特許 6440968 ＩｇＳＦ４／ＴＳＬＣ１／ＣＡＤＭ１を特異的に認識できる抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6440968

(24)【登録日】2018年11月30日

(45)【発行日】2018年12月19日

(54)【発明の名称】ＩｇＳＦ４／ＴＳＬＣ１／ＣＡＤＭ１を特異的に認識できる抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20181210BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20181210BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20181210BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20181210BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20181210BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20181210BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28

   C12N5/10

   C12P21/08

   G01N33/53 N

   G01N33/574 D

   !C12N15/13ZNA

【請求項の数】10

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2014-109037(P2014-109037)

(22)【出願日】2014年5月27日

(65)【公開番号】特開2015-7030(P2015-7030A)

(43)【公開日】2015年1月15日

【審査請求日】2017年4月20日

(31)【優先権主張番号】特願2013-111443(P2013-111443)

(32)【優先日】2013年5月28日

(33)【優先権主張国】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01621

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01622

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01623

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01626

(73)【特許権者】

【識別番号】504224153

【氏名又は名称】国立大学法人 宮崎大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000125381

【氏名又は名称】学校法人藤田学園

(73)【特許権者】

【識別番号】503196776

【氏名又は名称】株式会社ペルセウスプロテオミクス

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】森下 和広

(72)【発明者】

【氏名】黒澤 良和

(72)【発明者】

【氏名】黒澤 仁

(72)【発明者】

【氏名】須藤 幸夫

(72)【発明者】

【氏名】張 黎臨

【審査官】 市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０９０７５０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５１９４９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−３１７２２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本癌学会学術総会記事，２００６年，65th，p.277, O-520

【文献】 臨床血液，２００６年，Vol.47, No.9，p.1227, PS-3-46

【文献】 生化学，２００７年，抄録CD，p.4P-0944

【文献】 臨床血液，２００８年，Vol.49, No.9，p.1042, PS-2-22

【文献】 日本癌学会学術総会記事，２００８年，67th，p.338, P-5085

【文献】 日本癌学会学術総会記事，２００９年，68th，p.334, P-0781

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２１、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２２、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２３、又はＮＩＴＥ Ａ−０１６２６の何れかを有する抗体産生細胞が産生する抗IgSF4抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

IgSF４の細胞外領域に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、又はジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）である、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

成人性T細胞性白血病分子標的治療のためのコンパニオン診断に使用する、請求項１から３の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２１、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２２、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２３、又はＮＩＴＥ Ｐ−０１６２６の何れかを有する抗体産生細胞。

【請求項6】

請求項５に記載の抗体産生細胞を培地で培養し、培養物から抗体を採取することを含む、請求項１又は２に記載の抗体の製造方法。

【請求項7】

請求項１から３の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、医薬又は診断薬。

【請求項8】

請求項１から３の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、成人性T細胞性白血病診断薬。

【請求項9】

請求項１から３の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、成人性T細胞性白血病分子標的治療薬のコンパニオン診断薬。

【請求項10】

請求項１から３の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを生体組織由来の試料に接触させる工程を含む、成人性T細胞性白血病細胞の検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、成人T細胞白血病の診断に利用可能なヒトIgSF4/TSLC1/CADM1を特異的に認識できる抗IgSF4抗体に関する。さらに本発明は、抗IgSF4/TSLC1/CADM１抗体を含む組成物、特にATLの診断薬、及び分子標的治療薬の使用にあたってのコンパニオン診断薬に関する

【背景技術】

【0002】

成人T細胞白血病（ a d u l t T - c e l l l e u k e m i a； 以下ATLと称する） は、臓器浸潤を伴う予後不良の疾患であり、南九州を中心とする地域において特異的に見られる疾患として知られている。ATLは、リンパ球の中でＴ細胞が悪性化してリンパ節や血液の中で急激に異常増加して起こる白血病であり、その発症の基礎疾患としてはヒトＴ細胞白血病ウイルス（h u m a n T - c e l l l e u k e m i a v i r u s t y p e 1； 以下、HTLV-1と称する）の感染がある。ATLは、HTLV-1に感染してから発症までの潜伏期間が長く、また治療法についてもまだ完全に確立されたとは言えない。

【0003】

このような状況下においては、迅速かつ精確なATLの診断が非常に重要である。感度及び特異性の高いATL診断方法としては、細胞の形態、細胞表面マーカー検索或いはサザンブロット法を利用したHTLV-1のゲノム挿入の有無等を評価する方法が知られている（非特許文献１）。しかしながら、これらの方法は、簡便性が伴わないか又は精確性が乏しい診断であり、臨床現場での使用に適するシステムの作製は難しい。

【0004】

比較的簡便で、かつ感度、特異性の高い診断方法としては、ATL細胞表面に存在する細胞表面蛋白を検出することにより、ATL細胞を検出する方法が考えられる。具体的には、蛍光標識抗体を用いるフローサイトメーター（FACS:Fluorecence Activated Cell Sorting）法が挙げられる。フローサイトメーター法においては、ATL細胞表面蛋白の確定及びそれに結合する抗体の開発が必須となる。

