特許 6440166 イムノクロマトキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6440166

(24)【登録日】2018年11月30日

(45)【発行日】2018年12月19日

(54)【発明の名称】イムノクロマトキット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20181210BHJP

   G01N 33/553 20060101ALI20181210BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 521

   G01N33/553

【請求項の数】4

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2015-64125(P2015-64125)

(22)【出願日】2015年3月26日

(65)【公開番号】特開2015-194495(P2015-194495A)

(43)【公開日】2015年11月5日

【審査請求日】2018年3月12日

(31)【優先権主張番号】特願2014-68683(P2014-68683)

(32)【優先日】2014年3月28日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 溝口 大剛、宮澤 雄太、室内 聖人、「銀ナノプレートを用いたマルチカラーセンシング技術」、プラズモニック化学研究会、ＮｅｗｓＬｅｔｔｅｒ、２０１４年度第１０号、平成２７年２月２８日、インターネット（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｓｍｏｎｉｃ−ｃｈｅｍ．ｎｅｔ／ＮＬ／ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ２０１４１０．ｐｄｆ）

(73)【特許権者】

【識別番号】000003322

【氏名又は名称】大日本塗料株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(74)【代理人】

【識別番号】100166338

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 正夫

(74)【代理人】

【識別番号】100152054

【弁理士】

【氏名又は名称】仲野 孝雅

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(72)【発明者】

【氏名】溝口 大剛

(72)【発明者】

【氏名】宮澤 雄太

(72)【発明者】

【氏名】三浦 佳子

【審査官】 西浦 昌哉

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−２２０７０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第４７８７９３８（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特開２００９−１９２２２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３７１５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２９４６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 GAO, C., et al.，Highly Stable Sliver Nanoplates for Surface Plasmon Resonance Biosensing，Angewandte Chemie International Edition，２０１２年 ６月，Vol. 51, No. 23，p. 5629-5633，ＵＲＬ，http://www.researchgate,net/publication/224836094_Highly_Stable_Sliver_Nanoplates_for_Surface_Plasmon_Resonance_Biosensing

【文献】 CUI, Y. et al.，Synthesis of AgcoreAushell Bimetallic Nanoparticles for Immunoassay Based on Surface-Enhanced Raman，The Journal of Physical Chemistry B，２００６年，Vol. 110, No. 9，p. 4002−4006，ＵＲＬ，http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp056203x

【文献】 Mohammad Mehdi Shahjamali et al.，Gold Coating of Silver Nanoprisms，Advanced Functional Materials，２０１２年 ２月２２日，Volume 22, Issue 4，p.849-854

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

プレート状銀ナノ粒子及び該プレート状銀ナノ粒子の表面を被覆する金からなる金属微粒子（ａ）と、被験物質に対して特異的な結合性を有し且つ該金属微粒子（ａ）に対して結合性を有する分子（ｂ）とを備えることを特徴とするイムノクロマトキット。

【請求項2】

イムノクロマト試験後に１種又は複数種の検出ラインを呈するクロマトグラフ担体を備えるイムノクロマトキットであって、
前記検出ラインの色は、１種の金属微粒子（ａ）の色又は異なる色を呈する複数種の金属微粒子（ａ）の混色に基づいていることを特徴とする請求項１に記載のイムノクロマトキット。

【請求項3】

イムノクロマト試験後に複数種の検出ラインを呈するクロマトグラフ担体を備えるイムノクロマトキットであって、
前記クロマトグラフ担体は、異なる被験物質に対して結合性を有する複数種の分子（ｂ）がそれぞれ異なる位置に固定されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のイムノクロマトキット。

【請求項4】

前記被験物質に対して結合性を有さず且つ前記金属微粒子（ａ）に対して結合性を有する水溶性高分子（ｃ）を更に備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のイムノクロマトキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、イムノクロマトキットに関するものであり、特には、被験物質の検出感度に優れるイムノクロマトキットに関するものである。なお、イムノクロマトキットとは、被験物質を検出する際にイムノクロマトグラフ法を用いる検査キットである。

【背景技術】

【0002】

貴金属のコロイドは化学的に変化し難く、粒径が数ｎｍ〜数十ｎｍ程度の、いわゆるナノ粒子を構成する。また各コロイド特有の色を発色し、各種用途への適用が期待され、例えば分子認識機能を利用した検出技術への応用が提案されている。

【0003】

特許第４９５８０８２号公報（特許文献１）には、粒子の吸光スペクトルをシャープに改質させた金属ナノ粒子からなる局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）センサーが開示されており、該金属ナノ粒子は、１）粒径が５〜１００ｎｍであり、２）一辺が略４０ｎｍ程度の平板状で三角形の粒子を含み、３）光子相関法による測定で頂点４０ｎｍ付近にシャープな粒度分布を有することを特徴とする。

【0004】

また、特許第４７８７９３８号公報（特許文献２）は、ペプチド、代謝物、分子又はイオンなどの関心のある標的種を認識できるデバイスの分野において、板状銀ナノ粒子に着目し、標的検体と相互作用し得るレセプタが表面に付着した板状銀ナノ粒子が分散しているセンサーを開示している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第４９５８０８２号公報

【特許文献2】特許第４７８７９３８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、分子認識機能を利用した検出技術にプレート状銀ナノ粒子を適用した場合、プレート状銀ナノ粒子の体液や生化学緩衝液に対する安定性に関して課題があり、検出技術への適用には依然として改良の余地がある。また、金のような他の金属の球状のナノ粒子は局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）の吸収波長制御域が限定されるため、被験物質毎に検出色を変えるといった多色設計に適しておらず、ナノ粒子を検出技術に適用した場合、複数の被験物質を同時に測定する場合、検出ラインの判別が困難であるといった課題もある。

【0007】

そこで、本発明の目的は、上記従来技術の問題を解決し、分子認識機能を利用した検出技術の一つであるイムノクロマトキットに関して、被験物質の検出に優れ、且つ体液や生化学緩衝液の使用が可能であるイムノクロマトキットを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、プレート状銀ナノ粒子の表面を金で被覆してなる金属微粒子をイムノクロマトキットに用いた場合、金属微粒子の体液や生化学緩衝液に対する安定性を確保した上で、被験物質の検出感度を向上させることが可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0009】

即ち、本発明のイムノクロマトキットは、プレート状銀ナノ粒子及び該プレート状銀ナノ粒子の表面を被覆する金からなる金属微粒子（ａ）と、被験物質に対して特異的な結合性を有し且つ該金属微粒子（ａ）に対して結合性を有する分子（ｂ）とを備えることを特徴とする。

【0010】

本発明のイムノクロマトキットの好適例においては、イムノクロマト試験後に１種又は複数種の検出ラインを呈するクロマトグラフ担体を備えるイムノクロマトキットであって、
前記検出ラインの色は、１種の金属微粒子（ａ）の色又は異なる色を呈する複数種の金属微粒子（ａ）の混色に基づいている。

【0011】

本発明のイムノクロマトキットの他の好適例においては、イムノクロマト試験後に複数種の検出ラインを呈するクロマトグラフ担体を備えるイムノクロマトキットであって、
前記クロマトグラフ担体は、異なる被験物質に対して結合性を有する複数種の分子（ｂ）がそれぞれ異なる位置に固定されている。

【0012】

本発明のイムノクロマトキットの好適例においては、前記被験物質に対して結合性を有さず且つ前記金属微粒子（ａ）に対して結合性を有する水溶性高分子（ｃ）を更に備える。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、金属微粒子の体液や生化学緩衝液に対する安定性を確保した上で、被験物質の検出感度を向上させることが可能なイムノクロマトキットを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明のイムノクロマトキットの一実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。

【図2】本発明のイムノクロマトキットの他の実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。

【図3】本発明のイムノクロマトキットの他の実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。

【図4】本発明のイムノクロマトキットの他の実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。

【図5】本発明のイムノクロマトキットの他の実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。

【図6】本発明のイムノクロマトキットの他の実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。

【図7】図６に示すイムノクロマトキットに使用可能な第２展開液の一例である。

【図8】プレート状銀ナノ粒子の種粒子の光学特性を示す図である。

【図9】プレート状銀ナノ粒子Ａ〜Ｄの光学特性を示す図である。

【図10】金属微粒子Ａ〜Ｄの光学特性を示す図である。

【図11】緩衝液中でのプレート状銀ナノ粒子の分光特性の測定結果の図である。

【図12】緩衝液中での金属微粒子Ｂの分光特性の測定結果の図である。

【図13】[イムノクロマト試験 実施例１]及び[イムノクロマト試験 比較例１]の目視判定の結果を示す図である。

【図14】[イムノクロマト試験 実施例１]の金属微粒子Ａを用いて調製した展開液Ａを用いた場合の輝度解析の結果を示す図である。

【図15】[イムノクロマト試験 実施例１]の金属微粒子Ｂを用いて調製した展開液Ｂを用いた場合の輝度解析の結果を示す図である。

【図16】[イムノクロマト試験 実施例１]の金属微粒子Ｃを用いて調製した展開液Ｃを用いた場合の輝度解析の結果を示す図である。

【図17】[イムノクロマト試験 実施例１]の金属微粒子Ｄを用いて調製した展開液Ｄを用いた場合の輝度解析の結果を示す図である。

【図18】[イムノクロマト試験 比較例１]の球状金コロイドを用いて調製した抗体−金コロイド展開液Ｉを用いた場合の輝度解析の結果を示す図である。

【図19】[イムノクロマト試験 実施例１]及び[イムノクロマト試験 比較例１]の金属微粒子Ａ〜Ｄと球状金コロイドを用いて調製した展開液Ａ〜Ｄ及び抗体−金コロイド展開液Ｉの輝度解析の結果を比較した図である。

【図20】[イムノクロマト試験 実施例２]及び[イムノクロマト試験 比較例２]の目視判定の結果を示す図である。

【図21】[イムノクロマト試験 実施例２]の金属微粒子Ｂを用いて調製した展開液Ｅを用いた場合の輝度解析の結果を示す図である。

【図22】[イムノクロマト試験 比較例２]の球状金コロイドを用いて調製した抗体−金コロイド展開液ＩＩを用いた場合の輝度解析の結果を示す図である。

【図23】[イムノクロマト試験 実施例２]及び[イムノクロマト試験 比較例２]の金属微粒子Ｂと球状金コロイドを用いて調製した展開液Ｅ及び抗体−金コロイド展開液ＩＩの輝度解析の結果を比較した図である。

【図24】[イムノクロマト試験 実施例３]の展開液Ｉ〜Ｌの調合比を示す図である。

【図25】[イムノクロマト試験 実施例３]の展開液Ｆ〜Ｈ及び[イムノクロマト試験 比較例２]の抗体−金コロイド展開液ＩＩＩの分光特性を示す図である。

【図26】[イムノクロマト試験 実施例３]の展開液Ｉ〜Ｌの分光特性を示す図である。

【図27】[イムノクロマト試験 実施例３]及び[イムノクロマト試験 比較例２]の測色の結果を示す図である。

【図28】種粒子のＳＥＭ観察写真を示す図である。

【図29】金属微粒子ＡのＳＥＭ観察写真を示す図である。

【図30】金属微粒子ＢのＳＥＭ観察写真を示す図である。

【図31】金属微粒子ＣのＳＥＭ観察写真を示す図である。

【図32】金属微粒子ＤのＳＥＭ観察写真を示す図である。

【図33】ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における、イエロー、マゼンタ及びシアンの色度座標、並びに金属微粒子Ａ、Ｂ及びＣの水分散液の色度座標を示す図である。

