特許 6443344 スクリーニングおよび薬物開発のための新規キメラポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6443344

(24)【登録日】2018年12月7日

(45)【発行日】2018年12月26日

(54)【発明の名称】スクリーニングおよび薬物開発のための新規キメラポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20181217BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20181217BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20181217BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20181217BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20181217BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20181217BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20181217BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20181217BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C12N15/11 Z

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/02 C

   G01N33/50 Z

【請求項の数】25

【全頁数】91

(21)【出願番号】特願2015-555710(P2015-555710)

(86)(22)【出願日】2014年1月30日

(65)【公表番号】特表2016-504919(P2016-504919A)

(43)【公表日】2016年2月18日

(86)【国際出願番号】EP2014051845

(87)【国際公開番号】WO2014118297

(87)【国際公開日】20140807

【審査請求日】2017年1月27日

(31)【優先権主張番号】61/758,518

(32)【優先日】2013年1月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13154552.7

(32)【優先日】2013年2月8日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】13187265.7

(32)【優先日】2013年10月3日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】509333933

【氏名又は名称】フエー・イー・ベー・フエー・ゼツト・ウエー

(73)【特許権者】

【識別番号】509333922

【氏名又は名称】フリエ・ウニベルシテイト・ブリユツセル

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ステヤエルト，ヤン

(72)【発明者】

【氏名】レーレマンス，トーン

(72)【発明者】

【氏名】パルドン，エルス

【審査官】 千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０６２２８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J.Biol.Chem., 2003, Vol. 278, No. 18, pp. 15778-15788

【文献】 Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1994, Vol. 91, pp. 8827-8831

【文献】 TiPS, 2000, Vol. 21, pp. 24-28

【文献】 TiPS, 1999, Vol. 20, pp. 383-389

【文献】 Nature, 2011, Vol. 469, pp. 175-181

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

立体構造選択的な結合ドメインに融合したＧＰＣＲを含むキメラポリペプチドであって、前記結合ドメインは、免疫グロブリンの一本鎖可変ドメインであり、前記結合ドメインは、前記ＧＰＣＲに指向するか、及び／又はＧＰＣＲに特異的に結合することができ、前記ＧＰＣＲは、前記結合ドメインが結合すると、活性な立体構造又は不活性な立体構造で安定化され、前記活性な立体構造又は不活性な立体構造で安定化された前記ＧＰＣＲは、対応する融合していないＧＰＣＲと比較して、立体構造選択的なリガンドに対するアフィニティが増加している、キメラポリペプチド。

【請求項2】

前記結合ドメインが、直接的に、又はリンカーを介してＧＰＣＲに融合する、請求項１に記載のキメラポリペプチド。

【請求項3】

前記活性な立体構造は、アゴニスト立体構造、パーシャルアゴニスト立体構造、バイアスアゴニスト立体構造である、請求項１又は２に記載のキメラポリペプチド。

【請求項4】

前記不活性な立体構造は、インバースアゴニスト立体構造である、請求項１又は２に記載のキメラポリペプチド。

【請求項5】

前記結合ドメインは、ＧＰＣＲの細胞内エピトープに結合する、請求項１〜４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。

【請求項6】

前記細胞内エピトープは、下流のシグナル伝達タンパク質のための結合部位に含まれる、請求項５に記載のキメラポリペプチド。

【請求項7】

前記細胞内エピトープは、Ｇタンパク質結合部位に含まれる、請求項５に記載のキメラポリペプチド。

【請求項8】

前記免疫グロブリン一本鎖可変ドメインが、重鎖抗体に由来する、請求項１〜７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。

【請求項9】

前記免疫グロブリン一本鎖可変ドメインが、ＶＨＨ配列又はナノボディ配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。

【請求項10】

ＧＰＣＲは、天然に生じるＧＰＣＲである、請求項１〜９のいずれかに記載のキメラポリペプチド。

【請求項11】

ＧＰＣＲは、天然に生じるＧＰＣＲの改変体、又は天然に生じるＧＰＣＲからトランケーションされた形態である、請求項１〜１０のいずれかに記載のキメラポリペプチド。

【請求項12】

ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲグルタメートファミリーのＧＰＣＲ、ＧＰＣＲロドプシンファミリーのＧＰＣＲ、ＧＰＣＲ接着ファミリーのＧＰＣＲ、ＧＰＣＲのＦｒｉｚｚｌｅｄ／Ｔａｓｔｅ２ファミリーのＧＰＣＲ及びＧＰＣＲのセクレチンファミリーのＧＰＣＲを含む群から選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。

【請求項13】

請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチドと、受容体リガンドとを含む複合体。

【請求項14】

結晶性である、請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチド、又は請求項１３に記載の複合体。

【請求項15】

請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。

【請求項16】

請求項１５に記載の核酸配列を含む宿主細胞。

【請求項17】

細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。

【請求項18】

請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチド又は請求項１３に記載の複合体を含む膜組成物。

【請求項19】

結合ドメインに融合したＧＰＣＲを含むキメラポリペプチドを製造するための方法であって、適切な条件で請求項１６又は１７に記載の宿主細胞を培養する工程と、任意選択により、キメラポリペプチドを単離する工程とを含む、方法。

【請求項20】

細胞表面に活性な立体構造又は不活性な立体構造で、又は宿主細胞の特定の細胞膜フラクション中に、ＧＰＣＲを表出させるための方法であって、請求項１６又は１７に記載の宿主細胞を提供する工程と、適切な条件で前記細胞を培養し、キメラポリペプチドを発現する工程とを含む、方法。

【請求項21】

立体構造選択的な化合物を特定する方法であって、
（ｉ）請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチドを提供する工程と、
（ｉｉ）試験化合物を提供する工程と、
（ｉｉｉ）キメラポリペプチドに含まれるＧＰＣＲに対する試験化合物の選択的な結合を評価する工程と
を含む、方法。

【請求項22】

特定される立体構造選択的な化合物が、アゴニスト化合物、例えば、アゴニスト低分子又は抗体である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

ＧＰＣＲを結晶化し、及び／又はＧＰＣＲの構造を解明するための請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチド又は請求項１３に記載の複合体の使用。

【請求項24】

機能的な立体構造状態のＧＰＣＲを捕捉するための請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチド又は請求項１３に記載の複合体の使用。

【請求項25】

請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチド又は請求項１６又は１７に記載の宿主細胞を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規ポリペプチドおよびスクリーニングおよび薬物開発のためのこの新規ポリペプチドの使用に関する。さらに具体的には、本発明は、結合ドメインに融合する膜タンパク質（特に、ＧＰＣＲ）を含むキメラポリペプチドを提供し、この結合ドメインは、前記膜タンパク質に指向するか、および／または前記膜タンパク質に特異的に結合する。特に、本発明のキメラポリペプチドは、一本鎖タンパク質であり、分子内反応において、この結合ドメインが、目的の立体構造で膜タンパク質を安定化する。このようなキメラポリペプチドをコードする核酸配列、このようなキメラポリペプチドを発現することができる細胞、およびこれらに由来する細胞組成物も提供される。本発明のキメラポリペプチドを用いる化合物のためのスクリーニング方法も想定される。

【背景技術】

【0002】

薬物開発の努力は、一般的に、目的とする標的の活性を調節、即ち、阻害するか、または向上させる化合物の特定に集中している。従来のリード化合物を特定する努力は、生化学スクリーニングまたは細胞系スクリーニング、またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ化合物設計によって進められる。これらの方法によって、今日使用状態にある多数の実効可能な治療法を特定し、確認している。しかし、新しい薬化合物の高い失敗率（低めに見積もっても医薬あたり８億ドルの費用で、第Ｉ相試験の臨床治療薬のうち、概算で８％のみが最終的に食品医薬品局の承認を得る。）を反映すると、多くの努力は失敗に終わっており、多くの標的は、薬になり得ないとされ、一度は中止されている（Ｌｅｅら、２００９）。これらの失敗のかなりの部分は、ほとんどの生化学アッセイまたは細胞系アッセイが、この主な立体構造（基本立体構造とも呼ばれる。）の標的について行われるという事実に起因している。しかし、本願発明者らは、立体構造の自由度が、ＧＰＣＲ、イオンチャンネル、（核）受容体、キナーゼおよびホスファターゼを含む、現在および将来の薬物標的の大部分の機能および薬理学の鍵であることを知っている。これらの標的の多くについて、最も安定な立体構造は、リガンドまたはアクセサリータンパク質が存在しない状態での主な構造型に対応し（基本立体構造）、この治療適用に最も効果的であるように薬が結合しなければならないような、薬となり得る立体構造には対応していない。

【0003】

今日、医学的介入のために最も一般的に標的とされるタンパク質群は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であり、７回膜貫通型受容体（７ＴＭＲ）とも呼ばれる。このＧＰＣＲは、多様な一連のリガンド、例えば、生体アミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、プロスタノイド、リン脂質、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、Ｃａ^２＋イオン、臭気物質、苦味物質および甘味物質、フェロモンおよびプロトンに対する生理学的応答に必須の役割を果たす（Ｈｅｉｌｋｅｒら、２００９）。ＧＰＣＲに作用するオルソステリックリガンドは、下流のシグナル伝達経路に対し、ある範囲の影響を誘発することができる。一般的に、ＧＰＣＲは、活性化のためにアゴニストの結合を必要とする。全アゴニストは、この受容体を最大限に活性化する。パーシャルアゴニストは、飽和濃度でさえ、最大限より低い刺激を誘発する。ある場合には、ＧＰＣＲは、アゴニストが存在しない状態でさえ、特定のシグナル伝達経路に対する基礎活性を示す場合がある（恒常的な活性）。インバースアゴニストは、この基礎活性を阻害することができる。特に、ニュートラルアンタゴニストは、ＧＰＣＲのオルソステリック結合部位へのアゴニスト、パーシャルアゴニストおよびインバースアゴニストの結合を阻害することができる一方、ニュートラルアンタゴニストは、受容体の基礎活性を変えない。近年、正または負のアロステリック調整剤（それぞれ、ＰＡＭおよびＮＡＭ）およびオルソステリックリガンドと比較して新しい作用態様を与えるニュートラルリガンドを含め、受容体の機能を制御するアロステリック部位で作用するＧＰＣＲのための新規リガンドの開発において、進歩がみられた（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ２００２）。

【0004】

ＧＰＣＲが、Ｇタンパク質または多機能アダプタータンパク質β−アレスチンが介在する機序を含め、幾つかの別個の機序によってシグナルを伝達することができることは、十分に確立されている（Ｒａｊａｇｏｐａｌら、２０１０）。幾つかのＧＰＣＲの構造が、インバースアゴニスト、アンタゴニストおよびアゴニストを含む種々のリガンドとの複合体において解明され（Ｃｈｅｒｅｚｏｖら、２００７、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ｂ、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、２０１１、Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、２０１１、Ｘｕ ２０１１、Ｇｒａｎｉｅｒら、２０１２、Ｈａｇａら、２０１２、Ｈａｎｓｏｎら、２０１２、Ｋｒｕｓｅら、２０１２、Ｍａｎｇｌｉｋら、２０１２、Ｗｕら、２０１２、Ｚｈａｎｇら、２０１２）、ならびにＧタンパク質において解明され（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ａ）、本願発明者らは、ＧＰＣＲが、立体構造的に複雑な分子であり、特定の立体構造がＧタンパク質を活性化させることを知っている。本発明の文脈で特に重要なのは、基本立体構造と比較し、アゴニストが結合するポケットの構造の比較的小さな変化のみによって、膜貫通セグメントのうちの３つにおいて、かなりの移動（１４Åまで）および再配列が起こるという観察結果である（Ｌｅｂｏｎら、２０１２）。

【0005】

質量分析法に基づく戦略（Ｋａｈｓａｉら、２０１１）、生物物理学的分析（Ｙａｏら、２００６、Ｍａｒｙら、２０１２）およびＮＭＲ分光法（Ｌｉｕら、２０１２；Ｂｏｋｏｃｈら、２０１０）は、アレスチンが介在するシグナル伝達を生じる、他の別個のリガンドに特異的な立体構造が存在するという直接的な証拠を与える。この結果、異なるリガンドが、この立体構造および多様なシグナル伝達、一本鎖受容体の制御レパートリーに対し異なる影響を及ぼし得ることになる。これらの複数の立体構造状態の重要性は、この薬理学との関連性である。図１に示すように、これらの受容体のそれぞれの立体構造は、これらの立体構造が、Ｇタンパク質およびアレスチンを含む異なるエフェクター系に対してそれぞれ別個の相対的な有効性を促進するため、別個の治療薬物標的と考えることができる。

【0006】

薬物開発手法は、治療に関連する「薬となり得る」立体構造において標的を捕捉することによって、かなりの利点を与えることができる。特定の機能的立体構造で受容体を安定化すると、低分子または生物学的物質を用いて標的とするのに適した新しい構造特徴を示す単一の疾患に関連する薬となり得る立体構造に、受容体を固有に固定し、薬となり得る立体構造に選択的な化合物の同定も可能となる。基礎活性より低いエフェクター系に対応する不活性な状態または個々のエフェクター系を活性化する特定の機能的状態を含め、固有の薬となり得る立体構造の安定化は、化合物にもっと良好な治療有効性を与えるだけではなく、望ましくない経路の引き金となることから生じる望ましくない副作用が小さい化合物の特定の利益も与え得る（Ｇａｌａｎｄｒｉｎら、２００７）。

【0007】

これに加え、立体構造の自由度は、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）およびフラグメントに基づく薬物開発（ＦＢＤＤ）における課題である（Ｌａｗｓｏｎ ２０１２）。ＨＴＳにおいて、標的の異なる立体構造という問題は、ある場合には、還元論の組み換え系アッセイではなく、機能的な読み出しを伴う全システムアッセイを用いることによって克服することができる（Ｋｅｎａｋｉｎ、２００９；Ｒａｊａｇｏｐａｌら、２０１０）。しかし、ＦＢＤＤにおいて、全システムアッセイは、初期のヒットの有効性／効力が低く、生体活性のためにｍＭ濃度のフラグメントを必要とし、毒性を生じることが多いため、使用することができない。この結果、高スループットの一次スクリーニングは、リガンドまたはアクセサリータンパク質が存在しない状態で、望ましい機能的立体構造で安定化された標的受容体からかなり有益であろう。このような立体構造によって安定化された受容体への利用によって、特定の構造的特徴を有する立体構造に特異的なリガンドの部分集合の特定が可能になるであろう（図１）。この様式で、種々の（全システムの）シグナル伝達アッセイにおいて、この有効性プロフィールを確立する前に、単純な結合評価を用い、潜在的に生体活性のある化合物の最初の選択を行うことができる。

【0008】

立体構造の自由度は、フラグメントから出発する構造に基づく薬物開発も妨害する。第１に、フラグメントに基づくスクリーニング（ＦＢＳ）の多くの潜在的なヒットは、立体構造平衡を、回折する結晶の状態で結晶化可能なタンパク質−リガンド複合体の１つの立体構造へと定量的に変位させるのに十分なほど強力ではない。ある複合体が、結晶化することができない場合、リガンドを含まないタンパク質と（小さな）リガンドとの既存の結晶を浸漬することは、多くは、この複合体の結晶を得るための選択方法である。しかし、これらのリガンドが、立体構造的に複雑なタンパク質の立体構造平衡を変位させる場合、これらの誘発された立体構造の変化は、多くの場合に、この結晶を破壊するであろう（Ｄａｎｌｅｙ ２００６）。

【0009】

この最初のＧＰＣＲの構造が、２００７年に解明されると（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２００７、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、２００７）、本願発明者らは、ＧＰＣＲ薬物開発の努力に対して構造に基づく手法を適用する可能性を高めるＧＰＣＲ構造生物学の新しい時代に入った（ＳｈｏｉｃｈｅｔおよびＫｏｂｉｌｋａ ２０１２）。幾つかの治療適用に関連する非常に多くのＧＰＣＲ薬物標的について、アゴニストに結合した活性な状態は、多くは、薬となり得る立体構造である。この治療に関連する「薬となり得る」立体構造において、高解像度のＧＰＣＲで構造を解析することには、依然として問題がある。アゴニストに結合した活性な状態のＧＰＣＲ構造を得るための努力は、Ｇタンパク質が存在しない状態で、この状態の固有の不安定性に起因して、困難であることがわかっている。全アゴニストとの複合体におけるＧＰＣＲの構造は解明されたが、困難がなかったわけではない。第１に、天然アゴニストは、一般的に、回折品質の結晶の生成に対し、受容体を十分に安定化しない。この問題を解決する試みにおいて、アゴニストは、結晶化の目的のためにＧＰＣＲに共有結合している。しかし、例えば、アゴニストが共有結合したβ_２ＡＲの結晶構造は、膜貫通セグメントにおけるほんのわずかな再配列を有する活性な状態ではなく、不活性な状態に非常に似た立体構造であることがわかる（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、２０１１）（Ｌｅｂｏｎら、２０１２）。

【0010】

アゴニストに結合したＧＰＣＲの立体構造を決定することに対する別の手法は、系統的な突然変異誘発による受容体の熱安定化の後、結合したアゴニスト存在下、増加した熱安定性を測定することである（例えば、ＷＯ２００８１１４０２０、ＷＯ２００９０７１９１４、ＷＯ２０１０１４９９６４、ＷＯ２０１２０９８４１３）。例えば、アゴニストが結合したＡ_２ＡＡＲ（Ｌｅｂｏｎら、２０１１）、アゴニストが結合したβ１−アドレナリン作動性受容体（Ｗａｒｎｅら、２０１１）およびアゴニストが結合したニューロテンシン受容体（Ｗｈｉｔｅら、２０１２）について、熱に安定な突然変異が開発された。しかし、これらのアゴニストが結合して安定化された受容体の構造は、完全に活性な立体構造とは似ていないと考えられ、膜貫通らせん６の小さな置き換えがあると判断される。もっと重要なことに、Ｇタンパク質またはＧタンパク質模倣物によって安定化される活性な状態とは対照的に、これらの熱安定化された受容体は、それぞれのアゴニストについて顕著なアフィニティの増加を示さない（Ｓｅｒｒａｎｏ−Ｖｅｇａら、２００８、Ｓｈｉｂａｔａら、２００９、Ｌｅｂｏｎら、２０１１）。

【0011】

つい最近、Ｇタンパク質の機能を模倣し、オルソステリック部位でのアゴニストへのアフィニティが高い立体構造的に選択的なナノボディ（Ｘａｐｅｒｏｎｅ（商標））を利用し、アゴニストが結合したＧＰＣＲの活性な状態の構造を得ることも可能になった（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ｂ）。Ｘａｐｅｒｏｎｅは、ＧＰＣＲの構造を治療に関連する立体構造に固定するために有用なツールであり（Ｓｔｅｙａｅｒｔ ＆ Ｋｏｂｉｌｋａ、２０１１）、既存のスクリーニング方法の感度および選択性を高めることによって、薬物候補物質の発見を促進する（ＷＯ２０１２００７５９３）。しかし、この技術的手法には、制限もある。オルソステリック部位へのアゴニストの結合は、受容体のアロステリック細胞内部位で、Ｇタンパク質を模倣するＸａｐｅｒｏｎｅ（商標）へのアフィニティを高め、この逆も真であり（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ｂ）、ＧＰＣＲ−Ｘａｐｅｒｏｎｅ（商標）複合体は、アゴニストが存在すると、かなり安定である。この結果、ＧＰＣＲ、安定化するＸａｐｅｒｏｎｅ（商標）およびアゴニストは、一緒に結晶化し、活性な立体構造のＧＰＣＲ結晶を得なければならず、ＷＯ２０１２００７５９３に記載される発明は、例えば、結晶を成長させるために用いられるアゴニストがその後に浸漬されるリガンドと競争するため、既存の結晶へのリガンドの浸漬を伴う、構造ベースの薬物開発の手法に十分に適しているとは言えない。

【0012】

従って、アゴニストが存在しない状態であっても、特定の薬となり得る立体構造において、ＧＰＣＲを構成的に安定化させる新しい方法の開発は、化合物スクリーニングおよび／または構造ベースの薬物設計による薬物開発を改良するための重要な強みであろう。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】国際公開第２００８／１１４０２０号

【特許文献2】国際公開第２００９／０７１９１４号

【特許文献3】国際公開第２０１０／１４９９６４号

【特許文献4】国際公開第２０１２／０９８４１３号

【特許文献5】国際公開第２０１２／００７５９３号

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００９

【非特許文献2】Ｈｅｉｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９

【非特許文献3】Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ２００２

【非特許文献4】Ｒａｊａｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【非特許文献5】Ｃｈｅｒｅｚｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００７

【非特許文献6】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１ｂ

【非特許文献7】Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１

【非特許文献8】Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１１

【非特許文献9】Ｘｕ ２０１１

【非特許文献10】Ｇｒａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【非特許文献11】Ｈａｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【非特許文献12】Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【非特許文献13】Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【非特許文献14】Ｍａｎｇｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【非特許文献15】Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【非特許文献16】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【非特許文献17】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１ａ

【非特許文献18】Ｌｅｂｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【非特許文献19】Ｋａｈｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１

【非特許文献20】Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２００６

【非特許文献21】Ｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【非特許文献22】Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【非特許文献23】Ｂｏｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【非特許文献24】Ｇａｌａｎｄｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７

【非特許文献25】Ｌａｗｓｏｎ ２０１２

【非特許文献26】Ｋｅｎａｋｉｎ，２００９

【非特許文献27】Ｄａｎｌｅｙ ２００６

【非特許文献28】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７

【非特許文献29】Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００７

【非特許文献30】Ｓｈｏｉｃｈｅｔ ａｎｄ Ｋｏｂｉｌｋａ ２０１２

【非特許文献31】Ｌｅｂｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１

【非特許文献32】Ｗａｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１

【非特許文献33】Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【非特許文献34】Ｓｅｒｒａｎｏ−Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，２００８

【非特許文献35】Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，２００９

【非特許文献36】Ｓｔｅｙａｅｒｔ ＆ Ｋｏｂｉｌｋａ，２０１１

【発明の概要】

【0015】

本発明は、本質的に、治療に関連する立体構造で安定化される薬物標的を提供する。本願発明者らの新しい手法は、治療的な介入のために低分子または生物学的物質を用いて標的化するのに適切な新しい構造的特徴を明らかにするために、目的の立体構造で標的を捕捉する。薬物標的の固有の立体構造の構成的安定化は、目的の薬物標的と立体構造選択的な結合ドメインとを融合させる（場合により、リンカーによって空間的に離される。）ことによって得られ、一本鎖タンパク質中の両部分の分子内反応の結果である。得られる融合ポリペプチド（本明細書では、キメラポリペプチドとも呼ばれる。）は、非キメラ形態の薬物標的とは顕著に異なる構造特性を有する場合があり、例えば、新しく、もっと強力でもっと選択的な薬物の開発のための新しい革新的なツールとして役立つ場合があるため、特に興味深い。本発明がＧＰＣＲを用いて例示されるが、任意の膜タンパク質に等しく適用可能であると理解されるであろう。

【0016】

本発明のキメラポリペプチドの鍵となる利点の１つは、定義された１：１の化学量論量のＧＰＣＲと結合ドメインが、確実に一本鎖タンパク質の中にあり、特定の薬となり得る立体構造で受容体を安定化するための結合ドメインの特性を維持しつつ、融合パートナーの物理的近接性を強制することである。このことを示すために、限定する目的はないが、ＧＰＣＲおよび立体構造選択的なナノボディをコードする遺伝子セグメントの幾つかの遺伝的な融合物が構築され（実施例１、９、１３、１７、２０を参照）、発現するＧＰＣＲ−ナノボディ融合ポリペプチドの薬理特性が分析された（実施例６、８、１２、１６、１９、２２、２４から２５を参照）。本願発明者らは、ナノボディの特定のパネルの特性（例えば、ＧＰＣＲの活性な立体構造を安定化するもの、またはＧＰＣＲの不活性な立体構造を安定化するもの）が、このような１：１の遺伝子融合物で維持されることを示す。例えば、Ｎｂ８０に融合したβ２アドレナリン作動性受容体（β２ＡＲ）、つまり、Ｇタンパク質の機能を模倣し、Ｇタンパク質シグナル伝達にカップリングする活性な立体構造を安定化するナノボディ（ＷＯ２０１２００７５９３）は、β２ＡＲに指向せず、これに特異的に結合しないモックナノボディに融合した受容体と比較して、天然アゴニストであるエピネフリンに対するアフィニティを２０７２倍増加させ、インバースアゴニストＩＣＩ１１８，５５１へのアフィニティを４３分の１に低下させる（実施例６を参照）。

【0017】

β２ＡＲ−Ｎｂ８０融合物が、モックナノボディに融合したβ２ＡＲよりも２０００倍強く、天然のアゴニストであるエピネフリンに結合するという知見は、これらの立体構造が拘束された融合タンパク質が、Ｇタンパク質が介在するシグナル伝達のような特定のエフェクター系に関連するリガンドアフィニティを増加させることを示す。β２ＡＲ−Ｎｂ８０融合物が、合成アゴニスト（例えば、イソプロテレノールまたはサルブタモール）への増加したアフィニティも示すという観察結果は、このような立体構造が拘束された融合タンパク質が、特定のシグナル伝達経路の引き金となる／阻害する合成化合物または生物学的物質をスクリーニングするための良好な開始点を与え得ることを示す。従って、β２ＡＲの活性な立体構造（Ｇタンパク質共役型シグナル伝達を導く）に固有のオルソステリック部位またはアロステリック部位の構造特徴を選択的に認識する低分子またはフラグメントは、この活性部位に拘束されない受容体と比較して、β２ＡＲ−Ｎｂ８０の１：１融合物に対し、３桁まで強く結合する場合がある。ＨＴＳの目的のために、このことは、このようなスクリーニングが、ＧＰＣＲ−Ｎｂ融合物（例えば、β２ＡＲ−Ｎｂ８０融合物）で行われる場合、Ｇタンパク質共役型シグナル伝達を誘発する試験化合物を見つけ出す選択性が、この活性な状態に拘束されないβ２ＡＲに対するＨＴＳの努力と比較して、３桁大きくなり得ることを意味する。

【0018】

本発明のキメラポリペプチドのＧＰＣＲと結合ドメインの分子内相互作用の十分に定義された１：１の化学量論量は、分子間相互作用において効果的に維持／保証することはできず、ＧＰＣＲも、立体構造選択的な結合ドメインの外因性付加によって、特定の立体構造にも（ＷＯ２０１２００７５９３）、細胞系でも安定化されず、これによって、ＧＰＣＲは、立体構造選択的な結合ドメインと一緒に発現する。定義された１：１の化学量論量に関連する具体的な利点は、任意の立体構造選択的なリガンドが存在しない場合であっても、結合ドメイン部分が、高い効果的な分子内濃度で特定の受容体立体構造に拘束することができることである（実施例８を参照）。

【0019】

従来の受容体結合技術（例えば、所与のＧＰＣＲの特定の薬となり得る立体構造に特異的なリガンドの部分集合を選択的にスクリーニングするための放射性リガンド競争（阻害または置き換え）アッセイ）に基づくＨＴＳは、薬となり得る立体構造を安定化するナノボディとＧＰＣＲとの共有結合によらない複合体と比較した場合、本発明のキメラポリペプチドからかなりの利点を得ることができる（ＷＯ２０１２００７５９３）（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ｂ）。このことは、放射性リガンド競争アッセイ（または別の手段によって標識されたリガンドの競争アッセイ）が、遊離リガンドおよび受容体に結合したリガンドの物理的な分離に決定的に依存するという事実に起因する。これは、フィルタでの濾過によって、遠心分離によって、サイズ排除クロマトグラフィーによって、または他の生物物理学的方法によって一般的に行われる。ＧＰＣＲ−結合ドメイン融合物に結合した標識されたリガンドからの遊離リガンド（任意の手段によって標識されたもの）の分離は、キメラが、ＧＰＣＲと結合ドメインが定義された１：１の化学量論量で共有結合しているため、同じ従来の方法を用いて簡単に達成することができる。結合ドメインが、ＧＰＣＲに共有結合によって接続していない場合には（ＷＯ２０１２００７５９３）、放射性リガンド競争アッセイおよびその後のデータ分析は、ＧＰＣＲと結合ドメインの１：１の化学量論量が維持されず、かなり多くの分子種（ＧＰＣＲ−結合ドメイン融合物の場合には、遊離リガンド、遊離キメラおよびリガンド−キメラ複合体であるのに対し、遊離リガンド、遊離結合ドメイン、リガンド−受容体複合体、受容体−結合ドメイン複合体、リガンド−受容体−結合ドメイン複合体）が分離し、分析されることを伴うため、行うことがかなり困難である（実施例８を参照）。

【0020】

さらに、ＧＰＣＲを、ＧＰＣＲと結合ドメインの定義された１：１の化学量論量で、固体相の上に望ましい機能的立体構造で一本鎖タンパク質融合物として固定化することができるため、本発明のＧＰＣＲ−結合ドメイン融合タンパク質の革新的な特徴によって、特定の機能的立体構造のＧＰＣＲについて、表面プラズモン共鳴（Ｒｉｃｈら、２０１１）および標的が固定化されたＮＭＲスクリーニング（Ｆｒｕｈら、２０１０）を含む新しく出現した生物物理学的方法を用いて、リード化合物またはフラグメントの結合をスクリーニングすることもできる。

【0021】

さらに、特に驚くべきことに、本発明のＧＰＣＲ−結合ドメイン融合タンパク質は、１つの比較放射性リガンド競争アッセイにおいて、アゴニスト、アンタゴニストおよびインバースアゴニストをスクリーニングし、区別することができる。細胞受容体シグナル伝達アッセイを必要とせず、ｎＭ濃度からμＭ濃度の試験化合物の作用様式を区別し、予想する能力は、化合物スクリーニングのさらなる利点である（実施例２４から２６を参照）。

【0022】

定義される１：１の化学量論量でのこれらのＧＰＣＲ−結合ドメイン融合タンパク質の別の利点は、ＧＰＣＲのＸ線結晶学および構造ベースの薬物設計におけるこの適用である。さらに具体的には、ＧＰＣＲ−結合ドメイン融合物の１つの利点は、任意のリガンド存在下、または存在しない状態で、定義された１：１の化学量論量で融合タンパク質を精製し、結晶化させることができることである。従って、単に、リガンドを含まないＧＰＣＲ−結合ドメイン融合物に化合物を浸漬することによって、複数のリガンド−受容体の共複合体構造を決定することができ、さらなる利点は、この結晶系が、所定の受容体立体構造（例えば、Ｇタンパク質および／またはβ−アレスチン共役型シグナル伝達を生じる活性な立体構造、またはＧタンパク質および／またはアレスチン共役型シグナル伝達を促進することができない不活性な立体構造）で捕捉されることである。このように、リガンドを含まない受容体と、（低アフィニティの）リード化合物とを浸漬／共結晶化する可能性は、実際のスクリーニングを含むリード化合物生成のために、薬物開発のリード最適化部分中、例えば、選択性および溶解度の課題に対処するために必要である。

【0023】

従って、第１の態様によれば、本発明は、ＧＰＣＲ部分と、結合ドメイン部分とを含むキメラポリペプチドに関する。さらに具体的には、本発明のキメラポリペプチドは、結合ドメインに融合したＧＰＣＲを含み、前記結合ドメインは、分子内相互作用で、ＧＰＣＲに指向するか、および／またはＧＰＣＲに特異的に結合することができる。特定の実施形態によれば、結合ドメインは、直接的に、またはリンカーを介してＧＰＣＲに融合する。特定の実施形態において、結合ドメインは、天然に生じる結合パートナー（例えば、Ｇタンパク質またはアレスチン）ではない。

【0024】

好ましくは、キメラポリペプチドに含まれるような結合ドメインは、立体構造選択的な結合ドメインである。ある特定の実施形態によれば、本発明は、活性な立体構造に選択的な結合ドメインに融合したＧＰＣＲを含むキメラポリペプチドに関し、この結果、ＧＰＣＲは、前記結合ドメインに結合すると、活性な立体構造で安定化される。特定の実施形態によれば、活性な立体構造は、アゴニストに結合した活性な立体構造、例えば、全アゴニストに結合した活性な立体構造またはパーシャルアゴニストに結合した活性な立体構造である。または、本発明は、不活性な立体構造に選択的な結合ドメインに融合したＧＰＣＲを含むキメラポリペプチドにも関し、この結果、ＧＰＣＲは、前記結合ドメインに結合すると、不活性な立体構造で安定化される。一実施形態によれば、不活性な立体構造は、インバースアゴニストに結合した不活性な立体構造である。好ましくは、立体構造選択的な結合ドメインに融合したＧＰＣＲを含む本発明のキメラポリペプチドは、対応するＧＰＣＲのみと比較したとき、立体構造選択的なリガンドに対するアフィニティが増加している。

【0025】

さらに特定の実施形態によれば、本発明は、上述のキメラポリペプチドを提供し、結合ドメインは、ＧＰＣＲの細胞内立体構造エピトープに特異的に結合し、さらに特定的には、前記細胞内エピトープは、下流のシグナル伝達タンパク質（例えば、Ｇタンパク質結合部位）のための結合部位に含まれる。または、本発明は、上述のキメラポリペプチドを提供し、結合ドメインは、ＧＰＣＲの細胞外立体構造エピトープに結合する。

【0026】

他の特定の実施形態によれば、上述のようなキメラポリペプチドの一部を生成する結合ドメインは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列、またはこの任意の適切なフラグメントを含む。さらに具体的には、結合ドメインは、免疫グロブリン一本鎖可変ドメイン、好ましくは、重鎖のみの抗体に由来する免疫グロブリン一本鎖可変ドメインであってもよい。最も好ましくは、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、ＶＨＨ配列またはナノボディ配列を含む。

【0027】

別の態様において、本発明は、上述のようなキメラポリペプチドと、受容体リガンドとを含む複合体を想定する。このような複合体は、溶液または結晶の状態であってもよい。

【0028】

さらに、上述のようなキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子、このような核酸を含む宿主細胞も包含する。宿主細胞は、原核生物または真核生物（例えば、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞）由来であってもよい。さらに、本明細書に記載されるキメラポリペプチドまたは複合体を含む膜組成物も想定される。

【0029】

本発明の他の一態様は、結合ドメインに融合したＧＰＣＲを含むキメラポリペプチドを製造するための方法であって、この方法は、適切な条件で上述のキメラポリペプチドを含む宿主細胞を培養する工程と、任意選択により、キメラポリペプチドを単離する工程とを含む、方法に関する。

【0030】

さらに、本発明は、細胞表面に活性な立体構造または不活性な立体構造で、または宿主細胞の特定の細胞膜フラクション中に、ＧＰＣＲを表出させるための方法であって、この方法は、上述のキメラポリペプチドを含む宿主細胞を提供する工程と、適切な条件で前記細胞を培養し、キメラポリペプチドを発現させる工程とを含む、方法も提供する。