【0005】

近年、がん治療薬領域において、分子標的治療薬の開発、応用に伴って、コンパニオン診断も重要な課題となりつつある。コンパニオン診断は薬剤効果、副作用の患者個人差を検査によりあらかじめ予測することで最適な投薬を補助することを目的として実施される手法である。このため分子標的治療薬の開発と同時にコンパニオン診断法の開発も行われることが望ましい。コンパニオン診断法では、種々の手法が用いられているが、フローサイトメーター法も一方法である。たとえば、最近上市されているＣＣＲ４を分子標的とした抗体薬ポテリジオのコンパニオン診断は、フローサイトメーター法を採用している。このコンパニオン診断法は、CCR4抗体を利用するものである。(ポテリジオテスト：協和メディックス)。しかしながら、ＣＣＲ４は、ＡＴＬ細胞にだけ発現しているではなく、Treg（Regulatoru T Cell;制御性T細胞）のような正常な免疫細胞にも発現しているため、当該方法でポテリジオ投与の対象患者を選択するには特異性に欠ける（非特許文献２）。

【0006】

このような状況を打開すべく、本発明者らは、（１）ATLに特異的に発現し、かつ診断に利用できる標的の探索と、（２）上記標的に特異的に結合し、コンパニオン診断に利用できる抗体の開発を目指した。本発明者らは以前に、成人難治性白血病を対象として発癌要因の相違に基づく体系的な細胞表面マーカーを調査解析（統合的ゲノム解析・網羅的遺伝子発現解析）し、IgSF4(TSLC1/CADM1)が成人T細胞白血病（ATL）の細胞表面に特異的に発現していることを見いだしており、診断マーカーとしての重要性を示している（非特許文献３及び４）。

【0007】

IgSF4に対する抗体は、複数のグループにより開発されているが、これまでに診断に適応可能な程特異性の高い抗体を実証した例はない。例えば、特許文献１ではATL細胞株、臨床検体での幅広いIgSF４の発現を示し、特許文献２では肝臓がんを中心とした固形癌由来のIgSF4を基にして抗体を作成している。当該抗体のATLに対する反応性も試験され、一定の反応性が示されているが、診断への有用性は未だ実証できていない。発明者らはこれらの差異を、IgSF4の構造が個々の癌によりことなること事に起因すると推測できることを示した（非特許文献５）。

【0008】

一方、特許文献３には、1000億個もの独立したクローンからなる巨大なヒト抗体ライブラリーを用いてインタクト細胞に対する抗体を取得する技術が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特許第４２２７８８１号

【特許文献2】特許第４９４２６４４号

【特許文献3】特許第４８７０３４８号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Yoshida M et al:Proc. Nat. Acad. Sci., 81, 2534-2537 1984

【非特許文献2】Ishida T, et al: Cancer Sci. 2006 Nov;97(11):1139-46.

【非特許文献3】Sasaki H et al., Blood．105(3)．p1204-1213．2005.2．

【非特許文献4】S Nakahata et al., Leukemia (2012) 1-9

【非特許文献5】Kitamura Y, et al., BBRC (383) 480-484 2009

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明者らは、ATL細胞表面に存在するIgSF4と結合する抗体の開発を目指してきた。一般的に癌細胞表面に存在する蛋白質は、癌種により異なる３次構造をもつことが多く、このような癌細胞表面に存在している状態（インタクトな蛋白）を認識する抗体は必ずしも容易なものではない。本発明は、ATLの簡便で特異的な診断薬として有用なヒトIgSF4/TSLC1/CADM1抗原を特異的に認識できる抗IgSF4抗体を提供することを解決すべき課題とした。更に本発明は、前記抗体を用いたATL診断薬及びATL細胞の検出方法を提供することを解決すべき課題とした。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の抗体の作製においては、標的のIgSF4(TSLC1/CADM1)が複合体形成、翻訳後修飾、オルタネティブスプライシング等の影響を受け多様な高次構造を提示しうることを勘案し、特にATLの細胞膜上に発現するIgSF4(TSLC1/CADM1)に対して特異性の高いATL診断に適正化された抗体の取得を目指した。本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、1000億個もの独立したクローンからなる巨大なヒト抗体ライブラリーとインタクト細胞に対する抗体取得技術（特許文献３）を用いて、ATL細胞に発現するIgSF4を特異的に認識する抗体をスクリーニングすることにより抗体を取得し、さらに取得された抗体の評価やスクリーニングにおいてはFACS、ELISA、更には免疫染色において特異性及び感度が高い抗体を選別することにより、ATL診断に適した抗体を取得することに成功した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

【0013】

本発明によれば、以下の何れかの抗IgSF4抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
（１）受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２１、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２２、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２３、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２４、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２５、又はＮＩＴＥ Ｐ−０１６２６の何れかを有する抗体産生細胞が産生する抗IgSF4抗体；
（２）受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２１、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２２、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２３、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２４、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２５、又はＮＩＴＥ Ｐ−０１６２６の何れかを有する抗体産生細胞が産生する抗IgSF4抗体のアミノ酸配列を改変することにより得られるアミノ酸配列を有し、ヒトIgSF4を特異的に認識できる抗体。

【0014】

好ましくは、抗体はIgG抗体又はヒト−マウスIgG抗体である。
好ましくは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgSF４の細胞外領域に特異的に結合する。
好ましくは、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')₂、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）、又は抗体由来の相補性決定領域(CDR)を含むペプチドである。
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、成人性T細胞性白血病分子標的治療のためのコンパニオン診断に使用することができる。

【0015】

本発明によればさらに、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２１、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２２、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２３、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２４、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２５、又はＮＩＴＥ Ｐ−０１６２６の何れかを有する抗体産生細胞が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体産生細胞を培地で培養し、培養物から抗体を採取することを含む、本発明の抗体の製造方法が提供される。