【図34】ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における、赤色、青色及び緑色の色度座標、並びに混合液Ａ、Ｂ及びＣの色度座標を示す図である。

【図35】[イムノクロマト試験 実施例４]の目視判定の結果を示す図である。

【図36】[イムノクロマト試験 実施例４]の測色の結果を示す図である。

【図37】[イムノクロマト試験 実施例４]の金属微粒子Ｂ及びＣを用いて調製した展開液Ｍを用いた場合の輝度解析の結果を示す図である。

【図38】［イムノクロマト試験 実施例５］の展開液Ｑ〜Ｔの調合比を示す図である。

【図39】［イムノクロマト試験 実施例５］の測色の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下に、本発明を詳細に説明する。本発明のイムノクロマトキットは、プレート状銀ナノ粒子及び該プレート状銀ナノ粒子の表面を被覆する金からなる金属微粒子（ａ）と、被験物質に対して特異的な結合性を有し且つ該金属微粒子（ａ）に対して結合性を有する分子（ｂ）とを備えることを特徴とする。

【0016】

本発明のイムノクロマトキットに用いる金属微粒子（ａ）は、プレート状銀ナノ粒子と、該プレート状銀ナノ粒子の表面を被覆する金とからなる。上記金属微粒子（ａ）は、プレート状であるため球状微粒子が吸収する領域以外の可視光領域から近赤外光領域でプラズモン吸収が強く（J. Phys. Chem. B, 107, 668 (2003)）、イムノクロマト試験時の被験物質検出ラインの色が球状微粒子を使用した際より幅広い波長域で設定できるため被験物質検出ラインの多色化が可能であり、かつ被験物質検出ラインに集積した金属微粒子（ａ）のプラズモン吸収により輝度は低くなり、背景とのコントラスト差が大きくなるため視認性が高くなる。また、プレート状銀ナノ粒子は遠心分離で濃縮する際や生化学試験に必須の各種緩衝液中で酸化されてアスペクト比や吸光度が変化する。また、理由は不明であるが球状微粒子は遠心分離で濃縮する際に凝集や遠沈管への吸着が発生し吸光度が変化する。それに対して、上記金属微粒子（ａ）は金で被覆してあるため、各種緩衝液中での分散安定性、酸化耐性が高い。また、上記金属微粒子（ａ）は遠心分離で濃縮する際に凝集や遠沈管への吸着は発生しないため吸光度の変化が少ない。すなわち、イムノクロマトグラフィーに金属微粒子を使用する際の事前処理操作である遠心分離や緩衝液曝露に対し強い耐久性を有し、他の金属微粒子より酸化や凝集が発生しにくく吸光度を高い状態で保てるため、これを標識物質として利用すると、被験物質に対する検出感度を向上させることができる。
なお、本発明における検出感度は、目視判定と、輝度差解析によって数値化できる。目視判定はイムノクロマト試験後の検出ライン有無を目視によって確認し、検出ラインが確認可能な最低被験物質濃度を検出感度とすることができる。輝度解析では、下記１から２を引いた値の絶対値が２（検出限界輝度差）以上である時の最低被験物質濃度を検出感度とすることができる。
１．被験物質を含まない展開液を使用したイムノクロマト試験時の検出ラインと検出ライン以外の部分の輝度差
２．被験物質を含む展開液を使用したイムノクロマト試験時のイムノクロマト担体上の検出ラインと検出ライン以外の部分の輝度差

【0017】

なお、本発明のイムノクロマトキットにおいて、上記金属微粒子（ａ）は、イムノクロマトグラフ法に用いられる通常の標識物質と同様の形態で利用できるが、例えば、展開液中に分散しているか又は上記分子（ｂ）と一体となってクロマトグラフ担体に担持されているか又は上記分子（ｂ）と一体となってクロマトグラフの展開開始部に接合している吸収紙に担持されている。

【0018】

上記金属微粒子（ａ）を構成するプレート状銀ナノ粒子は、２つの主面を有する平たい粒子であり、その主面の形状は、三角形、五角形、六角形等の多角形状や、角がカーブ状となった円形状等の形状が挙げられ、例えば、銀イオンを還元する速度の調整やナノ粒子表面に吸着する分散剤の種類を選択することで、粒子の形状を制御できることが知られている。なお、主面の形状は、クロマトグラフの展開時にクロマトグラフ試験紙を構成する物質との物理的な引っかかりが少なく流動しやすいため、角がカーブ状になった円形状が好ましい。また、プレート状銀ナノ粒子の厚みは、通常４０ｎｍ以下であり、５〜２０ｎｍが好ましく、粒子の主面の最大長さとなる粒子径は、通常１０〜１０００ｎｍであり、１０〜１００ｎｍが好ましい。更に、プレート状銀ナノ粒子のアスペクト比（粒子径／厚み）は、通常２以上であり、可視光領域にＬＳＰＲの吸収波長が発現して多色設計が可能な２〜１０が好ましい。近赤外光で検出する場合には、ＬＳＰＲが８００〜２０００ｎｍで発現するようなアスペクト比（例えば、アスペクト比１１で９００ｎｍ付近にＬＳＰＲが発現）のプレート状銀ナノ粒子を用いればよい。多色設計の例としては、プレート状銀ナノ粒子のアスペクト比を調整することで単一のＬＳＰＲを発現するプレート状銀ナノ粒子を用いればよい。色を定量的に表す体系である表色系の一つであるマンセル・カラー・システムのマンセル値（以下、単にマンセル値ともいう）が５Ｙ ８．５／１４で、ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図の座標（以下、単に色度座標ともいう）がｘ：０．４４９８、ｙ：０．４８１１であるイエロー（イエロー系色、４００〜５００ｎｍ付近にＬＳＰＲを発現するプレート状銀ナノ粒子）、マンセル値が５ＲＰ ５／１４で、色度座標がｘ：０．４１４２、ｙ：０．２４２８であるマゼンタ（マゼンタ系色、５００〜６００ｎｍ付近にＬＳＰＲを発現するプレート状銀ナノ粒子）、マンセル値が７．５Ｂ ６／１０で、色度座標がｘ：０．１９３４、ｙ：０．２３７４であるシアン（シアン系色、６００〜７５０ｎｍ付近にＬＳＰＲを発現するプレート状銀ナノ粒子）など、プレート状銀ナノ粒子のアスペクト比を調整することで任意のＬＳＰＲの吸収波長を選択できる。なお、図３３は、ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図におけるイエロー、マゼンタ及びシアンの色度座標を示す。アスペクト比の異なる２種以上のプレート状銀ナノ粒子を混合して色設計してよい。例えば、イエローとマゼンタを混合し赤色（マンセル値：５Ｒ ４／１４、色度座標 ｘ：０．５７３４、ｙ：０．３０５７）、マゼンタとシアンを混合し青色（マンセル値：１０Ｂ ４／１４、色度座標 ｘ：０．１３１０、ｙ：０．１５８０）、イエローとシアンを混合し緑色（マンセル値：２．５Ｇ ６．５／１０、色度座標 ｘ：０．３０００、ｙ：０．６０００）などが設計できる。なお、図３４は、ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における赤色、青色及び緑色の色度座標を示す。さらに、イエロー系色、マゼンタ系色、シアン系色が発現するアスペクト比の異なる３種以上のプレート状銀ナノ粒子を三原色とした減法混合を適用した多色設計を用いることができる。例えば、イエロー系色、マゼンタ系色、シアン系色のプレート状銀ナノ粒子を任意の割合で混合して黒色を設計した場合、イムノクロマト試験時の被験物質検出ラインは背景（白色）とのコントラスト差が大きくなるため視認性（検出感度）が高くなる。また、アスペクト比の異なる複数のプレート状銀ナノ粒子を混合して色設計する場合は、クロマトグラフの展開時における粒子の流動速度の差が小さくなるように、プレート状銀ナノ粒子の厚みは、５〜１５ｎｍが好ましく、粒子の主面の最大長さとなる粒子径は、１０〜８０ｎｍが好ましい。

【0019】

上記プレート状銀ナノ粒子の調製方法は、特に制限されるものではなく、粒子サイズを調整する等の目的に応じて適宜選択することができる。例えば、適切な分散剤を溶解した水溶液中に銀イオンを添加し、その後、適切な還元方法で銀イオンを還元することで、プレート状銀ナノ粒子が合成できることが知られており、具体例として、銀イオンを光で還元する方法（SCIENCE, 294, 1901 (2001)）、熱で還元する方法（Nano Lett., 2, 903 (2002)）、還元剤で還元する方法（Adv. Mater., 14, 1084 (2002)）等が挙げられる。さらに、異種金属である銅イオン共存下で銀イオンを還元する方法（特許第5059317号公報）が挙げられる。また、プレート状銀ナノ粒子を合成する際には、通常、不純物として球状銀ナノ粒子も合成されることになるが、例えば「Adv. Funct. Mater., 18, 2005 (2008)」に記載されるような手法では、粒子の形状をプレート形状に成長させるために積層欠陥を有するプレート状銀ナノ粒子の種粒子の分散液を予め調製し、ここに銀イオンと還元剤を添加して、銀ナノ粒子の形状をプレート形状に成長させている。この種粒子を用いる手法は、球状粒子の生成を大幅に低減することができるため、好ましい。この種粒子は、ポリスチレンスルホン酸などのポリアニオン系ポリマーを溶解したクエン酸三ナトリウム水溶液中で銀イオンを還元すると生成し、ポリアニオン系ポリマーが銀ナノ粒子の表面と比較的強く相互作用した結果、欠陥構造が生じると考えられている。積層欠陥を有する種粒子は、＜１１１＞方向に成長して、大きな{１１１}面を有するプレート形状の銀ナノ粒子に成長する。種粒子を含む水分散液に銀イオンと還元剤を添加することで、プレート状銀ナノ粒子が得られる。このとき、種粒子の添加量を調製することで幅広いアスペクト比のプレート状銀ナノ粒子を得ることができる。種粒子の数を多く設定すると、個々の種粒子に消費される銀イオン量の割合が減少するため、得られるプレート状銀ナノ粒子の粒子径は小さくなる傾向がある。また、種粒子の数を少なく設定すると、個々の種粒子に消費される銀イオン量の割合が増大するため、得られるプレート状銀ナノ粒子の粒子径は大きくなる傾向がある。還元剤としては、アスコルビン酸を使用することができる。なお、プレート状銀ナノ粒子がこれらの手法により調製された場合、通常、水分散液の形態で調製される。また、球状銀ナノ粒子といった目的形状以外の形状を有する粒子や合成で使用した余剰の有機物を生成物から分離するためには、銀ナノ粒子の分散液を遠心分離機にかけたり又はフィルターにより濾過したりしてもよい。調製されたプレート状銀ナノ粒子は分散液中において粒子径に分布があり、その分布に応じて吸収スペクトルは変化する。粒子径の分布を狭くすることは、吸収スペクトルの半値幅を狭くし、色が鮮やかになるため、多色設計に好適である。

