特許 6443060 微生物培養シート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6443060

(24)【登録日】2018年12月7日

(45)【発行日】2018年12月26日

(54)【発明の名称】微生物培養シート

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/16 20060101AFI20181217BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20181217BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20181217BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/16

   C12M1/34 A

   C12Q1/04

【請求項の数】9

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2015-5146(P2015-5146)

(22)【出願日】2015年1月14日

(65)【公開番号】特開2016-129505(P2016-129505A)

(43)【公開日】2016年7月21日

【審査請求日】2017年11月29日

(73)【特許権者】

【識別番号】000002897

【氏名又は名称】大日本印刷株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100101904

【弁理士】

【氏名又は名称】島村 直己

(72)【発明者】

【氏名】風間 圭佑

(72)【発明者】

【氏名】野澤 麻衣

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／００７８０２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−１／４２

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートであって、
前記培養層が、ポリビニルピロリドン、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を含有し、
前記発色酵素基質が、β−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質又はα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質であり、
前記可塑剤が、ポリエチレングリコール及び１，３−ブチレングリコールから選択される少なくとも１つである微生物培養シート。

【請求項2】

前記可塑剤がポリエチレングリコールである、請求項１に記載の微生物培養シート。

【請求項3】

ポリエチレングリコールの平均分子量が１００以上１０００以下である、請求項２に記載の微生物培養シート。

【請求項4】

前記可塑剤が１，３−ブチレングリコールである、請求項１に記載の微生物培養シート。

【請求項5】

大腸菌群を検出するために用いられ、前記発色酵素基質がβ−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質である、請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物培養シート。

【請求項6】

黄色ブドウ球菌を検出するために用いられ、前記発色酵素基質がα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質である、請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物培養シート。

【請求項7】

前記基材シート及び前記カバーシートの少なくとも一方が、透明プラスチックシートからなる、請求項１乃至６のいずれかに記載の微生物培養シート。

【請求項8】

少なくとも１種の細菌を含む試料中の大腸菌群を検出するための方法であって、
請求項１乃至７のいずれかに記載の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも一部を接種する工程と、
前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、
を含む方法。

【請求項9】

少なくとも１種の細菌を含む試料中の黄色ブドウ球菌を検出するための方法であって、
請求項１乃至７のいずれかに記載の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも一部を接種する工程と、
前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、
を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物培養シートに関し、好ましくは微生物を検出するために用いられる微生物培養シートに関する。

【背景技術】

【0002】

試料中の微生物の存在を確認し、又は微生物数を測定する方法としては、寒天平板混釈法がある。この寒天平板混釈法では、あらかじめ滅菌したシャーレ中に形成した寒天培地を使用するので、寒天培地を高圧蒸気滅菌するためのオートクレーブや、微生物検査を無菌的に行うための検査室が必要となる。また、微生物のサンプリング、試料液の調製、分注、培地との混釈などの操作が要求される。そこで、このような一連の操作を必要とせず、簡便に微生物検査を行うことができる乾燥培地を備える微生物培養シートが開発されている。

【0003】

例えば、特許文献１には、基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートが記載されている。前記培養シートは、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種と、を含有する培地液がパターン形成されたものである。

【0004】

また、特許文献２でも、同様に、基材シートと、前記基材シートの上面に設けられた培養層と、前記培養層を覆うことができるカバーフィルムと、を備える微生物培養シートが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１１／００７８０２号

【特許文献2】特開２０１４−９０７０１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

特許文献１及び２に開示される微生物培養シートでは、作業の操作性及び安全性に優れ、作業効率を向上することができる。また、ポリビニルピロリドンを培地液の必須成分としているので、所定形状の培養層を安価かつ簡便にパターン形成することができる。

【0007】

しかし、ポリビニルピロリドンを培養層に用いる場合、培養層に反りが生じる場合がある。培養層に反りが生じると、微生物培養シートにも反りが生じることになり、作業の操作性や安全性の低下に繋がる。そこで、そのような反りの発生を防ぐため、培養層に可塑剤としてのグリセリンが添加される。特許文献２の実施例でもグリセリンが添加されている。

【0008】

ここで、従来から大腸菌群を検出するために、大腸菌群が有するβ−ガラクトシダーゼ活性を利用した発色反応試験が行われている。つまり、培養層上で増殖した大腸菌群は、β−ガラクトシダーゼによって培養層中に含まれるβ−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質（以下、β−ガラクトシダーゼ基質とも称す）を分解し、色原体化合物を遊離させ、これによってコロニーが発色する。しかしながら、上述の通り、ポリビニルピロリドンを用いた培養層では、培養層に反りが生じ易くなるため、培養層中に可塑剤としてグリセリンを添加することでその反りの発生を防いでいた。しかし、本発明者らは、意
外にも、ポリビニルピロリドン及びグリセリン等を含む培養層を用いた場合、本来β−ガラクトシダーゼ活性を有する大腸菌群の中でもβ−ガラクトシダーゼ基質による発色反応が確認できない菌が存在することを発見した。また、このような現象は、α−グルコシダーゼ活性を利用した発色反応試験でも起こることがわかった。具体的には、α−グルコシダーゼ活性を利用した発色反応試験は、例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus
）の検出等に利用することができるが、ポリビニルピロリドン及びグリセリン等を含む培養層を用いた場合、通常では発色反応が得られるはずの黄色ブドウ球菌においてもα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質（以下、α−グルコシダーゼ基質とも称す）による発色反応が確認できない菌が存在することを発見した。目的の発色反応が得られない菌が存在すると、例えば、微生物の生菌数を測定するための試験において正確な情報を得ることができない場合や、目的微生物を検出又は同定するための試験においても正確な結果を得ることができない場合がある。

【0009】

そこで、本発明の目的は、培養層にポリビニルピロリドンを含む場合であっても、反りの発生が抑えられ、かつ発色酵素基質による発色反応が広範囲の微生物で得られる微生物培養シートを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、意外にも、可塑剤として、グリセリンの代わりにポリエチレングリコール又は１，３−ブチレングリコールを用いることにより、β−ガラクトシダーゼ基質及びα−グルコシダーゼ基質による発色反応を得られることを見出し、本発明に至った。
本発明は以下のように表される。