【0016】

本発明によればさらに、上記した本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、医薬又は診断薬が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、成人性T細胞性白血病診断薬が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、成人性T細胞性白血病分子標的治療薬のコンパニオン診断薬が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを生体組織由来の試料に接触させる工程を含む、成人性T細胞性白血病細胞の検出方法が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを生体組織由来の試料に接触させる工程を含む、成人性T細胞性白血病分子標的治療薬のためのコンパニオン診断方法が提供される。

【0017】

本発明によればさらに、医薬又は診断薬（特に、成人性T細胞性白血病診断薬）の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。

【発明の効果】

【0018】

本発明の抗体は、ヒトIgSF4と特異的に認識し、IgSF4発現しているATL細胞を特異的に認識することができる。本発明の抗体は特に患者のATL細胞に対する特異性及び親和性が高いものを選抜しているため、ATLについて良好な診断結果が得られる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、本発明で取得した抗IgSF4抗体とIgSF4細胞外ドメインELISAのデータを示す。

【図2】図２は、本発明で取得された抗IgSF4抗体とATL細胞を使用したフローサイトメトリーのデータを示す。

【図3】図３は、本発明で取得された抗IgSF4抗体とATL患者より提供された臨床検体サンプルを使用したフローサイトメトリーのデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明について更に詳細に説明する。
定義および一般的技術
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法およびその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。
本発明の方法および技術は一般に、別段示さない限り、当技術分野で周知である従来の方法に従って、本明細書全体にわたって引用し論じた種々の一般的参照文献およびより具体的な参照文献に記載されているように実施する。

【0021】

IgSF4/CADM1/TSLC1
本発明の抗体の検出対象であるIgSF4は免疫グロブリン・スーパーファミリーに属し、その発見経緯や構造的特徴に基づき他にもCADM1、TSLC1、SynCAM、Necl2などいくつもの名前をもつ。本明細書においては、本発明の抗体の検出対象であるIgSF4を、IgSF4/CADM1/TSLC1、IgSF4(TSLC1/CADM1)などと記す場合がある。本分子の役割は、精巣、神経、肥胖細胞、活性化ナチュラルキラー(NK)細胞等でも発現し、精子形成、シナプス形成、腹膜感染や気管支喘息、がん免疫に各々重要な役割を果たすことが、その後の独立した研究により報告されている。ヒトの11q23.2の遺伝子座に位置する。

【0022】

IgSF4は、構造上特別に限定せず、単量体、多量体、細胞膜に発現しているｉｎｔａｃｔ ｆｏｒｍ、細胞外領域に構成された可溶化ｆｏｒｍ、ｔｒｕｎｃｔｅｄ ｆｏｒｍ、また、遺伝子の変異や、欠損などによりｍｕｔａｔｉｏｎ ｆｏｒｍ、リン酸化などにより翻訳後修飾を受けたｆｏｒｍなども含め、すべてヒトIgSF4を意味する。

【0023】

反応する及び反応性
本明細書において、「反応する」と「反応性」は特別に示さない限り、同じのことを意味する。すなわち、抗体が抗原を認識すること。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔ IgSF4でもよいし、ｔｒｕｎｃｔｅｄ ｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったIgSF4でもよいし、変性したIgSF4でもよい。反応性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）、免疫染色、免疫沈降などが挙げられる。

【0024】

フローサイトメーターに用いる抗体としては、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ビオチンなどにより標識された抗体であっても、標識をされていない抗体であってもよい。用いた抗体の標識の有無、その種類により、蛍光標識アビジン、蛍光標識抗ヒト免疫グロブリン抗体などを使用する。反応性は、十分量の抗IgSF4抗体（通常最終濃度が０．０１〜１０μｇ／ｍＬ）を検体に加えて行い、陰性対照抗体、陽性対照抗体の反応性との比較を行うことにより評価することができる。

【0025】

抗体
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号（括弧内）を使用する。
重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）

【0026】

本明細書において、「抗体」という用語は、イムノグロブリンと同義であり、当技術分野で通常知られている通りに理解されるべきである。具体的には、抗体という用語は、抗体を作製する任意の特定の方法により限定されるものではない。例えば、抗体という用語には、それだけに限らないが、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体がある。

【0027】

本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、可変領域および定常領域の配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。その用語は、ヒト遺伝子に由来する配列を有するが、例えば、考えられる免疫原性の低下、親和性の増大、望ましくない折りたたみを引き起こす可能性があるシステインの除去などを行うように変化させている抗体を包含する。その用語はまた、ヒト細胞に特有でないグリコシル化を施すことができる、非ヒト細胞中で組換えにより作製されたそのような抗体をも包含する。これらの抗体は、様々な形で調製することができる。

【0028】

本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト由来の抗体を指し、非ヒト種の抗体配列に特徴的なアミノ酸残基が、ヒト抗体の対応する位置で認められる残基と置換されている。この「ヒト化」の工程が、その結果得られる抗体のヒトでの免疫原性を低下させると考えられる。当技術分野で周知の技術を使用して、非ヒト由来の抗体をヒト化できることが理解されるであろう。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１４：４３〜４６（１９９３）を参照されたい。対象とする抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列と置換する組換えＤＮＡ技術によって工学的に作製することができる。例えば、ＷＯ９２／０２１９０、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７９２号、第５，７１４，３５０号、および第５，７７７，０８５号を参照できる。本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、その意味の範囲内で、キメラヒト抗体およびＣＤＲ移植抗体を含む。

