特許 6437462 眼内透過性亢進の予防及び治療におけるＳＥＭＡ３Ａの阻害

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6437462

(24)【登録日】2018年11月22日

(45)【発行日】2018年12月12日

(54)【発明の名称】眼内透過性亢進の予防及び治療におけるＳＥＭＡ３Ａの阻害

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20181203BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20181203BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20181203BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20181203BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20181203BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K38/17ZNA

   A61K31/7105

   A61K48/00

   A61P27/02

【請求項の数】22

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2015-558315(P2015-558315)

(86)(22)【出願日】2014年2月21日

(65)【公表番号】特表2016-516003(P2016-516003A)

(43)【公表日】2016年6月2日

(86)【国際出願番号】CA2014050119

(87)【国際公開番号】WO2014127479

(87)【国際公開日】20140828

【審査請求日】2017年2月2日

(31)【優先権主張番号】61/767,419

(32)【優先日】2013年2月21日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515228759

【氏名又は名称】アールエスイーエム・リミテッド・パートナーシップ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】プジェミスラウ・サピェハ

【審査官】 横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０２７７４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 ARVO Annual Meeting Abstract, 2012 Mar, p.5780

【文献】 BLOOD, 2011, Vol.117 No.22, p.6024-6035

【文献】 J Biol Chem., 2002, Vol.277 No.51, p.49799-49807

【文献】 Development, 2007, Vol.134, p.1833-1843

【文献】 Acta Paediatrica, 2012, Vol.101, p.819-826

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ３１／７１０５

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ２７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストを含む、非増殖性黄斑浮腫の予防または治療における使用のための組成物であって、前記Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストが、
（ｉ）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体、
（ｉｉ）抗Ｎｒｐ−１抗体、
（ｉｉｉ）Ｓｅｍａ３ＡのアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、
（ｉｖ）Ｎｒｐ−１のアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、および／または
（ｖ）Ｓｅｍａ３Ａに結合し、配列番号２の残基２３〜６０９もしくは配列番号１３の残基２３〜２８０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチド
である、組成物。

【請求項2】

Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストを含む、網膜の病的な血管新生と診断されない対象における血液網膜関門の腫脹の予防または治療における使用のための組成物であって、前記Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストが、
（ｉ）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体、
（ｉｉ）抗Ｎｒｐ−１抗体、
（ｉｉｉ）Ｓｅｍａ３ＡのアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、
（ｉｖ）Ｎｒｐ−１のアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、および／または
（ｖ）Ｓｅｍａ３Ａに結合し、配列番号２の残基２３〜６０９もしくは配列番号１３の残基２３〜２８０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチド
である、組成物。

【請求項3】

前記黄斑浮腫が、非増殖性糖尿病黄斑浮腫である、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

前記Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストが、Ｎｒｐ−１へのＶＥＧＦ結合を減少させない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

前記アンタゴニストが、Ｓｅｍａ３ＡのＮｒｐ−１結合ドメインに結合するＳｅｍａ３Ａ抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項6】

前記アンタゴニストが、Ｎｒｐ−１のａ１ａ２ドメインに結合するＮｒｐ−１抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項7】

前記Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストが、Ｓｅｍａ３Ａ ｓｈＲＮＡを保持するレンチウイルスベクターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項8】

前記ｓｈＲＮＡが、配列番号３、４、５または６に示される配列を含む、請求項７に記載の使用のための組成物。

【請求項9】

前記アンタゴニストが、Ｓｅｍａ３Ａに結合し、配列番号２の残基２３〜６０９または配列番号１３の残基２３〜２８０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項10】

前記可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチドが、Ｓｅｍａ３Ａに結合し、配列番号２の残基２３〜６０９または配列番号１３の残基２３〜２８０を含む、請求項９に記載の使用のための組成物。

【請求項11】

前記可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチドが、Ｓｅｍａ３Ａに結合し、配列番号２の残基２３〜４２８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の使用のための組成物。

【請求項12】

前記可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチドが、Ｓｅｍａ３Ａに結合し、配列番号２の残基２３〜４２８を含む、請求項１１に記載の使用のための組成物。

【請求項13】

前記アンタゴニストが、ＶＥＧＦに実質的に結合しない可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチドである、請求項９に記載の使用のための組成物。

【請求項14】

前記可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチドが、配列番号１３の残基２３〜２８０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９または１３に記載の使用のための組成物。

【請求項15】

前記Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストが、神経節細胞層（ＧＣＬ）または内顆粒層（ＩＮＬ）におけるニューロンを特異的に標的とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項16】

前記組成物が、眼内投与のためのものである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項17】

ａ）正常なレベルのＶＥＧＦを有する；ｂ）ＶＥＧＦ誘発前の初期糖尿病に罹患している；ｃ）周皮細胞の損失を患っていない；ｄ）網膜腫脹と診断されている；および／またはｅ）自覚症状がない、対象における使用のためのものである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項18】

非増殖性黄斑浮腫の予防または治療のための医薬の製造におけるＳｅｍａ３Ａアンタゴニストを含む組成物の使用であって、前記アンタゴニストが、
（ｉ）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体、
（ｉｉ）抗Ｎｒｐ−１抗体、
（ｉｉｉ）Ｓｅｍａ３ＡのアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、
（ｉｖ）Ｎｒｐ−１のアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、および／または
（ｖ）Ｓｅｍａ３Ａに結合し、配列番号２の残基２３〜６０９もしくは配列番号１３の残基２３〜２８０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチド
である、使用。

【請求項19】

網膜の病的な血管新生と診断されない対象における血液網膜関門の腫脹の予防または抑制のための医薬の製造におけるＳｅｍａ３Ａアンタゴニストを含む組成物の使用であって、前記アンタゴニストが、
（ｉ）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体、
（ｉｉ）抗Ｎｒｐ−１抗体、
（ｉｉｉ）Ｓｅｍａ３ＡのアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、
（ｉｖ）Ｎｒｐ−１のアンチセンスもしくはｓｈＲＮＡ、および／または
（ｖ）Ｓｅｍａ３Ａに結合し、配列番号２の残基２３〜６０９もしくは配列番号１３の残基２３〜２８０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチド
である、使用。

【請求項20】

前記浮腫が、非増殖性糖尿病黄斑浮腫である、請求項１８または１９に記載の使用。

【請求項21】

非増殖性黄斑浮腫の予防または治療のための医薬の製造における、請求項１、２および９〜１４のいずれか一項に規定される可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチドの使用。

【請求項22】

増殖性網膜症と診断されない対象における血液網膜関門の腫脹の予防または治療のための医薬の製造における、請求項１、２および９〜１４のいずれか一項に規定される可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチドの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１３年２月２１日に出願された米国仮出願第６１／７６７，４１９号の優先権を主張するものであり、当該出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、「１２８１０＿４９６＿ＳＴ２５」という名称で２０１４年２月２１日に作成された２２２キロバイトのサイズを有するコンピュータ読取り可能な形式の配列表を含み、当該配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本発明は、眼内血管透過性亢進に関する。より具体的には、本発明は、黄斑浮腫の予防または治療のためのＳＥＭＡ３Ａ経路の阻害に関係する。

【背景技術】

【0004】

糖尿病網膜症（ＤＲ）は、最も重要な糖尿病の合併症であり、生産年齢の個人における失明の主要な原因である^１，２。糖尿病網膜症は、低酸素状態の網膜が代謝平衡を回復しようとして展開する、代償性ではあるが、病的な過剰血管新生をもたらす初期の微小血管の変性を特徴とする^３−５。初期では自覚症状のない場合が多いが、主に糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、硝子体出血、進行段階では網膜前血管新生及び牽引性網膜剥離によって、失明が引き起こされる^６，７。これらのうち、糖尿病における中心視力喪失の主な原因はＤＭＥであり^８、糖尿病患者のうち２５％を超える患者がＤＭＥに罹患している。二次的には血液網膜関門（ＢＲＢ）の劣化を誘発し、結果として体液及び血漿成分の硝子体腔への溢出が上昇する。最終的に、網膜血管バリア機能の低下により、血管性浮腫及び病的な網膜の肥厚が生じる。

【0005】

一般に、糖尿病性網膜症には、ｉ）非増殖性網膜症（ＮＰＲ）、ｉｉ）黄斑浮腫、及びｉｉｉ）増殖性糖尿病網膜症の３つの段階がある。

【0006】

糖尿病網膜症の第１段階は、非増殖性網膜症または背景網膜症であり、多くの場合目立つ症状や徴候がないものの、網膜の腫脹がみられることがある。この段階は、網膜の微小血管が半透性膜になる段階である（後に、体液及び血液が漏出する）。糖尿病網膜症は、最初期では、自覚症状のないことが多い。これは、患者には痛みまたは視力喪失などの顕著な症状がないが、眼科専門医であれば疾患の徴候を認めることができるということを意味するものである。たとえば、眼科検査を通じてのみ発見可能な網膜腫脹が認められる。

【0007】

糖尿病網膜症の第２段階は、黄斑浮腫である。黄斑は、錐体光受容細胞の密度が高く、これにより、鮮明な直視を担う網膜の一部であり、網膜の後側に位置する。黄斑浮腫は、網膜内の黄斑領域における体液の貯留を指す（網膜下で体液が貯留する状態とは異なる）。病態生理学は主原因に左右されるが、通常、最終地点は血管の不安定化及び血液網膜関門の破綻であり、視力障害を招く。

【0008】

黄斑の中心部が膨化し始めると、視野がぼやけるようになる。この糖尿病網膜症の中期段階は、他の段階と重複する場合がある。この段階は、血液網膜関門が弱り、網膜内の毛細血管が体液を漏出することで、腫脹と視野のぼやけが生じる段階である。

【0009】

黄斑浮腫には、局所性とびまん性の２種類がある。局所性黄斑浮腫の場合、網膜の毛細血管に体液を漏出する微小動脈瘤が生じて、複数の認識可能な漏出点が出現する。びまん性黄斑浮腫は、網膜の毛細血管が膨化することで漏出が生じ、全領域にわたって漏出が広がるものである。この黄斑浮腫の種別は、糖尿病網膜症の治療の種類を決めることになる。黄斑浮腫の早期発見は、最も効果的な治療を確保するのに有用である。

【0010】

疾患が進行するに従って、軽微な視力障害が生じ得る。患者の目がまだ見える状態であっても、明瞭な視野を阻害する、ぼやけ及び暗点による障害に悩まされることがある。これらの糖尿病網膜症の症状は、場合によって、黄斑として知られている中心視力を制御する目の部分が腫脹する、黄斑浮腫につながる。

【0011】

損傷を受けた血管が破れ始めると、血液が眼内に漏出し得る。この糖尿病網膜症の第３段階は、増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）と呼ばれ、曇り及び視力障害を特徴とする。網膜の毛細血管が破裂すると、必要な栄養素を網膜に提供することができなくなる。栄養素の欠乏した網膜は、新しい毛細血管の成長を促す化学シグナルを発する。この成長が血管新生と呼ばれるものである。

【0012】

増殖性糖尿病網膜症の結果として形成される新しい血管は、眼により多くの損傷をきたす。これらの毛細血管は、壊れやすく、かつ弱いので、網膜への栄養素を回復することができない。また、破裂する傾向にあるため、血液及び体液が眼内に漏出する。新しい血管はさらに、周囲の構造及び結合組織に牽引作用を及ぼし、最終的に網膜を剥離させることがある。新しい毛細血管は、眼から体液を排出する管を塞ぐことがあるため、この結果、眼圧も同様に上昇する。この状態は、血管新生緑内障として知られている。増殖性糖尿病網膜症では、瘢痕組織の発現、網膜剥離及び失明が生じ得る。

【0013】

患者がいずれの予防処置または医療行為を受けることなく、疾患が増殖性糖尿病網膜症に進行した場合は、網膜剥離及び失明が生じ得る。現時点で、ＰＤＲは、米国における新しい失明症例の主要な原因である。網膜剥離、黄斑浮腫及び網膜内毛細血管の破裂はすべて、眼を通過する正常な血流を妨げ、完全な視力喪失につながる可能性がある。

【0014】

黄斑浮腫は、糖尿病の背景に限定されるものではない。血管の透過性亢進及び血液網膜関門の漏出は、多くの状況において起こり得る。黄斑浮腫で最も頻繁にみられる形態は、嚢胞様黄斑浮腫であり、ハチの巣状空間で囲まれた網膜内浮腫を特徴とする。ＣＭＥは、様々な外傷に対する一般的な病理的応答である（たとえば、眼内（白内障）外科手術後、網膜中心静脈閉塞及び網膜静脈分枝閉塞、眼の外傷後、脈絡膜腫瘍に関連するものまたは各種の網膜血管疾患もしくは網膜変性など）。ＣＭＥはまた、加齢黄斑変性症から生じ得る多くの状態の１つである。

【0015】

黄斑浮腫及び特にＤＲにおける破壊的な網膜前血管新生を司る機序の解明には多大な努力が払われてきたが^{６，９，１０}、網膜血管透過性を増加させる細胞過程についてはほとんどわかっていない。そのため、現在の標準治療では、無視できない副作用がある。こうした副作用には、コルチコステロイドの硝子体内使用に伴う、白内障発症及び眼圧の有害な上昇が挙げられる^９。同様に、抗ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）治療は、一般に高い安全性プロフィールを示すものであるが、血栓塞栓症の増加^１１、神経細胞毒性及び長期レジメンでの使用では地図状萎縮^{１２，１３}を伴う場合がある。さらに、最も広く使用されている最初に行われる治療形態は、増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）にも用いられる汎網膜光凝固術またはＤＭＥ向け局所／格子状レーザであるが、レーザ系光凝固法は、血管形成促進因子を分泌する低酸素性網膜組織を破壊し、意図せず、視野狭窄、中心暗点または傍中心暗点を招く。これらの治療上の限界は、新規の薬理学的な標的及び処置に対する必要性を強調するものである。

【0016】

本発明の説明は、多数の文献を参照する。これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｃ，Ｒａｈｉ Ｊ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ Ｊ，Ｆｏｓｔｅｒ Ａ．Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ ｉｎ ｍｉｄｄｌｅ−ｉｎｃｏｍｅ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ．Ｌａｎｃｅｔ．Ｊｕｌ ５ １９９７；３５０（９０７０）：１２−１４．

【非特許文献2】Ｋｅｍｐｅｎ ＪＨ，Ｏ’Ｃｏｌｍａｉｎ ＢＪ，Ｌｅｓｋｅ ＭＣ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ａｍｏｎｇ ａｄｕｌｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ａｐｒ ２００４；１２２（４）：５５２−５６３．

【非特許文献3】Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｓｍｉｔｈ Ｌ．Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍａｒ １９ ２００７；１０（２）：１３３−１４０．

【非特許文献4】Ｃｈｅｕｎｇ Ｎ．Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｍａｒ １ ２００８；２７（２）：１６１−１７６．

【非特許文献5】Ｓｍｉｔｈ ＬＥ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｅｙｅｓ ｏｆ ａ ｃｈｉｌｄ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＯＰ ｔｈｅ Ｆｒｉｅｄｅｎｗａｌｄ ｌｅｃｔｕｒｅ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．Ｄｅｃ ２００８；４９（１２）：５１７７−５１８２．

