特許 6446222 軟骨分化培養液、及び軟骨組織の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6446222

(24)【登録日】2018年12月7日

(45)【発行日】2018年12月26日

(54)【発明の名称】軟骨分化培養液、及び軟骨組織の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/077 20100101AFI20181217BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/077

【請求項の数】5

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2014-201803(P2014-201803)

(22)【出願日】2014年9月30日

(65)【公開番号】特開2016-67311(P2016-67311A)

(43)【公開日】2016年5月9日

【審査請求日】2017年4月26日

(73)【特許権者】

【識別番号】000181217

【氏名又は名称】株式会社ジーシー

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(72)【発明者】

【氏名】山中 克之

(72)【発明者】

【氏名】重光 勇介

(72)【発明者】

【氏名】坂井 裕大

【審査官】 伊藤 良子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００２／０２２７８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０２−０４０３９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１１１１６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５２９９３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Cellular Physiology，１９８６年，Vol. 128, No. 3，p. 475-484

【文献】 Journal of Cellular Physiology，１９８９年，Vol. 138, No. 1，p. 215-220

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヘパリンと、
ｂＦＧＦと、を含み、
前記ｂＦＧＦの含有量が、１ｎｇ／ｍＬ以上である、軟骨分化培養液。

【請求項2】

前記ヘパリンの含有量が、１Ｕｎｉｔ／ｍＬ以上１００００Ｕｎｉｔ／ｍＬ以下であり、
前記ｂＦＧＦの含有量が、１００００ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載の軟骨分化培養液。

【請求項3】

さらに、
ＴＧＦ−β３と、
インスリンと、
ＩＴＳ＋と、を含む、請求項１または２に記載の軟骨分化培養液。

【請求項4】

前記ＴＧＦ−β３の含有量が、０．１ｎｇ／ｍＬ以上１０００ｎｇ／ｍＬ以下であり、
前記インスリンの含有量が、１μｇ／ｍＬ以上１００００μｇ／ｍＬ以下であり、
前記ＩＴＳ＋の含有量が、０．１体積％以上１０体積％以下である、請求項３に記載の軟骨分化培養液。

【請求項5】

請求項１乃至４のいずれか一項に記載の軟骨分化培養液を用いて、間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させる、軟骨組織の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、軟骨分化培養液、及び軟骨組織の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、幹細胞を用いた再生医療の研究が盛んに行われている。幹細胞は分化能を有し、培地組成の選択により分化をコントロールできることから、各種分野における応用が期待されている。

【0003】

そして、例えば補綴歯科治療の分野においては、従来から骨造成の要求が高かった。そこで、間葉系幹細胞を軟骨分化させ、培養軟骨による骨造成技術の検討がなされるようになっている。

【0004】

間葉系幹細胞の軟骨分化は、軟骨分化培養液を用いた培地中で間葉系幹細胞を培養することによりなされており、例えば非特許文献１には、α−ＭＥＭに、ＩＴＳ、ＴＧＦβ３、デキザメサゾン、アスコルビン酸を添加した培養液を用いた例が開示されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８４（５４１１）１４３−１４７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、非特許文献１に開示されているような従来の培養液では軟骨分化が十分に促進できていなかった。

【0007】

本発明は上記従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであって、本発明の一側面では、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進することができる軟骨分化培養液を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の一態様によれば、ヘパリンと、ｂＦＧＦと、を含み、前記ｂＦＧＦの含有量が、１ｎｇ／ｍＬ以上である、軟骨分化培養液を提供する。

【発明の効果】

【0009】

本発明の一態様によれば、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進することができる軟骨分化培養液を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明は、下記の実施形態に制限されることはなく、本発明の範囲を逸脱することなく、下記の実施形態に種々の変形及び置換を加えることができる。

【0011】

本実施形態では軟骨分化培養液の一構成例について説明する。

【0012】

本実施形態の軟骨分化培養液は、ヘパリンと、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：塩基性線維芽細胞増殖因子）とを含むことができる。

