特許 6447130 癌の治療及び／又は予防用医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6447130

(24)【登録日】2018年12月14日

(45)【発行日】2019年1月9日

(54)【発明の名称】癌の治療及び／又は予防用医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20181220BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20181220BHJP

   C12N 5/16 20060101ALI20181220BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20181220BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20181220BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20181220BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20181220BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20181220BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20181220BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/30ZNA

   C07K16/46

   C12N5/16

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P43/00 121

   A61K45/00

   A61K39/395 T

   A61K39/395 L

   C12N15/13

【請求項の数】23

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2014-548217(P2014-548217)

(86)(22)【出願日】2014年8月8日

(86)【国際出願番号】JP2014071094

(87)【国際公開番号】WO2015020212

(87)【国際公開日】20150212

【審査請求日】2017年8月4日

(31)【優先権主張番号】特願2013-166164(P2013-166164)

(32)【優先日】2013年8月9日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003159

【氏名又は名称】東レ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100180954

【弁理士】

【氏名又は名称】漆山 誠一

(72)【発明者】

【氏名】岡野 文義

(72)【発明者】

【氏名】齋藤 孝則

(72)【発明者】

【氏名】南田 佳孝

(72)【発明者】

【氏名】井戸 隆喜

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０１６５２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０９６５１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０１８８８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５０２２０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１１３７４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５０５０２８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１、２及び３の相補性決定領域を含む重鎖可変領域と
配列番号４、５及び６の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と
を含み、かつ、
ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する、抗体又はそのフラグメント。

【請求項2】

重鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項3】

重鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項4】

重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項5】

重鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項6】

重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項7】

重鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項8】

重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項9】

重鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項10】

重鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項11】

重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項12】

重鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項13】

重鎖可変領域が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、かつ、
軽鎖可変領域が配列番号２１のアミノ酸配列を含んでなる
請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項14】

ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項15】

抗腫瘍剤がコンジュゲートされた請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。

【請求項16】

前記抗体の重鎖定常領域に１もしくは複数個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項17】

前記抗体が、重鎖定常領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンに結合したフコースを除去した抗体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項18】

前記抗体の組成物であって、請求項１７に記載の抗体及び重鎖定常領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合した請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体を含む、抗体の組成物。

【請求項19】

請求項１７に記載の抗体又は請求項１８に記載の抗体の組成物を産生する細胞。

【請求項20】

請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント、請求項１６又は１７に記載の抗体、あるいは請求項１８に記載の抗体の組成物を有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。

【請求項21】

前記癌が乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、肥満細胞腫、メラノーマ、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌又は頭頸部癌である、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

請求項２０又は２１に記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。

【請求項23】

請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体又はそのフラグメントの、癌の治療及び／又は予防剤等としての新規な医薬用途に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩によって、癌に特異的に反応する抗体類、細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原類、癌抗原をコードする遺伝子類等が同定されており、癌抗原類をターゲットにした特異的癌治療法への期待が高まっている。

【0003】

Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＣＡＰＲＩＮ−１）は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現し、また細胞内でＲＮＡと細胞内ストレス顆粒を形成してｍＲＮＡの輸送、翻訳の制御に関与することなどが知られている細胞内タンパク質として知られていたが、癌細胞の表面に特異的に発現することが見出され、癌治療のための抗体医薬のターゲットとして研究が進められている（特許文献１〜１９）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】ＷＯ２０１０／０１６５２６

【特許文献2】ＷＯ２０１１／０９６５１７

【特許文献3】ＷＯ２０１１／０９６５２８

【特許文献4】ＷＯ２０１１／０９６５１９

【特許文献5】ＷＯ２０１１／０９６５３３

【特許文献6】ＷＯ２０１１／０９６５３４

【特許文献7】ＷＯ２０１１／０９６５３５

【特許文献8】ＷＯ２０１３／０１８８８６

【特許文献9】ＷＯ２０１３／０１８８９４

【特許文献10】ＷＯ２０１３／０１８８９２

【特許文献11】ＷＯ２０１３／０１８８９１

【特許文献12】ＷＯ２０１３／０１８８８９

【特許文献13】ＷＯ２０１３／０１８８８３

【特許文献14】ＷＯ２０１３／１２５６３６

【特許文献15】ＷＯ２０１３／１２５６５４

【特許文献16】ＷＯ２０１３／１２５６３０

【特許文献17】ＷＯ２０１３／１２５６４０

【特許文献18】ＷＯ２０１３／１４７１６９

【特許文献19】ＷＯ２０１３／１４７１７６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、癌細胞の表面に特異的に発現するＣＡＰＲＩＮ−１を標的とした、従来の抗体よりも抗腫瘍活性の優れた抗体を作出し、癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、以下の特徴を有する。

【0007】

本発明では、配列番号１、２及び３を含む重鎖可変領域と配列番号４、５及び６を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。

【0008】

その実施形態において、上記癌は、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、肥満細胞腫、メラノーマ、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌、又は頭頸部癌である。

【0009】

別な実施形態において、上記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖型抗体又は多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）である。

【0010】

本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-166164号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

【発明の効果】

【0011】

本発明に係るＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は、癌細胞を障害する。したがって、本発明に係るＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は癌の治療や予防に有用である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ−１のポリペプチドに対する抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体外で、該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して免疫細胞を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって、あるいは、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって評価することができる。

【0013】

本発明に係る上記のＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよいが、好ましくはモノクローナル抗体であり、抗腫瘍活性を発揮しうる限りいかなる種類の抗体であってもよく、例えば、組換え抗体（例えば、合成抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等）、ヒト抗体、それらの抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ等）を含む。これらの抗体及びそのフラグメントはまた、当業者に公知の方法により調製することが可能である。また、被験者がヒトである場合には、拒絶反応を回避又は抑制するためにヒト抗体又はヒト化抗体であることが望ましい。

【0014】

「ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と特異的に結合する」とは、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に特異的に結合し、それ以外のタンパク質と実質的に結合しないことを意味する。

【0015】

また、本発明における癌の治療及び／又は予防の対象である被験者は、ヒト、ペット動物、家畜類、競技用動物等の哺乳動物であり、好ましい被験者は、ヒトである。

【0016】

以下に、本発明に関する抗原の作製、抗体の作製、ならびに医薬組成物について説明する。

【0017】

＜抗体作製用抗原の作製＞
本発明に係るＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ等、その由来となる動物種に制限されない。しかし細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましい。一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１がヒトＣＡＰＲＩＮ−１の場合、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチド、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１を発現する細胞等を用いることができる。

【0018】

ヒトＣＡＰＲＩＮ−１及びそのホモログの塩基配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）にアクセスし、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：５８７３−５８７７，１９９３； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２， １９９７）を利用することによって入手することができる。

【0019】

本発明では、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１の塩基配列（配列番号１６又は１８）又はアミノ酸配列（配列番号１７又は１９）を基準とした場合、これらのＯＲＦ又は成熟部分の塩基配列又はアミノ酸配列と７０％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、さらに好ましくは９５％〜１００％、例えば、９７％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％又は９９．５％〜１００％の配列同一性を有する配列からなる核酸又はタンパク質がターゲットのＣＡＰＲＩＮ−１になる（配列番号１７と配列番号１９のアミノ酸配列を比較すると、６９０位以降のアミノ酸残基が相違する。）。ここで、「％配列同一性」は、２つの配列を、ギャップを導入して又はギャップを導入しないで、最大の類似度（又は一致度）となるようにアラインメント（整列）したとき、アミノ酸（又は塩基）の総数（ギャップの数を含む）に対する同一アミノ酸（又は塩基）のパーセンテージ（％）を意味する。

【0020】

ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の断片は、抗体が認識する最小単位であるエピトープ（抗原決定基）のアミノ酸長から、該タンパク質の全長未満の長さを有する。エピトープは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７〜１２アミノ酸、例えば、８〜１１アミノ酸からなる。

【0021】

上記した、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチドを含むポリペプチド断片は、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第３版， Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ等）を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やそのポリペプチド断片を得ることができる。

【0022】

上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、該塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ等）及びＭｇ^２＋含有ＰＣＲバッファーを用いて、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件等を挙げることができるが、これに限定されない。ＰＣＲの手法、条件等については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第３版， Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（特に第１５章）に記載されている。

【0023】

また、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子の塩基配列及びＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒト等のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、ＣＡＰＲＩＮ−１のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。そのような細胞や組織の例は、精巣の他、白血病、乳癌、リンパ腫、脳腫瘍、肺癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、肉腫、肥満細胞腫、肝臓癌、胆嚢癌、メラノーマ、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌又は頭頸部癌等の癌又は腫瘍に由来する細胞又は組織である。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニング等の操作は当業者に既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９）、Ａｕｓｂｅｌら（上記）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。