【0020】

本発明のイムノクロマトキットに用いる金属微粒子（ａ）は、プレート状銀ナノ粒子の表面が金で被覆されていることを要する。例えば、プレート状銀ナノ粒子が金で被覆されずにクロマトグラフ担体に担持されているか又は展開開始部の吸収紙に担持されている場合、保管中のクロマトグラフ担体では該銀ナノ粒子が乾燥した状態で保持されており、また、使用時には該銀ナノ粒子が幅広いｐＨの展開液と接触するため、プレート状銀ナノ粒子が酸化してしまう場合も多い。銀ナノ粒子が酸化されると、銀ナノ粒子の形状も変化することになり、プラズモン吸収波長の変化に伴う色変化が発生するという問題が生じる。特に、プレート状銀ナノ粒子をイムノクロマトキットに適用する場合、プレート状銀ナノ粒子の精密な形状制御が要求されるため、プレート状銀ナノ粒子の適用には改善の余地があった。本発明者は、銀よりも酸化され難い金属の薄膜でプレート状銀ナノ粒子を被覆し、プレート状銀ナノ粒子の表面に金属のシェルを形成させることによって、イムノクロマトキットに用いる場合であってもプレート状銀ナノ粒子の酸化を防止できることを見出した。プレート状銀ナノ粒子の金属シェルとして使用できる金属としては、銀よりも貴な金属である金が挙げられる。

【0021】

上記プレート状銀ナノ粒子の表面を金属で被覆する方法は、特に制限されるものではなく、金属の膜厚を調整する等の目的に応じて適宜選択することができる。例えば、金で被覆する場合、プレート状銀ナノ粒子の水分散液中に金イオンを添加し、該金イオンを化学的に還元することで、プレート状銀ナノ粒子の表面を金の薄膜（金のシェル）で被覆することができる（Materials Chemistry and Physics, 90, 361 (2005)、Angew. Chem. Int. Ed., 51, 5629 (2012)）。例えば、まず、プレート状銀ナノ粒子の凝集や表面がエッチングされることを防ぐため、プレート状銀ナノ粒子の分散液中にクエン酸、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリアクリル酸（ＰＡ）、ゼラチン、アミン等の適切な有機物を加えて、プレート状銀ナノ粒子の表面を処理し、次いで、該分散液中に金イオンと還元剤とを加えることで、プレート状銀ナノ粒子の表面が金で被覆されている金属微粒子を得ることができる。なお、本発明において、「プレート状銀ナノ粒子の表面を被覆する金」とは、プレート状銀ナノ粒子の表面に存在している金を指すが、金単体で存在しているものに加えて、銀との合金の状態で存在しているものも含まれる。

【0022】

本発明のイムノクロマトキットに用いる分子（ｂ）は、被験物質（例えば、抗原または抗体）に対して特異的な結合性を有する分子（例えば、抗体または抗原）であるが、上記金属微粒子（ａ）に対して結合性を有することを要する。これにより、上記分子（ｂ）を介して被験物質と金属微粒子（ａ）とが結合してなる複合体が形成されるため、金属微粒子（ａ）の色調による被験物質の検出が可能になる。

【0023】

上記分子（ｂ）は、上記金属微粒子（ａ）に対して結合性を有するため、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を有することが好ましく、特にはメルカプト基、ジチオール基又はスルフィド基を有することが好ましい。しかし、これら官能基を有していなくても化合物の界面エネルギーや静電吸着により物理吸着していても良い。

【0024】

上記分子（ｂ）としては、被験物質の種類に応じて適宜選択されるものであるが、免疫反応性物質や、レクチンと糖鎖、アビジンとビオチン、核酸と当該核酸とハイブリダイズする核酸、核酸アプタマーやペプチドアプタマーなどのアプタマーと特異的に結合する有機低分子やタンパク質、核酸、細胞、細胞組織、微生物など、相互作用しうる物質であれば任意の物質に適用することができる。免疫反応性物質としては、各種抗体や抗原などを挙げることができる。ここで抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ等）としては、抗ＤＮＡ抗体、抗ＥＮＡ抗体、抗カルジオリビン抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗平滑筋抗体等に代表される自己抗体や各種免疫グロブリン等を挙げることができ、例えばアレルゲンを特異的に認識する特異的免疫グロブリン（特異的ＩｇＥ等）の分析等にも適用することが可能である。また、抗原としては、糖タンパク質や複数のサブユニットから構成される特定タンパク質、前立腺特異的抗原(ＰＳＡ）等のタンパク質複合体などを挙げることができる。
上記分子（ｂ）の例としては、抗コンカナバリンＡ抗体、マンノースおよびその誘導体（被験物質：コンカナバリンＡ）、抗ベロ毒素抗体、グロボ三糖およびその誘導体（被験物質：ベロ毒素）、シアリルラクトースおよびその誘導体、抗インフルエンザ抗体（被験物質：インフルエンザウイルスおよびその抗原）、抗Ｂ型肝炎ウイルス抗体(被験物質：Ｂ型肝炎ウイルスおよびその抗原)、抗インスリン抗体（被験物質：インスリン）、抗アフラトキシン抗体（被験物質：アフラトキシン）、抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体（被験物質：ヒト絨毛性ゴナドトロピン）、抗ヒト免疫不全ウイルス抗体（被験物質：ヒト免疫不全ウイルスおよびその抗原）、抗リシン抗体、ガラクトースおよびその誘導体（被験物質：リシン）、抗サルモネラ抗体（被験物質：サルモネラ菌）等の抗体や、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、Ｄ群赤痢菌・ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、溶連菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、パラチフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ)等の細菌や、ムチン１等の上皮の細胞表面に表れるがんマーカー等と結合するＤＮＡアプタマー、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の腫瘍性たんぱく質ＨＰＶ１６ Ｅ６と結合するペプチドアプタマー等が挙げられる。

【0025】

被験物質の例として、コンカナバリン Ａ（Ｃｏｎ Ａ）や麦芽アグルチニン、リシン等のレクチン、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）等の血清蛋白成分、ムチン等の糖たんぱく質、前立腺性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、アルカリ性フォスファターゼ、トランスアミナーゼ、トリプシン、ペプシノーゲン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）等のガン特異物質、ペプチドホルモン（成長ホルモン（ＧＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メラミン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、下垂体ホルモン、カルシユウム代謝調節ホルモン、膵ホルモン、消化管ホルモン、血管作用ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）等の胎盤ホルモン、便潜血、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス等のウイルス及びその抗原、抗体や代謝産物等、クラミジア、梅毒トレポネーマ、溶連菌、炭疽菌、黄色ブドウ球菌、赤痢菌、大腸菌、ネズミチフス菌、パラチフス、緑膿菌、腸炎ビブリオ等の細菌及びその抗原、抗体や代謝産物等、リュウマチ因子、セロトニン、ウロキナーゼ、フェリチン、サブスタンＰ、エストロン等の卵胞ホルモン、プロゲストロン等の天然又は合成黄体ホルモン、テストステロン等の男性ホルモン、コルチゾール等の副腎皮質ホルモン、コレステロール、胆汁酸、強心性ステロイド、サポゲニン等のその他のステロイド類、エピネフリン、ドーパミン、生理活性アルカロイド類、アミノ基含有向精神薬類、ＴＲＨ等の低分子ペプチド類、ジヨードサイロニン等の甲状腺ホルモン類、プロスタグランジン類、ビタミン類、ペニシリン等の抗生物質類、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、それらの増幅物等々が挙げられる。

【0026】

なお、本発明のイムノクロマトキットにおいて、上記分子（ｂ）は、イムノクロマトグラフ法に用いられる通常の抗体と同様の形態で利用できるが、例えば、展開液中に分散し且つクロマトグラフ担体に単独で固定化されている形態、上記金属微粒子（ａ）と一体となって展開液中に分散し且つクロマトグラフ担体に単独で固定化されている形態、上記金属微粒子（ａ）と一体となってクロマトグラフ担体に担持され且つクロマトグラフ担体の上記金属微粒子とは異なる位置に単独で固定化されている形態が挙げられる。

【0027】

本発明のイムノクロマトキットは、上記被験物質に対して結合性を有さず且つ上記金属微粒子（ａ）に対して結合性を有する水溶性高分子（ｃ）を更に備えることが好ましい。上記金属微粒子（ａ）が展開液中に分散している場合、該展開液中に水溶性高分子（ｃ）を加えることで、展開液中での金属微粒子（ａ）の分散安定性を向上させることができる。なお、「被験物質に対して結合性を有しない」という特徴は、水溶性高分子（ｃ）が上記分子（ｂ）とは異なる物質であることを意味する。

【0028】

上記水溶性高分子（ｃ）は、上記金属微粒子（ａ）に対して結合性を有するため、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を有することが好ましく、特にはメルカプト基、ジチオール基又はスルフィド基を有することが好ましい。しかし、これら官能基を有していなくても化合物の界面エネルギーや静電吸着により物理吸着していても良い。具体的には、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリアリルアミン、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルフェノール、ポリ安息香酸ビニル、ポリビニルアルコール等が挙げられる。なお、これら水溶性高分子は、一種単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0029】

本発明のイムノクロマトキットは、通常、クロマトグラフ担体を備える。クロマトグラフ担体は、イムノクロマト試験後に１種又は複数種の検出ラインを呈する。クロマトグラフ担体としては、毛細管現象を示す多孔性物質が好ましく、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、糸等が好適に挙げられる。

【0030】

クロマトグラフ担体には、分子（ｂ）が単独で固定化されるか又は同一の分子（ｂ）が複数で固定されるか又は異種の分子（ｂ）が複数で固定されており、この固定化部分が、被験物質の有無を判定する部分（検出ライン）として機能することになる。
クロマトグラフ担体がイムノクロマト試験後に複数種の検出ラインを呈する場合、該クロマトグラフ担体には、異なる被験物質に対して結合性を有する複数種の分子（ｂ）がそれぞれ異なる位置に固定されていることが好ましい。この場合、異なる被験物質の検出を一度に行うことが可能になる。
また、イムノクロマト試験後に呈する検出ラインの色は、１種の金属微粒子（ａ）の色又は異なる色を呈する複数種の金属微粒子（ａ）の混色に基づいている。
このため、クロマトグラフ担体は、異なる被験物質に対して結合性を有する複数種の分子（ｂ）により、複数の固定化部分を備える場合、金属微粒子（ａ）の色調の違いを利用して、それぞれの固定化部分を異なる色を呈する検出ラインとして機能させることも可能である（検出ラインの多色化）。これにより、複数の被験物質の検出が一度で可能になる。

【0031】

クロマトグラフ担体は、紙、プラスチック等の支持体上に設置して使用されてもよい。また、クロマトグラム担体は、展開液が展開する方向から見て下流側に位置する端部に、展開液を吸収除去するための吸収部（例えば、紙、不織布）が設けられていてもよい。また、展開液が展開する方向から見て上流側に位置する端部に金属微粒子（ａ）と抗体（ｂ）の複合体を担持可能で且つ被験物質を含む溶液を吸収するための吸収部（例えば、ガラス繊維）が設けられていてもよい。

【0032】

なお、分子（ｂ）が単独で固定化されたクロマトグラフ担体は、市販品を好適に使用できる。また、分子（ｂ）と金属微粒子（ａ）とからなる複合体を担持し且つ分子（ｂ）が単独で固定化されたクロマトグラフ担体は、前述の市販品のクロマトグラフ担体を使用して作製できる。市販品のクロマトグラフ担体の展開液を除去するための吸収部を上部としたとき、分子（ｂ）が固定化されている部分の下部に位置する部分に分子（ｂ）と金属微粒子（ａ）を一体化させた溶液を線状に滴下し乾燥させることによって作製できる。