【非特許文献6】Ｗａｎｇ Ｓ，Ｐａｒｋ ＪＫ，Ｄｕｈ ＥＪ．Ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．Ｃｕｒｒ Ｄｉａｂ Ｒｅｐ．Ａｕｇ ２０１２；１２（４）：３５５−３６３．

【非特許文献7】Ａｎｔｏｎｅｔｔｉ ＤＡ，Ｋｌｅｉｎ Ｒ，Ｇａｒｄｎｅｒ ＴＷ．Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．Ｍａｒ ２９ ２０１２；３６６（１３）：１２２７−１２３９．

【非特許文献8】Ｍｏｓｓ ＳＥ，Ｋｌｅｉｎ Ｒ，Ｋｌｅｉｎ ＢＥ．Ｔｈｅ １４−ｙｅａｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｖｉｓｕａｌ ｌｏｓｓ ｉｎ ａ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．Ｊｕｎ １９９８；１０５（６）：９９８−１００３．

【非特許文献9】Ｓｉｌｖａ ＰＳ，Ｃａｖａｌｌｅｒａｎｏ ＪＤ，Ｓｕｎ ＪＫ，Ａｉｅｌｌｏ ＬＭ，Ａｉｅｌｌｏ ＬＰ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｏｎｓｅｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｓｅｐ ２０１０；６（９）：４９４−５０８．

【非特許文献10】Ｓｔａｈｌ Ａ，Ｃｏｎｎｏｒ ＫＭ，Ｓａｐｉｅｈａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｒｅｔｉｎａ ａｓ ａｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｍｏｄｅｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．Ｊｕｎ ２０１０；５１（６）：２８１３−２８２６．

【非特許文献11】Ｓｔｅｗａｒｔ ＭＷ．Ｔｈｅ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｃ．Ｊａｎ ２０１２；８７（１）：７７−８８．

【非特許文献12】Ｓａｐｉｅｈａ Ｐ，Ｈａｍｅｌ Ｄ，Ｓｈａｏ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ：ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈａｔ ｂｌｉｎｄｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｊａｎ ２０１０；４２（１）：５−１２．

【非特許文献13】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＧＳ，Ｊｕ Ｍ，Ｓｈｉｈ ＳＣ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｎｖａｓｃｕｌａｒ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦＲ−１，２ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｎｅｕｒａｌ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．Ｍａｙ ２００１；１５（７）：１２１５−１２１７．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

したがって、出願人は、非増殖性糖尿病網膜症及び黄斑浮腫を含む、網膜血管透過性亢進に関連する網膜症の予防及び治療のための新規の治療標的であるＳｅｍａ３Ａを特定した。

【0019】

Ｓｅｍａ３Ａは、典型的な神経細胞誘導信号であり、また、非チロシンキナーゼ多官能性受容体であるニューロピリン−１（Ｎｒｐ−１）への結合を介して、種々の細胞応答に関与する。ニューロピリン−１は、細胞外ドメイン上の別個の部位を介して、構造的に異なる２つのリガンドに結合する特殊な機能を有している^{１５−１７}。Ｓｅｍａ３Ａとの結合^{１８，１９}では細胞骨格の崩壊が誘発され、ＶＥＧＦ_１６５との結合^{１６，１７，１９，２０}ではＶＥＧＦＲ２への結合が促進され、これにより血管形成能力が向上する^２１。結晶学的エビデンスによれば、ＶＥＧＦ_１６５及びＳｅｍａ３Ａは、Ｎｒｐ−１に対して直接競合することはなく、むしろ、別個の重複しない部位でＮｒｐ−１に同時に結合し得ることがわかっている^２２。さらに、遺伝子研究では、Ｎｒｐ−１が神経細胞及び血管発生に関するＶＥＧＦとＳｅｍａ３Ａの作用を明確に調節していることも示されている^２３。とりわけ、ＶＥＧＦと同様に、Ｓｅｍａ３Ａ自体も血管透過性を促進することが提案された（Ａｃｅｖｅｄｏ ｅｔ．ａｌ．，２００８）。これは、ＶＥＧＦとＳｅｍａ３Ａの互いに異なる生物学的役割を考えると、直感的には信じがたい報告であるが、糖尿病網膜症で観察されるようなバリア機能の破綻に影響を及ぼすＳｅｍａ３Ａの役割は、現在まで探究されていない。

【課題を解決するための手段】

【0020】

出願人は、本明細書にて、Ｓｅｍａ３Ａが糖尿病網膜症における血液網膜関門（ＢＲＢ）機能の劣化に関与することを初めて示す。出願人は、ヒト患者及び動物モデルの両方で、初期糖尿病において（ＶＥＧＦ誘発に先立って）、眼内Ｓｅｍａ３Ａが強く誘発されることを実証する。さらに、出願人は、ＳＥＭＡ３ＡがＮＲＰ１を介して内側ＢＲＢの破綻を仲介し、血管透過性を上昇させることにより、網膜腫脹及び黄斑浮腫をもたらす一因となることを示す。したがって、ＳＥＭＡ３Ａは、実質的な病的血管新生及び網膜への損傷が生じる前の、黄斑浮腫に関連する症状の予防または疾患（たとえば、糖尿病網膜症の非増殖性段階）の早期治療の格好の標的である。したがって、Ｓｅｍａ３Ａを中和することは、ＤＲにおける異常な血管透過性に対抗するための魅力的な代替治療法である。

【0021】

したがって、第１の態様では、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞活性を阻害することを含む、対象の黄斑浮腫を予防または治療するための方法を提供する。

【0022】

関連する態様において、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞活性を阻害することを含む、対象の非増殖性糖尿病網膜症を予防または治療するための方法を提供する。

【0023】

別の態様において、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞活性を阻害することを含む、対象の網膜腫脹を予防または治療するための方法を提供する。

【0024】

一実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞活性は、Ｓｅｍａ３Ａ媒介血管透過性を含む。関連する実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａ媒介活性は、Ｓｅｍａ３ＡのＮｒｐ−１受容体への結合を含む。

【0025】

一実施形態において、黄斑浮腫は、実質的に非増殖性黄斑浮腫である。別の実施形態において、黄斑浮腫は、糖尿病黄斑浮腫である。別の実施形態において、糖尿病黄斑浮腫は、実質的に非増殖性である（すなわち、血管新生が実質的に少ないか、存在しない）。また、さらなる実施形態において、黄斑浮腫は、加齢黄斑浮腫である。一実施形態において、加齢黄斑浮腫は、実質的に非増殖性である。

【0026】

一実施形態において、本発明の方法は、治療的または予防的に有効な量のＳｅｍａ３Ａアンタゴニストを対象に投与することを含む。一実施形態において、アンタゴニストは、Ｓｅｍａ３Ａの核酸またはタンパク質の発現を減少させる。別の実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、Ｓｅｍａ３Ａの分泌を減少させる。さらなる実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、Ｓｅｍａ３Ａの硝子体濃度を減少させる。さらなる実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、Ｎｐｒ−１の眼内（すなわち、硝子体）濃度及び／または活性を減少させる。さらに別の実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞シグナル伝達を阻害する。一実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞シグナル伝達は、Ｓｅｍａ３Ａがその同起源の受容体であるＮｐｒ−１に結合することを含む。

【0027】

一実施形態において、アンタゴニストは、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体である。一実施形態において、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３ＡのＮｒｐ−１への結合を特異的に阻害する一方、ＶＥＧＦのＮｒｐ−１への結合を実質的に減少させない。別の実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、Ｓｅｍａ３Ａの受容体への結合を阻害するＮｒｐ−１抗体である。好ましい実施形態において、Ｎｒｐ−１抗体は、ＶＥＧＦのＮｒｐ−１への結合を実施的に減少させない。特定の実施形態において、Ｎｒｐ−１抗体は、Ｎｒｐ−１のａ１、ａ２またはａ１／ａ２ドメインに結合する。

【0028】

また、さらなる実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、Ｓｅｍａ３Ａに結合する可溶性のＮｒｐ−１ポリペプチドまたはその断片である。一実施形態において、断片は、Ｎｒｐ−１のａ１、ａ２またはａ１及びａ２ドメインを含む。一実施形態において、断片は、Ｎｐｒ−１のｂ１、ｂ２またはｂ１及びｂ２ドメインを含まない。関連する実施形態において、可溶性Ｎｒｐ−１断片は、ＶＥＧＦに実質的に結合しない。一実施形態において、断片は、ａ１ａ２及びｂ１ｂ２ドメインまたはこれらの一部を含み、Ｓｅｍａ３Ａ及びＶＥＧＦに結合する。

【0029】

別の実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、Ｓｅｍａ３ＡまたはＮｐｒ−１の核酸またはタンパク質の発現を減少させる。一実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、Ｓｅｍａ３ＡのｓｈＲＮＡまたはアンチセンスである。一実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、Ｎｐｒ−１ポリペプチド、好ましくはヒトＮｐｒ−１ポリペプチド（たとえば、配列番号２または１２）をコードするポリヌクレオチドに結合する、Ｎｐｒ−１のｓｈＲＮＡまたはアンチセンスである。

【0030】

さらなる態様において、本発明は、上述したＳｅｍａ３Ａアンタゴニストのうち１つ以上を、好適な薬学的担体とともに含む、網膜血管透過性亢進を減少させるための組成物に関する。

【0031】

さらに別の態様において、本発明は、上述したＳｅｍａ３Ａアンタゴニストのうち１つ以上を、好適な薬学的担体とともに含む、血管透過性亢進、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、好ましくは加齢黄斑浮腫、より好ましくは非増殖性加齢黄斑浮腫、さらにより好ましくは非増殖性糖尿病黄斑浮腫の予防または治療のための組成物に関する。

【0032】

好ましい実施形態において、本発明の組成物は、眼内投与に適している。一実施形態において、当該組成物は、点眼薬の形態に製剤化される。別の実施形態において、当該組成物は、眼内注射用に製剤化される。

【0033】

一実施形態において、当該組成物は、非増殖性糖尿病網膜症または黄斑浮腫の治療に有用な１つ以上の追加の活性薬剤を含む。

【0034】

関連する態様において、本発明はまた、対象の網膜血管透過性亢進を減少させるための、治療的または予防的に有効な量の１つ以上の本発明のＳｅｍａ３Ａアンタゴニストの使用にも関する。一実施形態において、当該使用は、非増殖性糖尿病網膜症の予防または治療を目的にする。別の実施形態において、当該使用は、黄斑浮腫の予防または治療を目的にする。一実施形態において、黄斑浮腫は、糖尿病黄斑浮腫である。一実施形態において、糖尿病黄斑浮腫には、血管新生が実質的に存在しない（すなわち、概して非増殖性である）。さらなる実施形態において、黄斑浮腫は、加齢黄斑変性症である。別の実施形態において、加齢黄斑浮腫には、血管新生が実質的に存在しない。

【0035】

一実施形態において、上述の対象は、初期の糖尿病に罹患している。一実施形態において、対象は、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に罹患している。別の実施形態において、対象は、２型真性糖尿病に罹患している。一実施形態において、対象の視力は通常である（自覚症状がないこと、すなわち、点状やぼやけた視界などの血管透過性亢進による黄斑浮腫に関連した症状を患っていない）。別の実施形態において、対象は、実質的な周皮細胞の損失を患っていない。一実施形態において、対象は、非増殖性糖尿病網膜症または黄斑浮腫と診断されている。一実施形態において、対象は、網膜腫脹または網膜血管透過性亢進を患っている。ある特定の実施形態において、対象は、血液網膜関門の腫脹を患っている。

【0036】

一実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、実質的な黄斑浮腫の発症に先立って投与される。別の実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、ぼやけまたは点状の視界の発症に先立って投与される。別の実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ誘発に先立って（すなわち、ＶＥＧＦ発現が上昇する前に）投与される。別の実施形態において、本発明のＳｅｍａ３Ａアンタゴニストは、黄斑浮腫及び／または糖尿病の予防及び／または治療に使用される１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与される。黄斑浮腫の治療に使用される薬剤の非限定的な例には、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（商標））及びコルチコステロイドが含まれる。本発明はまた、Ｓｅｍａ３ａアンタゴニストを単独で、または黄斑浮腫及び糖尿病網膜症の治療に使用される１つ以上の薬剤と組み合わせて含む組成物に関係する。

【0037】

Ｓｅｍａ３Ａ活性の上昇とＢＲＢ漏出及び網膜血管透過性亢進との関連が証明されているので、本発明は、網膜血管透過性亢進（たとえば、非増殖性糖尿病網膜症及び黄斑浮腫など）の予防または治療に有用な化合物を特定するために使用されるスクリーニングアッセイにおける標的としてのＳｅｍａ３Ａの使用に関する。当該方法は、
（ａ）Ｓｅｍａ３Ａの核酸もしくはＳｅｍａ３Ａをコードしたポリペプチドの発現レベル、
（ｂ）Ｓｅｍａ３Ａの活性レベル、
（ｃ）Ｓｅｍａ３Ａ活性によって生じた分子のレベル、または
（ｄ）（ａ）から（ｃ）の任意の組み合わせ
が、試験化合物が存在しない場合と比較して、試験化合物の存在下で減少するかどうかを決定することを含む。この減少は、当該試験化合物が網膜血管透過性亢進の予防及び治療に有用である可能性を示すものである。一実施形態において、上述の方法は、インビトロ法である。一実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａ活性は、Ｓｅｍａ３ＡのＮｒｐ−１受容体への結合である。さらなる実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａ活性は、血管透過性の増加である。

【0038】

本発明はまた、網膜血管透過性亢進を予防または治療するための化合物を特定または特徴付けるための方法に関する。当該方法は、
ａ）試験化合物を、レポータタンパク質をコードすることができるレポータ遺伝子を含有する第２の核酸と機能的に連結させた、Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子に通常関連した転写調節エレメント（たとえば、内在性プロモータまたはその断片）を含有する第１の核酸を含む細胞に接触させること、及び
ｂ）レポータ遺伝子の発現またはレポータ活性が試験化合物の存在下で減少するかどうかを決定することを含む。
レポータ遺伝子の発現またはレポータ遺伝子の活性の減少は、当該試験化合物が血管透過性亢進を減少させるため（たとえば、非増殖性糖尿病網膜症及び黄斑浮腫の治療または予防）に使用できる可能性を示す。

【0039】

本発明の他の目的、利点及び特徴は、例示のみを目的として示す、以下の特定の実施形態に関する非制限的な説明を添付の図面を参照して読むことにより、一層明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】糖尿病網膜症に罹患しているヒトＴ１ＤＭ患者の硝子体内におけるＳｅｍａ３Ａのレベル上昇を示す。（ａ）ウエスタンブロット（Ｗｂ）分析では、１型真性糖尿病の罹患患者でＳｅｍａ３Ａの前駆型（約１２５ｋＤａ）と活性型（約９５ｋＤａ）の両方が強く誘発されていることが示された。（ｂ）Ｗｂ定量化では、ＤＲにおける約１２５ｋＤａのＳｅｍａ３Ａシグナルは、対照と比較して、約２５０倍高く（ｐ＜０．０５）、ＤＲ患者における約９５ｋＤａのＳｅｍａ３Ａシグナルは約１７５倍であった（ｐ＜０．０５）。（ｃ、ｄ）光干渉断層計（ＯＣＴ）では、かなりの網膜腫脹が、特に、黄斑及び黄斑周辺の領域に示された。（ｅ）患者の特徴の詳細。