【0011】

（１）基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートであって、
前記培養層が、ポリビニルピロリドン、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を含有し、
前記発色酵素基質が、β−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質又はα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質であり、
前記可塑剤が、ポリエチレングリコール及び１，３−ブチレングリコールから選択される少なくとも１つである微生物培養シート。
（２）前記可塑剤がポリエチレングリコールである、（１）に記載の微生物培養シート。
（３）ポリエチレングリコールの平均分子量が１００以上１０００以下である、（２）に記載の微生物培養シート。
（４）前記可塑剤が１，３−ブチレングリコールである、（１）に記載の微生物培養シート。
（５）大腸菌群を検出するために用いられ、前記発色酵素基質がβ−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質である、（１）乃至（４）のいずれかに記載の微生物培養シート。
（６）黄色ブドウ球菌を検出するために用いられ、前記発色酵素基質がα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質である、（１）乃至（４）のいずれかに記載の微生物培養シート。
（７）前記基材シート及び前記カバーシートの少なくとも一方が、透明プラスチックシートからなる、（１）乃至（６）のいずれかに記載の微生物培養シート。

【0012】

（８）少なくとも１種の細菌を含む試料中の大腸菌群を検出するための方法であって、
（１）乃至（７）のいずれかに記載の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも一部を接種する工程と、
前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、
を含む方法。
（９）少なくとも１種の細菌を含む試料中の黄色ブドウ球菌を検出するための方法であって、
（１）乃至（７）のいずれかに記載の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも一部を接種する工程と、
前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、
を含む方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明の構成により、培養層にポリビニルピロリドンを含む場合であっても、反りの発生が抑えられ、かつ発色酵素基質による発色反応が広範囲の微生物で得られる微生物培養シートを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】微生物培養シートの一例を示す平面図（ａ）及び断面図（ｂ）であり、基材シートの略中央に円形の培養層が形成されている態様を示す図である。

【図2】微生物培養シートの一例を示す断面図であり、図２（ａ）は、基材シートが多層構造である態様を示す図であり、図２（ｂ）は、培養層が多層構造である態様を示す図である。

【図3】微生物培養シートの一例を示す展開図（ａ）及び断面図（ｂ）であり、基材シートに培養層、カバーシートに特定成分層が形成されている態様を示す図である。

【図4】微生物培養シートの一例を示す平面図（ａ）及び断面図（ｂ）であり、基材シートの上に培養層と枠層とが形成されている態様を示す図である。

【図5】微生物培養シートの一例を示す断面図であり、基材シートの上に培養層と枠層が形成され、特定成分層が前記枠層の内側に対向するように、カバーシートに形成されている態様を示す図である。

【図6】微生物培養シートの一例を示す断面図であり、基材シートの上に培養層と枠層が形成され、特定成分層が前記枠層の内側に対向するように、また、粘着層が前記枠層と対向するように、カバーシートに形成されている態様を示す図である。

【図7】微生物培養シートの一例であって、基材シートの上に枠層が形成されている断面図であり、図７（ａ）は、基材シートが多層構造である態様を示す図であり、図７（ｂ）は、培養層が多層構造である態様を示す図である。

【図8】微生物培養シートの一例を示す図であって、基材シート上に外周を枠層で囲まれた複数の培養層が形成され、カバーシートが基材シートに固設されている態様を示す平面図（ａ）及び断面図（ｂ）である。

【図9】微生物培養シートの一例を示す図であって、カバーシートが連設されている基材シート上に、外周を枠層で囲まれた培養層が形成されている態様を示す展開図（ａ）、断面図（ｂ）、及び前記カバーシートが折り曲げられ、培養層が被覆されている態様を示す断面図（ｃ）である。

【図10】微生物培養シートの一例を示す図であって、カバーシートが両面接着テープによって培養層が形成されている基材シートに固設されている態様を示す断面図である。

【図11】微生物培養シートの一例を示す図であって、カバーシートが両面接着テープによって培養層と枠層とが形成されている基材シートに固設されている態様を示す断面図である。

【図12】微生物培養シートの一例を示す外観斜視図である。

【図13】微生物培養シートの一例であって、基材シートの上に枠層が形成されている外観斜視図である。

【図14】実施例１における培養後の培養層上の発色反応の様子を示す写真である。

【図15】実施例２における培養後の培養層上の発色反応の様子を示す写真である。

【図16】比較例１における培養後の培養層上の発色反応の様子を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートを対象とする。また、本発明の微生物培養シートにおいて、前記培養層は、ポリビニルピロリドン、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を含有する。また、前記発色酵素基質が、β−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質又はα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質である。また、前記可塑剤が、ポリエチレングリコール及び１，３−ブチレングリコールから選択される少なくとも１つである。

【0016】

以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。

【0017】

［微生物培養シート］
以下、微生物培養シートの各構成要素について説明する。
（１）培養層
本発明の微生物培養シートにおいて、基材シートの上に設ける培養層は、ポリビニルピロリドン、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を含有する。培養層は、これらの成分を分散又は溶解させる溶媒を含む培地液から形成することができる。

【0018】

（ｉ）ポリビニルピロリドン
ポリビニルピロリドンは、培地液の粘度調整剤としての役割を有する。ポリビニルピロリドンによれば、濃度を調整することで容易に培地液の粘度調整することができるので、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を均一に分散させることができる。また、培養層を必要な部分に形成することが可能となり、高価な材料の無駄が生じない。また、培地液を所定のパターンに配置した後に溶媒を除去すると、ポリビニルピロリドンの優れた皮膜性のため、ゲル化剤や栄養成分を取り込んで培養層を成膜することができる。また、基材シートとも良好な密着性を有するので、接着剤を使用しなくても培養層を形成することができる。そのため、接着剤成分による微生物の発育の影響を低減することができる。

【0019】

（ｉｉ）ゲル化剤
ゲル化剤を含有する培地液を用いて形成される培養層は、被検液を接種すると増粘若しくはゲル化するため、微生物の育成に良好な粘度を付与することができる。また、増粘後にはカバーシートに密着し得るため、培養時の培養層の乾燥を抑制することができる。

【0020】

ゲル化剤としては、特に制限されるものではなく、公知のゲル化剤を用いることができる。ゲル化剤としては、高分子多糖類が好ましく、カラギーナン、グアーガム、キタンサンガム、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ローカストビーンガム、アルギン酸及びアルギン酸塩等を挙げることができる。これらの高分子多糖類は、被検液中に含まれる水によって増粘又はゲル化するため、微生物の発育が良好となる。また、高分子多糖類は、透明性が高いため、コロニーの視認性に優れる。さらに、高分子多糖類は、増粘してカバーシートに密着し易くなるため、培養時の乾燥を抑制することができる。高分子多糖類の中でも、グアーガムが特に好ましい。グアーガムは、低濃度で極めて高い粘度を呈するため、少量で微生物の発育に適した環境を作ることができるからである。なお、グアーガムは、一年生の豆科植物であるグアーの種子の胚乳部より製造される。