【0013】

本発明の発明者らは、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進することができる軟骨分化培養液について検討を行った。そして、ヘパリンと、ｂＦＧＦとを含む軟骨分化培養液を用いることで間葉系幹細胞の軟骨分化を特に促進できることができることを見出し、本発明を完成させた。

【0014】

本発明の発明者らの検討によると、ｂＦＧＦは、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進する働きを有している。しかしながら、ｂＦＧＦは短期間に分解してしまうため、軟骨分化培養液がｂＦＧＦを含有するのみでは、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進する観点では十分な効果を発揮することができなかった。

【0015】

そこで、本発明の発明者らがさらに検討を行ったところ、ヘパリンは、ｂＦＧＦを安定化する働きを有することが見出された。このため、軟骨分化培養液がヘパリンとｂＦＧＦとを併せて含有することにより、ｂＦＧＦによる間葉系幹細胞の軟骨分化促進の効果を継続させることができ、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進する機能を特に高めることができる。

【0016】

軟骨分化培養液中のヘパリン、及びｂＦＧＦの含有量は特に限定されるものではなく、任意に選択することができる。例えば、軟骨分化培養液中のヘパリンの含有量は１Ｕｎｉｔ／ｍＬ以上１００００Ｕｎｉｔ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０Ｕｎｉｔ／ｍＬ以上１０００Ｕｎｉｔ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

【0017】

また、軟骨分化培養液中のｂＦＧＦの含有量は１ｎｇ／ｍＬ以上１００００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上１０００ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

【0018】

本実施形態の軟骨培養液には上述の成分に限られず、さらに任意の成分を含むことができる。

【0019】

本実施形態の軟骨分化培養液には、例えばさらに、ＴＧＦ−β３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β３）と、インスリンと、ＩＴＳ＋（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｔｅ）と、を含むことが好ましい。

【0020】

ＴＧＦ−β３、インスリン、及びＩＴＳ＋についも間葉系幹細胞の軟骨分化を促進する働きを有しており、これらの成分を含有する軟骨分化培養液は間葉系幹細胞の軟骨分化を促進することができる。

【0021】

従来の培養液において、インスリン、またはＩＴＳ＋のいずれか一方を添加することは知られていたが、両成分を同時に添加することは行われていなかった。ところが、本発明の発明者らの検討によると、インスリンと、ＩＴＳ＋と、を同時に添加することにより、間葉系幹細胞の軟骨分化を特に促進することができる。

【0022】

軟骨分化培養液中のＴＧＦ−β３、インスリン、及びＩＴＳ＋の含有量は特に限定されるものではなく、任意にその含有量を選択することができる。

【0023】

例えば軟骨分化培養液中のＴＧＦ−β３の含有量は０．１ｎｇ／ｍＬ以上１０００ｎｇ／ｍＬ以下の割合であることが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

【0024】

また、軟骨分化培養液中のインスリンの含有量は、１μｇ／ｍＬ以上１００００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ以上１０００μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

【0025】

軟骨分化培養液中のＩＴＳ＋の含有量は、体積比で０．１％以上１０％以下であることが好ましく、０．５％以上５％以下であることがより好ましい。

【0026】

本実施形態の軟骨分化培養液は、さらに任意の成分を含むことができる。例えば、脂肪酸濃縮液、ビタミン液、ＥＡＡ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）、エリスロポエチン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、及び活性型ビタミンＤ_３を含むことができる。

【0027】

上述した成分のうち、脂肪酸濃縮液、ビタミン液、ＥＡＡは、細胞の培養に必要な脂肪酸、ビタミン、アミノ酸を供給するために添加しているものである。

【0028】

上述した成分のうち、エリスロポエチンは赤血球の分泌を促進する成分として知られているが、本発明の発明者らの検討によると、間葉系幹細胞の軟骨分化を促進する機能も有することが見出された。

【0029】

また、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸は軟骨の基質に含まれる成分であり、間葉系幹細胞の軟骨分化を補助する機能を有する。

【0030】

脂肪酸濃縮液、ビタミン液、ＥＡＡ、エリスロポエチン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、及び活性型ビタミンＤ_３は、それぞれ単独で本実施形態の軟骨分化培養液に含まれていても上述の効果を発揮できるが、全てが同時に含まれていることが好ましい。本実施形態の軟骨分化培養液が、上述の成分を全て同時に含む場合、特に間葉系幹細胞の軟骨分化を促進することができる。