【0024】

発現ベクターを導入する上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌等、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物細胞、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、出芽酵母、分裂酵母等の酵母細胞、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0025】

宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム等が例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。

【0026】

宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば、（Ｈｉｓ）_６〜（Ｈｉｓ）_１０）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰ等各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。

【0027】

発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合等の周知の方法を用いることができる。

【0028】

宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素等の変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0029】

本発明に係る抗体を作製するため、以上のようにして作製した抗原を後述の通り感作抗原として用いることができる。

【0030】

＜抗体の構造＞
抗体（免疫グロブリン）は通常少なくとも２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭは別として、免疫グロブリンは、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間でジスルフィド結合の数は変動する。それぞれの重鎖及び軽鎖は鎖内ジスルフィド結合も有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＨ領域）を有し、それにいくつかの定常領域が続く。それぞれの軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ領域）を有し、その反対の端に１つの定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と整列しており、かつ軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。抗体の可変ドメインは、特定の領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を示して抗体に結合特異性を付与する。可変領域において相対的に保存されている部分は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）と呼ばれている。完全な重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、３つの相補性決定領域が４つのフレームワーク領域で連結された構造、すなわち、Ｎ末から順にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４が連結した構造からなる。３つの相補性決定領域は重鎖ではそのＮ末から順にＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３、同様に軽鎖ではＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，ＣＤＲＬ３と呼ばれている。抗体の抗原への結合特異性には、ＣＤＲＨ３が最も重要である。また、各鎖のＣＤＲはフレームワーク領域によって近接した状態で一緒に保持され、他方の鎖由来の相補性決定領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗体が抗原に結合することに直接寄与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用（ＡＤＣＰ）、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、補体カスケードのＣ１ｑ構成要素を介した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示す。

【0031】

＜抗体の作製＞
本発明における抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体とは、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の全長又はその断片と免疫学的反応性を有する抗体を意味する。

【0032】

ここで、「免疫学的反応性」とは、生体内で抗体とＣＡＰＲＩＮ−１抗原（ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の全長又はその部分ポリペプチド）とが結合する特性を意味する。本発明の抗体のＣＡＰＲＩＮ−１へのこのような結合を介して腫瘍細胞を障害（例えば、死滅、抑制又は退縮）する機能が発揮される。本発明の抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と結合して腫瘍、例えば、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌（例えば、結腸癌）、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、肥満細胞腫、メラノーマ、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌又は頭頸部癌等を障害することができる。

【0033】

本発明の抗体は、好適にはモノクローナル抗体であれば特に限定されず、合成抗体、多重特異性抗体（例えばダイアボディ、トリアボディ等）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ）等を含む。また、抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えば、ＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＹ、又は任意のサブクラス、例えば、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２等である。

【0034】

抗体はさらに、グリコシル化の他に、脱グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はペグ（ＰＥＧ）化等によって修飾されていてもよい。

【0035】

以下に、種々のモノクローナル抗体の作製例を示す。

【0036】

例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３等をマウスに投与して免疫し、同マウスより脾臓を抽出し、細胞を分離の上、該細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、癌細胞増殖抑制作用を持つ抗体を産生するクローンを選択する。癌細胞増殖抑制作用を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを単離し、当該ハイブリドーマを培養し、培養上清から一般的なアフィニティ精製法により抗体を精製することで、本発明の抗体を調製することが可能である。

【0037】

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば、以下のようにしても作製することができる。まず、公知の方法に従って、感作抗原を動物に免疫する。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。

【0038】

このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

【0039】

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９７９）１２３， １５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９７８）８１， １−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ． Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９７６）６， ５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ． Ｄ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （１９７６）８， ４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７８）２７６， ２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ． Ｇｒｏｔｈ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （１９８０）３５， １−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ， Ｉ．Ｓ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． （１９７８）１４８， ３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７９）２７７， １３１−１３３）、２４０Ｅ−１、２４０Ｅ−Ｗ並びに２４０Ｅ−Ｗ２等が好適に使用される。

【0040】

前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ケーラーとミルステインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９８１）７３， ３−４６）等に準じて行うことができる。

【0041】

より具体的には、前記細胞融合は、例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

【0042】

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。

【0043】

細胞融合では、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば、平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とするハイブリドーマを形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去することが好ましい。

【0044】

このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。

【0045】

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えば、ＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えば、Ｕ２６６（登録番号ＴＩＢ１９６）と融合させ、所望の活性（例えば、細胞増殖抑制活性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。

【0046】

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

【0047】

すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。

【0048】

抗原の調製は、例えば、動物細胞を用いた方法（特表２００７−５３００６８）やバキュロウイルスを用いた方法（例えば、国際公開第ＷＯ９８／４６７７７号等）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。抗原はアジュバントとともに投与して免疫してもよい。

【0049】

本発明の抗体は、さらにまた、その抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体としても得ることができる（例えば、Ｃａｒｌ， Ａ．Ｋ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ， Ｊａｍｅｓ， Ｗ． Ｌａｒｒｉｃｋ， ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ， １９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。

【0050】

本発明の抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体は、好適にはモノクローナル抗体であることを特徴とするが、モノクローナル抗体には、ヒトモノクローナル抗体、非ヒト動物モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体等）、キメラモノクローナル抗体等が含まれる。モノクローナル抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質又はその断片で免疫した非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ヒト抗体産生マウス、ニワトリ、ウサギ等）からの脾細胞とミエローマ細胞との融合によって得られたハイブリドーマを培養することによって作製されうる。キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体等である。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。

【0051】

なお、後述の実施例では、複数のヒト化モノクローナル抗体及びヒト−ウサギキメラモノクローナル抗体が作製され、強い抗腫瘍効果が確認された。これらモノクローナル抗体は、いずれも重鎖可変領域（ＶＨ領域）に配列番号１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ領域）に、配列番号４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３を含む。これらモノクローナル抗体はそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト化抗体＃０、配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト化抗体＃１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト化抗体＃２、配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト化抗体＃３、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト化抗体＃４、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト化抗体＃５、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト化抗体＃６、配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト化抗体＃７、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト化抗体＃８、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト化抗体＃９、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト化抗体＃１０、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶＬ領域から成るヒト−ウサギキメラ抗体を含む。

【0052】

ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体の相補性決定領域を、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。

【0053】

具体的には、例えば、マウス抗体、ウサギ抗体やニワトリ抗体の相補性決定領域とヒト抗体のフレームワーク領域を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開第ＥＰ２３９４００号、国際公開第ＷＯ９６／０２５７６号参照）。相補性決定領域を介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３， ５３： ８５１−８５６）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際公開第ＷＯ９９／５１７４３号参照）。

【0054】

キメラ抗体やヒト化抗体を作製する際には、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。

【0055】

アミノ酸の置換は、１もしくは複数個、例えば、１５未満、１０未満、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸、好ましくは１〜９アミノ酸の置換であり、置換抗体は、未置換抗体と機能的に同等であるべきである。

【0056】

ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の抗体と同様の生物学的あるいは生化学的活性、具体的には腫瘍を障害する機能を有すること、ヒトへの適用時に拒絶反応を本質的に起こさないことなどを指す。このような活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、あるいは結合活性を例示することができる。

【0057】

あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入してアミノ酸置換する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｇｅｎｅ １５２， ２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ， ＭＪ．， ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｍ． （１９８３） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００， ４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ， ＨＪ．， （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４， ３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ， ＴＡ．， （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８２， ４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ８５， ２７６３−２７６６）等を用いて、本発明の抗体に適宜アミノ酸置換を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。

【0058】

アミノ酸置換を導入する場合、置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。保存的アミノ酸置換とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換である。性質の類似したアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類しうる。

【0059】

抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。

【0060】

ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質又はそれを含むＣＡＰＲＩＮ−１断片ポリペプチドを認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質のエピトープを通常の方法（例えば、エピトープマッピングや後述にあるエピトープの同定の方法等）により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法等により得ることができる。

【0061】

本発明の抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１と免疫学的反応性を有する抗体、ＣＡＰＲＩＮ−１を特異的に認識する抗体、又はＣＡＰＲＩＮ−１と特異的に結合する抗体であって、癌に対する細胞障害活性、又は腫瘍増殖抑制作用を示す抗体である。該抗体は、それを投与する対象動物において拒絶反応がほとんど又は全く回避されるような構造をもつ抗体であることが好ましい。そのような抗体としては、例えば、対象動物がヒトである場合、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト−ウサギキメラ抗体）、単鎖抗体、二重特異性抗体等が挙げられる。これらの抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域がヒト抗体由来のものであるか、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）とヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）からなるものであるか、又は、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来のものであり、かつ、重鎖及び軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のものである組換え型抗体である。好ましい抗体は、前２つの抗体である。

