環状ポリヌクレオチドのローリングサークル増幅によって作製される。

【0111】

図１０は、単一の反復（一般には環状でなければ増幅されない）、および標的配列の多数のコピーを含むコンカテマーに関して、標的配列に対する第１および第２のプライマーの配置の例を説明する。本明細書に記載の他の態様に関して記載されている通り、プライマーのこの配置は、「背中合わせ」（Ｂ２Ｂ）または「逆方向」プライマーと称することができる。Ｂ２Ｂプライマーを用いた増幅により、環状および／またはコンカテマー鋳型の富化が容易になる。さらに、この方向を比較的小さなフットプリント（プライマー対が及ぶ総距離）と組み合わせることにより、接合部が、典型的な増幅反応において見いだされるプライマーの配置（互いに面し、標的配列に及ぶ）におけるものよりも、プライマー間に生じている可能性が低いので、標的配列の周囲の様々な断片化事象の増幅が可能になる。一部の実施形態では、配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離は、約２００もしくはそれ未満、約１５０もしくはそれ未満、約１００もしくはそれ未満、約７５もしくはそれ未満、約５０もしくはそれ未満、約４０もしくはそれ未満、約３０もしくはそれ未満、約２５もしくはそれ未満、約２０もしくはそれ未満、約１５もしくはそれ未満、またはそれ未満のヌクレオチドである。一部の実施形態では、配列Ａは配列Ｂの相補体である。一部の実施形態では、複数の異なる標的配列を対象とする多数のＢ２Ｂプライマー対を同じ反応において使用して、複数の異なる標的配列を並行して増幅する（例えば、約もしくは少なくとも約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、２５００、５０００、１００００、１５０００、またはそれ超の異なる標的配列）。プライマーは、本明細書の他の箇所に記載されているものなどの任意の適切な長さであってよい。増幅は、本明細書に記載の増幅反応などの、適切な条件下での任意の適切な増幅反応を含んでよい。一部の実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応である。

【0112】

一部の実施形態では、Ｂ２Ｂプライマーは、少なくとも２つの配列エレメント、標的配列と配列相補性によってハイブリダイズする第１のエレメント、および、第１のエレメントがハイブリダイズする第１のハイブリダイゼーション温度における第１の増幅相の間に標的配列とハイブリダイズしない（例えば、尾部と、標的配列の第１のエレメントが結合する場所に対してすぐ３’側の部分の間の配列相補性の欠如に起因して）、５’「尾部」を含む。例えば、第１のプライマーは、配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、第２のプライマーは、配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、第１のハイブリダイゼーション温度における第１の増幅相の間、配列Ｃも配列Ｄも複数のコンカテマー（または環状ポリヌクレオチド）とハイブリダイズしない。そのような有尾プライマーを使用する一部の実施形態では、増幅は、第１の相および第２の相を含んでよく、第１の相は、第１の温度におけるハイブリダイゼーションステップであって、その間に第１および第２のプライマーがコンカテマー（または環状ポリヌクレオチド）とハイブリダイズするハイブリダイゼーションステップ、およびプライマー伸長を含み、第２の相は、第１の温度よりも高い第２の温度におけるハイブリダイゼーションステップであって、その間に、第１および第２のプライマーが伸長した第１もしくは第２のプライマー、またはその相補体を含む増幅産物とハイブリダイズするハイブリダイゼーションステップ、およびプライマー伸長を含む。２つの温度のそれぞれにおける増幅サイクルの数は、所望の産物に基づいて調整することができる。一般には、第１の温度は、約１５もしくはそれ未満、約１０もしくはそれ未満、約９もしくはそれ未満、約８もしくはそれ未満、約７もしくはそれ未満、約６もしくはそれ未満、約５もしくはそれ未満またはそれ未満のサイクルなどの比較的少ないサイクル数に対して使用される。高温におけるサイクルの数は、第１の温度におけるサイクルの数とは独立して選択することができるが、一般には、約もしくは少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ超のサイクルなどの、多くのまたはより多くのサイクルになる。高温では、第１のエレメントとプライマー伸長産物におけるプライマーの尾部エレメントの間のハイブリダイゼーションが、プライマー内の第１のエレメントのみとコンカテマー内の内部標的配列とのハイブリダイゼーションによって形成される短い断片よりも有利である。したがって、二相増幅を使用して、そうでなければ短い増幅産物が有利になり得る程度を低下させ、それにより、標的配列の２つまたはそれ超のコピーを有する増幅産物の比較的高い割合を維持することができる。例えば、第２の温度におけるハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を５サイクル（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ超のサイクル）行った後に、反応混合物中の増幅されたポリヌクレオチドの少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ超）が、標的配列の２つまたはそれ超のコピーを含む。この二相の有尾Ｂ２Ｂプライマー増幅プロセスに従ったある実施形態の図が図１１において説明されている。

【0113】

一部の実施形態では、増幅は、コンカテマー由来のアンプリコンの長さが増大するように偏った条件下でのものである。例えば、プライマー濃度を低下させることができ、したがって、全てではないプライミング部位がプライマーとハイブリダイズし、したがってＰＣＲ産物がより長くなる。同様に、サイクル中のプライマーハイブリダイゼーション時間を減少させることにより、同様に、より少ないプライマーがハイブリダイズすることが可能になり、したがって、平均ＰＣＲアンプリコンサイズも増加する。さらに、サイクルの温度および／または伸長時間を増大させることにより、同様に、ＰＣＲアンプリコンの平均長が増加する。これらの技法の任意の組合せを使用することができる。

【0114】

一部の実施形態では、特に、Ｂ２Ｂプライマーを用いた増幅を実施した場合には、増幅産物を、生じたアンプリコンがサイズに基づいて選別されるように処理して、コンカテマーを含む単量体混合物の数を減少させ、かつ／または排除する。これは、これらに限定されないが、ゲルからの断片の切り出しおよびゲル濾過（例えば、約３００、４００、５００、またはそれ超のヌクレオチドの長さよりも大きな断片を富化するため）；ならびに結合緩衝液の濃度を細かく調整することによってサイズ選択するためのＳＰＲＩビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ）を含めた種々の利用可能な技法を使用して行うことができる。例えば、ＤＮＡ断片との混合の間に０．６×結合緩衝液の使用を使用して、約５００塩基対（ｂｐ）よりも大きなＤＮＡ断片を優先的に結合させることができる。

【0115】

一部の実施形態では、第１のプライマーは配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、第２のプライマーは配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、第１のハイブリダイゼーション温度における第１の増幅相の間、配列Ｃも配列Ｄも複数の環状ポリヌクレオチドとハイブリダイズしない。増幅は、第１の相および第２の相を含んでよく、第１の相は、第１の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、プライマー伸長の前に第１および第２のプライマーが環状ポリヌクレオチドまたはその増幅産物とハイブリダイズし、第２の相は、第１の温度よりも高い第２の温度におけるハイブリダイゼーションステップを含み、その間に、第１および第２のプライマーが、伸長した第１もしくは第２のプライマーまたはその相補体を含む増幅産物とハイブリダイズする。例えば、第１の温度は、およそ配列Ａ’のＴｍもしくはそれ超、およそ配列ＢのＴｍもしくはそれ超、またはおよそこれらの平均もしくはそれ超、またはこれらのＴｍのうちの１つよりも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃高い、またはそれ超の温度として選択することができる。この例では、第２の温度は、およそ組合せ配列（Ａ’＋Ｃ）のＴｍもしくはそれ超、およそ組合せ配列（Ｂ＋Ｄ）のＴｍもしくはそれ超、またはおよそこれらの平均もしくはそれ超、またはこれらのＴｍのうちの１つよりも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃高い、もしくはそれ超の温度になるように選択することができる。「Ｔｍ」という用語は、「融解温度」とも称され、一般に、参照配列からなるオリゴヌクレオチドの５０％（実際にはより大きなポリヌクレオチド内のサブ配列であってよい）とその相補配列がハイブリダイズする（または分離する）温度を表す。一般に、Ｔｍは、長さが増大するにしたがって上昇し、したがって、配列Ａ’のＴｍは、組合せ配列（Ａ’＋Ｃ）のＴｍよりも低いことが予想される。

【0116】

一態様では、本開示は、本開示の方法に従って方法を実施するための反応混合物を提供する。反応混合物は、本明細書に記載の方法に記載されている反応混合物を含めた、種々の方法のいずれかに関して本明細書に記載されている種々の成分のうちの１つまたは複数を含んでよい。一部の実施形態では、反応混合物は、標的配列の２つもしくはそれ超のコピーを含む複数の異なるコンカテマー、または標的配列の１つもしくは複数のコピーを含む環状ポリヌクレオチド（例えば、環状単量体）を増幅するための混合物であり、ここで、標的配列は、５’から３’の方向に配向された配列Ａおよび配列Ｂを含み、反応混合物は、（ａ）複数のコンカテマー（または環状ポリヌクレオチド）であって、前記複数の個々のコンカテマー（または環状ポリヌクレオチド）が、５’末端および３’末端を有する個々のポリヌクレオチドを環状化することによって形成された異なる接合部を含む、複数のコンカテマー（または環状ポリヌクレオチド）；（ｂ）配列Ａ’を含む第１のプライマーであって、標的配列の配列Ａと、配列Ａと配列Ａ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第１のプライマー；（ｃ）配列Ｂを含む第２のプライマーであって、標的配列の相補体を含む相補的なポリヌクレオチド内に存在する配列Ｂ’と、ＢとＢ’の間の配列相補性によって特異的にハイブリダイズする第２のプライマー；ならびに（ｄ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを伸長させて、増幅されたポリヌクレオチドを生成するポリメラーゼを含み、標的配列の配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端の間の距離は７５ｎｔまたはそれ未満である。試料、ポリヌクレオチド、プライマー、ポリメラーゼ、他の試薬、および反応条件は、例えば種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されているもののいずれであってもよく、これらは、任意の適切な組合せで反応混合物に含めることができる。一部の実施形態では、第１のプライマーは配列Ａ’に対して５’側に配列Ｃを含み、第２のプライマーは配列Ｂに対して５’側に配列Ｄを含み、増幅反応の第１の増幅ステップの間、配列Ｃも配列Ｄも２つまたはそれ超のコンカテマーとハイブリダイズしない。

【0117】

一態様では、本開示は、例えば、本開示の種々の他の態様のいずれかにおいてなど、本明細書に記載の方法において有用であるまたはそれによって生成する組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、一本鎖であり、リガーゼを実質的に含まない複数の環状化されたポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、１００００またはそれ未満の標的ポリヌクレオチドの群に対応する複数のコンカテマーを含み、さらに、複数の個々のコンカテマーは、（ａ）配列反復の２つまたはそれ超のコピーを含み、前記コピーの全てが同じ標的ポリヌクレオチドに対応すること、および（ｂ）前記組成物中の１つの個々のコンカテマーの配列反復の２つまたはそれ超のコピー間の接合部が別の個々のコンカテマーのものとは異なることを特徴とする。試料、ポリヌクレオチド、プライマー、ポリメラーゼ、および他の試薬は、例えば種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されているもののいずれであってもよく、これらは、任意の適切な組合せで組成物に含めることができる。組成物は、１つまたは複数の標的配列が増幅されるように設計された、本明細書に記載のＢ２Ｂプライマーなどの１つまたは複数のプライマー対を含んでよい。組成物は、キットの形態で提供することができる。キット中の試薬および他の材料は、任意の適切な容器に含有されていてよく、また、すぐに使用可能な形態であってもよく、キット中の他の試薬または使用者から供給される試薬と組み合わせること（例えば、濃縮した組成物の希釈または凍結乾燥した組成物の再構成）が必要であってもよい。キットにより緩衝液を提供することができ、その非限定的な例としては、炭酸ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびこれらの組合せが挙げられる。キットは、種々の態様のいずれかに関して本明細書に記載されている１つまたは複数の方法を実施するための説明書をさらに含んでよい。説明書は、１種または複数種の言語（例えば、２種、３種、４種、５種、またはそれ超の言語）で提供されてよい。

【0118】

一態様では、本開示は、配列変異体を検出するためのシステムを提供する。一部の実施形態では、システムは、（ａ）試料に対する検出反応を実施するための使用者要求を受信するように構成されたコンピュータ；（ｂ）使用者要求に応答して試料またはその一部に対する核酸増幅反応を実施する増幅システムであって、増幅反応が、（ｉ）個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｉｉ）環状ポリヌクレオチドを増幅するステップとを含む増幅システム；（ｃ）増幅システムによって増幅されたポリヌクレオチドの配列決定リードを作成し、配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定し、異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を配列変異体としてコールするシークエンシングシステム；および（ｄ）受信者に報告を送信する報告作成プログラムであって、報告が、配列変異体の検出の結果を含有する報告作成プログラムを含む。一部の実施形態では、受信者は使用者である。図３２は、本開示の方法において有用なシステムの非限定的な例を説明する。

【0119】

本システムにおいて使用するためのコンピュータは、１つまたは複数のプロセッサを含んでよい。プロセッサは、１つまたは複数の制御器、算出ユニット、および／またはコンピュータシステムの他のユニットを伴ってもよく、ファームウェアに所望の通り埋め込まれていてもよい。ソフトウェアで実行される場合、ルーティンは、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ、磁気ディスク、レーザーディスク（登録商標）、または他の適切な記憶媒体などの任意のコンピュータ可読メモリに記憶させることができる。同様に、このソフトウェアは、例えば、電話線、インターネット、無線接続などの通信チャネルを通して、またはコンピュータ可読ディスク、フラッシュドライブなどの可搬型媒体を介してなどを含めた任意の公知の送達方法によってコンピューティングデバイスに送達することができる。種々のステップは、種々のブロック、操作、ツール、モジュールおよび技法として実行することができ、それらは、今度は、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、またはハードウェア、ファームウェア、および／もしくはソフトウェアの任意の組合せで実行することができる。ハードウェアで実行する場合、ブロック、操作、技法などの一部または全部は、例えば、カスタム集積回路（ＩＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルロジックアレイ（ＦＰＧＡ）、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）などで実行することができる。クライアント−サーバー、リレーショナルデータベースアーキテクチャを当該システムの実施形態において使用することができる。クライアント−サーバーアーキテクチャは、ネットワーク上の各コンピュータまたはプロセスがクライアントまたはサーバーのいずれかであるネットワークアーキテクチャである。サーバーコンピュータは一般には、ディスクドライブ（ファイルサーバー）、プリンター（プリントサーバー）、またはネットワークトラフィック（ネットワークサーバー）の管理専用の強力なコンピュータである。クライアントコンピュータは、ＰＣ（パーソナルコンピュータ）または使用者がアプリケーションを実行するワークステーション、ならびに本明細書に開示されている出力デバイスの例を含む。クライアントコンピュータは、ファイル、デバイス、さらには処理能力などのリソースについてサーバーコンピュータに依拠する。一部の実施形態では、サーバーコンピュータは、データベース機能の全てを取り扱う。クライアントコンピュータは、フロントエンドデータ管理の全てを取り扱い、また、使用者からのデータ入力を受けることもできるソフトウェアを有してよい。