【0031】

本発明のさらなる態様は、立体構造選択的な化合物を特定する方法であって、この方法は、
（ｉ）上述のキメラポリペプチドを提供する工程と、
（ｉｉ）試験化合物を提供する工程と、
（ｉｉｉ）キメラポリペプチドに含まれるＧＰＣＲに対する試験化合物の選択的な結合を評価する工程と
を含む、方法である。

【0032】

上記の方法によって特定される立体構造選択的な化合物（低分子、抗体、抗体誘導体、ペプチド、またはＧＰＣＲと相互作用し得る任意の他のタンパク質足場）は、それぞれ、非バイアスアゴニスト、非バイアスインバースアゴニスト、またはＧタンパク質共役型またはアレスチン共役型シグナル伝達の引き金となるか、またはこれらを阻害するバイアスリガンドであってもよい。特定の実施形態によれば、上述のような方法は、さらに、生体活性（アゴニスト活性、インバースアゴニスト、アンタゴニスト活性）に従って試験化合物を分類する工程を含む。または、言い換えると、上述の方法によって、アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストの活性を区別することができる。

【0033】

ＧＰＣＲを結晶化し、および／またはＧＰＣＲの構造を解明し、機能的な立体構造状態のＧＰＣＲを捕捉するための上述のキメラポリペプチドまたは上述の複合体の使用も包含する。

【0034】

本発明のさらなる態様および好ましい実施形態は、以下の記載および添付の特許請求の範囲で定義される。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】ＧＰＣＲシグナル伝達の立体構造の複雑性。３つの異なるリガンドが、異なるエフェクター系に対して別個の相対的な有効性をそれぞれ促進し得る異なる受容体立体構造を誘発および／または安定化することができる、リガンドバイアス有効性を模式的に表す。省略語：Ｒ、受容体；Ａ、ＢおよびＣ、特定のシグナル伝達経路に関与するタンパク質またはタンパク質群（Ｇａｌａｎｄｒｉｎら、２００７から適用）。

【図2】実施例１に記載するβ２ＡＲ−ナノボディ融合物は、ペプチドリンカーと接続した２種類の異なるタンパク質を含む（ＧＰＣＲ β２ＡＲ３６５Ｎ、このリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（下線が引かれ、太字で強調される。）、ナノボディ）。下線は、ＨＡシグナルペプチドと、このＨｉｓ_６ペプチドタグである。ＦＬＡＧ−タグは太字で表され、ＴＥＶ開裂部位は、灰色の陰影で示される。Ａ．β２ＡＲ−ナノボディ融合構築物をイラストで表す。Ｂ．β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０によってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列。Ｃ．ｐＦａｓｔＢａｃ β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１によってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列。Ｄ．ｐＦａｓｔＢａｃ β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９によってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列。Ｅ．ｐＦａｓｔＢａｃ β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０によってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列。

【図3】ウェスタンブロットによって分析される、Ｓｆ９細胞における組み換えβ２ＡＲ−ナノボディ融合タンパク質の発現。融合タンパク質の存在は、実施例４に説明されるように、抗ＦＬＡＧ検出によって検出された。感染していないＳｆ９細胞の膜（レーン１）。Ｎｂに融合しなかった、組み換えβ２ＡＲ３６５Ｎを発現するＳｆ９細胞の膜（レーン２：細胞を、Ｐ２の１：２５０希釈物で感染させ、４８時間培養した。レーン３：細胞を、Ｐ２の１：２５０希釈物で感染させ、５５時間培養した。レーン５：細胞をＰ２の１：１００希釈物で感染させ、４８時間培養した。レーン６：細胞をＰ２の１：１００希釈物で感染させ、５５時間培養した。）。タンパク質マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒＴＭ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ カタログ番号ＳＭ０６７１）（レーン４）。組み換えβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０を発現するＳｆ９細胞の膜（レーン７：細胞をＰ２の１：１００希釈物で感染させ、５５時間培養した。）。組み換えβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１を発現するＳｆ９細胞の膜（レーン８：細胞をＰ２の１：１００希釈物で感染させ、５５時間培養した。）。組み換えβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９を発現するＳｆ９細胞の膜（レーン９：細胞をＰ２の１：１００希釈物で感染させ、５５時間培養した。）。

【図4】β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９モック融合物と比較した、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物のリガンド結合特性。β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０への結合について［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［^３Ｈ］−ＤＨＡ）と競争する異なるリガンドの放射性リガンド置き換えアッセイ（白色の丸）、および実施例６に記載するような拘束されていないβ２アドレナリン作動性受容体のための内部標準として、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラを用いたアッセイ（黒色の丸）。天然アゴニストエピネフリン（Ａ）、アゴニスト（−）−イソプロテレノール（Ｂ）、ニュートラルアンタゴニストアルプレノロール（Ｃ）、パーシャルアゴニストサルブタモール（Ｄ）、インバースアゴニストＩＣＩ−１１８，５５１（Ｅ）およびアンタゴニストであるカルベジロール（Ｆ）を競争リガンドとしてそれぞれ用い、両受容体で、競争アッセイを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０の標準的な設定を用い、曲線を非線形回帰によって競争結合のモデルにフィッティングした。ＩＣ５０と付された値を、１結合部位競争モデルにフィッティングした。ＩＣ５０^ｈｉｇｈと付された値を、２結合部位競争結合モデルにフィッティングし、これは、最も高いアフィニティ部位のＩＣ５０に対応する。

【図5】融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎと比較した、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物のリガンド結合特性。実施例６に記載するように、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０に対する結合について（白色の四角）、また、拘束されていないβ２アドレナリン作動性受容体のための内部標準として融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎ受容体を用いた（黒色の四角）、［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［^３Ｈ］−ＤＨＡ）と競争する異なるリガンドの放射性リガンド置き換えアッセイ。天然アゴニストであるエピネフリン（Ａ）およびアンタゴニストであるカルベジロール（Ｂ）をそれぞれ競争リガンドとして用い、両方の受容体について競争アッセイを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０の標準的な設定を用い、曲線を非線形回帰によって競争結合のモデルにフィッティングした。ＩＣ５０と付された値を、１結合部位競争モデルにフィッティングした。ＩＣ５０^ｈｉｇｈと付された値を、２結合部位競争結合モデルにフィッティングし、これは、最も高いアフィニティ部位のＩＣ５０に対応する。

【図6】β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合物と比較した、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１融合物のリガンド結合特性。実施例６に記載するように、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１に対する結合について（白色の三角）、また、拘束されていないβ２アドレナリン作動性受容体のための内部標準としてβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラを用いた（黒色の四角）、［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［^３Ｈ］−ＤＨＡ）と競争する異なるリガンドの放射性リガンド置き換えアッセイ。天然アゴニストであるエピネフリン（Ａ）、全アゴニストであるイソプロテレノール（Ｂ）、ニュートラルアンタゴニストであるアルプレノロール（Ｃ）、パーシャルアゴニストであるサルブタモール（Ｄ）、インバースアゴニストであるＩＣＩ−１１８，５５１（Ｅ）、およびアンタゴニストであるカルベジロール（Ｆ）をそれぞれ競争リガンドとして用い、両方の受容体について競争アッセイを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０の標準的な設定を用い、曲線を非線形回帰によって競争結合のモデルにフィッティングした。ＩＣ５０と付された値を、１結合部位競争モデルにフィッティングした。ＩＣ５０^ｈｉｇｈと付された値を、２結合部位競争結合モデルにフィッティングし、これは、最も高いアフィニティ部位のＩＣ５０に対応する。

【図7】β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合物を比較した、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物の熱安定性。リガンドを含まないＤＤＭで可溶化された融合タンパク質β２ＡＲ３６５−Ｎｂ８０の熱安定性（白色のひし形）およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９の熱安定性（黒色のひし形）。リガンドが存在しない状態で、実施例７に記載するように０．０８％ＤＤＭで可溶化された受容体について熱安定性アッセイを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ）を用い、ｌｏｇ（アゴニスト） 対 プリズムを用いた応答−可変傾き（４つのパラメータ）の式を用い、非線形回帰によって曲線をフィッティングした。

【図8】外から加えられたＮｂ８０との複合体における融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎと比較した、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物のリガンド結合特性。異なる濃度のＮｂ８０存在下（５００ｎＭ Ｎｂ８０：黒色の三角、５０ｎＭ Ｎｂ８０：黒色のひし形、５ｎＭ Ｎｂ８０：黒色の逆三角および５０ｐＭ Ｎｂ８０：黒色の四角；点線）または異なる濃度のＮｂ６９存在下（５００ｎＭ Ｎｂ６９：白色の三角、５０ｐＭ Ｎｂ６９ 白色の四角；点線）、融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎ受容体について、［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［^３Ｈ］−ＤＨＡ）と競争するエピネフリンの放射性リガンド置き換えアッセイ。β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物（黒色の丸、実線）およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合物（白色の円、実線）を、実施例８に記載するようにこのアッセイの内部標準として使用した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０の標準的な設定を用い、曲線を非線形回帰によって競争結合のモデルにフィッティングした。ＩＣ５０と付された値を、１結合部位競争モデルにフィッティングした。ＩＣ５０^ｈｉｇｈと付された値を、２結合部位競争結合モデルにフィッティングし、これは、最も高いアフィニティ部位のＩＣ５０に対応する。

【図9】実施例９に記載するＭ２Ｒ−ナノボディ融合物は、ペプチドリンカーと接続した２種類の異なるタンパク質を含む（ＧＰＣＲ Ｍ２Δｉ３Ｒ、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（下線が引かれ、太字で強調されている。）（配列番号４９）およびナノボディ）。下線が引かれているのは、ＨＡシグナルペプチドおよびＨｉｓ_６ペプチドタグである。ＦＬＡＧ−タグは、太字で表され、ＴＥＶ開裂部位は、灰色の陰影で示される。Ａ．Ｍ２Ｒ−ナノボディ融合構築物のイラスト図。Ｂ．ｐＦａｓｔＢａｃ１ Ｍ２Δｉ３Ｒによってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列。Ｃ．ｐＦａｓｔＢａｃ１ Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１によってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列。

【図10】遊離の融合していないＭ２Δｉ３Ｒと比較した、Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１のリガンド結合特性。実施例１２に記載するように、Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１に対する結合について（黒色の丸）、また、拘束されていないムスカリン性受容体Ｍ２のための内部標準としてＭ２Δｉ３Ｒを用いた（×印の入った白色の丸）、［^３Ｈ］−Ｎ メチルスコポラミン（［^３Ｈ］−ＮＭＳ）と競争する異なるリガンドの放射性リガンド置き換えアッセイ。競争アッセイは、アゴニストカルバコール（Ａ）またはアゴニストオキソトレモリンＭ（Ｂ）をそれぞれ競争リガンドとして用い、両方の受容体について行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０の標準的な設定を用い、曲線を非線形回帰によって競争結合のモデルにフィッティングした。ＩＣ５０と付された値を、１結合部位競争モデルにフィッティングした。ＩＣ５０^ｈｉｇｈと付された値を、２結合部位競争結合モデルにフィッティングし、これは、最も高いアフィニティ部位のＩＣ５０に対応する。

【図11】実施例１３に記載されるβ１ＡＲ−ナノボディ融合物は、ペプチドリンカーと接続した２種類の異なるタンパク質を含む（ＧＰＣＲヒトβ１ＡＲ、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号６０）（下線が引かれ、太字で強調されている。）およびナノボディ）。下線が引かれているのは、ＨＡシグナルペプチドおよびＨｉｓ_６ペプチドタグである。ＦＬＡＧ−タグは、太字で表され、ＴＥＶ開裂部位は、灰色の陰影で示される。Ａ．β１ＡＲ−ナノボディ融合構築物のイラスト図。Ｂ．ｐＦａｓｔＢａｃ ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０によってコードされるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列。Ｃ．ｐＦａｓｔＢａｃ ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９によってコードされるオープンリーディングのアミノ酸配列。

【図12】ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９融合物と比較した、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０融合物のリガンド結合特性。実施例１６に記載するように、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０に対する結合について（白色の丸）、また、拘束されていないβ１アドレナリン作動性受容体のための内部標準としてｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９キメラを用いた（黒色の丸）、［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［^３Ｈ］−ＤＨＡ）と競争する異なるリガンドの放射性リガンド置き換えアッセイ。天然アゴニストであるエピネフリン（Ａ）、インバースアゴニストであるＩＣＩ−１１８，５５１（Ｂ）およびニュートラルアンタゴニストであるアルプレノロール（Ｃ）をそれぞれ競争リガンドとして用い、両方のβ１−受容体融合物について、競争アッセイを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０の標準的な設定を用い、曲線を非線形回帰によって競争結合のモデルにフィッティングした。ＩＣ５０と付された値を、１結合部位競争モデルにフィッティングした。ＩＣ５０^ｈｉｇｈと付された値を、２結合部位競争結合モデルにフィッティングし、これは、最も高いアフィニティ部位のＩＣ５０に対応する。

【図13】β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９モック融合物と比較した、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０融合物のリガンド結合アッセイ。実施例１９に記載するように、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０に対する結合について（白色の丸）、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０に対する結合について（×印の入った白色の丸）、また、拘束されていないβ２アドレナリン作動性受容体のための内部標準としてβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラを用いた（黒色の丸）、［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［^３Ｈ］−ＤＨＡ）と競争する異なるリガンドの放射性リガンド置き換えアッセイ。天然アゴニストであるエピネフリン（Ａ）、アゴニスト（−）−イソプロテレノール（Ｂ）およびインバースアゴニストであるＩＣＩ−１１８，５５１（Ｃ）をそれぞれ競争リガンドとして用い、β２−受容体融合物について、競争アッセイを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０の標準的な設定を用い、曲線を非線形回帰によって競争結合のモデルにフィッティングした。ＩＣ５０と付された値を、１結合部位競争モデルにフィッティングした。ＩＣ５０^ｈｉｇｈと付された値を、２結合部位競争結合モデルにフィッティングし、これは、最も高いアフィニティ部位のＩＣ５０に対応する。

【図14】全長野生型Ｍｏｒ１（ＵｎｉｐｒｏｔコードＰ３５３７２；配列番号４６）およびマウスＭｏｒ１（ＵｎｉｐｒｏｔコードＰ４２８６６；配列番号４５）のＡＡ配列アラインメント。ｓｆ９細胞中で発現するマウスＭｏｒ１の精製のために、Ｎ末端ＴＥＶ（Ｎ末端；マウスＭｏｒ１の昆虫細胞発現）プロテアーゼ開裂部位を、２つの下線が引かれたグリシンの間に導入した。Ｃ末端の３Ｃプロテアーゼ開裂部位も、Ｓｆ９中で発現したマウスおよびヒトのＭｏｒ１において、下線が引かれたイソロイシンと下線が引かれたグルタミン酸との間に導入した。Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに従って、理論的な細胞内ループ（ＩＣＬ）および細胞内Ｃ末端を灰色の陰影で示す。Ｍｏｒ−ナノボディ融合構築物中で欠失したＡＡ残基は、取り消し線が引かれている。

【図15】実施例２０に記載するＭｏｒ１−ナノボディ融合物は、ペプチドリンカーと接続した２種類の異なるタンパク質を含む（ＧＰＣＲ Ｍｏｒ１、３４ ＧＳリンカー（下線が引かれ、太字で強調されている。）およびナノボディ）。下線が引かれているのは、ＨＡシグナルペプチドおよびＨｉｓ_６ペプチドタグである。ＦＬＡＧ−タグは、太字で表され、３Ｃ開裂部位は、灰色の陰影で示される。Ａ．Ｍｏｒ１−ナノボディ融合構築物のイラスト図。ＢからＥ．４つのＭｏｒ−Ｎｂオープンリーディングフレームのアミノ酸配列。

【図16】ｈＭｏｒ１−Ｎｂ１０モック融合物と比較した、ｈＭｏｒ１−Ｎｂ３３融合物のリガンド結合特性。ｈＭｏｒ１−Ｎｂ３３に対する結合について（丸）、拘束されていない受容体のための内部標準としてｈＭｏｒ１−Ｎｂ１０キメラ（四角）を用いた、放射性リガンドと競争する放射性リガンド置き換えアッセイ。両方の受容体について、アゴニストＤｍｔ１−Ｄａｌｄａ（Ａ）、ＫＧＯＰ０１（Ｂ）およびアンタゴニストであるナロキソン（Ｃ）を競争リガンドとして用い、競争アッセイを行った。

【図17】β２ＡＲ−融合物に対する異なる活性プロフィールを有する比較フラグメントの結合。［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［^３Ｈ］−ＤＨＡ）を放射性リガンドとして用いる放射性リガンド置き換えアッセイによって測定された、活性状態で安定化されたβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物（白色の棒） 対 主要な拘束されていない立体構造β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合物（黒色の棒）に対する、６フラグメントの結合の代表例。２フラグメント（ＡＣ２３５０６、ＣＣ５６２１３）は、アゴニストプロフィールを示し、２フラグメント（ＣＣ４６７４６、ＣＣ４４９１４）は、アンタゴニストプロフィールを示し、２フラグメント（ＫＭ０８９８５）は、インバースアゴニストプロフィールを示す。

【図18】β２ＡＲ−Ｎｂ６９融合物と比較した、β２ＡＲ−Ｎｂ８０融合物に対する６フラグメントの用量応答曲線。実施例２４に記載するように、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０に対する結合について（白色の丸）、また、拘束されていないβ２アドレナリン作動性受容体のための内部標準としてβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラを用いた（黒色の丸）、［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［^３Ｈ］−ＤＨＡ）と競争する６種類の異なるフラグメントの放射性リガンド置き換えアッセイ。アゴニストプロフィールを有する２フラグメント（Ａ）、アンタゴニストプロフィールを有する２フラグメント（Ｂ）およびインバースアゴニストプロフィールを有する２フラグメント（Ｃ）をそれぞれ競争リガンドとして用い、β２−受容体融合物について、競争アッセイを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０．（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ）を用いたプリズムを用い、ｌｏｇ（アゴニスト） 対 応答−可変傾き（４つのパラメータ）式を用いた非線形回帰によって、曲線をフィッティングした。

【図19】β２ＡＲ−Ｎｂ６９モック融合物と比較した、β２ＡＲ−Ｎｂ８０融合物に対する精巧なフラグメントの結合特性。β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０に対する結合について（黒色の記号）、また、拘束されていないβ２アドレナリン作動性受容体のための内部標準としてβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラを用いた（白色の記号）、［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［^３Ｈ］−ＤＨＡ）と競走する異なる精巧に作られたフラグメントと元々の親フラグメントの放射性リガンド置き換えアッセイ。（Ａ）ＣＣ４０２４６（実線）、精巧なフラグメント：化合物２（破線）および化合物３（点線）をそれぞれ競争リガンドとして、（Ｂ）ＣＣ５６２１３（実線）、精巧なフラグメント：化合物９（破線）および化合物１０（点線）を競争リガンドとしてそれぞれ用い、β２−受容体融合物について、競争アッセイを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０の標準的な設定を用い、曲線を非線形回帰によって競争結合のモデルにフィッティングした。ＩＣ５０と付された値を、１結合部位競争モデルにフィッティングした。

【発明を実施するための形態】

【0036】

定義
具体的な実施形態の観点で、特定の図を参照しつつ本発明を記載するが、本発明は、これらに限定されず、特許請求の範囲によって限定される。特許請求の範囲の任意の引用符号は、この範囲を限定するものと解釈すべきではない。記載される図面は、単に模式図であり、非限定的である。図面において、幾つかの要素の大きさは、強調されている場合があり、説明の目的のために、縮尺通りに描かれてはいない。「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」をいう用語が本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、他の要素または工程を除外するものではない。不定冠詞または定冠詞を使用する場合に、単数形の名詞（例えば、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」、「前記（ｔｈｅ）」）に言及するとき、他の内容が具体的に述べられていない限り、この名詞の複数形も含む。さらに、本明細書および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、同様の要素を区別するために用いられ、必ずしも連続した順序または番号順の順序を記載するためのものではない。このように使用される用語は、適切な状況下で互いに置き換え可能であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載または説明されている以外の他の順序で操作することができることが理解されるべきである。

【0037】

本明細書で他の意味であると定義されていない限り、本発明と組み合わせて用いられる科学的および技術的な用語および句は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。一般的に、本明細書に記載される分子生物学および細胞生物学、構造生物学、生物物理学、薬学、遺伝子学およびタンパク質および核酸の化学の技術と組み合わせて用いられる専門用語は、当該技術分野でよく知られており、一般的に知られている用語である。本発明の方法および技術は、一般的に、特に指示のない限り、当該技術分野でよく知られている従来の方法に従って行われ、本明細書全体で引用され、記述される種々の一般的な参考文献およびもっと具体的な参考文献に記載されるように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２年、２００２年に補遺）；Ｒｕｐ、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ、ＬＬＣ、ａｎ ｉｎｆｏｒｍａ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ｌｉｍｂｉｒｄ、Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００４）を参照。

【0038】

「キメラポリペプチド」、「キメラタンパク質」、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」という用語は、本明細書で相互に置き換え可能に用いられ、同じタンパク質に由来していてもよく、由来していなくてもよい、少なくとも２つの離された別個のポリペプチド成分を含むタンパク質を指す。ポリペプチド成分は、典型的には、この天然の状態では結合しておらず、ペプチド結合を介し、それぞれのアミノ末端およびカルボキシル末端によって接続しており、単一の連続したポリペプチドを生成する。例えば、抗体に融合する目的のタンパク質は、キメラタンパク質の一例である。２つのポリペプチドを接続または融合するための簡便な手段は、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に接続した、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む組み換え核酸分子から融合タンパク質としてこれらのポリペプチドを発現することによる。その他、融合タンパク質に含まれるポリペプチドは、インテインが媒介するタンパク質スプライシング（ＭｕｒａｌｉｄｈａｒａｎおよびＭｕｉｒ ２００６）またはソルターゼ介在ペプチド転移（Ｐｏｐｐら、２００７）から生じるペプチド結合を介して接続することができるか、または任意の他の手段によって化学的に接続してもよい。典型的には、キメラポリペプチドは、非組み換えゲノム中の遺伝子によってコードされるタンパク質中に連続的なポリペプチドとして存在しないであろう。「キメラポリペプチド」という用語および文法的に等価な用語は、人工であることを意味する、天然には生じない分子を指す。「に融合する」および他の文法的に等価な用語は、キメラポリペプチド（本明細書に定義するような）に言及する場合、２つ以上のポリペプチド成分を接続するための化学機構または組み換え機構を指す。２つ以上のポリペプチド成分の融合は、配列の直接的な融合であってもよく、または、例えば、介在するアミノ酸配列またはリンカー配列を用いた間接的な融合であってもよい。例は、本明細書にさらに与えられるであろう。

【0039】

「膜タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞または細胞小器官の膜に接続するか、またはこれらと会合するタンパク質を指す。これらは、内在性膜タンパク質、周辺膜タンパク質および脂質修飾タンパク質を含む幾つかのカテゴリーに分けられることが多い。好ましくは、膜タンパク質は、脂質二重層に永久的に結合し、除去するのに洗剤または他の非極性溶媒を必要とする内在性膜タンパク質である。内在性膜タンパク質は、脂質膜に永久的に結合し、膜を１回または数回通過して広がる膜貫通タンパク質を含む。適切な膜タンパク質の例としては、特に、ＧＰＣＲのような受容体が挙げられる。

【0040】

本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」という用語は、本明細書で相互に置き換え可能に用いられ、任意の長さを有するアミノ酸のポリマー形態を指し、コードされたアミノ酸またはコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含んでいてもよい。本出願全体で、アミノ酸の標準的な１文字表記が使用されるであろう。典型的には、「アミノ酸」という用語は、「タンパク質を構成するアミノ酸」、即ち、タンパク質中に天然に存在するアミノ酸を指すであろう。最も特定的に、アミノ酸は、Ｌ異性体形態であるが、Ｄアミノ酸も想定される。

【0041】

本明細書で使用する場合、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸」という用語は、相互に置き換え可能に用いられ、任意の長さを有するヌクレオチドのポリマー形態を指し、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはこれらの類似体である。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有していてもよく、任意の既知または未知の機能を発揮してもよい。ポリヌクレオチドの非限定例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列を有する単離されたＤＮＡ、制御領域、任意の配列を有する単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。核酸分子は、線状または環状であってもよい。

【0042】

本明細書に開示される任意のペプチド、ポリペプチド、核酸などは、「単離され」、または「精製され」てもよい。「単離された」は、言及される材料が、（ｉ）天然に存在する１つ以上の物質から分離され（例えば、少なくとも幾つかの細胞材料から分離され、他のポリペプチドから分離され、この天然配列の背景から分離され）、および／または（ｉｉ）人の手が関与する工程、例えば、組み換えＤＮＡ技術、化学合成などによって製造され；および／または（ｉｉｉ）天然には見出されない配列、構造または化学組成を有することを示すために本明細書で用いられる。「精製された」は、本明細書で使用する場合、示されている核酸またはポリペプチドが、他の生物学的高分子、例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質などが実質的に存在しない状態で存在することを示す。一実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの少なくとも９０重量％、例えば、少なくとも９５重量％、例えば、少なくとも９９重量％を構成するように精製される（しかし、水、バッファー、イオンおよび他の低分子、特に、分子量が１０００ダルトン未満の分子は存在してもよい。）。

【0043】

「配列同一性」という用語は、本明細書で使用する場合、配列が、比較範囲にわたって、ヌクレオチドごとを基準として、またはアミノ酸ごとを基準として同一である程度を指す。従って、「配列同一性の割合」は、比較範囲にわたって２つの最適に並べられた配列を比較し、同一の核酸対（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列で発生する位置の数を決定し、マッチした位置の数を得て、このマッチした位置の数を、この比較範囲での位置の合計数（即ち、この範囲の大きさ）で割り算し、この結果に１００を掛け算することによって計算され、配列同一性の割合を得る。配列同一性の割合の決定は、手動で行ってもよく、または、当該技術分野で利用可能なコンピュータプログラムを利用することによって行ってもよい。有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰ（Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１（１９８９）、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）である。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによって公に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。

【0044】

「類似性」は、同一であるか、または保存的置換を構成するアミノ酸の数の割合を指す。類似性は、配列比較プログラム、例えば、ＧＡＰを用いて決定されてもよい（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４）。この様式で、本明細書に引用される配列と類似の配列、または実質的に異なる長さを有する配列は、このアラインメントに、ギャップ（例えば、ＧＡＰによって用いられる比較アルゴリズムによって決定されるギャップ）を挿入することによって比較されてもよい。本明細書で使用する場合、「保存的置換」は、側鎖が類似の生化学特性を有する（例えば、脂肪族である、芳香族である、正に帯電している、などの）他のアミノ酸を用いたアミノ酸の置換であり、当業者にはよく知られている。次いで、非保存的置換は、側鎖が類似の生化学特性を有しない他のアミノ酸を用いたアミノ酸の置換である（例えば、極性残基を用いた疎水基の置き換え）。保存的置換は、典型的には、もはや同一ではないが、非常に類似している配列を与える。保存的置換とは、意図した組み合わせ、例えば、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；ｃｙｓ、ｍｅｔ；およびｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐである。

【0045】

「欠失」は、元々のポリペプチドまたは核酸のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、それぞれ１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基が存在しない、アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれかの変化であると本明細書で定義される。タンパク質という文脈で、欠失は、約２、約５、約１０、約２０まで、約３０まで、または約５０まで、またはこれより多いアミノ酸の欠失を含んでいてもよい。タンパク質またはこのフラグメントは、１つより多い欠失を含んでいてもよい。ＧＰＣＲという文脈で、欠失は、ループ状の欠失、またはＮ末端および／またはＣ末端の欠失、またはこれらの組み合わせであってもよい。当業者には明らかであろうが、ＧＰＣＲのＮ末端および／またはＣ末端の欠失は、ＧＰＣＲのアミノ酸配列のトランケーション、またはトランケーションされたＧＰＣＲとも呼ばれる。

【0046】

「挿入」または「付加」は、元々のタンパク質のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較した場合、それぞれ１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基の付加を生じる、アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。「挿入」は、一般的に、ポリペプチドのアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基への付加を指し、一方、「付加」は、挿入であってもよく、または、Ｎ末端またはＣ末端、または両末端に付加されたアミノ酸残基を指す。タンパク質またはこのフラグメントという文脈で、挿入または付加は、通常は、約１、約３、約５、約１０、約２０まで、約３０まで、または約５０まで、またはもっと多くのアミノ酸の挿入または付加である。タンパク質またはこのフラグメントは、１つより多い挿入を含んでいてもよい。

【0047】

「置換」は、本明細書で使用する場合、元々のタンパク質またはこのフラグメントのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを、それぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドによって置き換えることから生じる。タンパク質またはこのフラグメントは、このタンパク質の活性に実質的に影響を与えない保存的アミノ酸置換を有していてもよいことが理解される。保存的置換とは、意図した組み合わせ、例えば、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；ｃｙｓ、ｍｅｔ；およびｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐである。

【0048】

「組み換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターを参照して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入、または天然の核酸またはタンパク質の変更によって改変されているか、または、このようにして改変された細胞から、細胞が誘導されることを示す。従って、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然の（組み換えされていない）形態内に見出されない核酸またはポリペプチドを発現するか、天然の遺伝子を発現するが、その他の異常な発現をするか、少ない量を発現するか、過剰に発現するか、または全く発現しない。

【0049】

本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生される工程を指す。この工程は、転写および翻訳を含む。

【0050】

「作動可能に接続した」という用語は、本明細書で使用する場合、調節配列が目的の遺伝子と連続し、目的の遺伝子を制御する結合、および目的の遺伝子を制御するためにトランスに、またはある距離で作用する調節配列を指す。例えば、ＤＮＡ配列は、プロモーターの転写開始部位に対して下流でプロモーターに連結する場合、プロモーターに作動可能に接続し、ＤＮＡ配列によって転写伸長を進めることができる。シグナル配列のためのＤＮＡは、ポリペプチドの輸送に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に接続する。調節配列に対するＤＮＡ配列の結合は、典型的には、適切な制限部位で、または、当業者に既知の制限エンドヌクレアーゼを用いて代わりに挿入されたアダプターまたはリンカーに連結することによって達成される。

【0051】

「調節配列」という用語は、本明細書で使用する場合、「制御配列」とも呼ばれ、作動可能に接続したコード配列の発現を行うのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。調節配列は、核酸配列の転写、後転写事象および翻訳を制御する配列である。調節配列は、適切な転写開始、停止、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＭＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質の安定性を高める配列；および所望な場合、タンパク質の分泌を高める配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主有機体に依存して異なる。「調節配列」という用語は、最低限、この存在が発現に必須であるすべての要素を含むことを意図しており、この存在が有利であるさらなる要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含んでいてもよい。

【0052】

「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、接続した別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を指すことを意図している。ベクターは、限定されないが、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクミドを含む任意の適切な型を有していてもよく、または人工染色体であってもよい。特定のベクターは、ベクターが中に導入される宿主細胞中で、自律複製をすることができる（例えば、宿主細胞中で機能する複製源を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞に導入すると、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、これによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定の好ましいベクターは、目的となる特定の遺伝子の発現を命令することができる。このようなベクターは、本明細書で「組み換え発現ベクター」（または、単純に、「発現ベクター」）と呼ばれる。適切なベクターは、所望な場合、特定の宿主有機体（例えば、細菌細胞、酵母細胞）に従って、調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列などを含む。典型的には、本発明の組み換えベクターは、少なくとも１つの「キメラ遺伝子」または「発現カセット」を含む。発現カセットは、一般的に、好ましくは、（転写の方向で５’から３’に）プロモーター領域、ポリヌクレオチド配列、同族体、改変体または転写開始領域に作動可能に接続した本発明のフラグメントおよびＲＮＡポリメラーゼおよびポリアデニル化シグナルのための停止シグナルを含む転写終結配列のＤＮＡ構築物である。これらすべての領域が、形質転換される生体細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）で働くことができるべきであることが理解される。転写開始領域を含むプロモーター領域は、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含み、ポリアデニル化シグナルは、形質転換される生体細胞に元々備わっていてもよく、代替源に由来してもよく、この領域は、生体細胞において機能性である。

【0053】

「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、組み換えベクターが導入された細胞を指すことを意図している。このような用語が、特定の被検細胞のみを指すのではなく、このような細胞の後代も指すことを意図していると理解すべきである。突然変異または環境の影響のいずれかに起因して、次の世代で特定の改変が起こり得るため、このような後代は、実際には、元々の細胞と同一でない場合もあるが、本明細書で使用する場合、これも「宿主細胞」の用語の範囲内に含まれる。宿主細胞は、単離された細胞または培地で成長した細胞株であってもよく、または生きている組織または有機体中に存在する細胞であってもよい。特に、宿主細胞は、細菌由来または真菌由来であるが、植物由来または哺乳動物由来であってもよい。「宿主細胞」、「組み換え宿主細胞」、「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」という言葉は、同じ意味を有することを意図しており、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。

【0054】

「エピトープ」は、本明細書で使用する場合、ポリペプチドの抗原性の決定因子を指す。エピトープは、立体構造に３個のアミノ酸を含んでいてもよく、エピトープに固有である。一般的に、エピトープは、少なくとも４個、５個、６個、７個のこのようなアミノ酸からなり、もっと一般的には、少なくとも８個、９個、１０個のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の立体構造を決定する方法は、当該技術分野で知られており、例えば、ｘ線結晶学および多次元核磁気共鳴を含む。

【0055】

「立体的エピトープ」は、本明細書で使用する場合、ポリペプチドの折り畳まれた三次元構造に固有の立体構造でアミノ酸を含むエピトープを指す。一般的に、立体的エピトープは、線形の配列中で非連続的であるが、タンパク質の折り畳まれた構造では一緒になるアミノ酸からなる。しかし、立体的エピトープは、ポリペプチドの折り畳まれた三次元構造に固有の（変性される部位には存在しない）立体構造を採用するアミノ酸の線形配列からなっていてもよい。タンパク質複合体において、立体的エピトープは、異なる折り畳まれたポリペプチドの折り畳みおよび固有の四次構造における会合が起こると一緒になる１つ以上のポリペプチドの線形の配列で非連続的であるアミノ酸からなる。同様に、立体的エピトープは、ここでは、一緒になり、四次構造に固有の立体構造を採用する１つ以上のポリペプチドのアミノ酸の線形の配列からなっていてもよい。

【0056】

タンパク質の「立体構造」または「立体構造状態」は、一般的に、ある時間点でタンパク質が採用し得る構造の範囲を指す。当業者は、立体構造または立体構造状態の決定因子が、タンパク質のアミノ酸配列（改変されたアミノ酸を含む）に反映されるようなタンパク質の一次構造およびアミノ酸周囲の環境を含むことを認識するであろう。タンパク質の立体構造または立体構造状態は、構造的特徴、例えば、タンパク質の二次構造（例えば、特に、αらせん、βシート）、三次構造（例えば、ポリペプチド鎖の三次元折り畳み）および四次構造（例えば、ポリペプチド鎖と他のタンパク質サブユニットとの相互作用）にも関連する。ポリペプチド鎖に対する後翻訳および他の改変、例えば、特に、リガンドの結合、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、または疎水性基の接続は、タンパク質の立体構造に影響を与えることがある。さらに、環境的な因子、例えば、特に、ｐＨ、塩濃度、塩強度および周囲の溶液のモル浸透圧濃度および他のタンパク質および補因子との相互作用は、タンパク質の立体構造に影響を与えることがある。タンパク質の立体構造状態は、活性または別の分子に対する結合のための機能アッセイによって、または物理的な方法、特に、例えば、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、またはスピン標識によって決定されてもよい。タンパク質の立体構造および立体構造状態の包括的な議論のために、ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ、１９９３を参照する。