【0029】

本発明の抗体の可変領域においてフレームワーク領域（ＦＲ）の配列は、対応する抗原に対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されない。ヒト抗体のＦＲ領域を用いることが好ましいが、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）のＦＲ領域を用いることもできる。

【0030】

本明細書において、「ファージ抗体」という用語は、ファージにより産生されたｓｃＦｖ抗体を意味する。つまり、ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体断片である。この断片は、Ｌｉｎｋｅｒとしてのアミノ酸以外、タグとしてのアミノ酸配列を含むことでもよい。

【0031】

本発明の抗体の一態様において、可変領域に加えて定常領域を含む（例えばIgG型抗体）。定常領域の配列は特に限定されない。例えば、公知のヒト抗体の定常領域を用いることができる。ヒト抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）としては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、軽鎖定常領域（ＣＬ）としては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。また、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）の定常領域を用いることもできる。

【0032】

本発明の抗体に用いられるＦＲまたは定常領域のアミノ酸配列は、由来となる元のＦＲまたは定常領域のアミノ酸配列をそのまま用いてもよいし、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸を欠失、付加、置換及び／または挿入して異なるアミノ酸配列にして用いてもよい。

【0033】

即ち、本発明の抗体は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２１、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２２、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２３、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２４、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２５、又はＮＩＴＥ Ｐ−０１６２６の何れかを有する抗体産生細胞が産生する抗IgSF4抗体のみならず、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２１、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２２、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２３、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２４、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２５、又はＮＩＴＥ Ｐ−０１６２６の何れかを有する抗体産生細胞が産生する抗IgSF4抗体のアミノ酸配列を改変することにより得られるアミノ酸配列を有し、ヒトIgSF4を特異的に認識できる抗体でもよい。

【0034】

上記において、「ヒトIgSF4を特異的に認識できる」とは、改変前の抗体と同様にヒトIgSF4への結合活性を有するということである。結合活性としては、抗原を認識することを意味する。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔ IgSF4でもよいし、ｔｒｕｎｃｔｅｄ ｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったIgSF4でもよいし、変性したIgSF4でもよい。たとえば、結合活性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）などが挙げられる。

【0035】

本発明において、「改変前の抗体と同様に」とは、必ずしも同程度の活性である必要はなく、活性が増強されていてもよいし、又、活性を有する限り活性が減少していてもよい。活性が減少している抗体としては、例えば、元の抗体と比較して３０％以上の活性、好ましくは５０％以上の活性、より好ましくは８０％以上の活性、さらに好ましくは９０％以上の活性、特に好ましくは９５％以上の活性を有する抗体を挙げることができる。

【0036】

上記の通り、本発明の抗体は、IgSF4に対する結合活性を有する限り、可変領域（ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列）のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。アミノ酸配列において、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されており、IgSF4に対する結合活性を有する抗体のアミノ酸配列を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V,Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12,9941-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492）などを用いて、IgSF4に対する結合活性を有する抗体のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、IgSF4に対する結合活性および／または抗腫瘍活性を有する抗体と機能的に同等な変異体を調製することができる。

【0037】

このように、可変領域において、１または数個のアミノ酸が変異しており、IgSF4に対する結合活性を有する抗体もまた本発明の抗体に含まれる。

【0038】

本発明の抗体は、その由来で限定されず、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、如何なる動物由来の抗体でもよい。又、キメラ化抗体、ヒト化抗体などでもよい。

【0039】

本発明の抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。得られた抗体が、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明で記載されているアミノ酸配列に翻訳後に修飾を受ける場合も本発明に含まれる。更に、既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。また、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。

【0040】

抗体の作製
（１）ファージディスプレイライブラリーにより抗原と反応するｓｃＦｖ
本発明の抗体の取得は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、IgSF4に対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、IgSF4に対する抗体を同定し単離することができる。好ましくは、ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを使用して生成されるｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は当技術分野で知られている。ヒトIgSF4を抗原としてスクリーニングした反応性を示すファージクローンから遺伝物質を回収する。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を決定することができる。このｓｃＦｖの配列を用いて、ｓｃＦｖをＩｇＧ化すれば、ヒト抗体を取得することができる。

【0041】

（２）ｓｃＦｖのＩｇＧ化（ヒト抗体の作製）
Ｈ鎖またＬ鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。また、ＶＨ及びＶＬを同一ベクターに発現すること（タンデム型）によりヒト抗体の取得もできる。これらの方法は周知であり、ＷＯ９２/０１０４７、ＷＯ９２/２０７９１、ＷＯ９３/０６２１３、ＷＯ９３/１１２３６、Ｗ０９３/１９１７２、ＷＯ９５/０１４３８、ＷＯ９５/１５３８８、ＷＯ９７/１０３５４などを参考にすることができる。

【0042】

具体的には、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長重鎖遺伝子を取得することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域でよいが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域である。ＩｇＧ１定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）やＧｍ（１７）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子またはアロタイプでよい。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換に相当する。

【0043】

ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長Ｌ鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）を取得することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλの定常領域でよい。κ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）やＩｎｖ（３）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子でよい。λ定常領域は、３つのλ遺伝子のいずれかに由来するものでよい。

【0044】

上記のように得られたＨ鎖またＬ鎖コードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入することにより、発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができるし、また両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入することもできる。抗体遺伝子を、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的な制限部位とベクターの連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入する。