【0062】

これらの組換え型抗体は、次のようにして作製することができる。ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からヒトＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体等）をコードするＤＮＡをクローニングし、これを鋳型にして該抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法等により作製し、例えば、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈＥｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））に基づいて軽鎖及び重鎖の、各可変領域の配列、又は各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列、又は各ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の配列を決定することができる。

【0063】

さらに、これらの各可変領域をコードするＤＮＡ又は各相補性決定領域をコードするＤＮＡを、遺伝子組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））又はＤＮＡ合成機を用いて作製する。ここで、上記ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にヒトＣＡＰＲＩＮ−１を免疫したのち、該免疫動物から切除した脾細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって作製することができる。これとは別に、必要に応じて、遺伝子組換え技術又はＤＮＡ合成機を用いてヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡを作製する。

【0064】

ヒト化抗体の場合には、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ中のＣＤＲコーディング配列を、それらに対応する、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ等）由来の抗体のＣＤＲコーディング配列と置換することによって、ヒト化抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。例えば、ヒト抗体由来のＣＤＲコーディング配列をマウス抗体由来のＣＤＲコーディング配列と置換したヒト化抗体の場合、可変領域は、Ｎ末側からヒトＦＲ１、マウスＣＤＲ１、ヒトＦＲ２、マウスＣＤＲ２、ヒトＦＲ３、マウスＣＤＲ４、及びヒトＦＲ４の順で構成される。

【0065】

キメラ抗体の場合には、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ等）由来の抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、キメラ抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。

【0066】

単鎖抗体の場合には、この抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーを介して直線状に連結された抗体であり、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、リンカーをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを結合することによって単鎖抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、相補性決定領域のみヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ等）由来の抗体の相補性決定領域によって置換されたヒト抗体由来のものである。また、リンカーは、１２〜１９アミノ酸からなり、例えば、１５アミノ酸の（Ｇ_４Ｓ）_３（Ｇ． -Ｂ． Ｋｉｍら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２００７， ２０（９）： ４２５−４３２）が挙げられる。

【0067】

二重特異性抗体（例えば、ｄｉａｂｏｄｙ）の場合には、この抗体は２つの異なるエピトープと特異的に結合可能な抗体であり、例えば、重鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡをこの順序で結合する（ただし、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡと重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡとは上記のようなリンカーをコードするＤＮＡを介して結合される。）ことによって二重特異性抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、相補性決定領域のみヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ等）由来の抗体の相補性決定領域によって置換されたヒト抗体由来のものである。

【0068】

上記のようにして作製された組換えＤＮＡを、１つ又は複数の適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞等）に導入し、（共）発現させることによって組換え型抗体を作製することができる（Ｐ．Ｊ． Ｄｅｌｖｅｓ．， ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．， １９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ． Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ． Ｄｅａｎ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．， ２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ； Ｊ．Ｗ． Ｇｏｄｉｎｇ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．， １９９３ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ）。

【0069】

上記方法によって作製される本発明の抗体としては、例えば、後述の実施例で取得された配列番号１、２及び３を含む重鎖可変領域と配列番号４、５及び６を含む軽鎖可変領域とを含む以下の抗体（ａ）〜（ｌ）が挙げられる。

【0070】

（ａ）配列番号８の重鎖可変領域及び配列番号１５の軽鎖可変領域で構成される抗体
（ｂ）配列番号１０の重鎖可変領域及び配列番号１５の軽鎖可変領域で構成される抗体
（ｃ）配列番号７の重鎖可変領域及び配列番号１５の軽鎖可変領域で構成される抗体
（ｄ）配列番号８の重鎖可変領域及び配列番号１３の軽鎖可変領域で構成される抗体
（ｅ）配列番号７の重鎖可変領域及び配列番号１２の軽鎖可変領域で構成される抗体
（ｆ）配列番号８の重鎖可変領域及び配列番号１２の軽鎖可変領域で構成される抗体
（ｇ）配列番号７の重鎖可変領域及び配列番号１３の軽鎖可変領域で構成される抗体
（ｈ）配列番号１０の重鎖可変領域及び配列番号１４の軽鎖可変領域で構成される抗体
（ｉ）配列番号８の重鎖可変領域及び配列番号１１の軽鎖可変領域で構成される抗体
（ｊ）配列番号７の重鎖可変領域及び配列番号１１の軽鎖可変領域で構成される抗体
（ｋ）配列番号９の重鎖可変領域及び配列番号１５の軽鎖可変領域で構成される抗体
（ｌ）配列番号２０の重鎖可変領域及び配列番号２１の軽鎖可変領域で構成される抗体
ここで、配列番号１、２及び３に示すアミノ酸配列はそれぞれ、ウサギ抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、配列番号４、５及び６に示すアミノ酸配列はそれぞれ、ウサギ抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３である。

【0071】

また、本発明のヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体は、例えば以下の抗体（ｉ）〜（ｘｉｖ）である。

【0072】

（ｉ）重鎖の可変領域が配列番号１、２及び３のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列もしくはその置換体を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号４、５及び６のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列もしくはその置換体を含む抗体。

【0073】

（ｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号１、２及び３のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列もしくはその置換体を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号４、５及び６のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列もしくはその置換体を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0074】

（ｉｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0075】

（ｉｖ）重鎖の可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0076】

（ｖ）重鎖の可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0077】

（ｖｉ）重鎖の可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0078】

（ｖｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0079】

（ｖｉｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0080】

（ｉｘ）重鎖の可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0081】

（ｘ）重鎖の可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0082】

（ｘｉ）重鎖の可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0083】

（ｘｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0084】

（ｘｉｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0085】

（ｘｉｖ）重鎖の可変領域が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

【0086】

なお、ヒト抗体重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域のフレームワーク領域の配列は、例えば、ＮＣＢＩ（米国：ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅ等）から入手可能であり、例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２２８、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２３０、ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域については登録番号Ｘ０３６０４、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域については登録番号Ｋ０１３１６、ヒト軽鎖κ定常領域については登録番号Ｖ００５５７、Ｘ６４１３５、Ｘ６４１３３等、ヒト軽鎖λ定常領域については登録番号Ｘ６４１３２、Ｘ６４１３４等の配列を参照することができる。

【0087】

上記抗体は、好ましくは、細胞障害活性を有しており、これによって抗腫瘍効果（あるいは抗腫瘍活性）を発揮することができる。

【0088】

さらに上記抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１を特異的に認識するという特異性を有する限り、各抗体の相補性決定領域の配列、フレームワーク領域の配列及び／又は定常領域の配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加があってもよい。ここで数個とは、好ましくは１〜９個を意味する。

【0089】

本発明の抗体の、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質又はその断片に対する親和定数Ｋａ（ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）は、好ましくは、少なくとも少なくとも５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、少なくとも１０^１３Ｍ^−１、あるいは少なくとも１０^１４Ｍ^−１である。

【0090】

本発明の抗体によるＣＡＰＲＩＮ−１発現癌細胞に対する抗腫瘍効果の機序の１つとして、ＣＡＰＲＩＮ−１発現細胞のエフェクター細胞抗体依存的細胞障害性（ＡＤＣＣ）がある。本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸を１もしくは数個置換する、あるいは、重鎖定常領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖中のＮ−アセチルグルコサミンに結合しているフコースを除去することによって、本発明の抗体のＡＤＣＣによる抗腫瘍活性を増強することができる。さらに、上記重鎖定常領域のアミノ酸置換及びフコース除去を組み合わせることによって、本発明の抗体のＡＤＣＣによる抗腫瘍活性をさらに増強させることができる。

【0091】

また、本発明における重鎖定常領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖中のＮ−アセチルグルコサミンに結合しているフコースを除去した抗体は、それ単独であってもよいし、また、フコースが結合している抗体との組成物であってもよい。当該抗体の組成物においては、フコースを除去した抗体が主成分であることが好ましい。

【0092】

重鎖定常領域のアミノ酸を１もしくは数個置換された抗体は、例えば国際公開第ＷＯ２００４／０６３３５１号、国際公開第ＷＯ２０１１／１２０１３５号、米国特許８３８８９５５号、国際公開第ＷＯ２０１１／００５４８１号、米国特許６７３７０５６号、国際公開第ＷＯ２００５／０６３３５１号を参照して作製することができる。重鎖定常領域中のＮ−グリコシド結合糖鎖中のＮ−アセチルグルコサミンに付加しているフコースが除去された抗体又はその産生細胞は、例えば米国特許６６０２６８４号、欧州特許１９１４２４４号、米国特許７５７９１７０号を参照して作製することができる。重鎖定常領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖中のＮ−アセチルグルコサミンに結合しているフコースを除去した抗体とフコースが結合している抗体の組成物又はその産生細胞は、例えば米国特許８６４２２９２号を参照して作製することができる。