【0021】

ゲル化剤の含有量は、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して１００質量部以上６
００質量部以下であることが好ましい。

【0022】

（ｉｉｉ）栄養成分
栄養成分としては、特に制限されるものではなく、公知の栄養成分を用いることができる。栄養成分としては、例えば、一般生菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、又はペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物等、あるいはこれらにリン酸二カリウム及び／又は塩化ナトリウムを加えた混合物が好ましく用いられる。大腸菌群検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、デソキシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ペプトン・乳糖・リン酸二カリウム等が好ましく用いられる。黄色ブドウ球菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、肉エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・マンニット・卵黄混合物、又はペプトン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸卵黄液混合物等が好ましく用いられる。ビブリオ検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリウム・クエン酸第２鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁等が好ましく用いられる。腸球菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウム等が好ましく用いられる。真菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、ペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、又はポテトエキス・ブドウ糖混合物等が好ましく用いられる。これらの中から発育させようとする微生物に応じて一種又はそれ以上の栄養成分を選択して用いることができる。なお、培養層中で栄養成分が不足している場合は、被検液に不足分の栄養成分を加えてもよい。

【0023】

（ｉｖ）選択剤
培養層は、検出目的以外の微生物の生育を抑える選択剤を含有する。このような選択剤としては、例えば、抗生物質、合成抗菌剤等の抗生剤、色素、界面活性剤、無機塩等が用いられる。抗生物質としては、メチシリン、セフタメタゾール、セフィキシム、セフタジジム、セフスロジン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、リファンピシン、ノボビオシン、コリスチン、リンコマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、又はストレプトマイシン等を挙げることができる。合成抗菌剤としては、例えば、サルファ剤、ナリジクス酸、又はオラキンドックス等を挙げることができる。また、色素としては、例えば、静菌又は殺菌作用のあるクリスタルバイオレット、ブリリアントグリーン、マラカイトグリーン、メチレンブルー等を挙げることができる。また、界面活性剤としては、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ７、ドデシル硫酸塩、ラウリル硫酸塩等を挙げることができる。また、無機塩としては、例えば、亜セレン酸塩、亜テルル酸塩、亜硫酸塩、窒化ナトリウム、塩化リチウム、シュウ酸塩、又は高濃度の塩化ナトリウム等を挙げることができる。これら以外にも、例えば、タウロコール酸塩、グリシン、胆汁末、胆汁酸塩、又はデオキシコール酸塩等を挙げることができる。

【0024】

大腸菌群検査用の微生物培養シートの場合、選択剤としては、胆汁酸塩、デオキシコール等の胆汁由来物質、タージトール７、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤、クリスタルバイオレット等の色素類、又は、セフェキシム若しくはノボビオシン等の抗生物質等が好ましく用いられる。黄色ブドウ球菌検査用の微生物培養シートの場合、選択剤としては、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）、コリスチン、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナム、アンフォテリシン、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びデフェロキサミンから選ばれる少なくとも１種が好ましく用いられる。

【0025】

（ｖ）発色酵素基質
本発明の微生物培養シートにおいて、発色酵素基質としては、β−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質（β−ガラクトシダーゼ基質）又はα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質（α−グルコシダーゼ基質）を用いる。発色酵素基質は、天然基質であってもよく、合成基質であってもよい。発色は、吸収、蛍光又は発光の変化のような光学的性質の変異によるものであることが望ましい。β−ガラクトシダーゼ基質は、β−ガラクトシダーゼ活性により加水分解され、発色を呈する任意の化合物を用いることができる。

【0026】

α−グルコシダーゼ基質は、α−グルコシダーゼ活性により加水分解され、発色を呈する任意の化合物を用いることができる。

【0027】

発色酵素基質は、例えば、インドキシル誘導体に基く酵素基質、ウンベリフェロン誘導体に基く酵素基質、フラボン誘導体に基く酵素基質、アリザリン誘導体に基く酵素基質、ナフトールベンゼイン誘導体に基く酵素基質、ニトロフェノール誘導体に基く酵素基質、ナフトール誘導体に基く酵素基質、カテコール誘導体に基く酵素基質、ヒドロキシキノリン誘導体に基く酵素基質、クマリン誘導体に基く酵素基質、レゾルフィン誘導体に基く酵素基質、フェノキサジン誘導体に基く酵素基質、ナフトール誘導体に基く酵素基質、ナフチルアミン誘導体に基く酵素基質を挙げることができる。これらの中でも、インドキシル誘導体に基く酵素基質、又はウンベリフェロン誘導体に基く酵素基質が好ましい。

【0028】

β−ガラクトシダーゼ基質としては、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及びオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられる。これらのうち、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）が特に好ましい。

【0029】

α−グルコシダーゼ基質としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、３−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、３−インドキシル−α−グルコピラノシドトリハイドレート、ｎ−ヘプチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド等が挙げられる。これらのうち、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドが特に好ましい。

【0030】

発色酵素基質の培地液中の含有量は、例えば、０．０１〜２．０ｇ／ｌである。発色酵素基質の培地液中の含有量は、発色のコントラストの観点から、０．０２〜０．２ｇ／ｌであることが好ましい。

【0031】

発色酵素基質は、広いｐＨ範囲で用いることができ、例えば、ｐＨ５．５〜１０、好ましくはｐＨ６．５〜１０で用いることができる。

【0032】

（ｖｉ）可塑剤
本発明の微生物培養シートにおいて、可塑剤として、ポリエチレングリコール及び１，３−ブチレングリコールから選択される少なくとも１つを用いる。

【0033】

ポリエチレングリコールの平均分子量は、１００以上であることが好ましく、１５０以上であることがより好ましく、２００以上であることがさらに好ましく、３００以上であることが特に好ましい。また、ポリエチレングリコールの平均分子量は、１００００以下であることが好ましく、５０００以下であることがより好ましく、２０００以下であることがさらに好ましく、１０００以下であることが特に好ましく、８００以下であることがより特に好ましい。

【0034】

ポリエチレングリコールの培養層中の含有量は、例えば、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、３０質量部以上９０質量部以下である。ポリエチレングリコールの培養層中の含有量は、反りを抑制する観点から、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、４０質量部以上８０質量部以下であることが好ましい。