【0033】

本発明のイムノクロマトキットは、通常、展開液を備える。展開液としては、例えば、被験物質を含む可能性のある試料と適当な溶媒（例えば、水、生理食塩水又は緩衝液等）の混合物が挙げられるが、該試料それ自体をクロマトグラフ担体上で展開できるのであれば、該試料それ自体を展開液として使用することも可能である。

【0034】

上記被験物質を含む可能性のある試料としては、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。

【0035】

本発明のイムノクロマトキットにおいては、分子（ｂ）がクロマトグラフ担体に単独で固定化されている場合、金属微粒子（ａ）及び分子（ｂ）を更に含む展開液を使用することができる。

【0036】

なお、分子（ｂ）がクロマトグラフ担体に単独で固定化されている場合、先に説明した展開液では、被験物質を含む可能性のある試料と、金属微粒子（ａ）及び分子（ｂ）を混合しているが、展開液を２種類に分けて使用してもよい。例えば、被験物質を含む可能性のある試料を含む展開液を第１の展開液とし、金属微粒子（ａ）や分子（ｂ）を含む展開液を第２の展開液として用いることも可能である。また、分子（ｂ）が金属微粒子と一体となってクロマトグラフ担体に担持されている場合、被験物質を含む可能性のある試料を含む展開液のみを展開すればよい。同様に、分子（ｂ）が金属微粒子と一体となって展開液が展開する方向から見て上流側に位置する端部の吸収部に担持されている場合、被験物質を含む可能性のある試料を含む展開液のみを展開すればよい。

【0037】

本発明のイムノクロマトキットは、イムノクロマトグラフ法を利用する様々な検出方法に使用可能である。以下、図を参照しながら、本発明のイムノクロマトキットの実施態様を用いる検出方法（イムノクロマト試験）の一部について詳細に説明する。なお、下記に示すイムノクロマト試験では、上記被験物質を含む可能性のある試料に被験物質が存在していることを前提にして説明されているが、当然、被験物質が存在しない場合もある。

【0038】

図１は、本発明のイムノクロマトキットの一実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。図１に示すクロマトグラフ担体は、プラスチック上に設置されており、その上端には吸収紙が設けられている（これをイムノクロマト試験紙とする）。また、このクロマトグラフ担体は、分子（ｂ）が直線状に固定化され、判定部分が形成されている。図１に示す展開液は、被験物質及び緩衝液を含む第１の展開液（実際には上述の生物学的試料等でもよい）と、金属微粒子（ａ）、分子（ｂ）及び緩衝液を含む第２の展開液からなり、第２の展開液中では、金属微粒子（ａ）と分子（ｂ）が結合して複合体を形成している。図１に示すイムノクロマト試験によれば、まず、イムノクロマト試験紙に第１の展開液を展開させる（図１（ａ））。ここで、図１のように被験物質が第１の展開液に含まれる場合、該被験物質は、クロマトグラフ担体上に固定化された分子（ｂ）に結合する（図１（ｂ））。次に、クロマトグラフ担体上に残存する未結合の被験物質を除去するため、緩衝液を展開してクロマトグラフ担体を洗浄する（図１（ｂ））。なお、除去された被験物質は吸収紙に回収される。次に、イムノクロマト試験紙に第２の展開液を展開させる（図１（ｃ））。ここで、図１のように被験物質が第１の展開液に含まれる場合、金属微粒子（ａ）と分子（ｂ）の複合体が、クロマトグラフ担体上の分子（Ｂ）に結合している被験物質に結合する（図１（ｄ））。図１のように被験物質が第１の展開液に含まれる場合、金属微粒子（ａ）が判定部分に残るため、金属微粒子（ａ）の色調による被験物質の検出が可能になる。

【0039】

図２は、本発明のイムノクロマトキットの他の実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。図２に示すクロマトグラフ担体は、図１に示すものと同一である。図２に示す展開液は、被験物質、金属微粒子（ａ）、分子（ｂ）及び緩衝液を含む展開液であり、展開液中では、分子（ｂ）を介して金属微粒子（ａ）と被験物質が結合して複合体を形成している（図２（ａ））。図２に示すイムノクロマト試験によれば、イムノクロマト試験紙に展開液を展開させる（図２（ｂ）及び（ｃ））。ここで、図２のように被験物質が展開液に含まれる場合、該被験物質は、クロマトグラフ担体上に固定化された分子（ｂ）に結合するが、図２（ｄ）に示されるように、上記複合体が判定部分に残ることになる。ここで、上記複合体には金属微粒子（ａ）が含まれるため、金属微粒子（ａ）の色調による被験物質の検出が可能になる。

【0040】

図３は、本発明のイムノクロマトキットの他の実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。図３（ａ）に示すクロマトグラフ担体は、図１に示すものと同一である。また、図３（ａ）のクロマトグラフ担体の、展開液が展開する方向から見て、判定部分より上流側に（図３では判定部分より下側に）金属微粒子（ａ）と分子（ｂ）の複合体を含む溶液を滴下、乾燥し、複合体担持イムノクロマトグラフ担体を作製している（図３（ｂ）及び（ｃ））。図３（ｃ）のクロマトグラフ担体では、展開液が複合体担持部分を通ると、複合体も展開液と一緒に展開される。図３に示す展開液は、被験物質および緩衝液を含む展開液（実際には上述の生物学的試料等でもよい）である。図３に示すイムノクロマト試験によれば、イムノクロマト試験紙に展開液を展開させる（図３（ｄ）および（ｅ））。ここで、図３のように被験物質が展開液に含まれる場合、該被験物質は、クロマトグラフ担体上に固定化された分子（ｂ）に結合するが、図３（ｅ）および（ｆ）に示されるように、上記複合体が判定部分に残ることになる。ここで、上記複合体には金属微粒子（ａ）が含まれるため、金属微粒子（ａ）の色調による被験物質の検出が可能になる。

【0041】

図４は、本発明のイムノクロマトキットの他の実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。図４に示すクロマトグラフ担体には、展開液が展開する方向から見て上流側に位置する端部に金属微粒子（ａ）と抗体（ｂ）の複合体を担持可能で且つ被験物質を含む溶液を吸収するためのガラス繊維の吸収部が設けられている。
図４（ａ）のクロマトグラフ担体では、ガラス繊維の吸収部に金属微粒子（ａ）と分子（ｂ）の複合体を含む溶液を滴下、乾燥し、複合体担持イムノクロマトグラフ担体を作製している。
図４に示す展開液は、被験物質および緩衝液を含む展開液（実際には上述の生物学的試料等でもよい）である。図４に示すイムノクロマト試験によれば、イムノクロマト試験紙に展開液を展開させる（図４（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ））。ここで、図４のように被験物質が展開液に含まれる場合、該被験物質は、クロマトグラフ担体上に固定化された分子（ｂ）に結合するが、図４（ｅ）および（ｆ）に示されるように、上記複合体が判定部分に残ることになる。ここで、上記複合体には金属微粒子（ａ）が含まれるため、金属微粒子（ａ）の色調による被験物質の検出が可能になる。

【0042】

図５は、本発明のイムノクロマトキットの他の実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。図５に示すクロマトグラフ担体は、プラスチック上に設置されており、その上端には吸収紙が設けられている（これをイムノクロマト試験紙とする）。また、このクロマトグラフ担体は、複数の異種の分子（ｂ）１−３が異なる位置に直線状に固定化され、判定部分が形成されている。図５に示す展開液は、複数の異種の被験物質１−３及び緩衝液を含む第１の展開液（図５（ｂ）、（ｃ））と、複数の異種の金属微粒子（ａ）１−３、複数の異種の分子（ｂ）１−３（対応する数字の被験物質１−３と結合する）及び緩衝液を含む第２の展開液（図５（ｅ））からなり、第２の展開液中では、複数の異種の金属微粒子（ａ）１−３と複数の異種の分子（ｂ）１−３が結合して複合体を形成している。図５に示すイムノクロマト試験によれば、まず、イムノクロマト試験紙に第１の展開液を展開させる（図５（ｂ）、（ｃ））。ここで、図５のように複数の異種の被験物質１−３が第１の展開液に含まれる場合、該被験物質は、クロマトグラフ担体上に固定化された複数の異種の分子（ｂ）のうち対応する分子（ｂ）に結合する（図５（ｃ））。次に、クロマトグラフ担体上に残存する未結合の被験物質を除去するため、緩衝液を展開してクロマトグラフ担体を洗浄する（図５（ｄ））。なお、除去された被験物質は吸収紙に回収される。次に、イムノクロマト試験紙に第２の展開液を展開させる（図５（ｅ））。ここで、図５のように複数の異種の被験物質が第１の展開液に含まれる場合、複数の異種の金属微粒子（ａ）１−３と複数の異種の分子（ｂ）１−３の複合体が、クロマトグラフ担体上の各分子（ｂ）に結合している被験物質に結合する（図５（ｅ））。図５のように複数の異種の被験物質１−３が第１の展開液に含まれる場合、複数の異種の金属微粒子（ａ）１−３が複数の判定部分に残るため、各金属微粒子（ａ）の色調により複数の被験物質の検出が一度で可能になる。