【0057】

「機能的な立体構造」または「機能的な立体構造状態」は、タンパク質（特に、ＧＰＣＲ）が、動的な範囲の活性を有する（特に、活性なしから最大活性までの範囲の）異なる立体構造状態を有するという事実を指す。「機能的な立体構造状態」は、本明細書で使用する場合、活性なしを含む任意の活性を有するタンパク質（特に、ＧＰＣＲ）の任意の立体構造状態を包含することを意味し、変性した状態のタンパク質を包含することを意味しないことを明確にすべきである。ＧＰＣＲの機能的な立体構造の非限定例としては、活性な立体構造、不活性な立体構造または基本立体構造が挙げられる。特定の種類の機能的な立体構造は、「薬となり得る立体構造」であると定義され、一般的に、標的タンパク質の固有の治療に関連する立体構造状態を指す。１つの説明として、β２アドレナリン作動性受容体のアゴニストが結合した活性な立体構造は、平滑筋の弛緩、気管支の拡張（喘息）、筋肉および肝臓の血管拡張、子宮筋の弛緩およびインスリンの放出に関連する、この受容体の薬となり得る立体構造に対応する。従って、薬となり得る可能性は、治療適用に依存して特定の立体構造に限られることが理解されるであろう。さらなる詳細を本明細書でさらに提示する。

【0058】

「安定化する」または「安定化された」という用語は、ＧＰＣＲの機能的な立体構造状態に関し、本明細書で使用する場合、ＧＰＣＲ部分と、本発明のキメラポリペプチドの結合ドメイン部分との分子内相互作用の影響に起因して、ＧＰＣＲが、その他の方法で推測され得るような可能な立体構造の部分集合に維持または保持されることを指す。この文脈で、ＧＰＣＲの特定の立体構造に特異的または選択的に結合する結合ドメインは、ＧＰＣＲで推測し得る他の立体構造よりも、ある立体構造の部分集合のＧＰＣＲに対して高いアフィニティで結合する結合ドメインを指す。当業者は、ＧＰＣＲの特定の立体構造に特異的または選択的に結合する結合ドメインが、特定の立体構造およびこの関連する活性を安定化させ得ることを認識するであろう。さらなる詳細を本明細書でさらに提示する。

【0059】

「アフィニティ」という用語は、本明細書で使用する場合、一般的に、リガンド（本明細書でさらに定義されるような）が、標的タンパク質とリガンドの平衡状態を、この結合によって生成する複合体が存在する方向に変化させるように標的タンパク質に結合する程度を指す。従って、例えば、キメラポリペプチドとリガンドを相対的に等しい濃度で合わせると、高アフィニティのリガンドは、得られる複合体の濃度が高くなる方向に平衡を変化させるように、キメラポリペプチドに結合するであろう。解離定数Ｋｄは、一般的に、リガンドと標的タンパク質とのアフィニティを記述するために用いられる。典型的には、解離定数は、１０^−５Ｍより小さい値である。好ましくは、解離定数は、１０^−６Ｍより小さく、さらに好ましくは、１０^−７Ｍより小さい。最も好ましくは、解離定数は、１０^−８Ｍより小さい。リガンドとこの標的タンパク質とのアフィニティを記述する他の様式は、会合定数（Ｋａ）、阻害定数（Ｋｉ）であるか、または、半数阻害濃度（ＩＣ５０）または半数効果濃度（ＥＣ５０）を測定することによってリガンドの効力を評価することによって間接的に記述される。本発明の範囲内で、「アフィニティ」という用語は、標的ＧＰＣＲの立体的エピトープに結合する結合ドメインの文脈で、本発明のキメラポリペプチドに、さらに特定的には、キメラポリペプチドに含まれる標的ＧＰＣＲのオルソステリック部位またはアロステリック部位に結合する試験化合物（本明細書でさらに定義されるような）の文脈で使用されることが理解されるであろう。

【0060】

分子内相互作用、例えば、本発明のキメラポリペプチドのＧＰＣＲ部分に対する結合ドメイン部分の特定の相互作用において、この２つの相互作用する基が、１つの分子内に含まれることを注記すべきである。結合ドメインとこの標的との解離定数は、これらが個々の分子である場合は知られているが、分子内相互作用の場合には、溶液内のそれぞれの濃度は無関係である。この代わりに、分子内相互作用に重要なのは、この高分子内の２つの基の「有効濃度」である。「有効分子内濃度」または「有効モル濃度」（Ｍ_ｅｆｆ）という用語は、本明細書で使用する場合、有効な濃度を指し、Ｋ_ｄ^{ｉｎｔｅｒ}／Ｋ_ｄ^{ｉｎｔｒａ}として計算することができ、ここで、解離定数Ｋ_ｄ^{ｉｎｔｒａ}は、無単位であり、標的ＧＰＣＲと結合ドメインの融合物である分子内反応を記述するために用いられる解離定数であり、Ｋ_ｄ^{ｉｎｔｅｒ}は、濃度（例えば、モル濃度）の単位を有し、結合ドメインと標的ＧＰＣＲの共有結合によらない複合体である類似する分子間相互作用の解離定数である。有効モル濃度は、この高分子の構造、特に、２つの反応剤が一緒になるか、または空間的に離れた位置に維持される程度と、２つの基が維持される環境に依存するであろう。この分子内反応の有効モル濃度は、この高分子の構造が、２つの基を離れた位置に保持する場合、つまり、結合ドメインが、標的ＧＰＣＲに指向しないか、および／または標的ＧＰＣＲに特異的に結合（本明細書でさらに定義されるような）することができない場合には、本質的にゼロであろう。他の極端な例で、この高分子の構造が、２つの基を反応のために正しい近接度および配置に維持する場合、これらの有効モル濃度は、１０^１０Ｍまでの極端に高い値になる場合があり、この濃度は、２つの独立した分子では実現することはできない。本発明によれば、この場合は、結合ドメインが標的ＧＰＣＲに特異的に結合（本明細書でさらに定義されるような）することができる場合である。このような値は、これらの基が同じ分子上にある場合および別個の分子上にある場合に、同じ反応についての速度の比率または平衡定数から、理論的な考察によって予想され、実験的にも観察される。

【0061】

「特異性」という用語は、本明細書で使用する場合、結合ドメイン、特に、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメント、例えば、ＶＨＨまたはナノボディが、異なる抗原と比較して、ある抗原に優先的に結合する能力を指し、必ずしも高いアフィニティを伴わない。

【0062】

「特異的に結合する」および「特異的な結合」という用語は、本明細書で使用する場合、一般的に、結合ドメイン、特に、免疫グロブリン、例えば、抗体、または免疫グロブリンフラグメント、例えば、ＶＨＨまたはナノボディが、異なる抗原の均一な混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合する能力を指す。特定の実施形態において、特異的な結合相互作用は、ある実施形態において、約１０倍より多く、１００倍まで、またはこれより大きく（例えば、約１０００倍より大きく、または１０，０００倍より大きく）、サンプル中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを区別するであろう。ＧＰＣＲの立体構造状態の範囲の文脈で、この用語は、特に、結合ドメイン（本明細書に定義されるような）が、別の立体構造状態と比較して、ＧＰＣＲの特定の立体構造状態を優先的に認識するか、および／またはＧＰＣＲの特定の立体構造状態に優先的に結合する能力を指す。従って、本明細書で使用する場合、「立体構造選択的な結合ドメイン」という用語は、本発明の文脈で、立体構造選択的な様式で標的ＧＰＣＲに結合する結合ドメインを指す。ＧＰＣＲの特定の立体構造に選択的に結合する結合ドメインは、ＧＰＣＲに推定され得る他の立体構造に対するよりも、立体構造の部分集合のＧＰＣＲに高いアフィニティで結合する結合ドメインを指す。当業者は、ＧＰＣＲの特定の立体構造に選択的に結合する結合ドメインが、ＧＰＣＲをこの特定の立体構造に安定化するか、または維持することを認識するであろう。例えば、活性な状態の立体構造選択的な結合ドメインは、活性な立体構造状態でＧＰＣＲに優先的に結合し、不活性な立体構造状態では、ＧＰＣＲに結合しないか、または少ない割合で結合し、前記活性な立体構造状態に対する高いアフィニティを有するか、またはこの逆であろう。「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、「優先的に結合する」という用語、および文法的に等価な用語は、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「立体構造特異的な」または「立体構造選択的な」という用語も、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。

【0063】

「化合物」または「試験化合物」または「候補化合物」または「薬物候補化合物」という用語は、本明細書で使用する場合、同じ意味を有することを意図しており、アッセイ（例えば、薬物開発目的のためのスクリーニングアッセイ）で試験される、天然に生じるか、または合成の任意の分子を記述する。このように、これらの化合物は、有機化合物または無機化合物を含む。化合物は、分子量が低いことを特徴とする、低分子、ポリヌクレオチド、脂質またはホルモン類似体を含む。他のバイオポリマー有機試験化合物は、約２から約４０のアミノ酸を含む低分子ペプチドまたはペプチド様分子（ペプチド模倣物）、および約４０から約５００のアミノ酸を含むもっと大きなポリペプチド、例えば、抗体、抗体フラグメントまたは抗体コンジュゲートを含む。試験化合物は、タンパク質足場または合成足場であってもよい。高スループットの目的のために、試験化合物ライブラリー、例えば、十分な範囲の多様性を与えるコンビナトリアルライブラリーまたは無作為なライブラリーを使用してもよい。例としては、限定されないが、天然化合物ライブラリー、アロステリック化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体フラグメントライブラリー、合成化合物ライブラリー、フラグメントに基づくライブラリー、ファージディスプレイライブラリーなどが挙げられる。もっと詳細な記載は、本明細書中にさらに見出されるであろう。

【0064】

本明細書で使用する場合、「リガンド」という用語は、ポリペプチド（特に、ＧＰＣＲ）に結合する分子を意味する。リガンドは、限定する目的はないが、タンパク質、（ポリ）ペプチド、脂質、低分子、タンパク質足場、核酸、イオン、炭水化物、抗体または抗体フラグメントであってもよい。リガンドは、合成または天然に生じるものであってもよい。リガンドは、天然タンパク質のための内因性の天然リガンドである「天然リガンド」も含む。本発明の文脈で、リガンドは、細胞内の部位または細胞外の部位で、および／または膜貫通ドメインで、ＧＰＣＲに結合する分子を意味する。通常は、必須ではないが、ＧＰＣＲは、リガンドが結合すると、特定の立体構造を採用するであろう。従って、リガンドは、「立体構造選択的なリガンド」または「立体構造特異的なリガンド」であってもよい。この用語は、オルソステリック部位またはアロステリック部位で結合するアゴニスト、全アゴニスト、パーシャルアゴニストおよびインバースアゴニストを含む。明確さのために、ニュートラルアンタゴニストは、ＧＰＣＲの特定の立体構造に選択的に結合しないため、「立体構造選択的なリガンド」または「立体構造特異的なリガンド」という用語は、ニュートラルアンタゴニストを含まない。

【0065】

「オルソステリックリガンド」は、本明細書で使用する場合、受容体（例えば、ＧＰＣＲ）の活性部位に結合するリガンド（天然または合成）を指し、この有効性に従って、言い換えると、特定の経路を経てシグナル伝達する際に有する効果に従って、さらに分類される。本明細書で使用する場合、「アゴニスト」は、受容体タンパク質に結合することによって、受容体のシグナル伝達活性を高めるリガンドを指す。全アゴニストは、最大のタンパク質刺激を可能にし、パーシャルアゴニストは、飽和濃度でさえ、最大活性を誘発することができない。パーシャルアゴニストは、もっと強固なアゴニストの結合を防ぐことによって、「ブロッカー」としても機能することができる。「アンタゴニスト」は、「ニュートラルアンタゴニスト」とも呼ばれ、何らかの活性を刺激することなく受容体に結合するリガンドを指す。「アンタゴニスト」は、他のリガンドの結合を防ぐ能力、従って、アゴニストによって誘発される活性を遮断する能力に起因して、「ブロッカー」としても知られる。さらに、「インバースアゴニスト」は、アンタゴニストを指し、アゴニストの効果の遮断に加え、受容体の基礎活性または恒常的な活性を、リガンドを有しないタンパク質の活性より低く下げる。

【0066】

リガンドは、本明細書で使用する場合、受容体のシグナル伝達活性の部分集合を選択的に刺激する能力を有する「バイアスリガンド」であってもよい（例えば、ＧＰＣＲの場合、Ｇタンパク質またはβ−アレスチン機能の選択的な活性化）。このようなリガンドは、「バイアスリガンド」、「バイアスアゴニスト」または「機能的に選択的なアゴニスト」としても知られる。さらに具体的には、リガンドのバイアスは、異なるシグナルのための異なる相対的な有効性を伴う複数の受容体の活性のリガンド刺激を特徴とする不完全なバイアスであってもよく、または、別の既知の受容体タンパク質の活性を刺激することなく、ある受容体のタンパク質活性のリガンド刺激を特徴とする完全なバイアスであってもよい。

【0067】

別の種類のリガンドは、アロステリック制御剤として知られている。「アロステリック制御剤」またはその他の「アロステリック調整剤」、「アロステリックリガンド」または「エフェクター分子」は、本明細書で使用する場合、受容体タンパク質、例えば、ＧＰＣＲのアロステリック部位（即ち、タンパク質の活性部位とは物理的に別個の制御部位）に結合するリガンドを指す。オルソステリックリガンドとは対照的に、アロステリック調整剤は、異なる部位で受容体タンパク質に結合し、内因性リガンドも結合している場合であってもこの活性を変えるため、非競争的である。タンパク質の活性を高めるアロステリック制御剤は、本明細書では「アロステリック活性化剤」または「正のアロステリック調整剤」（ＰＡＭ）と呼ばれ、一方、タンパク質の活性を下げるアロステリック制御剤は、本明細書では、「アロステリック阻害剤」またはその他「負のアロステリック調整剤」（ＮＡＭ）と呼ばれる。

【0068】

本明細書で使用する場合、「を決定する」、「を測定する」、「を評価する」、「を監視する」および「をアッセイする」という用語は、相互に置き換え可能に用いられ、定量的な決定および定性的な決定を両方とも含む。

【0069】

本明細書で使用する場合、抗体の文脈で、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、Ｈ（重）鎖またはＬ（軽）鎖のいずれかの可変領域を指し（それぞれＶＨおよびＶＬとも省略される。）、抗原標的に特異的に結合することができるアミノ酸配列を含む。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原性の決定因子の構造に対する抗体の基本的な特異性の原因となる。このような領域は、「高度可変領域」とも呼ばれる。ＣＤＲは、可変領域内のアミノ酸の非連続的な伸張部分を表すが、種にかかわらず、可変重鎖および可変軽鎖内のこれらの重要なアミノ酸配列の位置的な配置は、可変鎖のアミノ酸配列内の同様の位置を有することがわかっている。すべてのカノニカル抗体の可変重鎖および軽鎖は、それぞれ３つのＣＤＲ領域を有し、それぞれ、それぞれの軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖について、他と非連続的である（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と呼ばれる。）。免疫グロブリン一本鎖可変ドメイン、特に、ＶＨＨまたはナノボディは、一般的に、４個の「フレームワーク配列または領域」、即ち、ＦＲと、３個の「相補性決定領域」、即ち、ＣＤＲを含むと考えることができる一本鎖アミノ酸鎖を含む。ナノボディは、３個のＣＤＲ領域を含み、それぞれ、互いに非連続的である（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれる。）。ＦＲ配列およびＣＤＲ配列の表示は、例えば、ＶドメインおよびＶ様ドメインのためのＩＭＧＴの固有の番号付けに基づいてもよい（Ｌｅｆｒａｎｃら、２００３）。

【0070】

詳細な記載
キメラポリペプチド
本発明の第１の態様は、結合ドメインに融合したＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を含み、前記結合ドメインが、ＧＰＣＲに指向するか、および／またはＧＰＣＲに特異的に結合するキメラポリペプチドに関する。従って、本発明は、少なくとも２つの部分、特に、少なくともＧＰＣＲ部分と結合ドメイン部分との融合タンパク質であり、前記結合ドメインが、ＧＰＣＲに指向するか、および／またはＧＰＣＲに特異的に結合するキメラポリペプチドを提供する。

【0071】

一般的に、キメラポリペプチドのＧＰＣＲ部分を生成する部分の選択は、本発明にとって重要ではなく、典型的には、意図する使用および適用に従って選択されるであろう。結合ドメイン部分の必要条件は、選択したＧＰＣＲに特異的に結合する（本明細書で定義されるような）能力である。従って、結合ドメイン部分は、一般的に、任意の望ましいＧＰＣＲに指向してもよく、特に、任意のＧＰＣＲの任意の立体的エピトープ（本明細書で定義されるような）に指向してもよい。「立体的エピトープ」に特異的に結合する結合ドメインは、折り畳まれたタンパク質の三次（即ち、三次元）構造に特異的に結合し、タンパク質の線形（即ち、折り畳まれておらず、変性した）形態に対するアフィニティがかなり小さい状態で（即ち、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍小さい状態で）結合する。特に、前記立体的エピトープは、細胞内領域または細胞外領域の一部であってもよく、または膜間領域、または任意の望ましいＧＰＣＲのドメインまたはループ構造であってもよい。従って、特定の実施形態によれば、結合ドメイン部分は、望ましいＧＰＣＲの細胞外領域、ドメイン、ループまたは他の細胞外の立体的エピトープに指向してもよいが、好ましくは、膜貫通ドメインの細胞外部分、またはさらに好ましくは、膜貫通ドメインに接続する細胞外のループに指向する。または、結合ドメイン部分は、望ましいＧＰＣＲの細胞内領域、ドメイン、ループまたは他の細胞内の立体的エピトープに指向してもよいが、好ましくは、膜貫通ドメインの細胞内部分、またはさらに好ましくは、膜貫通ドメインに接続する細胞内のループに指向してもよい。他の特定の実施形態において、結合ドメイン部分は、限定されないが、内因性オルソステリックアゴニストを含め、ニュートラルリガンドの結合部位の一部を生成する立体的エピトープに指向してもよい。さらに他の実施形態において、結合ドメイン部分は、下流のシグナル伝達タンパク質のための結合部位に含まれる立体的エピトープ、特に、細胞内エピトープ（限定されないが、Ｇタンパク質結合部位、β−アレスチン結合部位）に指向してもよい。

【0072】

好ましい実施形態によれば、本発明のキメラポリペプチドは、結合ドメインに融合したＧＰＣＲを含み、分子内反応でＧＰＣＲに結合ドメインが結合すると、ＧＰＣＲは、さらなるリガンドを必要とすることなく、特定の立体構造で安定化される。好ましくは、本発明のキメラポリペプチドは、結合ドメインによって機能的な立体構造（本明細書で定義されるような）に安定化されたＧＰＣＲを含む。「安定化された」という用語を用いる場合、本明細書で上記で定義されたように、構造（例えば、立体構造状態）および／または特定の生体活性（例えば、細胞内のシグナル伝達活性、リガンド結合アフィニティなど）に関し、ＧＰＣＲの安定性が高まることを意味する。構造および／または生体活性に関して安定性が高まることに関連して、物理的な方法、例えば、特に、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、またはスピンラベリングによって、または、特に、活性のための機能アッセイ（例えば、Ｃａ^２＋の放出、ｃＡＭＰの生成または転写活性、β−アレスチンの補充など）またはリガンド結合によって、容易に決定されるであろう。「安定化する」という用語は、変性剤または変性条件によって誘発される非生理学的条件で、ＧＰＣＲの熱安定性を高めることも含む。「熱安定化する」、「熱安定化すること」、「の熱安定性を高める」という用語は、本明細書で使用する場合、ＧＰＣＲの熱力学的特性ではなく、限定されないが、加熱、冷却、凍結、化学変性剤、ｐＨ、洗剤、塩、添加剤、プロテアーゼまたは温度を含め、熱および／または化学的な手法によって誘発される不可逆的な変性に対するタンパク質の耐性といった機能を指す。不可逆的な変性によって、タンパク質の機能的な立体構造の不可逆的なアンフォールディング、生体活性の消失および変性したタンパク質の凝集が生じる。熱に対する安定性の増加に関連して、リガンドの結合を測定することによって、または分光法、例えば、温度上昇時のアンフォールディングに感受性の蛍光、ＣＤまたは光散乱を用いることによって、簡単に決定することができる。結合ドメイン部分が、機能的な立体構造状態でのＧＰＣＲの熱安定性の増加によって測定される場合、少なくとも２℃、少なくとも５℃、少なくとも８℃、さらに好ましくは、少なくとも１０℃または１５℃または２０℃、安定性を高めることができることが好ましい。洗剤またはカオトロピックに対する安定性の増加に関連して、典型的には、ＧＰＣＲを、試験洗剤または試験カオトロピック剤存在下、所定の時間インキュベートし、例えば、リガンドの結合または分光法を用いて、場合により、上述のような高い温度で、安定性を決定する。その他、結合ドメイン部分は、ＧＰＣＲの機能的な立体構造状態の極端なｐＨでの安定性を高めることができる。極端なｐＨに関連して、典型的な試験ｐＨは、例えば、６から８の範囲、５．５から８．５の範囲、５から９の範囲、４．５から９．５の範囲、さらに具体的には、４．５から５．５の範囲（低ｐＨ）または８．５から９．５（高ｐＨ）で選択されるであろう。「（熱）安定化する」、「（熱）安定化すること」、「の（熱）安定性を高めること」という用語は、本明細書で使用する場合、脂質粒子または脂質層（例えば、脂質の単一層、脂質二重層など）に包まれたＧＰＣＲ、および洗剤に溶解したＧＰＣＲに適用される。

【0073】

従って、本発明のキメラポリペプチドが、結合ドメイン部分に結合すると、機能的な立体構造で安定化されたＧＰＣＲ部分を含むことが特に想定される。本発明の好ましい実施形態によれば、ＧＰＣＲ部分は、活性な立体構造に選択的な結合ドメインに結合すると、活性な立体構造で安定化される。「活性な立体構造」という用語は、本明細書で使用する場合、リガンドに結合すると、Ｇタンパク質に依存するシグナル伝達およびＧタンパク質に依存しないシグナル伝達（例えば、β−アレスチンシグナル伝達）を含め、細胞内のエフェクター系に対するシグナル形質導入を可能にする受容体の立体構造の範囲を指す。従って、「活性な立体構造」は、アゴニストが結合した活性な立体構造、パーシャルアゴニストが結合した活性な立体構造または細胞内のエフェクタータンパク質の協働的な結合を誘発するバイアスアゴニスト立体構造を含め、ある範囲のリガンド特異的な立体構造を包含する。別の好ましい実施形態において、ＧＰＣＲ部分は、不活性な立体構造に立体構造選択的な結合ドメインに結合すると、不活性な立体構造で安定化される。「不活性な立体構造」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞内エフェクター系に対するシグナル形質導入を可能にしないか、または遮断する受容体の立体構造の範囲を指す。従って、「不活性な立体構造」は、細胞内のエフェクタータンパク質の協働的な結合を妨害するインバースアゴニストが結合した不活性な立体構造を含め、ある範囲のリガンド特異的な立体構造を包含する。活性な立体構造または不活性な立体構造を得るために、リガンドの結合部位が重要ではないことが理解されるであろう。従って、オルソステリックリガンドおよびアロステリック調整剤は、等しく、活性な立体構造または不活性な立体構造でＧＰＣＲを安定化することができる。従って、本発明の特定の実施形態によれば、ＧＰＣＲ部分を安定化することができる結合ドメイン部分は、オルソステリック部位またはアロステリック部位に結合してもよい。他の特定の実施形態において、ＧＰＣＲ部分を安定化することができる結合ドメイン部分は、アゴニストが結合した活性な立体構造に選択的な結合ドメイン、またはパーシャルアゴニストが結合した活性な立体構造に選択的な結合ドメイン、またはバイアスアゴニストが結合した機能的な立体構造結合ドメインに選択的な結合ドメイン、またはインバースアゴニストが結合した不活性な立体構造に選択的な結合ドメインであってもよい。

【0074】

従って、本発明のキメラポリペプチドは、つなぎ止められた結合ドメインの局所的な高濃度に起因して、融合物のＧＰＣＲ部分が、特定の機能的な立体構造で安定化されるため、立体構造が拘束されたタンパク質であると理解されるであろう。これをさらに示すために、限定することを目的とするものではないが、活性な立体構造で安定化されたＧＰＣＲを含む本発明のキメラポリペプチドは、対応する融合していないＧＰＣＲと比較して、またはモック結合部分に融合したＧＰＣＲに対応するキメラポリペプチド（コントロール結合部分または不可逆的な結合部分とも呼ばれ、ＧＰＣＲに指向しないか、および／またはＧＰＣＲに特異的に結合しない。）と比較して、アゴニスト（さらに特定的には、全アゴニスト、パーシャルアゴニスト、またはバイアスアゴニスト）に対するアフィニティが増加または向上しているであろう。さらに、活性な立体構造で安定化されたＧＰＣＲを含む本発明のキメラポリペプチドは、対応する融合していないＧＰＣＲと比較して、またはモック結合部分に融合した対応するＧＰＣＲのキメラポリペプチドと比較して、インバースアゴニストに対するアフィニティが低いであろう。対照的に、不活性な立体構造で安定化されたＧＰＣＲを含む本発明のキメラポリペプチドは、対応する融合していないＧＰＣＲと比較して、またはモック結合部分に融合した対応するＧＰＣＲのキメラポリペプチドと比較して、インバースアゴニストに対し、高いアフィニティを有し、および／またはアゴニストに対するアフィニティが低下しているであろう。リガンドに対するアフィニティの増加または低下は、それぞれ、ＥＣ_５０、ＩＣ_５０、Ｋ_ｄ、Ｋ_ｉまたは当業者が知っている任意のアフィニティまたは効力の指標の低下または増加によって、直接的に測定されてもよく、および／またはこれらから計算されてもよい。好ましくは、リガンドに対する本発明のキメラポリペプチドのアフィニティは、拘束されたＧＰＣＲに結合すると、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、さらに好ましくは、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、さらになお好ましくは、少なくとも１０００倍、または２０００倍、またはこれ以上、増加または低下する。特定のシグナル伝達経路の引き金となり／阻害する、立体構造選択的なリガンドのアフィニティ測定は、天然リガンド、低分子、および生物学的物質を含む任意の種類のリガンドを用いて、オルソステリックリガンドおよびアロステリック調整剤を用いて、単一の化合物および化合物ライブラリーを用いて、リード化合物またはフラグメントなどを用いて行われてもよいことが理解されるであろう。

【0075】

さらに、上述のキメラポリペプチドの一部を生成する異なる部分を互いに融合する様式は、典型的には、ＧＰＣＲの種類および結合ドメインの特徴（例えば、結合する立体的エピトープ）の両方に依存するであろう。当業者なら知っているように、ＧＰＣＲは、細胞外のＮ末端、その後、３個の細胞内ループおよび３個の細胞外ループによって接続する７回膜貫通するαらせん、最後に、細胞内Ｃ末端を特徴とする（本明細書をさらに参照）。結合部位（細胞外または細胞内の膜、または膜貫通する膜）に依存して、結合ドメイン部分は、好ましくは、ＧＰＣＲのＮ末端またはこのＣ末端に融合するであろう。好ましくは、細胞内の部位でＧＰＣＲに結合する結合ドメインは、ＧＰＣＲのＣ末端に融合するであろう。同様に、細胞外の部位でＧＰＣＲに結合する結合ドメインは、ＧＰＣＲのＮ末端に融合するであろう。結合ドメイン部分は、ＧＰＣＲのＮ末端に、このＣ末端で融合してもよく、または、結合ドメインは、ＧＰＣＲのＣ末端に、このＮ末端で融合してもよい。さらに、融合は、配列の直接的な融合であってもよく、または、例えば、介在するアミノ酸配列またはリンカー配列（本明細書でさらに記載されるような）を用いて間接的に融合してもよい。当業者は、融合構築物をどのように設計するかを知っているであろう。利用可能な場合、ＧＰＣＲの原子構造を別個に、および／または結合ドメインの構造を別個に、および／または結合ドメインとの複合体でのＧＰＣＲの原子結合を利用するであろう。または、ＧＰＣＲは、インテインが介在するタンパク質スプライシング（ＭｕｒａｌｉｄｈａｒａｎおよびＭｕｉｒ ２００６）またはソルターゼが介在するペプチド転移（Ｐｏｐｐら、２００７）または部位特異的なラベリングのための他の化学酵素方法または低分子、または、例えば、ＣｈｅｎおよびＴｉｎｇ（２００５）およびＲａｂｕｋａ（２０１０）（本明細書に参照により組み込まれる。）によって記載されるような他のタンパク質を用いたタンパク質の遺伝子設計を用い、結合ドメインに接続することができるであろう。

【0076】

本発明のキメラポリペプチドの一部を生成する異なる部分の特定の実施形態を、本明細書で以下に詳細に記載する。

【0077】

ＧＰＣＲ部分
本発明のキメラポリペプチドは、少なくとも２つのポリペプチド成分を含み、この１つがＧＰＣＲである。ＧＰＣＲとして、目的の任意のＧＰＣＲを使用してもよい。当業者は、意図した用途（本明細書にさらに記載されるような）に依存して、適切なＧＰＣＲを選択することができる。同じ株において、意図した用途に依存して、例えば、真菌（酵母を含む）、線虫、ウイルス、昆虫、植物、鳥（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ）、爬虫類、または哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サル、ラクダまたはヒト）のような任意の有機体に由来するＧＰＣＲを選択してもよい。

【0078】

「Ｇタンパク質共役受容体」または「ＧＰＣＲ」は、本明細書で使用する場合、当業者によく知られており、それぞれが膜に広がる７個のαらせんを生成する２２から２４の疎水性アミノ酸を有する７個の領域を含む共通の構造モチーフを共有するポリペプチドを指す。それぞれの広がりは、数によって特定される（即ち、膜貫通−１（ＴＭ１）、膜貫通−２（ＴＭ２）などのように）。この膜貫通らせんは、膜貫通−２と膜貫通−３、膜貫通−４と膜貫通−５および膜貫通−６と膜貫通−７の間のアミノ酸領域によって、細胞膜の外側で、または「細胞外」の部位で接続し、それぞれ「細胞外」領域１、２および３（ＥＣ１、ＥＣ２およびＥＣ３）と呼ばれる。この膜貫通らせんは、膜貫通−１と膜貫通−２、膜貫通−３と膜貫通−４および膜貫通−５と膜貫通−６の間のアミノ酸領域によって、細胞膜の内側で、または「細胞内」の部位でも接続し、それぞれ「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ１、ＩＣ２およびＩＣ３）と呼ばれる。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は、細胞中の細胞内空間にあり、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は、細胞の外側の細胞外空間にある。これらの任意の領域は、ＧＰＣＲの主なアミノ酸配列の分析によって簡単に特定可能である。

【0079】

ＧＰＣＲの構造および分類は、一般的に、当該技術分野でよく知られており、ＧＰＣＲのさらなる記載は、Ｐｒｏｂｓｔら、１９９２；Ｍａｒｃｈｅｓｅら、１９９４；Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ＆Ｓｃｈｉｏｔｈ、２００８；Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、２００９；および以下の書籍：Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓによって出版された、Ｊｕｒｇｅｎ Ｗｅｓｓ（編集）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（第１版、１９９９年１０月１５日）；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓによって出版された、Ｋｅｖｉｎ Ｒ．Ｌｙｎｃｈ（編集）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（１９９８年３月）およびＣＲＣ Ｐｒｅｓｓによって出版された、Ｔａｔｓｕｙａ Ｈａｇａ（編集）、Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（１９９９年９月２４日）；およびＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓによって出版された、Ｓｔｅｖｅ Ｗａｔｓｏｎ（編集）Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ（第１版、１９９４年）の中に見出されるであろう。ＧＰＣＲは、配列の同一性および機能の類似性を基準として、幾つかのファミリーにグループ分けすることができ、それぞれ、本発明のキメラポリペプチドの作製および使用に使用することができる。ほとんどのヒトＧＰＣＲは、グルタメート、ロドプシン、付着、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｔａｓｔｅ２およびセクレチンと呼ばれる５種類の主なファミリー中に見出すことができる（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎら、２００３）。古い分類系のクラスＡ（Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ、１９９４）またはクラス１（Ｆｏｏｒｄら、２００５）に対応するロドプシンファミリーのメンバーは、小さな細胞外ループのみを有し、膜貫通の分裂部分内の残基とリガンドの相互作用が起こる。これは、最も大きなグループ（ＧＰＣＲの９０％を超える。）であり、臭気物質、低分子、例えば、カテコールアミンおよびアミン、（ニューロ）ペプチドおよび糖タンパク質ホルモンのための受容体を含む。このファミリーの代表例であるロドプシンは、構造が解明された最初のＧＰＣＲである（Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉら、２０００）。構造が解明された普及可能なリガンドと相互作用する最初の受容体であるβ２ＡＲ（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、２００７）もこのファミリーに属する。系統発生的な分析に基づき、クラスＢまたはクラス２のＧＰＣＲ（Ｆｏｏｒｄら、２００５）の受容体は、近年、付着およびセクレチンの２つのファミリーに分けられた（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎら、２００３）。付着およびセクレチンの受容体は、リガンド結合に関与する比較的長いアミノ末端の細胞外ドメインを特徴とする。膜貫通ドメインの配置についてはほとんど知られていないが、おそらく、ロドプシンの配置とかなり異なる。これらのＧＰＣＲのためのリガンドは、ホルモン、例えば、グルカゴン、セクレチン、ゴナドトロピンを放出するホルモンおよび副甲状腺ホルモンである。グルタメートファミリー受容体（クラスＣまたはクラス３の受容体）も、大きな細胞外ドメインを有し、アゴニストが内側に結合すると開閉し得るため、「ハエトリグサ」のような機能を有する。ファミリーメンバーは、代謝型グルタメート、Ｃａ^２＋を検知するもの、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）−Ｂ受容体である。

【0080】

従って、本発明の特定の実施形態によれば、本発明のキメラポリペプチドは、ＧＰＣＲグルタメートファミリーのＧＰＣＲ、ＧＰＣＲロドプシンファミリーのＧＰＣＲ、ＧＰＣＲ接着ファミリーのＧＰＣＲ、ＧＰＣＲのＦｒｉｚｚｌｅｄ／Ｔａｓｔｅ２ファミリーのＧＰＣＲおよびＧＰＣＲのセクレチンファミリーのＧＰＣＲを含む群から選択されるＧＰＣＲを含む。好ましくは、キメラペプチドに含まれるＧＰＣＲは、哺乳動物のタンパク質、または植物のタンパク質、または微生物のタンパク質、またはウイルスのタンパク質、または昆虫のタンパク質である。さらになお好ましくは、ＧＰＣＲは、ヒトタンパク質である。