【0120】

当該システムは、試料に対する検出反応を実施するための使用者要求を受信するように構成することができる。使用者要求は、直接的であっても間接的であってもよい。直接要求の例としては、キーボード、マウス、またはタッチスクリーン）などの入力デバイスを介して伝達されるものが挙げられる。間接的な要求の例としては、インターネットを通して（有線または無線のいずれか）などの、通信媒体を介した伝達が挙げられる。

【0121】

システムは、使用者要求に応答して試料またはその一部に対する核酸増幅反応を実施する増幅システムをさらに含んでよい。ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を増幅する種々の方法が利用可能である。増幅は、直線的なものであってもよく、指数関数的なものであってもよく、多相増幅プロセスにおいて直線位相と指数関数位相の両方を伴うものであってもよい。増幅方法は、熱変性ステップなどの温度の変化を伴ってもよく、熱変性を必要としない等温プロセスであってもよい。適切な増幅プロセスの非限定的な例は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、増幅は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む。ポリヌクレオチドを増幅するための種々のシステムが利用可能であり、実施される増幅反応の種類に基づいて変動し得る。例えば、温度変化のサイクルを含む増幅方法に関しては、増幅システムは、サーモサイクラーを含んでよい。増幅システムは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ｒｏｃｈｅ製、およびＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ製のシステムなどのリアルタイム増幅および検出計器を含んでよい。一部の実施形態では、増幅反応は、（ｉ）個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｉｉ）環状ポリヌクレオチドを増幅するステップとを含む。試料、ポリヌクレオチド、プライマー、ポリメラーゼ、および他の試薬は、例えば種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されているもののいずれであってもよい。環状化プロセス（例えば、アダプターオリゴヌクレオチドを用いる、および用いない）、試薬（例えば、アダプターの種類、リガーゼの使用）、反応条件（例えば、有利な自己接合）、任意選択の追加的な処理（例えば、反応後精製）、およびそれにより形成される接合部の非限定的な例は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書において提供される。システムは、任意のそのような方法が実行されるように選択および／または設計することができる。

【0122】

システムは、増幅システムによって増幅されたポリヌクレオチドの配列決定リードを作成し、配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定し、異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を配列変異体としてコールするシークエンシングシステムをさらに含んでよい。シークエンシングシステムおよび増幅システムは同じであってもよく、重複した機器を含んでもよい。例えば、増幅システムとシークエンシングシステムの両方で同じサーモサイクラーを利用することができる。当該システムにおいて使用するための種々の配列決定プラットフォームが利用可能であり、選択された配列決定方法に基づいて選択することができる。配列決定方法の例は、本明細書に記載されている。増幅および配列決定は、リキッドハンドラーの使用を伴ってよい。これらのプロセスの自動化を行うために、いくつかの市販の液体取扱いシステムを利用することができる（例えば、例として、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｅｃａｎ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ａｐｒｉｃｏｔ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ １１からのリキッドハンドラーを参照されたい）。種々の自動化された配列決定機が市販されており、それらとして、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のシークエンサー（ＳＯＬｉＤプラットフォーム、およびｐＨに基づく検出）、Ｒｏｃｈｅ製のシークエンサー（４５４プラットフォーム）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のシークエンサー（例えば、フローセルに基づくシステム、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒデバイスなど）が挙げられる。２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ超の自動化されたデバイス間（例えば、リキッドハンドラーおよび配列決定デバイスのうちの１つまたは複数間）の移行は手動であっても自動化されていてもよい。

【0123】

参照配列に対する配列の差異を同定し、配列変異体をコールするための方法は、例えば本開示の種々の態様のいずれかに関してなど、本明細書に記載されている。シークエンシングシステムは、一般には、配列決定データの入力および所望のパラメータ（例えば、参照ゲノムの選択）の入力に応答してこれらのステップを実施するためのソフトウェアを含む。これらのアルゴリズムを実行するアラインメントアルゴリズムおよびアライナーの例は、本明細書に記載されており、シークエンシングシステムの一部を形成してよい。

【0124】

システムは、受信者に報告を送信する報告作成プログラムであって、報告が、配列変異体の検出の結果を含有する報告作成プログラムをさらに含んでよい。報告は、例えば、配列決定リードの間または配列決定データの解析と同時になど、プロセスの進行にしたがって周期的に更新しながらリアルタイムで作成することができる。それに加えて、またはその代わりに、報告は、解析の終了時に作成することができる。報告は、シークエンシングシステムにより全ての配列変異体をコールするステップが完了した時などに自動的に作成することができる。一部の実施形態では、報告は、使用者の指示に応じて作成される。配列変異体の検出の結果に加えて、報告は、１つまたは複数の配列変異体に基づく解析も含有してよい。例えば、１つまたは複数の配列変異体が特定の汚染物質または表現型に関連する場合、報告は、その汚染物質または表現型が存在する可能性、どんなレベルであるかなどの、この関連にかかわる情報、および場合によってこの情報に基づく提案（例えば、追加的な試験、モニタリング、または矯正措置）を含んでよい。報告は、種々の形態のいずれをとってもよい。本開示に関するデータは、受信者による受領および／または再調査のためのこのようなネットワークまたは接続（または、これに限定されないが、プリントアウトなどの物理的な報告を郵送することを含めた、情報を伝達するための任意の他の適切な手段）を通じて伝達することができることが構想される。受信者は、これらに限定されないが、個人、または電子システム（例えば、１つもしくは複数のコンピュータ、および／または１つもしくは複数のサーバー）であり得る。

【0125】

一態様では、本開示は、１つまたは複数のプロセッサにより実行されると、配列変異体を検出する方法を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体を提供する。一部の実施形態では、実行される方法は、（ａ）試料に対する検出反応を実施するための顧客要求を受信するステップと、（ｂ）顧客要求に応答して試料またはその一部に対する核酸増幅反応を実施するステップであって、増幅反応が、（ｉ）個々のポリヌクレオチドを環状化して、それぞれが５’末端と３’末端の間に接合部を有する複数の環状ポリヌクレオチドを形成するステップと、（ｉｉ）環状ポリヌクレオチドを増幅するステップとを含むステップと、（ｃ）（ｉ）増幅反応において増幅されたポリヌクレオチドの配列決定リードを作成するステップと、（ｉｉ）配列決定リードと参照配列の間の配列の差異を同定するステップと、（ｉｉｉ）異なる接合部を有する少なくとも２つの環状ポリヌクレオチドにおいて生じている配列の差異を配列変異体としてコールするステップとを含む配列決定解析を実施するステップと、（ｄ）配列変異体の検出の結果を含有する報告を作成するステップとを含む。

【0126】

コンピュータにより実行可能なコードを含む機械可読媒体は、これらに限定されないが、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的な伝達媒体を含めた多くの形態をとってよい。非揮発性記憶媒体としては、例えば、任意のコンピュータ内のストレージデバイスのいずれかなどの光学または磁気ディスクなど、例えば、データベースを実行するために使用できるものなどが挙げられる。揮発性記憶媒体としては、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが挙げられる。有形伝達媒体としては、コンピュータシステム内のバスを含むワイヤーを含めた同軸ケーブル；銅線および光ファイバーが挙げられる。搬送波伝送媒体は、高周波（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）データ通信の間に生じるものなどの、電気シグナルもしくは電磁気シグナル、または音波もしくは光波の形態をとってよい。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを用いた任意の他の物理的な記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、搬送波移送データもしくは指示、そのような搬送波を移送するケーブルもしくはリンク、または、コンピュータによりプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取ることができる任意の他の媒体が挙げられる。これらのコンピュータ可読媒体の形態の多くは、１つまたは複数の連続した１つまたは複数の指示を実行のためにプロセッサに伝えることに関与する可能性がある。

【0127】

主題のコンピュータにより実行可能なコードは、サーバー、ＰＣ、またはスマートフォンもしくはタブレットなどの可動性デバイスを含めた、プロセッサを含む任意の適切なデバイスで実行することができる。任意の制御器またはコンピュータは、場合によってモニターを含み、これは、ブラウン管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、フラットパネルディスプレイ（例えば、アクティブ・マトリクス型液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイなど）、または他のものであってよい。コンピュータ回路網は、多くの場合、箱の中に配置され、マイクロプロセッサ、メモリ、インターフェース回路、およびその他などの多数の集積回路チップを含む。箱は、場合によって、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、書き込み可能ＣＤ−ＲＯＭなどの大容量リムーバブルドライブ、および他の一般的な周辺要素も含む。場合によって、キーボード、マウス、またはタッチセンシティブスクリーンなどの入力デバイスにより、使用者からの入力がもたらされる。コンピュータは、使用者指示を、パラメータフィールドのセット、例えば、ＧＵＩへの使用者入力の形態で、または予めプログラムされた指示、例えば、種々の異なる特定の操作に関して予めプログラムされた指示の形態でのいずれかで受信する適切なソフトウェアを含んでよい。

【0128】

本明細書に開示されている種々の態様のいずれかの一部の実施形態では、方法、組成物、およびシステムは、例えば、患者試料の特徴付けおよび場合によって対象の状態の診断においてなど、治療に適用される。治療への適用は、本明細書に記載の方法の結果に基づいて、患者が最も応答する療法の選択を通知すること（「セラノスティクス」とも称される）、およびそれを必要とする対象の実際の治療も含み得る。具体的には、本明細書に開示されている方法および組成物は、特に、解析されるポリヌクレオチドが、ｃｆＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、または断片化された腫瘍ＤＮＡを含む、またはそれからなる場合に、腫瘍の存在、腫瘍の進行および／または転移を診断するために使用することができる。一部の実施形態では、対象を治療の有効性についてモニターする。例えば、ｃｔＤＮＡを経時的にモニターすることにより、ｃｔＤＮＡの減少を効果的な治療の指標として使用することができ、一方、ｃｔＤＮＡの増加により、異なる治療または異なる投与量の選択を容易にすることができる。他の使用としては、移植レシピエントにおける臓器拒絶反応の評価（移植ドナーゲノムに対応する循環ＤＮＡの量の上昇が移植片拒絶反応の初期指標として使用される場合）、およびウイルスまたは細菌感染などの病原体感染の遺伝子型決定／アイソタイピングが挙げられる。循環胎児ＤＮＡにおける配列変異体の検出を使用して、胎児の状態を診断することができる。

【0129】

本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「緩和すること（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」または「好転させること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」は、互換的に使用される。これらの用語は、これらに限定されないが、治療的利益および／または予防的利益を含めた、有益なまたは所望の結果を得るための手法を指す。治療的利益とは、治療中の１つまたは複数の疾患、状態、または症状における任意の治療上関連する改善、または治療中の１つまたは複数の疾患、状態、または症状に対する任意の治療上関連する効果を意味する。予防的利益のために、特定の疾患、状態、もしくは症状が発生するリスクがある対象、または、疾患、状態、もしくは症状はまだ顕在化していない可能性があるにもかかわらず、当該疾患の生理症状のうちの１つまたは複数が報告されている対象に組成物を投与することができる。一般には、予防的利益は、治療中の１つまたは複数の疾患、状態、または症状の発生率および／または悪化を低下させることを含む（例えば、治療を受けた集団と治療を受けていない集団の間、または対象の治療を受けた状態と治療を受けていない状態の間で）。治療転帰の改善は、対象を、１種もしくは複数種の治療剤での治療、または他の治療介入（例えば、外科手術など）から利益を得るまたは得ない対象と同定するために対象の状態を診断することを含んでよい。そのような診断への適用では、１種または複数種の治療剤を用いた上首尾の治療の全体率を、本開示の方法に従った診断を伴わずに群分けされた患者の中でのその効果と比較して改善することができる（例えば、治療有効性の測定値の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ超の改善）。

【0130】

「対象」、「個体」および「患者」という用語は、本明細書では、互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物としては、これらに限定されないが、マウス、サル、ヒト、農場動物、競技動物、および愛玩動物が挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて得られたまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養された生物学的実体の組織、細胞、およびそれらの後代も包含される。

【0131】

「治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」、「治療能のある薬剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｐａｂｌｅ ａｇｅｎｔ）」または「処置用薬剤（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）」という用語は、互換的に使用され、対象に投与されると、なんらかの有益な効果を付与する分子または化合物を指す。有益な効果としては、診断的決定の実施可能性；疾患、症状、障害、または病的状態の好転；疾患、症状、障害または状態の発症の低下または予防；および一般に、疾患、症状、障害または病的状態の相殺が挙げられる。

【0132】

本明細書に記載の種々の方法の一部の実施形態では、試料は対象由来のものである。対象は、任意の生物体であってよく、その非限定的な例としては、植物、動物、真菌、原生生物、モネラ界の生物、ウイルス、ミトコンドリア、および葉緑体が挙げられる。試料ポリヌクレオチドは、例えば、培養細胞株、生検、血液試料、頬スワブ、または細胞を含有する流体試料（例えば、唾液）を含めた、細胞試料、組織試料、体液試料、もしくは臓器試料（またはこれらのいずれかに由来する細胞培養物）など、対象から単離することができる。いくつかの場合には、試料は、インタクトな細胞を含まないか、処理して細胞を除去するか、または細胞抽出ステップ（例えば、無細胞ポリヌクレオチドを単離するため、無細胞ＤＮＡなど）を伴わずにポリヌクレオチドを単離する。試料供給源の他の例としては、血液、尿、糞便、鼻孔、肺、消化管、他の体液もしくは排泄物に由来するもの、それらに由来する材料、またはそれらの組合せが挙げられる。対象は、これらに限定されないが、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含めた動物であってよく、通常、ヒトなどの哺乳動物である。一部の実施形態では、試料は、対象由来の腫瘍組織の試料中のものなどの腫瘍細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、血液試料またはその一部（例えば、血漿または血清）である。血清および血漿は、そのような組織の中でも、悪性細胞死率が高いことに関連付けられる腫瘍ＤＮＡの相対的な富化に起因して、特に興味深い場合がある。試料は新鮮な試料であってもよく、１つまたは複数の保存プロセスに供された試料（例えば、パラフィン包埋試料、特に、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料）であってもよい。一部の実施形態では、単一の個体由来の試料を多数の別々の試料（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の別々の試料）に分け、それらを、独立に、２連、３連、４連、またはそれ超の分析などの、本開示の方法に供する。試料が対象に由来する場合、参照配列も、分析中の試料由来のコンセンサス配列、または同じ対象の別の試料もしくは組織由来のポリヌクレオチドの配列などの、対象に由来するものであってよい。例えば、血液試料をｃｔＤＮＡ突然変異に関して分析することができ、別の試料（例えば、頬側または皮膚試料）由来の細胞内ＤＮＡを、参照配列を決定するために分析する。

