特許 6446049 脂肪肝を治療するためのザクロの皮抽出物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6446049

(24)【登録日】2018年12月7日

(45)【発行日】2018年12月26日

(54)【発明の名称】脂肪肝を治療するためのザクロの皮抽出物

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/185 20060101AFI20181217BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20181217BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20181217BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20181217BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20181217BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20181217BHJP

   A23L 19/00 20160101ALI20181217BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/185

   A61K31/7048

   A61P1/16

   A61P3/04

   A61P3/06

   A23L33/105

   A23L19/00 Z

【請求項の数】9

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2016-545848(P2016-545848)

(86)(22)【出願日】2014年1月9日

(65)【公表番号】特表2017-503806(P2017-503806A)

(43)【公表日】2017年2月2日

(86)【国際出願番号】CN2014070408

(87)【国際公開番号】WO2015103760

(87)【国際公開日】20150716

【審査請求日】2016年12月7日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 掲載年月日 ２０１４年１月６日 掲載アドレス ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅ．ｌｉｅｂｅｒｔｐｕｂ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／ｆｕｌｌ／１０．１０８９／ａｒｓ．２０１３．５５３８

(73)【特許権者】

【識別番号】599132904

【氏名又は名称】ネステク ソシエテ アノニム

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100140453

【弁理士】

【氏名又は名称】戸津 洋介

(72)【発明者】

【氏名】スートゥー， イグナティウス マン‐ヤウ

(72)【発明者】

【氏名】ツァン， ペイファン

(72)【発明者】

【氏名】ツァン， ウェイグオ

(72)【発明者】

【氏名】ワン， ジュンクァン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ， チー ジェイソン

【審査官】 渡部 正博

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−２００６１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１７１９０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−０１６３１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０２６４１３１２（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０３４６７５３４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 J Food Sci Biotechnol，２０１２年 ３月２０日，Vol.32, No.9，p957-961

【文献】 J Prev Med Chin PLA，２００５年 １月，Vol.23, No.3，p160-163

【文献】 J Med Res，２０１２年１０月，Vol.41, No.10，p80-82

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

Ａ２３Ｌ １９／００−１９／２０

Ａ２３Ｌ ３３／００−３３／２９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳動物における脂肪性肝疾患の予防及び／又は治療の方法における体重増加の抑制における使用のための組成物であって、ザクロの皮抽出物を含み、前記抽出物は少なくとも３０％のプニカラギンを含有し、前記哺乳動物は高脂肪食を摂取している、組成物。

【請求項2】

脂肪症を抑制するための、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

肝機能マーカーＡＬＴ及びＡＳＴの発現レベルを減少させるための、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記哺乳動物は２５以上のボディマス指数を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記ヒトは、非アルコール性脂肪性肝疾患に罹患した患者である、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

前記抽出物が経口投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記経口投与は、食品、飲料、栄養補助食品、又は医薬組成物を介して行われる、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記抽出物が１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、メタボリックシンドローム、より詳細には脂肪性肝疾患の治療における使用のための、ザクロの皮抽出物の利用に関する。

【発明の背景】

【0002】

ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ Ｌ．）は、地中海地方全域、北はヒマラヤに至るまで、東南アジア、並びにアメリカ合衆国ではカリフォルニア及びアリゾナで栽培される小さな長命の木に実る、古くからの神秘的で独特な果実である。古来の歴史的な利用に加えて、ザクロは様々な疾患に対するいくつかの薬の体系で利用されている。ザクロの成分は相乗的に作用するように見える。この１０年間に、がん、心臓血管疾患、歯の状態、細菌感染及び抗生物質耐性、並びに紫外線誘発性の皮膚障害の、治療及び予防に主眼をおいた、ザクロの成分の抗酸化物質、抗がん、及び抗炎症の特性について多数の研究が公表されている。加えて、ザクロについてのほとんどの研究は、葉、花及び種子に集中している。しかし、西洋諸国でザクロジュース製品がますます普及するようになって以来いまだに、ジュースの廃棄物であるザクロの皮は興味を持たれていない。