【0093】

本発明の抗体は、抗腫瘍剤とコンジュゲートすることができる。抗体と抗腫瘍剤との結合は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオール基等と反応性の基（例えば、コハク酸イミジル基、ホルミル基、２−ピリジルジチオ基、マレイイミジル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基等）をもつスペーサーを介して行うことができる。

【0094】

抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えば、カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン （ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な塩又は誘導体を包含する。

【0095】

抗体が、抗腫瘍剤とコンジュゲートした抗体である場合に、抗腫瘍活性を発揮するかどうかを評価する方法としては、例えば、マウス由来の抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体ならば、マウス抗体に結合する二次抗体に薬物が付いたものを同時に反応させて、ヒト癌細胞に対する抗腫瘍効果を生体外で評価することができる。例えば、サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）が結合されたセカンドイムノトキシンである抗ヒトＩｇＧ抗体 （Ｈｕｍ−ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて評価ができる。

【0096】

また、本発明の抗体と、抗腫瘍剤を併用投与することで、より高い治療効果を得ることができる。本手法は、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現している癌患者に対して、外科的手術前後どちらにおいても適応できる。特に手術後に、従来抗腫瘍剤単独で処置されていたＣＡＰＲＩＮ−１が発現している癌に対して、より高い癌再発防止や生存期間の延長が得られる。

【0097】

本発明の抗体との併用投与に用いられる抗腫瘍剤には、例えば、前記抗腫瘍剤を利用することができる。特にシクロホスファミド、パクリタキセル、ドキセタキセル、ビノレルビンが好ましく用いられる。

【0098】

あるいは、本発明の抗体には、文献等で公知の、^２１１Ａｔ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３ＳＭ、^２１２Ｂｉ、^３２Ｐ、^１７５Ｌｕ、^１７６Ｌｕ、^８９Ｓｒ、^６４Ｃｕ、^１１１Ｉｎ等の放射性同位体を結合することも可能である（Ｈｉｄｅｏ Ｓａｊｉ， ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ １２８（３） ３２３−３３２ ８（２００８）， Ｊｐｎ）。放射性同位体は、腫瘍の治療や診断のために有効なものが望ましい。このような放射性同位体も、本発明における抗腫瘍剤に含まれる。

【0099】

＜抗腫瘍効果＞
本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体によるＣＡＰＲＩＮ−１発現癌細胞に対する抗腫瘍効果は、以下の機序等により起こると考えられる：前述のＣＡＰＲＩＮ−１発現細胞のエフェクター細胞抗体依存的細胞障害性（ＡＤＣＣ）、及びＣＡＰＲＩＮ−１発現細胞の抗体依存的細胞貪食性（ＡＤＣＰ）。ただし、この機序により本発明の範囲を限定することは意図しない。

【0100】

したがって、本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の活性評価は、以下実施例に具体的に示されるように、生体外で、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞に対して上記ＡＤＣＣ活性又はＡＤＣＰ活性を測定することで評価することができる。

【0101】

本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体は、癌細胞上のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と結合し、上記活性等によって、抗腫瘍作用を示すことから、癌の治療あるいは予防に有用であると考えられる。すなわち本発明は、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を有効成分とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト化抗体にすることが好ましい。

【0102】

なお、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体と癌細胞表面上のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質との結合親和性が高い程、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による、より強い抗腫瘍活性が得られる。したがって、本発明の抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と高い結合親和性を有するため、より強い抗腫瘍効果が期待でき、癌の治療及び／又は予防を目的とした医薬組成物として適応することが可能になる。本発明の抗体は、高い結合親和性として、前述したように、結合定数（親和定数）Ｋａ（ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）が、好ましくは、少なくとも５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、少なくとも１０^１３Ｍ^−１、あるいは、少なくとも１０^１４Ｍ^−１を有することが好ましい。

【0103】

＜抗原発現細胞への結合＞
抗体がＣＡＰＲＩＮ−１に結合する能力は、実施例で述べられるような、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析等を用いた結合アッセイを利用して特定することができる。

【0104】

＜免疫組織化学染色＞
ＣＡＰＲＩＮ−１を認識する抗体は、当業者に周知の方法での免疫組織化学において用いることができる。例えば、外科手術の間に患者から得た組織や、自然に又はトランスフェクション後にＣＡＰＲＩＮ−１を発現する細胞系を接種した異種移植組織を担持する動物から得た組織を、パラホルムアルデヒド又はアセトン固定して得られた凍結切片、又はパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋した組織切片を使用して、ＣＡＰＲＩＮ−１との反応性に関して試験することができる。

【0105】

免疫組織化学染色のため、ＣＡＰＲＩＮ−１に対して反応性のある抗体を、様々な方法で染色させることができる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウス抗体、ヤギ抗ウサギ抗体やヤギ抗ニワトリ抗体を反応させることにより、可視化することができる。

【0106】

＜医薬組成物、及び癌の治療及び／又は予防方法＞
本発明の癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物の標的は、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子を発現する癌（細胞）であれば特に限定されない。

【0107】

本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。

【0108】

本発明において対象となる癌としては、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を細胞膜表面上に発現している癌であればいかなる癌でもよい。好ましくは、前述の乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、肥満細胞腫、メラノーマ、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌又は頭頸部癌である。

【0109】

上記癌は、より具体的には、例えば、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、肺腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、神経上皮組織性腫瘍である神経膠腫、膠芽腫、神経芽腫、脳室上衣腫、神経細胞性腫瘍、胎児型の神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫、慢性型リンパ球性白血病、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、盲腸癌、上行結腸癌、下行結腸癌、横行結腸癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌、卵巣上皮癌、胚細胞腫瘍、間質細胞腫瘍、膵管癌、浸潤性膵管癌、膵臓癌の腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腺癌、膵芽腫、膵頭細胞腫、Ｆｒａｎｔｓ腫瘍、漿液性嚢胞腺癌、固体乳頭状癌、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、インスリノーマ、多発性内分泌腺腫症１（Ｗｅｒｍｅｒ症候群）、非機能性島細胞腫、ソマトスタチノーマ、ＶＩＰ産生腫瘍、子宮頸癌、子宮体癌、線維肉腫、骨・関節肉種、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、肝芽腫、軟部肉腫、急性白血病、慢性白血病、脊髄腫瘍、軟部悪性腫瘍、奇形腫群腫瘍、頭頸部癌には下咽頭癌、中咽頭癌、舌癌、上咽頭癌、口腔癌、口唇癌、副鼻腔癌、喉頭癌等を包含するが、これらに限定されない。

【0110】

また、対象となる好ましい被験者（患者）は、哺乳動物であり、例えば、霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物等を含む哺乳動物であり、特にヒト、イヌ及びネコが好ましい。

【0111】

本発明で用いられる抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体又は媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。

【0112】

注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

【0113】

注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−６０と併用してもよい。

【0114】

油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えば、ベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

【0115】

投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型等が挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。

【0116】

また、患者の年齢、体重、性別、症状等により適宜投与方法を選択することができる。抗体又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重、年齢、性別、症状等により変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

【0117】

本発明の抗体又はそのフラグメントを含む上記の医薬組成物を被験者に投与することによって癌、好ましくは、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、肥満細胞腫、メラノーマ、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌、又は頭頸部癌を治療及び／又は予防することができる。

【0118】

さらに、本発明の医薬組成物を、上で例示したような抗腫瘍剤又は抗腫瘍剤を含む医薬組成物と組み合わせて、被験者に併用投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法も本発明に包含される。本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤は、同時に、又は、別々に被験者に投与されうる。別々に投与する場合には、いずれの医薬組成物が先であっても又は後であってもよく、それらの投与間隔、投与量、投与経路及び投与回数は、専門医によって適宜選択されうる。同時に投与する場合、例えば、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤を、薬理学上許容される担体（又は媒体）中で混合し製剤化して得られる医薬剤型の医薬組成物も包含されるものとする。また、抗腫瘍剤を含有する上記医薬組成物及び剤型のいずれに対しても、本発明の抗体を含有する医薬組成物及び剤型についての処方、製剤化、投与経路、用量、癌等の説明を適用しうる。

【0119】

したがって、本発明は、本発明の医薬組成物と、上で例示したような抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含む、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品及びそれを投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法も提供する。また、本発明は、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤とを、薬理学上許容される担体とともに含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物も提供する。

【0120】

＜ポリペプチド及びＤＮＡ＞
本発明はさらに、本発明の上記抗体をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡも提供する。そのようなＤＮＡは、例えば抗体（ａ）の場合、配列番号１、２及び３のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、配列番号４、５及び６のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、などを含む。