【0031】

軟骨分化培養液中のこれらの成分の含有量についても特に限定されるものではなく、任意にその含有量を選択することができる。

【0032】

例えば、軟骨分化培養液中の脂肪酸濃縮液の含有量は、体積比で０．０１％以上１０％以下であることが好ましく、０．１％以上５％以下であることがより好ましい。

【0033】

軟骨分化培養液中のビタミン液の含有量は、体積比で０．０１％以上１０％以下であることが好ましく、０．１％以上５％以下であることがより好ましい。

【0034】

軟骨分化培養液中のＥＡＡの含有量は、体積比で０．０１％以上１０％以下であることが好ましく、０．１％以上５％以下であることがより好ましい。

【0035】

軟骨分化培養液中のエリスロポエチンの含有量は、０．１ＩＵ／ｍＬ以上１０００ＩＵ／ｍＬ以下であることが好ましく、１ＩＵ／ｍＬ以上１００ＩＵ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

【0036】

軟骨分化培養液中のコンドロイチン硫酸の含有量は、０．１μｇ／ｍＬ以上１０００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

【0037】

軟骨分化培養液中のヒアルロン酸の含有量は、０．０１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．１μｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

【0038】

軟骨分化培養液中の活性型ビタミンＤ_３の含有量は、０．０１ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．１ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

【0039】

また、上述の成分に加えて抗生物質等も含むことができる。

【0040】

軟骨分化培養液の基材としては例えば基礎培地を用いることができ、基材に上記成分を添加、混合することにより軟骨分化培養液とすることができる。この際用いる基礎培地の種類は特に限定されるものではなく、一般的に市販されている各種基礎培地を用いることができる。特に基礎培地としては例えばＤＭＥＭ等を好ましく用いることができる。また基礎培地は、市販品に依らなくとも、水にアミノ酸、ビタミン、ｐＨ調整剤等の各種成分を添加して作製することもできる。このとき用いる水は、微粒子、イオン微粒金属や有機物を除去した超純水であることが好ましい。勿論、水に基礎培地の成分及び、上記成分を混合することによっても本実施形態の軟骨分化培養液を作製することができる。

【0041】

そして、上述の軟骨分化培養液を用いた培地中で、分化した軟骨細胞からなる軟骨組織を生成することができる。

【0042】

上述の軟骨分化培養液を用いた培地中で、間葉系幹細胞を分化した軟骨細胞からなる軟骨組織を生成する場合、従来の培養液を用いた培地により間葉系幹細胞を分化した軟骨細胞からなる軟骨組織を生成する場合と比較して、軟骨基質の産生量を多くすることができる。

【実施例】

【0043】

まず、以下の各実験例において調製した軟骨分化培養液の評価手順について説明する。
（移植細胞の準備）
移植細胞としては、以下の手順によりヒト腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞を用いた。

【0044】

ヒト腸骨骨髄液を採取し、αＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、３２単位／ｍｌ ペンシリン、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）でよく懸濁し，骨髄液をほぐした後、３００ｇ、５分間遠心分離して、細胞を分離した。

【0045】

前記骨髄液から約７×１０^７個の有核細胞を得た。骨髄液から採取した細胞を有核細胞数３．７５×１０^７細胞個／７５ｃｍ^２となるように培養フラスコへ播種し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、以後３日に１回培地を交換した。ｂＦＧＦは５日目から３ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（０．０５％）＋ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｚ１シングル，コールター社製）で計測し、５，０００細胞個／ｃｍ^２の密度で細胞を播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を試験に用いた。
（軟骨への分化誘導）
増殖させた細胞を２×１０^５細胞個／１ｍｌの密度で、各実験例で調製した軟骨分化培養液を用いた軟骨分化培地に懸濁させ、１５ｍｌ遠枕管に移し、５００Ｇで遠心し、ペレット（細胞塊）を得た。