【0081】

さらに具体的には、ＧＰＣＲとしては、限定されないが、５−ヒドロキシトリプタミン受容体、アセチルコリン受容体（ムスカリン性）、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、アナフィラトキシン受容体、アンギオテンシン受容体、アペリン受容体、胆汁酸受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、エストロゲン（Ｇタンパク質共役型）受容体、ホルミルペプチド受容体、遊離脂肪酸受容体、ガラニン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、ゴナドトロピンを放出するホルモン受容体、ヒスタミン受容体、ＫｉＳＳ１から誘導されるペプチド受容体、ロイコトリエン受容体、リゾリン脂質受容体、メラニンを濃縮するホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、モチリン受容体、ニューロメジンＵ受容体、ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体、ニューロペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、ニコチン酸受容体ファミリー、オピオイド受容体、オレキシン受容体、Ｐ２Ｙ受容体、ペプチドＰ５１８受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチンを放出するペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼを活性化する受容体、リラキシンファミリーペプチド受容体、ソマトスタチン受容体、タキキニン受容体、チロトロピンを放出するホルモン受容体、微量アミン受容体、ウロテンシン受容体、バソプレシンおよびオキシトシン受容体、Ａ型オーファン、非信号伝達型７ＴＭケモカイン結合タンパク質、カルシトニン受容体、コルチコトロピン放出因子受容体、グルカゴン受容体ファミリー、副甲状腺ホルモン受容体、ＶＩＰおよびＰＡＣＡＰ受容体、Ｂ型オーファン、カルシウム感知受容体、ＧＡＢＡ Ｂ受容体、ＧＰＲＣ５受容体、代謝型グルタメート受容体、Ｃ型オーファン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、ロドプシンおよび他のＧタンパク質共役型７回膜貫通セグメント受容体が挙げられる。ＧＰＣＲは、ホモマーまたはヘテロマーのダイマーまたはもっと高次のオリゴマーとしての互いに会合するこれらのＧＰＣＲ受容体も含む。ＧＰＣＲのアミノ酸配列（およびこれをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）を参照し、容易に入手可能である。ヒト遺伝子に対するＨＧＮＣ標準化された命名法、異なる有機体からの異なるイソ型の寄託番号は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から入手可能である。さらに、ＧＰＣＲに対する受容体命名法、薬理学、機能および病態生理学に関する情報の包括的な総説は、ＩＵＰＨＡＲデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｐｈａｒ−ｄｂ．ｏｒｇ／）から検索することができる。

【0082】

好ましい実施形態によれば、本発明のキメラポリペプチドの一部を生成するＧＰＣＲは、アドレナリン作動性受容体、好ましくは、αアドレナリン作動性受容体、例えば、α１アドレナリン作動性受容体およびα２アドレナリン作動性受容体およびβアドレナリン作動性受容体、例えば、β１アドレナリン作動性受容体、β２アドレナリン作動性受容体およびβ３アドレナリン作動性受容体を含む群から選択されるか、またはムスカリン性受容体、好ましくは、Ｍ１ムスカリン性受容体、Ｍ２ムスカリン性受容体、Ｍ３ムスカリン性受容体、Ｍ４ムスカリン性受容体およびＭ５ムスカリン性受容体を含む群から選択されるか、またはオピオイド受容体ファミリー、好ましくは、μオピオイド受容体（ミューまたはＭＯＰまたはＭｏｒ１）、δオピオイド受容体（デルタまたはＤＯＰ）、κオピオイド受容体（カッパまたはＫＯＰ）、ＮＯＰオピオイド受容体を含む群から選択され、すべて当該技術分野でよく知られている。

【0083】

この目的および用途に依存して、融合タンパク質に含まれるＧＰＣＲは、天然に生じる受容体または天然に生じない（即ち、ヒトによって変更された）受容体であってもよいことが理解されるであろう。「天然に生じる」という用語は、ＧＰＣＲを参照するとき、天然で産生されるＧＰＣＲを意味する。特に、ＧＰＣＲの野生型多形改変体およびイソ型、および異なる種にわたるオルソログは、天然に生じるタンパク質の例であり、例えば、限定されないが、哺乳動物、さらに具体的には、特に、ヒト、またはウイルス、または植物、または昆虫の中で発見される。このようなＧＰＣＲは、天然に見出される。これに加え、この用語は、野生型多形改変体、変異体を含むβ_２アドレナリン作動性受容体の特定の種を含む特定の他の改変体を包含することを意図している。例えば、「ヒトβ_２アドレナリン作動性受容体」は、天然に生じるＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００００１５の「ヒトβ_２アドレナリン受容体」と少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９５％同一または少なくとも９８％同一）のアミノ酸配列を有する。またはさらに、「ヒトムスカリン性アセチルコリン受容体Ｍ２」は、天然に生じるＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＡ５１５７０．１の「ヒトムスカリン性アセチルコリン受容体Ｍ２」と少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９５％同一または少なくとも９８％同一）のアミノ酸配列を有する。またはさらに、「ヒトミューオピオイド受容体」は、天然に生じるＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０００９０５の「ヒトミューオピオイド受容体」と少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９５％同一または少なくとも９８％同一）のアミノ酸配列を有する。「天然に生じない」という用語は、ＧＰＣＲを参照するとき、天然に生じないＧＰＣＲを意味する。変異した野生型ＧＰＣＲおよび天然に生じるＧＰＣＲの改変体は、天然に生じないＧＰＣＲの例である。天然に生じないＧＰＣＲは、天然に生じるＧＰＣＲと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有していてもよい。特定の状況において、キメラポリペプチドに含まれるＧＰＣＲが、天然に生じないタンパク質であることが有利な場合がある。例えば、単なる説明のために、特定の立体構造で安定化されたＧＰＣＲを含むキメラポリペプチドの結晶を得る可能性を高めるために、立体構造（例えば、アゴニストに対する高いアフィニティを有する活性な立体構造）に影響を与えないか、または最低限の影響のみを与えつつ、いくらかのタンパク質の遺伝子操作を行うことが望ましい場合がある。または、これに代えて、またはこれに加え、ＧＰＣＲの細胞発現レベルを高めるため、または、この安定性を高めるために、目的のＧＰＣＲに特定の突然変異を導入することを考えてもよい。天然に生じないＧＰＣＲの非限定例としては、限定されないが、突然変異によって恒常的に活性になったＧＰＣＲ、ループを欠失しているＧＰＣＲ、Ｎ末端および／またはＣ末端を欠失しているＧＰＣＲ、置換、挿入または付加を有するＧＰＣＲ、またはこのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に関して、これらの任意の組み合わせ、または天然に生じるＧＰＣＲの他の改変体が挙げられる。キメラＧＰＣＲまたはハイブリッドＧＰＣＲを含む標的ＧＰＣＲ、例えば、あるＧＰＣＲからのＮ末端および／またはＣ末端と第２のＧＰＣＲのループとを含むキメラＧＰＣＲ、またはある部分に融合したＧＰＣＲを含むもの（例えば、ＧＰＣＲ結晶化における有用性としてのＴ４リゾチーム、フラボドキシン、キシラナーゼ、ルブレドキシンまたはシトクロムｂ）も、本発明の範囲に含まれる（Ｃｈｕｎら、２０１２および特許明細書ＷＯ２０１２／１５８５５５、ＷＯ２０１２／０３０７３５、ＷＯ２０１２／１４８５８６にも記載されている。）。

【0084】

本発明の範囲内の特定の実施形態によれば、キメラポリペプチドに含まれるような天然に生じないＧＰＣＲは、天然に生じるＧＰＣＲと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有していてもよい。さらに、本発明は、ループが欠失したＧＰＣＲ、またはＮ末端および／またはＣ末端を欠失したＧＰＣＲ、またはこのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に関し、置換、または挿入または付加されたもの、またはこれらの任意の組み合わせ（本明細書で上記で定義され、実施例の章も参照）も想定することが理解されるであろう。

【0085】

結合ドメイン部分
本発明のキメラポリペプチドは、少なくとも２つのポリペプチド成分を含み、この１つがＧＰＣＲであり（本明細書で上記で定義されるような）、他方が、ＧＰＣＲに指向し、および／またはＧＰＣＲに特異的に結合する結合ドメインである。

【0086】

「結合ドメイン」という用語は、本明細書で使用する場合、ＧＰＣＲの特定の分子間相互作用を用いて結合することができるタンパク質系（タンパク質、タンパク質様またはタンパク質を含有する。）分子の全体または一部を意味する。特定の実施形態によれば、「結合ドメイン」という用語は、ＧＰＣＲの天然に生じる結合パートナー、例えば、Ｇタンパク質、アレスチン、内因性リガンド；またはこの改変体または誘導体（フラグメントを含む）を含まない。さらに具体的には、「結合ドメイン」という用語は、ポリペプチドを指し、さらに特定的には、タンパク質ドメインを指す。タンパク質の結合ドメインは、自己安定化し、タンパク質鎖の残りの部分と独立して折り畳まれることが多い、全タンパク質構造の一要素である。結合ドメインは、約２５アミノ酸から５００アミノ酸以上の長さで変動する。多くの結合ドメインは、折り畳み部分に分類することができ、認識可能で特定可能な三次元構造である。幾つかの折り畳み部分は、所与の特別な名称を有する多くの異なるタンパク質に共通である。

【0087】

非限定例は、特に、３ヘリックスバンドルまたは４ヘリックスバンドル、アルマジロリピートドメイン、ロイシンリッチリピートドメイン、ＰＤＺドメイン、ＳＵＭＯドメインまたはＳＵＭＯ様ドメイン、カドヘリンドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、ホスホチロシン結合ドメイン、プレクストリン相同ドメイン、ｓｒｃ相同２ドメインから選択される結合ドメインである。従って、結合ドメインは、天然に生じる分子、例えば、自然免疫系または獲得免疫系の要素から誘導されてもよく、または完全に人工的に設計されてもよい。

【0088】

一般的に、結合ドメインは、免疫グロブリン由来であってもよく、または、限定されないが、微生物タンパク質、プロテアーゼ阻害剤、毒素、フィブロネクチン、リポカリン、一本鎖逆平行コイルドコイルタンパク質またはリピートモチーフタンパク質を含む、タンパク質に存在するドメイン由来であってもよい。当該技術分野で知られている結合ドメインの特定の例としては、限定されないが、抗体、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、一本鎖ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ、ラクダ重鎖抗体から誘導される可変ドメイン（ＶＨＨまたはナノボディ）、サメ抗体から誘導される新しい抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）、アルファボディ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、設計されたアンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎｓ）、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、アンチカリン、ノッチン、操作されたＣＨ２ドメイン（ナノ抗体）、操作されたＳＨ３ドメイン、アフィボディ、ペプチドおよびタンパク質、リポペプチド（例えば、ペプデュシン）（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ＆Ｓｋｅｒｒａ、２００９；Ｓｋｅｒｒａ、２０００；Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋら、１９９７；Ｂｉｎｚら、２００４；Ｋｏｉｄｅら、１９９８；Ｄｉｍｉｔｒｏｖ、２００９；Ｎｙｇｒｅｎら、２００８；ＷＯ２０１００６６７４０を参照）。頻繁に、選択方法を用いて特定の種類の結合ドメインを作製する場合、ランダム化された潜在的な相互作用の残基を含むコンセンサス配列またはフレームワーク配列を含むコンビナトリアルライブラリーを使用し、目的の分子（例えば、タンパク質）への結合についてスクリーニングすることができる。

【0089】

好ましい実施形態によれば、本発明のキメラポリペプチドの一部を生成する結合ドメインが、自然免疫系または獲得免疫系から誘導されてもよいことが特に想定される。好ましくは、前記結合ドメインは、免疫グロブリンから誘導される。好ましくは、本発明の結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントから誘導される。「抗体」（Ａｂ）という用語は、一般的に、抗原に特異的に結合し、抗原を認識する免疫グロブリン遺伝子、またはこの機能性フラグメントによってコードされるポリペプチドを指し、当業者に知られている。抗体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対を含み、それぞれの対が、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０ｋＤａ）を有する、従来の４鎖型免疫グロブリンを含むことを意味する。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用し、抗原結合部位を生成する。「抗体」という用語は、一本鎖全抗体および抗原結合フラグメントを含め、全抗体を含むことを意味している。ある実施形態において、抗原結合フラグメントは、抗原結合抗体フラグメントであってもよく、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィドが接続したＦｖｓ（ｄｓＦｖ）、およびＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含むか、またはいずれかからなるフラグメント、およびこれらの任意の組み合わせ、または標的抗原に結合することができる免疫グロブリンペプチドの任意の他の機能性部分が挙げられる。「抗体」という用語は、本明細書でさらに定義されるように、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインを含め、重鎖のみの抗体、またはこのフラグメントも含むことも意味している。

【0090】

「免疫グロブリン一本鎖可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位が、一本鎖免疫グロブリンドメイン上に存在するか、一本鎖免疫グロブリンドメインによって作られる分子を定義している（従来の免疫グロブリンまたはこのフラグメントとは異なり、典型的には、２つの免疫グロブリン改変ドメインが相互作用し、抗原結合部位を生成する。）。しかし、「免疫グロブリン一本鎖可変ドメイン」という用語は、従来の免疫グロブリンのフラグメントを含み、抗原結合部位が一本鎖可変ドメインによって作られることは明確でなければならない。好ましくは、本発明の範囲内にある結合ドメイン部分は、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインである。

【0091】

一般的に、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含み、好ましくは、以下の式（１）：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）に従うアミノ酸配列、またはこの任意の適切なフラグメント（通常は、少なくとも１つの相補性決定領域を生成するアミノ酸残基の少なくとも一部を含むであろう。）であろう。４つのＦＲと３つのＣＤＲを含む免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、当業者に知られており、非限定例として、Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉら、２００９に記載されている。典型的には、非限定的であるが、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインの例は、１つの抗原結合単位を作製することができる限り、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬドメイン配列）またはこの適切なフラグメント、または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨドメイン配列またはＶＨＨドメイン配列）またはこの適切なフラグメントを含む。従って、好ましい実施形態によれば、結合ドメイン部分は、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬドメイン配列）または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨドメイン配列）である免疫グロブリン一本鎖可変ドメインであり、さらに具体的には、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、従来の４鎖型抗体から誘導される重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン配列である。免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、ドメイン抗体、または一本鎖ドメイン抗体、または「ｄＡＢ」またはｄＡｂ、またはナノボディ（本明細書で定義されるような）、または別の免疫グロブリン一本鎖可変ドメイン、またはいずれかの任意の適切なフラグメントであってもよい。一本鎖ドメイン抗体の一般的な記載のために、以下の本が参照される。「Ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＳａｅｒｅｎｓおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ編集、２０１２、Ｖｏｌ ９１１。免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、一般的に、４つの「フレームワーク配列」、つまりＦＲおよび３つの「相補性決定領域」、つまりＣＤＲ（本明細書で上記で定義されるような）を含むと考えることができる１つのアミノ酸鎖を含む。免疫グロブリン一本鎖可変ドメインのフレームワーク領域は、この抗原の結合にも寄与し得ることが明確になるはずである（Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、２００２；Ｋｏｒｏｔｋｏｖら、２００９）。ＣＤＲ配列（従って、ＦＲ配列も）の表示は、ＶドメインおよびＶ様ドメインのためのＩＭＧＴの固有の番号付けに基づいてもよい（Ｌｅｆｒａｎｃら、２００３）。または、ＦＲ配列およびＣＤＲ配列の表示は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２０００）の文献のラクダ由来のＶＨＨドメインに適用されるＫａｂａｔ番号付けに基づいて行うことができる。

【0092】

結合ドメイン部分としての免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、この最も広い意味で、特定の生体源または特定の調製方法に限定されないことを注記しておくべきである。「免疫グロブリン一本鎖可変ドメイン」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト、サメ、ラクダの可変ドメインを含め、異なる起源の可変ドメインを包含する。特定の実施形態によれば、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、サメ抗体から誘導され（いわゆる免疫グロブリンの新しい抗原受容体またはＩｇＮＡＲｓ）、もっと特定的には、天然に生じる重鎖サメ抗体から誘導され、軽鎖がなく、ＶＮＡＲドメイン配列として知られている。好ましくは、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、ラクダ抗体から誘導される。さらに好ましくは、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、天然に生じるラクダの重鎖のみの抗体から誘導され、軽鎖がなく、ＶＨＨドメイン配列またはナノボディとして知られている。

【0093】

特に好ましい実施形態によれば、本発明のキメラポリペプチドに含まれる結合ドメイン部分は、ナノボディである免疫グロブリン一本鎖可変ドメインである（本明細書でさらに定義され、限定されないが、ＶＨＨを含む。）。「ナノボディ」（Ｎｂ）という用語は、本明細書で使用する場合、一本鎖ドメイン抗原結合フラグメントである。特に、天然に生じる重鎖のみの抗体から誘導される一本鎖可変ドメインを指し、当業者には知られている。ナノボディは、通常は、ラクダ中にみられる重鎖のみの抗体（軽鎖を含まない。）から誘導され（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、１９９６）、この結果、ＶＨＨ抗体またはＶＨＨ配列と呼ばれることが多い。ラクダは、旧大陸のラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓおよびＣａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）および新大陸のラクダ（例えば、Ｌａｍａ ｐａｃｃｏｓ、Ｌａｍａ ｇｌａｍａ、Ｌａｍａ ｇｕａｎｉｃｏｅおよびＬａｍａ ｖｉｃｕｇｎａ）を含む。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（Ｒ）およびＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（Ｒ）は、Ａｂｌｙｎｘ ＮＶ（ベルギー）の登録商標である。ＶＨＨまたはナノボディのさらなる記載のために、「Ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＳａｅｒｅｎｓおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ編集、２０１２、Ｖｏｌ ９１１、特に、Ｃｈａｐｔｅｒ ｂｙ ＶｉｎｃｋｅおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２０１２）、および一般的な背景として述べられている以下の特許明細書の非限定的なリストを参照する。Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ ＢｒｕｓｓｅｌのＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９、ＷＯ９６／３４１０３；ＵｎｉｌｅｖｅｒのＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ １ １３４ ２３１およびＷＯ０２／４８１９３；Ｖｌａａｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ ｖｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６およびＷＯ０３／０５５５２７；Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７およびＷＯ０６／１２２８２５およびＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるさらなる公開された特許明細書。当業者に知られているように、ナノボディは、例えば、本明細書に参照により組み込まれるＷＯ０８／０２００７９の７５ページ、表Ａ−３に記載されるように、特に、１つ以上のフレームワーク配列に１つ以上のラクダ科の「ホールマーク残基」の存在を特徴とする（Ｋａｂａｔ番号付けによる。）。本発明のナノボディは、この最も広い意味で、特定の生体源または特定の調製方法に限定されないことを注記すべきである。例えば、ナノボディは、一般的に、（１）天然に生じる重鎖のみの抗体のＶＨＨドメインを単離することによって、（２）天然に生じるＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現によって、（３）天然に生じるＶＨＨドメインの「ヒト化」によって、またはこのようなヒト化されたＶＨＨドメインをコードする核酸の発現によって；（４）任意の動物種に由来し、特に、哺乳動物種、例えば、ヒトに由来する天然に生じるＶＨドメインの「ラクダ化」によって、またはこのようなラクダ化されたＶＨドメインをコードする核酸の発現によって、（５）当該技術分野で記載されるような「ドメイン抗体」または「Ｄａｂ」の「ラクダ化」によって、または、このようなラクダ化されたＶＨドメインをコードする核酸の発現によって、（６）これ自体が知られているタンパク質、ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列を調製するための合成技術または半合成技術を用いることによって、（７）これ自体が知られている核酸合成のための技術を用い、ナノボディをコードする核酸を調製し、その後、このようにして得られた核酸の発現によって、および／または（８）上の１つ以上の任意の組み合わせによって得られてもよい。ナノボディのヒト化および／またはラクダ化を含む、ナノボディのさらなる記載は、例えば、ＷＯ０８／１０１９８５およびＷＯ０８／１４２１６４に見出され、本明細書にさらに記載されるとおりである。天然標的の立体的エピトープと相互作用し、固有の主要ではない立体構造（基本立体構造とは異なる。）で標的を安定化させる特定の種類のナノボディは、Ｘａｐｅｒｏｎｅと呼ばれ、特に、ここで想定される。Ｘａｐｅｒｏｎｅは、構造生物学において固有のツールである。Ｘａｐｅｒｏｎｅ（商標）は、ＶＩＢおよびＶＵＢ（ベルギー）の商標である。柔軟な領域を固定し、攻撃的な表面を隠すことによって、Ｘａｐｅｒｏｎｅ（商標）複合体は、Ｘ線結晶学によるタンパク質構造の決定の鍵となる立体構造的に均一なサンプルを保証する。結晶化の補助としてのラクダ抗体フラグメントの使用の主な利点は、Ｘａｐｅｒｏｎｅが、（１）潜在性エピトープに結合し、固有の天然の立体構造にタンパク質を固定し、（２）可溶性タンパク質および可溶化した膜タンパク質の安定性を高め、（３）可溶性タンパク質および可溶化した膜タンパク質の立体構造の複雑さを低減し、（４）回折結晶の成長を可能にする極性表面を増やし、（５）攻撃的な表面または重合表面を隔離し、（６）アフィニティによる捕捉活性を有するタンパク質を可能にする。

【0094】

本発明の範囲内で、「免疫グロブリン一本鎖可変ドメイン」という用語は、「ヒト化」または「ラクダ化」された可変ドメイン、特に、「ヒト化」または「ラクダ化」されたナノボディも包含する。例えば、「ヒト化」および「ラクダ化」は、両方とも、天然に生じるＶ_ＨＨドメインまたはＶＨドメインをそれぞれコードするヌクレオチド配列を与え、次いで、これ自体既知の様式で、新しいヌクレオチド配列が、それぞれ本発明の「ヒト化」または「ラクダ化」された免疫グロブリン一本鎖可変ドメインをコードするような様式で前記ヌクレオチド配列の１つ以上のコドンを変化させることによって行うことができる。次いで、この核酸を、本発明の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインを与えるような、これ自体既知の様式で発現させることができる。または、天然に生じるＶ_ＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列にそれぞれ基づいて、望ましいヒト化またはラクダ化された本発明の望ましい免疫グロブリン一本鎖可変ドメインのアミノ酸配列をそれぞれ設計し、次いで、これ自体既知のペプチド合成技術を用い、ｄｅ ｎｏｖｏで合成してもよい。また、天然に生じるＶ_ＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列にそれぞれ基づいて、ヒト化またはラクダ化された本発明の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を設計し、次いで、これ自体既知の核酸合成技術を用い、ｄｅ ｎｏｖｏで合成してもよく、その後、このようにして得られた核酸を、本発明の望ましい免疫グロブリン一本鎖可変ドメインを得るように、これ自体既知の様式で発現させてもよい。天然に生じるＶＨ配列、好ましくは、ＶＨＨ配列から出発し、本発明の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインおよび／またはこれをコードする核酸を得るための他の適切な方法および技術は、当業者には明らかであり、例えば、本発明のナノボディまたはこれをコードするヌクレオチド配列または核酸を提供するように、適切な様式で、１つ以上の天然に生じるＶＨ配列の１つ以上の部分（例えば、１つ以上のＦＲ配列および／またはＣＤＲ配列）、１つ以上の天然に生じるＶＨＨ配列の１つ以上の部分（例えば、１つ以上のＦＲ配列またはＣＤＲ配列）、および／または１つ以上の合成または半合成の配列を合わせることを含んでいてもよい。

【0095】

さらに、本発明の範囲に含まれるのは、本明細書に定義されるような免疫グロブリン一本鎖可変ドメイン、特にナノボディの天然または合成の類似体、変異体、改変体、対立遺伝子、部分またはフラグメント（本明細書では、まとめて「改変体」と呼ぶ）、特に、配列番号１３から２０（表１から２を参照）の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインの改変体である。従って、本発明の一実施形態によれば、「本発明の免疫グロブリン一本鎖可変ドメイン」または「本発明のナノボディ」という用語は、最も広い意味で、このような改変体も包含する。一般的に、このような改変体において、本明細書に定義されるような本発明の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸残基が置き換わり、欠失し、および／または付加されていてもよい。配列番号１３から２０の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインの１つ以上のＦＲおよび／または１つ以上のＣＤＲ、特にＦＲおよびＣＤＲの改変体（表１から２を参照）において、このような置換、挿入または欠失がなされてもよい。改変体は、本明細書で使用する場合、それぞれまたは任意のフレームワーク領域およびそれぞれまたは任意の相補性決定領域が、アルゴリズム、例えば、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴを利用することによって電子的に測定することができるように、参照配列の対応する領域と少なくとも８０％の同一性、好ましくは、少なくとも８５％の同一性、さらに好ましくは、９０％の同一性、さらになお好ましくは、９５％の同一性、またはさらになお好ましくは、９９％の同一性を有する配列である（即ち、ＦＲ１＿改変体 対 ＦＲ１＿参照、ＣＤＲ１＿改変体 対 ＣＤＲ１＿参照、ＦＲ２＿改変体 対 ＦＲ２＿参照、ＣＤＲ２＿改変体 対 ＣＤＲ２＿参照、ＦＲ３＿改変体 対 ＦＲ３＿参照、ＣＤＲ３＿改変体 対 ＣＤＲ３＿参照、ＦＲ４＿改変体 対 ＦＲ４＿参照）。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。免疫グロブリン一本鎖可変ドメインの１つ以上の配列のＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸同一性の程度を決定するために、フレームワーク領域を生成するアミノ酸残基を無視することが理解されるであろう。同様に、本発明の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインの１つ以上の配列のＦＲのアミノ酸配列のアミノ酸同一性の程度を決定するために、相補性領域を生成するアミノ酸残基を無視することが理解されるであろう。免疫グロブリン一本鎖可変ドメインのこのような改変体は、改良された効力／アフィニティを有する場合があるため、特に有利であり得る。

【0096】

非限定例として、置換は、例えば、保存的置換（本明細書に記載されるような）であってもよく、および／またはアミノ酸残基は、別のＶＨＨドメインの同じ位置に天然に生じる別のアミノ酸残基と置き換わってもよい。従って、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインの望ましい特性、または望ましい特性のバランスまたは組み合わせを悪化させない（即ち、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインが、この意図した用途にもはや適していない程度まで）任意の１つ以上の置換、欠失または挿入、またはこれらの任意の組み合わせは、本発明の範囲に含まれる。当業者は、一般的に、本明細書の開示に基づき、適切な置換、欠失または挿入、またはこの適切な組み合わせを、場合により、制限される程度の通常の実験の後、決定し、選択することができ、例えば、多くの可能な置換を導入し、このようにして得られた免疫グロブリン一本鎖可変ドメインの特性に対する影響を決定することを含んでいてもよい。

【0097】

さらに、本発明の範囲に包含されるのは、「多価」形態であり、２つ以上の一価免疫グロブリン一本鎖可変ドメインの結合、化学によって作られるか、または組み換えＤＮＡ技術によって作られる、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインである。多価構築物の非限定例としては、「二価」構築物、「三価」構築物、「四価」構築物などが挙げられる。多価構築物の中に含まれる免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。別の特定の実施形態において、本発明の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、「多価」形態であり、２つ以上の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインを結合することによって作られ、このうち少なくとも１つが異なる特異性を有する。多重特異性構築物の非限定例としては、「二重特異性」構築物、「三重特異性」構築物、「四重特異性」構築物などが挙げられる。これをさらに示すために、任意の多価または多重特異性（本明細書で定義されるような）の本発明の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、同じ抗原上の２種類以上の異なるエピトープ、例えば、ＧＰＣＲの２種類以上の異なるエピトープに適切に指向してもよく、または２種類以上の異なる抗原、例えば、ＧＰＣＲのエピトープおよびＧＰＣＲの天然結合パートナー（例えば、Ｇタンパク質、β−アレスチン）のエピトープに指向してもよい。特に、本発明の一価免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、５００ｎＭ未満、好ましくは、２００ｎＭ未満、さらに好ましくは、１０ｎＭ未満、例えば、５００ｐＭ未満のアフィニティで標的ＧＰＣＲに結合するようなものである。多価または多重特異性の本発明の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、望ましいＧＰＣＲについての結合活性の増加および／または選択性の増加、および／またはこのような多価または多重特異性の免疫グロブリン一本鎖可変ドメインの使用によって得られてもよい任意の他の望ましい特性または望ましい特性の組み合わせを有してもよい（または、このために遺伝子操作されてもよく、および／または選択されてもよい。）。特定の実施形態において、このような多価または多重特異性の本発明の結合ドメインは、ＧＰＣＲのシグナル伝達活性（本明細書をさらに参照）の調整における有効性の向上も有していてもよい（または、このために遺伝子操作されてもよく、および／または選択されてもよい。）。

【0098】

さらに、本発明のキメラポリペプチドを発現するために使用される宿主有機体に依存して、当業者の能力の範囲内であるが、結合ドメイン部分中の欠失および／または置換を、例えば、後翻訳修飾のための１つ以上の部位（例えば、１つ以上のグリコシル化部位）が除去されるような様式で設計してもよい。または、置換または挿入を、官能基の接続（本明細書にさらに記載されるような）のための１つ以上の部位を導入するように設計してもよい。

【0099】

本発明に適切な結合ドメイン部分のスクリーニングおよび選択
好ましい種類の結合ドメイン、特に、本発明のキメラポリペプチドの一部を生成する免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、ＧＰＣＲの機能的な立体構造状態に指向するか、および／またはこれに特異的に結合する（本明細書で上記で記載されるように）。立体構造選択的な結合ドメイン、特に、免疫グロブリン一本鎖可変ドメインは、幾つかの様式で特定することができ、ＶＨＨのための非限定的な様式で、本明細書に以下に示す。好ましくは、立体構造選択的な結合ドメインは、機能的な立体構造状態の（場合により、受容体リガンドに結合した）ＧＰＣＲを用いてラクダを免疫化する工程の後、ＧＰＣＲ（例えば、活性な立体構造状態のＧＰＣＲに指向する抗体を高めるようなアゴニストが結合したＧＰＣＲ）に固有の立体的エピトープを動物の免疫系にさらすために選択されてもよい。場合により、特定のリガンドを、化学的架橋によって目的のＧＰＣＲにカップリングしてもよい。従って、本明細書でさらに記載されるように、このようなＶＨＨ配列は、好ましくは、ラクダ種をＧＰＣＲ、好ましくは、機能的な立体構造状態のＧＰＣＲで適切に免疫化する（即ち、免疫応答を上げるか、および／または前記ＧＰＣＲに指向する重鎖のみの抗体を高めるように）ことによって、前記ラクダ由来の適切な生体サンプル（例えば、血液サンプルまたは任意のＢ細胞のサンプル）を得ることによって、前記サンプルから出発して、前記ＧＰＣＲに指向するＶＨＨ配列を得ることによって、作られるか、または得ることができる。このような技術は、当業者には明確であろう。望ましいＶＨＨ配列を得るためのさらに別の技術は、重鎖のみの抗体を発現する（即ち、免疫応答を上げるか、および／または機能的な立体構造状態のＧＰＣＲに指向する重鎖のみの抗体を高める。）ことができるトラスジェニック哺乳動物を適切に免疫化し、前記トランスジェニック哺乳動物からの適切な生体サンプル（例えば、血液サンプル、または任意のＢ細胞のサンプル）を得て、次いで、これ自体既知の任意の適切な技術を用い、前記サンプルから出発し、前記ＧＰＣＲに指向するＶＨＨ配列を作製することを含む。例えば、この目的のために、ＷＯ０２０８５９４５およびＷＯ０４０４９７９４に記載される重鎖抗体を発現するマウスおよびさらなる方法および技術を使用することができる。

【0100】

ＧＰＣＲで動物を免疫化するために、宿主細胞においてＧＰＣＲの組み換え形態を発現し、アフィニティクロマトグラフィーおよび／または抗体に基づく方法を用いてＧＰＣＲを精製することを使用してもよい従来の方法を用い、ＧＰＣＲを産生し、精製してもよい。具体的な実施形態において、バキュロウイルス／Ｓｆ−９系を発現のために使用してもよいが、他の発現系（例えば、細菌、酵母または哺乳動物細胞系）を使用してもよい。ＧＣＰＲを発現し、精製するための例示的な方法は、例えば、Ｋｏｂｉｌｋａ（１９９５）、Ｅｒｏｇｌｕら（２００２）、Ｃｈｅｌｉｋａｎｉら（２００６）および多くの他の参考文献の中で、特に、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」（Ｋｅｖｉｎ Ｒ． Ｌｙｎｃｈ（Ｅｄ．）、１９９８）という書籍に記載される。ＧＰＣＲは、リン脂質小胞内で再構築されてもよい。同様に、リン脂質小胞内で活性なＧＰＣＲを再構築するための方法が知られており、特に、Ｌｕｃａら（２００３）、Ｍａｎｓｏｏｒら（２００６）、Ｎｉｕら．（２００５）、Ｓｈｉｍａｄａら．（２００２）およびＥｒｏｇｌｕら（２００３）に記載される。特定の場合に、ＧＰＣＲおよびリン脂質は、高リン脂質密度で再構築されてもよい（例えば、リン脂質１ｍｇあたり、１ｍｇの受容体）。具体的な実施形態において、リン脂質小胞を試験し、ＧＰＣＲが活性であることを確認してもよい。多くの場合に、ＧＰＣＲは、両方の配置（通常の配置および細胞内ループが小胞の外側にある「内側が外側になった」配置）で、リン脂質小胞内に存在していてもよい。ＧＰＣＲを用いた他の免疫化方法としては、限定されないが、特に、ＧＰＣＲを発現する完全細胞またはこのフラクションの使用、ＧＰＣＲをコードする核酸配列を用いたワクチン化（例えば、ＤＮＡワクチン化）、ＧＰＣＲを発現するウイルスまたはウイルス様粒子を用いた免疫化が挙げられる（例えば、ＷＯ２０１００７０１４５、ＷＯ２０１１０８３１４１に記載されるような）。

【0101】

任意の適切な動物、特に、哺乳動物、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ、ヒツジ、ウシ、サメ、ブタ、または鳥類、例えば、ニワトリまたはシチメンチョウを、免疫応答を生成するのに適切な当該技術分野でよく知られている任意の技術を用いて免疫化してもよい。