【0035】

１，３−ブチレングリコールの培養層中の含有量は、例えば、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、３０質量部以上９０質量部以下である。１，３−ブチレングリコールの培養層中の含有量は、反りを抑制する観点から、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、４０質量部以上８０質量部以下であることが好ましい。

【0036】

（ｖｉｉ）その他
培養層は、β−ガラクトシダーゼ発現誘導物質を含んでもよい。β−ガラクトシダーゼ発現誘導物質としては、例えば、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、ＩＰＴＧとも称す）又はメチル−β−Ｄ−チオガラクトシドなどが挙げられる。ＩＰＴＧについては、０．０５〜０．１ｍＭ（１．２〜２．４ｍｇ／１００ｍｌ）の濃度で大腸菌のβ−ガラクトシダーゼの合成を強力に誘導することが知られている。

【0037】

培養層は、発色指示薬を含んでもよい。発色指示薬は、培養過程で発育する微生物の代謝により産出される特異物質との反応、ｐＨ変化の認識等によって発色してコロニーを着色することができ、コロニー数の計数を極めて容易にする効果を有する。発色指示薬としては、例えば、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（以下ＴＴＣと表示）、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ベラトリルテトラゾリウムブルー等のテトラゾリム塩、ニュートラルレッド混合物、フェノールレッド、ブロムチモールブルー、又はチモールブルー混合物等のｐＨ指示薬がある。

【0038】

培養層は、１層で構成されてもよく、２層以上で構成されてもよい。例えば、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）にゲル化剤（ｉｉ）を含有する培地液で第１培養層を形成し、その上にポリビニルピロリドン溶液（ｉ）にゲル化剤（ｉｉ）、栄養成分（ｉｉｉ）、選択剤（ｉｖ）及び発色酵素基質（ｖ）を含有する培地液で第２培養層を形成し、本発明で使用する培養層としてもよい。

【0039】

また、培地液中に含まれる成分によっては混合により反応を起こす場合があり、これらを別の層に含有させることで混合反応を防ぐことができる。したがって、例えば栄養成分に混合反応を起こす成分ＡとＢとが含有される場合には、Ａ成分を除去した第１培養層と、Ｂ成分を除去した第２培養層との２層を積層して培養層としてもよい。

【0040】

（ｖｉｉｉ）培養層の形成
培養層は、基材シートの上に培地液を所定のパターンに塗布して乾燥することにより形成することができる。培養層をパターン形成することにより、被検液の滴下後に速やかにカバーシートを被覆することで、被検液が自然に一定範囲に拡がるため、優れた操作性を提供することができる。本発明において、「パターン形成」とは、基材シートの上に、培地液を予め決められた形状に印刷、塗布、塗工、又は噴霧等によって配置することをいう。培地液を基材上に配置する方法は、特に制限されるものではない。したがって、パター
ン形成には、スクリーン印刷、グラビア印刷、凸版印刷、転写印刷、フレキソ印刷、その他の印刷、ディスペンサーやインクジェット等による塗布、バー等を使用してコーティングするバーコートやナイフコート、ダイコート等の塗工、スプレー方式等の噴霧等の方法を使用することができる。

【0041】

培地液中に含まれる成分は、粉末で添加してもよいし、また、これらを溶媒に溶解した後、例えば、前記ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に混合し、培地液としてもよい。なお、発色指示薬の種類によっては滅菌処理時に着色が目立つものもあり、培養層に含有させず、被検液に発色指示薬を含んだものを使用して発色させてもよい。

【0042】

（２）微生物培養シートの構成
微生物培養シートの好適な態様の一例を図１（ａ）、（ｂ）に示す。図１（ａ）は平面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ’断面図である。

【0043】

図１は、方形の基材シート１０の略中央に培養層３０が形成され、かつ前記培養層３０を被覆するように、方形のカバーシート４０が設けられている態様を示す。基材シート１０に培養層３０がパターン形成されている。図２（ａ）の断面図に示すように、基材シート１０は、基材シート１１と、基材シート１３との２層からなる多層シートであってもよく、更に、プラスチック以外の他の層を積層する多層シートであってもよい。また、図２（ｂ）に示すように、培養層３０が２層以上の多層で構成されていてもよい。

【0044】

パターン形成により調製された培養層３０の形状は、図１に示す円形に限定されるものではなく、正方形、長方形、その他の多角形、不定形であってもよい。

【0045】

微生物培養シートは、図３（ａ）の展開図に示すように、基材シート１０とカバーシート４０との双方に、培養層３０と、バインダー成分及び栄養成分等のその他の成分を含有する特定成分層３０’と、がそれぞれ形成されていてもよい。例えば、培養層３０と、前記特定成分層３０’との双方にゲル化剤が含まれている場合には、基材シート１０の上の培養層３０と、カバーシート４０に設けられた特定成分層３０’とが対向して配設されるため、例えば、基材シート１０の上の培養層３０に被検液を接種した後に、カバーシート４０で培養層３０を被覆すると、前記被検液が培養層３０と特定成分層３０’とに吸水され、培養層３０と特定成分層３０’との双方で微生物を観察することができる。また、指示薬によっては、培養層３０に含有させると滅菌処理時に着色が目立つものもあり、その場合には、前記指示薬を特定成分層３０’に含有させることで、滅菌処理時の着色を防止することができる。なお、図３（ｂ）は、横断面図である。

【0046】

また、微生物培養シートは、図４（ａ）の平面図及び図４（ｂ）のＡ−Ａ’線断面図に示すように、基材シート１０の略中央に培養層３０が形成され、前記培養層の外周に円形の枠層２０が形成されたものであってもよい。枠層２０によれば、培養層３０に接種した被検液の吸水範囲をより確実に限定することができる。なお、枠層２０の形状は円形に限定されるものではなく、方形、楕円形、多角形、不定形等いずれであってもよいが、培養層３０に接種した被検液の吸水範囲が所定の面積を確保しうるように枠層が形成されていることが好ましい。また、この態様において、図５の断面図に示すように、更にカバーシート４０に、基材シート１０の上の培養層３０と対向するように特定成分層３０’が形成されていてもよい。

【0047】

更に、図６に示すように、前記枠層２０と対向するように、カバーシート４０に粘着層５０が形成されていてもよい。枠層２０と粘着層５０とが密着することで、培養層３０の乾燥や汚染をより効果的に防止することができる。