【0003】

したがって、本発明の目的は、特にメタボリックシンドローム治療の分野における、ザクロの皮の有用な適用を提供することである。

【発明の概要】

【0004】

本発明の１つの態様では、哺乳動物の脂肪性肝疾患の予防及び／又は治療における使用のためのザクロの皮抽出物が提供される。

【0005】

本発明の好ましい実施形態では、ザクロの皮抽出物は少なくとも３０％のプニカラギンを含有する。

【0006】

本発明のこれら及び他の態様、特徴及び利点は、添付の図と共に本発明の実施形態の詳細な記載から当業者にさらに明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図１。ラットの肝臓重量並びに肝機能のマーカーであるアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）についての、ザクロ抽出物（ＰＥ）補助食品及び高脂肪食（ＨＦＤ）に関する図を示す。ＨＦＤ及びＰＥ処理の２か月後に、ラットの体重を測定し、屠殺後直ちに肝臓を採取し重量を測定した。結果を、（Ａ）肝臓重量及び（Ｂ）全体重に対する割合として示した。ラット血清は屠殺後に採取し、血清中のＡＬＴ及びＡＳＴを測定した。（Ｃ）相対的なＡＬＴ活性；（Ｄ）相対的なＡＳＴ活性。値は、Ｎ＝１５の平均±ＳＥＭである。正常対照に対する^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、ＨＦＤ対照に対する＾ｐ＜０．０５、＾＾ｐ＜０．０１。

【図2】図２。新鮮な肝組織の写真を示す。肝組織はラットの屠殺後に採取した。新鮮な組織の写真（Ｂ）を撮影した後、ＨＥ染色（Ａ）のためにパラホルムアルデヒドで固定した。

【図3】図３。肝臓における脂質生成に関する遺伝子の発現レベルについての図を示す。肝臓のｍＲＮＡを抽出し、脂質生成に関する遺伝子をリアルタイムＰＣＲにより解析し、タンパク質を抽出してＳＲＥＢＰ１をウェスタンブロットにより分析した。ＳＲＥＢＰ１、ＦＡＳ、ＡＣＣ１、ＳＣＤ１のリアルタイムＰＣＲ結果を示す。値は、Ｎ＝１５の平均±ＳＥＭである。正常対照に対する^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、ＨＦＤ対照に対する＾ｐ＜０．０５、＾＾ｐ＜０．０１。

【図4】図４。ラット肝臓の酸化状態におけるＰＥ補助食品及びＨＦＤの影響に関連する。肝臓のタンパク質を抽出し、カルボニル化タンパク質をタンパク質の酸化状態のマーカーとして測定した。肝臓のホモジネートを用いて、ＧＳＨを測定した。（Ａ）カルボニル化タンパク質についての像；（Ｂ）相対的なＧＳＨ量。値は、Ｎ＝１５の平均±ＳＥＭである。正常対照に対する^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、ＨＦＤ対照に対する＾ｐ＜０．０５、＾＾ｐ＜０．０１。

【図5】図５。ラット肝臓のミトコンドリア複合体の活性におけるＰＥ補助食品及びＨＦＤの影響に関連する。肝臓のミトコンドリアを単離し、ミトコンドリア複合体の活性を分析した。（Ａ）相対的な複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＶの活性；（Ｂ）複合体Ｉ〜Ｖのウェスタンブロット像。値は、Ｎ＝１５の平均±ＳＥＭである。正常対照に対する^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、ＨＦＤ対照に対する＾ｐ＜０．０５、＾＾ｐ＜０．０１。

【図6】図６。ラット肝臓のミトコンドリアの動的な活性におけるＰＥ補助食品及びＨＦＤの影響に関連する。肝臓のｍＲＮＡを抽出し、ミトコンドリアの動態に関する遺伝子をリアルタイムＰＣＲにより解析し、タンパク質を抽出してウェスタンブロットにより分析した。（Ａ）Ｍｆｎ１、Ｍｆｎ２、ＯＰＡ１、Ｄｒｐ１、Ｆｉｓ１のリアルタイムＰＣＲ；（Ｂ）Ｍｆｎ１、Ｍｆｎ２、ＯＰＡ１、Ｄｒｐ１のウェスタンブロット像値は、Ｎ＝１５の平均±ＳＥＭである。正常対照に対する^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、ＨＦＤ対照に対する＾ｐ＜０．０５、＾＾ｐ＜０．０１。