【0046】

遠枕管のフタをゆるめ、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。２日目で軟骨分化培地を交換し、以後２日に１回培地を交換し、４週間培養して軟骨へと分化誘導した。

【0047】

なお、培地を交換する際にも、各実験例で調製した軟骨分化培養液を用いている。
（評価方法）
上述のように各実験例の軟骨分化培養液を用いて軟骨へと分化誘導した後、以下の２つの手法により評価を行った。
＜病理組織学的評価＞
各実験例の軟骨分化培養液により培養した組織を１０％ホルマリン中性緩衝溶液で２日間固定した後にパラフィン包埋し、ミクロトームにて厚さ５μｍに切り出し、トルイジンブルー染色を行った。そして、光学顕微鏡下にて観察を行い染色の有無を確認した。

【0048】

後述する表に示した各実験例の評価結果のうち×は染色が無かったことを、すなわち軟骨組織が確認されなかったことを示している。

【0049】

そして、後述する表に示した各実験例の評価結果のうち、〇については染色があったことを、すなわち軟骨組織が確認されたことを示している。染色があった試料については、トルイジンブルー染色にて赤紫色に染まるメタクロマジー（異調性）陽性の軟骨基質が多く沈着した成熟した軟骨組織である事を確認した。
＜生物学的評価＞
培養した組織をパパイン水溶液で消化したサンプルをＧＡＧ定量キット及びＤＮＡ定量キットで定量し、単位ＤＮＡあたりのグリコサミノグリカン量を算定し、別途細胞数とＤＮＡ量の関係を計測した結果より単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量を定量した。ＩＩ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲンはＥＬＩＳＡにより定量し、同様に単位細胞あたりの数値として算出した。

【0050】

なお、評価は以下の表１に示す成分からなる培養液を軟骨分化培養液として用いて、上述の手順と同様にして軟骨組織を培養し、培養した軟骨組織について同様にして分析した結果を基準として、後述する評価式に基づいて行った。なお、表１に示す成分からなる培養液は、既述の非特許文献１（より具体的には非特許文献１の参考文献１９も参照）に開示された培養液の組成を示している。また、表１中ＤＭＥＭの添加量を残部としているが、これはＤＭＥＭが軟骨分化培養液を１ｍｌ調製した場合の残部であることを示している。

【0051】

評価は具体的には、（１）単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量、及び（２）ＩＩ型コラーゲン比率（ＩＩ／（Ｉ＋ＩＩ）×１００（％））を算出し、その結果について、以下の評価式に基づいて基準値と、各実験例の結果とを比較して〇〜××で評価している。

【0052】

なお、単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量、及びＩＩ型コラーゲン比率は数値が大きいほど軟骨分化が促進されていることを意味する。

【0053】

以下の評価式中Ｃｔｒｌが表１に示した培養液を用いて培養した軟骨組織についての評価結果を、Ｅｘが各実験例で調製した培養液を用いて培養した軟骨組織についての評価結果を示している。
○ ： Ctrl ＜＜＜ Ex （実験結果（Ｅｘ）がコントロール（Ｃｔｒｌ）の１．５倍以上）
△＋ ： Ctrl ＜＜ Ex （実験結果（Ｅｘ）がコントロール（Ｃｔｒｌ）の１．２倍以上１．５倍未満）
△− ： Ctrl ＜ Ex （実験結果（Ｅｘ）がコントロール（Ｃｔｒｌ）の１．０５倍以上１．２倍未満）
× ： Ctrl ＝ Ex （実験結果（Ｅｘ）がコントロール（Ｃｔｒｌ）の１倍以上１．０５倍未満）
×× ： Ctrl ＞ Ex （実験結果（Ｅｘ）がコントロール（Ｃｔｒｌ）未満）
いずれの実験例においても（１）単位細胞あたりのグリコサミノグリカン量についての評価と、（２）ＩＩ型コラーゲン比率（ＩＩ／（Ｉ＋ＩＩ）×１００（％））についての評価とは同じ評価となった。このため、表７〜表９の生物学的評価の欄で１つの結果として示している。