【0045】

好適なベクターは、上記に記載のように任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し発現させることができるように工学的に作製された適当な制限部位を有する機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬイムノグロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域中のスプライス供与部位とヒトＣドメインに先行するスプライス受容部位の間で、またヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームでイムノグロブリン鎖のアミノ末端と連結するようにベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドでもよく、あるいは異種性シグナルペプチド（すなわち非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。

【0046】

本発明の抗体の発現ベクターは、抗体遺伝子および制御配列に加えて、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅とともに使用する）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子がある。

【0047】

以上の方法で作製された抗体遺伝子発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、本発明の抗体を産生させる可能であればいかなる細胞でもよいが、動物細胞が好ましい。動物細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ/ｄｈｆｒ (−)細胞ＣＨＯ/ＤＧ４４細胞、サル由来細胞ＣＯＳ細胞(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.１６０, ３３９３-３４０２ (１９９８))、ＳＰ２／Ｏ細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.５,５１２-５１９９(１９９６),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.５０,１４９５-１５０２ (１９９０)) など挙げられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６,６００７ (１９８９), P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８４,７４１３ (１９８７)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology ５２,４５６-４６７(１９７３))、ＤＥＡＥ-Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。

【0048】

形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト抗体を分離する。抗体の分離・精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。

【0049】

抗原結合フラグメント
本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして、抗体結合フラグメントを作製することができる。抗体結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')₂、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）、又は抗体由来の相補性決定領域(CDR)を含むペプチドを挙げることができる。

【0050】

Ｆａｂは、ＩｇＧをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のＨ鎖の一部及びＬ鎖をコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりＦａｂを調製することもできる。

【0051】

Ｆａｂ'は、後述のF(ａｂ')₂のＨ鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆａｂ'をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。

【0052】

Ｆ(ａｂ')₂は、ＩｇＧをペプシン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される断片（Ｆａｂ'）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆ(ａｂ')₂をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。

【0053】

ｓｃＦｖは、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とからなるＦｖを、片方の鎖のＣ末端と他方のＮ末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い（ＧＧＧＧＳ）₃などを用いることができる。例えば、上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカーをコードするＤＮＡを用いてｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｓｃＦｖを調製することができる。

【0054】

二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）は、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、scFv等）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、2つのVLと2つのVHを含む。Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント間の結合は非共有結合でも、共有結合でもよいが、好ましくは非共有結合である。

【0055】

ｄｓＦｖは、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の適切な位置にＣｙｓ残基を導入し、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたＦｖ断片である。各鎖におけるＣｙｓ残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｄｓＦｖを調製することができる。

【0056】

尚、適当なリンカーを用いてｓｃＦｖ抗体、ｄｃＦｖ抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。

【0057】

医薬及び診断薬
本発明によれば、本発明の抗体を含有する医薬又は診断薬が提供される。本発明一つの実施形態としてはATLの診断であるが、これに限らない。IgSF4の高発現によるATL以外の疾患についても、本発明の抗体を用いて診断することができる。好ましくは成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）であるが、固形癌（例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんなど）、または血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫など）なども診断対象に含まれる。
本発明の抗体が認識するIgSF4は、成人T細胞白血病（ATL）の細胞表面に特異的に発現していることから、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、成人性T細胞性白血病分子標的治療のためのコンパニオン診断に使用することができる。即ち、本発明によれば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、成人性T細胞性白血病分子標的治療薬のコンパニオン診断薬が提供される。

【0058】

例えば、本発明の抗体を用いて検体中に存在するATL細胞の検出又は定量を行うことができる。この場合、検体とは主にATL患者またはATLの疑いのある患者の血液であることが望ましい。また、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを生体組織由来の試料に接触させることによってATL細胞の検出を行い、これにより成人性T細胞性白血病分子標的治療薬のためのコンパニオン診断を行うことができる。

【0059】

診断薬を作製する際、抗体に直接もしくは間接的に標識を付加することによって、簡便な診断薬を設計することも可能である。リンカーには、抗体または薬剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。

【0060】

リンカーの例としては、Ｎ−スクシンイミジル４−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−１−カルボキシ−(６−アミドカプロエート) （ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−(α−マレイミドアセトキシ)−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−(β−マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−(ｐ−マレイミドフェニル)−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−(ｐ−マレイミドフェニル)イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６-マレイミドカプロイル(ＭＣ)、マレイミドプロパノイル(ＭＰ)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(ＰＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ) 及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(ＳＩＡＢ)等があげられるが、これらに限定されるものではない。また、このリンカーは例えば、バリン-シトルリン（Ｖａｌ-Ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン(ａｌａ−ｐｈｅ)のようなペプチドリンカーであってもよいし、上記にあげたリンカーをそれぞれ適時組み合わせて使用しても良い。

【0061】

上記の通り本発明の抗体は検出可能な物質により標識されていてもよい。この場合、検出可能な物質とは、光学的、電気化学的、放射化学的に検出可能なシグナルを放出または作製する物質である。例えば、蛍光色素、発光色素、放射性同位体（RI）、酵素等をあげることができる。また、このような、標識物質は、本発明の抗体に直接結合していてもいいし、また、本発明の抗体に特異的に結合する２次抗体を経由する方法であってもよい。

【0062】

また、本発明の抗体を含むATL診断薬キットを提供することもできる。ATL診断薬キットには、検体の前処理試薬、検体の後処理試薬、陰性コントロール抗体などを含めることができる。