【0121】

これらの配列のＤＮＡによってコードされる相補性決定領域は、抗体の特異性を決定する領域であるため、抗体のそれ以外の領域（すなわち、定常領域及びフレームワーク領域）をコードする配列は他の抗体由来の配列であってもよい。ここで他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。すなわち、上記のＤＮＡでは、重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。

【0122】

さらに、本発明の抗体をコードするＤＮＡの別の例は、例えば配列番号８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列番号１５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡなどである。ここで、配列番号８のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号２３の塩基配列である。また、配列番号１５のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号３０の塩基配列である。これらのＤＮＡでも、重鎖及び軽鎖の各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。

【0123】

これら抗体のＤＮＡは、例えば上記の方法又は以下の方法で得ることができる。まず、本発明の抗体に関わるハイブリドーマから、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを調製し、ランダムプライマー等を用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで既知のマウス抗体重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の各可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによってえることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミド又はファージに組み込むなどして、常法により決定することができる。

【0124】

本発明はさらに、上記抗体（ｉ）〜（ｘｉｖ）に関わる以下の（ｉ）〜（ｘｖ）に記載のポリペプチド及びＤＮＡも提供する。

【0125】

（ｉ）配列番号１、２及び３に示すアミノ酸配列からなる群から選択される、重鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【0126】

（ｉｉ）配列番号４、５及び６に示すアミノ酸配列から選択される、軽鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【0127】

（ｉｉｉ）配列番号８及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２３及び配列番号３０の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0128】

（ｉｖ）配列番号１０及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２５及び配列番号３０の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0129】

（ｖ）配列番号７及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２２及び配列番号３０の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0130】

（ｖｉ）配列番号８及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２３及び配列番号２８の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0131】

（ｖｉｉ）配列番号７及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２２及び配列番号２７の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0132】

（ｖｉｉｉ）配列番号８及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２３及び配列番号２７の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0133】

（ｉｘ）配列番号７及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２２及び配列番号２８の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0134】

（ｘ）配列番号１０及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２５及び配列番号２９の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0135】

（ｘｉ）配列番号８及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２３及び配列番号２６の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0136】

（ｘｉｉ）配列番号７及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２２及び配列番号２６の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0137】

（ｘｉｉｉ）配列番号９及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２４及び配列番号３０の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0138】

（ｘｉｖ）配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば配列番号３１及び配列番号３２の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0139】

（ｘｖ）前記（ｉ）〜（ｘｉｖ）に記載のポリペプチドにおいて重鎖定常領域に１もしくは複数個のアミノ酸置換を含むポリペプチド又はそのフラグメント、並びに該ポリペプチド又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ。

【0140】

これらのポリペプチド及びＤＮＡは、上記の通り、遺伝子組み換え技術を用いて作製することができる。

【0141】

＜本発明の要約＞
上で説明した本発明を以下に要約する。

【0142】

（１）配列番号１、２及び３の相補性決定領域を含む重鎖可変領域と配列番号４、５及び６の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント。

【0143】

（２）重鎖の可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0144】

（３）重鎖の可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0145】

（４）重鎖の可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0146】

（５）重鎖の可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0147】

（６）重鎖の可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0148】

（７）重鎖の可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0149】

（８）重鎖の可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0150】

（９）重鎖の可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0151】

（１０）重鎖の可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0152】

（１１）重鎖の可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0153】

（１２）重鎖の可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0154】

（１３）重鎖の可変領域が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号２１のアミノ酸配列を含んでなる（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0155】

（１４）ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、（１）〜（１３）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0156】

（１５）抗腫瘍剤がコンジュゲートされた（１）〜（１３）に記載の抗体又はそのフラグメント。

【0157】

（１６）前記抗体の重鎖定常領域に１もしくは複数個のアミノ酸置換を含む、（１）〜（１５）に記載の抗体。

【0158】

（１７）前記抗体が、重鎖定常領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンに結合したフコースを除去した抗体である、（１）〜（１６）に記載の抗体。

【0159】

（１８）前記抗体の組成物であって、（１７）に記載の抗体及び重鎖定常領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合した（１）〜（１６）に記載の抗体を含む、抗体の組成物。

【0160】

（１９）（１７）に記載の抗体又は（１８）に記載の抗体の組成物を産生する細胞。

【0161】

（２０）（１）〜（１５）のいずれかに記載の抗体又はそのフラグメント、（１６）又は（１７）に記載の抗体、あるいは（１８）に記載の抗体の組成物を有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。

【0162】

（２１）前記癌が乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、肥満細胞腫、メラノーマ、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌又は頭頸部癌である、（２０）に記載の医薬組成物。

【0163】

（２２）（２０）又は（２１）に記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。

【0164】

（２３）（１）〜（１６）に記載の抗体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ。

【0165】

（２４）（１）〜（１６）のいずれかに記載の抗体又はそのフラグメント、（１７）に記載の抗体、（１８）に記載の抗体の組成物、（２０）又は（２１）に記載の医薬組成物、あるいは（２２）に記載の組み合わせ医薬品を、被験者に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。

【実施例】

【0166】

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例によって制限されないものとする。

【0167】

実施例１：ウサギを用いた抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の作製
ＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例３で調製したヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質３００μｇを等量のフロイントの完全アジュバントと混合し、これをウサギ１羽当たりの抗原溶液とした。２回目以降の免疫にはフロインとの不完全アジュバントと混合したものを使用した。抗原溶液を１２週齢のウサギの腹腔内に投与後、２〜３週間毎に８回投与を行って免疫を完了した。最後の免疫から４日後に摘出したそれぞれの脾臓からリンパ球を得、ウサギのミエローマ細胞２４０Ｅ−Ｗ２と１：２の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地２００μＬとＰＥＧ１５００を８００μＬを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて、５分間静置して細胞融合を行った。遠心して上清を除去後、ＨＡＴ溶液を２％当量加えた１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ選択培地）３００ｍＬで細胞を懸濁し、９６穴プレートの１ウェル当たり１００μＬずつ、プレート８０枚に播種した。７日間、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件で培養することで、脾臓細胞とウサギミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。

【0168】

作製したハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に対する反応性を指標にハイブリドーマを選抜した。ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質溶液１μｇ／ｍＬを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μＬ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液を１ウェル当たり４００μＬ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μＬのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ウサギ抗体を１ウェル当たり１００μＬ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液を１ウェル当たり１００μＬ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μＬ添加して反応を停止させ、吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを複数個選抜した。

【0169】

選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に対する反応性を指標にハイブリドーマを選抜した。上記と同様の操作によって各抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に対する反応性評価を実施した結果、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に反応性を示すウサギモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を複数個得た。

【0170】

次にそれらＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に反応性を示すウサギモノクローナル抗体からＣＡＰＲＩＮ−１が発現するヒト癌細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、２×１０^５個のヒト肺癌細胞株ＱＧ５６及びヒト乳癌細胞ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣから入手）をそれぞれ１．５ｍＬ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの培養上清１００μＬを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．５％のＦＢＳを含むＰＢＳ（−）（０．５％ ＦＢＳ−ＰＢＳ（−））で１００倍希釈したＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体あるいはＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を添加し、氷上で１時間静置した。０．５％ ＦＢＳ−ＰＢＳ（−）で洗浄後、細胞を０．２μｇ／ｍＬのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅと０．５％ ＦＢＳ−ＰＢＳ（−）に細胞を懸濁して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ^ＴＭあるいはＦＡＣＳＶｅｒｓｅ^ＴＭ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー）で蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ハイブリドーマ培養用培地を用いて行い、陰性コントロールのサンプルとした。その結果、陰性コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現している癌細胞ＱＧ５６ならびにＢＴ−４７４の細胞表面に強く反応するウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体１個を選抜した。

【0171】

次に、上記で得たウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体について、ＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例５に記載の方法に沿って、可変領域をコードする遺伝子の増幅断片を取得し、遺伝子配列並びにそのアミノ酸配列を解析した。具体的にはウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、ウサギ可変領域配列に特異的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ法により、本抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域の遺伝子を取得した。それら遺伝子をクローニングベクターに挿入し、常法に従ってそれぞれの塩基配列を決定した。

【0172】

その結果得られたウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体は、配列番号２０に示す重鎖可変領域及び重鎖可変領域中のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３のアミノ酸配列からなり、配列番号２１に示す軽鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６のアミノ酸配列からなることが確認された。