【0054】

【表1】

【0055】

次に、各実験例における軟骨分化培養液の調製手順について説明する。例１、例６〜例２２が実施例、例２〜例５が比較例となる。

【0056】

なお、以下の各実験例においてＩＴＳ＋、脂肪酸濃縮液、ビタミン液、ＥＡＡとしては表２〜表５に示した成分を含有する試薬を用いている。表２がＩＴＳ＋、表３が脂肪酸濃縮液、表４がビタミン液、表５がＥＡＡの組成をそれぞれ示している。

【0057】

【表2】

【0058】

【表3】

【0059】

【表4】

【0060】

【表5】

【0061】

［例１〜例５］
以下の表６に示した共通成分と、各実験例について表７に示した各成分とを混合することにより軟骨分化培養液を調製した。

【0062】

すなわち、例えば例１の場合には、表６に示した共通成分と、表７に示したヘパリン１００Ｕｎｉｔ／ｍｌと、ｂＦＧＦ１００ｎｇ／ｍＬと、ＴＧＦ−β３を１０ｎｇ／ｍＬと、インスリン１００μｇ／ｍＬと、ＩＴＳ＋を１％とを混合して軟骨分化培養液を調製した。

【0063】

なお、ＩＴＳ＋の単位は体積比での百分率を示しており、共通成分を含む軟骨分化培養液全体に対する比率を示している。

【0064】

また、表６においてＤＭＥＭの添加量を残部としているが、これはＤＭＥＭが、軟骨分化培養液を１ｍｌ調製した場合の残部であることを示している。

【0065】

得られた軟骨分化培養液について上述の評価を行った。結果を表７に示す。

【0066】

【表6】

【0067】

【表7】

【0068】

以上に示した実験例のうち、例１と、例２〜例５と、を比較すると明らかなように、例１は生物学的評価についても〇となっており、軟骨分化が促進されていることが確認できた。例１の軟骨分化培養液が、ヘパリンと、ｂＦＧＦとを同時に含んでおり、これを添加した軟骨分化培養液を用いた培地が、間葉系幹細胞の軟骨分化を特に促進できたためと考えられる。

【0069】

また、ヘパリンと、ｂＦＧＦのうち、いずれか一方のみを含む例２、例３についても両方を含まない例４と同様に生物学的評価は×となることが確認できた。従って、ヘパリンと、ｂＦＧＦのうちいずれか一方のみを添加するのではなく、例１のようにヘパリンとｂＦＧＦとを同時に添加することで軟骨分化を特に促進できることを確認できた。

【0070】

［例６〜例１９］
上述の表６に示した共通成分と、各実験例について表８に示した各成分とを混合した点以外は、例１と同様にして軟骨分化培養液を調製し、評価を行った。結果を表８に示す。

【0071】

【表8】

【0072】

例６〜例９については、ヘパリン、及びｂＦＧＦのいずれか一方または両方を含まない例２〜例５と比較すると軟骨分化を促進する効果は確認できたものの、例１と比較すると、軟骨分化を促進する効果が若干劣ることが確認された。

【0073】

また例１０〜例１９については、生物学的評価が例１と同様に〇となっており、例１と同様に軟骨分化を促進する効果を有することが確認できた。

【0074】

これらの結果から、ヘパリンの添加量は１Ｕｎｉｔ／ｍＬ以上１００００Ｕｎｉｔ／ｍＬ以下が好ましく、ｂＦＧＦの添加量は１ｎｇ／ｍＬ以上１００００ｎｇ／ｍＬ以下が好ましいことを確認できた。

【0075】

［例２０〜例２２］
上述の表６に示した共通成分と、各実験例について表９に示した各成分とを混合した点以外は、例１と同様にして軟骨分化培養液を調製し、評価を行った。結果を表９に示す。

【0076】

【表9】

【0077】

例２０〜例２２については生物学的評価が△＋になっていることから従来技術と比較して、軟骨分化を促進する効果は確認できたものの、例１に比べると、その効果は若干劣ることが確認できた。これらの結果から、軟骨分化培養液は、ＴＧＦ−β３、インスリン、及びＩＴＳ＋も含有していることが好ましいことを確認できた。