【0133】

ポリヌクレオチドは、任意の適切な方法に従って、試料中の細胞からの抽出を伴ってまたは伴わずに試料から抽出することができる。ポリヌクレオチドを抽出するために種々のキットが利用可能であり、その選択は、試料の種類、または単離される核酸の種類に左右され得る。抽出方法の例は、本明細書に開示されている種々の態様のいずれかに関して記載されているものなど、本明細書において提供される。一例では、試料は、ＥＤＴＡチューブ（例えば、ＢＤバキュテナー）中に採取された試料などの血液試料であってよい。血漿は、末梢血液細胞から遠心分離によって（例えば、４℃、１９００×ｇで１０分）分離することができる。血液試料６ｍＬに対してこのように実施する血漿分離では、一般には、血漿２．５〜３ｍＬが得られる。循環無細胞ＤＮＡは、例えば、ＱＩＡｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ）を製造業者のプロトコールに従って使用することによって、血漿試料から抽出することができる。次いで、ＤＮＡを数量化することができる（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）において）。例として、健康な人由来のそのような血漿試料からの循環ＤＮＡの収量は、血漿１ｍＬ当たり１ｎｇから１０ｎｇまでにわたり得、がん患者試料ではそれよりも有意に多い。

【0134】

ポリヌクレオチドは、凍結または保管試料などの貯蔵試料に由来するものであってもよい。試料を貯蔵するための１つの一般的な方法は、それらをホルマリン固定し、パラフィン包埋することである。しかし、このプロセスには、核酸の分解も伴う。ＦＦＰＥ試料から処理し、分析したポリヌクレオチドは、５０〜２００塩基対の範囲、またはより短い断片などの短いポリヌクレオチドを含み得る。固定しパラフィン包埋した試料から核酸を精製するための技法は、例えば、ＷＯ２００７１３３７０３に記載されているもの、ならびにFossら、Diagnostic Molecular Pathology、（１９９４年）３巻：１４８〜１５５頁およびPaska, C.ら、Diagnostic Molecular Pathology、（２００４年）１３巻：２３４〜２４０頁により記載されている方法など、いくつか存在する。ＡｍｂｉｏｎのＲｅｃｏｖｅｒａｌｌ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔなどの市販のキットを、ＦＦＰＥ試料からポリヌクレオチドを精製するために使用することができる。典型的な方法は、キシレンまたは他の有機溶媒を用いた抽出によってパラフィンを組織から除去するステップから開始され、その後、熱ならびに組織およびタンパク質を切断してゲノム材料の組織からの放出を補助するプロテアーゼ様プロテイナーゼＫを用いて処理する。次いで、放出された核酸を膜に捕捉するまたは溶液から沈殿させ、洗浄して不純物を除去することができ、ｍＲＮＡ単離の場合には、時にはＤＮａｓｅ処理ステップを追加して望ましくないＤＮＡを分解する。ＦＦＰＥ ＤＮＡを抽出するための他の方法が利用可能であり、本開示の方法において使用することができる。

【0135】

一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）などの無細胞ポリヌクレオチドまたは循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。無細胞ＤＮＡは、健康な個体と疾患にかかっている個体のどちらでも循環している。腫瘍由来のｃｆＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、いかなる特定のがんの種類にも限局されず、異なる悪性腫瘍にわたって共通する所見であると思われる。いくつかの測定によると、血漿中の遊離の循環ＤＮＡ濃度は、対照の対象では約１４〜１８ｎｇ／ｍｌであり、新形成を有する患者では約１８０〜３１８ｎｇ／ｍｌである。アポトーシス性および壊死性細胞死が体液中の無細胞循環ＤＮＡに寄与する。例えば、前立腺がん患者ならびに良性前立腺肥大症および前立腺炎（prostatits）などの他の前立腺疾患の血漿において、循環ＤＮＡレベルの有意な上昇が観察されている。さらに、循環腫瘍ＤＮＡは、原発腫瘍が生じる臓器に由来する流体中に存在する。したがって、管洗浄液で乳がん検出を実現することができ、便で結腸直腸がん検出を実現することができ、痰で肺がん検出を実現することができ、尿または射出精液で前立腺がん検出を実現することができる。無細胞ＤＮＡは、種々の供給源から得ることができる。１つの一般的な供給源は、対象の血液試料である。しかし、ｃｆＤＮＡまたは他の断片化ＤＮＡは、種々の他の供給源に由来するものであってよい。例えば、尿および便試料がｃｔＤＮＡを含めたｃｆＤＮＡの供給源であってよい。

【0136】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを、抽出ステップを伴わずに、かつ／または精製ステップを伴わずに、その後のステップ（例えば、環状化および増幅）に供する。例えば、流体試料を、抽出ステップを伴わずに処理して細胞を除去して精製された液体試料および細胞試料を生じさせ、その後、精製された流体試料からＤＮＡを単離することができる。沈殿または基質への非特異的な結合、その後、基質を洗浄して結合したポリヌクレオチドを放出させることによるものなど、ポリヌクレオチドを単離するための種々の手順が利用可能である。ポリヌクレオチドを、細胞抽出ステップを伴わずに試料から単離する場合、ポリヌクレオチドは大部分が細胞外または「無細胞」ポリヌクレオチドになる。例えば、無細胞ポリヌクレオチドは、無細胞ＤＮＡ（「循環」ＤＮＡとも称される）を含んでよい。一部の実施形態では、循環ＤＮＡは、体液または排泄物（例えば、血液試料）に由来するものなどの、腫瘍細胞由来の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）である。腫瘍は、アポトーシスまたは壊死を頻繁に示し、したがって、腫瘍核酸は、種々の機構を通じて、異なる形態で、かつ異なるレベルで、対象の血流を含めた体内に放出される。一般には、ｃｔＤＮＡのサイズは、高濃度の小さな断片、一般に、７０〜２００ヌクレオチドの長さから、低濃度の大きな断片、数千キロベースに至るまでにわたり得る。

【0137】

本明細書に記載の種々の態様のいずれかの一部の実施形態では、配列変異体の検出は、参照配列に対して、または突然変異のないバックグラウンドで突然変異（例えば、稀な体細胞突然変異）を検出することを含み、その配列変異体は疾患と相関する。一般に、疾患または形質との関連に関する統計学的、生物学的、および／または機能的証拠が存在する配列変異体は、「原因遺伝子変異体」と称される。単一の原因遺伝子変異体を２つ以上の疾患または形質と関連付けることができる。一部の実施形態では、原因遺伝子変異体は、メンデル形質、非メンデル形質、またはその両方と関連付けることができる。原因遺伝子変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ超の配列の差異（例えば、原因遺伝子変異体を含むポリヌクレオチドと、同じ相対的なゲノム位に原因遺伝子変異体がないポリヌクレオチドの間など）などのポリヌクレオチドの変異として顕在化し得る。原因遺伝子変異体の型の非限定的な例としては、一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失／挿入多型（ＤＩＰ）、コピー数変異体（ＣＮＶ）、短い縦列反復（ＳＴＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、単純配列反復（ＳＳＲ）、可変数縦列反復（ＶＮＴＲ）、ランダムに増幅された多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、レトロトランスポゾン間増幅多型（ＩＲＡＰ）、長いおよび短い分散要素（ＬＩＮＥ／ＳＩＮＥ）、長い縦列反復（ＬＴＲ）、可動要素、レトロトランスポゾンマイクロサテライト増幅多型、レトロトランスポゾンに基づく挿入多型、配列特異的増幅多型、ならびに遺伝性後成的修飾（例えば、ＤＮＡメチル化）が挙げられる。原因遺伝子変異体は、密接に関連する原因遺伝子変異体のセットであってもよい。いくつかの原因遺伝子変異体は、ＲＮＡポリヌクレオチドにおける配列変異として影響を及ぼし得る。このレベルでは、いくつかの原因遺伝子変異体は、ＲＮＡポリヌクレオチドの種の有無によっても示される。また、いくつかの原因遺伝子変異体により、タンパク質ポリペプチドにおける配列変異がもたらされる。いくつかの原因遺伝子変異体が報告されている。ＳＮＰである原因遺伝子変異体の例は、鎌状赤血球貧血を引き起こす、ヘモグロビンのＨｂ Ｓ変異体である。ＤＩＰである原因遺伝子変異体の例は、嚢胞性線維症を引き起こす、ＣＦＴＲ遺伝子のデルタ５０８突然変異である。ＣＮＶである原因遺伝子変異体の例は、ダウン症候群を引き起こす２１トリソミーである。ＳＴＲである原因遺伝子変異体の例は、ハンチントン病を引き起こす縦列反復である。原因遺伝子変異体およびそれらが関連する疾患の非限定的な例を表４において提示する。原因遺伝子変異体のさらなる非限定的な例は、ＷＯ２０１４０１５０８４に記載されている。突然変異が疾患に関連する遺伝子、および本開示の方法に従って配列変異体を検出することができる遺伝子のさらなる例を表５において提示する。

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【表4-6】

【表4-7】

【表4-8】

【表4-9】

【表4-10】

【表4-11】

【表4-12】

【表4-13】

【表4-14】

【表4-15】

【表4-16】

【表4-17】

【表4-18】

【表4-19】

【表4-20】

【表4-21】

【表4-22】

【表4-23】

【表4-24】

【表4-25】

【表4-26】

【表4-27】

【表4-28】

【表5】

【0138】

一部の実施形態では、方法は、検出された原因遺伝子変異体に関連する疾患を有する対象を診断するステップ、または患者がそのような疾患を有するまたは発生する可能性を報告するステップなどの、コールするステップに基づいて対象を診断するステップをさらに含む。疾患、関連する遺伝子、および関連する配列変異体の例は本明細書において提供される。一部の実施形態では、結果は、本明細書に記載されているような報告作成プログラムを介して報告される。

【0139】

一部の実施形態では、１つまたは複数の原因遺伝子変異体は、がんまたは特定の特性（例えば、転移能、薬物抵抗性、薬物応答性）を有するがんの特定の種類または病期に関連する配列変異体である。一部の実施形態では、本開示は、例えば、ある特定の突然変異が患者の転帰に関連することが公知である場合など、予後を決定するための方法を提供する。例えば、ｃｔＤＮＡは、乳がん予後に関して従来のがん抗原５３（ＣＡ−５３）および循環性腫瘍細胞の列挙よりも良好なバイオマーカーであることが示されている（例えば、Dawsonら、N Engl J Med ３６８巻：１１９９頁（２０１３年）を参照されたい）。さらに、本開示の方法は、治療上の決定、手引きおよびモニタリング、ならびにがん療法の開発および臨床試験において使用することができる。例えば、治療の有効性は、例えば、分子標的療法（モノクローナル薬物）、化学療法薬、放射線プロトコールなどの特定の療法またはこれらの組合せを用いた治療の前、その間、およびその後の患者のｃｔＤＮＡ試料を比較することによってモニターすることができる。例えば、ｃｔＤＮＡをモニターして、治療後にある特定の突然変異が増加または減少しているか、新しい突然変異が出現しているかなどを確かめることができ、それにより、医師が、患者の症状を追跡するモニター方法によってもたらされるよりもはるかに短い期間で治療を変更する（例えば、治療を継続する、中止するまたは変化させる）ことが可能になる。一部の実施形態では、方法は、検出された配列変異体に関連する特定の病期もしくは種類のがんを有する対象を診断するステップ、または患者がそのようながんを有するもしくは発生する可能性を報告するステップなどの、コールするステップに基づいて対象を診断するステップをさらに含む。

【0140】

例えば、分子マーカー（例えば、ハーセプチンおよびｈｅｒ２／ｎｅｕの状態）に基づいて患者を特異的に標的とする療法に関しては、患者を検査して、患者の腫瘍にある特定の突然変異が存在するかどうか、およびこれらの突然変異を、療法に対する応答または抵抗性を予測し、その療法を使用するかどうかの決定を手引きするために使用することができるかどうかを見いだす。したがって、治療の過程中にｃｔＤＮＡを検出およびモニターすることは、治療の選択の手引きにおいて非常に有用であり得る。いくつかの一次的な（治療前）または二次的な（治療後）がん突然変異が、いくつかの療法に対するがんの抵抗性に関与することが見いだされる（Misaleら、Nature ４８６巻（７４０４号）：５３２頁（２０１２年））。

【0141】

診断、予後、または治療の決定において有用であり得る、１つまたは複数の種類のがんに関連する種々の配列変異体は公知である。本開示の方法において使用を見いだす、腫瘍学的に重要な適切な標的配列としては、これらに限定されないが、ＴＰ５３遺伝子、ＡＬＫ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子、ＢＲＡＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、およびＫＩＴ遺伝子における変更が挙げられる。特異的に増幅し、かつ／または配列変異体に関して特異的に分析することができる標的配列は、がん関連遺伝子の全部または一部であってよい。一部の実施形態では、ＴＰ５３遺伝子における１つまたは複数の配列変異体を同定する。ＴＰ５３は、ヒトがんにおいて最も頻繁に突然変異する遺伝子の１つであり、例えば、ＴＰ５３突然変異は、卵巣がんの４５％、大腸がんの４３％、および上部気道消化管（upper aerodigestive track）のがんの４２％において見いだされる（例えば、M. Olivierら、TP53 Mutations in Human Cancers: Origins, Consequences, and Clinical Use. Cold Spring Harb Perspect Biol. ２０１０年１月；２巻（１号）を参照されたい。ＴＰ５３の突然変異の状態の特徴付けは、臨床的診断の助けになり得、予後値をもたらし得、がん患者の治療に影響を及ぼし得る。例えば、ＴＰ５３突然変異を、グリア細胞に由来するＣＮＳ腫瘍の患者に対する予後不良の予測因子および慢性リンパ球性白血病の患者における急速な疾患の進行の予測因子として使用することができる（例えば、McLendon REら、Cancer. ２００５年１０月１５日；１０４巻（８号）：１６９３〜９頁；Dicker Fら、Leukemia. ２００９年１月；２３巻（１号）：１１７〜２４頁を参照されたい）。配列変異は、遺伝子内のどこにでも生じ得る。したがって、本発明ではＴＰ５３遺伝子の全部または一部を評価することができる。すなわち、本明細書の他の箇所に記載の通り、標的特異的成分（例えば、標的特異的プライマー）を使用する場合、例えば、選択された標的に対して使用することができるのと同様に、１つまたは複数の選択された部分配列（例えば、突然変異「ホットスポット」など）だけではなく、遺伝子にわたる断片を増幅し、検出するために、複数のＴＰ５３特異的配列を使用することができる。あるいは、１つまたは複数の選択された部分配列（同様に「ホットスポット」という用語に包含される、対象のクラスの中で突然変異の率の上昇に関連するそのようなヌクレオチドまたはヌクレオチド領域）の上流または下流にハイブリダイズする標的特異的プライマーを設計することができる。そのような部分配列にわたる標準のプライマーを設計することができ、かつ／または、そのような部分配列の上流または下流にハイブリダイズするＢ２Ｂプライマーを設計することができる。