【0173】

次に取得したウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の各種ヒト癌細胞への反応性を確認した。ＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子の発現が確認されているヒト癌細胞である、乳癌細胞（ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１）、大腸癌細胞（ＨＴ−２９）、肺癌細胞（ＱＧ５６）、胃癌細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７）、子宮癌細胞（ＨＥＣ−１−Ａ）、前立腺癌細胞（２２Ｒｖ１）、膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ１０．５）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）、卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３）、腎癌細胞（Ｃａｋｉ−２）、脳腫瘍細胞（Ｕ−８７ＭＧ）、膀胱癌細胞（Ｔ２４、ＨＴ−１３７６）、食道癌細胞（ＯＥ３３）、白血病細胞（ＯＣＩ−ＡＭＬ５）、リンパ腫細胞（Ｒａｍｏｓ）、胆嚢癌細胞（ＴＧＢＣ１４ＴＫＢ）、線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）、メラノーマ細胞（Ｇ−３６１）、副腎皮質癌細胞（Ａ−６７３）、ユーイング腫瘍細胞（ＲＤ−ＥＳ）、ホジキンリンパ腫細胞（ＲＰＭＩ１６６６）、中皮腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ２４５２）、多発性骨髄腫細胞（ＩＭ−９）、睾丸癌細胞（ＮＴ／Ｄ１）、甲状腺癌細胞（ＴＴ）又は頭頸部癌細胞（ＦａＤｕ）に、取得した上記抗体を反応させ、フローサイトメトリー法で蛍光強度を評価した。１．５ｍＬ容のミクロ遠心チューブに各癌細胞をそれぞれ１０^６個に集め、上記で得たウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清（１００μＬ）をそれぞれのチューブに添加し、４℃で１時間反応させた。０．５％ ＦＢＳ−ＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．５％ ＦＢＳ−ＰＢＳ（−）で５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を添加し、４℃で６０分間静置した。０．５％ ＦＢＳ−ＰＢＳ（−）で洗浄後、最終濃度が０．２μｇ／ｍＬのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅを含む０．５％ ＦＢＳ−ＰＢＳ（−）に細胞を懸濁して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ^ＴＭあるいはＦＡＣＳＶｅｒｓｅ^ＴＭ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー）で蛍光強度を測定した。一方、陰性コントロールとして、ハイブリドーマ培養用培地を用いて上記と同様の操作を行って調製したものを、陰性コントロールのサンプルとした。その結果、上記評価に用いた全ての癌細胞で、ウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清を用いた場合の蛍光強度は、陰性コントロールを用いた場合の蛍光強度よりも強かった。以上の結果から、ウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体は、ヒト癌細胞の癌細胞膜表面のＣＡＰＲＩＮ−１に反応することが確認された。

【0174】

実施例２：ヒト−ウサギキメラ抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の作製
実施例１で確認されたウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の配列番号２０で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列を発現させるための遺伝子と、配列番号２１で表される軽鎖可変領域を発現させるための遺伝子とを、それぞれヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域が挿入された哺乳類細胞発現用ベクターとヒトＩｇＧ１の軽鎖定常領域が挿入された哺乳類細胞発現用ベクターに挿入した。作製した２つの組み換え発現ベクターを常法に従って哺乳類細胞に導入してヒト−ウサギキメラ抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体（ヒト−ウサギキメラ抗体）を含む培養上清を得た。得られたキメラ化抗体を含む培養上清を常法に従ってＨｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（−）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを調製した。

【0175】

実施例３：ヒト化抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の作製
次に、実施例１で確認されたウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の重鎖可変領域中のＣＤＲ１〜３ならびに軽鎖可変領域中のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列と塩基配列の情報を基に、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列からなる配列番号７で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列を発現できるように塩基配列を設計し、これをヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域が挿入された哺乳類細胞発現用ベクターに挿入した。同様にして、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列からなる配列番号１１で表される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を発現できるように塩基配列を設計し、これをヒトＩｇＧ１の軽鎖定常領域が挿入された哺乳類細胞発現用ベクターに挿入した。上記２つの組換え発現ベクターを常法に従って哺乳類細胞に導入して、配列番号７で表される重鎖全長アミノ酸配列と配列番号１１で表される軽鎖全長アミノ酸配列とからなるヒト化抗体＃０を含む培養上清を得た。

【0176】

同様にして、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列からなる配列番号８で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、配列番号１１で表される軽鎖可変領域のアミノ酸配列とからなるヒト化抗体＃１を含む培養上清を得た。

【0177】

さらに同様にして、以下のヒト化抗体＃２〜１０を含む培養上清を得た。

【0178】

配列番号８で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列からなる配列番号１２で表される軽鎖全長アミノ酸配列とからなるヒト化抗体＃２。

【0179】

配列番号８で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列からなる配列番号１３で表される軽鎖全長アミノ酸配列とからなるヒト化抗体＃３。

【0180】

配列番号７で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、配列番号１２で表される軽鎖全長アミノ酸配列とからなるヒト化抗体＃４。

【0181】

配列番号７で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、配列番号１３で表される軽鎖全長アミノ酸配列とからなるヒト化抗体＃５。

【0182】

配列番号７で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列からなる配列番号１５で表される軽鎖全長アミノ酸配列とからなるヒト化抗体＃６。

【0183】

配列番号８で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、配列番号１５で表される軽鎖全長アミノ酸配列とからなるヒト化抗体＃７。

【0184】

重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列からなる配列番号９で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、配列番号１５で表される軽鎖全長アミノ酸配列とからなるヒト化抗体＃８。

【0185】

重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列からなる配列番号１０で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列からなる配列番号１４で表される軽鎖全長アミノ酸配列とからなるヒト化抗体＃９。

【0186】

配列番号１０で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列と、配列番号１５で表される軽鎖全長アミノ酸配列とからなるヒト化抗体＃１０。

【0187】

得られたヒト化抗体＃０〜＃１０を含む培養上清を常法に従ってＨｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（−）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを調製した。

【0188】

実施例４：ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃０〜＃１０の抗原特異性と癌細胞への反応性
次に、実施例２で調製したヒト−ウサギキメラ抗体と、実施例３で調製したヒト化抗体＃０〜＃１０のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質への特異的反応性を常法に従い、ＥＬＩＳＡ法で確認した。具体的には、あらかじめ５μｇ／ｍＬのＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を含むＰＢＳ溶液を９６穴プレート１ウェル当たりに１００μＬ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、５％のスキムミルクを含むＰＢＳ溶液からなるブロッキング溶液を１ウェル当たり４００μＬ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、ＰＢＳ−Ｔでウェルを洗浄後、０．２％のスキムミルクを含むＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調製したヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃０〜＃１０を含むそれぞれの溶液を１ウェル当たり５０μＬずつ各ウェルに添加し、室温にて１時間静置した。陰性コントロールとして、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に反応しないことが確認されているヒトＩｇＧ抗体を同様の抗体濃度で添加したウェル、ならびに抗体を添加しないウェルを同時に用意した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、０．２％のスキムミルクを含むＰＢＳで３０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を１ウェル当たり５０μＬ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して１〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μＬ添加して反応を停止させ、吸光度計を用いて４５０ｎｍと６３０ｎｍの吸光度値を測定した。また、同時にＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を固相していないウェル（非固相ウェル）も用意して、同様に各抗体を添加して測定を行った。その結果、陰性コントロールとして用いたＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に反応しないことが確認されているヒトＩｇＧ抗体を添加したウェルの吸光度値は、抗体を添加していないウェルと同等に低値であったのに対して、ヒト−ウサギキメラ抗体及びヒト化抗体＃０〜＃１０をそれぞれ添加したウェルの吸光度値は同等に高い値を示した。また、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を固相していないウェルに対してヒト−ウサギキメラ抗体及びヒト化抗体＃０〜＃１０は陰性コントロールと同等の吸光度値しか示さなかった。この結果から、ヒト−ウサギキメラ抗体及びヒト化抗体＃０〜＃１０はＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に特異的に反応することが確認された。