【図7】図７。免疫系及び腎臓におけるザクロの皮抽出物の毒性に関する。（Ａ）血液中のリンパ球（ＬＹＭ）、（Ｂ）白血球（ＷＢＣ）の数及び腎機能マーカーである（Ｃ）血中尿素窒素（ＢＵＮ）及び（Ｄ）クレアチニン（ＣＲＥＡ）における影響を評価した。値は、Ｎ＝１５の平均±ＳＥＭである。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明は、哺乳動物の脂肪性肝疾患の予防及び／又は治療における使用のためのザクロの皮抽出物に関する。

【0009】

「ザクロの皮抽出物」とは、ザクロの皮（ザクロの外皮又はザクロの実皮とも言われる。）から得られる抽出物を表す。

【0010】

好ましくは、この抽出物は、少なくとも３０％、好ましくは４０％、より好ましくは５０％、さらに好ましくは６０％のプニカラギンを含有する。

【0011】

本明細書中で使用する場合、単語「含む」、「含んでいる」、及び類似の単語は、限定的又は網羅的な意味で解釈されるべきではない。換言すれば、これらは、「…を含むが、それらに限定されない」ことを意味するものとする。

【0012】

本発明によるザクロの皮抽出物は、エタノール水溶液のような水−アルコール溶液でザクロの皮を抽出することにより得ることができる。好ましくは、そのような溶液は０〜３５体積％のエタノールを含む。

【0013】

例として、抽出物は以下により調製され得る：
− 原材料（ザクロの皮）を破砕する；
− エタノール水溶液を用いて、４０〜８０℃の温度で原材料を抽出する；
− 濃縮、ろ過し、得られた抽出物をカラムクロマトグラフィーを用いて分離する。

【0014】

「脂肪性肝疾患」とは、肝細胞にトリグリセリド脂肪の大きな空胞が蓄積している可逆的な状態を意味する（図２参照）。この疾患は、過度のアルコール摂取又は肥満（インスリン抵抗性の影響を伴う場合又は伴わない場合）などの複数の原因による場合がある。より特徴的には、体重増加が脂肪性肝疾患の１つの症状となり得る。

【0015】

本発明によるザクロの皮抽出物は、脂肪性肝疾患の予防及び／又は治療の方法における体重増加の抑制において使用される。

【0016】

このように本発明によるザクロの皮抽出物は、脂肪性肝疾患に罹患した患者の予防及び／又は治療のために用いられ得る。

【0017】

脂肪性肝疾患に罹患した患者、特に非アルコール性脂肪性肝疾患の患者に対しては、体重の漸減がしばしば唯一の推奨となる。

【0018】

哺乳動物における体重増加の抑制は以下により計測され得る：
− ザクロ抽出物の投与前に哺乳動物を計量する；
− 哺乳動物の食餌を変更せずにザクロ抽出物を投与する；
− ザクロ抽出物の投与後に哺乳動物を計量する。

【0019】

好ましくは、ザクロ抽出物の投与は、１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、好ましくは５〜３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で毎日なされる。加えて、２回の計量の期間は、好ましくは１週間、より好ましくは１か月である。好ましくは、計量は毎週又は毎月など定期的に実施される。

【0020】

有利なことに、本発明によるザクロの皮抽出物は、高脂肪食を摂取している哺乳動物の体重増加及び肝臓重の増加を抑制することが示されている。

【0021】

より特徴的には、本発明によるザクロの皮抽出物は以下のことが可能である：
− 脂肪症を抑止する、及び／又は
− 肝機能マーカーＡＬＴ及びＡＳＴの発現レベルを減ずる。

【0022】

脂肪症とは細胞内の脂質の異常な貯留を表す。

【0023】

ザクロの皮抽出物は、哺乳動物に、好ましくはヒトに投与される。そのような投与は、ヒトが高脂肪食を摂取している場合、及び／又は２５以上のボディマス指数を有する場合に特に有利である。