【0063】

本発明の抗体及び診断薬は、潜在的なATL患者の診断をするだけではなく、治療前または治療中に、治療の有効性を判断する診断（いわゆるコンパニオン診断）としても利用できる。また、本発明においては、治療前または治療中のATL患者の治療の有効性を判断する材料としても利用が可能である。

【0064】

細胞の検出
細胞に結合した本発明の抗体の検出は、フローサイトメトリー法や、ELISA法等 およびその組み合わせによって行うことが可能である。本発明の抗体が結合した細胞を検出又は定量する装置としては、フローサイトメーター（FACS:Fluorescence Activagted Cell Sorter）が好ましい。血中循環癌細胞（CTC:CirculatingTumorCells）の測定の可能な他の測定器を用いる方法も考えられる。最も好ましくは、本発明の抗体が結合した細胞をフローサイトメーターにより測定することができる。この場合、本発明の抗体は、蛍光色素により標識されていることが好ましい。血液検体より得られた、血球細胞に本発明の抗体の蛍光標識物を接触させた後、フローサイトメーターにより解析することができる。

【0065】

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

【実施例】

【0066】

実施例１：癌細胞株を使用したファージ抗体スクリーニング
（１）癌細胞に結合するファージ抗体のスクリーニング（ATL細胞株S1T）
S1T細胞を任意の方法で培養した。細胞を回収し、冷却したＰＢＳで洗浄した後、１×１０¹³ｃｆｕのヒト抗体ファージライブラリー（特開２００５−１８５２８１号公報、ＷＯ２００８／００７６４８号公報、ＷＯ２００６／０９０７５０号公報を参照）を混ぜ、最終容積１．６ｍＬになるように反応液（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）を添加し、４℃にて４時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれ事前に用意した０．６ｍＬの有機溶液(ｄｉｂｕｔｙｌ ｐｈｔａｌａｔｅ ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ９：１)に重層し、マイクロ遠心機により２分間遠心（３０００ｒｐｍ）した。上清を捨て、チューブの底に沈降した細胞を０．７ｍＬの１％ＢＳＡ/ＭＥＭで懸濁し、更に０．７ｍＬの有機溶媒に重層した。同じように遠心により上清を捨て、細胞を０．３ｍＬのＰＢＳで懸濁し、液体窒素で凍結した。

【0067】

凍結した細胞を３７℃で解凍し、２０ｍＬの大腸菌ＤＨ１２Ｓ（ＯＤ０．５）に１時間で感染させた。ファージに感染した大腸菌を６００ｍＬの２×ＹＴＧＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ、１％ Ｇｌｕｃｏｓｅ）に入れ、３０℃で一晩培養した。その後１０ｍＬを取り、２００ｍＬ ２×ＹＴＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ）に入れ、３７℃で１．５時間培養した。１×１０¹¹ヘルパーファージＫＯ７を入れ、更に３７℃で１時間培養した。８００ｍＬの２×ＹＴＧＡＫ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ、０．０５％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、５０μｇ/ｍＬｋａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、３０℃で一晩培養した。１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）により上清を回収した。回収した上清に２００ｍＬのＰＥＧ液（２０％ ｐｏｌｙｅｔｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を入れよく攪拌した後、１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）によりファージを沈殿させた。これを１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、これが１ｓｔスクリーニングのファージとした。

【0068】

次は、２ｎｄスクリーニングを行った。２×１０⁷培養細胞と１×１０¹⁰１ｓｔスクリーニングのファージを混合し、最終容積０．８ｍＬになるように反応液を（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）入れた。その後は上記１ｓｔスクリーニングと同様の手法を行い、２ｎｄスクリーニングのファージを取得した。

【0069】

３ｒｄスクリーニングは１×１０⁹の２ｎｄスクリーニングのファージを使用し、上記と同じように行った。

【0070】

（２）ファージ抗体の解析
３ｒｄスクリーニングしたファージを回収し、既存法によりＤＮＡ配列を解析し、欠損領域を保持する不完全な抗体や配列が重複する抗体を排除し、独立した抗体配列を持つファージ抗体を取得した（特許第４８７０３４８を参照）。

【0071】

同様の手法により、他のATL細胞株であるKK1、MT2細胞を用いて、細胞膜上に反応するファージ抗体のスクリーニングを行った。その結果、後述のELISA試験においてIgSF4に反応できる独立配列を有するファージ抗体２９種類の抗体を取得した。

【0072】

実施例２：可溶性IgSF4と反応するファージのスクリーニング
（１）可溶性IgSF4抗原産生細胞の作製
ATL細胞株S1Tを用いて、IgSF4のｃＤＮＡをＰＣＲ法により作製した。常法によりIgSF4 細胞外ドメインのｃＤＮＡを調整し、ｐＣＭＶ-Ｓｃｒｉｐｔ（クロンテク社製）に挿入することにより、可溶性IgSF4抗原発現ベクターを作製した。この発現ベクターを細胞株２９３Ｔへ導入し、可溶性IgSF4抗原を産生する発現細胞を作製した。