【0102】

非限定的な例として、前記ＧＰＣＲの機能的な立体構造状態の立体的エピトープに特異的に結合するナノボディの選択は、例えば、この表面で重鎖のみの抗体を発現する細胞（例えば、適切に免疫化されたラクダから得られるＢ細胞）のセット、集合またはライブラリー、またはこの表面にｇｅｎＩＩＩおよびナノボディの融合物を表出させるバクテリオファージ、または接合因子タンパク質Ａｇａ２ｐの融合物を表出させる酵母細胞のスクリーニングによって、ＶＨＨ配列またはナノボディ配列の（天然または免疫）ライブラリーのスクリーニングによって、または、ＶＨＨ配列またはナノボディ配列をコードする核酸配列の（天然または免疫）ライブラリーのスクリーニングによって行われてもよく、すべて、これ自体が既知の様式で行われてもよく、方法は、場合により、１つ以上の他の適切な工程、例えば、限定されないが、アフィニティ成熟の工程、望ましいアミノ酸配列を発現する工程、望ましい抗原（この場合には、ＧＰＣＲ）への結合および／または望ましい抗原に対する活性のためのスクリーニング工程、望ましいアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を決定する工程、１以上のヒト化置換を導入する工程、適切な多価および／または多重特異性フォーマットをフォーマットする工程、望ましい生物学的特性および／または生理学的特性をスクリーニングする工程（即ち、当該技術分野で既知の適切なアッセイを用いる。）、および／または１つ以上のこのような工程の任意の適切な順序での組み合わせをさらに含んでいてもよい。

【0103】

種々の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記載され、実施例の章にさらに示されるように、例えば、当該技術分野で一般的な実施である酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、放射性リガンド結合アッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、ファージディスプレイなどを使用し、結合ドメインと標的ＧＰＣＲとの特異的な結合（本明細書で上記で定義されるような）を決定してもよい。この目的のために、本明細書にさらに記載されるように、固有のラベルまたはタグ（例えば、ペプチドラベル、核酸ラベル、化学ラベル、蛍光ラベル、または放射性同位体ラベル）を使用することが多いことが理解されるであろう。

【0104】

立体構造選択的な結合剤を選択する特に好ましい様式は、例えば、ＷＯ２０１２／００７５９３に記載されるとおりである。代替的な好ましい実施形態において、立体構造選択的な結合剤の選択は、例えば、Ｋｒｕｓｅら．（２０１３）に記載されるように、両方ではないが、細胞ソーティングを行い、表面に細胞外結合剤がつなぎ止められた細胞、活性な立体構造のＧＰＣＲまたは不活性な立体構造のＧＰＣＲのいずれかに特異的に結合する細胞のライブラリーを含む細胞集合から選択することによって行うこともできる。限定する目的ではなく、立体構造選択的な結合剤の選択も、実施例の章でさらに説明する。

【0105】

結合ドメインが、一般的に、本発明のキメラポリペプチドに含まれるような特定のＧＰＣＲの天然に生じる類似体または合成類似体、改変体、変異体、対立遺伝子、部分、フラグメントおよびイソ型に、または、本発明のドメインが特定のＧＰＣＲに結合するときの抗原性の決定因子またはエピトープと本質的に同じ１つ以上の抗原性の決定因子またはエピトープを含む特定のＧＰＣＲのこれらの類似体、改変体、変異体、対立遺伝子、部分、フラグメントおよびイソ型に少なくとも結合することができることも予想される。

【0106】

リンカー部分
本発明の文脈で、結合ドメイン部分およびＧＰＣＲ部分（または本明細書でさらに記載されるように、最終的にはさらに他の部分に）は、互いに直接的または間接的に融合してもよく、これによって、間接的なカップリングは、通常は、介在するアミノ酸配列またはリンカー部分の使用を介して起こる。好ましい「リンカー分子」または「リンカー」は、１から２００アミノ酸長のペプチドであり、典型的には、必須ではないが、組織化されておらず、柔軟性を有するように選択されるか、または設計される。例えば、特定の二次構造を生成しないアミノ酸を選択することができる。または、アミノ酸は、安定な三次構造を生成しないように選択することができる。または、アミノ酸リンカーは、ランダムコイルを生成してもよい。このようなリンカーとしては、限定されないが、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕまたは天然タンパク質の組織化されていない領域と関係があることが多いさらなるアミノ酸を豊富に含む合成ペプチドが挙げられる（Ｄｏｓｚｔａｎｙｉ，Ｚ．、Ｃｓｉｚｍｏｋ，Ｖ．、Ｔｏｍｐａ，Ｐ．、＆Ｓｉｍｏｎ，Ｉ．（２００５）．ＩＵＰｒｅｄ：ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｅｎｅｒｇｙ ｃｏｎｔｅｎｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、２１（１６）、３４３３−４）。非限定例としては、（ＧＳ）_５または（ＧＳ）_１０が挙げられる。適切なリンカー配列の他の非限定例も、実施例の章に記載される。

【0107】

多くの場合、必須ではないが、有効分子内濃度（本明細書で定義されるような）は、ＧＰＣＲ−結合ドメイン融合物のリンカーの長さによって変わるであろう。従って、最適なリンカー長は、有効分子内濃度が最大値に達するように選択されるであろう。好ましくは、アミノ酸リンカー配列は、タンパク質分解開裂の起こりやすさが少なく、キメラポリペプチドの生体活性を妨害しない。

【0108】

従って、特定の実施形態によれば、アミノ酸（ＡＡ）リンカー配列は、０から２００ＡＡ、０から１５０ＡＡ、０から１００ＡＡ、０から９０ＡＡ、０から８０ＡＡ、０から７０ＡＡ、０から６０ＡＡ、０から５０ＡＡ、０から４０ＡＡ、０から３０アミノ酸、０から２０ＡＡ、０から１０アミノ酸、０から５アミノ酸のペプチドである。短いリンカーの配列の例としては、限定されないが、ＰＰＰ、ＰＰまたはＧＳが挙げられる。

【0109】

特定の用途のために、１つ以上の特定の配列モチーフを含むか、またはこの配列モチーフからなることが有利であり得る。例えば、タンパク質分解開裂部位が、ＧＰＣＲ部分および結合ドメイン部分を放出することができるようにリンカー分子に導入されてもよい。有用な開裂部位は、当該技術分野で知られており、プロテアーゼ開裂部位、例えば、配列ＩＥＧＲ（配列番号４７）を有するＦａｃｔｏｒ Ｘａ開裂部位、配列ＬＶＰＲ（配列番号４８）を有するトロンビン開裂部位、配列ＤＤＤＤＫ（配列番号４９）を有するエンテロキナーゼ開裂部位、またはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（または３Ｃ）開裂部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号５０）を含む。

【0110】

結合ドメイン部分およびＧＰＣＲ部分が、タンパク質改変のための化学酵素方法を用いて接続する場合には、リンカー部分は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで共有結合によるキメラを生成するために用いられる酵素または合成化学に依存して、異なる化学部分が存在していてもよい（Ｒａｂｕｋａ ２０１０）。

【0111】

他の部分および改変
本発明のキメラポリペプチドは、さらに改変されてもよく、および／または本明細書でさらに記載するように、他の部分を含んでいてもよい（またはさらに他の部分に融合していてもよい。）。改変の例、および改変可能な（即ち、タンパク質の骨格のいずれかで、好ましくは側鎖で）本発明のキメラポリペプチド内のアミノ酸残基、このような改変を導入するために使用可能な方法および技術、およびこのような改変の潜在的な用途および利点の例は、当業者には明らかであろう。例えば、このような改変は、１つ以上の官能基、残基または部分を、キメラポリペプチドの内部または表面に、特に、結合ドメイン部分の内部または表面に、またはＧＰＣＲ部分の内部または表面に、および／または場合によりリンカー部分の内部または表面に（例えば、共有結合または別の適切な様式で）導入することを含んでいてもよい。このような官能基およびこのような官能基を導入する技術の例は、当業者には明らかであると思われ、一般的に、当該技術分野で述べられるすべての官能基および技術、および医薬タンパク質の改変のため、特に、抗体または抗体フラグメント（ＳｃＦｖおよび一本鎖ドメイン抗体を含む）の改変のためのこれ自体が既知の官能基および技術を含み、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８０）が参照される。このような官能基は、これも当業者に明らかなように、例えば、キメラポリペプチドに直接的に（例えば、共有結合によって）接続してもよく、または場合により、適切なリンカーまたはスペーサーを介して接続してもよい。通常のあまり好ましくない改変は、本発明のキメラポリペプチドを発現するために用いられる宿主細胞に依存して、通常は翻訳と同時および／または翻訳後の改変の一部としてのＮ接続したグリコシル化またはＯ接続したグリコシル化である。さらに別の改変は、ラベルが付されたキメラポリペプチドの意図した使用に依存して、１つ以上の検出可能なラベルまたは他のシグナルを生成する基または部分の導入を含んでいてもよい。適切なラベル、およびラベルを接続し、用い、検出するための技術は、当業者に明らかであると思われ、例えば、限定されないが、蛍光ラベル（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンおよび蛍光金属、例えば、Ｅｕまたはランタノイド族からのその他の金属）、燐光ラベル、化学発光ラベルまたは生物発光ラベル（例えば、ルミナール、イソルミノール、発光性アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンまたはＧＦＰおよびこの類似体）、放射性同位体、金属、金属キレートまたは金属カチオン、またはｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｔｕでの検出およびイメージングに使用するのに特に適した他の金属または金属カチオン、および発色団および酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ）が挙げられる。他の適切なラベルは、当業者に明らかであると思われ、例えば、ＮＭＲまたはＥＳＲ分光法を用いて検出可能な部分が挙げられる。特定のラベルの選択肢に依存して、このようなラベルが付された本発明のキメラポリペプチドを、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕのアッセイ（これ自体が知られているイムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の「サンドイッチアッセイ」など）およびｉｎ ｖｉｖｏターゲティングおよびイメージングの目的で使用してもよい。当業者には明らかなように、別の改変は、例えば、上記で言及された金属または金属カチオンのいずれかをキレート化するためのキレート化基の導入を含んでいてもよい。適切なキレート化基としては、例えば、限定されないが、ジエチル−エントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。さらに別の改変は、特定の結合対（例えば、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対）の一部である官能基の導入を含んでいてもよい。このような官能基を使用し、結合対の片方の半分に結合する（即ち、結合対の生成によって）別のタンパク質、ポリペプチドまたは化学化合物に対し、本発明のキメラポリペプチドを接続してもよい。例えば、本発明のキメラポリペプチドは、ビオチンにコンジュゲート化してもよく、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲート化した別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体に接続してもよい。例えば、このようなコンジュゲート化したキメラポリペプチドを、例えば、検出可能なシグナルを生成する薬剤がアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲート化される検出可能な系において、レポーターとして使用してもよい。例えば、このような結合対を使用し、本発明のキメラポリペプチドを担体（医薬用途に適切な担体）に結合してもよい。ある非限定的な例は、ＣａｏおよびＳｕｒｅｓｈ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、８、４、２５７（２０００）に記載されるリポソーム配合物である。このような結合対を使用し、本発明のキメラポリペプチドに治療に活性な薬剤を接続してもよい。

【0112】

キメラポリペプチドを含む組成物
本発明のキメラポリペプチドは、他の分子（特に、受容体リガンド（例えば、全アゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、バイアスアゴニスト、天然結合パートナーなど）を含め、リガンド）を含んでいてもよい（または、これらに融合していてもよい。）。従って、一態様によれば、本発明は、本明細書で上記したようなキメラポリペプチドと、受容体リガンドとを含む複合体も想定する。非限定的な例として、安定な複合体をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製してもよい。好ましい実施形態において、本発明の複合体は、可溶化した形態、例えば、洗剤に可溶化した形態である。代替的な好ましい実施形態において、本発明の複合体は、固体支持材に固定化される。固体支持材および固定化のための方法および技術の非限定例は、詳細な説明にさらに記載される。さらに別の実施形態において、本発明の複合体は、有機体、組織、細胞、細胞株、または膜組成物、または前記有機体、組織、細胞または細胞株から誘導されるリポソーム組成物を含む、細胞組成物である。膜またはリポソーム組成物の例としては、限定されないが、細胞小器官、膜調製物、ウイルス、ウイルス様の脂質粒子（ＶＬＰ）などが挙げられる。細胞組成物、または膜またはリポソーム組成物が、天然または合成の脂質を含んでいてもよいことが理解されるであろう。さらに別の好ましい実施形態において、複合体は、結晶性である。このため、複合体の結晶および前記結晶を製造する方法も提供され、以下にもっと詳細に記載される。好ましくは、本発明のキメラポリペプチドと受容体リガンドとを含む複合体の結晶性形態が想定される。

【0113】

従って、本発明は、上述のようなキメラポリペプチドまたは複合体を含む膜またはリポソーム組成物にも関する。膜組成物は、組織、細胞または細胞株から誘導されてもよく、キメラポリペプチドの十分な機能が保持されている限り、細胞小器官、膜抽出物またはこのフラクション、ＶＬＰ、ウイルスなどが挙げられる。

【0114】

発現系
別の態様において、本発明は、本明細書で上記されるような本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。特定の実施形態によれば、本発明は、本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子に関し、核酸は、５’から３’にかけて、
・シグナルペプチド、
・エピトープタグ、
・プロテアーゼ開裂部位、
・目的のＧＰＣＲ、
・目的のＧＰＣＲを標的とする立体構造選択的な結合ドメイン
をコードする。

【0115】

または、別の特定の実施形態によれば、本発明は、本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子に関し、核酸は、５’から３’にかけて、
・シグナルペプチド、
・エピトープタグ、
・プロテアーゼ開裂部位、
・目的のＧＰＣＲを標的とする立体構造選択的な結合ドメイン、
・目的のＧＰＣＲ
をコードする。

【0116】

このような核酸分子は、実施例の章でさらに例示される。

【0117】

さらに、本発明は、本発明の任意のキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターを発現する宿主細胞も想定する。適切な発現系としては、細菌または酵母、ウイルス発現系、例えば、バキュロウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびレンチウイルスにおける恒常的な発現系および誘発可能な発現系、または昆虫または哺乳動物細胞における一時的なトランスフェクションが挙げられる。本発明のキメラポリペプチドのクローニングおよび／または発現は、当業者に知られている技術に従って行うことができる。

【0118】

本発明の「宿主細胞」は、任意の原核有機体または真核有機体であってもよい。好ましい実施形態によれば、宿主細胞は、真核細胞であり、任意の真核有機体であってもよいが、特定の実施形態において、酵母、植物、哺乳動物および昆虫細胞が想定される。使用される細胞の性質は、典型的には、キメラポリペプチドを産生する容易さおよび費用、望ましいグリコシル化特性、キメラポリペプチドの由来、意図した用途、またはこれらの任意の組み合わせによって変わる。哺乳動物細胞は、例えば、複合体のグリコシル化を達成するために使用されてもよいが、哺乳動物細胞系でタンパク質を産生するのは、費用対効果がよくない場合がある。植物および昆虫細胞、および酵母は、典型的には、高い産生レベルを達成し、もっと費用対効果が高いが、哺乳動物タンパク質の複雑なグリコシル化パターンを模倣するために、さらなる改変が必要であり得る。酵母細胞は、経済的に培養することができ、高い収率の（媒体に分泌した）タンパク質を与え、適切に改変された場合、適切なグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生することができるため、タンパク質発現のために用いられることが多い。さらに、酵母は、迅速な形質転換、試験されるタンパク質の局在化方法論および容易な遺伝子ノックアウト技術を可能にする確立した遺伝子を与える。昆虫細胞が、哺乳動物のＧＰＣＲシグナル伝達を妨害することなく発現系を与えるため、昆虫細胞は、ＧＰＣＲを発現するために魅力的な系でもある。タンパク質産生のための真核細胞または細胞株は、当該技術分野でよく知られており、改変されたグリコシル化経路を有する細胞を含み、非限定例は、本明細書で以下に与える。

【0119】

その後の単離および／または精製のためのタンパク質の内包、発現および産生に適切な動物または哺乳動物の宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎら、１９８６；Ｋｏｌｋｅｋａｒら、１９９７）、ＣＨＯ−Ｋ１ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＨＯと命名したＥＣＡＣＣ ８５０５０３０２（ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ＣＨＯクローン１３（ＧＥＩＭＧ、Ｇｅｎｏｖａ、ＩＴ）、ＣＨＯクローンＢ（ＧＥＩＭＧ、Ｇｅｎｏｖａ、ＩＴ）、ＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦと命名したＥＣＡＣＣ ９３０６１６０７（ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ＲＲ−ＣＨＯＫ１と命名したＥＣＡＣＣ ９２０５２１２９（ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼネガティブＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、１９８０）およびｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（米国特許第５，７２１，１２１号）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）；ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、２９３細胞、または２９３Ｔ細胞、または懸濁培養物中で成長させるためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、１９７７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、またはＧｎＴＩ ＫＯ ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、Ｒｅｅｖｅｓら、２００２）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７；ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、１９８０、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３−２５１）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７５）；ヒト幹細胞癌細胞（ＨＥＰ−Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−５１）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４４２）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ、１９８２）；ＭＣＲ ５細胞；ＦＳ４細胞が挙げられる。特定の実施形態によれば、細胞は、Ｈｅｋ２９３細胞またはＣＯＳ細胞から選択される哺乳動物細胞である。

【0120】

例示的な非哺乳動物細胞株としては、限定されないが、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞／バキュロウイルス発現系（例えば、Ｊａｒｖｉｓの総説、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３１０、Ｉｓｓｕｅ １、２００３年５月２５日、ページ１−７）、植物細胞、例えば、タバコ細胞、トマト細胞、トウモロコシ細胞、藻類細胞、または酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種、Ｙａｒｒｏｗｉａ種またはＰｉｃｈｉａ種が挙げられる。特定の実施形態によれば、真核細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種（例えば、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｙａｒｒｏｗｉａ種（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、Ｐｉｃｈｉａ種（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、またはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ種（例えば、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来の酵母細胞である。特定の実施形態によれば、真核細胞は、Ｐｉｃｈｉａ細胞であり、最も特定の実施形態において、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞である。

【0121】

標的細胞（例えば、哺乳動物細胞）のトランスフェクションは、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｖｏｌｕｍｅ ３、Ｃｈａｐｔｅｒ １６、Ｓｅｃｔｉｏｎ １６．１−１６．５４）によって概説される原理に従って行うことができる。これに加え、ウイルス形質導入は、試薬、例えば、アデノウイルスベクターを用いて行うこともできる。適切なウイルスベクター、制御領域および宿主細胞の選択は、当業者のレベルの範囲内の一般的な知識である。得られるトランスフェクションされた細胞は、培地内に維持されるか、または標準的な実施に従うその後の使用のために凍結される。

【0122】

従って、本発明の別の態様は、本発明のキメラポリペプチドを製造するための方法に関し、この方法は、少なくとも、
（ａ）適切な細胞発現系（本明細書で上記で定義されるような）中、本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸を発現する工程と、任意選択により、
（ｂ）前記キメラポリペプチドを単離し、および／または精製する工程と
を含む。

【0123】

従って、上記した立体構造が拘束されたキメラポリペプチドは、スクリーニングおよび薬物開発（この最も広い意味で）のために特に有用な新規の単一のタンパク質ツールと考えることができ、これらをすべて本明細書でさらに詳細に記載する。

【0124】

適用
本明細書に記載するキメラポリペプチドおよびこれをコードする核酸、複合体、細胞およびこれらから誘導される細胞組成物を、種々の文脈および用途で使用することができ、例えば、限定されないが、（１）一本鎖タンパク質としてのキメラポリペプチドの直接的な分離および／または精製、ここで、目的のＧＰＣＲは、目的の立体構造で恒常的な様式で安定化される、（２）本発明のキメラポリペプチドを利用することによる、ＧＰＣＲの結晶化研究および高解像度構造分析のため、（３）リガンドスクリーニングおよび（構造に基づく）薬物開発のため、（４）細胞表面または別の細胞膜フラクション中、目的の立体構造で一本鎖融合タンパク質としてＧＰＣＲを安定に恒常的に発現するために使用することができ、これらはすべて、本明細書にさらに詳細に記載される。

【0125】

分離および精製方法
本発明の鍵となる利点の１つは、ＧＰＣＲを、ＧＰＣＲと結合ドメインの化学量論量が定義される１：１で、目的の立体構造で分離し、精製することができることである。本発明の特定の利点は、キメラポリペプチド中の結合ドメインを、非常に高い有効分子内濃度で、リガンドが存在しない状態であっても、特定の受容体立体構造で安定化することができることである。これに加え、当業者は、折り畳まれた状態のＧＰＣＲに選択的に結合する結合ドメインが、このＧＰＣＲを化学物質または熱による変性から保護し、このため、立体構造安定性および／または熱安定性が高まることを認識するであろう。従って、キメラポリペプチドを、混合物から分離し、場合により、一本鎖タンパク質として精製することができ、受容体は、結合ドメインによって安定化される立体構造に適合する。この分離され、精製されたキメラポリペプチドは、非常に有用であり、特に、その後の結晶化、リガンドの特性決定および化合物スクリーニング、免疫化のための直接的なツールである。

【0126】

従って、本発明は、ＧＰＣＲに特異的に結合する結合ドメインに融合したＧＰＣＲを含むキメラポリペプチドを分離および／または精製する方法を想定し、この方法は、任意の適切な手段によって、キメラポリペプチドを分離および／または精製する工程を含む。

【0127】

または、第１に、本明細書で上記されるようなキメラポリペプチドと受容体リガンド（例えば、オルソステリックリガンド、アロステリックリガンド、天然の結合タンパク質、例えば、Ｇタンパク質など）との複合体を生成することが望ましく、次いで、その後に分離し、最終的に精製してもよい。

【0128】

従って、本発明は、キメラポリペプチドと受容体リガンドとの複合体を分離および／または精製する方法も想定し、この方法は、任意の適切な手段によって、キメラポリペプチドを分離および／または精製する工程を含む。

【0129】

本質的に、ＧＰＣＲ（上記を参照）を産生し、精製するために一般的に用いられるのと同じ方法を、本発明のキメラポリペプチドの産生および精製に等しく使用することができる。上述のキメラポリペプチドを単離／精製するための方法としては、限定されないが、アフィニティに基づく方法、例えば、特に、アフィニティクロマトグラフィー、アフィニティ精製、免疫沈降、タンパク質検出、免疫化学、表面ディスプレイ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーが挙げられ、すべて当該技術分野でよく知られている。例えば、キメラポリペプチドは、宿主細胞中に組み換え形態で発現し、その後、アフィニティクロマトグラフィーおよび／または抗体に基づく方法を用いて精製することができる。具体的な実施形態において、バキュロウイルス／Ｓｆ−９系を発現に使用してもよいが、他の発現系（例えば、細菌、酵母または哺乳動物細胞系）を使用してもよい（本明細書にさらに記載されるような）。

【0130】

結晶学および構造に基づく薬物設計の適用
本発明の一態様は、ＧＰＣＲのＸ線結晶学における本発明のキメラポリペプチドの有用性および構造に基づく薬物設計におけるこの適用に関する。

【0131】

ＧＰＣＲを含む膜タンパク質の結晶化には、依然として課題がある。発現方法および精製方法は、ミリグラム量の生成は可能なようであるが、これらの分子を用いて安定性を達成することは、特に、これらのタンパク質が複数の立体構造を取り得るという観点で、おそらく克服するのが最も困難な障害である。洗剤で可溶化したＧＰＣＲの受容体安定性を高めると、ＧＰＣＲのタンパク質分解および／または凝集を防ぎ、この精製を促進し、正しく折り畳まれたタンパク質の均質なサンプルの濃縮を促進する。当業者は、このようなサンプルが、回折結晶の生成のために好ましい出発点であることを認識するであろう。

【0132】

結晶化工程自体は、Ｘ線結晶学による高分子構造の決定工程において、別の大きな障害である。結晶化の成功には、核の生成およびその後の適切な大きさの結晶への成長を必要とする。結晶の成長は、一般的に、均質な核生成の結果として過飽和溶液中で自然に起こる。タンパク質は、典型的なスパースマトリックススクリーニング実験で結晶化されてもよく、沈殿剤、添加剤およびタンパク質の濃度を広範囲にサンプリングし、特定のタンパク質のための核生成および結晶成長に適切な過飽和状態を特定することができる。これに関連して、スパースマトリックススクリーニング手法は、例えば、タンパク質に結合するリガンドを加えることによって、または、異なる突然変位を作り出すことによって（優先的には、標的タンパク質の表面残基において）、または標的タンパク質の異なる種類のオルソログを結晶化させようと試みることによって、タンパク質自体の構造多様性を作り出すことである。

【0133】

結晶化は、結晶格子内に並べられる分子の立体構造エントロピーの望ましくない低下を含むので、溶液中に存在しながら標的の立体構造エントロピーを下げる方法は、格子形成の正味のエントロピーの損失を下げることによって、結晶化の可能性を高めるべきである。「表面エントロピー低下」手法は、非常に効果的であることがわかっている（Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ ２００４）。同様に、結合対（例えば、イオン、低分子リガンドおよびペプチド）は、タンパク質の立体構造状態の部分集合に結合し、これを安定化することによって、立体構造の不均一性を減らすことができる。このような結合対は効果的ではあるが、すべてのタンパク質に既知の結合パートナーがあるわけではなく、結合パートナーが知られている場合であっても、このアフィニティ、溶解度および化学安定性が、結晶化の試みに合わない場合もある。

【0134】

高解像度の構造研究のためのＧＰＣＲの結晶化は、これらのタンパク質の表面が両親媒性であるため、特に困難である。膜二重層に包まれ、タンパク質とリン脂質のアシル鎖との接触部位は疎水性であり、一方、極性表面が、脂質の極性の頭部基および水相にさらされる。十分に整列した三次元結晶を得るために、高解像度でのＸ線構造分析に必要な条件は、ＧＰＣＲが、洗剤の助けを借りて可溶化し、タンパク質−洗剤複合体として精製されることである。洗剤ミセルは、ベルト状の様式で膜タンパク質の疎水性表面を覆う（ＨｕｎｔｅおよびＭｉｃｈｅｌ ２００２；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、１９９５）。ＧＰＣＲ−洗剤複合体は、隣接するタンパク質分子間の接触が、洗剤ミセルから飛び出したタンパク質の極性表面によって作られる、三次元構造を生成する（Ｄａｙら、２００７）。明らかに、洗剤ミセルは、結晶格子内に空間を必要とする。ミセル間の引力相互作用が、結晶の充填を安定化し得るが（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２００７）、これらの相互作用は、強固な結晶の接触点を生じない。ＧＰＣＲを含む多くの膜タンパク質は、比較的小さいか、または非常に柔軟性の高い親水性ドメインを含むため、十分に整列した結晶がゲル化する確率を高める戦略は、タンパク質の極性表面を広げ、および／またはこの柔軟性を下げることである。ほとんどの生理学的手法は、Ｇタンパク質またはアレスチンのような天然のシグナル伝達パートナーを使用することである。残念なことに、ＧＰＣＲとＧタンパク質またはアレスチンとの相互作用は、非常に脂質依存性であり、結晶学のための十分な安定性を有する複合体を生成することは困難であった。

【0135】

従って、結合ドメインが、非常に高い有効分子内濃度でＧＰＣＲの立体的エピトープに結合するため、受容体を安定化し、立体構造の自由度を下げ、この極性表面を増加させ、強固な１：１の受容体−結合ドメイン融合物の結晶化を促進することが、本発明のキメラポリペプチドの特定の利点である。本発明のキメラポリペプチドは、リガンドが存在しない状態で結晶化させることができることが特に利点である。

【0136】

驚くべきことに、本発明のキメラポリペプチドを、定義された１：１の化学量論量で立体構造選択的な結合ドメインに融合することによって、選択したＧＰＣＲでの立体構造の不均一性を最小限にすることによって、十分に並んだ結晶を得る確率を高めるためのツールとして使用することができることがわかった。従って、一実施形態によれば、結晶化の目的のために本発明のキメラポリペプチドを使用することが想定される。有利には、結晶は、融合タンパク質の一部を生成する立体構造選択的な結合ドメインの選択によって確保されるように、ＧＰＣＲが特定の受容体立体構造に、さらに特定的には、治療に関連する受容体立体構造（例えば、活性な立体構造）に捕捉された融合タンパク質から作ることができる。結合ドメインは、十分に並んだ結晶を成長させるためにＧＰＣＲに結合すると、細胞外領域の自由度も減らすであろう。ナノボディを含む免疫グロブリンの一本鎖可変ドメインは、立体的エピトープに結合し、単一の強固な球状ドメインで構成され、従来の抗体または誘導されたフラグメント（例えば、Ｆａｂ’）とは異なり、柔軟性の高いリンカー領域がないため、特に、この目的に適している。

【0137】

従って、好ましい実施形態によれば、本発明は、ＧＰＣＲを結晶化し、最終的に、この構造を解明するための直接的なツールとして有用な、結合ドメインに融合したＧＰＣＲを含むキメラポリペプチドを提供する。特定の実施形態によれば、本発明は、キメラポリペプチドと受容体リガンド（本明細書で以下に定義されるような）の複合体を結晶化させることも想定する。上の方法の特に好ましい実施形態において、キメラポリペプチドまたは複合体に含まれるＧＰＣＲは、活性な状態の立体構造で、低分子または生物学的物質を用いて標的化するのに適切な新しい構造特徴を示し、活性な立体構造に選択的な化合物の特定が可能になるであろう。特に、これらの新しい構造特徴は、オルソステリック部位またはアロステリック部位で起こってもよく、それぞれ、新しい立体構造特異的なオルソステリック化合物またはアロステリック化合物またはこれらのフラグメントを開発することができる。別の実施形態において、キメラポリペプチドまたは複合体に含まれるＧＰＣＲは、不活性な状態の立体構造（インバースアゴニストに対するアフィニティの増加および／または拘束されていないＧＰＣＲと比較して、アゴニストに対するアフィニティの減少を特徴とする。）、または、β−アレスチン依存性シグナル伝達を導く機能的な立体構造である（拘束されていないＧＰＣＲと比較して、β−アレスチンのバイアスアゴニストに対するアフィニティの増加を特徴とする。）。

【0138】

従って、本発明のキメラポリペプチドは、場合により、受容体リガンドとの複合体の状態であり、膜タンパク質のための任意の種々の専門的な結晶化方法を用いて結晶化してもよく、この多くは、Ｃａｆｆｒｅｙ（２００３および２００９）にまとめられている。一般的な観点で、この方法は、結晶化前に複合体に脂質を加えることを含む、脂質に基づく方法である。このような方法は、以前から、他の膜タンパク質を結晶化するために使用されてきた。脂質立方相の結晶化方法およびバイセル結晶化方法を含むこれらの多くの方法は、脂質が自然に自己整列する特性と、小胞としての洗剤（小胞融合方法）、円板状ミセル（バイセル方法）および液晶または中間相（中間相または立法相の方法）を利用する。脂質立方相の結晶化方法は、例えば、Ｌａｎｄａｕら、１９９６；Ｇｏｕａｕｘ １９９８；Ｒｕｍｍｅｌら、１９９８；Ｎｏｌｌｅｒｔら、２００４、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ａ，ｂに記載され、これらの刊行物は、これらの方法を開示するために参照により組み込まれる。バイセル結晶化方法は、例えば、Ｆａｈａｍら、２００５；Ｆａｈａｍら、２００２に記載され、これらの刊行物は、これらの方法を開示するために参照により組み込まれる。

【0139】

別の実施形態によれば、本発明は、ＧＰＣＲ−結合ドメイン融合物（場合により、さらに受容体リガンドを含む）の構造を解明するための本明細書に記載するようなキメラポリペプチドの使用に関する。「構造を解明する」とは、本明細書で使用する場合、原子の配置またはタンパク質の原子軌道を決定することを指し、多くは、生物物理学的方法、例えば、Ｘ線結晶学によって行われる。

【0140】

多くの場合に、回折品質の結晶を得ることは、この原子解像構造を解明するための鍵となる障害である。従って、特定の実施形態によれば、ＧＰＣＲ−結合ドメイン融合物の結晶構造を解明することができるため、本明細書に記載されるキメラポリペプチドを使用し、結晶の回折品質を高めることができる。

【0141】

さらに、例えば、ＧＰＣＲ薬物開発の助けとなるようにＧＰＣＲ標的の構造情報を得ることは、非常に望ましい。もっと多くのＧＰＣＲの結晶化以外に、特に、受容体の構造を獲得するための方法は、薬理学的活性または生体活性を有するリード化合物に結合し、効力、選択性または薬理学的パラメータを高めるために、この化学構造を、化学的改変の出発点として使用する。当業者は、この結合ドメインは、立体構造選択的な化合物に対するアフィニティを実質的に高めることができるため、本発明のキメラポリペプチドが、結合ドメインによって誘発される、主要なものではない機能的な立体構造（基本立体構造とは異なる。）に選択的なリード化合物を用いた共結晶化に特に適していることを理解するであろう。

【0142】

別の実施形態によれば、本発明は、定義された１：１の化学量論量の受容体と結合ドメインから出発し、リガンドが存在しない状態でキメラポリペプチドを結晶化することができ、非常に高い有効分子内濃度の立体構造選択的な結合ドメインが、結晶格子内の望ましい立体構造で受容体を安定化することができる。当業者は、このようにしてあらかじめ作られた、特定の機能的な立体構造で安定化された、遊離受容体の結晶が、浸漬実験の理想的な出発点であり、結合ドメインによって誘発される立体構造で受容体を結合するフラグメントまたは化合物との複合体で受容体の構造を解明するのに役立つことを認識するであろう。

【0143】

別の実施形態によれば、本発明は、ＧＰＣＲ−結合ドメイン融合物を含むキメラポリペプチドの結晶構造を決定する方法を包含し、この方法は、
（ａ）本発明のキメラポリペプチドを提供する工程と、
（ｂ）キメラポリペプチドを結晶化する工程と
を含む。

【0144】

結晶構造を決定する上記の方法の特定の実施形態において、ＧＰＣＲ−結合ドメイン融合物を含むキメラポリペプチドは、さらに、受容体リガンド、さらに具体的には、ＧＰＣＲに結合したアゴニスト、インバースアゴニストなどを含む。

【0145】

上述の結晶構造を決定することは、Ｘ線結晶学のような生物物理学的方法を用いて行われてもよい。この方法は、結晶の原子軌道を得るための方法をさらに含んでいてもよい（本明細書で以下に定義されるような）。

【0146】

リガンドスクリーニングおよび薬物開発
他の用途は、特に、本発明のキメラポリペプチドを利用することによって、または、有利には、本発明のキメラポリペプチドを含む宿主細胞または細胞培養物を直接利用することによって、またはこれらから誘導される膜調製物を使用することによって、化合物スクリーニングおよび免疫化を含め、想定され、本明細書にさらに記載される。