【図2-1】ＳＴＺ誘発糖尿病の初期段階における神経性Ｓｅｍａ３Ａが上方制御され、その発現が黄斑浮腫の役割と地図的に一致することを示す。（ａ）約６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を投与し、スキームに従って血糖を観察し、非絶食状態での血糖が１７ｍＭ（３００ｍｇ／ｄＬ）より高いマウスを糖尿病とみなした。（ｂ）糖尿病の誘発から４週で、ＳＴＺ処置マウスの網膜内のＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡレベルが、ビヒクルを注入した対照と比較して２倍を超えて高くなり（ｐ＝０．００４５、ｎ＝５）、８週で約３倍（Ｐ＝０．００１１、ｎ＝８）、１２週で４倍（Ｐ＝０．００８４６、ｎ＝４）及び１４週間で約２．５倍（Ｐ＝０．０３３４、ｎ＝３）であった。逆に、ＶＥＧＦレベルは、約３倍にまで上昇した１４週間まで変化しなかった（Ｐ＝０．０２５３、ｎ＝３）。（ｃ）Ｓｅｍａ３Ａ発現が周皮細胞の損失より先に生じることを示す、ＳＴＺ処置マウス及びビヒクル処置マウスの平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の周皮細胞特異的染色。（ｄ）ＳＴＺ処置マウスは、糖尿病４週及び８週の両方において血糖が約３０ｍＭまで病的に上昇した（両時点ともｐ＜０．０００１）。（ｅ）８週時で、密着結合（ＴＪ）要素であるオクルディンｍＲＮＡレベルは変わらないままであったが、クローディン−５は３８．６％まで減少した（ｐ＜０．０１）。（ｆ）神経節細胞層（ＧＣＬ）及び内顆粒層（ＩＮＬ）の網膜凍結切片に関するＳｅｍａ３Ａの免疫組織化学、ならびに網膜神経節細胞（ＲＧＣ）マーカであるβＩＩＩ−チューブリンとの共局在化。（ｇ）健常マウス及び糖尿病マウスから得た網膜層のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション。（ｈ）健常マウス及び糖尿病マウスから得たＳｅｍａ３Ａの網膜層の定量ＲＴ−ＰＣＲ。

【図2-2】ＳＴＺ誘発糖尿病の初期段階における神経性Ｓｅｍａ３Ａが上方制御され、その発現が黄斑浮腫の役割と地図的に一致することを示す。（ａ）約６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を投与し、スキームに従って血糖を観察し、非絶食状態での血糖が１７ｍＭ（３００ｍｇ／ｄＬ）より高いマウスを糖尿病とみなした。（ｂ）糖尿病の誘発から４週で、ＳＴＺ処置マウスの網膜内のＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡレベルが、ビヒクルを注入した対照と比較して２倍を超えて高くなり（ｐ＝０．００４５、ｎ＝５）、８週で約３倍（Ｐ＝０．００１１、ｎ＝８）、１２週で４倍（Ｐ＝０．００８４６、ｎ＝４）及び１４週間で約２．５倍（Ｐ＝０．０３３４、ｎ＝３）であった。逆に、ＶＥＧＦレベルは、約３倍にまで上昇した１４週間まで変化しなかった（Ｐ＝０．０２５３、ｎ＝３）。（ｃ）Ｓｅｍａ３Ａ発現が周皮細胞の損失より先に生じることを示す、ＳＴＺ処置マウス及びビヒクル処置マウスの平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の周皮細胞特異的染色。（ｄ）ＳＴＺ処置マウスは、糖尿病４週及び８週の両方において血糖が約３０ｍＭまで病的に上昇した（両時点ともｐ＜０．０００１）。（ｅ）８週時で、密着結合（ＴＪ）要素であるオクルディンｍＲＮＡレベルは変わらないままであったが、クローディン−５は３８．６％まで減少した（ｐ＜０．０１）。（ｆ）神経節細胞層（ＧＣＬ）及び内顆粒層（ＩＮＬ）の網膜凍結切片に関するＳｅｍａ３Ａの免疫組織化学、ならびに網膜神経節細胞（ＲＧＣ）マーカであるβＩＩＩ−チューブリンとの共局在化。（ｇ）健常マウス及び糖尿病マウスから得た網膜層のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション。（ｈ）健常マウス及び糖尿病マウスから得たＳｅｍａ３Ａの網膜層の定量ＲＴ−ＰＣＲ。

【図2-3】ＳＴＺ誘発糖尿病の初期段階における神経性Ｓｅｍａ３Ａが上方制御され、その発現が黄斑浮腫の役割と地図的に一致することを示す。（ａ）約６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を投与し、スキームに従って血糖を観察し、非絶食状態での血糖が１７ｍＭ（３００ｍｇ／ｄＬ）より高いマウスを糖尿病とみなした。（ｂ）糖尿病の誘発から４週で、ＳＴＺ処置マウスの網膜内のＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡレベルが、ビヒクルを注入した対照と比較して２倍を超えて高くなり（ｐ＝０．００４５、ｎ＝５）、８週で約３倍（Ｐ＝０．００１１、ｎ＝８）、１２週で４倍（Ｐ＝０．００８４６、ｎ＝４）及び１４週間で約２．５倍（Ｐ＝０．０３３４、ｎ＝３）であった。逆に、ＶＥＧＦレベルは、約３倍にまで上昇した１４週間まで変化しなかった（Ｐ＝０．０２５３、ｎ＝３）。（ｃ）Ｓｅｍａ３Ａ発現が周皮細胞の損失より先に生じることを示す、ＳＴＺ処置マウス及びビヒクル処置マウスの平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の周皮細胞特異的染色。（ｄ）ＳＴＺ処置マウスは、糖尿病４週及び８週の両方において血糖が約３０ｍＭまで病的に上昇した（両時点ともｐ＜０．０００１）。（ｅ）８週時で、密着結合（ＴＪ）要素であるオクルディンｍＲＮＡレベルは変わらないままであったが、クローディン−５は３８．６％まで減少した（ｐ＜０．０１）。（ｆ）神経節細胞層（ＧＣＬ）及び内顆粒層（ＩＮＬ）の網膜凍結切片に関するＳｅｍａ３Ａの免疫組織化学、ならびに網膜神経節細胞（ＲＧＣ）マーカであるβＩＩＩ−チューブリンとの共局在化。（ｇ）健常マウス及び糖尿病マウスから得た網膜層のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション。（ｈ）健常マウス及び糖尿病マウスから得たＳｅｍａ３Ａの網膜層の定量ＲＴ−ＰＣＲ。

【図3-1】網膜バリア機能がＳｅｍａ３Ａによって弱められることを示す。（ａ）Ｓｅｍａ３Ａの硝子体内注入により、エバンスブルー（ＥＢ）透過によって決定した網膜血管透過性（ＶＰ）が約２倍上昇した（ｐ＜０．０１）。類似の上昇がＶＥＧＦの硝子体内投与（ｐ＜０．０５）及びＳｅｍａ３ＡとＶＥＧＦの両方の組み合わせ（ｐ＜０．０１）で観察された。（ｂ）ビヒクル、ＶＥＧＦ及びＳＥＭＡ３Ａを注入した網膜断片の共焦点画像であり、代表的なＥＢ漏出パターンの上昇を示す。（ｃ）ＥＣＩＳによって測定した経内皮電気抵抗により、Ｓｅｍａ３Ａが内皮細胞のバリア機能を実質上減じることを示す。（ｄ）ヒト網膜毛細血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のウエスタンブロット（ＷＢ）分析；Ｓｅｍａ３ＡまたはＶＥＧＦのいずれかの処置によりＴｙｒ４１６でのＳｒｃの強いリン酸化反応がもたらされる。ＦＡＫはＴｙｒ５７６及び５７７でリン酸化された（Ｓｒｃキナーゼに関する部位）。接着結合タンパク質ＶＥカドヘリンはそれぞれ、ＶＰ上昇に関係する部位であるチロシン７３１（ｐＹ７３１）でリン酸化された。Ｓｅｍａ３ＡとＶＥＧＦとを組み合わせて刺激を行った場合には、付加的な影響も作用の増加も観察されなかった。これは、冗長な経路を介した作用を示唆している。（ｅ）ＶＥ−カドヘリンリン酸化反応及び密着結合の緩みをもたらすＳｅｍａ３Ａシグナル伝達の概略図。（ｆ）Ｓｅｍａ３Ａで処置したＨＲＭＥＣの共焦点顕微鏡では、ＶＥ−カドヘリン及びファロイジン染色によって決定された血管退縮線維の形成が認められた（白色矢印；図３ｆ）。退縮は、ＶＥＧＦ単独またはＶＥＧＦとＳｅｍａ３Ａの組み合わせの場合と類似した。（ｇ）Ｓｅｍａ３ＡまたはＶＥＧＦを注入したフラットマウント網膜では、網膜血管（レクチン染色）との共局在において、Ｙ７３１（白色矢印）でのＶＥ−カドヘリンのリン酸化反応がビヒクル注入網膜に比べて高かった。（ｈ）ＳＴＺ注入マウス及びビヒクル注入マウスから得たフラットマウント網膜。（ｉ）Ｓｅｍａ３Ａ処置（１００〜２００μＭ）後のカスパーゼ３評価による細胞死及びアポトーシス。

【図3-2】網膜バリア機能がＳｅｍａ３Ａによって弱められることを示す。（ａ）Ｓｅｍａ３Ａの硝子体内注入により、エバンスブルー（ＥＢ）透過によって決定した網膜血管透過性（ＶＰ）が約２倍上昇した（ｐ＜０．０１）。類似の上昇がＶＥＧＦの硝子体内投与（ｐ＜０．０５）及びＳｅｍａ３ＡとＶＥＧＦの両方の組み合わせ（ｐ＜０．０１）で観察された。（ｂ）ビヒクル、ＶＥＧＦ及びＳＥＭＡ３Ａを注入した網膜断片の共焦点画像であり、代表的なＥＢ漏出パターンの上昇を示す。（ｃ）ＥＣＩＳによって測定した経内皮電気抵抗により、Ｓｅｍａ３Ａが内皮細胞のバリア機能を実質上減じることを示す。（ｄ）ヒト網膜毛細血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のウエスタンブロット（ＷＢ）分析；Ｓｅｍａ３ＡまたはＶＥＧＦのいずれかの処置によりＴｙｒ４１６でのＳｒｃの強いリン酸化反応がもたらされる。ＦＡＫはＴｙｒ５７６及び５７７でリン酸化された（Ｓｒｃキナーゼに関する部位）。接着結合タンパク質ＶＥカドヘリンはそれぞれ、ＶＰ上昇に関係する部位であるチロシン７３１（ｐＹ７３１）でリン酸化された。Ｓｅｍａ３ＡとＶＥＧＦとを組み合わせて刺激を行った場合には、付加的な影響も作用の増加も観察されなかった。これは、冗長な経路を介した作用を示唆している。（ｅ）ＶＥ−カドヘリンリン酸化反応及び密着結合の緩みをもたらすＳｅｍａ３Ａシグナル伝達の概略図。（ｆ）Ｓｅｍａ３Ａで処置したＨＲＭＥＣの共焦点顕微鏡では、ＶＥ−カドヘリン及びファロイジン染色によって決定された血管退縮線維の形成が認められた（白色矢印；図３ｆ）。退縮は、ＶＥＧＦ単独またはＶＥＧＦとＳｅｍａ３Ａの組み合わせの場合と類似した。（ｇ）Ｓｅｍａ３ＡまたはＶＥＧＦを注入したフラットマウント網膜では、網膜血管（レクチン染色）との共局在において、Ｙ７３１（白色矢印）でのＶＥ−カドヘリンのリン酸化反応がビヒクル注入網膜に比べて高かった。（ｈ）ＳＴＺ注入マウス及びビヒクル注入マウスから得たフラットマウント網膜。（ｉ）Ｓｅｍａ３Ａ処置（１００〜２００μＭ）後のカスパーゼ３評価による細胞死及びアポトーシス。

【図4】ニューロン誘導性Ｓｅｍａ３Ａの標的サイレンシング及びＳｅｍａ３Ａの硝子体内中和により、Ｔ１ＤＭの血管透過性が効果的に減少することを示す。（ａ）ＶＳＶＧカプシドを有するレンチウイルスベクターは、ＧＦＰ ＲＮＡを保持するＬｖベクターによって表現されるように、硝子体内に導入されると、ＲＧＣ及びＯＮＬ細胞に高い親和性を呈する。Ｓｅｍａ３Ａに対するＬｖ．ｓｈＲＮＡを使用して、ＲＧＣまたはＩＮＬのニューロンにおけるＳｅｍａ３Ａ産生をインビボで特異的に阻害した。（ｂ）ＳＴＺ処置マウスが５６．８％の透過性増加を示すのに対し（エバンスブルー透過による評価（ｐ＜０．０５））、（ｃ）糖尿病の５週でＬｖ．ｓｈＳｅｍａ３Ａを単回硝子体内注入した場合は、網膜内のＳｅｍａ３Ａ発現が有意に６２．３％減少し（ｐ＜０．００５）、（ｄ）血管漏出も比例して４９．５％の減少となった（ｐ＜０．０５）。（ｅ）硝子体内のＳｅｍａ３Ａを中和するために、Ｓｅｍａ３ＡとＶＥＧＦの両方の二価トラップとして、組換え（ｒ）可溶性Ｎｒｐ−１を使用した。ニューロピリン−１は、細胞外ドメインが別個のサブドメインにさらに分割された一回膜貫通型受容体であり、セマフォリンの結合するａ１ａ２サブドメインと、ＶＥＧＦの結合するｂ１ｂ２サブドメインがある。（ｆ）糖尿病誘発から６週及び７週後のＳＴＺマウスにｒｍＮＲＰ1を硝子体内注入すると、糖尿病８週での網膜透過性が４８．１％減少した（Ｐ＝０．０１２、ｎ＝６（マウス１８匹））。逆に、マウスＶＥＧＦに対する中和抗体の注入では、ビヒクルと比較して、疾患の当段階における糖尿病誘発性網膜透過性の減少に効果はなかった（Ｐ＝０．７３０２、ｎ＝５（マウス１４匹））。ビヒクル注入網膜に対する値を示す。

【図5】Ｎｒｐ−１条件付きノックアウトマウスがＳｅｍａ３Ａ誘発性網膜バリア機能破綻を予防することを示す。５日間にわたるタモキシフェンの全身投与により、Ｎｒｐ−１タンパク質（ａ）及び遺伝子（ｂ）発現が効果的に失われた。（ｃ）ＮＲＰ１が欠如するため、Ｓｅｍａ３Ａの硝子体内投与では血管漏出は上昇しなかったが（Ｐ＝０．３６；ｎ＝７（マウス２１匹））、Ｔａｍ処置ＴｇＣｒｅ−ＥＳＲ１／Ｎｒｐ１＋／＋対照では、血管漏出が３倍高かった（Ｐ＝０．０００６５；ｎ＝３（マウス９匹））。（ｄ）逆に、Ｎｒｐ１の破壊は、ＶＥＧＦ誘発性血管網膜透過性に影響を与えず（ｐ＝０．００２４；ｎ＝３（マウス９匹））、ＶＥＧＦ誘発性網膜血管漏出には、これまでに報告されているように、ＮＲＰ１と関係しないことが示唆される。