【0048】

微生物培養シートでは、図７（ａ）の断面図に示すように、疎水性樹脂からなる枠層２０が基材シート１０の表面に形成されている場合であっても、基材シート１０は、基材シート１１と、基材シート１３との２層からなる多層シートの態様であってもよいし、プラスチック以外の他の層を積層する多層シートであってもよい。また、図７（ｂ）の断面図に示すように、疎水性樹脂からなる枠層２０が基材シート１０の表面に形成されている場合であっても、培養層３０は２層以上の多層で構成されていてもよい。

【0049】

また、培養層３０は、基材シート１０の上に複数存在してもよい。複数の培養層３０と、それらの外周を囲む凸形状の疎水性樹脂からなる枠層２０と、前記培養層３０を被覆するカバーシート４０とが基材シート１０の端部で固設された態様を図８（ａ）、（ｂ）に示す。図８（ａ）は平面図であり、図８（ｂ）は、図８（ａ）のＡ−Ａ’断面図である。図８（ｂ）では、カバーシート４０は、培養層３０を被覆し、かつ枠層２０の上部に密着することができるように、２つの角部（Ｃ１，Ｃ２）が形成される態様となっている。なお、図８とは相違するが、前記基材シート１０上に形成された培養層３０と対向するように、カバーシート４０に特定成分層３０’が形成されていてもよい。

【0050】

（３）基材シート
本発明の微生物培養シートでは、基材シートの上に培地液をパターン形成するため、基材シートは、耐溶媒性、印刷適性を有する必要がある。また、微生物培養シートとして、耐水性も要求され、培養層を形成する際の乾燥処理に耐える耐熱性を有することも要求される。基材シートは、単層でもよく、２層以上の積層シートであってもよい。

【0051】

（４）カバーシート
本発明の微生物培養シートでは、カバーシートは、基材シートに固設されていることが好ましい。カバーシートは、培養中の落下菌等による汚染を防止すると共に、培養層の水分蒸発を防止する作用を有する。カバーシートは、防水性、水蒸気不透過性を有すると同時に、微生物の培養後、カバーシートを通してコロニーを観察及び計数できるように、透明であることが好ましい。カバーシートとしては、例えば、前記基材シートで挙げたようなポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等のプラスチックシートを使用することができる。微生物培養シートでは、前記基材シートとカバーフィルムとが透明であれば、微生物培養シートの背面からの投射光で観察することもでき、また、側面からの入射光で観察することもできる。すなわち、カバーシート側からも基材シート側からもコロニーを観察及び計数することができるので、観察方法及び計測方法の選択の幅が広がることとなる。なお、カバーシートの開け閉め等の作業性を考慮すると、ポリエステルフィルム、ポリオレフィンフィルムが特に好ましい。

【0052】

（５）枠層
本発明の微生物培養シートでは、前記培養層の外周に、疎水性樹脂からなる枠層が形成されていることが好ましい。枠層が形成されていると、被検液を培養層に接種し、カバーシートを被覆した場合に、被検液が枠層まで速やかに拡散されるため、培養層による被検液の吸水を待たずにカバーシートを被覆することができ、接種操作を短時間で行うことができる。また、枠層によって被検液の遺漏をより確実に防げ、接種時の作業効率を向上することできる。培養層にゲル化剤が含まれる場合には、被検液が枠層の内側にある培養層に吸水され、ゲル化剤が増粘し、培養層とカバーシートとの密着性により培養層の乾燥を防止することができる。また、培養層にゲル化剤が含まれない場合であっても、ポリビニルピロリドンが溶解し増粘するため、培養層とカバーシートとの密着性により培養層の乾燥を防止することができる。培養層とカバーシートとの密着性が優れると、カバーシートにコロニー形成のための層等を形成する必要がなく、コロニーの優れた視認性を確保することができる。

【0053】

（６）粘着層
本発明の微生物培養シートでは、基材シートやカバーシートに粘着層を形成することができる。このような粘着層は、培養層を被覆したカバーシートを固定し、培養層の水分蒸発や汚染を防止する目的で配設され、基材シートを密封できればいかなる種類の粘着剤を用いてもよい。作業性を考えると基材シートとカバーシートとが再接着できる程度に、弱い粘着力を有する粘着剤が好ましい。例えば、ゴム系粘着剤やアクリル系粘着剤が好ましく、特に再剥離タイプ及び微粘着タイプのアクリル系粘着剤が好ましく用いられる。具体的には、ブチルアクリレートや２−エチルヘキシルアクリレート等のアルキルアクリレート（好ましくはアルキルの炭素数が２〜１２）１００質量部に対し、カルボキシル基や水酸基、アミノ基等の官能基を含有するモノマーを２〜１５質量部共重合させたポリマーに、粘着付与剤としてロジン、キシレン樹脂、フェノール樹脂等を加え、メラミン類、イソシアネート類、エポキシ等で架橋したもの等を使用することができる。また、粘着層はどのような形状でもよいが、基材シートとカバーシートとの接着部分に隙間がなく接着できるように配設されることが好ましい。

【0054】

（７）格子印刷層
本発明の微生物培養シートには、格子印刷層が積層されていてもよい。格子印刷は、着色剤、樹脂、溶剤等の選択範囲が広い点でグラビア印刷等が好ましい。枡目の大きさは１ｃｍ角程度が適当である。

【0055】

（８）微生物培養キット
本発明では、前記微生物培養シートと、特定成分を含む被検液とを組み合わせて、微生物培養キットとすることができる。
被検液に、培養層に添加することが望ましい成分（例えば、発色指示薬）を添加して培養することができる。特に、滅菌処理その他の工程で変質、変色、分解等を受けやすい成分を含む場合に、有効である。

【0056】

（９）製造方法
（ｉ）培養層の形成
本発明の微生物培養シートにおける培養層は、上述のように、基材シートの上に培地液を所定のパターンに配置して乾燥することにより形成することができる。また、パターン形成の方法も、培地液を基材シートの予定した形状に塗布できるものであれば、特に制限はなく、印刷、塗布、塗工、噴霧等の任意の方法を用いることができる。好ましくは、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を含有させた培地液を調製し、該培地液を基材シートの上にパターン形成した後、前記培地液に含まれるアルコールを除去して培養層を形成する。