【0024】

そのような投与は、非アルコール性脂肪性肝疾患に罹患した患者、特に脂肪症だけを示し炎症が見られない非アルコール性脂肪性肝疾患の患者に対しても、とりわけ意義がある。実際、ＰＥ補助食品が、食物摂取量が減らされない場合においても、体重増加を有意に抑制することが示されてきている。ザクロの皮抽出物は、特にＳＲＥＢＰ１量及び脂質生成に関連する遺伝子の発現を抑制することによって、顕著に脂質生成を抑制することも見出された。そのような遺伝子は、例えば脂肪酸合成酵素（Ｆａｓ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ１）、ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）である。

【0025】

好ましくは、ザクロの皮抽出物は経口投与される。そのような投与は、食品、飲料、栄養補助食品、又は医薬組成物を介して行われ得る。特に、ザクロの皮抽出物は、粉ミルク、栄養／タンパク質粉末、コーヒーミックス／メイト、チョコレート／ココア粉末、茶、粉チーズ、砂糖、甘味料のような粉末の製品に添加され得る。

【0026】

有利なことに、ザクロの皮抽出物は、１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、好ましくは５〜３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。

【0027】

本発明は、以下の実施例を参考としてさらに記載される。請求された本発明がこれらの実施例により限定されることが意図されていないことは理解されるであろう。

【実施例】

【0028】

実施例： 脂肪肝の形成におけるザクロ抽出物（ＰＥ）の影響
本実施例は、ＰＥ処理が脂肪肝の形成に対してどの程度防御効果を示したかを記載する。したがって、肝組織を採取、計量した。その後、脂肪肝に対するＰＥの防御効果を調査するために種々の試験を用いた。特に、肝機能マーカー（ＡＬＴ及びＡＳＴ）を測定した。酸化状態及びミトコンドリア機能、脂肪肝形成の指標となり得るパラメータもまた解析された。そして、本研究で観察されたＨＦＤ食及びＰＥ処理による脂質代謝及びミトコンドリア活性の相違に関する、可能性のある作用機序について、ＳＲＥＢＰ１（ステロール調節因子結合タンパク質１）に媒介される脂質生成経路を分析した。

【0029】

１． 材料及び方法
１．１ ザクロ抽出物（ＰＥ）の調製
ザクロ抽出物（ＰＥ）の粉末は、ＴｉａｎＪｉｎｇ ＪＦ−Ｎａｔｕｒａｌによりザクロの皮から製造された。ザクロ抽出物は４０％プニカラギン（乾燥重）となるよう規格化された。水とエタノールのみが全抽出工程で用いられた。

【0030】

１．２ 動物
１８０〜２００ｇの３０日齢の雄のスプラーグドーリーラットを商業ブリーダー（ＳＬＡＣ，Ｓｈａｎｇｈａｉ）から購入し、１２時間の明暗サイクル、２２℃のＳＰＦ（特定病原体除去）環境に収容した。すべてのラットには７日間固形飼料を与え、環境と食餌に順応させた。過体重のモデルは、高脂肪（ＨＦ）食（１５％飽和脂肪、１％コレステロール、８４％固形飼料）を与えることにより作製した。高脂肪を与えたラットを、ＨＦ対照群、ＨＦ＋低ザクロ抽出物群（プニカラギン２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量となるＰＥ５０ｍｇ／ｋｇ体重）、及びＨＦ＋高ザクロ抽出物群（プニカラギン６０ｍｇ／ｋｇ体重の用量となるＰＥ１５０ｍｇ／ｋｇ体重）に無作為に割付けた。対照群には固形飼料を与えた。各群は１５頭とした。ザクロ抽出物は、ＨＦ食（ＨＦＤ）と同時に投与した。ラットの体重及び食物消費量は週２回記録した。ラットはザクロ抽出物及びＨＦ食を与えた２か月後に屠殺し、血液、肝臓、筋肉及び脂肪組織を採取し、−７５℃で凍結した。ラットの体重が、ザクロ抽出物の効果を評価するための最も重要な指標として用いられた。

【0031】

１．３ ＡＬＴ／ＡＳＴの分析
ラットを屠殺した後、心臓穿刺により血液試料を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）により血清を分離した。自動生化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の量を分析した。