【図6】ヒトＳｅｍａ３Ａ前駆体タンパク質配列（配列番号１）を示す。この配列は、成熟型にさらに処理される。残基１〜２０はシグナルペプチドに相当する。

【図7】ヒト可溶性ニューロピリン−１（Ｎｒｐ−１）受容体タンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＨ０７７３７．１−配列番号２）を示す。

【図8】シグナルドメイン、Ｓｅｍａ３ａ結合ドメインａ１ａ２、ＶＥＧＦ結合ドメインｂ１ｂ２、ドメインＣ、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインを有するＮｒｐ−１について、ラット（配列番号１５、Ａｃｃｅｓｓ．Ｎｏｓ．ＥＤＬ９６７８４、ＮＰ＿６５９５６６）と、ヒト（配列番号１２、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００３８６４）と、マウス（配列番号１４、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＰ＿０３２７６３）とのアラインメントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0041】

血液網膜関門の劣化と、その結果として生じる黄斑浮腫は、糖尿病網膜症（ＤＲ）の重要な症状であり、最も関連の深い臨床的特徴は失明である。黄斑浮腫は、糖尿病患者のうち２５％を超える患者が罹患しており、現在利用可能な治療法には、コルチコステロイドの局所的投与及び最近認可された抗ＶＥＧＦ治療などがあるが、いくつかの難点がある。ここで、出願人は、Ｉ型糖尿病において病的な黄斑血管透過性を誘発する、典型的な神経細胞誘導信号であるセマフォリン３Ａの役割に関して、ヒト及び動物研究から得た最初のエビデンスを提供する。セマフォリン３Ａは胚形成ならびに神経細胞及び血管のパターニングに典型的に関連しているが、発現ダイナミクスの研究では、糖尿病の初期高血糖段階においても神経網膜内のセマフォリン３Ａが誘発され、内皮バリア機能の最初の破綻を引き起こすことがわかった。出願人は、ストレプトゾトシンマウスモデルをヒト糖尿病網膜症の代わりとして使用して、一連のオーソロガス法（遺伝子サイレンシングまたはセマフォリン３Ａトラップとして採用した可溶性ニューロピリン−１を用いた処置）によって、セマフォリン３Ａの中和が網膜血管漏出を効果的に防ぐことを実証する。セマフォリン３Ａによって誘発される透過性の増加は、同起源の受容体であるニューロピリン−１を介してもたらされる。Ｔｇ^{Ｃｒｅ−Ｅｓｒ１}；Ｎｒｐ１^{ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ}のニューロピリン−１条件付きノックアウトマウスでは、セマフォリン３Ａ誘発性眼内透過性が減少する。この知見により、非増殖性網膜症、黄斑浮腫及び特にＤＭＥの予防または治療に関する新しい治療標的が特定された。
定義

【0042】

本明細書で使用する場合、Ｓｅｍａ３Ａという用語は、Ｓｅｍａ３Ａ（たとえば、ＨＧＮＣ：１０７２３；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１０３７１；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００７５２１３；ＯＭＩＭ：６０３９６１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１４５６３；図６、配列番号１）及びその機能的アイソフォームならびにアレル／多型変異体を指す。Ｓｅｍａ３Ａは、Ｉｇ様Ｃ２型（免疫グロブリン様）ドメイン、ＰＳＩドメイン及びＳｅｍａドメインを有するタンパク質をコードする。この分泌タンパク質は、軸索成長及び血管新生を阻害する化学反発作用物質、または尖端樹状突起の成長を刺激する化学誘引作用物質のいずれかとして機能し得る。これは、ストレスを受けた網膜神経節ニューロンを含む、種々の組織で発現する。

【0043】

「Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞活性」とは、概して、Ｓｅｍａ３Ａが実質的な役割を担う、生理学上または病理学上の事象を指す。このような活性の非限定的な例としては、ｉ）血液網膜関門の劣化、ｉｉ）血管透過性の上昇（すなわち、透過性亢進）、ｉｉｉ）低酸素部位におけるＶＥＧＦ誘発性血管新生の阻害（抗血管形成作用）、及び軸索成長の調節（たとえば、成長円錐の崩壊誘発）が挙げられる。Ｓｅｍａ３Ａは、ニューロピリン−１受容体（Ｎｒｐ−１）に結合する。

【0044】

本明細書で使用する場合、「ニューロピリン−１受容体」または「Ｎｒｐ−１」受容体という用語は、ニューロピリン−１及びそのアイソフォーム、ならびにＳｅｍａ３Ａ結合及びシグナル伝達に関与するアレル／多型変異体を指す（たとえば、ＨＧＮＣ：８００４；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：８８２９；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００９９２５０；ＯＭＩＭ：６０２０６９；及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ１４７８６；図７、配列番号２、配列番号１２）。ニューロピリン−１の基本構造は、３つの細胞外ドメイン（ａ１ａ２、ｂ１ｂ２及びｃ）と、１つの膜貫通ドメインと、１つの細胞質ドメインの５つのドメインからなる（図８及び配列番号１２を参照）。ａ１ａ２（配列番号１３）ドメインは、ジスルフィド架橋を形成する４つのシステイン残基を通常含有する、相補体のｓｅｄｘｗ２３４ｗｅｑｑｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｃ１ｒ及びＣ１ｓ（ＣＵＢ）と相同である。このドメインがＳｅｍａ３Ａと結合する。ニューロピリン−１には複数のスプライシングバリアントアイソフォーム及び可溶型があり、これらはすべて本発明に包含される。

【0045】

本明細書で使用する場合、「機能性断片」または「機能性異性体」（たとえば、本発明の可溶性Ｎｒｐ−１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能性断片）は、元の分子と同じ活性を保持するが、任意の修飾、及び／またはアミノ酸／ヌクレオチドの置換、欠失もしくは付加（たとえば、別のポリペプチドとの融合）の点で異なる分子を指す。修飾は、ポリペプチド／ポリヌクレオチド骨格を含むいずれの部分にも生じ得る（たとえば、アミノ酸配列、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端またはカルボキシ末端）。かかる置換、欠失または付加には１つ以上のアミノ酸が関与し得、ポリヌクレオチドの場合には１つ以上のヌクレオチドが関与し得る。置換は、保存的であることが好ましい。すなわち、当業者によく知られているように、あるアミノ酸が、類似の物理化学的特性（大きさ、疎水性、電荷／極性など）を有する別のアミノ酸によって置き換えられているものである。可溶性Ｎｒｐ−１受容体（配列番号２）の機能性断片には、可溶性Ｎｒｐ−１ポリペプチド（たとえば、ａ１ａ２ドメイン、配列番号１３）の断片もしくは一部、または阻害活性を維持する（すなわち、Ｓｅｍａ３Ａに結合し、Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞活性の伝達を阻害する）Ｎｒｐ−１のホモログ変異体もしくはアレル変異体の断片もしくは一部が挙げられる。特定の実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞活性は、血管透過性亢進である。一実施形態において、Ｎｐｒ−１ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０、８５、８８、９０、９５、９８または９９％同一である。一実施形態において、Ｎｐｒ−１ポリペプチドは、図８に示すＮｐｒ−１のドメインａ１、ａ２、ｂ１及び／またはｂ２と少なくとも８０、８５、８８、９０、９５、９８または９９％同一である。一実施形態において、Ｎｐｒ−１は、図８に示すラット、マウス及びヒトのＮｒｐ−１に保存されていないアミノ酸に変異を含む、機能性変異体である。好ましくは、Ｎｐｒ−１ポリペプチド／ポリヌクレオチドまたはその断片は、ヒトである。

【0046】

さらなる実施形態において、本明細書に記載したポリペプチド及び核酸と実質的に同一のポリペプチド及び核酸を本発明において使用することができる。

【0047】

「相同性」及び「相同」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、アラインメントした配列の各位置を比較することによって決定することができる。核酸配列間またはアミノ酸配列間の相同性の程度は、配列の共有する位置にて、ヌクレオチドまたはアミノ酸が同一である数もしくは一致した数に相関する。本明細書で当該用語を使用する場合、２つの配列が実質的に同一であり、当該配列の機能活性が保存されていれば、その核酸／ポリヌクレオチド配列は、他方の配列と「相同」である（本明細書で使用する場合、「相同」という用語は進化的関係を意味するものではない）。最適アラインメント（ギャップ許容あり）を行った場合に、少なくとも約５０％の配列類似性または同一性を有するか、定義した機能モチーフを配列が共有していれば、２つの核酸配列は実質的に同一であるとみなされる。代替実施形態では、最適アラインメントを行った実質的に同一の配列における配列類似性は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であり得る。本明細書で使用する場合、配列間の相同性を示す特定の割合は、最適アラインメントを行った配列における配列同一性の程度を示す。「無関係」または「非相同」の配列は、配列番号１〜１４のいずれかと、４０％未満の同一性を有するが、好ましくは約２５％未満の同一性を有する。

【0048】

実質的に相補的な核酸は、一方の分子の相補体が他方の分子と実質的に同一である核酸である。２つの核酸配列またはタンパク質配列は、最適アラインメントを行った場合に、少なくとも約７０％の配列同一性を有すれば、実質的に同一であるとみなされる。代替実施形態では、配列同一性は、たとえば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であり得る。同一性を比較するための配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ２：４８２）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４）、ならびにこれらのアルゴリズムのコンピュータ処理（たとえば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）などの各種アルゴリズムを用いて行うことができる。配列同一性はまた、Ａｌｔｓｃｈｕｌらが記述したＢＬＡＳＴアルゴリズム（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を用いて決定することもできる（発表されたデフォルト設定を使用）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センターより（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／上のインターネットを介して）入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントを行ったときに、ある正の値の閾値スコアＴと一致するかまたは満足させる、検索配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、スコアの高い配列ペア（ＨＳＰ）を同定する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値を表す。最初の隣接ワードヒットは、より長いＨＳＰを見出すための検索を開始する手掛かりとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。ワードヒットの両方向への拡張は、次のパラメータが満たされるときに停止する。累積アラインメントスコアが最大到達値から量Ｘだけ低下した場合、負のスコア残基アラインメントが１つ以上蓄積したことにより累積スコアがゼロ以下になった場合、またはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０（または１または０．１または０．０１または０．００１または０．０００１）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を用いることができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いる２つの配列間の統計的類似性の一つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列間の一致が偶然により生じ得る確率の指標を提供する。本発明の代替実施形態では、試験配列の比較における最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、実質的に同一とみなされる。

【0049】

２つの核酸配列が実質的に相補的であることの代替指標は、中程度のストリンジェントな条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、２つの配列が互いにハイブリッド形成することである。中程度のストリンジェントな条件下でのフィルタ結合配列に対するハイブリダイゼーションは、たとえば、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中６５℃にて行い、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４２℃にて洗浄することで実施できる（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ａｔ ｐ．２．１０．３参照）。あるいは、ストリンジェントな条件下でのフィルタ結合配列に対するハイブリダイゼーションは、たとえば、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中６５℃にて行い、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６８℃にて洗浄することで実施できる（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９８９、上述、参照）。ハイブリダイゼーションの条件は、目的の配列に応じて、既知の方法に従って変更してよい（Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ − Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列に対する熱的融点よりも約５℃低くなるように選択される。たとえば、一実施形態では、Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニストは、Ｎｐｒ−１核酸配列（好ましくはヒト配列）にハイブリダイズするアンチセンス／ＲＮＡｉまたはｓｈＲＮＡである。

【0050】

本明細書で使用する場合、黄斑浮腫及び／または非増殖性網膜症に関して「治療する」または「治療」という用語は、黄斑浮腫及び／または非増殖性糖尿病網膜症の１つ以上の症状の低減／改善を指すことを意味する。症状には、限定するものではないが、視力障害（たとえば、暗点、点状またはぼやけた視界）、網膜腫脹、黄斑浮腫、血管透過性亢進、血液網膜関門の完全性、網膜肥厚、周皮細胞損失及び／または輪状硬性白斑の存在が挙げられる。

【0051】

本明細書で使用する場合、黄斑浮腫及び／または血管透過性亢進に関して「予防する」または「予防」という用語は、視力障害（たとえば、暗点、点状またはぼやけた視界）、網膜腫脹、黄斑浮腫、血管腫脹／漏出、血液網膜関門の完全性、網膜肥厚、周皮細胞損失及び／または輪状硬性白斑の存在の少なくとも１つの進行の抑制または発症の遅延を指すことを意味する。

【0052】

本明細書で使用する場合、血管透過性亢進という用語は、血管及び／または毛細血管の透過性が、通常の状態、たとえば非糖尿病患者または黄斑浮腫もしくは網膜腫脹のいかなる形態も罹患していない患者と比較して異常に高いことを指す。血管透過性亢進は、急性（一過性）であっても、慢性であってもよい。血管透過性亢進の結果、体液が血流から血管壁を越えて移動し、これにより浮腫領域が形成される。本発明との関係においては、血管透過性亢進は、腫脹（たとえば、網膜腫脹）及び血管の異常な漏出（血液網膜関門を通過するものなど）を含む。

【0053】

本明細書で使用する場合、「Ｓｅｍａ３Ａ阻害剤」または「Ｓｅｍａ３Ａアンタゴニスト」という用語は、Ｓｅｍａ３Ａを介する細胞シグナル伝達を低減または阻止できる薬剤を指す。非限定的な例としては、Ｓｅｍａ３Ａの発現（転写もしくは翻訳）を低減もしくは阻止する薬剤、Ｓｅｍａ３Ａの分泌を低減もしくは阻止できる薬剤、またはＳｅｍａ３ＡのＮｒｐ−１受容体への結合を低減もしくは阻止できる薬剤、及びＮｐｒ−１の（転写もしくは翻訳を）低減もしくは阻止する薬剤が挙げられる。限定するものではないが、薬剤は天然でも合成でもよく、タンパク質／ポリペプチドであり得、たとえば、これらに限定されないが、Ｓｅｍａ３ＡまたはＮｒｐ−１受容体に特異的に結合する抗体、可溶性Ｎｒｐ−１ポリペプチドまたはその断片、ペプチド、小分子、ヌクレオチド、たとえば、これらに限定されないが、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質（たとえば、配列番号１）をコードするＳｅｍａ３Ａ核酸配列またはＮｐｒ−１タンパク質（たとえば、配列番号２または１２）をコードするＮｐｒ−１核酸配列（Ｇｅｎｅ ＩＤ８８２９（ヒト）、Ｇｅｎｅ ＩＤ１８１８６（ハツカネズミ（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））またはＧｅｎｅ ＩＤ２４６３３１（ドブネズミ（ｒａｔｔｕｓ Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））に特異的なアンチセンスまたはｓｈＲＮＡなどである。一実施形態において、薬剤は、ＶＥＧＦのＮｒｐ−１受容体への結合、したがってＶＥＧＦ媒介細胞シグナル伝達を実質的に低減することなく、Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞シグナル伝達を阻害することができる。