【0057】

微生物培養シートの製造方法では、基材シートと培養層との密着性、パターン形成の容易さ等の理由から、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液を使用することが好ましい。アルコールとしては、炭素数１〜５のアルコールを好適に使用することができる。例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、及びブタノールから選ばれる少なくとも１種を使用することができる。これらの中でも、メタノール、エタノール、又はイソプロピルアルコールが好ましい。従来は、栄養成分を溶解するために水やトルエン等の高沸点溶媒が使用されていたが、溶媒除去のために高温で加熱する必要があり、培養層に含まれる成分や基材の熱分解を招くおそれがあった。また、溶媒除去に過剰の熱エネルギーを使用する必要があり、コスト上昇の一因となり、また、溶媒除去時間も長くなるため生産効率低下の一因ともなっていた。本実施形態では、ポリビニルピロリドンを使用し、その溶媒として、低沸点である前記アルコールを使用することで、培地液に含まれる成分や基材の熱変性を回避し、並びに生産効率を向上することができる。なお、前記趣旨を損
なわない範囲で、アルコールにクロロホルム等の副溶媒を混合した溶媒を使用することもできる。

【0058】

ポリビニルピロリドンを培地液の必須の成分とした理由は、前記したように濃度を調整することでゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤等を均一に分散させることができ、しかも、容易に粘度を調整することができるためである。これにより、培地液を容易にパターン形成できる。なお、ポリビニルピロリドンは、優れた成膜性と基材シートに対する密着性とを有するため、接着剤を使用することなく基材シートに培養層を形成することができ、接着剤による微生物の発育阻害を回避することができる。

【0059】

ポリビニルピロリドンに対するアルコールの量は、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、１００質量部以上１００００質量部以下であることが好ましく、３００質量部以上２０００質量部以下であることがより好ましく、９００質量部以上１４００質量部以下であることが特に好ましい。

【0060】

培地液を構成するゲル化剤はパターン形成が可能であれば、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に溶解している必要はない。したがって、微生物培養シートの製造方法では、ゲル化剤を粉末で添加することができる。粉末で添加する場合のゲル化剤の平均粒子径は５〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。平均粒子径が前記範囲にあれば、分散性に優れる。５００μｍを超えると分散性が低下し、パターン形成適性が損なわれる場合がある。ただし、これらを溶媒に溶解し、前記ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に混合して培地液としてもよい。

【0061】

培地液におけるゲル化剤の含有量は、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、１００質量部以上６００質量部以下であることが好ましく、２５０質量部以上４００質量部以下であることがより好ましい。ゲル化剤の含有量が前記範囲であれば、被検液滴下の際の水分によって、増粘又はゲル化し、菌の育成に良好な粘度とすることができる。

【0062】

なお、ポリビニルピロリドンの皮膜は硬くもろい場合があるため、本発明では可塑剤としてポリエチレングリコール又は１，３−ブチレングリコールを添加する。本発明において、本発明の効果を阻害しない限り、エーテルエステル誘導体系可塑剤、プロピレングリコールやグリコール誘導体系可塑剤、グリコールエーテル誘導体系可塑剤、ポリヒドロキシカルボン酸誘導体系可塑剤、又はフタル酸誘導体系可塑剤等の他の可塑剤を添加してもよい。グリセリンやグリセリン誘導体系可塑剤は含まないことが望ましい。

【0063】

微生物培養シートの製造方法では、前記培地液を使用してパターン形成するが、特に、前記培地液を使用し、ディスペンサーによる塗布等で好適に培養層を形成することができる。

【0064】

前記したように培養層は、２層以上の多層であってもよい。なお、本発明では、培養層が第１培養層と第２培養層とからなる２層である場合に、異なる方法でパターン形成を行ってもよい。例えば、第１培養層をディスペンサーで塗布してパターン形成し、第２培養層のパターン形成に関しては、噴霧等その他の方法を用いてもよい。

【0065】

本実施形態では、培地液を基材シート上にパターン形成した後に、培地液に含まれるアルコールを除去する。ポリビニルピロリドンにゲル化剤等を配合した培養層を使用することで、寒天培地と同様に微生物コロニーを観察及び計数することができ、かつ極めて優れた視認性を得ることができる。なお、ゲル化剤は、水溶性であるため水溶液として調製された後に基材に塗工されることが一般的である。しかし、ゲル化剤は水の除去に高温かつ長時間の加熱処理を行う必要があり、水溶液の調製時に、高い粘度のために気泡等が混入
する場合があった。本実施形態によれば、ゲル化剤等の粉末をポリビニルピロリドンのアルコール溶液に分散させるため、気泡の混入を回避することができ、水を使用していないため、乾燥を低温かつ短時間で行うことができる。また、ゲル化剤等は、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に分散しているだけで溶解していないため、培地液の粘度の上昇を防止することができ、これによって円滑なパターン形成を行うことができる。しかも、得られた培養層では、前記成分がポリビニルピロリドンで被覆されているので、被検液を接種するとポリビニルピロリドンが直ちに溶解し、前記成分が溶解又は吸水する。そのため、被検液の接種後、すぐにカバーシートで被覆することができる。また、ポリビニルピロリドンが溶解したり、ゲル化剤が含まれたりする場合には、それが増粘してカバーシートに密着するため、乾燥を防止しうると共に、極めて優れた視認性を確保することができる。

【0066】

微生物培養シートにおいて、特定成分層は、例えば塗布方法は、全面塗布であっても、パターン形成であってもよい。パターン形成の場合には、培養層の形成と同様に、印刷、塗布、塗工、噴霧等であってもよい。

【0067】

培養層の乾燥は、培地液に含まれる前記アルコールを除去できればよく、温度、圧力等、従来公知の方法に準じて乾燥することができる。

【0068】

基材シートの上に形成する培養層の厚さは、乾燥後において５０〜１０００μｍであることが好ましく、２００〜６００μｍであることがより好ましい。また、塗布量は、乾燥後において５〜４００ｇ／ｍ^２であることが好ましく、１００〜３００ｇ／ｍ^２であることがより好ましい。前記範囲で、菌の発育に最適な粘度の培養層とすることができる。

【0069】

（ｉｉ）枠層の形成
本発明の微生物培養シートは、基材シートの表面、かつ培養層の外周に枠層を形成してもよい。枠層は、疎水性樹脂を用いて形成することができる。なお、枠層の製造方法は特に問わない。あらかじめ枠層が形成された基材シートを使用することもできる。

【0070】

枠層が形成された基材シートとしては、少なくとも疎水性樹脂を表面に有する基材シートであって、その疎水性樹脂の部分がエンボス加工されることにより、枠の形状に凸部が形成されたものが挙げられる。そして、前記凸部の内側に培養層を形成すれば、微生物培養シートを製造することができる。また、培養層を形成する箇所を凹状にエンボス加工し、凹部の外周に形成される凸部を枠層とすることもできる。