【0032】

１．４ ＧＳＨの分析
ＧＳＨ量は、公表されている方法［８］により、２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒド（ＮＤＡ）を用いて測定した。２０μＬの試料及び１８０μＬのＮＤＡ誘導体化溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０）、０．５Ｎ ＮａＯＨ、及び１０ｍＭ ＮＤＡのＭｅ_２ＳＯ溶液，ｖ／ｖ／ｖ １．４／０．２／０．２）を、９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。室内灯からウェルを防護するためにプレートにカバーをして、室温で３０分間保持した。ＮＤＡ−ＧＳＨの蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ １４２０；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を用いて測定した（励起波長４７２／放出波長５２８）。

【0033】

１．５ リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡは、製造元の手順に従って、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて肝臓試料から抽出した。逆転写は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ，ＤａＬｉａｎ，Ｃｈｉｎａ）を用いて行い、続いて特異的プライマを用いた半定量リアルタイムＰＣＲを実施した。ｍＲＮＡ量は、ハウスキーピング遺伝子である１８Ｓ ＲＮＡのｍＲＮＡに対して標準化し、２−^ΔΔＣＴ法を用いて相対値として表した。

【0034】

１．６ カルボニル化タンパク質の測定
肝臓試料は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ａｎｄ ＩＰ細胞溶解液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）を用いて溶解した。溶解物は均質化し、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔによりタンパク質濃度を測定した。肝臓の可溶性タンパク質中のタンパク質カルボニルは、Ｏｘｙｂｌｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）により測定した。タンパク質カルボニルは、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）により標識し、ウェスタンブロットにより検出した。

【0035】

１．７ ミトコンドリア複合体の活性測定
ＮＡＤＨ−ＣｏＱオキシドレダクターゼ（複合体Ｉ）活性は、測定緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１％ ＢＳＡ、１０μＭアンチマイシンＡ、２ｍＭ ＮａＮ３、０．５ｍＭコエンザイムＱ１を含む１０×緩衝液）に６００ｎＭとなるよう添加した２，６−ジクロロインドフェノール−インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の還元をモニタリングすることにより測定した［１］。ミトコンドリアタンパク質の終濃度を２５μｇ／ｍＬとした。２００μＭのＮＡＤＨの添加により反応を開始し、６００ｎｍで２分間スキャンした。対照ブランクとしてロテノン（３μＭ）を反応系に添加した［２］。

【0036】

コハク酸−ＣｏＱオキシドレダクターゼ（複合体ＩＩ）、ＣｏＱ−シトクロムＣレダクターゼ（複合体ＩＩＩ）、及びシトクロムＣオキシダーゼ（複合体ＩＶ）の測定は［３−５］に記載のとおり実施した。簡潔には、複合体ＩＩは、ミトコンドリア（終濃度２５μｇ／ｍＬ）を含む測定緩衝液（０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．１）、１％ ＢＳＡ、１０μＭアンチマイシンＡ、２ｍＭ ＮａＮ３、０．５ｍＭ コエンザイムＱ１を含む１０×緩衝液）中で測定した。１０ｍＭのコハク酸で反応を開始し、３０℃、６００ｎｍで２分間スキャンした。複合体ＩＩＩは、ミトコンドリア（終濃度１０μｇ／ｍＬ）及び４０μＭのシトクロムＣを測定緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、２ｍＭ ＮａＮ３、０．８％ ｔｗｅｅｎ−２０、１％ ＢＳＡ、２ｍＭデシルユビキノールを含む１０×緩衝液）に添加し、シトクロムＣの還元を５５０ｎｍでモニタリングすることにより測定した。１×測定緩衝液で反応を開始し、５５０ｎｍで２分間スキャンした。複合体ＩＶの解析には、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）、０．１％ ＢＳＡ、０．２％ ｔｗｅｅｎ−２０、及び４０μＭ還元シトクロムＣを含む測定緩衝液を用いた。３μｇ／ｍＬのミトコンドリアの添加により反応を開始し、５５０ｎｍで２分間スキャンした。