【0142】

一部の実施形態では、ＡＬＫ遺伝子の全部または一部における１つまたは複数の配列変異体を同定する。肺腫瘍の７％もにおいてＡＬＫ融合が報告されており、そのいくつかは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）抵抗性と関連付けられている（例えば、Shawら、J Clin Oncol. ２００９年９月１０日；２７巻（２６号）：４２４７〜４２５３頁を参照されたい）。２０１３年まで、ＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に対する二次的な抵抗性を有する患者において、ＡＬＫチロシンキナーゼドメイン全体にわたる、いくつかの異なる点突然変異が見いだされた（Katayama R 2012 Sci Transl Med. ２０１２年２月８日；４巻（１２０号））。したがって、ＡＬＫ遺伝子における突然変異の検出を使用して、がん療法の決定を補助することができる。

【0143】

一部の実施形態では、ＫＲＡＳ遺伝子の全部または一部における１つまたは複数の配列変異体を同定する。肺腺癌の患者のおよそ１５〜２５％および結腸直腸がんの患者の４０％が腫瘍に関連するＫＲＡＳ突然変異を有することが報告されている（例えば、Neuman ２００９年、Pathol Res Pract. ２００９年；２０５巻（１２号）：８５８〜６２頁を参照されたい）。突然変異の大部分は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、１３、および６１に位置する。これらの突然変異によりＫＲＡＳシグナル伝達経路が活性化し、それにより、腫瘍細胞の成長および増殖が誘発される。いくつかの研究により、ＫＲＡＳに突然変異を有する、腫瘍を有する患者は、単独または化学療法と組み合わせた抗ＥＧＦＲ抗体療法から利益を得る可能性が低いことが示されている（例えば、Amadoら、２００８年 J Clin On col. ２００８年４月１日；２６巻（１０号）：１６２６〜３４頁、Bokemeyerら、２００９年 J Clin Oncol. ２００９年２月１０日；２７巻（５号）：６６３〜７１頁を参照されたい）。配列変異の同定を標的とすることができる配列変異の１つの特定の「ホットスポット」は、遺伝子の３５位である。例えば、結腸直腸がんの対象に対する治療の選択においてなど、治療の選択においてＫＲＡＳ配列変異体の同定を使用することができる。

【0144】

一部の実施形態では、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の全部または一部における１つまたは複数の配列変異体を同定する。ＰＩＫ３ＣＡにおける体細胞突然変異は、種々の種類のがんにおいて頻繁に見いだされており、例えば、結腸直腸がんの１０〜３０％において見いだされている（例えば、Samuelsら、２００４年 Science. ２００４年４月２３日；３０４巻（５６７０号）：５５４頁を参照されたい）。これらの突然変異は、最も一般的に、エクソン９（ヘリックスドメイン）およびエクソン２０（キナーゼドメイン）内の２つの「ホットスポット」領域内に位置し、配列変異体の検出の増幅および／または分析に関して特異的に標的とすることができる。３１４０位も特異的に標的とすることができる。

【0145】

一部の実施形態では、ＢＲＡＦ遺伝子の全部または一部における１つまたは複数の配列変異体を同定する。全ての悪性黒色腫のうちの５０％近くがＢＲＡＦに体細胞突然変異を有することが報告されている（例えば、Maldonadoら、J Natl Cancer Inst. ２００３年１２月１７日；９５巻（２４号）：１８７８〜９０頁を参照されたい）。ＢＲＡＦ突然変異は、全ての黒色腫サブタイプに見いだされるが、日光により誘導される慢性損傷を伴わない皮膚から生じる黒色腫における頻度が最も高い。黒色腫における最も一般的なＢＲＡＦ突然変異は、６００位のバリンがグルタミンで置換されたミスセンス突然変異Ｖ６００Ｅである。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異は、ＢＲＡＦ阻害剤療法の臨床的利益に関連する。ＢＲＡＦ突然変異の検出は、黒色腫の治療の選択および標的化療法への抵抗性の研究に使用することができる。

【0146】

一部の実施形態では、ＥＧＦＲ遺伝子の全部または一部における１つまたは複数の配列変異体を同定する。ＥＧＦＲ突然変異は、非小細胞肺がんに頻繁に付随する（米国では約１０％、および東アジアでは３５％；例えば、Paoら、Proc Natl Acad Sci US A.２００４年９月７日；１０１巻（３６号）：１３３０６〜１１頁を参照されたい）。これらの突然変異は、一般にはＥＧＦＲエクソン１８〜２１の範囲内に生じており、通常はヘテロ接合性である。これらの突然変異のおよそ９０％はエクソン１９欠失またはエクソン２１ Ｌ８５８Ｒ点突然変異である。

【0147】

一部の実施形態では、ＫＩＴ遺伝子の全部または一部における１つまたは複数の配列変異体を同定する。消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の８５％近くがＫＩＴ突然変異を有することが報告されている（例えば、Heinrichら、２００３年 J Clin Oncol. ２００３年１２月１日；２１巻（２３号）：４３４２〜９頁を参照されたい）。大多数のＫＩＴ突然変異は、膜近傍ドメイン（エクソン１１、７０％）、細胞外二量体化モチーフ（エクソン９、１０〜１５％）、チロシンキナーゼＩ（ＴＫＩ）ドメイン（エクソン１３、１〜３％）、およびチロシンキナーゼ２（ＴＫ２）ドメインおよび活性化ループ（エクソン１７、１〜３％）に見いだされる。二次的なＫＩＴ突然変異は、一般に、標的療法イマチニブの後および患者に療法に対する抵抗性が発生した後に同定される。

【0148】

その全部または一部を配列変異体に関して本明細書に記載の方法に従って分析することができる、がんに関連する遺伝子のさらなる非限定的な例としては、これらに限定されないが、ＰＴＥＮ；ＡＴＭ；ＡＴＲ；ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ２；ＥＲＢＢ３；ＥＲＢＢ４；Ｎｏｔｃｈ１；Ｎｏｔｃｈ２；Ｎｏｔｃｈ３；Ｎｏｔｃｈ４；ＡＫＴ；ＡＫＴ２；ＡＫＴ３；ＨＩＦ；ＨＩＦ１ａ；ＨＩＦ３ａ；Ｍｅｔ；ＨＲＧ；Ｂｃｌ２；ＰＰＡＲアルファ；ＰＰＡＲガンマ；ＷＴ１（ウィルムス腫瘍）；ＦＧＦ受容体ファミリーメンバー（５種のメンバー：１、２、３、４、５）；ＣＤＫＮ２ａ；ＡＰＣ；ＲＢ（網膜芽細胞腫）；ＭＥＮ１；ＶＨＬ；ＢＲＣＡ１；ＢＲＣＡ２；ＡＲ；（アンドロゲン受容体）；ＴＳＧ１０１；ＩＧＦ；ＩＧＦ受容体；Ｉｇｆ１（４種の変異体）；Ｉｇｆ２（３種の変異体）；Ｉｇｆ１受容体；Ｉｇｆ２受容体；Ｂａｘ；Ｂｃｌ２；カスパーゼファミリー（９種のメンバー：１、２、３、４、６、７、８、９、１２）；Ｋｒａｓ；およびＡｐｃが挙げられる。さらなる例は、本明細書の他の箇所で提示されている。本明細書に開示されている方法に従って、１つまたは複数の配列変異体をコールすることに基づいて診断することができるがんの例としては、限定することなく、棘細胞腫、腺房細胞癌、聴神経腫、末端黒子型黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟化を伴う急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、アダマンチノーマ、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺様歯原性腫瘍、副腎皮質癌、成人Ｔ細胞白血病、侵攻性ＮＫ細胞白血病、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル芽細胞線維腫、肛門がん、未分化大細胞型リンパ腫、甲状腺未分化がん、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様横紋筋肉腫様腫瘍、基底細胞癌、基底様癌、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、ベリーニ管癌、胆道がん、膀胱がん、芽細胞腫、骨がん、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、ブレンナー腫瘍、気管支腫瘍、細気管支肺胞癌、褐色腫、バーキットリンパ腫、原発部位不明がん、カルチノイド腫瘍、癌腫、上皮内癌、陰茎癌、原発部位不明癌、癌肉腫、キャッスルマン病、中枢神経系胚芽腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸がん、胆管細胞癌、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、脈絡叢乳頭腫、慢性リンパ球性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性好中球性白血病、明細胞腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚のＴ細胞リンパ腫、デゴス病、隆起性皮膚線維肉腫、類皮嚢胞、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、胎児性癌、卵黄嚢腫瘍、子宮体がん、子宮内膜がん、子宮内膜性腫瘍、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫、上衣芽腫、上衣腫、類上皮肉腫、赤白血病、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング腫瘍、ユーイングファミリー肉腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、乳房外パジェット病、卵管がん、封入奇形児、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、甲状腺濾胞がん、胆嚢がん、胆嚢がん、神経節膠腫、神経節細胞腫、胃がん、胃リンパ腫、胃腸がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞性腫瘍、胚細胞腫、妊娠性絨毛癌、妊娠性絨毛性腫瘍、骨の巨細胞腫、多形神経膠芽腫、神経膠腫、大脳神経膠腫症、グロムス腫瘍、グルカゴノーマ、生殖腺芽細胞腫、顆粒膜細胞腫、ヘアリー細胞白血病、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、頭頸部がん、心臓がん、血管芽細胞腫、血管外皮腫、血管肉腫、血液悪性腫瘍、肝細胞癌、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、遺伝性乳がん卵巣がん症候群、ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部神経膠腫、炎症性乳がん、眼内黒色腫、膵島細胞癌、膵島細胞腫瘍、若年性骨髄単球性白血病、カポジ肉腫、カポジ肉腫、腎がん、クラツキン腫瘍、クルケンベルグ腫瘍、喉頭がん、喉頭がん、悪性黒子黒色腫、白血病、白血病、口唇・口腔がん、脂肪肉腫、肺がん、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、悪性線維性組織球腫、骨の悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、悪性横紋筋肉腫様腫瘍、悪性トリトン腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肥満細胞性白血病、縦隔胚細胞性腫瘍、縦隔腫瘍、甲状腺髄様がん、髄芽腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、転移性尿路上皮癌、ミュラー管混合腫瘍、単球性白血病、口腔がん、粘液性腫瘍、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、菌状息肉腫、骨髄異形成疾患、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄肉腫、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔がん、鼻咽頭がん、上咽頭癌、新生物、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、神経腫、結節性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、眼腫瘍、乏突起星細胞腫、乏突起神経膠腫、オンコサイトーマ、視神経鞘髄膜腫、口腔がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、骨肉腫、卵巣がん、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、乳房パジェット病、パンコースト腫瘍、膵がん、膵がん、甲状腺乳頭がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、血管周囲類上皮細胞腫瘍、咽頭がん、褐色細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、松果体芽腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、胸膜肺芽腫、多胚腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、原発性肝細胞がん、原発性肝臓がん、原発性腹膜がん、原始神経外胚葉性腫瘍、前立腺がん、腹膜偽粘液腫、直腸がん、腎細胞癌、第１５染色体上のＮＵＴ遺伝子が関与する呼吸器癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒタートランスフォーメーション、仙尾部奇形腫、唾液腺がん、肉腫、神経鞘腫症、脂腺癌、続発性新生物、セミノーマ、漿液性腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、性索間質腫瘍、セザリー症候群、印環細胞癌、皮膚がん、小円形青色細胞腫瘍、小細胞癌、小細胞肺がん、小細胞型リンパ腫、小腸がん、軟部肉腫、ソマトスタチノーマ、煤煙性疣贅、脊髄腫瘍、脊椎腫瘍、脾臓周辺帯リンパ腫、扁平上皮癌、胃がん、表在拡大型黒色腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、表層上皮性間質性腫瘍、滑膜肉腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、奇形腫、末期のリンパのがん、精巣がん、莢膜細胞腫、のどがん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺がん、腎盤および尿管の移行上皮がん、移行上皮癌、尿膜管癌、尿道がん、泌尿生殖器新生物、子宮肉腫、ぶどう膜黒色腫、膣がん、ヴェルナー・モリソン症候群、疣状癌、視経路グリオーマ、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ワルチン腫瘍、ウィルムス腫瘍、およびこれらの組合せが挙げられる。がんに関連する特異的な配列変異体の非限定的な例を表６に提示する。

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【0149】

さらに、本明細書に開示されている方法および組成物は、１つまたは複数のがんの種類、病期またはがんの特性に関連付けられる新しい稀な突然変異の発見において有用であり得る。例えば、分析中の特性（例えば、特定の疾患、がんの種類、がんの病期など）を共有する個体の集団を、配列変異体または配列変異体の種類（例えば、特定の遺伝子または遺伝子の一部における突然変異）を同定するために、本開示による配列変異体の検出方法に供することができる。特性を共有する個体の群の中で、特性を伴わない個体よりも統計的に有意に大きな頻度で生じていることが同定された配列変異体に、その特性とのある程度の関連を割り当てることができる。次いで、そのように同定された配列変異体または配列変異体の種類を、その配列変異体を有することが発見された個体の診断または治療において使用することができる。

【0150】

他の治療への適用としては、非侵襲的な胎児の診断における使用が挙げられる。胎児ＤＮＡは、妊娠中の女性の血液中に見いだすことができる。本明細書に記載の方法および組成物は、循環胎児ＤＮＡにおける配列変異体を同定するために使用することができ、したがって、１つまたは複数の原因遺伝子変異体に関連するものなどの、胎児における１つまたは複数の遺伝子疾患を診断するために使用することができる。原因遺伝子変異体の非限定的な例は、本明細書に記載されており、それらとして、トリソミー、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、およびテイ・サックス病（Tay-Saks disease）が挙げられる。この実施形態では、比較のために使用する対照試料および血液試料を母親が提供することができる。対照試料は、任意の適切な組織であってよく、一般には、処理して細胞内ＤＮＡを抽出し、次いでそれを配列決定して、参照配列をもたらすことができる。次いで、胎児のゲノムＤＮＡに対応するｃｆＤＮＡの配列を母体参照に対する配列変異体と同定することができる。胎児の配列、および配列変異体の同定を補助するために、父親も参照試料を提供することができる。