【0043】

図６は、本発明のイムノクロマトキットの他の実施態様を用いたイムノクロマト試験の概略図を示す。図６に示すクロマトグラフ担体は、プラスチック上に設置されており、その上端には吸収紙が設けられている（これをイムノクロマト試験紙とする）。また、このクロマトグラフ担体は、複数の異種の分子（ｂ）１−３が異なる位置に直線状に固定化され、判定部分が形成されている。図６に示す展開液は、複数の異種の被験物質１−３及び緩衝液を含む第１の展開液（図６（ｂ）、（ｃ））と、複数の異種の金属微粒子（ａ）１−３、複数の異種の分子（ｂ）１−３（対応する数字の被験物質１−３と結合する）及び緩衝液を含む第２の展開液（図６（ｅ））からなり、第２の展開液中では、複数の異種の金属微粒子（ａ）１−３と複数の異種の分子（ｂ）１−３が結合して複合体を形成しているが、金属微粒子（ａ）−１は、分子（ｂ）−１又は分子（ｂ）−３と共に複合体を形成し、金属微粒子（ａ）−２は、分子（ｂ）−１又は分子（ｂ）−２と共に複合体を形成し、金属微粒子（ａ）−３は、分子（ｂ）−２又は分子（ｂ）−３と共に複合体を形成している。
図６に示すイムノクロマト試験によれば、まず、イムノクロマト試験紙に第１の展開液を展開させる（図６（ｂ）、（ｃ））。ここで、図６のように複数の異種の被験物質１−３が第１の展開液に含まれる場合、該被験物質は、クロマトグラフ担体上に固定化された複数の異種の分子（ｂ）１−３のうち対応する分子（ｂ）に結合する（図６（ｃ））。次に、クロマトグラフ担体上に残存する未結合の被験物質を除去するため、緩衝液を展開してクロマトグラフ担体を洗浄する（図６（ｄ））。なお、除去された被験物質は吸収紙に回収される。次に、イムノクロマト試験紙に第２の展開液を展開させる（図６（ｅ））。ここで、図６のように複数の異種の被験物質１−３が第１の展開液に含まれる場合、複数の異種の金属微粒子（ａ）１−３と複数の異種の分子（ｂ）１−３の複合体が、クロマトグラフ担体上の各分子（ｂ）に結合している被験物質に結合する（図６（ｅ））。図６のように複数の異種の被験物質１−３が第１の展開液に含まれる場合、一つの判定部分に複数の異種の金属微粒子（ａ）が残るため、金属微粒子（ａ）１−３の混色の検出ラインが確認できる。
次に、図６に用いた第２の展開液の調製方法の一例を以下に記載する。金属微粒子（ａ）−１がイエロー調、金属微粒子（ａ）−２がマゼンタ調、金属微粒子（ａ）−３がシアン調の色であるとき、金属微粒子（ａ）−１と分子（ｂ）−１、金属微粒子（ａ）−２と分子（ｂ）−１をそれぞれ別々に複合体化し、これら複合体を等量ずつ混合することで赤色調の第２の展開液が調製可能である。同様に、金属微粒子（ａ）−２と分子（ｂ）−２、金属微粒子（ａ）−３と分子（ｂ）−２をそれぞれ別々に複合体化し、その後これら２種の複合体を等量ずつ混合することで青色調の第２の展開液が調製可能である。また、金属微粒子（ａ）−１と分子（ｂ）−３、金属微粒子（ａ）−３と分子（ｂ）−３をそれぞれ別々に複合体化し、その後これら２種の複合体を等量ずつ混合することで緑色調の第２の展開液が調製可能である。これら３種の第２展開液を同量混合することで黒色調の第２の展開液が調製でき、これを図６のイムノクロマト試験紙に展開すると、イムノクロマト紙に固定された分子（ｂ）１−３に金属微粒子（ａ）の混色の検出ラインが確認される。図７に、図６に示すイムノクロマトキットに使用可能な第２展開液の一例を示す。なお、金属微粒子（ａ）や分子（ｂ）の種類は、前述の３種に限定されず上限無く増やすことが可能であるため、検出部分の色を自由に制御することが可能である。

【実施例】

【0044】

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。

【0045】

（プレート状銀ナノ粒子の種粒子の調製）
２．５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液２０ｍＬに、０．５ｇ／Ｌの分子量７０，０００ポリスチレンスルホン酸水溶液１ｍＬと、１０ｍＭの水素化ほう素ナトリウム水溶液１．２ｍＬとを添加し、次いで、２０ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら、０．５ｍＭの硝酸銀水溶液５０ｍＬを添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に６０分間静置し、プレート状銀ナノ粒子の種粒子の水分散液を作製した。調製した水分散液（原液）の光学特性を図８に示す。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。最大吸収を示す波長は球状銀ナノ粒子のＬＳＰＲである３９６ｎｍ（消光度３．３）であった。なお、本発明の消光度とは分散液を分光光度計で測定した際の吸光度の値である。また、ＳＥＭ写真を図２８に示す。ＳＥＭ写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。粒子径は主に３ｎｍ以上、１０ｎｍ未満のプレート状粒子であった。

【0046】

（プレート状銀ナノ粒子Ａの調製）
蒸留水２００ｍｌに、１０ｍＭのアスコルビン酸水溶液４．５ｍＬを添加し、上述のプレート状銀ナノ粒子の種粒子の分散液（以下、種粒子水分散液という）１２ｍｌを添加した。得られた溶液に、０．５ｍＭの硝酸銀水溶液１２０ｍＬを３０ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した４分後に攪拌を停止し、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液２０ｍｌを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター（３０℃）中に１００時間静置し、プレート状銀ナノ粒子Ａの水分散液を調製した。調製した分散液を蒸留水で４倍容に希釈した水分散液の光学特性を図９に示す。最大吸収を示す波長は４５４ｎｍ（消光度１．０）であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。水分散液中のプレート状銀ナノ粒子ＡをＳＥＭにより観察したところ、プレート状銀ナノ粒子Ａの平均粒子径は１８ｎｍであり、平均厚さは８ｎｍでアスペクト比は２．２であった。ＳＥＭ写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。

【0047】

（プレート状銀ナノ粒子Ｂの調製）
上記種粒子水分散液の添加量を１２ｍｌから４ｍｌに変更した以外は、プレート状銀ナノ粒子Ａの調製と同様にして、プレート状銀ナノ粒子Ｂの水分散液を調製した。調製した分散液を蒸留水で４倍容に希釈した水分散液の光学特性を図９に示す。最大吸収を示す波長は５２６ｎｍ（消光度１．１）であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。水分散液中のプレート状銀ナノ粒子ＢをＳＥＭにより観察したところ、プレート状銀ナノ粒子Ｂの平均粒子径は３１ｎｍであり、平均厚さは８ｎｍでアスペクト比は３．８であった。ＳＥＭ写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。

【0048】

（プレート状銀ナノ粒子Ｃの調製）
上記種粒子水分散液の添加量を１２ｍｌから２ｍｌに変更した以外は、プレート状銀ナノ粒子Ａの調製と同様にして、プレート状銀ナノ粒子Ｃの水分散液を調製した。調製した分散液を蒸留水で４倍容に希釈した水分散液の光学特性を図９に示す。最大吸収を示す波長は６２６ｎｍ（消光度１．１）であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。水分散液中のプレート状銀ナノ粒子ＣをＳＥＭにより観察したところ、プレート状銀ナノ粒子Ｃの平均粒子径は５０ｎｍであり、平均厚さは１０ｎｍでアスペクト比は５．０であった。ＳＥＭ写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。

【0049】

（プレート状銀ナノ粒子Ｄの調製）
上記種粒子水分散液の添加量を１２ｍｌから１ｍｌに変更した以外は、プレート状銀ナノ粒子Ａの調製と同様にして、プレート状銀ナノ粒子Ｄの水分散液を調製した。調製した分散液を蒸留水で４倍容に希釈した水分散液の光学特性を図９に示す。最大吸収を示す波長は７０４ｎｍ（消光度１．０）であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。水分散液中のプレート状銀ナノ粒子ＤをＳＥＭにより観察したところ、プレート状銀ナノ粒子Ｄの平均粒子径は７４ｎｍであり、平均厚さは８ｎｍでアスペクト比は９．２であった。ＳＥＭ写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。

【0050】

（金属微粒子Ａの調製）
上記プレート状銀ナノ粒子Ａの水分散液１２０ｍｌに、５質量％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）水溶液８ｍｌを添加し、ジエチルアミン１．２ｍｌを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍｌを添加した後、０．１６ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍｌを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、プレート状銀ナノ粒子Ａの表面が金で被覆された金属微粒子Ａの水分散液（イエロー調）を調製した。この金属微粒子Ａの水分散液を原液とした。原液を蒸留水で４倍容に希釈した水分散液の光学特性を図１０に示し、ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における原液の色度座標を図３３に示す。最大吸収を示す波長は４６４ｎｍ（消光度０．８）であり、色度座標はｘ＝０．５０７０、ｙ＝０．４７７４であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。色度座標の測定は、同分光光度計を用い、光路長：１ｃｍ及び分光光度計操作用ソフトウェア「カラー測定ソフトウェア Ｐ／Ｎ ２０６−６５２０７（株式会社島津製作所製）」にて照明：Ｄ６５、視野：２°と設定した条件下で行われた。また、ＳＥＭ写真を図２９に示す。ＳＥＭ写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。

【0051】

（金属微粒子Ｂの調製）
プレート状銀ナノ粒子Ａの水分散液１２０ｍｌに代えてプレート状銀ナノ粒子Ｂの水分散液１２０ｍｌを使用した以外は、金属微粒子Ａの調製と同様にして、プレート状銀ナノ粒子Ｂの表面が金で被覆された金属微粒子Ｂの水分散液（マゼンタ調）を調製した。この金属微粒子Ｂの水分散液を原液とした。原液を蒸留水で４倍容に希釈した水分散液の光学特性を図１０に示し、ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における原液の色度座標を図３３に示す。最大吸収を示す波長は５３４ｎｍ（消光度０．９）であり、色度座標はｘ＝０．４２７６、ｙ＝０．１７５１であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。色度座標の測定は、同分光光度計を用い、光路長：１ｃｍ及び分光光度計操作用ソフトウェア「カラー測定ソフトウェア Ｐ／Ｎ ２０６−６５２０７（株式会社島津製作所製）」にて照明：Ｄ６５、視野：２°と設定した条件下で行われた。また、ＳＥＭ写真を図３０に示す。ＳＥＭ写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。

【0052】

（金属微粒子Ｃの調製）
プレート状銀ナノ粒子Ａの水分散液１２０ｍｌに代えてプレート状銀ナノ粒子Ｃの水分散液１２０ｍｌを使用した以外は、金属微粒子Ａの調製と同様にして、プレート状銀ナノ粒子Ｃの表面が金で被覆された金属微粒子Ｃの水分散液（シアン調）を調製した。この金属微粒子Ｃの水分散液を原液とした。原液を蒸留水で４倍容に希釈した水分散液の光学特性を図１０に示し、ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における原液の色度座標を図３３に示す。最大吸収を示す波長は６３４ｎｍ（消光度０．９）であり、色度座標はｘ＝０．１４６７、ｙ＝０．２０９０であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。色度座標の測定は、同分光光度計を用い、光路長：１ｃｍ及び分光光度計操作用ソフトウェア「カラー測定ソフトウェア Ｐ／Ｎ ２０６−６５２０７（株式会社島津製作所製）」にて照明：Ｄ６５、視野：２°と設定した条件下で行われた。また、ＳＥＭ写真を図３１に示す。ＳＥＭ写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。

【0053】

（複数種の金属微粒子による混色の調製）
原液である金属微粒子Ａの水分散液及び金属微粒子Ｂの水分散液を等しい質量で混合したところ、赤色調の混合液Ａ（色度座標 ｘ：０．６０５７、ｙ：０．３３１７）が得られた。原液である金属微粒子Ｂの水分散液及び金属微粒子Ｃの水分散液を等しい質量で混合したところ、青色調の混合液Ｂ（色度座標 ｘ：０．１７３１、ｙ：０．０６７５）が得られた。原液である金属微粒子Ａの水分散液及び金属微粒子Ｃの水分散液を等しい質量で混合したところ、緑色調の混合液Ｃ（色度座標 ｘ：０．２５４９、ｙ：０．５７１２）が得られた。ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における混合液Ａ、Ｂ及びＣの色度座標を図３４に示す。色度座標の測定は、同分光光度計を用い、光路長：１ｃｍ及び分光光度計操作用ソフトウェア「カラー測定ソフトウェア Ｐ／Ｎ ２０６−６５２０７（株式会社島津製作所製）」にて照明：Ｄ６５、視野：２°と設定した条件下で行われた。

【0054】

（金属微粒子Ｄの調製）
プレート状銀ナノ粒子Ａの水分散液１２０ｍｌに代えてプレート状銀ナノ粒子Ｄの水分散液１２０ｍｌを使用した以外は、金属微粒子Ａの調製と同様にして、プレート状銀ナノ粒子Ｄの表面が金で被覆された金属微粒子Ｄの水分散液を調製した。調製した分散液を蒸留水で４倍容に希釈した水分散液の光学特性を図１０に示す。最大吸収を示す波長は７１４ｎｍ（消光度０．８）であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。また、ＳＥＭ写真を図３２に示す。ＳＥＭ写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。