【0071】

（ｉｉｉ）カバーシートの固設
本発明の微生物培養シートは、培養層に被検液を接種した後にカバーシートで培養層を被覆し、これを培養するため、カバーシートの一部が基材シートに固設されていることが好ましい。ただし、直接スタンプや拭き取り試験等の場合、カバーシートが無いことで作業効率が向上する場合には、カバーシートを取り除いて使用してもよい。

【0072】

カバーシートと基材シートとが同一部材で構成される場合には、別個に作成したカバーシートを基材シートにヒートシールやラミネート接着、その他によって固設してもよいが、カバーシートと基材シートとを同質の材料を使用し、図９（ａ）の展開図、図９（ｂ）の断面図に示すように基材シート１０とカバーシート４０とを連設したまま基材シート１０に枠層２０と培養層３０とを形成し、カバーシート４０を折り曲げて微生物培養シートを形成してもよい。図９（ｃ）にその断面図を示す。この方法によれば、カバーシートに特定成分層３０’や粘着層５０を形成する場合でも、基材シート１０とカバーシート４０が連設されているため、基材シート１０の上の培養層３０と対向する位置に正確かつ簡便に特定成分層３０’を形成することができる。

【0073】

また、図１０及び図１１の横断面図に示すように、カバーシート４０と基材シート１０とを異なる部材で構成し、カバーシート４０と、培養層３０を形成した基材シート１０とを、両面接着テープ６０等で張り合わせてもよい。

【0074】

図１２及び図１３に、カバーシート４０に格子印刷が形成され、カバーシート４０と培養層３０を形成した基材シート１０とが端部で接着された微生物培養シートの外観斜視図を示す。図１３では、培養層３０の周囲に枠層２０が形成されている。

【0075】

微生物培養シートは、ガンマ線照射やエチレンオキサイドガス滅菌等の滅菌を施し、微生物培養シートの製品とすることができる。微生物培養シートは、含まれる微生物栄養成分の種類や、使用する基材シート、カバーシートの通気性その他に応じて各種の微生物の培養を行うことできる。

【0076】

また、本発明の微生物培養シートを用いて、試料中に含まれる大腸菌群を効果的に検出することができる。すなわち、本発明の微生物培養シートは、β−ガラクトシダーゼ活性による発色反応において、大腸菌群に対して優れた検出性能を有するため、大腸菌群の検出用ツールとして有用である。また、同様に、本発明の微生物培養シートを用いて、試料中に含まれる黄色ブドウ球菌を効果的に検出することができる。すなわち、本発明の微生物培養シートは、α−グルコシダーゼ活性による発色反応において、黄色ブドウ球菌に対して優れた検出性能を有するため、黄色ブドウ球菌の検出用ツールとして有用である。

【0077】

そこで、本発明の一形態は、少なくとも１種の細菌を含む試料中の大腸菌群を検出するための方法であって、本発明の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも１部を接種する工程と、前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、を含む方法である。

【0078】

また、本発明の一形態は、少なくとも１種の細菌を含む試料中の黄色ブドウ球菌を検出するための方法であって、本発明の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも１部を接種する工程と、前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、を含む方法である。

【実施例】

【0079】

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。

【0080】

（実施例１）
メタノール２７６ｇにポリビニルピロリドン２４ｇを溶解し、ポリビニルピロリドンのメタノール溶液を調製した。このポリビニルピロリドンのメタノール溶液に、ゲル化剤としてのグアーガム粉末７５．８ｇ、栄養成分としてのトリプトン９．３ｇ、酵母エキス０．９ｇ、ピルビン酸ナトリウム０．３５ｇ、Ｌ−トリプトファン０．３５ｇ、塩化ナトリウム１．７ｇ、リン酸二水素ナトリウム０．１８ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．９５ｇ、硝酸カリウム０．１８ｇ、選択剤としてのラウリル硫酸ナトリウム０．０４ｇ、発色酵素基質としてのＸ−ｇａｌ０．０４ｇ、可塑剤としてのポリエチレングリコール１０ｇ、β−ガラクトシダーゼ発現誘導物質としてのＩＰＴＧ０．０４ｇを添加して培地液を調製した。なお、使用した材料の入手先は以下の通りである。

【0081】

・ポリビニルピロリドン（日本触媒社製、商品名「ポリビニルピロリドン Ｋ−９０」）・グアーガム粉末（三晶社製、商品名「ネオビスコ Ｇ」、２００メッシュタイプ）
・トリプトン（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製、商品
名「ＢＡＣＴ ＴＲＹＰＴＯＮＥ」）
・酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製、商品名「ＹＥＡＳＴ ＥＸＴＲＡＣＴ」）
・ピルビン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）
・Ｌ−トリプトファン（和光純薬工業社製）
・塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）
・リン酸二水素ナトリウム（和光純薬工業社製）
・リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業社製）
・硝酸カリウム（和光純薬工業社製）
・ラウリル硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）
・Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社製）
・ポリエチレングリコール（和光純薬工業社製、ポリエチレングリコール６００、和光一級）
・ＩＰＴＧ（和光純薬工業社製）

【0082】

次に、この培地液をポリエチレンテレフタラートフィルム（帝人デュポン社製、商品名「テイジンテトロンフィルム」）の上に所定のパターンに配置した後、５０℃で１５分間乾燥させ、培養層を形成した。乾燥後の培養層の厚さは、約２５０μｍであった。次いで、ディスペンサーを用いて、ＵＶ硬化インク（十条ケミカル社製、商品名「レイキュアーＧＡ ４１００−２」）を幅１．０ｍｍ、高さ７５０μｍ、直径５２ｍｍの円状に塗布した。続いて、水銀ランプを用いて積算光量２５０ｍＪ／ｃｍ^２の紫外線を照射し、ＵＶ硬化インクを硬化させ、培養層の周りに疎水性樹脂を用いて枠層を形成した。

【0083】

そして、カバーシート（東セロ社製、ＯＰＰフィルム、型番「ＯＰ Ｕ−１（片面コロナ放電処理）」、厚み：４０μｍ）を、前記ポリエチレンテレフタラートフィルムの上に積層し、端部を接着した後、γ線で滅菌して、微生物培養シート（１）を作製した。

【0084】

（実施例２）
ポリエチレングリコール１０ｇの代わりに、１，３−ブチレングリコール（和光純薬工業社製）１０ｇを用いて培地液を調製したこと以外は、実施例１と同様にして微生物培養シート（２）を作製した。