【0054】

本発明の方法、組成物、使用及びパッケージは、哺乳動物、好ましくはヒトに対して特に有用である。特定の実施形態において、本発明のＳｅｍａ３Ａ阻害剤を投与する対象は、糖尿病に罹患している。別の実施形態において、対象は、糖尿病に罹患するリスクがある。一実施形態において、糖尿病は、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）である。一実施形態において、対象は、黄斑浮腫と診断されているか、黄斑浮腫のリスクがある。一実施形態において、黄斑浮腫は、糖尿病黄斑浮腫である。一実施形態において、黄斑浮腫は、びまん性黄斑浮腫である。別の実施形態において、黄斑浮腫は、局所性黄斑浮腫である。一実施形態において、対象は、非増殖性網膜症に罹患している（すなわち、Ｓｅｍａ３Ａ抑制剤を投与するときに、病的な血管新生がないか、実質的に少ない）。一実施形態において、対象は、初期糖尿病に罹患している。関連する実施形態において、対象は、健常対象者と比較して、血糖レベルが高い。さらに別の実施形態において、対象は、実質的な周皮細胞の損失を患っていない。さらに別の実施形態において、糖尿病対象者は、網膜腫脹を患っている。

【0055】

本明細書で使用する場合、「初期糖尿病」などの表現は、対象がまだ糖尿病の初期段階、たとえば第１〜第４段階、好ましくは第１〜第３段階にあることを意味する。第１段階は、インスリン抵抗性及び／またはβ細胞量の減少に対して正常血糖を維持するためにインスリン分泌が増加するという代償を特徴とする。この段階は、健全な急性グルコース応答性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を伴う分化機能の維持を特徴とする。第２段階は、ブドウ糖レベルが上昇し始め、５．０〜６．５ｍｍｏｌ／ｌに達するときに発生する。これは、β細胞量の損失ならびにＧＳＩＳの減少及びβ細胞脱分化によって裏づけられる機能破綻にβ細胞が順応した安定状態である。第３段階は、ブドウ糖レベルが比較的急激に第４段階の顕性糖尿病まで上昇する、初期の代償不全の不安定な過渡期である。第４段階は、より深刻なβ細胞脱分化を伴う持続的な代償不全を特徴とする。最後に、第５段階は、ケトン症に進行するβ細胞量の大幅な低減に表される重篤な代償不全を特徴とする。第１段階から第４段階の中での移行は、いずれの方向でも生じ得る。たとえば、２型糖尿病を治療している個人は、第４段階から第１段階または第２段階に移行し得る。１型糖尿病の場合、寛解が進むにつれて、通常、第４段階から第２段階への経過が認められる（Ｄｉａｂｅｔｅｓ５３（Ｓｕｐｐｌ．３）：Ｓ１６−Ｓ２１０，２００４参照、当該文献はその全体が本明細書に参照により組み込まれる）。

【0056】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」または「賦形剤」は、生理学的に適合性のあるあらゆるすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、生理学的媒体などを含む。実施形態において、担体は眼投与に適するものである。薬学的に許容可能な担体は、滅菌水溶液または滅菌分散液、及び注入可能な滅菌溶液または滅菌分散液をその場で調製するための滅菌粉末を含む。こうした媒体及び剤の使用、たとえば、眼適用への使用などは、当該技術分野においてよく知られている。任意の従来の媒体または剤が本発明の化合物と配合変化を生じる場合を除き、本発明の組成物におけるこれらの使用が企図される。また、補助的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。
血管透過性亢進を治療または予防するための方法

【0057】

第１の態様では、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞活性を特異的に阻害する化合物を投与することによって、対象の血管透過性亢進及び黄斑浮腫の形成を阻害する治療法に関する。Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞活性は、多くの方法によって阻害することができる。Ｓｅｍａ３Ａ細胞活性の阻害は、Ｓｅｍａ３Ａの核酸またはタンパク質の発現を低減すること、または関連する受容体であるＮｒｐ−１へのＳｅｍａ３Ａの結合を阻害することによって、直接的に行うことができる。Ｓｅｍａ３Ａ活性の阻害はまた、Ｓｅｍａ３Ａ誘導性血管透過性亢進に関与する、Ｓｅｍａ３Ａの既知の下流エフェクタの１つを標的にすることによって（たとえば、Ｎｒｐ−１受容体を標的にすることによって）、間接的に達成し得る。Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞活性の阻害方法の非限定的な例としては、ｉ）Ｓｅｍａ３Ａに特異的な抗体、ｉｉ）Ｎｒｐ−１に特異的な抗体（すなわち、Ｓｅｍａ３Ａの受容体への結合との競合）、ｉｉ）Ｓｅｍａ３Ａ発現を低減するためのアンチセンス法及びＲＮＡｉ法、ならびにｉｖ）機能性Ｓｅｍａ３Ａトラップとして作用する可溶性Ｎｒｐ−１受容体またはその断片を提供することが挙げられる。
Ｓｅｍａ３Ａ媒介細胞活性の阻害
ａ．抗体

【0058】

本発明の特定の態様では、Ｓｅｍａ３Ａ細胞活性（たとえば、Ｓｅｍａ３Ａ媒介血管透過性亢進）がＳｅｍａ３Ａ抗体を使用することによって阻害され得る。特定の実施形態において、これらの抗体は、同起源の受容体であるＮｒｐ−１と相互作用するＳｅｍａ３Ａの一部に結合し、これによりＳｅｍａ３Ａ媒介細胞シグナル伝達を予防する^４１。

【0059】

あるいは、Ｓｅｍａ３ＡのＮｒｐ−１への結合を阻止する、Ｎｒｐ−１受容体を直接標的にする抗体を用いることもできる。本発明の特定の態様において、Ｎｒｐ−１を標的にする抗体は、Ｓｅｍａ３Ａの受容体への結合を阻止するが、ＶＥＧＦのＮｒｐ−１への結合に実質的に干渉しない。一実施形態において、Ｎｒｐ−１抗体は、Ｎｒｐ−１ポリペプチドのａ１ａ２（Ａ）ドメインに結合する。

【0060】

本明細書で使用する場合、「Ｓｅｍａ３Ａ抗体」という用語は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に特異的に結合（相互作用）し、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質と同じ抗原決定基を有する天然タンパク質以外の他の天然タンパク質に実質的に結合しない抗体を指す。同様に、「Ｎｒｐ−１抗体」という用語は、Ｎｒｐ−１タンパク質に特異的に結合（相互作用）し、Ｎｒｐ−１タンパク質と同じ抗原決定基を有する天然タンパク質以外の他の天然タンパク質に実質的に結合しない抗体を指す。Ｓｅｍａ３Ａ／Ｎｒｐ−１抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体を含む。抗体または免疫グロブリンという用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体及び抗体断片を含む。抗体断片は、完全長抗体の一部、一般的には、その抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖの断片、ダイアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、単一ドメイン抗体（たとえば、ラクダ科由来）、サメＮＡＲ単一ドメイン抗体、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。抗体断片はまた、ＣＤＲまたは抗原結合ドメインを含有する結合部分も指し得、たとえば、ＶＨ領域（ＶＨ、ＶＨ−ＶＨ）、アンチカリン、ＰｅｐＢｏｄｉｅｓ（商標）、抗体−Ｔ細胞エピトープ融合体（Ｔｒｏｙｂｏｄｉｅｓ）またはＰｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓが挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

抗ヒトｓｅｍ３Ａ／Ｎｒｐ−１抗体は、これまでに調製されており^４３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚを含む各種供給業者からも市販されている。

【0062】

一般に、抗体（モノクローナル抗体及びハイブリドーマを含む）を調製するための技術及び抗体を使用して抗原を検出する技術は、当該技術分野においてよく知られており、各種プロトコールもよく知られており、入手可能である。
ｂ．可溶性Ｎｒｐ−１受容体またはその断片

【0063】

本発明によれば、可溶性Ｎｒｐ−１受容体（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ Ｏ１４７８６、アイソフォーム２）またはその機能性断片を使用して、Ｓｅｍａ３Ａ誘発性血管透過性亢進を低減することができる。特定の実施形態において、可溶性Ｎｒｐ−１受容体機能性断片は、Ｓｅｍａ３Ａに結合するが、ＶＥＧＦには結合しない断片である。たとえば、機能性断片は、Ｓｅｍａ３Ａに結合するが、ＶＥＧＦに結合しないａ１ａ２ドメインを含み得る。
Ｓｅｍａ３Ａ発現の阻害

【0064】

Ｓｅｍａ３Ａ発現を減少させ、これにより黄斑浮腫の一因となる網膜のＳｅｍａ３Ａ誘発性血管透過性亢進を軽減させるには、各種方法が利用可能である。非限定的な例には、Ｓｅｍａ３Ａプロモータなどを標的にする小ヘアピンｓｈＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、リボザイム、ＴＡＬエフェクタなどの使用が挙げられる。

【0065】

細胞におけるｓｈＲＮＡの発現は、プラスミドの導入またはウイルスベクター（たとえば、レンチウイルスベクター）もしくは細菌ベクターを介して行うことができる。特定の実施形態において、本発明に従って使用され得るｓｈＲＮＡは、以下の配列を有する。

【0066】

表１：Ｓｅｍａ３Ａに対するｓｈＲＮＡの配列

【表1】

【0067】

したがって、代替実施形態において、本発明は、目的とするｍＲＮＡの分解及び／または翻訳の阻害をもたらすための外因性投与用アンチセンス、ｓｈＲＮＡ分子及びリボザイムを提供する。好ましくは、アンチセンス、ｓｈＲＮＡ分子及びリボザイムは、ヒトＳｅｍａ３Ａを標的にする。アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療応用の例には、１９９２年８月４日発行の米国特許第５，１３５，９１７号、１９９２年３月２４日発行の米国特許第５，０９８，８９０号、１９９２年２月１１日発行の米国特許第５，０８７，６１７号、１９９２年１１月２４日発行の米国特許第５，１６６，１９５号、１９９１年４月２日発行の米国特許第５，００４，８１０号、１９９３年３月１６日発行の米国特許第５，１９４，４２８号、１９８９年２月２１日発行の米国特許第４，８０６，４６３号、１９９４年２月１５日発行の米国特許第５，２８６，７１７号、米国特許第５，２７６，０１９号及び米国特許第５，２６４，４２３号、１９９４年４月２９日付けＢｉｏＷｏｒｌｄ Ｔｏｄａｙ、ｐ．３が挙げられる。

【0068】

好ましくは、アンチセンス分子では、目的のｍＲＮＡとの相補性の程度は、特異的結合が望まれる状況下、たとえば、インビボアッセイもしくは治療処置の場合の生理学的条件下、またはインビトロアッセイの場合のアッセイが実施される条件下で、アンチセンス分子の標的ではない配列への結合を十分に回避するものである。アンチセンス結合の標的ｍＲＮＡは、タンパク質をコードするための情報だけでなく、関連するリボヌクレオチド、たとえば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、５’キャップ領域及びイントロン／エクソン連結リボヌクレオチドを形成するものも含み得る。本発明のＳｈｃ阻害剤などの分子を得るために使用できるアンチセンス及びリボザイム核酸のスクリーニング方法は、米国特許第５，９３２，４３５号に開示されている。

【0069】

本発明のアンチセンス分子（オリゴヌクレオチド）には、糖間骨格結合、たとえば、リン酸トリエステル、メチルホスホン酸、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環の糖間結合、ホスホロチオエートなどを含むもの、ならびにＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２、ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２、ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２及びＯ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２骨格（式中のホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２）を有するものを挙げることができる。モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドを用いてもよい（米国特許第５，０３４，５０６号）。代替実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ、時に「タンパク質核酸」とも呼ばれる）骨格を有し得る。この場合、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格により置き換えられ得、ヌクレオシド塩基がポリアミド骨格中のアザ窒素原子またはメチレン基に直接的または間接的に結合している（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７及び米国特許第５，５３９，０８２号）。ホスホジエステル結合は、キラル及び鏡像異性的に特異である構造で置換されてもよい。当業者であれば、本発明の実施に使用するための他の結合を選択できるであろう。

【0070】

オリゴヌクレオチドはまた、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド塩基などの種を含み得る。したがって、天然に通常みられないプリン及びピリミジンも使用できる。同様に、ヌクレオチドサブユニットのペントフラノシル部分の修飾も行ってよい。かかる修飾の例は、２’−Ｏ−アルキル−置換及び２’−ハロゲン置換のヌクレオチドである。本発明で有用な糖部分の２’位における修飾のいくつかの具体例は、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ_３、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ ＮＨ_２またはＯ（ＣＨ_２）_ｎ ＣＨ_３（式中ｎは１〜約１０）；Ｃ_１〜Ｃ_１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ_３；ＯＣＦ_３；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ_３；ＳＯ_２ ＣＨ_３；ＯＮＯ_２；ＮＯ_２；Ｎ_３；ＮＨ_２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポータ基；インターカレータ；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基及び類似の特性を有する他の置換基である。１つ以上のペントフラノシル基が、別の糖、シクロブチルなどの糖類似体、または糖に代わる別の部分と置き換わっていてもよい。

【0071】

いくつかの実施形態において、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約１００の核酸単位を含み得る。核酸単位が、ホスホジエステルまたは骨格構造を形成する他の結合を通じて、隣接するヌクレオチド単位に適切に結合した塩基−糖の組み合わせ（または類似構造の組み合わせ）であることは理解される。

【0072】

さらなる実施形態において、目的のポリペプチド（Ｓｅｍａ３ＡまたはＮｒｐ−１）をコードする核酸またはその断片の発現を、転写後遺伝子サイレンシングの一種であるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術を用いて阻害または妨害してよい。ＲＮＡｉを使用して、偽の「ノックアウト」、すなわち、目的の遺伝子またはコード領域がコードする産物の発現を減少させる系を作製し、系内の当該コード産物の活性を全体的に減少させてもよい。このように、ＲＮＡｉは、目的の核酸またはその断片もしくは変異体を標的にし、そのコードする産物の発現及び活性レベルを低減するために実施することができる。このような系は、当該産物の機能研究に使用できるだけでなく、かかる産物の活性に関する疾患の治療にも用いることができる。ＲＮＡｉについては、たとえば、公開済み米国特許出願２００２０１７３４７８（Ｇｅｗｉｒｔｚ；２００２年１１月２１日公開）及び同２００２０１３２７８８（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．；２００２年１１月７日公開）に記載されている。ＲＮＡｉを実施するための試薬及びキットは、たとえば、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。

【0073】

一部の系において、ＲＮＡｉの最初の試薬は、標的核酸に対応するｄｓＲＮＡ分子である。次いで、ｄｓＲＮＡ（たとえば、ｓｈＲＮＡ）が、２１〜２３のヌクレオチド長である低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（１９〜２１塩基対の二重鎖、各々２つのヌクレオチドが３’で突出）に切断されると考えられる。この最初の切断段階をもたらすと思われる酵素は、「ダイサー」と呼ばれており、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩＩＩファミリーの１つに分類されている。あるいは、ｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ様分子などを細胞に直接導入することによって、またはｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ様分子などの適切な前駆体（たとえば、前駆体をコードするベクターなど）を細胞に導入して細胞内で生成させることによって、ＲＮＡｉを行ってもよい。次いで、ｓｉＲＮＡは、他の細胞内成分と結合し、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成し得る。このようにして形成されたＲＩＳＣは、その後、相同性に基づき、ｓｉＲＮＡ部分と標的転写産物との間の塩基対相互作用を介して、目的の標的転写産物を標的にすることができる。これにより、標的転写産物がｓｉＲＮＡの３’末端から約１２ヌクレオチドで切断されることになる。このように、標的ｍＲＮＡが切断され、ｍＲＮＡがコードするタンパク質産物のレベルが減少する。