【0055】

（金属微粒子Ｂの緩衝液中での安定性試験）
[プレート状銀ナノ粒子の緩衝液中での安定性]
先に調製されたプレート状銀ナノ粒子Ｂの分散液１ｍＬを蒸留水３ｍＬおよび１０ｍＭ ＰＢＳ（＋）緩衝液（塩化カルシウム二水和物（関東化学株式会社製）０．１３３ｇ、塩化マグネシウム六水和物（関東化学株式会社製）０．１ｇを蒸留水８００ｍＬで溶解し、市販の２００ｍＭ ＰＢＳ（−）溶液（関東化学株式会社製）５０ｍＬを添加し、全量を１Ｌとして調製）３ｍＬにそれぞれ添加し、４倍希釈とした。
調製した溶液の消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）を紫外可視近赤外分光光度計（装置名：紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣ、製造元：株式会社島津製作所）で測定した。プレート状銀ナノ粒子Ｂの波長５４２ｎｍの消光度減少率は約９０％であり、大幅に低下した。消光度測定結果を図１１に示す。

【0056】

[金被覆プレート状銀ナノ粒子の緩衝液中での安定性]
先に調製された金属微粒子Ｂの水分散液１ｍＬを蒸留水３ｍＬおよび１０ｍＭ ＰＢＳ（＋）緩衝液（塩化カルシウム二水和物（関東化学株式会社製）０．１３３ｇ、塩化マグネシウム六水和物（関東化学株式会社製）０．１ｇを蒸留水８００ｍＬで溶解し、市販の２００ｍＭ ＰＢＳ（−）溶液（関東化学株式会社製）５０ｍＬを添加し、全量を１Ｌとして調製）３ｍＬにそれぞれ添加し、４倍希釈とした。
調製した溶液の消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）を紫外可視近赤外分光光度計（装置名：紫外可視近赤外分光光度計 ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣ、製造元：株式会社島津製作所）で測定した。金属微粒子Ｂの波長５５６ｎｍの消光度減少率は約１．４％であり、殆ど変化が無く安定であった。消光度測定結果を図１２に示す。

【0057】

以上のことから、金属微粒子Ｂは、生化学緩衝液中での安定性に優れることが分かった。

【0058】

[イムノクロマト試験 実施例１]
金属微粒子Ａ〜Ｄを使用したコンカナバリンＡのイムノクロマト試験
（コンカナバリンＡイムノクロマト試験用展開液Ａ〜Ｄの調製）
５ｍＭのＰＢＳ（＋）緩衝液（２００ｍＭ ＰＢＳ溶液（製品名：ＰＢＳ溶液２０倍濃縮液、製造元：関東化学株式会社）を４０倍容に希釈し５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液を１Ｌ調製し、塩化カルシウム（関東化学株式会社製）の１ｇ／ｍＬ水溶液０．１ｍＬ及び、塩化マグネシウム六水和物（関東化学株式会社製）の１ｇ／ｍＬ水溶液０．０５ｍＬを添加して調製）中における濃度５０μｇ／ｍＬの抗コンカナバリンＡ抗体（品名：Ａｎｔｉ Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ、製造元：ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の溶液０．２ｍＬと、先に調製された金属微粒子Ａの分散液１．８ｍＬを混合し、得られた混合物を室温にて３０分間振とうした。次いで、遠心分離（７５０００ｒｐｍ、４℃、１時間）を行い、抗体−金属微粒子複合体を沈殿させ、上澄み液を除去した。その後、抗体−金属微粒子複合体を純水５００μＬ中に再分散させ、紫外可視分光光度計Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３（アジレント・テクノロジー株式会社製）を使用して消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）０．５５になるように調整し、展開液Ａを調製した。同様に、金属微粒子Ｂ〜Ｄの分散液を用いて、展開液Ｂ〜Ｄを調製した。

【0059】

（コンカナバリンＡのイムノクロマト試験１）
図１に示されるようなイムノクロマト試験を行った。抗コンカナバリンＡ抗体が直線状に固定化されたイムノクロマト試験紙を用いた。イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社（有限会社バイオデバイステクノロジー）より購入したものを使用した。抗コンカナバリンＡ抗体を直線状に固定する際、抗コンカナバリンＡ抗体溶液を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液(上記の市販品の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を蒸留水で２００倍容 希釈して作製)で濃度１ｇ／ｍＬに調整したものを使用した。第１の展開液は、５ｍＭのＰＢＳ（＋）緩衝液中におけるコンカナバリンＡ（品名：Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（Ｊａｃｋ Ｂｅａｎ）［Ｃｏｎ Ａ］，Ｊａｃｋ ｂｅａｎ（−）、株式会社Ｊ−オイルミルズ製）の溶液であり、コンカナバリンＡの濃度が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭ、０．６ｎＭ、０．０６ｎＭ及び０Ｍの溶液を用意した（ｐＨ７．４）。洗浄用展開液は５ｍＭのＰＢＳ（＋）緩衝液である（ｐＨ７．４）。第２の展開液には、上述の展開液Ａ〜Ｄを用いた（ｐＨ７．０）。具体的には、イムノクロマト試験紙に、各濃度の第１の展開液１５μＬをそれぞれ展開させた。次いで、洗浄用展開液である５ｍＭのＰＢＳ（＋）緩衝液３０μＬを展開させた。最後に、各種第２の展開液６０μＬを展開させた。展開液Ａ〜Ｄを用いた全てのイムノクロマト試験において、コンカナバリンＡの検出が展開液Ａでは６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭ、０．６ｎＭ、０．０６ｎＭの濃度に亘って目視により確認され、展開液Ｂ、Ｃ、Ｄでは６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭ、０．６ｎＭの濃度に亘って目視により確認された。結果を図１３に示す。

【0060】

（コンカナバリンＡのイムノクロマト試験２）
図２に示されるようなイムノクロマト試験を行った。イムノクロマト試験１と同じイムノクロマト試験紙を用いた。展開液には、展開液Ａ〜Ｄのうち１種の展開液６０μＬと、５ｍＭのＰＢＳ（＋）緩衝液中における濃度が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭ、０．６ｎＭ、０．０６ｎＭ又は０ＭのコナカバリンＡである溶液１５μＬとを混合したものを用いた（ｐＨ７．０）。具体的には、イムノクロマト試験紙に各種展開液を展開させた。全ての展開液において、コンカナバリンＡの検出が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭ、０．６ｎＭの濃度に亘って目視により確認できた。

【0061】

（コンカナバリンＡのイムノクロマト試験１の輝度解析）
コンカナバリンＡのイムノクロマト試験１での試験後のイムノクロマト試験紙をスキャニング（装置名：Ｃａｎｏ Ｓｃａｎ ＬｉＤＥ５００Ｆ、キヤノン株式会社）し、判定部分（抗コンカナバリンＡ抗体の固定化部分）と、判定部分以外の部分の最低輝度を画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｊ）で測定することにより、検出感度を数値化することができる。なお、Ｉｍａｇｅ−Ｊは、アメリカ国立衛生研究所でＷａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄが開発したオープン・ソースで公有の画像処理ソフトウェアである（http://imagej.nih.gov/ij/）。検出感度は各部分をそれぞれ５回測定し、得られた数値の中央値の差とすることができる。輝度差解析の結果、金属微粒子Ａ、ＢではコンカナバリンＡの検出が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭ、０．６ｎＭ、０．０６ｎＭの濃度に亘って確認でき、金属微粒子Ｃ、ＤではコンカナバリンＡの検出が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭ、０．６ｎＭの濃度に亘って確認できた。輝度解析の結果を図１４〜１７、後述する球状金コロイドとの比較を図１９に示す。

【0062】

[イムノクロマト試験 実施例２]
金属微粒子Ｂを使用したＢ型肝炎ウイルス抗原のイムノクロマト試験
（Ｂ型肝炎ウイルス抗原イムノクマト試験用展開液の調製）
先に調製された金属微粒子Ｂの分散液２．０ｍＬの遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、金属微粒子を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、金属微粒子を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液１．８５ｍＬで再分散した。この作業を二回繰り返し、分散液のｐＨを７．４に調整した。
５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液（市販の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を４０倍希釈して調製）中における濃度５０μｇ／ｍＬの抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体（品名：Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ＨＢｓＡｇ、製造元：Ａｒｉｓｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）の溶液０．２ｍＬと、先に遠心分離によりｐＨを７．４に調整された金属微粒子Ｂの分散液１．８ｍＬを混合し、得られた混合物を室温にて３０分間振とうした。次いで、遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、抗体−金属微粒子複合体を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、抗体−金属微粒子複合体を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液で再分散させ、紫外可視分光光度計 Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３（アジレント・テクノロジー株式会社製）を使用して消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）０．３５になるように調整し、展開液Ｅを調製した。

【0063】

（Ｂ型肝炎ウイルス抗原のイムノクロマト試験）
図１に示されるようなイムノクロマト試験を行った。抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体が直線状に固定化されたイムノクロマト試験紙を用いた。イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社（有限会社バイオデバイステクノロジー）より購入したものを使用した。抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体を直線状に固定する際、抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体溶液を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液(上記の市販品の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を蒸留水で４０倍希釈して作製)で濃度１ｇ／ｍＬに調整したものを使用した。第１の展開液は、１ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中におけるＢ型肝炎ウイルス抗原（品名：ＨＢｓＡｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｕｂｔｙｐｅ ａｄｒ）、製造元：Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）の溶液であり、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の濃度が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭ、０Ｍ（Ｂｌａｎｋ）の溶液を用意した。洗浄用展開液は５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液である。第２の展開液には、上述の展開液Ｅを用いた。具体的には、イムノクロマト試験紙に、各濃度の第１の展開液１５μＬをそれぞれ展開させた。次いで、洗浄用展開液である５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液３０μＬを展開させた。最後に、第２の展開液６０μＬを展開させた。本イムノクロマト試験において、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の検出が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭの濃度に亘って目視により確認された。結果を図２０に示す。

【0064】

（Ｂ型肝炎ウイルス抗原のイムノクロマト試験の輝度解析）
Ｂ型肝炎ウイルス抗原のイムノクロマト試験での試験後のイムノクロマト試験紙をスキャニング（装置名：Ｃａｎｏ Ｓｃａｎ ＬｉＤＥ５００Ｆ、製造元：キヤノン株式会社）し、判定部分（抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体の固定化部分）と、判定部分以外の部分の最低輝度を画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｊ）で測定することにより、検出感度を数値化することができる。検出感度は各部分をそれぞれ５回測定し、得られた数値の中央値の差とすることができる。輝度差解析の結果、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の検出が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭの濃度に亘って確認された。輝度解析の結果を図２１、球状金コロイドとの比較を図２３に示す。