【0147】

化合物スクリーニングの工程、リード化合物の最適化および薬物開発（抗体の開発を含む）において、もっと迅速で、もっと効果的で、高価ではなく、特に、情報が豊富に得られる、種々の化合物の特徴および種々の細胞経路に対する影響（即ち、有効性、特異性、毒性および薬物代謝）に関する同時の情報を与えるスクリーニングアッセイの必要性が存在する。従って、潜在的な新しい薬物候補物質となり得る、目的のタンパク質の新しい特異的なリガンド、好ましくは、立体構造特異的なリガンドを特定するために、非常に多くの化合物を迅速に安価にスクリーニングする必要性が存在する。本発明は、１：１の化学量論量で共有結合した立体構造選択的な結合ドメインの非常に高い有効分子内濃度に起因して、薬となり得る主要ではない立体構造で安定化されたＧＰＣＲ薬物標的を与えることによって、この問題を解決する。これにより、アゴニストプロフィール、インバースアゴニストプロフィール、アンタゴニストプロフィール、バイアスアゴニストプロフィールなどを有するリガンドなどの異なる機能プロフィールを有するリガンドを、単一のアッセイにおいて、迅速に信頼性高く特定し、識別することができ、この結果、望ましい薬理特性を有するリガンドを特定する速度および可能性が高まる。特に、キメラポリペプチドおよびこれを含む宿主細胞、およびこれらから誘導される宿主細胞培養物または膜調製物が提供され、このために、特定の好ましいものが本明細書で上記され、この目的に特に適している。従って、これらのキメラポリペプチド、宿主細胞およびこれらから誘導される宿主細胞培養物または膜調製物を、種々の文脈でのスクリーニングのための免疫原または選択試薬として選択することができる。

【0148】

従って、好ましい実施形態によれば、本発明は、ＧＰＣＲの立体構造選択的な化合物のスクリーニングおよび／または特定プログラムにおける、本明細書で上記されるような、本発明のキメラポリペプチド、宿主細胞、宿主細胞培養物、またはこれらから誘導される膜調製物の使用を包含し、最終的に、潜在的な新しい薬物候補物質に導かれ得る。

【0149】

一実施形態によれば、本発明は、立体構造選択的な化合物を特定する方法を想定し、この方法は、
（ｉ）本発明のキメラポリペプチドを提供する工程と、
（ｉｉ）試験化合物を提供する工程と、
（ｉｉｉ）キメラポリペプチドに含まれるＧＰＣＲに対する試験化合物の選択的な結合を評価する工程と、
（ｉｖ）立体構造選択的な化合物を選択する工程と
を含む。

【0150】

キメラポリペプチド、宿主細胞、宿主細胞培養物およびこの膜調製物の具体的な好ましいものは、本発明の上記の態様に関し、上記で定義されるとおりである。

【0151】

上記の方法の特定の実施形態において、立体構造選択的な化合物は、キメラポリペプチドに含まれるＧＰＣＲの活性な立体構造に選択的な化合物である。上記の方法の別の具体的な実施形態において、立体構造選択的な化合物は、キメラポリペプチドに含まれるＧＰＣＲの不活性な立体構造に選択的な化合物である。上記の方法のさらに別の実施形態において、立体構造選択的な化合物は、β−アレスチン依存性シグナル伝達を導く機能的な立体構造、または目的の他の任意の機能的な立体構造に選択的な化合物である。

【0152】

好ましい実施形態において、本明細書にさらに記載される任意のスクリーニング方法で使用されるようなキメラポリペプチドは、全細胞、または細胞（細胞小器官）抽出物、例えば、膜抽出物またはこのフラクションとして与えられ、または、脂質層または小胞（天然および／または合成の脂質を含む）、高密度脂質粒子、または任意のナノ粒子、例えば、ナノディスクに組み込まれてもよく、または、ウイルスまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）として与えられ、この結果、それぞれのタンパク質の十分な機能性が保持される。膜フラグメントまたは膜−洗剤抽出物からＧＰＣＲ含有キメラポリペプチドを調製するための方法は、Ｃｏｏｐｅｒ（２００４）に詳細にまとめられており、本明細書に参照により組み込まれる。または、キメラポリペプチドを洗剤で可溶化してもよい。

【0153】

薬物開発のためのスクリーニングは、固体相（例えば、ビーズ、カラム、スライド、チップまたはプレート）または溶液相のアッセイ、例えば、結合アッセイ、例えば、放射性リガンド結合アッセイであってもよい。高スループットアッセイにおいて、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのフォーマットで、数千までの異なる化合物を１日にスクリーニングすることができる。例えば、マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルを使用し、選択された潜在的な調整剤に対し、別個のアッセイを行ってもよく、または、濃度またはインキュベーション時間の影響が観察される場合には、５から１０ウェルごとに１種類の調整剤を試験することができる。従って、単一のマイクロタイタープレートは、約９６種類の調整剤をアッセイすることができる。１日に多くのプレートをアッセイすることができ、今日、約６．０００まで、２０．０００まで、５０．０００までまたはもっと多い異なる化合物のアッセイスクリーニングが可能である。

【0154】

例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹにおいて、当該技術分野での一般的な実務である、例えば、フローサイトメトリー、放射性リガンド結合アッセイ、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴アッセイ、チップに基づくアッセイ、イムノサイトフルオレッセンス、酵母ツーハイブリッド技術およびファージディスプレイを含む種々の方法を用い、安定化されたＧＰＣＲと試験化合物との結合を決定してもよい。試験化合物と膜タンパク質との結合を検出する他の方法としては、イオンスプレー質量分光法／ＨＰＬＣ方法を伴う限外濾過、または他の（生物）物理学的方法および分析方法が挙げられる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）方法（例えば、当業者によく知られているもの）を使用してもよい。化合物に関連する固有のラベルまたはタグ（例えば、本明細書にさらに記載されるようなペプチドラベル、核酸ラベル、化学ラベル、蛍光ラベル、または放射性同位体ラベル）を用い、結合した試験化合物を検出することができることが理解されるであろう。

【0155】

一実施形態において、この化合物が、受容体リガンド（本明細書で定義されるような）に対する、キメラポリペプチドに含まれるようなＧＰＣＲの結合を変えるかどうかを決定する。本明細書に記載されるような当該技術分野で知られている標準的なリガンド結合方法を用い、このリガンドに対するＧＰＣＲの結合をアッセイすることができる。例えば、リガンドは、放射性標識または蛍光標識されていてもよい。このアッセイは、全細胞で、または細胞から得られる膜で、または洗剤で可溶化された水性受容体で、行われてもよい。この化合物は、標識されたリガンド（実施例の章も参照）の結合を変える能力を特徴とするであろう。この化合物は、ＧＰＣＲとこのリガンドとの結合を低下させてもよく、または、ＧＰＣＲとこのリガンドとの結合を、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍高めてもよい。

【0156】

特に好ましい実施形態によれば、立体構造選択的な化合物を特定する上述の方法は、リガンド結合アッセイまたは競争アッセイによって行われ、さらになお好ましくは、放射性リガンドの結合アッセイまたは競争アッセイによって行われる。最も好ましくは、立体構造選択的な化合物を特定する上述の方法は、比較アッセイ、さらに具体的には、比較リガンド競争アッセイ、さらになお具体的には、比較放射性リガンド競争アッセイで行われ、実施例の章でさらに説明される。

【0157】

上述の方法が比較アッセイで行われる場合には、この方法が、ＧＰＣＲが、立体構造選択的な結合ドメイン部分によって、目的の機能的な立体構造（例えば、活性な立体構造または不活性な立体構造）で安定化される、キメラポリペプチドに含まれるＧＰＣＲに対する試験化合物の結合を、コントロールに対する試験化合物の結合と比較する工程を含むことが理解されるであろう。本発明の範囲内で、コントロールは、対応する融合していないＧＰＣＲ、または、対応するＧＰＣＲに指向していないか、および／または対応するＧＰＣＲに特異的に結合しない結合ドメイン部分であるモック結合ドメインに融合した、対応するＧＰＣＲのキメラポリペプチド（コントロール結合部分または無関係な結合部分とも呼ばれる。）であってもよい。

【0158】

特に好ましい実施形態において、上述の任意の方法で、キメラポリペプチドに含まれるＧＰＣＲに対する試験化合物の選択的な結合を評価する工程は、実施例の章にもさらに示されるように、キメラポリペプチドに対する試験化合物のアフィニティ（本明細書で定義されるような）を測定および／または計算することによって行われる。

【0159】

立体構造選択的な化合物に対するＧＰＣＲ標的の高スループットスクリーニングが好ましいことが多い。これは、アッセイまたは多重化が可能な適切な固体表面または支持材にその他の本発明のキメラポリペプチドを固定することによって促進されるであろう。適切な固体支持材の非限定例としては、ビーズ、カラム、スライド、チップまたはプレートが挙げられる。

【0160】

さらに具体的には、固体支持材は、粒状物（例えば、ビーズまたは顆粒、一般的に、抽出カラムで用いられる。）またはシート形態（例えば、膜またはフィルタ、ガラスまたはプラスチックビーズ、マイクロタイターアッセイプレート、ディップスティック、キャピラリー充填デバイスなど）であってもよく、平坦、ひだ状、または中空繊維または管であってもよい。以下のマトリックスが例として与えられ、排他的ではないが、このような例は、シリカ（多孔性アモルファスシリカ）、即ち、Ｂｉｏｔａｇｅ（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．の一部門）によって供給される６０Ａの不規則なシリカ（３２から６３ｕｍまたは３５から７０ｕｍ）を含むＦＬＡＳＨシリーズのカートリッジ、アガロースまたはポリアクリルアミド支持材、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈによって供給されるＳｅｐｈａｒｏｓｅ範囲の製品、またはＢｉｏ−Ｒａｄによって供給されるＡｆｆｉ−Ｇｅｌ支持材を含んでいてもよい。これに加え、マクロ多孔質ポリマー、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄによって供給される圧力に安定なＡｆｆｉ−Ｐｒｅｐ支持材が存在していてもよい。利用可能な他の支持材としては、デキストラン、コラーゲン、ポリスチレン、メタクリレート、アルギン酸カルシウム、孔径制御されたガラス、アルミニウム、チタンおよび多孔性セラミックスが挙げられる。または、固体表面は、質量依存性のセンサの一部、例えば、表面プラズモン共鳴検出器を含んでいてもよい。市販の支持材のさらなる例は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ、Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ編集、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９９１）に記載される。

【0161】

固定は、非共有結合性または共有結合性のいずれかであってもよい。特に、本発明のキメラポリペプチドの固体表面に対する非共有結合性の固定または吸着は、任意の抗体、またはストレプトアビジンまたはアビジン、または金属イオンを有する表面コーティングを介して行われてもよく、当業者に知られている標準的な技術に従って、キメラポリペプチドに接続した分子タグを認識する（例えば、ストレプトタグ、ヒスチジンタグなど）。

【0162】

特に、キメラポリペプチドは、従来のカップリング化学を用い、共有結合性の架橋によって固体表面に接続してもよい。固体表面は、天然に、共有結合に適した架橋可能な残基を含んでいてもよく、または、当該技術分野でよく知られている方法に従って、適切な架橋可能な基を導入するために、コーティングされてもよく、または誘導体化されてもよい。ある特定の実施形態において、固定されたタンパク質の十分な機能性は、化学スペーサーアーム部を含まない反応性部分を介した望ましいマトリックスへの直接的な共有結合性カップリングの後に、保持される。固体支持材に対する抗体（フラグメント）の固定方法についてのさらなる例およびもっと詳細な情報は、Ｊｕｎｇら（２００８）に記載され、同様に、膜受容体の固定方法は、Ｃｏｏｐｅｒ（２００４）にまとめられ、両方とも参照により本明細書に組み込まれる。

【0163】

分子生物学における進化、特に、部位特異的突然変異を解する分子生物学における進化によって、タンパク質配列の特定のアミノ酸残基の突然変異が可能である。特定のアミノ酸（既知の構造または推測される構造中）の突然変異、例えば、リジンまたはシステイン（または他のアミノ酸）に対する突然変異によって、共有結合性カップリングに特異的な部位を与えることができる。化学カップリングに含まれる表面で利用可能なアミノ酸の分布を変えるために、特定のタンパク質を遺伝子操作することもできる（Ｋａｌｌｗａｓｓら、１９９３）。同様の手法を本発明のキメラポリペプチドに適用してもよく、このため、天然または非天然のアミノ酸を含有する他のペプチドのテール部またはドメインを付加することなく、指向性の固定手段を与える。キメラポリペプチドのＧＰＣＲ部分および／または結合ドメイン部分に突然変異を導入することができ、立体構造および／または生体活性を妨害しないように、注意深く選択する必要があることが理解されるであろう。例えば、突然変異が、抗体または抗体フラグメントである結合ドメイン部分（例えば、ナノボディ）に導入される場合には、フレームワーク領域への突然変異の導入が好ましく、抗体（フラグメント）の抗原結合活性の崩壊を最小限にする。

【0164】

簡便には、固定されたタンパク質は、当該技術分野で従来の標準的な方法に従って、本発明の固定されたタンパク質と、試験サンプルとを接触させることによって、免疫吸着工程、例えば、イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、またはイムノアフィニティ精製工程で使用されてもよい。または、特に、高スループット目的のためには、固定化されたタンパク質を整列させるか、またはその他の方法で多重化してもよい。好ましくは、本発明の固定されたタンパク質を、ＧＰＣＲの特定の立体構造に選択的に結合する化合物のスクリーニングおよび選択に使用する。

【0165】

用途の種類、または行われることが必要なスクリーニングの種類に依存して、融合物の一部を生成する結合ドメインまたはＧＰＣＲ部分のいずれかが固定されてもよいことが理解されるであろう。また、ＧＰＣＲを安定化する結合ドメイン（ＧＰＣＲの特定の立体的エピトープを標的とする。）の選択は、ＧＰＣＲの配置、従って、化合物特定の望ましい結果、例えば、前記立体構造によって安定化されたＧＰＣＲ部分の細胞外部分、膜内部分または細胞内部分に特異的に結合する化合物を決定する。

【0166】

代替的な実施形態において、試験化合物（または試験化合物のライブラリー）は、固体表面、例えば、チップ表面に固定されてもよく、一方、キメラポリペプチドは、例えば、洗剤溶液または膜状の調製物で与えられる。

【0167】

従って、ある特定の実施形態において、本発明キメラポリペプチドが固定される固体支持材は、上の任意のスクリーニング方法で使用するために与えられる。

【0168】

最も好ましくは、例えば、溶液中のファージディスプレイ選択プロトコルにおいて、または放射性リガンド結合アッセイにおいて、キメラポリペプチドも試験化合物も固定されない。

【0169】

試験される化合物は、任意の小さな化学化合物、または高分子、例えば、タンパク質、糖、核酸または脂質であってもよい。典型的には、試験化合物は、小さな化学化合物、ペプチド、抗体またはこのフラグメントであり得る。ある場合には、試験化合物は、試験化合物のライブラリーであってもよいことが理解されるであろう。特に、治療化合物（例えば、本発明のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストおよび／または調整剤の形態）のための高スループットスクリーニングアッセイは、本発明の一部を形成する。高スループットの目的のために、例えば、アロステリック化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー、フラグメントに基づくライブラリー、合成化合物ライブラリー、天然化合物ライブラリー、ファージディスプレイライブラリーなどの化合物ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリーを使用してもよい。このようなライブラリーを作製し、スクリーニングする方法論は、当業者に知られている。

【0170】

試験化合物は、場合により、検出可能なラベルに共有結合または非共有結合によって接続してもよい。適切な検出可能なラベルおよびこれを接続し、使用し、検出するための技術は、当業者に明確であり、限定されないが、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。有用なラベルとしては、磁気ビーズ（例えば、ダイナビーズ）、蛍光染料（例えば、すべてのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ染料、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性ラベル（例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３２Ｐ）、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）および比色ラベル、例えば、コロイド状の金または着色したガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。このようなラベルを検出する手段は、当業者によく知られている。従って、例えば、放射性ラベルは、写真フィルムまたはシンチレーションカウンタによって検出されてもよく、蛍光マーカーは、発光を検出するための光検出器を用いて検出されてもよい。酵素ラベルは、典型的には、基材とともに酵素を与えることによって検出され、基材の上の酵素の活性によって作られる反応生成物を検出し、比色ラベルは、着色したラベルを単純に視覚化することによって検出される。他の適切な検出可能なラベルは、本発明のキメラポリペプチドに関連する本発明の第１の態様の文脈の中ですでに記載した。

【0171】

従って、特定の実施形態によれば、上の任意のスクリーニング方法で使用されるような試験化合物は、本明細書で上記で定義されるように、ポリペプチド、ペプチド、低分子、天然産物、ペプチド模倣物、核酸、脂質、リポペプチド、炭水化物、抗体またはこれらから誘導される任意のフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィドが接続したＦｖｓ（ｄｓＦｖ）およびＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、一本鎖ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、抗体、ラクダ重鎖抗体から誘導される可変ドメイン（ＶＨＨまたはナノボディ）、サメ抗体から誘導される新しい抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）、アルファボディを含むタンパク質足場、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、設計されたアンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎｓ）、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、アンチカリン、ノッチン、操作されたＣＨ２ドメイン（ナノ抗体）を含む群から選択される。

【0172】

ある好ましい実施形態において、高スループットスクリーニング方法は、非常に多くの潜在的な治療リガンドを含むコンビナトリアル化合物またはペプチドのライブラリーを与えることを含む。次いで、このような「コンビナトリアルライブラリー」または「化合物ライブラリー」は、本明細書で記載されるように、１つ以上のアッセイでスクリーニングされ、望ましい特徴的な活性を示すライブラリーメンバー（特に、化学種またはサブクラス）を特定する。「化合物ライブラリー」は、通常は、最終的に高スループットスクリーニングに用いられる保存された化学物質の集合である。「コンビナトリアルライブラリー」は、多くの化学「ビルディングブロック」を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成のいずれかによって作られる多様な化学化合物の集合である。コンビナトリアルライブラリーの調製物およびスクリーニングは、当業者によく知られている。このようにして特定された化合物は、従来の「リード化合物」として機能することができ、または、これ自体を潜在的な治療薬または実際の治療薬として使用することができる。従って、あるさらなる実施形態において、本明細書で上記されるようなスクリーニング方法は、さらに、特定の立体構造のＧＰＣＲを含むキメラポリペプチドを含むキメラポリペプチドに選択的に結合することが示された試験化合物を改変し、特定の立体構造にある場合に、改変された試験化合物がＧＰＣＲに結合するかどうかを決定することとを含む。

【0173】

従って、さらに特定の実施形態によれば、本発明のキメラポリペプチドと受容体リガンドとを含む複合体を上述の任意のスクリーニング方法で使用してもよい。好ましくは、受容体リガンドは、低分子、ポリペプチド、抗体またはこれらから誘導される任意のフラグメント、天然産物などを含む群から選択される。さらに好ましくは、受容体リガンドは、本明細書で上記されるように、全アゴニスト、またはパーシャルアゴニスト、バイアスアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストである。

【0174】

標的ＧＰＣＲの天然リガンドまたは内因性リガンドを特定し、特性決定することが望ましいであろう。特に、天然の活性化リガンドが特定されていないＧＰＣＲを「脱オーファン化」する必要がある。このようなリガンドは、生体サンプル（例えば、血液または組織抽出物）から回収されてもよく、またはリガンドのライブラリーから回収されてもよい。従って、特定の実施形態によれば、上記の任意のスクリーニング方法で使用されるような試験化合物は、生体サンプルとして与えられる。特に、サンプルは、個体から採取された任意の適切なサンプルであってもよい。例えば、サンプルは、体液、例えば、血液、血清、血清、髄液であってもよい。

【0175】

上述のようなスクリーニング方法は、化合物の機能性プロフィールを決定するのに十分であるが、標的ＧＰＣＲの下流のシグナル伝達に対する化合物の機能的影響を、さらに第２のアッセイによって評価してもよい。従って、関与する特定の疾患または障害に依存して、化合物および／またはこの化合物を含む組成物の有効性を、任意の適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞に基づくアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイおよび／またはこれ自体が既知の動物モデル、またはこれらの任意の組み合わせを用いて試験することができる。

【0176】

本発明のキメラポリペプチド、宿主細胞およびこの誘導体をさらに遺伝子操作してもよく、従って、細胞に基づくアッセイの開発または改良のための特に有用なツールであることが理解されるであろう。細胞に基づくアッセイは、新しい生体標的の作用機序および化学化合物の生体活性を評価するために重要である。例えば、限定する目的はないが、現行のＧＰＣＲのための細胞に基づくアッセイとしては、経路活性化の測定（Ｃａ^２＋放出、ｃＡＭＰ生成または転写活性）；ＧＰＣＲおよび下流の要素をＧＦＰでタグ付けすることによるタンパク質トラフィッキングの測定；および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）または酵母ツーハイブリッド手法を用いた、タンパク質間の相互作用の直接的な測定が挙げられる。

【0177】

さらに、標的ＧＰＣＲに対する抗体、好ましくは、立体構造選択的な抗体を高めるために、本発明のキメラポリペプチド、またはこのキメラポリペプチドを含む宿主細胞またはこの誘導体を用いて動物を免疫化することが特に有利な場合がある。従って、このような免疫化方法も本明細書で想定される。抗体をｉｎ ｖｉｖｏで上げるための方法は、当該技術分野で知られており、本明細書で上記でも記載される。任意の適切な動物、特に、哺乳動物、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ、ヒツジ、ウシ、サメ、ブタ、または鳥類、例えば、ニワトリまたはシチメンチョウを、免疫応答を生成するのに適切な当該技術分野でよく知られている任意の技術を用いて免疫化してもよい。免疫化後、細菌、酵母、繊維状ファージ、リボソームまたはリボソームサブユニットまたは他の表出する系で発現される免疫グロブリン遺伝子またはこの一部をコードする発現ライブラリーを、当該技術分野でよく知られる技術に従って作ることができる。これに加えてさらに、作られる抗体ライブラリーは、本明細書で上記されるような任意のスクリーニング方法で使用するのに適切な試験化合物の集合を含む。本明細書に記載されるように生起された抗体は、特定の立体構造状態でＧＰＣＲを特異的に検出するための有用な診断ツールであってもよく、従って、これも本発明の一部を形成する。

【0178】

一実施形態において、固定化されたキメラポリペプチド（本明細書で上記されるような）は、立体構造によって安定化された受容体に結合する抗体または抗体フラグメントまたはペプチドを含む結合ドメインの選択に使用されてもよい。当業者は、このような結合ドメインが、非限定的な例として、特に、この表面で結合ドメインを発現する細胞のセット、集合またはライブラリー、または、この表面にｇｅｎＩＩＩとナノボディの融合物を表出させるバクテリオファージ、または、接合因子タンパク質Ａｇａ２ｐの融合物を表出させる酵母細胞をスクリーニングすることによって、またはリボソームディスプレイによって選択することができることを認識するであろう。

【0179】

ある特定の実施形態は、１対１の化学量論量で受容体に共有結合する、非常に高い有効分子内濃度の立体構造選択的な結合ドメインによって誘発される受容体の立体構造に選択的な結合ドメインの単離のためのこのような固定化されたキメラポリペプチドの使用に関する。

【0180】

本発明のさらに別の態様は、本発明のキメラポリペプチド、または本発明の宿主細胞または宿主細胞培養物または膜調製物を含むキットに関する。キットは、さらに、試薬、例えば、バッファー、分子タグ、ベクター構築物、参照サンプル材料および適切な固体支持材などを含んでいてもよい。このようなキットは、本明細書に記載するような本発明の任意の用途に有用であり得る。例えば、キットは、化合物スクリーニング用途に有用名試験化合物（のライブラリー）を含んでいてもよい。

【0181】

以下の実施例は、本発明のさらなる理解を促進することを意図している。本発明を、示した実施形態を参照して本明細書で記載するが、本発明がこれに限定されないことを理解すべきである。当業者は、本明細書の教示を利用し、本発明の範囲内のさらなる改変および実施形態を認識するであろう。従って、本発明は、本明細書に添付する特許請求の範囲によってのみ限定される。

【実施例】

【0182】

［実施例１］
β２ＡＲ−ナノボディ融合タンパク質構築物の生成
この実施例に記載するＧＰＣＲ−ナノボディ融合物は、ペプチドリンカーと接続した２種類の異なるタンパク質を含むキメラポリペプチドであり（ＧＰＣＲ β２ＡＲ、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５１）およびナノボディ）、アミノ酸末端からカルボキシ末端に向けて、すべてがこの順序で融合している。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、以下に記載したように融合し（図２）、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３５９−０１６）にクローン化された。

【0183】

このＧＰＣＲ部分は、インフルエンザウイルス（ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ；配列番号５２）、その後、Ｆｌａｇエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＡ；配列番号５３）、その後、ＴＥＶ開裂部位（ＥＮＬＹＦＱＧＦ；配列番号５４）、その後、Ｇｌｙ２からＧｌｙ３６５を包含するヒトβ２アドレナリン作動性受容体のコード配列（配列番号５５）から誘導される開裂可能なヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質シグナルペプチド（ＳＰ）をコードするＤＮＡから増幅された。Ｎ１８７Ｅの点変異は、この望ましくないグリコシル化部位を破壊するために、この構築物にも導入された（β２ＡＲ３６５Ｎ；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ｂ）。β２ＡＲ３６５Ｎに対するβ２アドレナリン作動性受容体の遺伝子操作が行われ、Ｓｆ９細胞における受容体の細胞発現レベルを増加させた。

【0184】

ナノボディ遺伝子セグメントは、それぞれのナノボディをコードするファージミドから増幅された。Ｎｂ８０（配列番号１３）は、全アゴニスト（例えば、ＢＩ−１６７１０７）に結合するβ２ＡＲの活性な状態を安定化するβ２ＡＲ特異的なナノボディである（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ｂ）。Ｎｂ７１（配列番号１４）は、活性な状態を安定化させる別のβ２ＡＲ特異的なＸａｐｅｒｏｎｅである（ＷＯ２０１２００７５９３）。Ｎｂ６９６９（配列番号１５）は、Ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ３受容体に特異的であり、β２ＡＲに対する検出可能なアフィニティを有しない。

【0185】

ＧＰＣＲおよびナノボディは、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって、フレーム中で遺伝的に融合された。従って、ＧＰＣＲ ｃＤＮＡを含有する２０ｎｇのプラスミドを、４％のＤＭＳＯを含有する５０μｌのＰＣＲ反応のテンプレートとして使用し（Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、カタログ番号ＥＰ０５０１）、プライマーＥＰ２１１（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＣＣ−３’；配列番号５６）およびプライマーＥＰ２０７（５’−ＣＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧ−３’；配列番号５７）を用い、β２ＡＲをコードするＤＮＡを増幅させた。プライマーＥＰ２１１は、コード配列の５’末端にＥｃｏＲＩ制限部位を有している。プライマーＥＰ２０７は、受容体のＣ末端にＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５１）リンカーの一部が組み込まれている。この反応の増幅条件は、９５℃で２分間、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を３５サイクル、次いで、７２℃で１０分間であり、この融合物のオープンリーディングフレームのＧＰＣＲコード部分を増幅させた。

【0186】

Ｎｂ６９、Ｎｂ７１およびＮｂ８０は、すべて、Ｎ末端およびＣ末端の配列が同じである。ナノボディのＤＮＡは、５ｎｇのそれぞれの構築物と、プライマーＥＰ２０６（ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧ；配列番号５８）を用い、５０μｌ中、ＰＣＲ中のＰｆｕポリメラーゼを用いて増幅させ、ナノボディのＮ末端にＧＧＧＧＳＧＧＧＳリンカーの重複する部分、およびＥＰ２０２（ＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ；配列番号５９）を組み込み、この遺伝子の３’末端にＸｂａＩクローニング部位を組み込んだ融合タンパク質のＣ末端にＨｉｓ６−タグ配列を付加した。９５℃で２分間、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル、次いで、７２℃で１０分間の増幅条件を使用し、ハイブリッドのナノボディコード部分を増幅させた。

【0187】

ＧＰＣＲまたはナノボディをコードするＰＣＲフラグメントを、ＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製し、新しい５０μｌのＰＣＲ反応：２０ｎｇのＥＰ２１１−β２ＡＲ−ＥＰ２０７（ＥＰ２１１およびＥＰ２０７は、ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーを指す。）において、テンプレートとして使用し、増幅されたＰＣＲフラグメントを、約２０ｎｇの増幅されたＥＰ２０６−ナノボディ−ＥＰ２０２フラグメントと混合し、以下のように、オーバーラップエクステンションによって、ＫａｐａＴａｑポリメラーゼ（Ｓｏｐａｇｈｅｍ、カタログ番号ＢＫ１００２）を用いて融合させた。９５℃で２分間での融解、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、１分４５秒間を５サイクルの後、融合したβ２ＡＲ−ナノボディのオープンリーディングフレームを、プライマーＥＰ２０２およびＥＰ２１１を用い、２８サイクル（９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分４５秒間）、その後、７２℃で１０分間かけて増幅させた。異なるβ２ＡＲ−ナノボディのオープンリーディングフレームを含むＰＣＲフラグメントを別個に精製し、ｐＦａｓｔＢａｃ１中で、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０中で形質転換した。プラスミドＤＮＡを、１個のコロニーから調製し、オープンリーディングフレームの配列をシークエンシングによって確認した。構築物をｐＦａｓｔＢａｃ β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０（実験室参照番号ＣＡ６８３６）、ｐＦａｓｔＢａｃ β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９（実験室参照番号ＣＡ６８３３）およびｐＦａｓｔＢａｃ β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１（実験室参照番号ＣＡ６８３５）と名付けた。異なるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ融合構築物によってコードされるアミノ酸配列は、図２に与えられる（配列番号１から４）。

【0188】

［実施例２］
バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞におけるβ２ＡＲ−ナノボディ融合物の発現
β２ＡＲ−ナノボディ融合物をコードするバクミドを産生するために、製造業者の指示に従って、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（Ｒ）バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３５９−０１６）を用い、１ｎｇの各ｐＦａｓｔＢａｃ β２ＡＲ３６５Ｎ−ナノボディ融合物をＤＨ１０Ｂａｃ（商標）細胞内で形質変換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌおよび４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧを含む新鮮なＬＢ寒天プレートに一晩接種した。白色コロニーを取り出し、バクミドを精製し、β２ＡＲ−ナノボディオープンリーディングフレームの配列を確認した。β２ＡＲオープンリーディングフレームをコードし、リンカーおよびナノボディ（ｐＦａｓｔＢａｃ β２ＡＲ３６５Ｎ）を含まないプラスミドも、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）細胞内で形質転換し、コントロールとして、融合していない受容体をコードするバクミドを産生した。β２ＡＲ−ナノボディバクミドおよびβ２ＡＲ３６５ＮバクミドをＳｆ９細胞内でトランスフェクションすることによって、組み換えバキュロウイルスを産生した。

【0189】

それぞれのバクミドについて、１ｍｌのＧｒａｃｅの栄養無添加昆虫細胞培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ８１４２）、１５μＬのセルフェクチンＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３６２−１００）および５μＬのバクミドＤＮＡ（約３μｇ）を混合することによって、トランスフェクション混合物を調製した。このトランスフェクション混合物を、ＲＴで２０分間あらかじめインキュベーションした。次いで、１×１０^７のペレット化されたＳｆ９細胞を、このトランスフェクション混合物に懸濁させ、２７℃で振り混ぜた。４時間後、４ｍｌのタンパク質を含まないＥＳＦ ９２１ Ｓｆ９培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＣ、カタログ番号９６−００１）を加え、２７℃、１３０ｒｐｍで４８時間、細胞を成長させた。さらなる５ｍｌのＥＳＦ ９２１ Ｓｆ９培地を加え、細胞をさらに２４時間から４０時間インキュベーションした後、遠心分離によってＰ１組み換えバキュロウイルスストック（Ｐ１）を集めた。Ｐ１を、３×１０^６細胞／ｍｌの密度で、新鮮なＳｆ９培地で１００倍に希釈することによって、Ｐ２組み換えバキュロウイルスストックを作製し、２７℃、１３０ｒｐｍで培養した。インキュベーションして７２時間後、遠心分離によってＰ２ウイルスストックを集めた。異なるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ融合物の組み換え発現は、Ｐ２バキュロウイルスストックを用い、４００万／ｍｌの密度で（１：１００から１：２５０で）新しく成長させたＳｆ９細胞の感染によって達成された。感染した細胞を２７℃（１３０ｒｐｍ）で４８時間から５５時間培養した後、集めた。ＧＰＣＲ−ナノボディハイブリッドの発現は、生きた細胞の蛍光顕微鏡観察によって確認された（実施例３）。この組み換えタンパク質を発現する細胞を、１．５ｍＭ ＥＤＴＡを加えた氷冷ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１００１０−０２３）で２回洗浄し、ペレット化し、−８０℃で保存した。

【0190】

［実施例３］
蛍光顕微鏡によるβ２ＡＲ−ナノボディ融合タンパク質の発現の確認
異なるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ融合物の発現を監視するために、感染していないＳｆ９細胞、およびＰ１組み換えバキュロウイルスストックで感染したＳｆ９細胞（感染７２時間後に集めた。）を、蛍光顕微鏡を用い、受容体の発現について分析した。この目的のために、１５μｌの各細胞培養物を８ウェルのマイクロスライド（Ｉｂｉｄｉ、カタログ番号８０８２１）中、１μｇのマウス抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ３１６５）および１μｇのＦＩＴＣにコンジュゲート化したラット抗マウス−ＩｇＧ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１１−４０１１）を含む２００μｌのＰＢＳで希釈し、暗状態で１５分間インキュベーションした。細胞が表面接着したら、過剰な染色溶液を注意深く除去した。感染した細胞および感染していない細胞の画像を、Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００（Ｎｉｋｏｎ）倒立顕微鏡を用いて撮影した。透過型顕微鏡法を用い、およびＦＩＴＣフィルタを用いた蛍光透過型顕微鏡法を用い、画像を撮影した。すべての蛍光測定を、同じ露光設定を用いて行った。

【0191】

感染していないＳｆ９細胞の蛍光画像と、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９または融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎを発現する細胞の蛍光画像とを比較し、キメラポリペプチドが、融合していない受容体と同様に（データは示さない。）、昆虫細胞の細胞表面で主に発現することを示す。

【0192】

［実施例４］
β２ＡＲ−ナノボディ融合物を発現する昆虫細胞からの膜の調製
組み換えβ２ＡＲ−Ｎｂ融合物を発現するＳｆ９細胞の新鮮な５０ｍｌ培養物の遠心分離によって得られる細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤（１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．２ｍＭのＰＭＳＦ）を含有する８ｍｌの溶解バッファーに懸濁させた。小さなガラスグラインダおよびテフロン乳棒を用い、再び懸濁させたペレットを十分に砕くことによって、細胞を溶解させた。２６０００ｇでの遠心分離によって、膜を回収した。膜ペレットを、１．５ｍｌの保存バッファー（１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のサッカロース）に再懸濁させ、小分けして８０℃で保存した。合計タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２３２２５）を用い、製造業者の指示に従って測定した。バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞におけるＧＰＣＲ−ナノボディハイブリッドの発現は、ウェスタンブロット分析によってこれらのＳｆ９膜のタンパク質含有量を分析することによって確認した（実施例５）。これらのＧＰＣＲ−ナノボディハイブリッドの薬理特性を、放射性リガンド競争アッセイによって分析した（実施例６）。