【0085】

（比較例１）
ポリエチレングリコール１０ｇの代わりに、グリセリン（阪本薬品工業社製）１０ｇを用いて培地液を調製したこと以外は、実施例１と同様にして、微生物培養シート（３）を作製した。

【0086】

「評価」
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）又はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ１３８８３）（両方とも大腸菌群に含まれる）を液体培地（ＴＲＹＰＴＩＣ ＳＯＹ ＢＲＯＴＨ）にて３７℃で２４時間振盪培養した。そして、得られた被検液のそれぞれを菌数が１０^２／ｍｌとなるように滅菌生理食塩水で希釈し、ＴＴＣを添加して、２つの培養試験用被検液をそれぞれ調製した。これらの培養試験用被検液を、微生物培養シート（１）〜（３）の培養層の上に１ｍｌずつそれぞれ接種し、それらの上にカバーシートを乗せて、被検液を培養層全体に広げた。その後、約１分間静置してゲルを形成させ、６つの培養試験用サンプルを得た。得られた培養試験用サンプルを３７℃で４８時間培養した。そして、培養後に発生したコロニーについて発色の有無を確認した。培養後の培養試験用サンプルの写真を図１４〜１６にそれぞれ示す。なお、図１４は実施例１で作製した微生物培養シート（１）を用いた培養試験用サンプルを示し
、図１４（Ａ）はＥ．ｃｏｌｉの被検液を接種した培養試験用サンプル、図１４（Ｂ）はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの被検液を接種した培養試験用サンプルを示す。図１５は実施例２で作製した微生物培養シート（２）を用いた培養試験用サンプルを示し、図１５（Ａ）はＥ．ｃｏｌｉの被検液を接種した培養試験用サンプル、図１５（Ｂ）はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの被検液を接種した培養試験用サンプルを示す。図１６は比較例１で作製した微生物培養シート（３）を用いた培養試験用サンプルを示し、図１６（Ａ）はＥ．ｃｏｌｉの被検液を接種した培養試験用サンプル、図１６（Ｂ）はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの被検液を接種した培養試験用サンプルを示す。

【0087】

可塑剤としてポリエチレングリコール又は１，３−ブチレングリコールが含まれている微生物培養シート（１）又は（２）（実施例１及び２）では、図１４又は１５に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ１３８８３）の両方でＸ−Ｇａｌによる発色が確認された。しかし、可塑剤としてグリセリンが含まれている微生物培養シート（３）（比較例１）では、図１６に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）では発色が確認されるものの、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ１３８８３）では発色が確認されなかった。比較例１の結果より、グリセリンを用いると、大腸菌群の中でもβ−ガラクトシダーゼ基質による発色反応を確認できない菌がいることがわかる。そして、意外にも、グリセリンの代わりにポリエチレングリコール又は１，３−ブチレングリコールを可塑剤として用いることにより、グリセリンを用いた場合では発色が確認できない菌であっても、β−ガラクトシダーゼ基質による発色反応を確認できることがわかる。

【0088】

以下の試験例では、α−グルコシダーゼ活性又はホスファターゼ活性を利用した発色反応試験において、グリセリンを含む培養層を用いた場合に発色反応が得られない菌がいるかどうか、また、グリセリンの代わりにポリエチレングリコールを用いた場合に発色反応が得られるかどうかについて、寒天培地にて簡易的に調べた。

【0089】

（参考例１）
トリプトンを４．０ｇ／ｌ、ポリエチレングリコールを１８．７ｇ／ｌ、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを０．１ｇ／ｌ、及び寒天を１５．０ｇ／ｌ含む培地液を調製した。この培地液をオートクレーブで滅菌した後、シャーレに広げて固め、寒天培地（１）を作製した。

【0090】

（参考例２）
ポリエチレングリコールを寒天培地液に添加しなかったこと以外は、参考例１と同様にして、寒天培地（２）を作製した。

【0091】

（参考例３）
４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド０．１ｇ／ｌの代わりに、ホスファターゼの発色酵素基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ホスフェイトを０．１ｇ／ｌの濃度で寒天培地液に添加し、かつポリエチレングリコール１８．７ｇ／ｌの代わりにグリセリンを１８．７ｇ／ｌの濃度で寒天培地液に添加したこと以外は、参考例１と同様にして、寒天培地（３）を作製した。

【0092】

（比較例２）
ポリエチレングリコール１８．７ｇ／ｌの代わりにグリセリンを１８．７ｇ／ｌの濃度で寒天培地液に添加したこと以外は、参考例１と同様にして、寒天培地（４）を作製した。

【0093】

「評価」
α−グルコシダーゼ活性を有する菌として、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２５９２３）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２５９０４）、及びＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ１３２７６）を使用した。これらの３種の菌を液体培地（ＴＲＹＰＴＩＣ ＳＯＹ ＢＲＯＴＨ）にて３７℃で２４時間振盪培養した。そして、得られた被検液を菌数が１０^２／ｍｌとなるように滅菌生理食塩水で希釈し、３つの培養試験用被検液をそれぞれ調製した。この培養試験用被検液を、寒天培地（１）〜（４）の上に０．１ｍｌずつそれぞれ接種し、コンラージ棒を用いて塗抹後、培養試験用サンプルを得た。得られた培養試験用サンプルを３５℃で４８時間培養した。表１に発色反応の結果を示す。なお、表１において、○はα−グルコシダーゼ基質又はホスファターゼ基質による発色反応が確認されたことを示す。×はα−グルコシダーゼ基質による発色反応が確認されなかったことを示す。

【0094】

【表1】

【0095】

比較例２では、可塑剤としてグリセリンを含む場合、α−グルコシダーゼ基質による発色反応は確認されなかった。また、可塑剤を添加しなかった参考例２では、α−グルコシダーゼ基質による発色反応が確認された。これにより、通常ではα−グルコシダーゼ基質による発色反応により検出できる菌において、グリセリンの存在により、発色反応が確認できなくなる菌が存在することがわかる。また、可塑剤としてポリエチレングリコールを用いた参考例１では、試験したすべての菌についてα−グルコシダーゼ基質による発色反応を確認できた。なお、参考例３より、可塑剤としてグリセリンを用いた場合であっても、ホスファターゼ基質による発色反応は確認された。

【産業上の利用可能性】

【0096】

本発明の微生物培養シートは、例えば、菌の検出や菌数検査等に用いることができる。

【符号の説明】

【0097】

１０ 基材シート
２０ 枠層
３０ 培養層
３０’ 特定成分層
４０ カバーシート
５０ 粘着層
６０ 両面接着テープ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】