【0065】

[イムノクロマト試験 実施例３]
多色イムノクロマト試験
（多色イムノクロマト試験用展開液の調製）
先に調製された金属微粒子Ａ〜Ｃの分散液２．０ｍＬの遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、金属微粒子を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、金属微粒子を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液１．８５ｍＬで再分散した。この作業を二回繰り返し、分散液のｐＨを７．４に調整した。
５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液（市販の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を４０倍希釈して調製）中における濃度５０μｇ／ｍＬの抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体（品名：Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ＨＢｓＡｇ、製造元：Ａｒｉｓｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）の溶液０．２ｍＬと、先に遠心分離によりｐＨを７．４に調整された金属微粒子Ａ〜Ｃの分散液１．８ｍＬを混合し、得られた混合物を室温にて３０分間振とうした。次いで、遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、抗体−金属微粒子複合体を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去し抗体-金属微粒子複合体の１３．３倍濃縮液を調製した。該濃縮液を紫外可視分光光度計 Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３（アジレント・テクノロジー株式会社製）を使用して消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）２．０になるように５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液で１４倍希釈し、展開液Ｆ〜Ｈを調製した。また、前述の濃縮液を７倍希釈し、２倍濃度の濃縮展開液Ｆ〜Ｈを調製し、これらを図２４に従って調合し、展開液Ｉ〜Ｌを調製した。展開液Ｆ〜Ｌの分光特性測定結果を図２５、２６に示す。図２５、２６に示すように球状金コロイドを使用した展開液の場合、単色設計しかできないが、本発明のように、金属微粒子Ａ、Ｂ、Ｃを使用した場合は多色設計が可能であった。

【0066】

（多色イムノクロマト試験）
図１に示されるようなイムノクロマト試験を行った。抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体が直線状に固定化されたイムノクロマト試験紙を用いた。イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社（有限会社バイオデバイステクノロジー）より購入したものを使用した。抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体を直線状に固定する際、抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体溶液を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液(上記の市販品の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を蒸留水で４０倍希釈して作製)で濃度１ｇ／ｍＬに調整したものを使用した。第１の展開液は、１ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中におけるＢ型肝炎ウイルス抗原（品名：ＨＢｓＡｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｕｂｔｙｐｅ ａｄｒ）、製造元：Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）の溶液であり、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の濃度が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭ、０Ｍ（Ｂｌａｎｋ）の溶液を用意した。洗浄用展開液は５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液である。第２の展開液には、上述の展開液Ｆ〜Ｌを用いた。具体的には、イムノクロマト試験紙に、各濃度の第１の展開液１５μＬをそれぞれ展開させた。次いで、洗浄用展開液である５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液３０μＬを展開させた。最後に、第２の展開液６０μＬを展開させた。本イムノクロマト試験において、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の検出が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭの濃度に亘って目視により確認された。また、検出ラインの色が展開液により異なり、展開液Ｆ使用時はイエロー調、展開液Ｇ使用時はマゼンタ調、展開液Ｈ使用時はシアン調、展開液Ｉ使用時は赤色調、展開液Ｊ使用時は青色調、展開液Ｋ使用時は緑色調、展開液Ｌ使用時は黒色調の色を呈した。
よって、図５や図６に示されるようなイムノクロマト試験を行う場合（クロマトグラフ担体に、複数の異種の分子（ｂ）が異なる位置に直線状に固定化され、判定部分が形成されている場合）、金属微粒子（ａ）の色調の違いを利用して、それぞれの固定化部分を異なる色を呈する検出ラインとして機能できることが分かる（検出ラインの多色化）。これにより、複数の被験物質を一度に検出できることも分かる。

【0067】

（多色イムノクロマト試験結果の測色）
多色イムノクロマト試験により得られたイムノクロマト紙をスキャニング（装置名：Ｃａｎｏ Ｓｃａｎ ＬｉＤＥ５００Ｆ、製造元：キヤノン株式会社）し、得られた画像をビットマップ画像編集ソフトウェアのＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで取り込み、検出ラインのＣＩＥＬＡＢ Ｄ５０を測定した。測色の結果を図２７に示す。

【0068】

[イムノクロマト試験 実施例４]
金属微粒子Ｂ及びＣを使用したＢ型肝炎ウイルス抗原及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの二検体二色検出イムノクロマト試験
（Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンイムノクマト試験用複合体分散液Ａの調製）
先に調製された金属微粒子Ｂの分散液２．０ｍＬの遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、金属微粒子を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、金属微粒子を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液１．８５ｍＬで再分散した。この作業を二回繰り返し、分散液のｐＨを７．４に調整した。５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液（市販の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を４０倍希釈して調製）中における濃度５０μｇ／ｍＬの抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体（品名：Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ＨＢｓＡｇ、製造元：Ａｒｉｓｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）の溶液０．２ｍＬと、先に遠心分離によりｐＨを７．４に調整された金属微粒子Ｂの分散液１．８ｍＬを混合し、得られた混合物を室温にて６０分間振とうした。その後、３．２６ｗｔ％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−５ｍＭ ＰＢＳ（−）溶液１００μＬを添加し、得られた混合物を室温にて６０分間振とうした。次いで、遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、抗体−金属微粒子複合体を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、抗体−金属微粒子複合体を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液で再分散させ、紫外可視分光光度計 Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３（アジレント・テクノロジー株式会社製）を使用して消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）１．０になるように調整し、複合体分散液Ａを調製した。

【0069】

（Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンイムノクマト試験用複合体分散液Ｂの調製）
先に調製された金属微粒子Ｃの分散液２．０ｍＬの遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、金属微粒子を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、金属微粒子を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液１．８５ｍＬで再分散した。この作業を二回繰り返し、分散液のｐＨを７．４に調整した。５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液（市販の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を４０倍希釈して調製）中における濃度５０μｇ／ｍＬの抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体（品名：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩ−ＨＵＭＡＮ ＣＨＯＲＩＯＮＩＣ ＧＯＮＡＤＯＴＲＯＰＩＮ、製造元：Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ製）の溶液０．２ｍＬと、先に遠心分離によりｐＨを７．４に調整された金属微粒子Ｃの分散液１．８ｍＬを混合し、得られた混合物を室温にて３０分間振とうし、その後４℃にて２４時間静置した。次いで、遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、抗体−金属微粒子複合体を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、抗体−金属微粒子複合体を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液で再分散させ、紫外可視分光光度計 Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３（アジレント・テクノロジー株式会社製）を使用して消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）１．０になるように調整し、複合体分散液Ｂを調製した。

【0070】

（Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンイムノクマト試験用展開液Ｍの調製）
先に調製された金属微粒子Ａの分散液２．０ｍＬの遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、金属微粒子を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、金属微粒子を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液１．８５ｍＬで再分散した。この作業を二回繰り返し、分散液のｐＨを７．４に調整した。その後、ｐＨ７．４に調整した金属微粒子Ａの分散液を紫外可視分光光度計 Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３（アジレント・テクノロジー株式会社製）を使用して消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）１．０になるように調整し、ｐＨ調整分散液Ａを調整した。ｐＨ調整分散液Ａと、複合体分散液Ａと、複合体分散液Ｂとを等しい体積比で混合し、展開液Ｍ（色調：黒色調）を調製した。

【0071】

（Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのイムノクロマト試験）
図５に示されるようなイムノクロマト試験を行った。抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体および抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体がそれぞれ直線状に固定化されたイムノクロマト試験紙（展開液が展開する方向から見て下流側に抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体が固定され、展開液が展開する方向から見て上流側に抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体が固定される）を用いた。イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社（有限会社バイオデバイステクノロジー）より購入したものを使用した。抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体および抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体を直線状に固定する際、各抗体溶液を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液(上記の市販品の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を蒸留水で４０倍希釈して作製)で濃度１ｇ／ｍＬに調整したものを使用した。第１の展開液は、５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中におけるＢ型肝炎ウイルス抗原（品名：ＨＢｓＡｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｕｂｔｙｐｅ ａｄｒ）、製造元：Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）とヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（品名：ｈＣＧ Ｈｕｍａｎ（−）、製造元：Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．製）の混合溶液であり、両抗原濃度が０．３μＭ、０．０３μＭ、０．００３Ｍ、０Ｍ（Ｂｌａｎｋ）である混合溶液を用意した。洗浄用展開液は５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液である。第２の展開液には、展開液Ｍを用いた。具体的には、イムノクロマト試験紙に、各濃度の第１の展開液３０μＬをそれぞれ展開させた。次いで、洗浄用展開液である５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液３０μＬを展開させた。最後に、第２の展開液１２０μＬを展開させた。本イムノクロマト試験において、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の検出が０．３μＭ、０．０３０μＭ、０．００３μＭの濃度に亘って目視により確認され、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの０．３μＭ、０．０３μＭの濃度に亘って確認された。結果を図３５に示す。また、検出ラインの色調は、抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体の固定化部分がシアン調、抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体の固定化部分がマゼンタ調であった。

【0072】

（Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの二検体二色検出イムノクロマト試験結果の測色）
二検体二色検出イムノクロマト試験により得られたイムノクロマト紙をスキャニング（装置名：Ｃａｎｏ Ｓｃａｎ ＬｉＤＥ５００Ｆ、製造元：キヤノン株式会社）し、得られた画像をビットマップ画像編集ソフトウェアのＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで取り込み、検出ラインのＣＩＥＬＡＢ Ｄ５０を測定した。測色の結果を図３６に示す。

【0073】

（Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの二検体二色検出イムノクロマト試験の輝度解析）
二検体二色検出イムノクロマト試験での試験後のイムノクロマト試験紙をスキャニング（装置名：Ｃａｎｏ Ｓｃａｎ ＬｉＤＥ５００Ｆ、製造元：キヤノン株式会社）し、判定部分（抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体および抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体の固定化部分）と、判定部分以外の部分の最低輝度を画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｊ）で測定することにより、検出感度を数値化することができる。検出感度は各部分をそれぞれ５回測定し、得られた数値の中央値の差とすることができる。輝度差解析の結果、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の検出が０．３μＭ、０．０３μＭ、０．００３μＭの濃度に亘って確認され、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの０．３μＭ、０．０３μＭの濃度に亘って確認された。輝度解析の結果を図３７に示す。

【0074】

[イムノクロマト試験 実施例５]
高精彩多色イムノクロマト試験
（高精彩多色イムノクロマト試験用展開液の調製）
先に調製された金属微粒子Ａ〜Ｃの分散液２．０ｍＬの遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、金属微粒子を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、金属微粒子を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液１．８５ｍＬで再分散した。この作業を二回繰り返し、分散液のｐＨを７．４に調整した。
５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液（市販の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を４０倍希釈して調製）中における濃度５０μｇ／ｍＬの抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体（品名：Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ＨＢｓＡｇ、製造元：Ａｒｉｓｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）の溶液０．２ｍＬと、先に遠心分離によりｐＨを７．４に調整された金属微粒子Ａ〜Ｃの分散液１．８ｍＬを混合し、得られた混合物を室温にて３０分間振とうした。その後、３．２６ｗｔ％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−５ｍＭ ＰＢＳ（−）溶液１００μＬを該混合物に添加し、得られた混合物を室温にて６０分間振とうした。次いで、遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、抗体−金属微粒子複合体を沈殿させ、上澄み液１．７５ｍＬを除去し、その後、沈殿物に０．１６ｗｔ％ ＢＳＡ−５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液０．７５ｍＬを添加し、抗体−金属微粒子複合体の２倍濃縮液を調製した。該濃縮液を０．１６ｗｔ％ ＢＳＡ−５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液で３．０倍希釈し、展開液Ｎ〜Ｐを調製した。また、前述の濃縮液を図３８に従って調合し、展開液Ｑ〜Ｔを調製した。