【0151】

さらに別の治療への適用としては、病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌、および微生物）に由来するものなどの外因性ポリヌクレオチドの検出が挙げられ、この情報により、診断および治療の選択が通知され得る。例えば、いくつかのＨＩＶサブタイプは薬物抵抗性と相関する（例えば、hivdb.stanford.edu/pages/genotype-rxを参照されたい）。同様に、ＨＣＶタイピング、サブタイピングおよびアイソタイプ突然変異も本開示の方法および組成物を使用して行うことができる。さらに、ＨＰＶサブタイプは、子宮頸がんのリスクと相関し、このような診断により、がんリスクの評価をさらに通知することができる。検出することができるウイルスの別の非限定的な例としては、ヘパドナウイルスＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ウッドチャック肝炎ウイルス、地リス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）肝炎ウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、サギＢ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、モルモットサイトメガロウイルス（ＧＰＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ変異体ＡおよびＢ）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、Ｂウイルスポックスウイルスワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス、天然痘ウイルス、サル痘ウイルス、牛痘ウイルス、ラクダ痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、マウス痘ウイルス、ウサギ痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、オルフウイルス、ミルカー結節ウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス、羊痘ウイルス、山羊痘ウイルス、ランピースキン病ウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、鳩痘ウイルス、スズメ痘ウイルス、粘液腫ウイルス、ノウサギ線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルス、豚痘ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバポックスウイルス、フラビウイルスデングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＧＢ肝炎ウイルス（ＧＢＶ−Ａ、ＧＢＶ−ＢおよびＧＢＶ−Ｃ）、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、トガウイルス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、チクングニアウイルス、ロスリバーウイルス、マヤロウイルス、シンドビスウイルス、風疹ウイルス、レトロウイルスヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型および２型、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）１型、２型、および５型、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、レンチウイルス、コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、フィロウイルスエボラウイルス、マールブルグウイルス、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）などのメタニューモウイルス（ＭＰＶ）、ラブドウイルス狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ブニヤウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラクロスウイルス、ハンタンウイルス、オルソミクソウイルス、インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、およびＣ型）、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ１型、２型および３型）、呼吸器合胞体ウイルス（Ａ型およびＢ型）、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサウイルス、アマパリウイルス、フレキサルウイルス、イッピーウイルス、モバラウイルス、モペイアウイルス、ラチノウイルス、パラナウイルス、ピキンデウイルス、プンタトロウイルス（ＰＴＶ）、タカリベウイルスおよびタミアミウイルスが挙げられる。

【0152】

本開示の方法によって検出することができる細菌病原体の例は、限定することなく、細菌病原体の特定の例を含み、それらとして、限定することなく、とりわけ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．（例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉおよびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉなど）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．（例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ ｂｉｏｖａｒ ｓｏｂｒｉａ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｏｂｒｉａ）、およびＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅなど）、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなど）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓなど）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓおよびＢａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅなど）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａなど）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐ．（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉなど）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｎｔｅｎｓｉｓおよびＢｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓなど）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａなど）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉおよびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓなど）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｉｋｅｕｍおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍなど）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉなど）、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、ならびにｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、例えば、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉおよびｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉを含めたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなど）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍなど）Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐ．（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｅｅｎｓｉａおよびＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓなど）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｇｅｍｅｌｌａ ｍｏｒｂｉｌｌｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓなど）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉおよびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｎｎｅｌｌｉａｅなど）、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇｉｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａなど）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍなど）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ ｓｐ．（例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍなど）、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．（例えば、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｙｒｉａｃｉｇｅｏｒｇｉｃａおよびＮｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓなど）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓなど）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ． Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｍｉｎｏｇｅｎｉｃａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓおよびＰｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓなど）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐ．（例えば、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉおよびＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉなど）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐ．（例えば、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉおよびＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ（以前はＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）およびＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉなど）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなど）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓおよびＳｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓなど）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉおよびＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉなど）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓなど）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えば、クロラムフェニコール抵抗性血清型４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、スペクチノマイシン抵抗性血清型６Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ストレプトマイシン抵抗性血清型９Ｖ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、エリスロマイシン抵抗性血清型１４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、オプトヒン抵抗性血清型１４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、リファンピシン抵抗性血清型１８Ｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、テトラサイクリン抵抗性血清型１９Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ペニシリン抵抗性血清型１９Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびトリメトプリム抵抗性血清型２３Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、クロラムフェニコール抵抗性血清型４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、スペクチノマイシン抵抗性血清型６Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ストレプトマイシン抵抗性血清型９Ｖ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、オプトヒン抵抗性血清型１４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、リファンピシン抵抗性血清型１８Ｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ペニシリン抵抗性血清型１９Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはトリメトプリム抵抗性血清型２３Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｂ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｃ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｍｉｌｉｓ、Ｄ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｆ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ Ｇ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉなど）、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．（例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎ
ｅｍａ ｐｅｔｅｎｕｅ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍおよびＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｅｎｄｅｍｉｃｕｍなど）、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｍｉｍｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｈｏｌｌｉｓａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｖｉｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｄａｍｓｅｌａおよびＶｉｂｒｉｏ ｆｕｒｎｉｓｉｉなど）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．（例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなど）、ならびにＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａのうちの任意の１つまたは複数（またはそれらの任意の組合せ）が挙げられる。

【0153】

一部の実施形態では、本開示の方法および組成物を、臓器移植レシピエントのモニタリングに使用する。一般には、ドナー細胞由来のポリヌクレオチドは、レシピエント細胞由来のポリヌクレオチドのバックグラウンドにおいて循環中に見いだされる。ドナー循環ＤＮＡのレベルは、一般に、臓器が十分に受け入れられている場合には安定であり、ドナーＤＮＡの急速な増加（例えば、所与の試料における頻度として）を移植片拒絶反応の初期の徴候として使用することができる。移植不全を予防するためにこの段階で治療を行うことができる。ドナー臓器の拒絶反応により、血液中のドナーＤＮＡが増加することが示されている；Snyderら、PNAS １０８巻（１５号）：６６２９頁（２０１１年）を参照されたい。本開示は、この領域における以前の技法に対する有意な感度の改善を提供する。この実施形態では、レシピエント対照試料（例えば、頬スワブなど）およびドナー対照試料を比較のために使用することができる。レシピエント試料を、その参照配列をもたらすために使用することができ、ドナーのゲノムに対応する配列を、その参照に対する配列変異体として同定することができる。モニタリングは、ある期間にわたってレシピエントから試料（例えば、血液試料）を得ることを含んでよい。初期試料（例えば、最初の数週間以内）を、ドナーｃｆＤＮＡの画分についてのベースラインを確立するために使用することができる。その後の試料をベースラインと比較することができる。一部の実施形態では、約もしくは少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２５０％、５００％、１０００％、またはそれ超のドナーｃｆＤＮＡの画分の増加が、レシピエントが、ドナー組織を拒絶するプロセス中であることの指標としての機能を果たし得る。

【実施例】

【0154】

以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的でもたらされ、本発明をいかなる様にも限定することを意図するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、現在好ましい実施形態を表し、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲によって定義される本発明の主旨の範囲内に包含される、実施例における変化および他の使用が当業者には想起されよう。
（実施例１）
突然変異を検出するための縦列反復性の配列決定ライブラリーの調製

【0155】

１２μＬの水または１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中約１５０ｂｐのＤＮＡ断片＞１０ｎｇから開始して、１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ緩衝液ミックス２μＬを添加し、混合物を９５℃まで２分加熱し、氷上で５分冷却した。これに、５Ｍのベタインを４μＬ、５０ｍＭのＭｎＣｌ_２を１μＬ、およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩを１μＬ添加した。反応物を６０℃で少なくとも１２時間インキュベートした。次に、ＲＣＡプライマーミックス（各５０ｎＭ、最終濃度５ｎＭまで）２μＬを添加し、混合した。混合物を９５℃まで２分加熱し、４２℃まで２時間冷却した。ＣｉｒＬｉｇａｔｉｏｎ産物を、Ｚｙｍｏオリゴヌクレオチド精製キットを用いて精製した。製造業者の説明書に従って、水２８μＬをＣｉｒｃＬｉｇａｔｉｏｎ産物２２μＬに添加して総体積を５０μＬにした。これをオリゴ結合緩衝液１００μＬおよびエタノール４００μＬと混合した。これを＞１０，０００×ｇで３０秒回転させ、フロースルーを廃棄した。ＤＮＡ洗浄緩衝液７５０μＬを添加し、次いで、＞１０，０００×ｇで３０秒回転させ、フロースルーを廃棄し、最高速度でさらに１分、回転させた。カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し、水１７μＬを用いて溶出した（最終的な溶出体積はおよそ１５μＬであった）。

【0156】

約５０μＬの体積でローリングサークル増幅を行った。溶出試料１５μＬ中に、１０×ＲｅｐｌｉＰＨＩ緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を５μＬ、２５ｍＭのｄＮＴＰを１μＬ、１００ｍＭのＤＴＴを２μＬ、１００Ｕ／μＬのＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９を１μＬ、および水を２６μＬ添加した。反応混合物を３０℃で１時間インキュベートした。ＲＣＡ産物を、Ａｍｐｕｒｅビーズ８０μＬを添加し、残りの洗浄ステップについて製造業者の説明書に従うことによって精製した。溶出のために、溶出緩衝液２２．５μＬを添加し、ビーズを６５℃で５分インキュベートした。手短に回転させた後、チューブを磁石に戻した。

【0157】

ＲＣＡ反応からの溶出産物約２０μＬを２×Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ２５μＬ、ＤＭＳＯ ２．５μＬ、および１０μＭの各Ｂ２Ｂプライマーミックス０．５μＬと混合した。増幅には以下のＰＣＲプログラムを使用した：９５℃で１分、５サイクルの伸長（９５℃で１５秒、５５℃で１５秒、７２℃で１分）、１３〜１８サイクルの複製（９５℃で１５秒、６８℃で１５秒、７２℃で１分）、および７２℃で７分の最終的な伸長。ＰＣＲ産物サイズをＥゲルに流すことによって確認した。範囲が１００〜５００ｂｐである場合、０．６×Ａｍｐｕｒｅビーズ精製を実施して３００〜５００ｂｐを富化し、１〜２ｎｇを、低分子ＲＮＡライブラリーアダプタープライマーを用いたＰＣＲの別のラウンドのために取った。産物のサイズ範囲が＞１０００ｂｐであった場合、１．６×Ａｍｐｕｒｅビーズを用いて産物を精製し、０．６×Ａｍｐｕｒｅビーズ精製によって４００〜１０００ｂｐの範囲のサイズを富化するためにＮｅｘｔｅｒａ ＸＴアンプリコンライブラリープレップのために２〜３ｎｇを取った。

【0158】

配列決定データに対してバイオインフォマティクスを実施するために、ＦＡＳＴＱファイルをＭｉＳｅｑの実行から得た。ＢＷＡを使用して、配列をＦＡＳＴＱファイルにおいて標的配列（例えば、ＫＲＡＳおよびＥＧＦＲ）を含有する参照ゲノム配列とアラインした。アラインメント結果を使用して、反復単位およびその参照位置の領域および長さを各配列（両方のリード）について見いだした。アラインメント結果および各配列の反復単位に関する情報を使用して全ての遺伝子座における変異体を見いだした。２つのリードからの結果を統合した。正規化された変異体の頻度およびノイズレベルを計算した。ｑスコア＞３０およびｐ値＜０．０００１を含めた、確認された変異体からの変異体コールにおける多数の追加的な基準を適用した。これらの基準を通った確認された変異体を真の変異体（突然変異）として報告した。プロセスは、コンピュータ言語（例えば、ｐｙｔｈｏｎ）によって自動化することができる。
（実施例２）
配列変異体を検出するための縦列反復性の配列決定ライブラリーの作出

【0159】

平均長が１５０ｂｐであるＤＮＡ断片１０ｎｇを体積１２μＬで縦列反復性の配列決定ライブラリー構築のために使用した。ＤＮＡは、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて予め処理して、５’末端にリン酸基を付加し、３’末端にヒドロキシル基を残した。ＤＮａｓｅＩもしくは酵素的な断片化によって作製されたまたは血清もしくは血漿から抽出されたＤＮＡ断片については、末端処理ステップは飛ばした。ＤＮＡを１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ＣＬ９０２１Ｋ）２μＬと混合した。混合物を９５℃まで２分加熱し、氷上で５分冷却し、次いで、ベタインを４μＬ、５０ｍＭのＭｎＣｌ_２を１μＬ、およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩを１μＬ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ＣＬ９０２１Ｋ）添加した。ライゲーション反応を６０℃で少なくとも１２時間実施した。２００ｎＭ（最終的に１０ｎＭの最終濃度）の各ＲＣＡプライマーミックス１μＬをライゲーション産物に添加し、混合し、９６℃まで１分加熱し、４２℃まで冷却し、４２℃で２時間インキュベートした。

【0160】

ハイブリダイズしたＲＣＡプライマーを含むＣｉｒｃＬｉｇａｔｉｏｎ産物を、Ｚｙｍｏオリゴヌクレオチド精製キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ４０６０）を用いて精製した。これを行うために、産物２１μＬを、水２８μＬおよび担体ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒ５６３６、１×ＴＥ緩衝液を用いて２００ｎｇ／μＬに希釈したもの）１μＬを用いて５０μＬまで希釈した。希釈した試料を、オリゴ結合緩衝液１００μＬおよび１００％エタノール４００μＬと混合した。混合物をカラムにローディングし、＞１０，０００×ｇで３０秒遠心分離した。フロースルーを廃棄した。カラムを、ＤＮＡ洗浄緩衝液７５０μＬを用い、＞１０，０００×ｇで３０秒遠心分離し、フロースルーを廃棄し、最高速度でさらに１分遠心分離することによって洗浄した。カラムを新しい１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、ＤＮＡを、溶出緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、最終的な溶出体積約１５μＬ）１７μＬを用いて溶出した。

【0161】

１０×ＲｅｐｌｉＰＨＩ緩衝液を５μＬ、２５ｍＭのｄＮＴＰを２μＬ、１００ｍＭのＤＴＴを２μＬ、１００Ｕ／μＬのＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９を１μＬ、および水（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ＲＨ０４０２１０）を２５μＬ、カラムから溶出した試料１５μＬに添加し、反応総体積を５０μＬにした。反応混合物を３０℃で２時間インキュベートした。ＲＣＡ産物を、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）８０μＬを添加することによって精製した。洗浄ステップは製造業者の説明書に従った。溶出緩衝液２２．５μＬ中、６５℃で５分インキュベートした後、ＲＣＡ産物を溶出させた。チューブを手短に遠心分離した後、磁石に戻した。