【0189】

次に、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に特異的に反応するヒト−ウサギキメラ抗体及びヒト化抗体＃０〜＃１０の各種ヒト癌細胞ならびにマウス癌細胞への反応性を確認した。ＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子の発現が確認されているヒト癌細胞である、乳癌細胞（ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１）、大腸癌細胞（ＨＴ−２９）、肺癌細胞（ＱＧ５６）、胃癌細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７）、子宮癌細胞（ＨＥＣ−１−Ａ）、前立腺癌細胞（２２Ｒｖ１）、膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ１０．５）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）、卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３）、腎癌細胞（Ｃａｋｉ−２）、脳腫瘍細胞（Ｕ−８７ＭＧ）、膀胱癌細胞（Ｔ２４、ＨＴ−１３７６）、食道癌細胞（ＯＥ３３）、白血病細胞（ＯＣＩ−ＡＭＬ５）、リンパ腫細胞（Ｒａｍｏｓ）、胆嚢癌細胞（ＴＧＢＣ１４ＴＫＢ）、線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）、メラノーマ細胞（Ｇ−３６１）、副腎皮質癌細胞（Ａ−６７３）、ユーイング腫瘍細胞（ＲＤ−ＥＳ）、ホジキンリンパ腫細胞（ＲＰＭＩ１６６６）、中皮腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ２４５２）、多発性骨髄腫細胞（ＩＭ−９）、睾丸癌細胞（ＮＴ／Ｄ１）、甲状腺癌細胞（ＴＴ）又は頭頸部癌細胞（ＦａＤｕ）に、精製されたヒト−ウサギキメラ抗体及びヒト化抗体＃０〜＃１０をそれぞれ反応させ、フローサイトメトリー法で蛍光強度を評価した。具体的には、１．５ｍＬ容のミクロ遠心チューブに各癌細胞をそれぞれ５×１０^５個ずつ集め、ヒト−ウサギキメラ抗体及びヒト化抗体＃０〜＃１０を最終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように、それぞれのチューブに添加し、４℃で１時間反応させた。０．５％ ＦＢＳ−ＰＢＳ（−）で２回洗浄して、０．５％ ＦＢＳ−ＰＢＳ（−）で１００倍に希釈したＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加して４℃で６０分間静置した。０．５％ ＦＢＳ−ＰＢＳ（−）で洗浄後、最終濃度が０．２μｇ／ｍＬのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅを含む０．５％ ＦＢＳ−ＰＢＳ（−）に細胞を懸濁して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ^ＴＭあるいはＦＡＣＳＶｅｒｓｅ^ＴＭ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー）で蛍光強度を測定した。一方、陰性コントロールとして、ハイブリドーマ培養用培地を用いて上記と同様の操作を行って調製したものを用いた。その結果、上記評価に用いた全ての癌細胞で、ヒト−ウサギキメラ抗体及びヒト化抗体＃０〜＃１０の蛍光強度は、陰性コントロールを用いた場合の蛍光強度よりも強かった。以上の結果から、ヒト−ウサギキメラ抗体及びヒト化抗体＃０〜＃１０は、ヒト癌細胞膜表面上に発現しているＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に反応することが確認された。

【0190】

実施例５：ヒト−ウサギキメラ抗体ならびにヒト化抗体＃０〜＃１０の各種ヒト癌細胞に対する抗腫瘍活性
次に、実施例２で調製したヒト−ウサギキメラ抗体と、実施例３で調製したヒト化抗体＃０〜＃１０の各種ヒト癌細胞に対する抗腫瘍効果をＡＤＣＣ活性で評価した。

【0191】

ヒト−ウサギキメラ抗体及びヒト化抗体＃０〜＃１０に対する比較抗体として、以下の抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を用いた。

【0192】

ＷＯ２０１０／０１６５２６に記載される抗体であり同文献中の配列番号２６の重鎖可変領域と配列番号２７の軽鎖可変領域を有する比較抗体１、配列番号２８の重鎖可変領域と配列番号２９の軽鎖可変領域を有する比較抗体２、配列番号３０の重鎖可変領域と配列番号３１の軽鎖可変領域を有する比較抗体３、配列番号３２の重鎖可変領域と配列番号３３の軽鎖可変領域を有する比較抗体４、配列番号３４の重鎖可変領域と配列番号３５の軽鎖可変領域を有する比較抗体５、配列番号３６の重鎖可変領域と配列番号３７の軽鎖可変領域を有する比較抗体６、配列番号３８の重鎖可変領域と配列番号３９の軽鎖可変領域を有する比較抗体７、配列番号４０の重鎖可変領域と配列番号４１の軽鎖可変領域を有する比較抗体８、配列番号４２の重鎖可変領域と配列番号４３の軽鎖可変領域を有する比較抗体９、配列番号４４の重鎖可変領域と配列番号４５の軽鎖可変領域を有する比較抗体１０、配列番号４６の重鎖可変領域と配列番号４７の軽鎖可変領域を有する比較抗体１１。

【0193】

ＷＯ２０１１／０９６５１７に記載される抗体であり同文献中の配列番号４３の重鎖可変領域と配列番号４７の軽鎖可変領域を有する比較抗体１２、配列番号４３の重鎖可変領域と配列番号５３の軽鎖可変領域を有する比較抗体１３。

【0194】

ＷＯ２０１１／０９６５２８に記載される抗体であり同文献中の配列番号４３の重鎖可変領域と配列番号４７の軽鎖可変領域を有する比較抗体１４、配列番号５１の重鎖可変領域と配列番号５５の軽鎖可変領域を有する比較抗体１５、配列番号５９の重鎖可変領域と配列番号６３の軽鎖可変領域を有する比較抗体１６、配列番号７６の重鎖可変領域と配列番号８０の軽鎖可変領域を有する比較抗体１７、配列番号８４の重鎖可変領域と配列番号８８の軽鎖可変領域を有する比較抗体１８、配列番号９２の重鎖可変領域と配列番号９６の軽鎖可変領域を有する比較抗体１９。

【0195】

ＷＯ２０１１／０９６５１９に記載される抗体であり同文献中の配列番号４２の重鎖可変領域と配列番号４６の軽鎖可変領域を有する比較抗体２０。

【0196】

ＷＯ２０１１／０９６５３３に記載される抗体であり同文献中の配列番号４３の重鎖可変領域と配列番号５１の軽鎖可変領域を有する比較抗体２１、配列番号４７の重鎖可変領域と配列番号５１の軽鎖可変領域を有する比較抗体２２、配列番号６３の重鎖可変領域と配列番号６７の軽鎖可変領域を有する比較抗体２３。

【0197】

ＷＯ２０１１／０９６５３４に記載される抗体であり同文献中の配列番号４３の重鎖可変領域と配列番号４７の軽鎖可変領域を有する比較抗体２４、配列番号４３の重鎖可変領域と配列番号５１の軽鎖可変領域を有する比較抗体２５、配列番号６３の重鎖可変領域と配列番号６７の軽鎖可変領域を有する比較抗体２６。

【0198】

ＷＯ２０１３／０１８８９４に記載される抗体であり同文献中の配列番号９の重鎖可変領域と配列番号１３の軽鎖可変領域を有する比較抗体２７、配列番号１９の重鎖可変領域と配列番号２３の軽鎖可変領域を有する比較抗体２８、配列番号９の重鎖可変領域と配列番号５３の軽鎖可変領域を有する比較抗体２９、配列番号５８の重鎖可変領域と配列番号６２の軽鎖可変領域を有する比較抗体３０、配列番号６３の重鎖可変領域と配列番号６５の軽鎖可変領域を有する比較抗体３１、配列番号６９の重鎖可変領域と配列番号７３の軽鎖可変領域を有する比較抗体３２、配列番号７７の重鎖可変領域と配列番号８１の軽鎖可変領域を有する比較抗体３３。

【0199】

ＷＯ２０１３／０１８８９２に記載される抗体であり同文献中の配列番号８の重鎖可変領域と配列番号１２の軽鎖可変領域を有する比較抗体３４。

【0200】

ＷＯ２０１３／０１８８９１に記載される抗体であり同文献中の配列番号８の重鎖可変領域と配列番号１２の軽鎖可変領域を有する比較抗体３５。

【0201】

ＷＯ２０１３／０１８８８９に記載される抗体であり同文献中の配列番号８の重鎖可変領域と配列番号１２の軽鎖可変領域を有する比較抗体３６。

【0202】

ＷＯ２０１０／０１８８８３に記載される抗体であり同文献中の配列番号８の重鎖可変領域と配列番号１２の軽鎖可変領域を有する比較抗体３７。

【0203】

ＷＯ２０１３／１２５６３６に記載される抗体であり同文献中の配列番号６の重鎖可変領域と配列番号７の軽鎖可変領域を有する比較抗体３８。

【0204】

ＷＯ２０１３／１２５６５４に記載される抗体であり同文献中の配列番号５２の重鎖可変領域と配列番号５４の軽鎖可変領域を有する比較抗体３９。同文献中の配列番号２１の重鎖可変領域と配列番号２３の軽鎖可変領域を有する比較抗体４０。同文献中の配列番号２５の重鎖可変領域と配列番号２３の軽鎖可変領域を有する比較抗体４１。同文献中の配列番号１６の重鎖可変領域と配列番号１８の軽鎖可変領域を有する比較抗体４２。同文献中の配列番号２９の重鎖可変領域と配列番号３３の軽鎖可変領域を有する比較抗体４３。同文献中の配列番号３９の重鎖可変領域と配列番号４３の軽鎖可変領域を有する比較抗体４４。同文献中の配列番号４９の重鎖可変領域と配列番号４３の軽鎖可変領域を有する比較抗体４５。