【0073】

（２）ＥＬＩＳＡによる陽性ファージのスクリーニング
上記可溶性IgSF4産生細胞の上清を回収し、精製により可溶性IgSF4抗原を取得した。この可溶性IgSF4抗原を用いてＥＬＩＳＡによる抗原抗体の反応性を検討した。すなわち、可溶性IgSF4抗原をＰＢＳで１0μg/ｍＬになるように調整し、Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ Ｐｌａｔｅｓ（ＮＵＮＫ）に50μＬ/ｗｅｌｌに添加し、３７℃で２時間静置した。その後、可溶性IgSF4抗原を捨て、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ液（５％ スキムミルク / ０．０５％ ＮａＮ３/ ＰＢＳ)２００μＬ/ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳにより洗浄し、上記２ｎｄスクリーニングのファージの培養上清を１00μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１μｇ/ｍＬＲａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｃｐ３を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、更にＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２０００倍希釈したａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰを１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＯＰＤ ｉｎ ０．１Ｍクエン酸リン酸バーファー（ｐＨ５．１）＋０．０１％Ｈ₂Ｏ₂ を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し室温で５分間反応させた。２ＮＨ₂ＳＯ₂を１００μＬ/ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止した。その後、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、可溶性IgSF4抗原と顕著な陽性反応を示すものは２０株であった。この２０株ファージのＤＮＡ配列を解析し、それぞれのＣＤＲ配列が新規であることが確認された。

【0074】

実施例３：ファージ抗体（ｓｃＦｖ）のIgG化
（１）IgSF4ＩｇＧ抗体を発現するｐｌａｓｍｉｄの作製
ファージ抗体のIgG化はIgSF4のＩｇＧ化を例として下記のように説明する。
IgSF4のファージ抗体（ｓｃＦｖ）の遺伝子はＶＨ-ＶＬの順で並んでおり、ＶＨとＶＬはリンカー以下の配列で接続したｓｃＦｖの構造をしている。
＜リンカー配列＞
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号１）

【0075】

IgSF4のＶＨ,ＶＬで使用していると推定されるヒト生殖系列の遺伝子をＩＭＧＴ (*)で検索した結果を表１で示す。
(*) ＩＭＧＴ : http://www.imgt.org

【0076】

【表1】

【0077】

ＩＭＧＴの検索結果を参考にして、ファージ抗体のＩｇＧ化をおこなった。IgSF4のＶＨをヒトＩｇG１の定常領域と連結した。IgSF4のＶＬはＩＧＬＪ３＊０１遺伝子と並列に並んでいるＩＧＬＣ３＊０４と接続した遺伝子を作製した。5'側にＮｈｅＩ、3'側にＥｃｏＲＩを付加したH鎖、Ｌ鎖遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で全合成した。合成した重鎖、軽鎖の遺伝子はそれぞれ別々の発現ベクターに組み込んだ。すなわちH鎖、L鎖それぞれの人工合成遺伝子をＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ部位に組み込み、抗IgSF4０２０抗体Ｈ鎖発現ベクター、およびＬ鎖発現ベクターを得た。
同様な方法で、他の抗体の発現ベクターを作製した。

【0078】

（２）ＩｇＧ抗体の一過性発現
ＩｇＧ抗体の一過性発現にはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ （ライフテクノロジーズ）を用いた。遺伝子導入用浮遊細胞である２９３-Ｆ （ライフテクノロジーズ） は前日に継代した。トランスフェクション当日、一種類の抗体発現には、１ｘ１０⁶細胞／ｍＬの細胞濃度に調整した４００ｍＬの細胞懸濁液を準備した。これに抗体重鎖発現ベクターを１００ μｇ、軽鎖発現ベクターを１００μｇ合計２００μｇのプラスミドをＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭに懸濁した溶液（Ｉ）を調整した。次に２００μＬのＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔを８ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭに加えた（溶液ＩＩ）。 溶液（Ｉ）と（ＩＩ）を混合して室温で１０分から２０分静置した。この合計１６ｍＬの反応液を２９３-F細胞を懸濁した４００ｍＬの２９３発現培地に加え、６日から７日間３７℃、８％ＣＯ₂で細胞培養震盪機のＴＡＩＴＥＣ ＢｉｏＳｈａｋｅｒ ＢＲ-４３ＦＬで培養した。６日から７日間後、それぞれの組換え抗体を含む培養上清を回収し、これを材料に精製をおこなった。

【0079】

上述したＩｇＧ抗体の重鎖の発現ベクターと軽鎖の発現ベクターをＣＨＯ由来ＤＸＢ１１にエレクトロポレーションによってコトランスフェクションした。抗体遺伝子を遺伝子導入したＤＸＢ１１細胞は、０．５ ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８で８日間選択して抗体を安定して発現する生産細胞を作製した。抗体生産細胞について、ＥＬＩＳＡで組み換え抗体が分泌されていることを確認した。

【0080】

作製された抗体生産細胞にはＰＰＡＴ−０７７−４０１、ＰＰＡＴ−０７７−４０２、ＰＰＡＴ−０７７−４０３、ＰＰＡＴ−０７７−４０４、ＰＰＡＴ−０７７−４０５、ＰＰＡＴ−０７７−４０６、ＰＰＡＴ−０７７−４０７の番号を付した。このうちＰＰＡＴ−０７７−４０１、ＰＰＡＴ−０７７−４０３、ＰＰＡＴ−０７７−４０４、ＰＰＡＴ−０７７−４０５、ＰＰＡＴ−０７７−４０６、ＰＰＡＴ−０７７−４０７はそれぞれ以下の受領番号及び受託番号の下で２０１３年５月１６日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
ＰＰＡＴ−０７７−４０１：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１６２１、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２１
ＰＰＡＴ−０７７−４０３：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１６２２、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２２
ＰＰＡＴ−０７７−４０４：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１６２３、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２３
ＰＰＡＴ−０７７−４０５：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１６２４、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２４
ＰＰＡＴ−０７７−４０６：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１６２５、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２５
ＰＰＡＴ−０７７−４０７：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１６２６、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２６