【0037】

複合体Ｖの活性は、オリゴマイシン感受性Ｍｇ^２＋−ＡＴＰ加水分解酵素の活性として測定された［６］。この工程は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭコハク酸、２０ｍＭグルコース、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１１ｍＭ ＡＭＰ、０．７５ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１０ｍＭリン酸水素二カリウム、４ｕ／ｍＬヘキソキナーゼ、２ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸脱水素酵素及び６０μｇ／ｍＬミトコンドリアとなるよう添加し、３４０ｎｍでＮＡＤＰＨの増加を測定することにより実施した［７］。１ｍＭのＡＤＰの添加により反応を開始した。すべての測定は３０℃で行われた。

【0038】

１．８ 統計解析
データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（平均の標準誤差）として表わされる。統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続くＬＳＤ事後解析により評価した。すべての比較において有意水準はｐ＜０．０５に設定した。

【0039】

２． 結果
２．１ ラットの過体重及び脂肪蓄積におけるＰＥ補助食品及びＨＦＤ
ＰＥ及びＨＦＤ処理の２か月後、ラットを計量し、食物摂取量を計測した。ＨＦＤは有意に体重増加を誘起することが可能であり、ラットは約１３％の過体重であった。そして高用量のＰＥ補助食品が、食物摂取量を減らさずともＨＦＤによる体重増加を有意に減じることが明らかとなった（下記表１参照）。

【0040】

表１ 体重及び食物摂取量

【表1】

【0041】

２．２ ラットの肝臓重量におけるＰＥ補助食品及びＨＦＤ
ＨＦＤ処理により、体重に対する肝臓重量の割合は有意な影響を受けることはなかったが、肝臓重量が増加することが明らかとなった。低及び高用量のＰＥ補助食品はいずれも、肝臓重量及び体重に対する肝臓重量の割合を有意に減少することが可能であった（図１Ａ、Ｂ）。

【0042】

２．３ ラットの肝機能マーカーＡＬＴ及びＡＳＴにおけるＰＥ補助食品及びＨＦＤ
ＡＬＴ及びＡＳＴは、肝細胞障害の診断評価の一部として肝臓の健康状態を把握するためによく測定される。ＨＦＤが血清中のＡＬＴ及びＡＳＴ量を有意に増加することが可能であることをデータは示した（図１Ｃ、Ｄ）。低用量のＰＥ処理は明瞭な効果を示さなかったが、高用量のＰＥにより血清ＡＬＴ及びＡＳＴ量が効果的に減少することが明らかとなった（図１Ｃ、Ｄ）。

【0043】

２．４ ラット肝臓の脂質生成におけるＰＥ補助食品及びＨＦＤ
主要制御因子であるＳＲＥＢＰ１のｍＲＮＡはＨＦＤにより有意に増加したが、他の研究と異なり、脂肪酸合成酵素（Ｆａｓ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ１）、ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）のような脂質生成に関連する遺伝子のＨＦＤによる誘導は見られなかった（図４）。そこでＳＲＥＢＰ１タンパク質の量を調べた。ＳＲＥＢＰ１の前駆体はＨＦＤにより増加したが、成熟ＳＲＥＢＰ１は影響されなかった（図３）。この結果は、ＨＦＤ誘導性の脂肪肝形成に脂質生成は関連しないということを示唆した。いずれにせよ、高用量のＰＥ処理は、ＳＲＥＢＰ１及びその標的遺伝子であるＦＡＳ、ＡＣＣ１及びＳＣＤ１を減少することによって、顕著に脂質生成を抑制することが可能であった（図３）。

【0044】

２．５ ラット肝臓の酸化状態におけるＰＥ補助食品及びＨＦＤの影響
次に我々は肝組織の酸化状態を調査した。ＨＦＤがカルボニル化タンパク質の量を増加し、これらの量は高用量のＰＥ補助食品により効果的に減じられることを、データは示した（図４Ａ）。ＧＳＨ量はＨＦＤにより減じるどころか有意に増加し、これもまたＰＥ処理により回復した（図４Ｂ）。