【0162】

ＲＣＡ反応から溶出した産物約２０μＬを、２×Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｍ０５３１Ｓ）２５μＬ、水２．５μＬ、ＤＭＳＯ ２．５μＬ、およびＢ２Ｂプライマーミックス（各１０μＭ）０．５μＬと混合した。以下のサーモサイクリングプログラムを用いて増幅を実施した：９５℃で２分、５サイクルの伸長（９５℃で３０秒、５５℃で１５秒、７２℃で１分）、１８サイクルの複製（９５℃で１５秒、６８℃で１５秒、７２℃で１分）、および７２℃で７分の最終的な伸長。ＰＣＲ産物サイズを電気泳動によって確認した。長いＰＣＲ産物が電気泳動によって確認されたら、ＰＣＲ産物を、精製して＞５００ｂｐのＰＣＲ産物を富化するためにＡｍｐｕｒｅビーズ（０．６×体積）３０μＬと混合した。精製された産物を、Ｑｕｂｉｔ ２．０ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いて数量化した。精製されたＤＮＡ約１ｎｇをＮｅｘｔｅｒａ ＸＴアンプリコンライブラリー調製のために使用した（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＣ−１３１−１０２４）。挿入断片サイズが＞５００ｂｐであるライブラリー要素を、０．６×Ａｍｐｕｒｅビーズを用いて精製することによって富化した。

【0163】

増幅されたライブラリーの濃度およびサイズ分布を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に対してＡｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｋｉｔを使用して解析した。配列決定を、２〜２５０ｂｐ ＭｉＳｅｑ配列決定キットを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用して実施した。ＭｉＳｅｑマニュアルに従って、変性ライブラリー１２ｐＭを配列決定実行にローディングした。

【0164】

この手順の変形では、ライブラリー調製においてＮｅｘｔｅｒａ調製物の代わりにＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを使用した。これを行うために、同様に精製したＤＮＡ約１ｎｇを、Ｂ２Ｂプライマーのユニバーサル部分およびＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を含有するプライマー対（Ｐ５およびＰ７；５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ３’および５’ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ３’）を用いたＰＣＲ増幅に対して使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、１２サイクルの複製ステップ（９５℃で３０秒、５５℃で１５秒、７２℃で６０秒）を実施した。この増幅ステップの目的は、アンプリコン配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを付加することであった。長さが＞５００ｂｐのアンプリコンを、０．６×Ａｍｐｕｒｅビーズを用いて富化した。アンプリコンライブラリーの濃度およびサイズ分布を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に対してＡｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｋｉｔを使用して解析した。配列決定を、２×２５０ｂｐ ＭｉＳｅｑ配列決定キットを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用して実施した。Ｂ２Ｂプライマーのユニバーサル部分も配列決定プライマー配列としての機能を果たし、Ｉｌｌｕｍｉｎａキットにプライマーが含有されない場合にはカスタム配列決定プライマーを添加した。変性ライブラリー１２ｐＭを配列決定実行にローディングした。

【0165】

１つの例の分析における標的領域カバレッジを図３３において説明する。以下の表３には標的領域の分析結果が記載されている。

【0166】

表１は、本開示の方法において有用なＲＣＡプライマーの例を提供する。表２は、本開示の方法において有用なＢ２Ｂプライマーの例を提供する。

【表1-1】

【表1-2】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表3】

（実施例３）
配列決定ライブラリー構築のためのゲノムＤＮＡの断片化

【0167】

ゲノムＤＮＡ１μＬを、ＮＥＢＮｅｘｔ ｄｓＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し、製造業者のプロトコールに従って処理した。インキュベート時間を３７℃で４５分に延長した。０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、５μＬを添加することによって断片化反応を停止させ、２×体積のＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８１）を製造業者のプロトコールに従って添加することによって精製した。ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおいてＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて断片化ＤＮＡを解析した。断片化ＤＮＡのサイズ範囲は、一般には、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐであり、ピークは約１５０ｂｐであった。
（実施例４）
ライブラリー調製手順

【0168】

本実施例では、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＫＫ８２３０）を例示のために使用した。

【0169】

ビーズ精製を伴うステップに関しては、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（ｃａｔ＃Ａ６３８８１）を室温まで平衡化し、徹底的に再懸濁させた後に試料と混合した。ボルテックスミキサーで試料と徹底的に混合した後、室温で１５分インキュベートして、ＤＮＡをビーズに結合させた。次いで、ビーズを液体が透明になるまで磁気台の上に置いた。次いで、ビーズを８０％エタノール２００μｌで２回洗浄し、室温で１５分乾燥させた。

【0170】

末端修復反応を実施するために、最大５０μＬ（２〜１０ｎｇ）の無細胞ＤＮＡを末端修復マスターミックス（水８μＬ、１０×ＫＡＰＡ末端修復緩衝液７μＬ、およびＫＡＰＡ末端修復酵素ミックス５μＬ）２０μＬと混合し、２０℃で３０分インキュベートした。次いで、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ１２０μＬを末端修復反応物７０μＬに添加した。次いで、試料を上記の通り精製した。

【0171】

Ａ尾部付加反応を実施するために、末端修復したＤＮＡ断片を含有する乾燥ビーズを、Ａ尾部付加マスターミックス（水４２μＬ、１０×ＫＡＰＡ Ａ尾部付加緩衝液５μＬ、およびＫＡＰＡ Ａ尾部付加酵素）と混合した。反応物を３０℃で３０分インキュベートした。ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、２．５ＭのＮａＣｌ）９０μＬを添加した後、混合物を上記のビーズ精製プロトコールに従って洗浄した。平滑末端ライゲーション反応に関してはこのＡ尾部付加ステップを飛ばした。

【0172】

リンカーライゲーションのために、以下の配列（５’から３’へ）を有する２種のオリゴを使用して、アダプターポリヌクレオチド二重鎖：／５Ｐｈｏｓ／ＣＣＡＴＴＴＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＴＡＧＡＴ＊Ｔおよび／５Ｐｈｏｓ／ＡＴＣＴＡＴＧＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧ＊Ｔを形成した。末端修復した（平滑末端ライゲーション用）またはａ尾部付加した（リンカーに基づくライゲーション用）を含有する乾燥ビーズを、ライゲーションマスターミックス（水３０μＬ、５×ＫＡＰＡライゲーション緩衝液１０μＬ、およびＫＡＰＡ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ５μＬ）４５μＬ、および水５μＬ（平滑末端ライゲーション用）またはリンカーオリゴヌクレオチドの同等モル濃度ミックス５μＬ（リンカーに基づくライゲーション）と混合した。ビーズを徹底的に再懸濁させ、２０℃で１５分インキュベートした。ＰＥＧ溶液（上記を参照されたい）５０μＬを添加した後、混合物を上記のビーズ精製プロトコールに従って洗浄した。

【0173】

Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｇｅｎｏｍｉｐｈｉ Ｖ２ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓを使用して多置換増幅（ＭＤＡ）を実施した。ライゲーションした断片鎖を含有する乾燥ビーズをランダムな六量体を含有する緩衝液９μＬに再懸濁させ、９５℃で３分加熱し、その後、氷上で急速に冷却した。酵素ミックス１μＬを添加した後、冷却した試料を３０℃で９０分インキュベートした。次いで、６５℃で１０分加熱することによって反応を停止させた。ＰＥＧ溶液（上記を参照されたい）３０μＬを添加した後、混合物を上記の精製プロトコールに従って洗浄し、ＴＥ２００μＬに再懸濁させた（６５℃で５分のインキュベーションを伴って）。所望であれば、精製された産物を、定量的ＰＣＲ、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて定量化すること、または次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を提案することができる。

【0174】

ＭＤＡ後、長いライゲーションした断片鎖（例えば、＞２ｋｂ）を、総体積１３０μＬでＣｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０を使用して超音波処理して約３００ｂｐにした。製造業者のプロトコールによりピーク電力１４０Ｗ、デューティ比１０％、バースト当たり２００サイクル、および処理時間８０秒が指示された。インタクトな元の無細胞ＤＮＡ断片が維持される可能性を上昇させるために約３００ｂｐの断片長を選択した。配列決定するために、所望であれば超音波処理したＤＮＡ断片にアダプターを付加するために、標準のライブラリー調製プロトコールを使用することができる。種々のリード組成物をＩｌｌｕｍｉｎａシークエンサー（ＨｉＳｅｑまたはＭｉＳｅｑのいずれか）での対末端配列決定実行から戻した。接合部（自己接合部、またはアダプターをライゲーションステップに含めた場合ではアダプター接合部）がリードの内側にあるもの（５’および３’に非アダプター配列が隣接する）を使用して目的の配列をバーコード処理した。
（実施例５）
環状化および増幅

【0175】

これにより、環状化および増幅手順（「Ｎｅｂｕｌａ」手順とも称される）の例示的な説明がもたらされる。この手順では、以下の供給材料を使用した：ＰＣＲ Ｍａｃｈｉｎｅ（例えば、ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）；Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ ＩＩ、ｓｓＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ｃａｔ＃ＣＬ９０２５Ｋ；Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（例えば、ＥｘｏＩ、ＮＥＢ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔ＃Ｍ０２９３Ｓ；ＥｘｏＩＩＩ、ＮＥＢ ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔ＃Ｍ０２０６Ｓ）；Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＮＥＢ Ｂｉｏｌａｂ ｃａｔ＃Ｍ０２０１Ｓ）；Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｉｌｌｕｓｔｒａ、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ、Ｇｅｎｏｍｉｐｈｉ、Ｖ３ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）；ＧｌｙｃｏＢｌｕｅ（例えば、Ａｍｂｉｏｎ ｃａｔ＃ＡＭ９５１５）；Ｍｉｃｒｏ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｒｏｆ ５４１５Ｄ）；ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｅａｄｓ（例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ｃａｔ＃Ａ６３８８１）；Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔａｎｄ（例えば、Ｔｈｅ ＭａｇｎａＲａｃｋ（商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ＃ＣＳ１５０００）；Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃Ｑ３２８６６）；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ ｄｓ ＤＮＡ ＨＳ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ＃０３２８５４）；およびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００）、およびｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ｃａｔ＃５０６７−４６２６）。

【0176】

５’末端リン酸を欠くＤＮＡ断片（例えば、無細胞ＤＮＡ）を増幅するために、第１のステップは末端修復および単一鎖の形成であった。ＤＮＡを９６℃で３０秒変性させた（例えば、ＰＣＲ機器において）。ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）反応を、ＤＮＡ４０μＬおよび１０×ＰＮＫ反応緩衝液５μＬと組み合わせ、その後、３７℃で３０分インキュベートすることによって調製した。１ｍＭのＡＴＰおよびＰＮＫ酵素を反応に添加し、３７℃で４５分インキュベートした。ＤＮＡを沈殿させ、再懸濁させることによって緩衝液の交換を行った。ＰＮＫ反応からのＤＮＡ５０μＬ、０．５Ｍ、ｐＨ５．２の酢酸ナトリウム５μＬ、ＧｌｙｃｏＢｌｕｅ１μＬ、オリゴ（１００ｎｇ／μＬ）１μＬ、および１００％エタノール１５０μＬを合わせた。混合物を−８０℃で３０分インキュベートし、１６ｋ ｒｐｍで５分遠心分離してＤＮＡをペレット化した。ＤＮＡペレットを７０％エタノール５００μＬで洗浄し、室温で５分風乾させ、ＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１２μＬに懸濁させた。

【0177】

次いで、再懸濁させたＤＮＡをライゲーションによって環状化した。ＤＮＡを９６℃で３０秒変性させ、試料を氷上で２分冷却し、リガーゼミックス（１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ緩衝液２μＬ、５Ｍのベタイン４μＬ、５０ｍＭのＭｎＣｌ_２、１μＬ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ、１μＬ）を添加した。ライゲーション反応物をＰＣＲ機器において６０℃で１６時間インキュベートした。ライゲーションしていないポリヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ消化によって分解した。このために、ＤＮＡを８０℃で４５秒変性させ、Ｅｘｏヌクレアーゼミックス（２０Ｕ／μＬのＥｘｏＩ：１００Ｕ／μＬのＥｘｏＩＩＩ＝１：２）１μＬを各チューブに添加した。これを５回ピペッティングすることによって混合し、手短に回転させた。消化ミックスを３７℃で４５分インキュベートした。水３０μＬを用いて体積を５０μＬにし、上記の通り沈殿および再懸濁させることにより、さらに緩衝液の交換を行った。

【0178】

全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を行うために、精製したＤＮＡをまず、６５℃で５分変性させた。ＧＥ ＷＧＡキットからの変性緩衝液１０μＬを、精製したＤＮＡ１０μＬに添加した。ＤＮＡを冷却ブロックまたは氷上で２分冷却した。ＤＮＡ２０μＬをＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ３ ｃａｋｅ（ＷＧＡ）に添加した。ＷＧＡ反応物を３０℃で１．５時間インキュベートし、その後、６５℃で１０分熱不活化した。

【0179】

試料を、ＡｍｐｕｒｅＸＰ磁気ビーズ（１．６×）を使用して精製した。ビーズをボルテックスし、８０μＬを１．５ｍＬのチューブに分注した。次いで、水３０μＬ、増幅されたＤＮＡ２０μＬ、およびビーズ８０μＬを合わせ、室温で３分インキュベートした。チューブを磁気台に２分置き、透明な溶液をピペットで取り出した。ビーズを８０％エタノールで２回洗浄した。１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０を２００μＬ添加することによってＤＮＡを溶出させた。ＤＮＡビーズ混合物を６５℃で５分インキュベートした。チューブを磁気台に戻して２分置いた。ＤＮＡ１９５μＬを新しいチューブに移した。１μＬをＱｕｂｉｔによる数量化のために使用した。最後に、ＷＧＡ産物１３０μＬを、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０を使用して超音波処理しておよそ４００ｂｐのサイズにした。
（実施例６）
追加的な精製を伴う環状化および増幅

【0180】

これにより、フェノールクロロホルム抽出ステップを伴う環状化および増幅手順（「Ｎｅｂｕｌａ」手順とも称される）の例示的な説明がもたらされる。

【0181】

ステップ１は、ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ反応のために競合ＲＮＡ（抽出物中の担体ＲＮＡから）および天然ＲＮＡ（同時精製された）の除去であった。ＲＮＡ分解酵素Ａ（１０ｍｇ／ｍｌ）（Ｑｉａｇｅｎ１００７８８５）１μｌをｃｆＤＮＡ（２〜１０ｎｇ）５０μｌに添加し、ＰＣＲ機器（ＭＪ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）において３７℃で３０分インキュベートすることによってＲＮＡを除去した。

【0182】

ステップ２は、塩およびエタノール沈殿を用いた緩衝液の交換であった。このステップは、ほぼ１００％の回収率を伴うライゲーションのためにインプットを浄化し、濃縮するのに有用であった（一方、カラムでは一般に３０％のみが回収される）。エタノール共沈殿剤ミックス（ＲＮＡ分解酵素処理からのＤＮＡ５０μＬ、０．５Ｍ、ｐＨ５．２の酢酸ナトリウム５μＬ、ＧｌｙｃｏＢｌｕｅ（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ９５１５）１μＬ、担体オリゴ（１００ｎｇ／μｌ）１μＬ、１００％エタノール１５０μＬ）を−８０℃で３０分インキュベートし、１６ｋ ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５Ｄ）で５分遠心分離してＤＮＡを沈殿させた。２０−ｍｅｒの非特異的担体オリゴ（我々はＰＣＲプライマーを使用した）を使用することにより、沈殿回収の収率および安定性がわずかに上昇した。ＤＮＡペレットを７０％エタノール５００μＬで洗浄した。ＤＮＡペレットを室温で５分風乾させ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１３μＬを用いて再懸濁させた。