【0074】

ＲＮＡｉは、適切にインビトロ合成されたｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはｓｉＲＮＡ様分子の細胞導入により行ってもよい。たとえば、化学合成されたＲＮＡを用いてＲＮＡｉを行ってもよい。あるいは、適切な発現ベクターを用いて、当該ＲＮＡをインビトロまたはインビボのいずれかで転写してもよい。センス鎖及びアンチセンス鎖（同じベクターまたは異なるベクター上に存在する配列によってコードされるもの）のインビトロ転写は、たとえば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて行うことができる。この場合、ベクターは、Ｔ７プロモータに機能的に連結した適切なコード配列を含み得る。インビトロ転写されたＲＮＡを、実施形態において、ＲＮＡｉをもたらす大きさに（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ ＩＩＩを用いて）インビトロ処理してよい。センス及びアンチセンスの転写産物を組み合わせて、ＲＮＡ二重鎖を形成し、これを目的の標的細胞に導入する。ｓｉＲＮＡ様分子に処理可能な小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現する、他のベクターを使用してもよい。ベクターを用いる各種方法及びかかるベクターをインビトロまたはインビボ（たとえば、遺伝子治療）のいずれかで細胞に導入するための各種方法は、当技術分野において知られている。

【0075】

したがって、一実施形態において、目的のポリペプチド（Ｓｅｍａ３ＡまたはＮｒｐ−１）をコードする核酸またはその断片の発現は、目的のポリペプチド（たとえば、ミオスタチン）をコードする核酸もしくはその断片、またはこれらに相同の核酸に対応するｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ様分子を細胞に導入すること、または細胞内で生成させることによって阻害することができる。「ｓｉＲＮＡ様分子」は、ｓｉＲＮＡに類似し（たとえば、大きさ及び構造）、ｓｉＲＮＡ活性を惹起できる（すなわち、ＲＮＡｉを介した発現阻害をもたらす）核酸分子を指す。各種実施形態において、このような方法には、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子の細胞への直接投与、または上述のベクターを使用する方法の利用が含まれ得る。一実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は約３０未満のヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、約２１〜２３のヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、１９〜２１塩基対の二重鎖部分を含み、各鎖は３’に突出した２ヌクレオチドを有する。実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、目的のポリペプチドをコードする核酸またはその断片もしくは変異体（または変異体の断片）と実質的に同一である。このような変異体は、目的のポリペプチドに類似した活性を有するタンパク質をコードすることができる。

【0076】

細胞内でのｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ発現を得るために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス及びレンチウイルスを含む、各種のウイルスベクターを使用することができる。アデノ随伴ウイルス及びアデノウイルスを用いる場合、ゲノムはエピソームとして存在する。これは、挿入変異が回避されるので、利点である。不利な点は、細胞が非常にゆっくり分裂しない限り、細胞の子孫が細胞分裂によってウイルスをすぐに失うことである。ＡＡＶは、ウイルス遺伝子が除去され、パッケージング能力が小さくなっている点で、アデノウイルスとは異なる。レンチウイルスは、転写活性のあるクロマチン部分に組み込むため、子孫細胞に受け継がれる。この方法では挿入変異のリスクが上がるが、インテグラーゼ欠損レンチウイルスを使用することによってこのリスクを軽減することができる。
医薬組成物

【0077】

本発明のＳｅｍａ３Ａ阻害剤は、単独でまたは医薬組成物として、ヒト対象に投与することができる。医薬組成物の場合、血管透過性亢進、非増殖性網膜症、網膜腫脹または黄斑浮腫及び関連症状を治療または予防する用量で、適切な担体または賦形剤と混合する。これら化合物の混合物もまた、単純な混合物として、または適切に配合された医薬組成物の状態で、対象に投与することができる。さらに治療的有効量とは、黄斑浮腫及び／または関連症状（点状またはぼやけた視界、Ｓｅｍａ３Ａ関連透過性亢進、浮腫、網膜腫脹及び／または血液網膜関門漏出）の予防または治療をもたらすのに十分な化合物の量を指す。本出願の化合物の製剤技術及び投与技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ中に認めることができる。
投与経路

【0078】

好適な投与経路は、たとえば、全身、経口、経眼（点眼薬または眼内注射）を含み得る。好ましい投与経路は、点眼薬及び眼内注射を含む。製剤はまた、持続放出性製剤の形態であってよい。

【0079】

さらに、標的指向性薬物送達システム、たとえば、内皮細胞または細胞に特異的な抗体をコーティングしたリポソームで、薬剤を投与してもよい。
組成物／製剤

【0080】

したがって、本発明に従った使用のための医薬組成物は、活性化合物の薬学的に使用可能な調剤への加工を容易にする賦形剤及び助剤を含む、１つ以上の生理学的に許容可能な担体を使用して従来の方法で製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路による。注射の場合、本発明の薬剤を、水溶液、好ましくは生理学的に適合性のある緩衝液、たとえばＨａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、または生理食塩水で調製してよい。

【0081】

眼投与の場合、活性化合物と、当該技術分野においてよく知られている眼投与に適した薬学的に許容可能な担体とを組み合わせることにより化合物を容易に調製することができる。

【0082】

化合物は、眼投与用、たとえば、点眼薬または眼内注射ボーラス注入用に製剤化できる。注射用の製剤は、単位剤形、たとえばアンプル、または防腐剤を添加したバイアルで提供してよい。組成物は、懸濁液、溶液または油性もしくは水性媒体中の乳濁液などの形態を取ることができ、懸濁剤、安定化剤及び／または分散剤などの調合剤を含み得る。

【0083】

あるいは、医薬化合物のための他のデリバリーシステムを採用することもできる。リポソーム及びエマルジョンが疎水性薬剤の送達媒体または担体のよく知られている例である。
有効用量

【0084】

本発明での使用に適した医薬組成物には、活性成分がその使用目的を達成するのに有効な量で含まれた組成物が挙げられる。より具体的には、治療的有効量は、治療対象の既存の症状の進行防止または緩和に有効な量を意味する。有効量の決定は、当業者であれば適切に行うことができる。

【0085】

有効量の化合物は、Ｓｅｍａ３Ａの細胞シグナル伝達機能を阻害し、大きな副作用を生じることなく、血管透過性亢進及び血液網膜関門漏出を十分に低減または予防する。こうした活性を有する化合物は、Ｓｅｍａ３Ａ阻害剤の用量依存阻害を決定するインビトロアッセイで特定することができる。

【0086】

本発明の方法で使用される化合物に関する治療的有効量は、初めに細胞アッセイから推定することができる。たとえば、細胞及び動物モデルにおいて、細胞アッセイで決定されたＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するように、用量を配合することができる（すなわち、通常、ＩＩ−１βなどの炎症メディエータ、または低酸素、虚血、細胞ストレス、ＥＲストレスなどの他の活性化刺激に対して、Ｓｅｍａ３Ａの細胞シグナル伝達機能の半数阻害を達成する試験化合物の濃度）。

【0087】

治療的有効量は、対象の症状に改善をもたらす化合物の量を指す。同様に、予防的有効量は、患者の症状（たとえば、Ｓｅｍａ３Ａ誘発性血管透過性亢進、点状及び／またはぼやけた視界、周皮細胞損失、黄斑浮腫、網膜腫脹、血液網膜関門漏出など）の予防または遅延に必要な量を指す。当該化合物の毒性及び治療有効性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法、たとえば、最大耐性量（ＭＴＤ）及びＥＤ（最大反応５０％の有効量）を求めることによって決定することができる。毒性と治療有効性との用量比は、治療指数であり、ＭＴＤとＥＤ５０の比率で表される。治療指数の高い化合物が好ましい。的確な製剤、投与経路及び用量は、患者の状態を鑑み、個々の医師によって決定され得る。

【0088】

投与の用量及び間隔は、Ｓｅｍａ３Ａ調節効果を維持するのに十分な活性化合物のレベル、または最小有効濃度（ＭＥＣ）をもたらすために、個々に調整してよい。ＭＥＣは、化合物ごとに変動し得るが、インビトロデータ、たとえば、Ｓｅｍａ３Ａ発現または活性（たとえば、Ｎｒｐ−１受容体への結合）の実質的な阻害を達成するのに必要な濃度から推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個人の特徴及び投与経路に左右される。

【0089】

組成物の投与量は、当然のことながら、治療対象、対象の体重、疾患の重症度、投与方法及び処方医師の判断によって変更し得る。
パッケージ

【0090】

組成物は、所望であれば、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサ装置で提供することができる。パックまたはディスペンサ装置には、投与に関する説明書が添付されてよい。また、薬学的に適合する担体中に配合した本発明の化合物を含む組成物を調製し、適切な容器中に入れ、指定疾患の治療に関するラベルを付けることもできる。ラベル上に示す適切な疾患には、糖尿病黄斑浮腫及び加齢黄斑浮腫などの黄斑浮腫、網膜血管透過性亢進、血液網膜関門の漏出などの予防及び治療が含まれ得る。
スクリーニングアッセイ

【0091】

Ｓｅｍａ３Ａ活性の上昇とＢＲＢ漏出及び網膜血管透過性亢進との関連が証明されているので、本発明は、網膜血管透過性亢進（たとえば、非増殖性糖尿病網膜症及び黄斑浮腫など）の予防または治療に有用な化合物を特定するために使用されるスクリーニングアッセイにおける標的としてのＳｅｍａ３Ａの使用に関する。当該方法は、
（ａ）Ｓｅｍａ３Ａの核酸もしくはＳｅｍａ３Ａをコードしたポリペプチドの発現レベル、
（ｂ）Ｓｅｍａ３Ａの活性レベル、
（ｃ）Ｓｅｍａ３Ａ活性によって生じた分子のレベル、または
（ｄ）（ａ）から（ｃ）の任意の組み合わせ
が、試験化合物が存在しない場合と比較して、前記試験化合物の存在下で減少するかどうかを決定することを含む。この減少は、当該試験化合物が網膜血管透過性亢進の予防及び治療に有用である可能性を示すものである。一実施形態において、上述の方法は、インビトロ法である。一実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａ活性は、Ｓｅｍａ３ＡのＮｒｐ−１受容体への結合である。さらなる実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａ活性は、血管透過性の増加である。

【0092】

本発明の別の実施形態において、Ｓｅｍａ３Ａ発現を調節する薬剤を選択するためのレポータアッセイ方法が提供される。当該方法は、適切なレポータ遺伝子と機能的に結合させたＳｅｍａ３Ａ転写制御配列を含有する核酸配列を含む細胞を提供することを含む。この細胞をＳｅｍａ３Ａ発現に作用すると推定される薬剤（たとえば、試験／候補化合物）に曝露し、レポータ遺伝子の活性によって転写効率を測定する。次いで、この活性と、当該薬剤に曝露していない細胞のレポータ遺伝子の活性とを比較することができる。適切なレポータ遺伝子には、ベータ（β）−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0093】

したがって、本発明はさらに、網膜血管透過性亢進を治療または予防するための化合物を特定または特徴付けるための方法を提供する。当該方法は、（ａ）試験化合物を、レポータタンパク質をコードすることができるレポータ遺伝子を含有する第２の核酸と機能的に連結させた、Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子に通常関連した転写調節エレメント（たとえば、Ｓｅｍａ３Ａ遺伝子に天然に関連したプロモータ領域）を含有する第１の核酸を含む細胞に接触させること、及び（ｂ）レポータ遺伝子の発現またはレポータタンパク質の活性が試験化合物の存在下で減少するかどうかを決定することを含む。レポータ遺伝子の発現またはレポータタンパク質の活性の減少は、当該試験化合物が網膜血管透過性亢進（たとえば、非増殖性糖尿病網膜症または黄斑浮腫における網膜腫脹）の治療または予防に使用できる可能性を示す。一実施形態において、上述の方法は、インビトロ法である。

【0094】

上記のアッセイは、単一の試験化合物、または当該化合物の複数もしくは「ライブラリ」（たとえば、コンビナトリアルライブラリ）に適用してもよい。任意の当該化合物を主要化合物として利用して、肥満及び／または肥満関連高血圧症の予防及び治療向けに、さらに変更を加えて、その治療的、予防的及び／または薬理学的特性を改良することができる。

【0095】

こうしたアッセイシステムは、有用なアッセイ条件を実現し、最適化する種々の手段を含み得る。このような手段には、たとえば、ｐＨ及びイオン強度の調整、及び最適なＳｅｍａ３Ａ活性及び安定性に必要な任意の成分（たとえば、プロテアーゼ阻害剤）を供給するのに適した緩衝溶液、最適なＳｅｍａ３Ａ活性及び／または安定性のための温度制御手段、ならびにＳｅｍａ３ＡとＮｒｐ−１の相互作用を検出できる検出手段が挙げられるが、これらに限定されない。かかる検出手段には種々の検出手段を使用することができ、たとえば、放射標識（たとえば、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^３Ｈ）、抗体による検出、蛍光、化学発光、分光の各方法（たとえば、分光的性質を変更した産物の生成）、各種レポータ酵素またはレポータタンパク質（たとえば、セイヨウワサビ ペルオキシダーゼ、緑色蛍光タンパク質）、特異的結合試薬（たとえば、ビオチン／ストレプトアビジン）などの１つまたはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0096】

アッセイは、自然単離したＳｅｍａ３Ａまたは組換え生成したＳｅｍａ３Ａを含み得るＳｅｍａ３Ａの供給源を用いて、未精製のものから純粋なものにわたる各種調製物中で、インビトロで実施することができる。組換えＳｅｍａ３Ａは、多数の原核細胞または真核細胞の発現系で産生することができ、Ｓｅｍａ３Ａの組換え発現に関しては当該技術分野においてよく知られている（たとえば、Ｍａｒｔｉｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ５３（４）：２９６−３０６参照）。当該アッセイは、アレイ形式で実施してもよい。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のアッセイ工程が自動化される。

【0097】

また、活性を保持した（たとえば、Ｎｒｐ−１受容体に結合する）Ｓｅｍａ３Ａのホモログ、変異体及び／または断片も本発明のスクリーニング方法に使用することができる。ホモログには、完全長Ｓｅｍａ３Ａのアミノ酸配列と実質的に同一であるタンパク質配列（たとえば、図１）、またはＳｅｍａ３Ａと構造的及び機能的にかなりの相同性を有する成熟断片が挙げられる。変異体には、任意の修飾及び／またはアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（たとえば、別のポリペプチドとの融合）の点でＳｅｍａ３Ａと異なるタンパク質またはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。修飾は、ポリペプチド骨格（すなわち、アミノ酸配列）、アミノ酸側鎖及びアミノ末端またはカルボキシ末端を含むいずれの部分にも生じ得る。こうした置換、欠失または付加は、１つ以上のアミノ酸に関係し得る。断片には、Ｓｅｍａ３Ａの断片もしくは一部、またはＳｅｍａ３Ａ活性を保持した（すなわち、Ｎｒｐ−１受容体に結合し、血管透過性亢進を引き起こす）Ｓｅｍａ３Ａのホモログもしくは変異体の断片もしくは一部が挙げられる。

【実施例】

【0098】

実施例１
材料及び方法
ヒト試料
Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ−Ｒｏｓｅｍｏｎｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＨＭＲ）倫理委員会によるヒト臨床試験実施要項及び同意説明文書の承認、ならびにＴ１ＤＭ罹患患者からの局所硝子体生検標本を得るための患者募集。
動物