【0045】

２．６ ラット肝臓のミトコンドリア複合体の活性におけるＰＥ補助食品及びＨＦＤの影響
ミトコンドリアがＰＥによる防護に関与するか否かを検証するために、我々はまず肝臓のミトコンドリアを単離し、ミトコンドリア複合体の活性を分析した。ＨＦＤが、他の３つの複合体の活性に何の影響も与えることなく、有意に複合体Ｉの活性を減ずること（図５Ａ）及び複合体ＩＩＩの活性を増加すること（図５Ｂ）が明らかとなった。ＰＥ補助食品は、ミトコンドリア複合体Ｉの活性をＨＦＤ群に比べて改善することが可能であった（図５Ａ）。さらに、ＰＥは複合体ＩＩ及びＩＶの活性も増加することが可能であった（図５Ａ）。ＨＦＤ及びＰＥ処理のいずれも複合体Ｖの活性には影響を与えなかった（図５Ｂ）。

【0046】

２．７ ラット肝臓ミトコンドリアの動的な活性におけるＰＥ補助食品及びＨＦＤ
ミトコンドリアの動的な活性はミトコンドリア複合体の活性と密接に関連する。リアルタイムＰＣＲの結果は、ＰＥ処理によりミトコンドリアの融合及び分裂タンパク質（Ｍｆｎ１、Ｍｆｎ２、ＯＰＡ１、Ｄｒｐ１、Ｆｉｓ１）のｍＲＮＡ量が有意に増加することを示した（図６Ａ）。しかし、ウェスタンブロットの結果は、Ｄｒｐ１及びＯＰＡ１タンパク質の量はＨＦＤ又はＰＥにより影響されないこと、並びにＭｆｎ１及びＭｆｎ２タンパク質の量がＨＦＤにより減少しＰＥにより明瞭に増加することを示した（図６Ｂ）。

【0047】

２．８ ラットの免疫系及び腎臓におけるＰＥ補助食品の毒性
ＨＦＤ及びＰＥ処理のいずれも、血液中のリンパ球（図７Ａ）及び白血球（図７Ｂ）に影響を与えることはなかった。さらに、ＨＦＤは腎機能マーカーＢＵＮ（Ｃ）及びＣＲＥＡ（Ｄ）に影響しなかったが、低及び高用量のＰＥにより有意に血清中のＢＵＮ量が減少した。

【0048】

結論：
ＨＦＤ処理８週後のラットの体重と脂肪蓄積は通常食に比べて有意に高かった。本研究では、低ＰＥ用量（５０ｍｇ／ｋｇ／日）及び高ＰＥ用量（１５０ｍｇ／ｋｇ／日）が用いられる。高用量のＰＥにより、ＨＦＤにより誘導された体重増加が有意に減少することが明らかとなった。

【0049】

一方、ＰＥがいかなる毒性をも現さないことを確認するために、我々は血液細胞を分析し、腎機能マーカーを調査した。データは、ＰＥ補助食品が血液細胞に影響を与えないことを示した。毒性がある代わりに、むしろＰＥが腎機能を改善することが見出された。

【0050】

高用量のＰＥ処理が、肝臓重量及び体重に対する肝臓重量の割合を効果的に減少できることも見出された。したがって、肝臓重量の減少は、ＨＦＤにより誘導された体重増加がＰＥ処理により減少するという作用の機序の１つである可能性があると考えることができる。形態についての写真及びＨＥ染色は、高用量のＰＥが脂肪肝形成を顕著に抑制するということを示した。高用量ＰＥにより肝臓のトリグリセリド及びコレステロールが減少した。肝機能マーカーＡＬＴ及びＡＳＴは、高用量ＰＥにより正常へ回復した。すべてのデータは、ＰＥがＨＦＤにより誘導された脂肪肝形成を効果的に抑制し、肝機能を正常の水準に回復することができることを示唆した。