【0193】

［実施例５］
ウェスタンブロットによって確認したβ２ＡＲ−ナノボディ融合タンパク質の発現
異なるバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞の膜調製物（合計タンパク質２５μｇ）を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに乗せた。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロースシートに移し、４％の脱脂乳で膜をブロッキングした。この組み換えタンパク質の発現は、抗ｆｌａｇ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ３１６５）を一次抗体として用い、ブロットを発色させるために抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ３５６２）をＮＢＴおよびＢＣＩＰと組み合わせて用いて検出した（図３）。適切な分子量を有するバンド（それぞれ、ナノボディに融合したβ２ＡＲおよび融合していないβ２ＡＲについて、約５７ｋＤａおよび４３ｋＤａ）の検出によって、生成したすべての構築物の融合タンパク質の発現を確認する。

【0194】

［実施例６］
比較放射性リガンド競争アッセイによる、β２ＡＲ−ナノボディ融合物の薬理特性の分析
異なるβ２ＡＲ３６５Ｎ−ナノボディ融合物の薬理特性を分析するために、本願発明者らは、天然アゴニストであるエピネフリン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｅ４２５０）、（−）−イソプロテレノール塩酸塩（全アゴニスト、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｉ６５０４）、サルブタモール（パーシャルアゴニスト、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ８２６０）、ＩＣＩ−１１８，５５１塩酸塩（インバースアゴニスト、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｉ１２７）またはアルプレノロール塩酸塩（ニュートラルアンタゴニスト、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ８６７６）およびカルベジロール（アンタゴニスト、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ３９９３）を競争剤として、ニュートラルアンタゴニスト［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールを放射性リガンドとして使用し、比較放射性リガンド競争実験を行った。異なるリガンドの薬理効果は、Ｋａｈｓａｉら．（２０１１）による。

【0195】

放射性リガンド競争結合実験を、β２ＡＲ３６５Ｎ（ナノボディが融合していない）、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１またはβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のいずれかを発現するＳｆ９昆虫細胞膜で行った。異なる組み換えタンパク質を発現するｓｆ９細胞の膜（実施例２および４、合計タンパク質５μｇ）を、結合バッファー（７５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＢＳＡ）中、１０^−１１Ｍから１０^−４Ｍの範囲の濃度で、（−）−イソプロテレノール、エピネフリン、サルブタモール、ＩＣＩ１１８，５５１またはアルプレノロールのいずれかと混合した。次に、それぞれの希釈物に放射性リガンド［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールを加え（最終濃度２ｎＭ）、振とうプラットフォームでサンプルを室温で２時間インキュベートした（アッセイ点あたりの合計反応容積は２５０μｌであった。）。受容体が結合した放射性リガンドを、９６ウェルのＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ収集器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用い、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃユニフィルタ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００５１７４）で、遊離した放射性リガンドから濾過によって分離した。濾過の後、フィルタプレートに保持された膜を、氷冷した洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４）で洗浄し、フィルタを５０℃で１時間乾燥させた。４０μｌのシンチレーション液（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ（商標）−Ｏ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６０１３６１１）を加えた後、フィルタ上に保持された放射活性（ｃｐｍ）を、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘシンチレーションカウンタで測定した。データは、３回ずつ行われた各実験の平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）で表す。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ）によって、非線形回帰分析によって決定された。

【0196】

第１のシリーズの実験において、本願発明者らは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物の薬理特性をβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラの薬理特性と比較した（図４）。Ｎｂ８０は、アゴニストが結合したβ２ＡＲに選択的に結合するＸａｐｅｒｏｎｅであり、Ｇタンパク質様の挙動を示し、このため、アゴニスト・β２ＡＲ・Ｎｂ ８０複合体中の受容体の活性な状態の立体構造を安定化する（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ｂ）。Ｎｂ６９は、ラットムスカリン性受容体Ｍ３に特異的に結合するモックナノボディであり、β２ＡＲに対する検出可能なアフィニティを有しない。本願発明者らは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラの薬理特性が、コントロールであるＮｂ６９融合受容体の特性と顕著に異なることを発見した。Ｎｂ６９キメラと比較して、Ｇタンパク質様の挙動を有するナノボディ（Ｎｂ８０）に融合したβ２ＡＲは、アゴニスト（エピネフリン、イソプロテレノール、サルブタモール）に対する増加したアフィニティと、インバースアゴニスト（ＩＣＩ−１１８，５５１）に対する低下したアフィニティを示し、Ｎｂ８０およびモック融合物に対する試験リガンドの変化したＩＣ５０によって例示される（表３）。このことから、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラは、コントロールであるモックβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラとは異なり、アゴニストに対する増加したアフィニティおよびインバースアゴニストに対する低下したアフィニティを特徴とする活性な状態の立体構造を採用していることがわかった。

【0197】

コントロールであるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９と比較して、天然アゴニストであるエピネフリンに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラの増加したアフィニティは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０を、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０のＩＣ５０^ｈｉｇｈで割り算することによって図４Ａに示される競争結合実験のＩＣ５０値の比率によって計算することができ、約２０８０の明らかな効力の変化が得られる。合成アゴニストであるイソプロテレノールに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラの増加したアフィニティは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０をβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０のＩＣ５０^ｈｉｇｈで割り算することによって、競争結合実験からのＩＣ５０の比率から計算することができ（図４Ｂ）、約６７０の明らかな効力の変化が得られる。合成パーシャルアゴニストであるサルブタモールに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラの増加したアフィニティは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０をβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０のＩＣ５０^ｈｉｇｈで割り算することによって、図４Ｄに示される競争結合実験からのＩＣ５０の比率から計算することができ、約３７０の明らかな効力の変化が得られる。

【0198】

同様に、コントロールであるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９と比較して、インバースアゴニストＩＣＩ−１１８，５５１に対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラの低下したアフィニティは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０をβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０のＩＣ５０で割り算することによって、図４Ｅに示される競争結合実験からＩＣ５０値の比率から計算することができ、約０．０２３の明らかな効力の変化が得られる。

【0199】

特に、β２ＡＲ−Ｎｂ８０融合物は、ニュートラルアンタゴニストアルプレノロールに対するアフィニティについて、コントロールであるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラと比較して、ほとんど影響がない。アルプレノロールに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０（図４Ｃ）は、実際に非常に類似しており、ニュートラルアンタゴニストが、異なる機能的な立体構造に結合する非選択的なリガンドであるという事実と一致する。

【0200】

注目すべきことに、β２ＡＲ−Ｎｂ８０融合物は、アンタゴニストであるカルベジロールに対するアフィニティについて、コントロールであるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラと比較して、ほとんど影響がない。β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９で検出されたカルベジロールのＩＣ５０（図４Ｆ）は、実際に非常に類似している（２倍未満の差）。

【0201】

第２のシリーズの実験において、本願発明者らは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物の薬理特性と、融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎ受容体の薬理特性とを比較した（図５）。Ｇタンパク質様の挙動を有するナノボディ（Ｎｂ８０）に融合したβ２ＡＲは、天然アゴニストのエピネフリンに対し、３桁大きなアフィニティを示し、このことは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラが、融合していないコントロール受容体とは異なり、アゴニストに対する増加したアフィニティを特徴とする活性な状態の立体構造を採用していることを示している。コントロールの融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎと比較して、天然アゴニストのエピネフリンに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラの増加したアフィニティは、融合していないβ２ＡＲ３６５ＮのＩＣ５０をβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０のＩＣ５０^ｈｉｇｈで割り算することによって、図５Ａに示される競争結合実験から、ＩＣ５０の比率から計算することができ、約１３７０の明らかな効力の変化が得られる（表３）。

【0202】

注目すべきことに、β２ＡＲ−Ｎｂ８０融合物は、コントロールである融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎと比較して、アンタゴニストであるカルベジロールに対するアフィニティにほとんど影響がない。カルベジロールに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０および融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０（図５Ｂおよび表３）は、実際に非常に類似している。

【0203】

第３の実験において、本願発明者らは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１融合物の薬理特性を、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラの薬理特性と比較した（図６および表３）。Ｎｂ７１は、β２ＡＲの活性な立体構造に選択的に結合する別のナノボディである（ＷＯ２０１２００７５９４）。本願発明者らは、次のことを発見した。β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１キメラの薬理特性も、アゴニスト（イソプロテレノール、サルブタモール）に対する増加したアフィニティおよびインバースアゴニストＩＣＩ−１１８，５５１に対する減少したアフィニティを示し、このことは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１キメラが、コントロールであるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラとは異なり、アゴニストに対する増加したアフィニティおよびインバースアゴニストに対する減少したアフィニティを特徴とする活性な状態の立体構造を採用していることを示している。コントロールであるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９と比較し、天然アゴニストであるエピネフリンに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１キメラの増加したアフィニティは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０をβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１のＩＣ５０^ｈｉｇｈで割り算することによって、図６Ａに示される競争結合実験から、ＩＣ５０の比率から計算することができ、約２０３０の明らかな効力の変化が得られる。合成アゴニストであるイソプロテネロールに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１キメラの増加したアフィニティは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０をβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１のＩＣ５０^ｈｉｇｈで割り算することによって、図６Ｂに示される競争結合実験から、ＩＣ５０の比率から計算することができ、約８０の明らかな効力の変化が得られる。合成パーシャルアゴニストであるサルブタモールに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１キメラの増加したアフィニティは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０をβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１のＩＣ５０^ｈｉｇｈで割り算することによって、図６Ｄに示される競争結合実験から、ＩＣ５０の比率から計算することができ、約４５０の明らかな効力の変化が得られる。

【0204】

同様に、コントロールであるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９と比較して、インバースアゴニストＩＣＩ−１１８，５５１に対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１キメラの減少したアフィニティは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０をβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１のＩＣ５０で割り算することによって、図６Ｅに示される競争結合実験から、ＩＣ５０の比率から計算することができ、約０．０１の明らかな効力の変化が得られる。

【0205】

特に、β２ＡＲ−Ｎｂ７１融合物は、コントロールであるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラと比較して、ニュートラルアンタゴニストアルプレノロールに対するアフィニティにほとんど影響がない。アルプレノロールに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０（図６Ｃ）は、実際に非常に類似しており、ニュートラルアンタゴニストが、異なる機能的な立体構造に結合する非選択的なリガンドであるという事実と一致する。

【0206】

注目すべきことに、β２ＡＲ−Ｎｂ７１融合物は、コントロールであるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラと比較して、アンタゴニストであるカルベジロールに対するアフィニティにほとんど影響がない。カルベジロールに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ７１およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０（図６Ｆ）は、実際に非常に類似している。

【0207】

［実施例７］
β２ＡＲ−ナノボディ融合物の立体構造の熱安定性
ＧＰＣＲの安定化のための１つの戦略は、即ち、改良された熱安定性を有する変異体についてスクリーニングするための、（放射性）リガンド存在下、熱安定性アッセイと組み合わせた全体的な突然変異に基づくＧＰＣＲの熱安定化である（Ｔａｔｅ ２０１２）。残念なことに、アゴニスト存在下で熱安定化される受容体は、それぞれのアゴニストに対する顕著なアフィニティの増加を示さず（Ｓｅｒｒａｎｏ−Ｖｅｇａら、２００８、Ｓｈｉｂａｔａら、２００９、Ｌｅｂｏｎら、２０１１）、このことは、これらの熱安定化された受容体が、この受容体の完全に活性な立体構造を採用していないことを示す。

【0208】

活性な状態のβ２ＡＲ受容体のすべての特性を有する融合タンパク質であるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物が、増加した熱安定性を有するかどうかを調べるために、本願発明者らは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９について熱安定性アッセイを行ない、受容体の活性な立体構造を安定化するＧタンパク質様の挙動を有するナノボディ（Ｎｂ８０）もこの熱安定性を高めるかどうかを測定し、真に立体構造が熱安定化された受容体を生じる。

【0209】

受容体を可溶化するために、本願発明者らは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０またはβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のいずれかを発現するＳｆ９細胞からの膜（合計膜タンパク質が約１ｍｇ）を、１％ＤＤＭ（２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、１％のｎ−ドデシル β−Ｄ−マルトシド、１０μｇ／ｍｌのロイペプチド、０．２ｍＭのＰＭＳＦ）中、氷上で１時間インキュベートした。次に、不溶性の物質を１７０００ｇで５分間、遠心分離によって除去した。次いで、可溶化した受容体をバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ）で、ＤＤＭ濃度が０．０８％ＤＤＭになるまで希釈し、不溶性の物質を再び遠心分離によって除去した（２００００ｇ、４℃で２０分間）。可溶化した受容体の小分け分２０μｌをアッセイバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、１％のｎ−ドデシル β−Ｄ−マルトシド）で９０μｌになるまで希釈し、氷上で３０分間放置した。

【0210】

リガンドが存在しない状態で、特定の温度で３０分間、希釈した小分け分をインキュベートすることによって、熱安定性を評価した。３０分後、過剰な放射性リガンド（最終濃度５ｎＭ）を各サンプルに加え、およびサンプルを氷上で４５分間放置した。

【0211】

機能的な受容体の残りのフラクションを定量するために、氷冷したアッセイバッファーで平衡化したセファデックスＧ５０カラム２ｍｌを用いたゲル濾過によって、受容体に結合した放射性リガンドを遊離の放射性リガンドから分離した。受容体に結合した放射性リガンドを１ｍｌの容積で集め、６ｍｌのシンチレーション液（Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ Ｈｉｓａｆｅ２、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号１２００−４３６）で希釈し、液体シンチレーション分析機Ｔｒｉ−ｃａｒｂ２８１０ＴＲ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で、放射活性（ｃｐｍ）を計測した。この非特異的な結合は、１μＭの未標識アルプレノロールの存在下、タンパク質フラクションに残った放射活性を測定することによって概算された。

【0212】

データは、０℃での受容体が結合したリガンドに対し、所与の温度で受容体に特異的に結合する放射性リガンドの平均±ＳＥＭ（実験は３回ずつ行った。）を表す。これらの実験は、０．０８％のＤＤＭ中、可溶化されたβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラ（Ｔｍ＝３３℃）が、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９（Ｔｍ＝２９℃）よりも高い熱安定性を有することを示す（図７）。Ｎｂ８０は、β２ＡＲの活性な立体構造を安定化するため、本願発明者らは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラが、立体構造が熱安定化された受容体を表すと結論付ける。

【0213】

［実施例８］
β２ＡＲ−ナノボディ融合物の薬理特性と、外から加えられたナノボディとの複合体において、融合していないβ２ＡＲの薬理特性との比較
融合したＮｂ８０と、融合していないＮｂ８０とが、β２ＡＲの活性な状態を安定化する有効性を比較するために、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物の薬理特性を、外から加えられたＮｂ８０との複合体において、融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎと比較した。本願発明者らは、実施例６に記載したのと同様の比較放射性リガンド競争実験を行った。天然アゴニストであるエピネフリン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｅ４２５０）を競争剤として、［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールを放射性リガンドとして使用した。β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合物と、外から加えられたＮｂ６９との複合体におけるβ２ＡＲ３６５Ｎをコントロールとして並行してアッセイした。

【0214】

β２ＡＲ３６５Ｎ（ナノボディが融合していない）、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０またはβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のいずれかを発現するＳｆ９昆虫細胞膜（合計タンパク質５μｇ）について、放射性リガンド競争結合実験を行った。β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物またはβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合物のいずれかを発現するＳｆ９細胞の膜を、結合バッファー（７５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＢＳＡ）中、１０^−１０Ｍから１０^−４Ｍの範囲の異なる濃度のエピネフリンと混合した。並行して、５０ｐＭから５００ｎＭの範囲の異なる濃度の精製されたＮｂ８０またはＮｂ６９を、結合バッファー中で１０^−１０Ｍから１０^−４Ｍの範囲の異なる濃度のエピネフリンと混合する前に、融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎを発現するＳｆ９細胞の膜に加えた。次に、それぞれの条件に、放射性リガンド［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールを加え（最終濃度が２ｎＭ）、振とうプラットフォームでサンプルを室温で２時間インキュベートした（アッセイ点あたりの合計反応容積は２５０μｌであった。）。リガンドが結合した膜を厚め、放射活性を実施例６に記載するように測定した。データは、３回ずつ行った各データ点の平均±ＳＥＭを表す。

【0215】

データは、３回ずつ行った各実験の平均±ＳＥＭを表す。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ）によって、非線形回帰分析によって決定された。

【0216】

図８から観察することができるように、天然アゴニストであるエピネフリンに対する融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎのアフィニティは、Ｎｂ８０の濃度に依存して変わり、明らかなアフィニティの増加は、外から加えられたＮｂ８０の濃度の上昇に伴って起こった。５００ｎＭのＮｂ８０存在下、β２ＡＲ３６５Ｎのエピネフリンの効力の変化は、わずか８７倍であり、一方、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物（モック融合物のＩＣ５０を、外から加えられたＮｂ８０存在下、融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎ、およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０のそれぞれのＩＣ５０によって割り算することによって計算される。）について５３４倍であった。５μＭの外因性Ｎｂ８０が存在するだけで、融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎを用いて得られたＩＣ５０は、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物を用いて得られたＩＣ５０と同じである。天然アゴニストであるエピネフリンに対し、融合していないβ２ＡＲ３６５Ｎとβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物の匹敵するアフィニティを測定するために、５μＭの遊離Ｎｂ８０を、融合していない受容体に加えなければならない。従って、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物におけるＮｂ８０の効果的な分子内濃度は、５００ｎＭより高いように思われる。

【0217】

Ｓｆ９膜中のＢ２ＡＲの量は、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物について、全膜タンパク質のｍｇあたり約２０ｐｍｏｌであると決定された。従って、５μｇのβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０ Ｓｆ９膜は、約０．１ｐｍｏｌのβ２ＡＲを含む。５μＭの外から加えられたＮｂ８０（反応容積２５０μｌ中）は、約１．２５ｎｍｏｌのＮｂ８０に対応する。受容体をこのエピネフリンが結合した活性な状態に拘束し、試験した条件で、β２ＡＲ−Ｎｂ８０融合物と比較して同じ有効性を有するために、β２ＡＲに１２５００倍モル過剰の外から加えられたＮｂ８０が必要であり、Ｎｂ８０が融合しているかどうかにかかわらず、同じβ２ＡＲの発現が推定される。

【0218】

活性な状態に拘束されたβ２ＡＲと拘束されていないβ２ＡＲとについて、比較放射性リガンド競争アッセイによって得られる結果（実施例６および８）によって、（パーシャル）アゴニスト（ＩＣ５０の比率が１０より大きい）を、アンタゴニストおよびインバースアゴニスト（ＩＣ５０の比率が１未満）と区別することができる（表３）。細胞受容体シグナル伝達アッセイを必要とすることなく、ｎＭからμＭ濃度での試験化合物（アゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト）の作用態様を区別し、予想する能力は、化合物スクリーニングの強みである。

【0219】

［実施例９］
Ｍ２Ｒ−ナノボディ融合タンパク質構築物の作製
この実施例で記載されるＧＰＣＲ−ナノボディ融合物は、ペプチドリンカーと接続した２種類の異なるタンパク質を含むキメラポリペプチドであり（ＧＰＣＲ Ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体（Ｍ２Ｒ）、このリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４９）およびナノボディ）、すべてがアミノ末端からカルボキシ末端までこの順序で融合した。これらのタンパク質をコードする遺伝子を、以下に記載するように融合し（図９）、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター内でクローン化した。

【0220】

ＧＰＣＲ部分は、合成によって合成され、インフルエンザウイルス（ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ；配列番号５２）、その後、Ｆｌａｇエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤ；配列番号５０）、その後、ＴＥＶ開裂部位（ＥＮＬＹＦＱＧ；配列番号５１）、その後、ヒトＭ２ムスカリン性アセチルコリン受容体のコード配列から誘導され、細胞内ループ３が欠失したＭｅｔ１からＡｒｇ４６６を包含し、アミノ酸Ｐｒｏ２３３からＬｙｓ３７４までがＴｈｒおよびＡｒｇに置き換わった開裂可能なヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質シグナルペプチド（ＳＰ）をコードする。グリコシル化部位（Ｍ２Δｉ３Ｒ；配列番号５）を破壊するために、点変異（Ｎ２Ｄ、Ｎ３Ｄ、Ｎ６Ｄ、Ｎ９Ｄ）がこの構築物に導入された。Ｓｆ９細胞における受容体の細胞発現レベルを増加させるために、このムスカリン性受容体の遺伝子操作が行われた。

【0221】

Ｎｂ９−１（配列番号１６）は、アゴニストが結合し、Ｇタンパク質様の挙動を示す（Ｇタンパク質模倣物とも呼ばれる。）Ｍ２Δｉ３Ｒに選択的に結合するナノボディであり、これにより、アゴニスト・Ｍ２Δｉ３Ｒ・Ｎｂ９−１複合体における受容体の活性な状態の立体構造を安定化する。Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１融合物は、昆虫細胞の発現について最適化され、Ｇｅｎｅａｒｔによって合成された（ｐＭＫ−ＲＱＭ２Δｉ３−Ｎｂ９−１；実験室参照番号ＣＡ７９０８；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。受容体−ナノボディ融合物は、ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてＢａｍＨＩ−ＸｂａＩが開いたｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター中でクローン化され、ｐＦａｓｔＢａｃ１−Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１（実験室参照番号ＣＡ７９１１）が得られる。Ｍ２Δｉ３Ｒのオープンリーディングフレームのみをコードし、リンカーおよびナノボディを含まないコントロール構築物（ｐＦａｓｔＢａｃ１−Ｍ２Δｉ３Ｒ；実験室参照番号ＣＡ７９１４）を、ｐＭＫ−ＲＱＭ２Δｉ３ＲからのＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩフラグメント（Ｇｅｎｅａｒｔによって合成、実験室参照番号７９０９）をｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター中でクローン化することによって構築した。すべての構築物をＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０細胞に移した。Ｍ２Δｉ３Ｒコントロール構築物およびＭ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ融合構築物によってコードされるアミノ酸配列を図９ＢおよびＣに示す（配列番号５および６）。Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−８融合構築物を同様の様式で作製した。Ｎｂ９−８（配列番号１７）は、Ｇタンパク質様の挙動を有するＭ２Ｒ特異的なナノボディの別の態様である（Ｋｒｕｓｅ、２０１３）。

【0222】

［実施例１０］
バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞におけるＭ２Δｉ３Ｒ−ナノボディ融合物およびＭ２Δｉ３Ｒの発現
Ｍ２Δｉ３Ｒ−ナノボディ融合物をコードするバクミドを産生するために、１ｎｇのｐＦａｓｔＢａｃ１−Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１を、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（Ｒ）バキュロウイルス発現系を用い、製造業者の指示に従って、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）細胞内でトランスフェクションし、実施例２に記載するように一晩接種した。白色コロニーを取り出し、バクミドを精製し、オープンリーディングフレームの配列を再確認した。Ｍ２Δｉ３Ｒ−ナノボディ９−１バクミドおよびＭ２Δｉ３Ｒバクミドをトランスフェクションすることによって、組み換えバキュロウイルスをＳｆ９細胞中で産生した。

【0223】

Ｐ１およびＰ２バキュロウイルスストックを実施例２に記載したように調製した。新しく成長させたＳｆ９細胞を、４×１０^６／ｍｌの密度で、１００倍希釈したＰ２バキュロウイルスストックで感染させることによって、Ｍ２Δｉ３ＲまたはＭ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１融合物の組み換え発現を達成した。感染した細胞を２７℃（１３０ｒｐｍ）で４８時間から６０時間培養した後、集めた。ＧＰＣＲ−ナノボディハイブリッドの発現を、生きた細胞での蛍光顕微鏡観察によって確認した。この組み換えタンパク質を発現する細胞を氷冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１．５ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、ペレット化し、−８０℃で保存した。

【0224】

［実施例１１］
Ｍ２Δｉ３ＲまたはＭ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ融合物を発現する昆虫細胞からの膜の調製）
組み換えＭ２Δｉ３ＲまたはＭ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ融合物を発現するＳｆ９細胞の新鮮な５０ｍｌ培養物の遠心分離によって得られる細胞ペレットを、実施例４に記載するように膜抽出物へと処理し、実際に保存した。合計タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用い、製造業者の指示に従って測定した。これらのＧＰＣＲ−ナノボディハイブリッドの薬理特性を放射性リガンド競争アッセイによって分析した（実施例１２）。

【0225】

［実施例１２］
比較放射性リガンド競争アッセイによる、Ｍ２Δｉ３Ｒ−ナノボディ融合物の薬理特性の分析
Ｍ２Δｉ３Ｒ−ナノボディ融合物の薬理特性を分析するために、本願発明者らは、カルバコール（全アゴニスト、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ４３８２）およびオキソトレモリンＭ（アゴニスト、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｏ１００）を競争剤として、［^３Ｈ］−Ｎメチルスコポラミン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号ＮＥＴ６３６００１ＭＣ）を放射性リガンドとして用い、比較放射性リガンド競争実験を行った。

【0226】

Ｍ２Δｉ３Ｒ（ナノボディが融合していない）またはＭ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１のいずれかを発現するＳｆ９昆虫細胞膜について、放射性リガンド競争結合実験を行った。異なる組み換えタンパク質を発現するＳｆ９細胞の膜（実施例１０および１１、合計タンパク質１０μｇ）を、結合バッファー（７５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＢＳＡ）中、１０^−９Ｍから１０^−２Ｍの範囲の濃度で、カルバコールまたはオキソトレモリンＭのいずれかと混合した。次に、それぞれの希釈物に放射性リガンド［^３Ｈ］−Ｎメチルスコポラミンを加え（最終濃度０．５ｎＭ）、振とうプラットフォームでサンプルを室温で２時間インキュベートした（アッセイ点あたりの合計反応容積は２５０μｌであった。）。受容体が結合した放射性リガンドを、９６ウェルのＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ収集器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用い、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃユニフィルタ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００５１７４）で、遊離した放射性リガンドから濾過によって分離した。濾過の後、フィルタプレートに保持された膜を、氷冷した洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４）で洗浄し、フィルタを５０℃で１時間乾燥させた。３５μｌのシンチレーション液（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ（商標）−Ｏ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６０１３６１１）を加えた後、フィルタ上に保持された放射活性（ｃｐｍ）を、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘシンチレーションカウンタで測定した。

【0227】

本願発明者らは、Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１融合物の薬理特性と、Ｍ２Δｉ３Ｒの薬理特性とを比較した（図１０）。本願発明者らは、Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１キメラの薬理特性が、コントロールＭ２Δｉ３Ｒの薬理特性と異なっていることを発見し、Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１融合物およびＭ２Δｉ３Ｒに対する試験リガンドのＩＣ５０およびＩＣ５０の比率によって例示される（表４）。合成アゴニストであるカルバコールに対し、コントロールの融合していないＭ２Δｉ３Ｒと比較して、Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１キメラの増加したアフィニティは、ＩＣ５０_{Ｍ２Δｉ３Ｒ}／ＩＣ５０^ｈｉｇｈ_{Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１}の比率として計算され（図１０Ａ）、約６７の明らかな効力の変化が得られる。合成アゴニストオキソトレモリンＭに対して得られるこの比率は３１６であり、Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−１キメラが、活性な状態の立体構造を採用していることを示す（図１０Ｂ）。同様に、Ｍ２Δｉ３Ｒ−Ｎｂ９−８融合物は、融合していないＭ２Δｉ３Ｒと比較して、合成アゴニストであるカルバコールに対し、高いアフィニティを有する（データは示さない。）。

【0228】

［実施例１３］
β１ＡＲ−ナノボディ融合タンパク質構築物の生成
この実施例に記載されるＧＰＣＲ−ナノボディ融合物は、ペプチドリンカーと接続した２種類の異なるタンパク質を含むキメラポリペプチドであり（β１アドレナリン作動性受容体（β１ＡＲ）、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号６０）およびナノボディ）、すべてがアミノ末端からカルボキシ末端までこの順序で融合した。これらのタンパク質をコードする遺伝子（図Ｆ１１Ａ）を、以下に記載するように融合した。

【0229】

Ｇｅｎｅａｒｔによって、合成β１ＡＲ遺伝子を合成した（ｐＭＫ−ＲＱ ｈｂｅｔａ１ＡＲ；実験室参照番号ＣＡ ＣＡ７９１０）。これは、インフルエンザウイルス（ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ；配列番号５２）、その後、Ｆｌａｇエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＡ；配列番号５３）、その後、ＴＥＶ開裂部位（ＥＮＬＹＦＱＧ；配列番号５１）、その後、Ｐｒｏ５０からＡｒｇ４０１を包含するヒトβ１アドレナリン作動性受容体のコード配列（ｈβ１ＡＲ、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８５８８）から誘導される開裂可能なヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質シグナルペプチド（ＳＰ）をコードする。β１ＡＲコード配列は、Ｓｆ９細胞における受容体の細胞発現レベルを高めるために、細胞内ループ３（Ｓｅｒ２６０からＧｌｙ３０４まで）の欠失と、２つの点変異Ｃ３９２Ｓ、Ｃ３９３Ｓを含む。β１ＡＲおよびβ２ＡＲのアミノ酸配列のアラインメントは、β２ＡＲ・Ｇ複合体中のＮｂ８０エピトープを構成するアミノ酸側鎖（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ａ）が、β２ＡＲ中、リジンによって置き換わったＲ３１８（β１ＡＲ番号付け；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８５８８）以外は、β１ＡＲおよびβ２ＡＲと同一であることを示す。この観察に基づき、１つのこれ以外の点変異Ｒ３１８Ｋが導入され、β１ＡＲ中、全Ｎｂ８０エピトープを作製した。

【0230】

それぞれのナノボディをコードするナノボディ遺伝子セグメントを、実施例１に記載するプラスミドからクローン化した。Ｎｂ８０（配列番号１３）は、全アゴニスト、例えば、ＢＩ−１６７１０７に結合したβ２ＡＲの活性な状態を安定化するβ２ＡＲナノボディである（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ｂ）。Ｎｂ６９（配列番号１５）は、ムスカリン性３受容体に特異的であり、β２ＡＲについて検出可能なアフィニティを有しない。

【0231】

β１ＡＲ受容体を、ＢａｍＨＩの開いたｐＦａｓｔＢａｃ β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０（ＣＡ６８３６）ベクターから、ｐＭＫ−ＲＱ ｈｂｅｔａ１ＡＲ（実験室参照番号ＣＡ７９１０）からＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてクローン化し、β２ＡＲ受容体を置き換え、ｐＦａｓｔＢａｃ−ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０（実験室参照番号ＣＡ７９２３）が得られる。Ｎｂ６９に接続したβ１ＡＲオープンリーディングフレームをコードするコントロール構築物ｐＦａｓｔＢａｃ−ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９（実験室参照番号ＣＡ７９２４）を、ｐＦａｓｔＢａｃ β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９（ＣＡ６８３３）中、ｐＭＫ−ＲＱ ｈｂｅｔａ１ＡＲからの同じＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをクローン化することによって構築し、β２ＡＲ受容体を置き換えた。すべての構築物をＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０細胞中で形質転換した。ｈｂｅｔａ１ＡＲ−Ｎｂ融合構築物をコードするアミノ酸配列を図１１Ｂ−Ｃに示す（配列番号７および８）。

【0232】

［実施例１４］
バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞におけるβ１ＡＲ−ナノボディ融合物の発現
β１ＡＲ−ナノボディ融合物の１つをコードするバクミドを産生するために、１ｎｇのｐＦａｓｔＢａｃ−ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０またはｐＦａｓｔＢａｃ−β１ＡＲ−Ｎｂ６９を、製造業者の指示に従って、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（Ｒ）バキュロウイルス発現系を用い、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）細胞内で形質転換し、実施例２に記載されるように一晩接種した。白色コロニーを取り出し、バクミドを精製しオープンリーディングフレームの配列を再確認した。β１ＡＲ−Ｎｂ８０バクミドおよびβ１ＡＲ−Ｎｂ６９バクミドをトランスフェクションすることによって、組み換えバキュロウイルスをＳｆ９細胞中で産生した。

【0233】

Ｐ１およびＰ２バキュロウイルスストックを実施例２に記載したように調製した。新しく成長させたＳｆ９細胞を、４×１０^６／ｍｌの密度で、１００倍希釈したＰ２バキュロウイルスストックで感染させることによって、β１ＡＲ−Ｎｂ８０またはβ１ＡＲ−Ｎｂ６９融合物の組み換え発現を達成した。感染した細胞を２７℃（１３０ｒｐｍ）で４８時間から６０時間培養した後、集めた。この組み換えタンパク質を発現する細胞を氷冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１．５ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、ペレット化し、−８０℃で保存した。

【0234】

［実施例１５］
ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０またはｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９融合物を発現する昆虫細胞からの膜の調製
組み換えｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０またはｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９融合物を発現するＳｆ９細胞の新鮮な５０ｍｌ培養物の遠心分離によって得られる細胞ペレットを、実施例４に記載するように膜抽出物へと処理し、実際に保存した。合計タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用い、製造業者の指示に従って測定した。これらのＧＰＣＲ−ナノボディハイブリッドの薬理特性を放射性リガンド競争アッセイによって分析した（実施例１６）。

【0235】

［実施例１６］
比較放射性リガンド競争アッセイによる、ｈβ１ＡＲ−ナノボディ融合物の薬理特性の分析
異なるｈβ１ＡＲ−ナノボディ融合物の薬理特性を分析するために、本願発明者らは、天然アゴニストであるエピネフリン、次いで、インバースアゴニストＩＣＩ−１１８，５５１塩酸塩またはニュートラルアンタゴニストアルプレノロール塩酸塩を競争剤として、ニュートラルアンタゴニスト［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールを放射性リガンドとして用い、比較放射性リガンド競争実験を行った。異なるリガンドの薬理特性は、Ｋａｈｓａｉら（２０１１）に従う。

【0236】

異なる組み換えタンパク質を発現するＳｆ９細胞の膜（実施例１４および１５、合計タンパク質５μｇ）を、結合バッファー（７５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＢＳＡ）中、１０−^１１Ｍから１０^−４Ｍの範囲の濃度で、エピネフリン、ＩＣＩ１１８，５５１またはアルプレノロールのいずれかと混合した。次に、それぞれの希釈物に放射性リガンド［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールを加え（最終濃度２ｎＭ）、振とうプラットフォームでサンプルを室温で２時間インキュベートした（アッセイ点あたりの合計反応容積は２５０μｌであった。）。受容体が結合した放射性リガンドを、実施例６に記載するように、遊離放射性リガンドから分離した。データは、３回ずつ行われた各実験の平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）で表す。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ）によって、非線形回帰分析によって決定された。