【0075】

（高精彩多色イムノクロマト試験）
図１に示されるようなイムノクロマト試験を行った。抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体が直線状に固定化されたイムノクロマト試験紙を用いた。イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社（有限会社バイオデバイステクノロジー）より購入したものを使用した。抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体を直線状に固定する際、抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体溶液を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液(上記の市販品の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を蒸留水で４０倍希釈して作製)で濃度１ｇ／ｍＬに調整したものを使用した。第１の展開液は、１ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中におけるＢ型肝炎ウイルス抗原（品名：ＨＢｓＡｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｕｂｔｙｐｅ ａｄｒ）、製造元：Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）の溶液であり、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の濃度が０．６０μＭ、０Ｍ（Ｂｌａｎｋ）の溶液を用意した。洗浄用展開液は５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液である。第２の展開液には、上述の展開液Ｎ〜Ｔを用いた。具体的には、イムノクロマト試験紙に、各濃度の第１の展開液１５μＬをそれぞれ展開させた。次いで、洗浄用展開液である５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液３０μＬを展開させた。最後に、第２の展開液６０μＬを展開させた。本イムノクロマト試験において、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の検出が０．６μＭの濃度で目視により確認され、０μＭ（Ｂｌａｎｋ）の濃度では確認されず、非特異検出が無いことが確認された。また、検出ラインの色が展開液により異なり、展開液Ｎ使用時はイエロー調、展開液Ｏ使用時はマゼンタ調、展開液Ｐ使用時はシアン調、展開液Ｑ使用時は赤色調、展開液Ｒ使用時は青色調、展開液Ｓ使用時は緑色調、展開液Ｔ使用時は黒色調の色を呈した。

【0076】

（高精彩多色イムノクロマト試験結果の測色）
高精彩多色イムノクロマト試験により得られたイムノクロマト紙をスキャニング（装置名：Ｃａｎｏ Ｓｃａｎ ＬｉＤＥ２２０、製造元：キヤノン株式会社）し、得られた画像をビットマップ画像編集ソフトウェアのＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで取り込み、検出ラインのＣＩＥＬＡＢ Ｄ５０を測定した。測色の結果を図３９に示す。

【0077】

[イムノクロマト試験 比較例１]
球状金コロイドを使用したコンカナバリンＡのイムノクロマト試験
（球状金コロイドを使用したコンカナバリンＡのイムノクマト試験用展開液の調製）
市販の球状金コロイド分散液（品名：Ａｕコロイド溶液−ＳＣ、粒径：４０ｎｍ、製造元：田中貴金属株式会社）１０ｍＬに５質量％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）水溶液３．５ｍＬを添加、攪拌後、一晩静置し、金コロイド調整液を作製した。
上記の金コロイド調整液２．０ｍＬの遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、金微粒子を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、金微粒子を５ｍＭのＰＢＳ（＋）緩衝液（２００ｍＭ ＰＢＳ溶液（製品名：ＰＢＳ溶液２０倍濃縮液、製造元：関東化学株式会社）を４０倍容に希釈し５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液を１Ｌ調製し、塩化カルシウム（関東化学株式会社製）の１ｇ／ｍＬ水溶液０．１ｍＬ及び、塩化マグネシウム六水和物（関東化学株式会社製）の１ｇ／ｍＬ水溶液０．０５ｍＬを添加して調製）１．８５ｍＬで再分散した。この作業を二回繰り返し、分散液のｐＨを７．４に調整した。
５ｍＭのＰＢＳ（＋）緩衝液中における濃度５０μｇ／ｍＬの抗コンカナバリンＡ抗体（品名：Ａｎｔｉ Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ、製造元：ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の溶液０．２ｍＬと、先に調製された金コロイドの分散液１．８ｍＬを混合し、得られた混合物を室温にて３０分間振とうした。次いで、遠心分離（７５０００ｒｐｍ、４℃、１時間）を行い、抗体−金コロイド複合体を沈殿させ、上澄み液を除去した。その後、抗体−金コロイド複合体を純水５００μＬ中に再分散させ、紫外可視分光光度計Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３（アジレント・テクノロジー株式会社製）を使用して消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）０．３５になるように調整し、抗体−金コロイド展開液Ｉを調製した。

【0078】

（金コロイドを使用したコンカナバリンＡのイムノクロマト試験）
図１に示されるようなイムノクロマト試験を行った。抗コンカナバリンＡ抗体が直線状に固定化されたイムノクロマト試験紙を用いた。イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社（有限会社バイオデバイステクノロジー）より購入したものを使用した。抗コンカナバリンＡ抗体を直線状に固定する際、抗コンカナバリンＡ抗体溶液を５ｍＭ ＰＢＳ（＋）緩衝液で濃度１ｇ／ｍＬに調整したものを使用した。第１の展開液は、５ｍＭのＰＢＳ（＋）緩衝液中におけるコンカナバリンＡ（品名：Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（Ｊａｃｋ Ｂｅａｎ）［Ｃｏｎ Ａ］，Ｊａｃｋ ｂｅａｎ（−）、株式会社Ｊ−オイルミルズ製）の溶液であり、コンカナバリンＡの濃度が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭ、０．６ｎＭ、０．０６ｎＭ及び０Ｍの溶液を用意した。洗浄用展開液は５ｍＭのＰＢＳ（＋）緩衝液である。第２の展開液には、上述の抗体−金コロイド展開液Ｉを用いた。具体的には、イムノクロマト試験紙に、各濃度の第１の展開液１５μＬをそれぞれ展開させた。次いで、洗浄用展開液である５ｍＭのＰＢＳ（＋）緩衝液３０μＬを展開させた。最後に、第２の展開液である抗体−金コロイド展開液Ｉ６０μＬを展開させた。イムノクロマト試験の結果、コンカナバリンＡの検出が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭの濃度に亘って目視により確認された。結果を図１３に示す。

【0079】

（球状金コロイドを使用したコンカナバリンＡのイムノクロマト試験の輝度解析）
球状金コロイドを使用したコンカナバリンＡのイムノクロマト試験での試験後のイムノクロマト試験紙をスキャニング（装置名：Ｃａｎｏ Ｓｃａｎ ＬｉＤＥ５００Ｆ、キヤノン株式会社）し、判定部分（抗コンカナバリンＡ抗体の固定化部分）と、判定部分以外の部分の最低輝度を画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｊ）で測定することにより、検出感度を数値化することができる。検出感度は各部分をそれぞれ５回測定し、得られた数値の中央値の差とすることができる。輝度差解析の結果、球状金コロイドではコンカナバリンＡの検出が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭの濃度に亘って確認できた。輝度解析の結果を図１８、金属微粒子Ａ〜Ｄとの比較を図１９に示す。

【0080】

[イムノクロマト試験 比較例２]
球状金コロイドを使用したＢ型肝炎ウイルス抗原のイムノクロマト試験
（球状金コロイドを使用したＢ型肝炎ウイルス抗原イムノクマト試験用展開液の調製）
市販の球状金コロイド分散液（品名：Ａｕコロイド溶液−ＳＣ、粒径：４０ｎｍ、製造元：田中貴金属株式会社）１０ｍＬに５質量％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）水溶液３．５ｍＬを添加、攪拌後、一晩静置し、金コロイド調整液を作製した。
上記の金コロイド調整液２．０ｍＬの遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、金微粒子を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、金微粒子を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液１．８５ｍＬで再分散した。この作業を二回繰り返し、分散液のｐＨを７．４に調整した。
５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液（市販の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を２００倍希釈して調製）中における濃度５０μｇ／ｍＬの抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体（品名：Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ＨＢｓＡｇ、製造元：Ａｒｉｓｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）の溶液０．２ｍＬと、先に遠心分離によりｐＨを７．４に調整された金コロイド調整液１．８ｍＬを混合し、得られた混合物を室温にて３０分間振とうした。次いで、遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、抗体−金コロイド複合体を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去し、抗体−金コロイド複合体の１３．３倍濃縮液を調製した。その後、該濃縮液を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液で希釈、紫外可視分光光度計Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３（アジレント・テクノロジー株式会社製）を使用して消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）０．３５になるように調整し、抗体−金コロイド展開液ＩＩを調製した。また、該濃縮液を３倍希釈し消光度２．０の抗体−金コロイド展開液ＩＩＩを調製し、後述するＢ型肝炎ウイルス抗原イムノクロマト試験結果の測色に使用するイムノクロマト試験に使用した。

【0081】

（金コロイドを使用したＢ型肝炎ウイルス抗原のイムノクロマト試験）
図１に示されるようなイムノクロマト試験を行った。抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体が直線状に固定化されたイムノクロマト試験紙を用いた。イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社（有限会社バイオデバイステクノロジー）より購入したものを使用した。抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体を直線状に固定する際、抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体溶液を１ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液(上記の市販品の２００ｍＭ ＰＢＳ溶液を蒸留水で２００倍希釈して作製)で濃度１ｇ／ｍＬに調整したものを使用した。第１の展開液は、１ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中におけるＢ型肝炎ウイルス抗原（品名：ＨＢｓＡｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｕｂｔｙｐｅ ａｄｒ）、製造元：Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）の溶液であり、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の濃度が６μＭ、０．６０μＭ、０．０６μＭ、６ｎＭ、０Ｍ（Ｂｌａｎｋ）の溶液を用意した。洗浄用展開液は１ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液である。第２の展開液には、先に調製された消光度０．３５に調整した抗体−金コロイド展開液ＩＩを用いた。具体的には、イムノクロマト試験紙に、各濃度の第１の展開液１５μＬをそれぞれ展開させた。次いで、洗浄用展開液である１ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液３０μＬを展開させた。最後に、第２の展開液６０μＬを展開させた。本イムノクロマト試験において、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の検出が６μＭ、０．６０μＭの濃度に亘って目視により確認できた。結果を図２０に示す。また、検出ラインの色は赤紫色であった。

【0082】

（球状金コロイドを使用したＢ型肝炎ウイルス抗原のイムノクロマト試験の輝度解析）
球状金コロイドを使用したＢ型肝炎ウイルス抗原のイムノクロマト試験での試験後のイムノクロマト試験紙をスキャニング（装置名：Ｃａｎｏ Ｓｃａｎ ＬｉＤＥ５００Ｆ、製造元：キヤノン株式会社）し、判定部分（抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体の固定化部分）と、判定部分以外の部分の最低輝度を画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｊ）で測定することにより、検出感度を数値化することができる。検出感度は各部分をそれぞれ５回測定し、得られた数値の中央値の差とすることができる。輝度差解析の結果、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の検出が６μＭ、０．６０μＭの濃度に亘って確認された。輝度解析の結果を図２２、金属微粒子Ｂとの比較を図２３に示す。

【0083】

[イムノクロマト試験 比較例３]
（金コロイドを使用したＢ型肝炎ウイルス抗原イムノクロマト試験結果の測色）
先に調製された消光度２．０に調整した抗体−金コロイド展開液ＩＩＩを使用したＢ型肝炎ウイルス抗原イムノクロマト試験により得られたイムノクロマト紙をスキャニング（装置名：Ｃａｎｏ Ｓｃａｎ ＬｉＤＥ５００Ｆ、製造元：キヤノン株式会社）し、得られた画像をビットマップ画像編集ソフトウェアのＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで取り込み、検出ラインのＣＩＥＬＡＢ Ｄ５０を測定した。抗体−金コロイド展開液ＩＩＩの分光特性を図２５、測色の結果を図２７に示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】