【0051】

ＰＥがどの程度防護効果を有するのかをより深く理解するために、まず古典的なＳＲＥＢＰ１経路が調査された。Ｆａｓ、ＳＣＤ１、Ａｃｃ１のような脂質生成に関する遺伝子は、成熟ＳＲＥＢＰ１により活性化され、脂肪肝形成に関与する。これまでの研究と異なり、ＳＲＥＢＰ１の前駆体はＨＦＤにより有意に増加するが、成熟ＳＲＥＢＰ１はＨＦＤにより影響されないということをこれらの結果は示した。したがって、ＨＦＤにより脂質生成は活性化されなかった。にもかかわらず、ＰＥ処理はＳＲＥＢＰ１の前駆体量及び脂質生成に関する遺伝子の発現を、ＨＦＤ群に比較して有意に抑制することが明らかとなった。

【0052】

そして、肝臓における酸化ストレスの状態及びミトコンドリア機能が分析された。ＰＥ処理は、ＨＦＤにより誘導されたカルボニル化タンパク質の量及びＧＳＨ量の変化を効果的に回復することが可能であった。ＰＥ処理は、ＨＦＤにより誘導された複合体Ｉの活性減少を抑制することも可能であった。ＰＥ処理は複合体ＩＩ及びＩＶの活性を、ＨＦＤ群に比較して有意に増加することが可能であった。ここまですべてのデータは、ＰＥがＨＦＤにより誘導された脂肪肝形成を効果的に抑制することが可能であるということを示唆した。

【0053】

本発明は例を用いて記載されてきたが、請求項に規定されている本発明の範囲から逸脱することなく、変形形態及び変更形態がなされ得ることが理解されるべきである。さらに、既知の均等物が特定の特徴に存在する場合、かかる均等物は、本明細書で具体的に表されるかのように組み込まれる。

【0054】

参考文献：
［１］ Ｔｒｏｕｎｃｅ，Ｉ．Ａ．；Ｋｉｍ，Ｙ．Ｌ．；Ｊｕｎ，Ａ．Ｓ．；Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ． Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔ ｍｕｓｃｌｅ ｂｉｏｐｓｉｅｓ，ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ，ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６４：４８４−５０９；１９９６．
［２］ Ｓｕｎ，Ｌ．；Ｌｕｏ，Ｃ．；Ｌｏｎｇ，Ｊ．；Ｗｅｉ，Ｄ．；Ｌｉｕ，Ｊ． Ａｃｒｏｌｅｉｎ ｉｓ ａ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｏｘｉｎ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ６：１３６〜１４２；２００６．
［３］ Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｋ．Ｍ．；Ｓｚｗｅｄａ，Ｌ．Ｉ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ ｗｉｔｈ ４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎｏｎｅｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１５８３５〜１５８４１；１９９８．
［４］ Ｐｉｃｋｌｏ，Ｍ．Ｊ．；Ａｍａｒｎａｔｈ，Ｖ．；ＭｃＩｎｔｙｒｅ，Ｊ．Ｏ．；Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．Ｇ．；Ｍｏｎｔｉｎｅ，Ｔ．Ｊ． ４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２（Ｅ）−ｎｏｎｅｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＣＮＳ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ａｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｉｔｅｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ７２：１６１７〜１６２４；１９９９．
［５］ Ｙａｎｇ，Ｓ．；Ｔａｎ，Ｔ．Ｍ．；Ｗｅｅ，Ａ．；Ｌｅｏｗ，Ｃ．Ｋ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ ｌｉｖｅｒｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６１：２２０〜２２９；２００４．
［６］ Ｐｉｃｋｌｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｍｏｎｔｉｎｅ，Ｔ．Ｊ． Ａｃｒｏｌｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｒａｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５３５：１４５〜１５２；２００１．
［７］ Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．；Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｖ．Ｄ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｒｏｔｏｎ Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ／ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｂｙ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃ ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １３０：１１１５〜１１２３；２０００．
［８］ Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．Ｃ．；Ｖｉｅｒｎｅｓ，Ｈ．；Ｋｒｅｊｓａ，Ｃ．Ｍ．；Ｂｏｔｔａ，Ｄ．；Ｋａｖａｎａｇｈ，Ｔ．Ｊ． Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｉｇａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１８：１７５〜１８０；２００３．

【0055】

本明細書内の先行技術文献を参照することはいずれも、かかる先行技術が周知であるか、又は当分野で共通の一般的な認識の一部を形成しているということを認めたものであるとみなされるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】