【0099】

すべての研究は、視覚と眼科学研究協会会議（ＡＲＶＯ）の眼科視覚研究における動物使用に関する文書に従って実施し、カナダ動物管理協会の合意を得たモントリオール大学動物保護委員会による承認を受けた。Ｃ５７ＢI／６野生型は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。タモキシフェン誘導（Ｔａｍ誘導）Ｃｒｅマウス（Ｔｇ^{Ｃｒｅ−Ｅｓｒ１}；ｎｏ．００４６８２）及びニューロピリン１ｆｌｏｘマウス（Ｎｒｐ１^{ｔｍ２Ｄｄｇ}／Ｊ；ｎｏ．００５２４７）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）マウスモデル

【0100】

６〜７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの体重を測り、基準血糖を測定した（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ，Ｒｏｃｈｅ）。マウスにストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｅｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）を５５ｍｇ／ｋｇで続けて５日間、腹腔内注入した。同齢の対照には緩衝液のみを注入した。最後のＳＴＺ注入から１週間後に血糖を再度測定し、非絶食状態での血糖が１７ｍＭ（３００ｍｇ／ｄＬ）より高いマウスを糖尿病とみなした。
リアルタイムＰＣＲ分析

【0101】

ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＲＮＡを単離し、ゲノムＤＮＡの増殖を防ぐためにＤＮａｓｅ Ｉで消化した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いて逆転写を実施し、ＡＢＩ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）リアルタイムＰＣＲ装置のＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（商標）を用いて遺伝子発現を解析した。βアクチンを標準遺伝子として用いた。
レーザマイクロダイセクション

【0102】

Ｐ１４のＯＩＲ（酸素誘発性網膜症）の仔動物または正常酸素圧の同腹仔から眼球を摘出し、ＯＣＴで急速凍結した。Ｌｅｉｃａクリオスタットを用いて−２０℃で１２μｍ片に切断し、１０分間空気乾燥した。レーザマイクロダイセクション用Ｐａｌｍ ＭｉｃｒｏＢｅａｍ（商標）装置を備えたＺｅｉｓｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ顕微鏡を用いて網膜層を切断した。これらの切片からｍＲＮＡを単離し、ｑＰＣＲを上述の通り実施した。
ウエスタンブロット法

【0103】

網膜のタンパク質レベルを評価するために、様々な時点で眼球を摘出し、迅速に切断し、網膜を均質化した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｓｉｇｍａ）によって評価し、次いで、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって各状態について３０ｕｇのタンパク質を分析した。ウエスタンブロット法に使用した抗体は、Ｎｒｐ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＡＦ５６６）、ｐＶＥ−カドヘリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃４４１１４５Ｇ）、Ｓｒｃ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃２１０８）、ｐＳＲＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃２１０１）、ＦＡＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３２８５）、ｐＦＡＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３２８１）、ｂ−アクチン（Ｓｉｇｍａ，＃Ａ２２２８）、Ｓｅｍａ３Ａ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，＃ｓｃ−１１４８またはＡＢＣＡＭ ＃ａｂ２３３９３）である。
免疫組織化学

【0104】

タンパク質発現の箇所を特定するために、マウスから眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に室温で４時間固定し、３０％スクロース中で一晩インキュベートしてから、ＯＣＴコンパウンドで凍結した。次いで、眼球全体をＯＣＴコンパウンド（ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で−２０℃にて包埋し、１２ｕｍの連続切片にした。免疫組織化学実験を行い、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ（商標））または共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ｃｏｎｆｏｃａｌ ＦＶ１０００）を用いて切片を視覚化した。免疫組織化学に用いた抗体は、Ｓｅｍａ３Ａ（ＡＢＣＡＭ ＃ａｂ２３３９３）、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）（ＡＢＭＣＡ，＃ａｂ７８１７）及びβＩＩＩ−チューブリン（ＥＣＭ）である。二次抗体は、Ａｌｅｘａ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ａ１１００５）及びＡｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ａ１１００８）である。

【0105】

網膜全体の血管構造を視覚化するために、網膜血管構造に対して、１ｍＭ ＣａＣｌ_２のＰＢＳ中の蛍光標識したイソレクチンＢ４（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４−Ｉ２１４１３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてフラットマウント網膜を染色した。血管透過性を評価するために（エバンスブルー（ＥＢ）透過を参照）、ＥＢ注入の２時間後に、マウスの硝子体にビヒクルとＶＥＧＦを注入し、眼球を摘出し、網膜をフラットマウントのために切断するか、または凍結切片及び蛍光顕微鏡下での視覚化のために処理した。
レンチウイルスの調製

【0106】

以前の記述の通り^４０、レンチベクターとパッケージングベクターとをＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトすることにより、伝染性レンチウイルスベクターを作製した。ウイルス上清を超遠心分離（＞５００倍）で濃縮し、ウイルスのｐ２４抗原についての力価を市販のキットを用いて（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）ＥＬＩＳＡにより決定した。
可溶性組換えＮＲＰ１及びマウス抗ＶＥＧＦ

【0107】

ＳＴＺで処理した糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＳＴＺ投与から６週及び７週後に、プラスミド（Ｍａｍｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２００２^１７）またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得たｒｍＮＲＰ1を硝子体内へ注入した。マウス特異的抗ＶＥＧＦをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＦ−４９３−ＮＡ）から購入し、１μｌを８０ｕｇ／ｍＬで注入した。網膜のエバンスブルー透過アッセイを上述の通りにＳＴＺ処置から８週間後に行った。
統計的分析

【0108】

データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で表す。異なる群を比較するために、必要に応じて、スチューデントのＴ検定及びＡＮＯＶＡを用いた。Ｐ＜０．０５であれば、統計的に差異があるとみなした。
実施例２
糖尿病網膜症に罹患しているヒト患者硝子体におけるＳｅｍａ３Ａの上昇

【0109】

ＤＲにて観察される浮腫表現型の発生におけるＳｅｍａ３Ａの潜在的役割を評価するために、まず、ＤＭＥ罹患患者の硝子体内におけるこの細胞誘導信号の存在を決定することにした。標準的な硝子体手術中に８人の患者から硝子体を採取した。黄斑円孔（ＭＨ）または網膜上膜（ＥＲＭ）の手術を実施して、５つの標本をＤＭＥに罹患しているＴ１ＤＭ患者から取得し、３つの標本を対照患者（血管異常なし）から得た。

【0110】

ウエスタンブロット分析では、ＤＭＥ罹患患者でＳｅｍａ３Ａの前駆型（約１２５ｋＤａ）と活性型（約９５ｋＤａ）の両方が強く誘発されているのがわかった（図１ａ、ｂ）。予想されるＤＭＥでの役割と一致して、ＥＬＩＳＡによるＳｅｍａ３Ａ検知でも、ＤＭＥ罹患患者の硝子体では、眼血管病変のない場合と比較して大幅な増加がみられた（対照中央値３．７９ｎｇ／ｍｌ［四分位数間範囲｛ＩＱＲ｝：２５％、７５％：２．０８ｎｇ／ｍｌ、５．５８ｎｇ／ｍｌ］；ＤＭＥ中央値１６．２７ｎｇ／ｍｌ［ＩＱＲ：２５％、７５％：５．７７０ｎｇ／ｍｌ、３５．３６ｎｇ／ｍｌ］；ｐ＝０．０４６４）（データ不図示）。スペクトルドメイン光干渉断層計（ＯＣＴ）を実施して、三次元（３Ｄ）マップを作成し、網膜損傷及び浮腫の程度を評価した。対照とは異なり、サンプリングしたＤＭＥ患者にはかなりの網膜腫脹が、特に、図１ｃ、ｄに示すように、黄斑及び黄斑周辺の領域にみられた。ＤＭＥ患者の特徴の詳細を図１ｅに示す。

【0111】

これらのデータは、糖尿病誘発性網膜血管障害との関係におけるＳｅｍａ３Ａの役割を調査する裏づけを提供するものである。
実施例３
ストレプトゾトシン誘発糖尿病の初期段階における神経性Ｓｅｍａ３Ａの上方制御

【0112】

ＤＭＥ患者の硝子体内におけるＳｅｍａ３Ａのレベル上昇を考慮し、出願人は、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）のマウスモデルでのＳｅｍａ３Ａ発現の動態とパターンを解明することにした。６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を連続５日間にわたって投与し、図２ａに示すスキームに従って血糖を観察した。非絶食状態での血糖が１７ｍＭ（３００ｍｇ／ｄＬ）より高いマウスを糖尿病とみなした。

【0113】

糖尿病の誘発から４週間という早い時点で、ビヒクルを注入した対照と比較して、ＳＴＺ処置マウスの網膜内Ｓｅｍａ３Ａレベルが２倍を超えて高くなった（ｐ＝０．００４５、ｎ＝５）。網膜内Ｓｅｍａ３Ａレベルは、８週（Ｓｅｍａ３Ａ、２．８０±０．３４０；ｐ＝０．００１１；ＶＥＧＦ、１．２３６±０．１９３；ｐ＝０．２６６、ｎ＝８）、１２週（Ｓｅｍａ３Ａ、４．０７±０．７９８；ｐ＝０．００８４６；ＶＥＧＦ、０．９２３±０．１４５；ｐ＝０．６１２、ｎ＝４）及び１４週（Ｓｅｍａ３Ａ、２．４４±０．５９３；ｐ＝０．０３３４；ＶＥＧＦ、３．２６±０．６５；ｐ＝０．０２５３、ｎ＝３）で、有意に高い状態が継続した。重要なことは、疾患の初期時点（４〜１２週）を通して、これまでに記載されている通り^２４、ＳＴＺ処置マウスのＶＥＧＦレベルが、ビヒクル処置同種マウスで観察されたＶＥＧＦレベルと類似のレベルを維持したことである（図２ｂ）。すべての分析時点で、ＳＴＺ処置マウスは、約３０ｍＭの血糖レベルの病的な上昇がみられた（図２ｄ；糖尿病８週及び４週の両方においてｐ＜０．０００１）。重要なことは、Ｓｅｍａ３Ａの発現上昇が初期事象であり、ＳＴＺ処置マウスとビヒクル処置マウスとの両方が類似の平滑筋アクチン（ＳＭＡ、図２ｃ）レベルを示したように、周皮細胞の損失より先に生じたことである。同様に、密着結合要素であるオクルディン及びクローディン−５の発現レベルが８週の初期でわずかに変化した（図２ｅ）。最後に、ＳＴＺ処置マウスとビヒクル処置マウスの両方で、周皮細胞マーカである血小板由来成長因子受容体−ｂ（Ｐｄｇｆｒ−ｂ；１．４７７±０．３６４；ｐ＝０．２１９、ｎ＝１１）、ＮＧ２プロテオグリカン（Ｎｇ２；２．０６５±０．８８６；ｐ＝０．３１６、ｎ＝４）またはアルファ平滑筋アクチン（ａ−Ｓｍａ；１．３４２±０．４４１；ｐ＝０．４９４、ｎ＝４）の転写レベルに有意な差異はみられなかった。
実施例４
糖尿病網膜症における役割と地図的に一致するＳｅｍａ３Ａの発現パターン

【0114】

次に、出願人は、糖尿病網膜内のＳｅｍａ３Ａの細胞源を特定することにした。網膜凍結切片の免疫組織化学により、Ｓｅｍａ３Ａが神経節細胞層（ＧＣＬ及び内顆粒層（ＩＮＬ））の網膜ニューロンによって強く発現されていることがわかった（図２ｆ、ｇ）。最も顕著な発現は、ＲＧＣマーカのβＩＩＩ−チューブリンとの共局在化により示すように、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）において認められた。Ｓｅｍａ３Ａの網膜免疫局在化と一致して、健常マウス及び糖尿病マウスから得た網膜層のレーザマイクロダイセクションに続く定量ＲＴ−ＰＣＲも、Ｓｅｍａ３Ａが血管床にごく近接したニューロンに位置することを正確に示した（図２ｈ）。
実施例５
Ｓｅｍａ３Ａによる網膜バリア機能の弱体化

【0115】

糖尿病の網膜内Ｓｅｍａ３Ａのレベル上昇が観察されたことを受け、出願人は、血管バリア機能を破綻させるＳｅｍａ３Ａの性質に関する調査を進めた。Ｓｅｍａ３Ａの硝子体内注入により、エバンスブルー（ＥＢ）透過によって決定した網膜血管透過性が約２倍上昇した（図３ａ；ｐ＜０．０１）。この上昇は、ＶＥＧＦの硝子体内投与（図３ａ；ｐ＜０．０５）またはＳｅｍａ３ＡとＶＥＧＦの両方の組み合わせ（図３ａ；ｐ＜０．０１）で観察されたものと類似した。図３ｂは、ビヒクル、ＶＥＧＦ及びＳｅｍａ３Ａを注入した網膜断片の共焦点画像であり、代表的なＥＢ漏出パターンの上昇を示す。内皮細胞のバリア機能を弱めるＳｅｍａ３Ａの能力をさらに調べるために、出願人は、経内皮電気抵抗のリアルタイム分析を行った。健全な内皮単層をＳｅｍａ３Ａで処置すると、添加後の最初の６時間では、ＶＥＧＦのほうがより低かったが、同様の程度でバリア機能が低下した（図３ｃ）。

【0116】

次に、出願人は、血管透過性を促進することが知られているシグナル経路をＳｅｍａ３Ａが活性化することを確認した。この点に関し、出願人は、ウエスタンブロット分析を用いて、内皮細胞の密着結合を緩めさせる^{２５−２８}、細胞外シグナルを伝達することが知られているＳｒｃキナーゼ及び接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）の活性化プロファイルを調べた。Ｓｅｍａ３ＡまたはＶＥＧＦのいずれかによるヒト網膜毛細血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）の刺激は、酵素活性を促進することが報告されている^２９、キナーゼドメインの活性化ループのＴｙｒ４１６でＳｒｃの強いリン酸化反応をもたらす。さらに、ＦＡＫもＴｙｒ５７６及び５７７でリン酸化された（Ｓｒｃキナーゼに関する部位）。最終的に、それぞれ、密着結合タンパク質ＶＥカドヘリンはチロシン７３１でリン酸化された（血管透過性の上昇に関係する部位^{３０−３２}）（図３ｄ）。網膜透過性に関する上記データ（図３ａ）と一致して、Ｓｅｍａ３ＡとＶＥＧＦとを組み合わせて刺激を行った場合には、付加的な影響も作用の増加も観察されなかった。これは、両方の因子が冗長な経路を介してシグナルを伝達することを示唆している（図３ｄ）。ＶＥ−カドヘリンのウエスタンブロット分析（図３ｄ）によれば、Ｓｅｍａ３ＡまたはＶＥＧＦを注入したフラットマウント網膜では、レクチン染色した網膜血管との共局在において、ビヒクル注入網膜に比べて、Ｙ７３１（矢印）でのＶＥ−カドヘリンのリン酸化反応が高かった（図３ｇ）。同様に、ＳＴＺ注入マウス及びビヒクル注入マウスから得たフラットマウント網膜では、網膜血管との共局在により、ＶＥ−カドヘリンのリン酸化反応がみられた（図３ｈ）。