【0183】

ステップ３は環状化であった。ｃｆＤＮＡ１２μＬを９６℃で３０秒変性させ、氷ブロック上で２分冷却した。ライゲーションミックス（ｃｆＤＮＡ１２μＬ、１０×Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ緩衝液２μＬ、５Ｍのベタイン４μＬ、５０ｍＭのＭｎＣｌ_２、１μＬ、Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ ＩＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ＃ＣＬ９０２５Ｋ）１μＬを冷却ブロック上にセットアップし、ライゲーションを６０℃で１６時間実施した。

【0184】

ステップ４は、エキソヌクレアーゼ消化であった。ライゲーションＤＮＡ混合物をＰＣＲ機器において８０℃で４５秒インキュベートし、その後、エキソヌクレアーゼ処理を行った。Ｅｘｏヌクレアーゼミックス（２０Ｕ／μＬのＥｘｏＩ：１００Ｕ／μＬのＥｘｏＩＩＩ＝１：２）１μＬを各チューブに添加し、反応物を３７℃で３０分インキュベートした。品質管理のために直鎖状の鋳型の除去は必要でなかった。

【0185】

ステップ５は、フェノールクロロホルム抽出ならびに塩およびエタノール沈殿を用いた緩衝液の交換であった。フェノール／エタノールは、８０％超のライゲーション効率を実現するために役立った（環状化産物の量はインプットポリヌクレオチドの量とほぼ等しかった）。１０ｍＭのＴｒｉｓ１８０μＬをエキソヌクレアーゼ処理からのＤＮＡ２０μＬに添加して体積を２００μＬにし、フェノール２００μＬを使用してＤＮＡを抽出した。水層を採取し、ＤＮＡをエタノール沈殿によって回収した。エタノール共沈殿剤ミックス（フェノール抽出後のＤＮＡ溶液２００μＬ、０．５Ｍ、ｐＨ５．２の酢酸ナトリウム２０μＬ、ＧｌｙｃｏＢｌｕｅ１μＬ、担体オリゴ（１００ｎｇ／μＬ）１μＬ、１００％エタノール６００μＬ）を−８０℃で３０分インキュベートし、１６ｋ ｒｐｍで５分遠心分離してＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡペレットを７０％エタノール５００μＬで洗浄した。ＤＮＡペレットを室温で５分風乾させ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１１μＬを用いて再懸濁させた。

【0186】

ステップ６は全ゲノム増幅であった。精製したＤＮＡ１０μＬを加熱ブロック上、６５℃で５分インキュベートし、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ、Ｇｅｎｏｍｉｐｈｉ、Ｖ３ ＤＮＡ増幅キットからの変性緩衝液１０μＬを添加した。ＤＮＡを室温で５分冷却した後、ＤＮＡ２０μＬをＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ３ ｃａｋｅ（ＷＧＡ）に供した。増幅反応物を３０℃で１．５時間インキュベートし、反応を６５℃で１０分熱不活化することによって終結させた。

【0187】

ステップ７は、ＡｍｐｕｒｅＸＰ磁気ビーズ（１．６×）を使用したビーズ精製であった。これは以前の実施例と同様に行った。

【0188】

ステップ８は以前の実施例と同様の超音波処理であった。次いで、定量的ＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、または配列決定ライブラリー構築に対するＤＮＡの準備ができた。
（実施例７）
ライゲーション効率およびオンターゲット率の分析

【0189】

上記の実施例と同様に環状化し、全ゲノム適用に供したｃｆＤＮＡを定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって分析した。試料標的についてのｑＰＣＲ増幅曲線の結果（ＫＲＡＳプライマーを使用）が図１８に示されている。図１８Ａに示されている通り、インプットｃｆＤＮＡの１／１０のｑＰＣＲ増幅により、３１．７５の平均Ｃｔ（サイクル閾値）がもたらされ、同じ試料のライゲーション産物の１／１０では３１．９２７の平均Ｃｔがもたらされ、これにより、約８８％の高いライゲーション効率が示される。ライゲーション効率は、約７０％もしくはそれ超、約８０％もしくはそれ超、約９０％もしくはそれ超、約９５％もしくはそれ超、またはそれ超、例えば、約１００％などにわたり得る。いくつかの例では、環状化されなかった直鎖状ＤＮＡを除去し、したがって、ほぼ全てのＤＮＡを環状形態から増幅することができる。各試料について、２連で３回実行した。図１８Ｂに示されている通り、ＷＧＡ産物１０ｎｇおよび参照ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（１２８７８、１０ｎｇ）の増幅曲線は、事実上、互いに重複した。ＷＧＡ試料についての平均Ｃｔは２６．６５５であったが、ｇＤＮＡ試料についての平均Ｃｔは２６．６０５であり、これにより、９６％を超える高いオンターゲット率が示される。所与の量の増幅されたＤＮＡ中のＫＲＡＳの数は、増幅されなかったｇＤＮＡと同等であり、これにより、増幅プロセスに偏りがないことが示される。各試料を２連で３回試験した。対比点として、Louら（PNAS、２０１３年、１１０巻（４９号））において提供される環状化プロトコールも試験した。上記の実施例の沈殿および精製ステップを欠くＬｏｕの方法を使用すると、直鎖状インプットＤＮＡの１０〜３０％のみが環状ＤＮＡに変換された。そのような低回収率により、下流の配列決定および変異体の検出に対する難題が提示される。
（実施例８）
ｄｄＰＣＲによる増幅された環状化ＤＮＡの分析

【0190】

ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して、環状化されたポリヌクレオチドから生じた全ゲノム増幅産物における対立遺伝子頻度の保存および偏りを評価した。一般に、ｄｄＰＣＲとは、ＰＣＲ増幅を支持する、別個の容積測定的に定義済みの油中水液滴分配に封入された核酸分子を計数することによって絶対的な分量を測定するデジタルＰＣＲアッセイを指す（Hinsonら、２０１１年、Anal. Chem. ８３巻：８６０４〜８６１０頁；Pinheiroら、２０１２年、Anal. Chem. ８４巻：１００３〜１０１１頁）。単一のｄｄＰＣＲ反応は、ウェル当たり少なくとも２０，０００の分配された液滴で構成されてよい。ドロップレットデジタルＰＣＲは、ＰＣＲ増幅を支持する、別個の容積測定的に定義済みの油中水液滴分配に封入された核酸分子を計数することによって絶対的な分量を測定するデジタルＰＣＲアッセイを実施する任意のプラットフォームを使用して実施することができる。ドロップレットデジタルＰＣＲの典型的な戦略は、以下の通り要約することができる：試料を希釈し、それぞれが目的の核酸分子のコピーを１つ含有するまたは含有しないように数千から数百万の別々の反応チャンバー（油中水液滴）に分配する。検出された、標的アンプリコン（すなわち、目的の核酸分子）を含有する「陽性」液滴の数と、標的アンプリコン（目的の核酸分子）を含有しない「陰性」液滴の数を使用して、元の試料に存在していた目的の核酸分子のコピーの数を決定することができる。ドロップレットデジタルＰＣＲシステムの例としては、核酸鋳型を含有する試料を２０，０００ナノリットルサイズの液滴に分配する、Ｂｉｏ−ＲａｄによるＱＸ１００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ；および核酸鋳型を含有する試料を１，０００，０００〜１０，０００，０００ピコリットルサイズの液滴に分配する、ＲａｉｎＤａｎｃｅによるＲａｉｎＤｒｏｐ（商標）ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。ｄｄＰＣＲに関する方法のさらなる例は、ＷＯ２０１３１８１２７６Ａ１において提供される。

【0191】

本実施例では、メラノーマ細胞株由来のＢＲＡＦ Ｖ６００ＥゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を参照ゲノムＤＮＡ １２８７８と特定の割合（０％、０．６７％、２．０％、６．６７％、２０％、または１００％）で混合し、断片化して、ｃｆＤＮＡに見いだされるものと類似したサイズ（この場合、約１５０ｂｐ）の断片を作製した。混合したＤＮＡ試料（１０ｎｇ）を環状化し、実施例２に従って増幅した。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅおよび野生型について、増幅されたＤＮＡ４０ｎｇをｄｄＰＣＲに供した。観察された突然変異対立遺伝子頻度は、図１９においてグラフによって説明され、表で示されている。示されている通り、増幅を伴う観察された突然変異対立遺伝子頻度（図１９の表の中央の行）は、インプット突然変異体対立遺伝子頻度（上の行）、ならびに増幅を伴わないゲノムＤＮＡ１００ｎｇからのｄｄＰＣＲ結果（下の行）を反映する。ｄｄＰＣＲアウトプットからの対立遺伝子頻度を、液滴を含有する突然変異体および野生型の両方の合計に対する、液滴を含有するＢＲＡＦ突然変異の数として算出する。増幅を伴うＤＮＡは白抜きの丸で示されており、増幅を伴わないＤＮＡは小さな黒塗りの丸で示されている。０．６７％における小さな偏差を例外として、２つのデータセットは完全に重複する。これにより、突然変異体対立遺伝子頻度の真の表示が実質的に偏りなく保存されることが実証される。
（実施例９）
バックグラウンドを超える配列変異体の検出

【0192】

超音波処理したｇＤＮＡ（１５０ｂｐ、Ｍｕｌｔｉ−Ｇｅｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ参照ＤＮＡ、Ｈｏｒｉｚｏｎ）１０ｎｇを実施例２に記載の通り環状化し、増幅し、その後、超音波処理を行った。次いで、断片化ＤＮＡをＲｕｂｉｃｏｎ配列決定ライブラリー構築に供した。捕捉配列決定後、参照ホットスポットから５０ｂｐ以内の変異体をプロットした。変異体のコールに、異なる接合部によって区別される２つの異なるポリヌクレオチドの検出を要求した場合の変異体の検出の結果が図２０に示されている。７つの予測される参照ホットスポット（ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｓ、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ）が０位にプロットされている。２つの他の変異体も確認され、図２０では白抜きの三角形およびダイヤモンドとして説明されている。

【0193】

比較のために、ｇＤＮＡを、上記の通りであるが、超音波処理したｇＤＮＡ１０ｎｇを一般的な慣習に従ってＲｕｂｉｃｏｎ配列決定ライブラリー構築に直接供し、環状化を伴わず、２つの異なるポリヌクレオチドに対する配列変異体の確認を要求せずに、超音波処理した。捕捉配列決定後、参照ホットスポットから５０ｂｐ以内の変異体を再度プロットし、結果が図２１に示されている。７つの予測される参照ホットスポット（ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ、ＥＧＦＲ Ｇ７１９Ｓ、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ）が０位にプロットされている。他の位置の変異体は予測されず、配列決定誤差に起因する可能性が最も高い。図２０の作成に使用した方法の結果と対照すると、図２１の結果により、標準の配列決定方法のランダムな誤差率がはるかに高く、それにより、対立遺伝子頻度が低い（例えば、５％未満など）場合に真の突然変異シグナルが遮蔽される可能性があることが示される。

【0194】

２つの異なるポリヌクレオチドの検出を要求して、および要求せずに、配列決定方法によって検出された感度およびバックグラウンドノイズの別々の分析の結果が図１６〜１７において説明されている。これらの図により説明される通り、検証の要求により、バックグラウンドノイズが著しく低下し、感度が上昇する。
（実施例１０）
ＧＣ組成およびサイズ分布の分析

【0195】

超音波処理したｇＤＮＡ（１５０ｂｐ、Ｍｕｌｔｉ−Ｇｅｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ参照ＤＮＡ、Ｈｏｒｉｚｏｎ）１０ｎｇを実施例５と同様に増幅、環状化および増幅し、配列決定し、変異体コール２ポリヌクレオチド検証フィルターを用いて分析した（左側）。図２２に示されている通り、様々なＣＧ百分率を有する配列の数を表にし、グラフにプロットした。左端のプロットに示されている通り、実施例５に従って調製した試料の配列は、中心ピーク（基礎をなすゲノムの全ＧＣ含量に対応する）以外は大部分が理論的分布と類似している。対照的に、同じ量のｇＤＮＡを、Ｒｕｂｉｃｏｎ配列決定ライブラリー構築キットを使用した増幅を伴わずに配列決定ライブラリーを構築するために直接使用した場合、配列決定結果と理論的分布の差異は、非常に明らかである（中央のプロットを参照されたい）。この直接Ｒｕｂｉｃｏｎ配列決定の中心ピークは理論的分布よりも大きい。Newmanら（２０１４年；Nature Medicine、（２０巻）：５４８〜５４頁）は、ｃｆＤＮＡ３２ｎｇを使用した場合、ｃｆＤＮＡ配列決定ＧＣ含量分布は理論的分布と同様であったことを報告した。これは、右端のプロットにおいて説明されている。

【0196】

実施例５と同様に環状化し、増幅し、配列決定したｃｆＤＮＡについて、ＤＮＡサイズ分布を評価した。図２３に示されている通り、配列決定結果によって示される断片の長さの分布のピークは約１５０〜１８０ｂｐにおいてであり、これは、ｃｆＤＮＡの典型的な分布パターンと類似している。
（実施例１１）
増幅均一性の評価

【0197】

実施例５に従って環状化し増幅した産物１０種のｑＰＣＲ結果を、増幅しなかった参照ＤＮＡ（１２８７８細胞株由来のｇＤＮＡ、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）と比較した。ゲノム参照ＤＮＡまたは増幅産物１０ｎｇを各リアルタイムｑＰＣＲ反応のために使用し、ゲノム参照に対する増幅産物の相対的な数量化によって比を生じさせた。図２４に示されている通り、各ＰＣＲの比は２倍の変化の範囲内であり、これにより、増幅されたＤＮＡプール内のこれらの標的のコピー数が増幅しなかった参照ＤＮＡと非常に類似していることが示唆される。６遺伝子（ＢＲＡＦ、ｃＫＩＴ、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＩ３ＫＣＡ）からＰＣＲプライマー１０対を設計し、予め検証した。
（実施例１２）
ＤＮＡ断片の増幅収率の数量化

【0198】

ｃｆＤＮＡを患者４名（患者１〜４）および健康な対照１名から単離した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ、Ｍｕｌｔｉ−Ｇｅｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｈｏｒｉｚｏｎ）を超音波処理し、およそ１５０ｂｐの断片にした。ＤＮＡを環状化し、ランダムプライマーを用いて増幅した。表７は、増幅反応へのＤＮＡインプットの量、および増幅によって生成するＤＮＡの量を示す。最小の試料（０．４ｎｇ）でさえ有意な増幅が得られ、全ての試料が少なくとも６００倍に増幅した。