【0081】

（３）ＩｇＧ抗体の精製
上記で発現した培養上清に含まれるＩｇＧ抗体タンパク質は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅを用いたＡｂ-Ｃａｐｃｈｅｒ ＥｘＴｒａ（プロテノバ）アフィニティーカラムで精製した。得られたピークフラクションは、溶媒としてダルベッコのＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ-３００カラムによるゲルろ過をして、さらに精製した。精製したＩｇＧ抗体タンパク質の定量は、吸光係数を用いて算出した。各ＩｇＧ抗体の吸光係数はＥＸＰＡＳＹのＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）に各抗体の全アミノ酸配列を用いて計算して求めた。

【0082】

（４）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による各抗体の定量
それぞれのＩｇＧ抗体生産細胞の培地上清に含まれる抗体や、精製した抗体の濃度は、吸光度による定量とともに、酵素免疫測定法（ELISA）による定量もおこなった。固相抗体としてプレートにヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）（コスモバイオ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．；ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ-１１０ＵＤ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ（５μｇ／ｍＬの濃度）で加えて４℃で一昼夜静置した。次にブロックエースを２００μＬ／ｗｅｌｌで加えて室温で１時間ブロックした後、試料の抗体を段階希釈し、各ｗｅｌｌに加えて１時間インキュベーションして反応させた。ＰＢＳＴ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ)で５回洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）-ＨＲＰ（コスモバイオ：ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ａ-１１０ＰＤ）をＰＢＳＴで１００００倍希釈した検出抗体溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌの割合で加えた。１時間インキュベーション後、ＰＢＳＴで5回洗浄してから基質緩衝液TMBを１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えた。室温暗所で１5分間インキュベーションした後、反応停止液を１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えて反応を停止してから、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準品として精製ヒトＩｇＧを用いて検量線を作成し、これを用いてそれぞれの抗体の濃度を算出した。

【0083】

実施例４：IgSF4抗体の反応性
（１）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による各抗体の反応性の解析（図１）
それぞれの候補抗体親和性評価は、吸光度による定量とともに、酵素免疫測定法（ELISA）によってもおこなった。固相抗原としてプレートに分泌型IgSF4組み換え体抗原を１００μｌ／ｗｅｌｌ（１μｇ／ｍＬの濃度）で加えて４℃で一昼夜静置した。次に３％スキムミルク/PBSを２００μＬ／ｗｅｌｌで加えて室温で１時間ブロックした後、ＰＢＳＴで5回洗浄してから試料の抗体を各ｗｅｌｌに加えて１時間インキュベーションして反応させた。ＰＢＳＴ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ)で５回洗浄後、anti-cp3 Rabbit ポリクローナル抗体（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）各ｗｅｌｌに加えて１時間インキュベーションして反応させた。ＰＢＳＴで5回洗浄してからanti Rabbit IgG(H+L)--ＨＲＰ（コスモバイオ：ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ａ-１１０ＰＤ）をＰＢＳＴで１００００倍希釈した検出抗体溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌの割合で加えた。１時間インキュベーション後、ＰＢＳＴで5回洗浄してから基質緩衝液TMBを１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えた。室温暗所で１5分間インキュベーションした後、反応停止液を１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えて反応を停止してから、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１に示す。図１において、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２１、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２２、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２３、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２４、ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２５、及びＮＩＴＥ Ｐ−０１６２６はそれぞれ、それぞれの受託番号を有する抗体産生細胞が産生する抗体を使用した結果を示す。

【0084】

（２）フローサイトメーターによる各抗体の反応性の解析（図２及び図３）
ATL細胞株S1T、または患者検体より分離したIgSF4陽性細胞を用いて、抗IgSF4抗体の反応性を検討した。本発明の抗IgSF4抗体としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１６２２を有する抗体産生細胞が産生する抗体を使用した。それぞれの細胞を遠心により回収し、2ｍMEDTA/PBSで洗浄した。その後、FCM Buffer（0.5％BSA、2ｍM EDTA、0.1％NaN3/PBS)で細胞を5×10＾6/ｍLになるように懸濁し、この細胞懸濁液100μＬを96-ｗｅｌｌ Ｖ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ3897）に分注した。IgSF4ＩｇＧ抗体(candidate2）をFCM Ｂｕｆｆｅｒで10倍希釈し、調製した抗体溶液100μＬを細胞に添加した。4℃で１時間インキュベートした後、細胞をFCM Ｂｕｆｆｅｒにより２回洗浄した。FCM Bufferで2μg/ｍLに調整したAlexa488標識抗ヒトIgGマウス抗体（invitrogen）100μＬを細胞に添加した。4℃で1時間インキュベートした後、FCM bufferを用いて遠心により2回洗浄した後、FACS Calibur(ベクトンディッキンソン)を用いてFL1蛍光強度を測定した。結果を図２（ATL細胞株S1Tを用いた場合）及び図３（患者検体より分離したIgSF4陽性細胞を用いた場合）に示す。

【0085】

なおコントロール抗体として、anti-SynCAM/TSLC1ニワトリモノクローナル抗体(MBL社)＜図２、３においては市販抗体Ａと表記＞、ポテリジオテストFCM（協和メデックス社）＜図２、３においては検査用上市抗体と表記＞を用いて蛍光強度の比較目安にした。また、それぞれの使用条件は添付の指示書に従った。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]