【0117】

バリア機能を破綻させる役割と一致して、Ｓｅｍａ３Ａで処置したＨＲＭＥＣの共焦点顕微鏡では、ＶＥ−カドヘリン及びファロイジン染色によって決定された血管退縮線維の顕著な形成が認められた（白色矢印；図３ｆ）。観察された退縮は、ＶＥＧＦ単独またはＶＥＧＦとＳｅｍａ３Ａの組み合わせの場合と類似した。重要なことは、即時検査（１００〜２００ｕＭ）で使用した用量では、Ｓｅｍａ３Ａが、カスパーゼ−３の活性化の評価によって決定されたように、細胞死またはアポトーシスを誘導しなかったことである（図３ｉ）。これらのデータは、Ｓｅｍａ３Ａの網膜血管透過性への直接作用を際立たせるものである。
実施例６
ニューロン誘導性Ｓｅｍａ３Ａの阻害によるＴ１ＤＭの血管透過性の効果的な減少

【0118】

近年の研究によれば、網膜ニューロンが灌流する血管に重要な影響を与える可能性があることが示されている^{１４，３３−３５}。出願人は、ＲＧＣ及びＩＮＬにおけるＳｅｍａ３Ａの強力な発現ならびに血管漏出を促進する能力を鑑み、この細胞誘導信号の産生をこれらの細胞集団で直接阻害しようとした。ＲＧＣまたはＩＮＬのニューロンでＳｅｍａ３Ａの産生をインビトロで特異的に阻害するために、Ｓｅｍａ３Ａに対するｓｈＲＮＡを保持するレンチウイルス（Ｌｖ）ベクターを作製した（ＴＴＡＴＴＴＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＧＧＧ−配列番号１１）。ＶＳＶＧカプシドを有するこれらのＬｖベクターは、硝子体内に導入されると、ＲＧＣ及びＯＮＬ細胞に高い親和性を呈する^{１４，３５}（図４ａ）。ＳＴＺ処置マウスが５６．８％の透過性増加を示すのに対し（図４ｂ；ｐ＜０．０５、ｎ＝４）、糖尿病の５週でＬｖ．ｓｈＳｅｍａ３Ａを単回硝子体内注入した場合は、網膜内のＳｅｍａ３Ａ発現が有意に６２．３％減少し（図４ｃ；ｐ＜０．００５、ｎ＝３）、血管漏出も比例して４９．５％の減少となった（図４ｄ；ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。したがって、糖尿病マウスにおいてＳｅｍａ３Ａが最も多量に発現したＧＣＬ及びＩＮＬのニューロンのＳｅｍａ３Ａ発現（図２ｆ〜ｈ）を直接標的にすることで、病的な血管漏出が効果的に減少した。
実施例７
Ｓｅｍａ３Ａの硝子体内中和による網膜血管透過性の減少

【0119】

硝子体内のＳｅｍａ３Ａを中和するために、Ｓｅｍａ３ＡとＶＥＧＦの両方の二価トラップとして、組換え（ｒ）可溶性Ｎｒｐ−１を使用した。ニューロピリン−１は、細胞外ドメインが別個のサブドメインにさらに分割された一回膜貫通型受容体であり、セマフォリンの結合するａ１ａ２サブドメインと、ＶＥＧＦの結合するｂ１ｂ２サブドメインがある^３６（図４ｅ）。糖尿病誘発から６週及び７週に、ＳＴＺマウスに対してｒＮｒｐ−１を硝子体内注入すると、糖尿病の８週で測定された網膜透過性が４８．１％減少した（図４ｆ；ｐ＜０．０５、ｎ＝５）。これはＳｅｍａ３Ａの遺伝子サイレンシングによって観察された減少と類似の大きさであった（図４ｄ）。重要なことは、マウスＶＥＧＦ_１６４の中和抗体を用いたＶＥＧＦの中和が、糖尿病の初期段階における血管透過性の減少に効果的でなかったことである（ビヒクル対抗ＶＥＧＦ：０．９７５±０．０７０７；Ｐ＝０．７３０２／／ｒｍＮＲＰ1対抗ｍＶＥＧＦ：Ｐ＝０．０３５、ｎ＝５、マウス計１４匹を用いた個々の実験）。これは、初期時点（８週）の糖尿病網膜において、Ｓｅｍａ３Ａが強力に誘発されるのに対し（図２ｂ）、ＶＥＧＦは上昇しないという事実に起因すると思われる。また、これらのデータは、糖尿病網膜におけるＳＥＭＡ３Ａの中和が血管性浮腫の低減に効果的な手法であることを示している。
実施例８
Ｎｒｐ−１条件付きノックアウトマウスでのＳｅｍａ３Ａ誘発性網膜バリア機能破綻の阻害

【0120】

Ｎｒｐ−１がＳｅｍａ３Ａの受容体であることを鑑み、出願人は、Ｎｒｐ−１ノックアウトがＳｅｍａ３Ａ誘発性血管透過性を防止するかどうかを決定することにした。Ｎｒｐ−１欠失の全生殖細胞系列が胎生致死であるため^{３７−３９}、Ｎｒｐ−１のエクソン２の欠失を誘導するために、全個体のタモキシフェン誘導（Ｔａｍ誘導）Ｃｒｅマウス（Ｔｇ^{Ｃｒｅ−Ｅｓｒ１}）を作製した。Ｎｒｐ−１遺伝子座のＣｒｅ組換えを検証し、かつＮｒｐ−１の破壊をインビボで確認するために、Ｔｇ^{Ｃｒｅ−Ｅｓｒ１}；Ｎｒｐ１^{ｆｌ／ｆｌ}マウス（ｉＫＯ）及び同腹仔にＴａｍまたはビヒクル（Ｖｅｈ）を６週齢で投与した。連続５日間にわたるＴａｍの全身投与により、ウエスタンブロット（図５ａ）及びｑＰＣＲ（図５ｂ：Ｐ＝０．００１２）によって決定されたように、血管系に十分なＮｒｐ−１ノックアウトがもたらされ、網膜血管のＮＲＰ１はほぼ完全に近い欠如となった（図示しない網膜凍結切片の免疫蛍光法による評価）。重要なことは、Ｔａｍで処置したｉＫＯ（ＴａｍｉＫＯ）マウスは、週齢４〜２０の同腹仔と比較して、体重、大きさまたはオープンフィールド行動に差異がなかったことである（データ不図示）。予期した通り、Ｎｒｐ−１が破壊されたＴａｍ処置ＴｇＣｒｅ−Ｅｓｒ１；Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌマウスは、Ｓｅｍａ３Ａの硝子体内注入後、Ｓｅｍａ３ａ誘発性血管透過性を防止した（１．２７６±０．２９０１；Ｐ＝０．３６；ｎ＝７、マウス２１匹を用いた個別実験）（図５ｃ；一方、対照のＴａｍ処置ＴｇＣｒｅ−ＥＳＲ１／Ｎｒｐ１＋／＋マウスではＳｅｍａ３Ａに応じた血管漏出が３倍高い（２．９７２±０．２０４５；Ｐ＝０．０００６５；ｎ＝３、マウス計９匹を用いた個別実験）。逆に、Ｎｒｐ１の破壊は、ＶＥＧＦ誘発性血管網膜透過性に影響を与えず（Ｔａｍ処置ＴｇＣｒｅ−Ｅｓｒ１／Ｎｒｐ１ｆｌ／ｆｌ−ビヒクル対ＶＥＧＦ：１．８１４±０．１１８８、Ｐ＝０．００２４、ｎ＝３、マウス計９匹を用いた個別実験；Ｔａｍ処置ＴｇＣｒｅ−Ｅｓｒ１／Ｎｒｐ１＋／＋−ビヒクル対ＶＥＧＦ：１．７８３＋０．２４４０；Ｐ＝０．０３２、ｎ＝３、マウス計９匹を用いた個別実験）（図５ｄ）、ＶＥＧＦ誘発性網膜血管透過性にはＮＲＰ１を要しないことを示している。これは、これまでの研究と一致する。ｓｈを用いたＮｒｐ１ノックダウンの有効性は、ｑＰＣＲで検証した（データ不図示）。まとめると、これらのデータは、Ｓｅｍａ３Ａによる内側血液網膜関門の機能破綻がＮＲＰ１に依存することを裏づけ、ＮＰＲ−１がＳｅｍａ３Ａによる黄斑浮腫の透過性亢進及び血液脳関門漏出を低減するための良好な標的であることを実証するものである。

【0121】

本発明の各種実施形態を本明細書にて開示したが、当業者の共通一般知識に従った多数の翻案及び変更が本発明の範囲内にて実施可能である。こうした変更には、実質的に同じ方法で同じ結果をもたらすために、本発明の任意の態様に対する既知の均等物の代替も含まれる。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、非限定的な用語として用いられ、「含むが、これらに限定されない」という語句と実質的に等価である。以下の実施例は、本発明の各種態様を例示するものであり、本明細書にて開示した本発明の広範な態様を限定するものではない。
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２１．Ｓｏｋｅｒ Ｓ，Ｍｉａｏ ＨＱ，Ｎｏｍｉ Ｍ，Ｔａｋａｓｈｉｍａ Ｓ，Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ Ｍ．ＶＥＧＦ１６５ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＶＥＧＦＲ−２ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅ ＶＥＧＦ１６５−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２；８５（２）：３５７−３６８．
２２．Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＢＡ，Ｗｕ Ｐ，Ｍａｌｏｎｅｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ／ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ａｎｄ ＶＥＧＦ ｂｉｎｄｉｎｇ．ＥＭＢＯ Ｊ．Ｎｏｖ ２８ ２００７；２６（２３）：４９０２−４９１２．
２３．Ｖｉｅｉｒａ ＪＭ，Ｓｃｈｗａｒｚ Ｑ，Ｒｕｈｒｂｅｒｇ Ｃ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ ｌｉｇａｎｄｓ ＶＥＧＦ１６４ ａｎｄ ＳＥＭＡ３Ａ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ．２００７；２８３：２３０−２３５；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ２３５−２４１．
２４．Ｍｉｍａ Ａ，Ｑｉ Ｗ，Ｈｉｒａｏｋａ−Ｙａｍｏｍｏｔｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｔｉｎａｌ ｎｏｔ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＶＥＧＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．Ｎｏｖ ２９ ２０１２．
２５．Ｃｈｅｎ ＸＬ，Ｎａｍ ＪＯ，Ｊｅａｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＶＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＦＡＫ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ．Ｊａｎ １７ ２０１２；２２（１）：１４６−１５７．
２６．Ｓｃｈｅｐｐｋｅ Ｌ，Ａｇｕｉｌａｒ Ｅ，Ｇａｒｉａｎｏ ＲＦ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｏｐｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＶＥＧＦＲ２／Ｓｒｃ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２００８；１１８（６）：２３３７．
２７．Ａｃｅｖｅｄｏ ＬＭ，Ｂａｒｉｌｌａｓ Ｓ，Ｗｅｉｓ ＳＭ，Ｇｏｔｈｅｒｔ ＪＲ，Ｃｈｅｒｅｓｈ ＤＡ．Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ＶＥＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｙｅｔ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ．２００８；１１１（５）：２６７４−２６８０．
２８．Ｅｌｉｃｅｉｒｉ ＢＰ，Ｐａｕｌ Ｒ，Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ ＰＬ，Ｈｏｏｄ ＪＤ，Ｌｅｎｇ Ｊ，Ｃｈｅｒｅｓｈ ＤＡ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｒｃ ｋｉｎａｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ＶＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ．１９９９；４（６）：９１５−９２４．
２９．Ｈｕｎｔｅｒ Ｔ．Ａ ｔａｉｌ ｏｆ ｔｗｏ ｓｒｃ’ｓ：ｍｕｔａｔｉｓ ｍｕｔａｎｄｉｓ．Ｃｅｌｌ．Ａｐｒ １０ １９８７；４９（１）：１−４．
３０．Ｐｏｔｔｅｒ ＭＤ，Ｂａｒｂｅｒｏ Ｓ，Ｃｈｅｒｅｓｈ ＤＡ．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｐ１２０− ａｎｄ ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔａｔｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｅｐ ９ ２００５；２８０（３６）：３１９０６−３１９１２．
３１．Ｃａｌａｌｂ ＭＢ，Ｐｏｌｔｅ ＴＲ，Ｈａｎｋｓ ＳＫ．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ ａｔ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ：ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｓｒｃ ｆａｍｉｌｙ ｋｉｎａｓｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｆｅｂ １９９５；１５（２）：９５４−９６３．
３２．Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ ＤＤ，Ｈａｎｋｓ ＳＫ，Ｈｕｎｔｅｒ Ｔ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅｒ Ｐ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ｒａｓ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ＧＲＢ２ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ．Ｄｅｃ ２２−２９ １９９４；３７２（６５０８）：７８６−７９１．
３３．Ｋｉｍ Ｊ，Ｏｈ ＷＪ，Ｇａｉａｎｏ Ｎ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｙ，Ｇｕ Ｃ．Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ｅ−Ｐｌｅｘｉｎ−Ｄ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＶＥＧＦ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｖｉａ ａ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．Ｊｕｌ １ ２０１１；２５（１３）：１３９９−１４１１．
３４．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｙ，Ｏｋａｄａ Ｍ，Ｋａｔａｏｋａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｍａ３Ｅ−ＰｌｅｘｉｎＤ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｄｉｓｏｒｉｅｎｔｅｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍａｙ ２ ２０１１；１２１（５）：１９７４−１９８５．
３５．Ｓａｐｉｅｈａ Ｐ，Ｓｉｒｉｎｙａｎ Ｍ，Ｈａｍｅｌ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＧＰＲ９１ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｈａｓ ａ ｍａｊｏｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００８；１４（１０）：１０６７−１０７６．
３６．Ｇｅｒｅｔｔｉ Ｅ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ａ，Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ Ｍ．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｇｏｖｅｒｎｓ ＶＥＧＦ ａｎｄ ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００８；１１（１）：３１−３９．
３７．Ｊｏｎｅｓ ＥＡ，Ｙｕａｎ Ｌ，Ｂｒｅａｎｔ Ｃ，Ｗａｔｔｓ ＲＪ，Ｅｉｃｈｍａｎｎ Ａ．Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ １ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ａｕｇ ２００８；１３５（１４）：２４７９−２４８８．
３８．Ｋｉｔｓｕｋａｗａ Ｔ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｍ，Ｓａｎｂｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ＩＩＩ／Ｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｒｅｐｕｌｓｉｖｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｐｌａｙ ａ ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｎｅｕｒｏｎ．Ｎｏｖ １９９７；１９（５）：９９５−１００５．
３９．Ｋａｗａｓａｋｉ Ｔ，Ｋｉｔｓｕｋａｗａ Ｔ，Ｂｅｋｋｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎｏｖ １９９９；１２６（２１）：４８９５−４９０２．
４０．Ｄｕｌｌ Ｔ，Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ，Ｋｅｌｌｙ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｈｉｒｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｎｏｖ １９９８；７２（１１）：８４６３−８４７１．
４１．Ａｎｔｉｐｅｎｋｏ Ａ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ−３Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ．Ｎｅｕｒｏｎ３９：５８９−５９８．
４２．Ｓｈｉｒｖａｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）．Ａｎｔｉ−ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒｅｓｃｕｅ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇａｎｇｌｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｏｐｔｉｃ Ｎｅｒｖｅ Ａｘｏｔｏｍｙ．ＪＢＣ２７７（５１）：４９７９９−４９８０７．

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]