【表7】

（実施例１３）
がん患者のｃｆＤＮＡからの低頻度突然変異の検出

【0199】

ステップ１では、ｃｆＤＮＡを環状化した。環ライゲーションミックスを室温でＰＣＲチューブ中に調製した。４ｎｇ〜１０ｎｇのｃｆＤＮＡを、ピペットで体積１２μｌを取りＰＣＲチューブ中に入れた。ＤＮＡを９６℃で３０秒変性させ、次いで、ＰＣＲチューブを氷上で２分冷却した。ライゲーションミックス（１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ緩衝液２μｌ、５Ｍのベタイン４μｌ、５０ｍＭのＭｎＣｌ２、１μｌ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ、１μｌ）を各チューブに添加し、ＰＣＲ機器において反応を６０℃で１６時間進行させた。

【0200】

ステップ２では、ライゲーション反応物を処理してライゲーションしていない直鎖状ＤＮＡを除去した。エキソヌクレアーゼミックス（ＮＥＢ Ｍ０２０６Ｓ、Ｍ０２９３Ｓ；２０ｕ／μｌのＥｘｏＩ：１００ｕ／μｌのＥｘｏＩＩＩ＝１：２）１μｌを各チューブに添加し、混合し、ＰＣＲ機器において３７℃で３０分インキュベートした。

【0201】

ステップ３では、緩衝液の交換に関してライゲーション反応物を精製した。ライゲーション産物をＯｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製した。エキソヌクレアーゼ処理後、結合ミックス（１０ｍＭのＴｒｉｓ、３０μｌ、オリゴ結合緩衝液１００μｌ、１００％エタノール４００μｌ）をライゲーション反応物に添加し、混合し、手短に遠心沈殿させた。Ｚｙｍｏ−スピンカラムをローディングし、１０，０００×ｇ超で３０秒回転させた。カラムをＤＮＡ洗浄緩衝液７５０μｌで洗浄し、１４，０００×ｇで１分遠心分離した。１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５μｌを用い、１０，０００×ｇ超で３０秒遠心分離することによってＤＮＡを溶出した。

【0202】

ステップ４では、ＤＮＡをランダムプライミングによって増幅した。全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｇｅｎｏｍｉｐｈｉ Ｖ３ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。精製されたライゲーション物１０μｌを２×変性緩衝液１０μｌと混合し、９５℃で３分インキュベートし、次いで、氷上で４℃まで冷却した。変性ＤＮＡ２０μｌをＷＧＡプレミックスに添加し、試料を３０℃で１．５時間インキュベートし、その後、６５℃で１０分不活化した。

【0203】

ステップ５では、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１．６×）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して増幅産物を浄化した。１０ｍＭのＴｒｉｓ、３０μｌおよびＡＭｐｕｒｅビーズ８０μｌをＷＧＡ反応物２０μｌに添加した。混合物を室温で２分インキュベートした。チューブを磁石台に置き、２分インキュベートした。上清を取り出し、廃棄した。試料をエタノール（８０％）２００μｌで２回洗浄し、５分風乾させ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、２００μｌを用いてＤＮＡを溶出した。

【0204】

ステップ６では、ＷＧＡ ＤＮＡを断片化した。ＷＧＡ産物１３０μｌを、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０ ｓｏｎｉｃａｔｏｒを使用して超音波処理して、およそ４００ｂｐの断片サイズを得た。Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０の設定は以下の通りであった：ピーク入射電力＝１４０Ｗ、デューティ比＝１０％、バースト当たりのサイクル＝２００、処理時間＝５５秒。

【0205】

ステップ７では、試料をｑＰＣＲによって数量化した。ライゲーション効率を測定するために、ライゲーションインプットの１／１０およびライゲーション産物をｑＰＣＲ反応のために使用し、３つの反復を伴った。断片化されたＷＧＡ産物１０ｎｇを、参照ｇＤＮＡ（１２８７８細胞株）１０ｎｇと共に、ｑＰＣＲのために使用して、オンターゲット率を測定した。反応物は、２×マスターミックス（ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（２×）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｅｖａｇｒｅｅｎ ｄｙｅ、Ｂｉｏｔｉｕｍ）５μｌ、プライマー（５μＭ）０．５μｌ、Ｈ_２Ｏ、１．２μｌ、ＤＮＡ１０μｌを含んだ。以下のプログラムに従って増幅を進行させた：９５℃で２分；および［９５℃で１０秒；６０℃で２０秒］を４０サイクル。

【0206】

ステップ８では、配列決定ライブラリーを構築した。超音波処理した増幅されたＤＮＡ５００〜１０００ｎｇから、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＫＫ８５００）またはＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＫＫ８２００）を使用して配列決定ライブラリーを調製した。アダプターライゲーション（１ｕＭのアダプター最終濃度）を製造業者のプロトコールに従って調製した。ライゲーション産物のアダプターライゲーションした洗浄物、２０％ＰＥＧ８０００／２．５ＭのＮａＣｌ溶液３０μｌ（０．３×）を再懸濁させたライゲーション産物１００μｌに添加した。ビーズをライゲーション産物と徹底的に混合し、室温で１５分インキュベートした。次いで、液体が透明になるまでビーズを磁石上に捕捉した。次いで、上清１３０μｌを、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズを使用したサイズ選択に供した。試料を新しいプレートに移し、その後、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（０．５×）２０μｌを添加した。ライゲーション産物をすぐにビーズに捕捉し、８０％エタノール２００μｌで２回洗浄した。次いで、ライゲーション産物をＥＢ緩衝液２０μｌ中に再懸濁させ、溶出した。サイズ選択および精製後、ライゲーション産物２０μｌを２×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ｒｅａｄｙ ｍｉｘ、２５μｌおよび１０μＭのＰ５＋Ｐ７プライマー（５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ３’、５’ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ３’）５μｌに添加し、以下のサイクリングプログラムを使用してライブラリーを増幅した：９８℃で４５秒；（９８℃で１５秒；６０℃で３０秒；７２℃で３０秒）を５サイクル；７２℃で６０秒。増幅されたライブラリーを２０×に希釈した後、定量化のために断片分析機器またはバイオアナライザー（高感度チップ）にローディングした。ゲルサイズ選択機（Ｓａｇｅ ＳｃｉｅｎｃｅからのＢｌｕｅ Ｐｉｐｐｉｎ ｐｒｅｐ）によってさらなるサイズ選択を行った。

【0207】

ステップ９では、配列決定ライブラリーを、ｘＧＥＮ Ｐａｎ−Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌ ｖ１．５、１２７９０８５９７（ＩＤＴ）からのプローブを使用したプローブ捕捉富化によって富化した。ステップ１０では、ライブラリーをＨｉＳｅｑ２５００において、平均深さ１０００×で配列決定した。

【0208】

ステップ１１では、配列決定データを解析して変異体コールを行った。変異体コールは、２つの異なるポリヌクレオチド（例えば、異なる接合部によって同定）において生じている配列の差異を変異体として計数することを要求するステップを含んだ。いくつかの体細胞突然変異が検出され、それらはまた、公共のデータベース（ＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ））に報告された。同定された突然変異としては、０．０５％対立遺伝子頻度を有するＢＲＡＦ Ｖ６００Ｍがあり、これにより、インプットが少ない場合であってもこのシステムが高感度であることが実証される。様々な突然変異の検出の結果を、それらの試料における頻度を含め、表８に示す。

【表8】

（実施例１４）
ＦＦＰＥ試料由来のマルチプレックス参照ＤＮＡからの正確な突然変異の検出

【0209】

試料Ｈｏｒｉｚｏｎ ＦＦＰＥ−マルチプレックス（ＨＤ２００）から、製造業者のプロトコール（Ｃｏｖａｒｉｓ ｔｒｕＸＴＲＡＣ（商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔ）に従ってＤＮＡを抽出した。ＦＦＰＥ ｇＤＮＡ１３０μｌを、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０ ｓｏｎｉｃａｔｏｒを使用して超音波処理して、およそ１５０ｂｐの断片サイズを得た（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０の設定：ピーク入射電力＝１７５Ｗ、デューティ比＝１０％、バースト当たりのサイクル＝２００、処理時間＝４３０秒）。１１μｌ体積のＤＮＡ５０ｎｇを９５℃で３０秒変性させた。Ｈ_２Ｏ、１０．５μｌ、リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ Ｂ０２０２Ｓ）２．５μｌ、およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＮＥＢ Ｍ０２０１Ｓ）１μｌを添加した。リン酸化のために反応物を３７℃で３０分インキュベートした。

【0210】

試料をライゲーションし、次いで、Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製した。エキソヌクレアーゼ処理後に結合ミックス（１０ｍＭのＴｒｉｓ、３０μｌ、オリゴ結合緩衝液１００μｌ、１００％エタノール４００μｌ）をライゲーション反応物に添加し、ボルテックスによって混合し、手短に回転させた。試料をＺｙｍｏ−スピンカラムにローディングし、１０，０００×ｇ超で３０秒回転させた。カラムをＤＮＡ洗浄緩衝液７５０μｌで洗浄し、１４，０００×ｇで１分遠心分離した。１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５μｌを用い、１０，０００×ｇ超で３０秒遠心分離することによってＤＮＡを溶出した。

【0211】

試料を実施例１３におけるステップ５〜１１に従ってさらに処理し、分析した。結果を表９に要約する。Ｈｏｒｉｚｏｎ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ＤＮＡにおける９つの突然変異の表示はこのプロセスによってほぼ保持されたが、ＤＮＡの数量は少なくとも６００倍に増加した。

【表9】

（実施例１５）
がん突然変異細胞株ｇＤＮＡ多量体からの低頻度突然変異の検出

【0212】

本実施例では、超音波処理したゲノムＤＮＡをライゲーションして多量体を形成し、次いで、それを増幅、断片化、および分析に供した。図２５は、このプロセスの例を説明する。

【0213】

ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異を含有するメラノーマ細胞株ＳＫ−−ｍｅｌ−２８（ＡＴＣＣ）由来のｇＤＮＡを参照ｇＤＮＡ（１２８７８ Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）と混合して、１％ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅを実現した。ＤＮＡを実施例１４と同様に超音波処理して、およそ１５０ｂｐの断片サイズを得た。１１μｌ体積のＤＮＡ１００ｎｇを９５℃で３０秒変性させ、Ｈ_２Ｏ、１０．５μｌ、リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ Ｂ０２０２Ｓ）２．５μｌ、およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＮＥＢ Ｍ０２０１Ｓ）１μｌを添加し、その後、３７℃で３０分インキュベートしてＤＮＡをリン酸化した。

【0214】

Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて試料を精製した。これは、エキソヌクレアーゼ処理後に結合ミックス（１０ｍＭのＴｒｉｓ、２５μｌ、オリゴ結合緩衝液１００μｌ、１００％エタノール４００μｌ）をライゲーション反応に添加することを含んだ。これをボルテックスによって混合し、手短に回転させた。Ｚｙｍｏ−スピンカラムをローディングし、１０，０００×ｇ超で３０秒回転させ、ＤＮＡ洗浄緩衝液７５０μｌで洗浄し、１４，０００×ｇで１分遠心分離した。１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５μｌを用い、１０，０００×ｇ超で３０秒遠心分離することによってＤＮＡを溶出した。

【0215】

ライゲーションするために、４μｌ体積のＤＮＡ６ｎｇを１０×末端修復緩衝液（Ｅｎｙｚｙｍａｔｉｃｓ）０．４５μｌ、２５ｍＭのｄＮＴＰ、０．０５μｌ、１０ｍＭのＡＴＰ、０．５μｌ、Ｅｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｅｎｙｚｙｍａｔｉｃｓ）、および２０００単位／μｌのＴ４リガーゼと混合した。反応物を２５℃で３０分、その後、７５℃で２０分インキュベートした。

【0216】

全ゲノム増幅を、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｇｅｎｏｍｉｐｈｉ Ｖ３ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。Ｈ_２Ｏ、８μｌおよび精製されたライゲーション物１０μｌを、２×変性緩衝液１０μｌと混合した。ＤＮＡを９５℃で３分変性させ、次いで、氷上で４℃まで冷却した。変性ＤＮＡ２０μｌをＷＧＡプレミックスに添加し、３０℃で１．５時間インキュベートし、その後、６５℃で１０分不活化した。

【0217】

次いで、増幅反応物を、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１．６×）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して浄化した。１０ｍＭのＴｒｉｓ、３０μｌおよびＡＭｐｕｒｅビーズ８０μｌをＷＧＡ反応物２０μｌに添加した。これを室温で２分インキュベートした。チューブを磁石台に置き、２分インキュベートした。上清を取り出し、廃棄した。ビーズをエタノール（８０％）２００μｌで２回洗浄し、次いで、５分風乾させた。１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、２００μｌを用いてＤＮＡを溶出した。次いで、ＷＧＡ産物１３０μｌを、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０ ｓｏｎｉｃａｔｏｒを使用して断片化して、およそ４００ｂｐの断片サイズを得た（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０の設定：ピーク入射電力＝１４０Ｗ、デューティ比＝１０％、バースト当たりのサイクル＝２００、処理時間＝５５秒）。

【0218】

ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｉｍｅ ＰＣＲ ｄｄＰＣＲ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙを使用したｄｄＰＣＲによって突然変異を検出した。突然変異−検出ｄｄＰＣＲ反応物は、室温でＰＣＲチューブ中に集合させた（増幅されたＤＮＡ８０ｎｇ、プローブ用の２×ｄｄＰＣＲスーパーミックス１０μｌ、２０×標的（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＢｉｏＲａｄ）プライマー（９μＭ）／プローブ（ＦＡＭ；５μＭ）１μｌ、２０×野生型プライマー（９μＭ）／プローブ（ＨＥＸ；５μＭ）１μｌ、ＤＮＡ試料（５０ｎｇ）８μｌ。反応物を５回ピペッティングすることによって混合し、次いで、液滴発生剤カートリッジに移した。ＱＸ２００液滴発生剤を使用して液滴を生じさせ、９６ウェルのＰＣＲプレートに移し、以下のＰＣＲプログラムを使用して増幅した：９５℃で１０分；［９４℃で３０秒、５５℃で１分］を４０サイクル；９８℃で１０分。ＰＣＲ反応プレートをＱＸ２００液滴リーダーに移して結果を数量化した。インプットＤＮＡに基づいて、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異の予測される頻度は１％であった。このライゲーションおよび増幅手順により、この頻度はほぼ維持されたが（ｄｄＰＣＲ分析に従って１．４１％）、ＤＮＡの数量は約２００倍に増加した。

【0219】

本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態が単に例として提供されていることは当業者には明白であろう。当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形、変化および置換をすぐに思いつくであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する種々の代替を、本発明の実施において使用することができることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲に入る方法および構造ならびにそれらの等価物がそれにより包含されることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]