【0237】

このシリーズの実験において、本願発明者らは、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０融合物の薬理特性と、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９融合物の薬理特性とを比較した（図１２Ａ）。本願発明者らは、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０キメラの薬理活性が、コントロールであるＮｂ６９融合受容体の薬理特性と顕著に異なることを発見した。Ｎｂ６９キメラと比較して、Ｇタンパク質様の挙動を有するナノボディ（Ｎｂ８０）に融合したｈβ１ＡＲは、アゴニストであるエピネフリンに対する増加したアフィニティおよびインバースアゴニスト（ＩＣＩ−１１８，５５１）に対する低下したアフィニティを示し、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０融合物およびｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９融合物に対する試験リガンドの調整されたＩＣ５０によって例示される（表５）。これにより、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０キメラは、コントロールであるモックβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラとは異なり、アゴニストに対する増加したアフィニティおよびインバースアゴニストに対する低下したアフィニティを特徴とする活性な状態の立体構造を採用していることがわかった。

【0238】

コントロールであるｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９と比較して、天然アゴニストであるエピネフリンに対し、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０キメラの増加したアフィニティは、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９のＩＣ５０を、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０のＩＣ５０^ｈｉｇｈで割り算することによって図１２Ａに示される競争結合実験のＩＣ５０値の比率によって計算することができ、約６８の明らかな効力の変化が得られる。コントロールであるｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９と比較して、インバースアゴニストであるＩＣＩ−１１８，５５１に対し、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０キメラの低下したアフィニティは、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９のＩＣ５０を、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０のＩＣ５０^ｈｉｇｈで割り算することによって図１２Ｂに示される競争結合実験のＩＣ５０値の比率によって計算することができ、約０．０７７の明らかな効力の変化が得られる。

【0239】

特に、ｈβ１ＡＲ−Ｎｂ８０融合物は、コントロールであるｈβ１ＡＲ−Ｎｂ６９キメラと比較して、ニュートラルアンタゴニストであるアルプレノロールに対するアフィニティについて、ほとんど影響がない。アルプレノロールに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０（図１２Ｃ）は、実際に非常に類似しており、ニュートラルアンタゴニストが、異なる機能的な立体構造に結合する非選択的なリガンドであるという事実と一致する。

【0240】

［実施例１７］
β２ＡＲ−Ｎｂ６０融合構築物の生成
この実施例に記載されるＧＰＣＲ−ナノボディ融合物は、ペプチドリンカーと接続した２種類の異なるタンパク質を含むキメラポリペプチドであり（ＧＰＣＲ β２ＡＲ、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５１）およびＮｂ６０）、すべてがアミノ末端からカルボキシ末端までこの順序で融合した。これらのタンパク質をコードする遺伝子を、最低限調節しつつ実施例１に記載するように融合した。

【0241】

ＧＰＣＲ部分は、インフルエンザウイルス（ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ；配列番号５２）、その後、Ｆｌａｇエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＡ；配列番号５３）、その後、ＴＥＶ開裂部位（ＥＮＬＹＦＱＧＦ；配列番号５４）、その後、Ｇｌｙ２からＧｌｙ３６５を包含するヒトβ２アドレナリン作動性受容体のコード配列（配列番号５５）によって誘導される開裂可能なヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質シグナルペプチド（ＳＰ）をコードするＤＮＡから増幅された。Ｎ１８７Ｅの点変異は、この望ましくないグリコシル化部位を破壊するために、この構築物にも導入された（β２ＡＲ３６５Ｎ；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ｂ）。β２ＡＲ３６５Ｎに対するβ２アドレナリン作動性受容体の遺伝子操作が行われ、Ｓｆ９細胞における受容体の細胞発現レベルを増加させた。

【0242】

ナノボディ遺伝子セグメントは、Ｎｂ６０をコードするファージミドから増幅された。Ｎｂ６０（配列番号１８）は、不活性なβ２ＡＲの立体構造を安定化し、Ｇタンパク質の活性化およびβ−アレスチンの補充を顕著に阻害するβ２ＡＲ特異的なナノボディである（Ｓｔａｕｓら、２０１３）。

【0243】

ＧＰＣＲおよびナノボディは、オーバーラップエクステンションＰＣＲのフレーム内で遺伝的に融合した。従って、ＧＰＣＲ ｃＤＮＡを含有する２ｎｇのプラスミドを、５０μｌのＰＣＲ反応のテンプレートとして使用し（Ｐｈｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０５３０Ｓ）、プライマーＥＰ２３２（５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＣＣＧＡＡＧ−３’；配列番号６１）およびプライマーＥＰ２０７（５’−ＣＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧ−３’；配列番号５７）を用い、β２ＡＲをコードするＤＮＡ（ＣＡ６８１７）を増幅した。プライマーＥＰ２３２は、コード配列の５’末端で、ＥｃｏＲＩ制限部位の５’をアニーリングする。プライマーＥＰ２０７は、受容体のＣ末端にＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５１）リンカーの一部を組み込む。この反応の増幅条件は、融合物のオープンリーディングフレームをコードするＧＰＣＲを増幅させるために、９８℃で３０秒間、９８℃で１０秒間、６４．５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を２５サイクル、その後、７２℃で５分間であった。

【0244】

Ｎｂ６０は、実施例１のナノボディと同一のＮ末端配列およびＣ末端配列を有する。このナノボディＤＮＡを、５０μｌの反応中、２ｎｇのテンプレート（ＣＡ２７６０）およびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用い、実施例１に記載するように増幅した。以下の増幅条件を使用した。ハイブリッドの一部をコードするナノボディを増幅するために、９８℃で３０分間、９８℃で１０秒間および７２℃で１０秒間を２５サイクル、その後、７２℃で５分間であった。

【0245】

ＧＰＣＲまたはナノボディをコードするＰＣＲフラグメントを、新しい５０μｌのＰＣＲ反応中、ＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）をテンプレートとして用いて精製し、６ｎｇのＥＰ２３２−β２ＡＲ−ＥＰ２０７（ＥＰ２３２およびＥＰ２０７は、ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーを指す。）によって増幅したＰＣＲフラグメントを、約２ｎｇの増幅したＥＰ２０６−ナノボディ−ＥＰ２０２フラグメントと混合し、以下のようなオーバーラップエクステンションによって、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いて融合させた。９８℃で３０秒間での融解、および９８℃で１０秒間、７２℃で３０秒間を５サイクルの後、融合したβ２ＡＲ−ナノボディのオープンリーディングフレームを、プライマーＥＰ２３２およびＥＰ２０２を用いて２５サイクル（９８℃で１０秒間、６７℃で３０秒間、７２℃で４０秒間）、その後、７２℃で５分間増幅した。β２ＡＲ−Ｎｂ６０のオープンリーディングフレームを含むＰＣＲフラグメントを精製し、ｐＦａｓｔＢａｃ１中でＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０中で形質転換した。プラスミドＤＮＡを、１つのコロニーから調製し、オープンリーディングフレームの配列をシークエンシングによって確認した。構築物は、ｐＦａｓｔＢａｃ β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０（実験室参照番号ＣＡ８２３５）と名付けられた。異なるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ融合構築物によってコードされるアミノ酸配列を図２Ｅに与える（配列番号４）。

【0246】

［実施例１８］
バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞におけるβ２ＡＲ−Ｎｂ６０の発現およびβ２ＡＲ−Ｎｂ６０融合物を発現する昆虫細胞からの膜の調製
Ｓｆ９細胞においてβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０融合物を発現するために、β２ＡＲ−Ｎｂ６０融合物をコードするバクミドを作製し、Ｓｆ９細胞を実施例２に記載するように感染させた。β２ＡＲ−Ｎｂ６０融合物を発現する昆虫細胞からの膜を、実施例４に記載するように調製した。これらのＧＰＣＲ−ナノボディハイブリッドの薬理特性を、放射性リガンド競争アッセイによって分析した（実施例１９）。

【0247】

［実施例１９］
比較放射性リガンド競争アッセイによるβ２ＡＲ−Ｎｂ６０融合物の薬理特性の分析
β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０融合物の薬理特性を分析するために、本願発明者らは、天然アゴニストであるエピネフリン、（−）−イソプロテレノール塩酸塩（全アゴニスト）およびＩＣＩ−１１８，５５１塩酸塩（インバースアゴニスト）を競争剤として、ニュートラルアンタゴニスト［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールを放射性リガンドとして用い、比較放射性リガンド競争実験を行った。異なるリガンドの薬理特性は、Ｋａｈｓａｉら．（２０１１）に従う。

【0248】

β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０またはβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のいずれかを発現するＳｆ９昆虫細胞膜について、放射性リガンド競争結合実験を行った。異なる組み換えタンパク質を発現するＳｆ９細胞の膜（実施例２および４、合計タンパク質５μｇ）を、結合バッファー（７５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＢＳＡ）中、１０^−１１Ｍから１０^−２Ｍの範囲の濃度で、エピネフリン、（−）−イソプロテレノールまたはＩＣＩ１１８，５５１のいずれかと混合した。次に、それぞれの希釈物に放射性リガンド［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールを加え（最終濃度２ｎＭ）、振とうプラットフォームでサンプルを室温で２時間インキュベートした（アッセイ点あたりの合計反応容積は２５０μｌであった。）。受容体が結合した放射性リガンドを、実施例６に記載するように、遊離放射性リガンドから分離した。データは、３回ずつ行われた各実験の平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）で表す。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ）によって、非線形回帰分析によって決定された。

【0249】

これらの実験において、本願発明者らは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０融合物の薬理特性と、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラの薬理特性とを比較した（図１３Ａ）。Ｎｂ６０は、不活性なβ２ＡＲ立体構造を安定化すると主張されているナノボディであり（Ｓｔａｕｓら、２０１３）、Ｎｂ８０は、アゴニストが結合したβ２ＡＲに選択的に結合し、Ｇタンパク質様の挙動を示すナノボディであり、従って、アゴニスト・β２ＡＲ・Ｎｂ８０複合体において、受容体の活性な状態の立体構造を安定化する（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２０１１ｂ）。Ｎｂ６９は、ラットムスカリン性受容体Ｍ３に特異的に結合し、β２ＡＲに対する検出可能なアフィニティを有しないモックナノボディである。本願発明者らは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０キメラの薬理特性が、コントロールであるＮｂ６９融合受容体の薬理特性と顕著に異なることを発見した。Ｎｂ６９キメラと比較し、Ｎｂ６０に融合したβ２ＡＲは、アゴニスト（エピネフリン、イソプロテレノール）に対する低下したアフィニティを示し、インバースアゴニストＩＣＩ−１１８，５５１に対するアフィニティにほとんど影響がなく、Ｎｂ６０およびＮｂ６９融合物に対する試験リガンドの調整されたＩＣ５０によって例示される（表６）。これによって、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０キメラは、コントロールであるモックβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９キメラと異なり、アゴニストが結合した活性な状態の立体構造とは異なり、受容体の基本立体構造とは異なる立体構造を採用することがわかる。この立体構造は、アゴニストに対する低下したアフィニティを特徴とする。本願発明者らの結果は、異なるナノボディが、受容体の異なる立体構造状態を安定化することができることを明らかに示す。

【0250】

コントロールであるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９と比較して、天然アゴニストであるエピネフリンに対し、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０キメラの低下したアフィニティ（β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラの増加したアフィニティに対する。）は、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０を、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０のＩＣ５０で割り算することによって図１３Ａに示される競争結合実験のＩＣ５０値の比率によって計算することができ、約０．００４６の明らかな効力の変化が得られる（Ｎｂ６９融合物と比較して、Ｎｂ８０融合物の場合、約８５５に対する。）。合成アゴニストであるイソプロテネロールに対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０の低下したアフィニティは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０を、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６０のＩＣ５０で割り算することによって競争結合実験のＩＣ５０値の比率によって計算することができ（図１３Ｂ）、約０．０１２の明らかな効力の変化が得られる（Ｎｂ６９融合物と比較して、Ｎｂ８０融合物の場合、約１５５に対する。）。

【0251】

［実施例２０］
ミューオピオイド受容体−ナノボディ融合構築物の作製
Ｍｏｒ１ ＡＡ配列は、異なる哺乳動物種間で高度に保存されている。さらに具体的には、予想される細胞内トポロジカルドメイン（ＩＣＬ＋Ｃ末端）についてのマウス、ウシ、ブタおよびヒトＭｏｒ１の間の交差種の配列同一性は、９０％を超える。Ｎｂ３３が、マウスＭｏｒ１の細胞内エピトープと相互作用することが知られており、本願発明者らは、ＩＣＬ２にたった１つの保存された置換（図１４の「：」によって示される。）、Ｃ末端に１つの半保存された置換（図１４で「．」によって示される。）が存在する場合、Ｎｂ３３が、ｈＭｏｒ１の活性な立体構造も安定化させることが予測される。

【0252】

この実施例に記載されるＧＰＣＲ−ナノボディ融合物は、実施例１に記載されるものと類似するキメラポリペプチドをコードする。ここで、本願発明者らは、ナノボディＮｂ３３（実験室参照番号ＸＡ８６３３）に遺伝的に融合され、３４ＡＡ Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号６２）によって分割されたヒトミューオピオイド受容体（ｈＭｏｒ１、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００９１４．１）を記載する。ｈＭｏｒ１をコードするオープンリーディングフレームを、昆虫細胞発現のために最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして特注で合成した。合成ハイブリッド遺伝子のイラストを図１５に表す。図２Ａに示されるβ２ＡＲ融合物と比較して、オピオイド受容体融合物に対し、（ｉ）ＴＥＶ開裂部位が除去され、（ｉｉ）β２ＡＲ３６５Ｎが、ＡＡ残基１−３６０をコードするヒトＭｏｒ１ ｎｔ配列と置き換わり、さらなるＡＡ残基２−５（ＤＳＳＡ）の欠失、この直後に、３４ＧＳリンカーの前に３Ｃ開裂部位挿入（ＬＥＶＬＦＱＧＰ）を有する。Ｎｂ３３（実験室参照番号ＸＡ８６３３；配列番号１９）は、Ｇ_ｉ／ｏタンパク質様の挙動を示し（Ｇ_ｉ／ｏタンパク質模倣物とも呼ばれる。）、アゴニスト・Ｍｏｒ１・Ｎｂ３３複合体においてＭｏｒ１の活性な状態の立体構造を選択的に安定化する。Ｇ_ｉと同様に、過剰量のＮｂ３３を加えると、アゴニストＤｍｔ１−Ｄａｌｄａに対するマウスＭｏｒ１のアフィニティが少なくとも１０倍増加する。融合構築物において、Ｎｂ３３のコード配列を遺伝子操作し、ＦＲ１に固有のＰｓｔＩ制限部位を導入した。ｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３をコードする合成遺伝子を、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｐＦａｓｔＢａｃ１中でクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に形質転換し、ｐＦａｓｔＢａｃ１：：ｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３（実験室参照番号ＸＡ８９０１）が得られる。この融合物のコードするＡＡ配列を図１５Ａに示す。並行して、無関係のナノボディを含むｈＭＯＲ１の別の融合物を、主要な立体構造のＭｏｒ１を発現するコントロール構築物として作製した。従って、ｐＦａｓｔＢａｃ１：：ｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３中のＮｂ３３コード配列を、ナノボディＮｂ１０（実験室参照番号ＣＡ４９１０）をコードする遺伝子セグメントによって交換した。Ｎｂ１０（配列番号２０）は、ケモカインＧＰＣＲの細胞外エピトープに特異的であり、Ｍｏｒ１に対する検出可能なアフィニティを有しない、十分に特性決定されたナノボディである。融合物のためのＮｂ１０コード遺伝子セグメントを調製するために、Ｎｂ１０を、プライマーＡ６Ｅ（５’−ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＲＧＧＡＧＧ−３’；配列番号６３）を用い、ナノボディのＦＲ１にＰｓｔＩ部位（ＶをＱに変える。）および遺伝子ＩＩＩにオリゴハイブリダイズするＧＩＩＩ（５’−ＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＧ−３’；配列番号６４）を導入し、ＰＣＲによって再び増幅した。テンプレートとして、Ｎｂ１０遺伝子ＩＩＩ融合物を発現するファージミドｐＸＡＰ１００の５ｎｇのＤＮＡ調製物を使用した。この反応の増幅条件は、９４℃で３分間、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間を２５サイクル、その後、７２℃で１０分間であった。精製した後、アンプリコンを、ＰｓｔＩ（オリゴＡ６Ｅによって導入）およびＢｓｔＥＩＩ（ＦＲ４中の天然に生じる固有部位）で２回消化し、精製し、ｐＦａｓｔＢａｃ１：：ｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３から誘導される６．２ｋｂｐゲルの精製したＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントに連結し、ｐＦａｓｔＢａｃ１：：ｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ１０が得られる。融合物ｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ１０のコードするＡＡ配列（配列番号２０）を図１５Ｃに示す。クローニング後、両融合構築物のプラスミドＤＮＡを、１つのコロニーから調製し、ハイブリッド遺伝子の配列をシークエンシングによって確認した。

【0253】

［実施例２１］
バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞におけるミューオピオイド受容体−ナノボディ融合物の発現
Ｍｏｒ１−ナノボディ融合物をコードするバクミドを産生するために、５ｎｇのｐＦａｓｔＢａｃ１：：ｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３またはｐＦａｓｔＢａｃ１：：ｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ１０を、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）細胞内で形質転換した。Ｓｆ９細胞中、Ｍｏｒ１−ナノボディバクミドをトランスフェクションすることによって、組み換えバキュロウイルスを産生した。Ｐ１組み換えバキュロウイルスを、Ｎｂ１０融合物についてはトランスフェクションから７２時間後、Ｎｂ３３融合物については４８時間後に集める以外は、実施例２に記載するように、セルフェクチンＩＩが介在するＳｆ９トランスフェクションのために各バクミドを使用した。Ｐ１ウイルスストックを、液体窒素で凍結させた５％（最終濃度）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地上澄みを小分け分として−８０℃で保存した。Ｐ１を新しいＳｆ９培地で、１×１０^６細胞／ｍｌの密度で５０から１０００倍に希釈し、２７℃、１３０ｒｐｍで培養することによって、Ｐ２組み換えバキュロウイルスストックを作製した。Ｐ２ウイルスストックを感染から４８時間後および７２時間後に遠心分離によって集め、さらに使用するまで、上述のように−８０℃で保存した。細胞ペレットを、１．５ｍＭ ＥＤＴＡを追加した氷冷ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１００１０−０２３）で２回洗浄し、−８０℃で保存し、膜を調製した。異なるＭｏｒ１−Ｎｂ融合物の組み換え発現は、新しく成長させたＳｆ９細胞を、２ｅ６細胞／ｍｌの密度で、５０倍、２００倍および１０００倍に希釈したＰ２バキュロウイルスストックで感染させることによって達成した。ネガティブコントロール発現として、Ｓｆ９細胞を、Ｆｌａｇタグ付けした無関係なＭ２ＲのＰ２と並行して感染させた。感染した細胞を２７℃（１３０ｒｐｍ）で４８時間培養した後、集めた。細胞ペレットを、氷冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１．５ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、膜を調製するまで−８０℃で保存した。ＧＰＣＲ−ナノボディキメラの過剰発現は、フローサイトメトリーによって確認された（データは示さない。）。

【0254】

［実施例２２］
比較放射性リガンド競争アッセイによる、ｈＭＯＲ１−Ｎｂ融合物の薬理特性の分析
天然のＭｏｒ１の折り畳みおよびＮｂ３３による活性な立体構造異性体の安定化を確認するために、Ｓｆ９細胞におけるｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３またはｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ１０の過剰発現を、膜（Ｐ２）に対する放射性リガンドアッセイによって評価した。膜を調製するために、１Ｅ７ ｈＭｏｒ１ Ｓｆ９細胞を小分けしたものを、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷却した溶解バッファー１ｍｌに再懸濁させた（実施例４）。細胞懸濁物を、低容積Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ細胞混合機（ＩＫＡ）を用い、６回の１０秒のパルスを加え、氷上で均質化した。あらかじめ冷却しておいた遠心分離機において、細胞均質物を１５０００×ｇで３５分間遠心分離処理した。上澄みを捨て、膜ペレットを７５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％のスクロースで再び懸濁させ、さらなる使用まで−８０℃で保存した。膜調製物の合計タンパク質含有量は、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用い、製造業者の指示に従って決定された。

【0255】

ナノボディ融合物の組み換えＭｏｒ１の過剰発現（ｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３およびｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ１０膜；Ｐ２、７２時間インキュベーション）を、合計（ＴＢ）および［３Ｈ］−ジプレノルフィンアンタゴニスト放射性リガンドの非特異的な（ＮＳ）結合を測定することによって、放射性リガンドアッセイで確認した（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ｃａｔ ｎｒ ＮＥＴ１１２１）。

【0256】

組み換えＭｏｒ１の薬理特性を、ｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３またはｈＭＯＲ１−３４ＧＳ−Ｎｂ１０膜について（Ｐ２、発現７２時間）、放射性リガンド競争アッセイで評価する（Ｍａｎｇｌｉｋら、２０１２）。結合バッファーとして１％ＢＳＡを含有するＴＢＢ（７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ）中、１５μｇのｈＭｏｒ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３またはｈＭｏｒ１−３４ＧＳ−Ｎｂ１０ Ｓｆ９膜を９６ウェルプレートに移す。その後、未標識アゴニスト競争剤（Ｄｍｔ１−ＤａｌｄａまたはＫＧＯＰ０１）またはアンタゴニスト（ナロキソン）の順次希釈物を加える。１ｎＭの［^３Ｈ］−ジプレノルフィン（最終濃度）を加えた後、反応混合物（合計容積が１２５μｌ）を室温で１時間インキュベーションする。膜に結合した［３Ｈ］−ジプレノルフィンを、１％ＢＳＡを含むＴＢＢ中にあらかじめ浸しておいたＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃフィルタを通過させ、９６ウェルのＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ収集器によって、結合していない放射性リガンドから分離し、氷冷したＴＢＢ中にあらかじめで洗浄した。フィルタを５０℃で１時間乾燥させた。３５μｌのシンチレーション液（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ（商標）−Ｏ）を加えた後、フィルタに保持された放射活性（ｃｐｍ）を、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘシンチレーションカウンタで測定した。残った放射性リガンド結合の割合を計算し、代表的な実験の曲線を図１６に表す。このグラフのそれぞれの値は、３回のデータ点の平均を表す。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ）を用い、１サイトフィットｌｏｇＩＣ５０式を用い、ＩＣ５０を非線形回帰分析によって決定した。試験したすべてのリガンドについて得られたＩＣ５０を表ｘに示す。ｈＭｏｒ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３およびｈＭｏｒ１−３４ＧＳ−Ｎｂ１０ Ｓｆ９膜に対するアゴニストＤｍｔ−ＤＡＬＤＡのＩＣ５０は、それぞれ、６５５および１８である。試験したそれぞれのアゴニストリガンド（Ｄｍｔ１−ＤａｌｄａまたはＫＧＯＰ０１）について、最も高いアフィニティ（最小ＩＣ５０）は、ｈＭｏｒ１−３４ＧＳ−Ｎｂ１０膜で得られる値と比較して、ｈＭｏｒ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３膜で示される。それぞれのアゴニストについて、ＩＣ５０比率が２０以上であること（表７）は、活性な状態の拘束されたＭｏｒ１受容体のために好ましいことを示す。アンタゴニストであるナロキソンの場合、ＩＣ５０は、ｈＭｏｒ１−３４ＧＳ−Ｎｂ３３で決定するか、またはｈＭｏｒ１−３４ＧＳ−Ｎｂ１０膜で決定するかによらず、顕著に異ならない。このデータは、Ｎｂ３３融合物が、活性な立体構造異性体としてＭｏｒ１を発現し、アンタゴニストであるナロキソンに対するアゴニストのアフィニティが高いことを裏付けている。

【0257】

［実施例２３］
β２ＡＲ−Ｎｂ融合物に対する比較放射性リガンド置き換えアッセイを用いたフラグメントライブラリースクリーニング）
実施例６は、２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物の薬理特性が、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合物と比較して、基本的に異なっていることを示し、Ｎｂ８０融合物は、天然アゴニストおよび合成アゴニストに優先的に結合し、一方、インバースアゴニストに対する低いアフィニティを示す。実施例１２、１６、１９は、さらに、特定のＧＰＣＲ−Ｎｂ融合物の改変された薬理特性を示す。この知識に基づいて、本願発明者らは、これらの薬理学的違いを薬物開発に活用することができるか否かを試験した。

【0258】

一例として、本願発明者らは、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９と比較して、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０に対して異なるアフィニティで結合するフラグメントを特定するために、フラグメントライブラリーをスクリーニングした。

【0259】

β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９と比較して、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０に対して異なるアフィニティで結合するフラグメントを特定するために、本願発明者らは、立体構造選択的なフラグメントのために、分子量が８０から３００Ｄａの範囲のフラグメントを含むＭａｙｂｒｉｄｇｅ ＲＯ３フラグメントライブラリーの１０００フラグメントをスクリーニングした。すべてのフラグメントを、濃度２００ｍＭで１００％ＤＭＳＯに溶解した。第１に、１０００種類の異なるＭａｙｂｒｉｄｇｅフラグメントを１００％ＤＭＳＯで２０ｍＭまで希釈し、次いで、これを結合バッファー（７５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＢＳＡ）で４０倍に希釈した。比較放射性リガンド競争結合実験において、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物を発現するＳｆ９細胞の膜（１００μｌの結合バッファー中、合計タンパク質５μｇ）を、１２個の９６ウェルプレート中、１００μｌのそれぞれの１０００種類の希釈したフラグメントと混合した。並行して、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合物を発現するＳｆ９細胞の膜（１００μｌの結合バッファー中、合計タンパク質５μｇ）を、別個のシリーズの９６ウェルプレート中、１００μｌのそれぞれの同じ１０００種類の希釈したフラグメントと混合した。次に、それぞれのサンプル（合計で２０００サンプル）に、放射性リガンド［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールを加え（５０μｌ、最終濃度２ｎＭ）、振とうプラットフォームですべてを室温で２時間インキュベートした（アッセイ点あたりの合計反応容積は２５０μｌであった。）。それぞれのフラグメントの最終的なスクリーニング濃度は、２００μＭであった。各９６ウェルプレートには、コントロールとしてのエピネフリン（１Ｅ−７Ｍ）およびアルプレノロール（１Ｅ−６Ｍ、１Ｅ−８Ｍ）とともにインキュベートした膜も含まれていた。膜を集め、残った［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール放射活性を実施例６に記載するように測定した。ほとんどのフラグメントが、放射性リガンドを示さないという推論から、本願発明者らは、各９６ウェルプレートについて、（コントロールを除き）ウェルあたりの平均計測数を計算し、この平均値を使用し、このプレートでのすべてのデータ点を正規化した（％で表される。）。これらの正規化したデータを使用し、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９について得られた正規化した値を、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０について得られた正規化した値で割り算することによって、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９と比較して、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０に対する各フラグメントの結合を比較した。１より大きな比率は、フラグメントがβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０に選択的である（高いアフィニティを有する。）ことを示す。１より低い比率は、フラグメントが、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９に選択的であることを示す。

【0260】

このアッセイの再現性を測定するために、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０に最も選択的な４４フラグメント、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９に最も選択的な４４フラグメントおよびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９に対し同様の程度まで放射性リガンドを示す４４フラグメントを、２個ずつ再びアッセイし、３つの独立したアッセイのデータを用い、もう１回ランク分けした。この比較アッセイによって、以下の３つの別個の機能性プロフィールにヒットするβ２ＡＲフラグメントを分類することができる。

【0261】

・それぞれ、天然および合成のβ２ＡＲアゴニストであるエピネフリンおよびイソプロテレノールと同様に（アゴニストプロフィール）、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９と比較して、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０の方に選択的なフラグメント。

【0262】

・アルプレノロールと同様に（アンタゴニストプロフィール）、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０およびβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９について同様の程度に放射性リガンドを示すフラグメント。

【0263】

・ＩＣＩ１１８５５１と同様に（インバースアゴニストプロフィール）、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０と比較して、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９の方に選択的なフラグメント。

【0264】

代表的な例として、６フラグメントの［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール結合％を図１７に示し、本願発明者らは、この有効性に従って、異なるフラグメントのプロフィールを描くことができることを示す。アゴニストプロフィールを有する１２の最も高いランクのフラグメントから、ＡＣ２３５０６、ＣＣ５６２１３によって表される２フラグメントは、β２ＡＲの活性な立体構造に優先的に結合し、インバースアゴニストプロフィールを有する最も高いランクのフラグメントから、２フラグメント（ＫＭ０８９８５、ＡＷ００１８９）は、主要な立体構造に優先的に結合し（インバースアゴニストプロフィール）、２フラグメント（ＣＣ４６７４６、ＣＣ４４９１４）は、同じアフィニティで両方の立体構造に結合する（アンタゴニストプロフィール）。注目すべきことに、アゴニストプロフィールを有する上位１２ヒットのうち、１つのフラグメントのみが、内因性の幾つかの合成β２ＡＲアゴニストに特徴的なカテコールアミン構造を有する。

【0265】

［実施例２４］
比較放射性リガンド競争アッセイによって選択されたフラグメントの活性プロフィールの分析
１２がアゴニスト活性プロフィールを有し、３がアンタゴニスト活性プロフィールを有し、３がインバースアゴニスト活性プロフィールを有する、選択された１８フラグメントヒットのプロフィールを、その後、実施例６に記載するように、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合物に対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物の用量応答曲線を比較することによって確認した。簡単に説明すると、異なる組み換え融合タンパク質を発現するＳｆ９細胞の膜を、結合バッファー中、４×１０^−７Ｍから４×１０^−４Ｍの範囲の濃度でそれぞれの１８フラグメントヒットと混合し、放射性リガンド［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールをそれぞれの混合物に加え、振とうプラットフォームでサンプルを室温で２時間インキュベートした。実施例６に記載するように、受容体が結合した放射性リガンドを遊離の放射性リガンドから分離した。データは、３回ずつ行われた各実験の平均±ＳＤ（平均の標準偏差）で表す。グラフは、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ）を用い、非線形回帰分析によって作成された。β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合物（受容体の主要な立体構造）に対し、活性な状態で安定化されたβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物の用量応答曲線は、実施例２３で選択された１８フラグメントの活性プロフィールを確認する。驚くべきことに、アゴニストプロフィールに属する１２の特定されたフラグメントのうち、１１が、アゴニスト活性を有するβ２ＡＲリガンドに全く関係がなかった。（それぞれの活性プロフィール（アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト）についての２フラグメントの用量応答曲線の代表例を図１８に示す。）フラグメントＡＣ２３５０６、ＣＣ５６２１３は、明らかに、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合物よりも、活性な状態で安定化されたβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物に高いアフィニティで結合する（図１８Ａ）。フラグメントＫＭ０８９８５、ＡＷ００１８９について、本願発明者らは、この反対であることがわかり（図１８Ｃ）、一方、アンタゴニストプロフィールを有するフラグメントＣＣ４６７４６、ＣＣ４４９１４は、同じアフィニティで両方の立体構造に結合する（図１８Ｂ）。

【0266】

［実施例２５］
比較放射性リガンドアッセイによる精巧なフラグメントの薬理特性の分析
比較放射性リガンドアッセイが、アゴニストプロフィールを有するフラグメントの精巧さを導くことができることを示すために、フラグメントＣＣ５６２１３は、精巧にするために用量応答曲線に基づいて選択された。その後、実施例６に記載するように、（図１９）のように、複数の化学改変体を比較放射性リガンドアッセイで試験した。簡単に説明すると、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０融合物またはβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９融合タンパク質を発現するＳｆ９細胞の膜を、それぞれの精巧なフラグメント（化合物８、９、１０と呼ばれる。）および元々のフラグメントＣＣ５６２１３と、結合バッファー中、１０^−９Ｍから１０^−３Ｍの範囲の濃度で混合し、放射性リガンド［^３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールをそれぞれの混合物に加え、振とうプラットフォームでサンプルを室温で２時間インキュベートした。受容体が結合した放射性リガンドを実施例６に記載するように遊離放射性リガンドから分離した。データは、３回ずつ行われた各実験の平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）で表す。グラフは、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ）を用い、非線形回帰分析によって作成された。

【0267】

化合物８は、元々のフラグメントと比較して、アフィニティが低下しており（データは示さず）、一方、化合物９および１０は、元々のフラグメントＣＣ５６２１３と比較して、効力が増加していた。元々の化合物と比較して、精巧に作られたフラグメント（化合物９、１０）の向上したアフィニティは、それぞれのβ２ＡＲ立体構造異性体についてＩＣ５０を計算することによって示された。コントロールであるβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９と比較して、精巧に作られた化合物９および１０および元々のフラグメントＣＣ５６２１３に対するβ２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０キメラの増加したアフィニティは、図１９に示される競争結合実験から、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ６９のＩＣ５０を、β２ＡＲ３６５Ｎ−Ｎｂ８０のＩＣ５０で割り算することによって、ＩＣ５０値の比率から計算することができ、それぞれ化合物９、１０、ＣＣ５６２１３について、約７１、９４、２２の明らかな効力の変化が得られる。特に、化合物１０は、この元々のフラグメントＣＣ５６２１３より強力なだけではなく、活性な状態で安定化されたβ２ＡＲに対する選択性が５倍大きい。

【0268】

［実施例２６］
ＡＤＲＢ２ ｃＡＭＰ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ａｓｓａｙｓ（ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ−ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）を用いたアゴニズムのためのプロフィール
「アゴニストプロフィール」を有するフラグメント（実施例２３および２４に記載される１２フラグメント）が、β２ＡＲシグナル伝達を誘発することができるか否かを試験するために、実施例２３からの１８フラグメントを、細胞アッセイにおいて２種類の濃度（２ｍＭおよび１００μＭ）で、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ装置で試験し、Ｇタンパク質が介在するβ２ＡＲの活性化を測定する。ＨｉｔＨｕｎｔｅｒアッセイ中のＤＭＳＯ％は１％以下であり、この濃度は、使用したβ２ＡＲ細胞では毒性でないことが示された。コントロールとして、エピネフリン（１μＭおよび５０ｎＭ）およびアルプレノロール（０．１μＭおよび５ｎＭ）がこのアッセイに含まれていた。ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（Ｒ）ｃＡＭＰアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）は、セカンドメッセンジャーｃＡＭＰ蓄積によるＧＰＣＲの活性化を監視する。コントロールアゴニストイソプロテレノールによって生じるｃＡＭＰの最大合成を１００％に設定し、試験した化合物のアゴニスト挙動を、イソプロテレノールアゴニズムに対して表した（データは示さない。）。顕著なことに、試験した濃度で、ＨｉｔＨｕｎｔｅｒバイオアッセイは、ＣＣ５６２１３を含む３種類のフラグメントのみを特定し、検出可能で用量依存性のβ２ＡＲシグナル伝達活性を生じる。多くのフラグメントが、ｍＭ濃度で細胞にとって毒性であり、細胞アッセイで特定されないことは、フラグメントライブラリーのよく知られた特徴である。従って、本願発明者らは、現時点でフラグメントスクリーニングおよびＨＴＳに使用される細胞アッセイで特定することができない特定の生体活性プロフィールを有する複数のフラグメントを特定することができるようである。

【0269】

【表1】

【0270】

【表2】

【0271】

【表3】

【0272】

【表4】

【0273】

【表5】

【0274】

【表6】

【0275】

【表7】

【0276】

【表8】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19】

【配列表】

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