【0205】

ＷＯ２０１３／１２５６３０に記載される抗体であり同文献中の配列番号１１の重鎖可変領域と配列番号１５の軽鎖可変領域を有する比較抗体４６。

【0206】

ＷＯ２０１３／１２５６４０に記載される抗体であり同文献中の配列番号１１の重鎖可変領域と配列番号１５の軽鎖可変領域を有する比較抗体４７。同文献中の配列番号２１の重鎖可変領域と配列番号２５の軽鎖可変領域を有する比較抗体４８。

【0207】

なお、比較した上記抗体（比較抗体１〜４８）は、重鎖可変領域のアミノ酸配列を発現させるための遺伝子と、軽鎖可変領域を発現させるための遺伝子とを、それぞれヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域が挿入された哺乳類細胞発現用ベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）とヒトＩｇＧ１の軽鎖定常領域が挿入された哺乳類細胞発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に挿入し、作製した２つの組み換え発現ベクターを常法に従って哺乳類細胞に導入して得たヒトキメラ化もしくはヒト化された抗体をＨｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（−）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを用いた。

【0208】

また、陰性コントロールとして、アイソタイプコントロール抗体を添加したウェル、抗体を添加していないウェル及びＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質には反応するが、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現するヒト癌細胞表面に反応性を示さない抗体を添加したウェルを用意した。各抗体は、最終濃度が５μｇ／ｍＬとなるようにＶ底９６穴プレートに添加した。

【0209】

エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核球細胞から常法を用いて分離したヒトＮＫ細胞を用いた。末梢血単核球細胞分離用の比重分離液Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（シグマアルドリッチ社）を用いてヒト末梢血単核球を分離し、ＦＩＴＣ蛍光色素で標識された抗体（抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２０抗体、抗ヒトＣＤ１９抗体、抗ヒトＣＤ１１ｃ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ファーミンジェン社））で反応させてセルソーター（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー））を用いて、上記抗体で染まらない、ＮＫ細胞を含んだ細胞集団を分離したもの、又はヒトＮＫ細胞分離キット（ミルテニー社製）を用いて分離したものを用いた。上記各抗体を添加したＶ底９６穴プレートにヒトＮＫ細胞を、１穴あたり０．４〜２．０×１０^５個添加したものを準備した。

【0210】

標的細胞は、乳癌細胞（ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１）、大腸癌細胞（ＨＴ−２９）、肺癌細胞（ＱＧ５６）、胃癌細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７）、子宮癌細胞（ＨＥＣ−１−Ａ）、前立腺癌細胞（２２Ｒｖ１）、膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ１０．５）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）、卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３）、腎癌細胞（Ｃａｋｉ−２）、脳腫瘍細胞（Ｕ−８７ＭＧ）、膀胱癌細胞（Ｔ２４、ＨＴ−１３７６）、食道癌細胞（ＯＥ３３）、白血病細胞（ＯＣＩ−ＡＭＬ５）、リンパ腫細胞（Ｒａｍｏｓ）、胆嚢癌細胞（ＴＧＢＣ１４ＴＫＢ）、線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）、メラノーマ細胞（Ｇ−３６１）、副腎皮質癌（Ａ−６７３）、ユーイング腫瘍（ＲＤ−ＥＳ）、ホジキンリンパ腫（ＲＰＭＩ１６６６）、中皮腫（ＮＣＩ−Ｈ２４５２）、多発性骨髄腫（ＩＭ−９）、睾丸癌（ＮＴ／Ｄ１）、甲状腺癌（ＴＴ）又は頭頸部癌（ＦａＤｕ）を用いた。１０^６個の上記ヒト癌細胞株をそれぞれ５０ｍＬ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１（パーキンエルマー社製）を加え３７℃で１時間インキュベートした。その後１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、前記でエフェクター細胞ならびに各抗体を添加した９６穴Ｖ底プレートに、１穴あたり２×１０^３個ずつ添加して、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で４時間反応させた。反応後、障害を受けた癌細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１培養上清を含んだ培養上清を各ウェル５０μＬずつ回収して、ウェル底面に個体シンチレータがコーティングされた、ＬｕｍａＰｌａｔｅ−９６（パーキンエルマー社製）に添加し、乾燥させて、障害を受けた癌細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による癌細胞に対する抗腫瘍効果を算出した。

【0211】

その結果、乳癌細胞（ＢＴ−４７４）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６抗体は５４％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は５０％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は４６％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て２５％以下であり、陰性コントロール群はいずれも１０％以下であった。

【0212】

乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６抗体は５２％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は４５％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は４０％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て２５％以下であり、陰性コントロール群はいずれも６％以下であった。

【0213】

大腸癌細胞（ＨＴ−２９）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は４３％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は４０％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は３５％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て２０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも３％以下であった。

【0214】

肺癌細胞（ＱＧ５６）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は４６％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は４２％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は３８％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て２２％以下であり、陰性コントロール群は、いずれも１０％以下であった。

【0215】

胃癌細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は４５％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３８％以上の活性を示し、抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は３４％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１５％以下であり、陰性コントロール群はいずれも８％以下であった。

【0216】

子宮癌細胞（ＨＥＣ−１−Ａ）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は５２％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は４５％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は４０％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て２０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも５％以下であった。

【0217】

前立腺癌細胞（２２Ｒｖ１）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は４９％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は４５％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は３８％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て２０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも１２％以下であった。

【0218】

膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ１０．５）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は３５％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３０％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は２４％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも２％以下であった。

【0219】

肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は２８％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は２５％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は２１％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１２％以下であり、陰性コントロール群はいずれも５％以下であった。

【0220】

卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は３５％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３１％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は２７％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１５％以下であり、陰性コントロール群はいずれも５％以下であった。

【0221】

腎癌細胞（Ｃａｋｉ−２）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は３７％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３３％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は、２６％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１５％以下であり、陰性コントロール群はいずれも５％以下であった。

【0222】

脳腫瘍細胞（Ｕ−８７ＭＧ）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は３６％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は２９％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は２４％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも６％以下であった。

【0223】

膀胱癌細胞（Ｔ２４）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は３６％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３３％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は３０％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１５％以下であり、陰性コントロール群はいずれも６％以下であった。

【0224】

膀胱癌細胞（ＨＴ−１３７６）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は４５％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は４０％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は２８％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て２０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも７％以下であった。

【0225】

食道癌細胞（ＯＥ３３）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は３５％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３３％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は３０％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１５％以下であり、陰性コントロール群はいずれも６％以下であった。

【0226】

白血病細胞（ＯＣＩ−ＡＭＬ５）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は２０％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は１８％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は１５％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも６％以下であった。

【0227】

リンパ腫細胞（Ｒａｍｏｓ）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は２０％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は１８％以上の活性を示し、抗体＃９、抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は１５％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも６％以下であった。

【0228】

胆嚢癌細胞（ＴＧＢＣ１４ＴＫＢ）に対してヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は３５％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３０％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は２５％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１５％以下であり、陰性コントロール群はいずれも６％以下であった。

【0229】

線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は３０％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は２５％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は２０％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも６％以下であった。

【0230】

メラノーマ（Ｇ−３６１）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は２５％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は２１％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は１５％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て８％以下であり、陰性コントロール群はいずれも６％以下であった。

【0231】

副腎皮質癌細胞（Ａ−６７３）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は５０％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は４６％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は４０％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て２０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも８％以下であった。

【0232】

ユーイング腫瘍細胞（ＲＤ−ＥＳ）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は４８％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は４０％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は３１％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１５％以下であり、陰性コントロール群はいずれも６％以下であった。

【0233】

ホジキンリンパ腫細胞（ＲＰＭＩ１６６６）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は４０％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３６％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は３０％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て２０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも５％以下であった。

【0234】

中皮腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ２４５２）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は３５％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３９％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は３１％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも５％以下であった。

【0235】

多発性骨髄腫細胞（ＩＭ−９）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は３５％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３０％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は２７％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも６％以下であった。

【0236】

睾丸癌細胞（ＮＴ／Ｄ１）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は３７％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３０％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は２５％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１１％以下であり、陰性コントロール群はいずれも５％以下であった。

【0237】

甲状腺癌細胞（ＴＴ）に対してはヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は４２％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は３５％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、ヒト化抗体＃８は３０％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て１５％以下であり、陰性コントロール群はいずれも５％以下であった。

【0238】

頭頸部癌細胞（ＦａＤｕ）に対しては、ヒト化抗体＃７、ヒト化抗体＃１０、ヒト化抗体＃６は５０％以上の抗腫瘍効果を示し、ヒト化抗体＃３、ヒト化抗体＃４、ヒト化抗体＃２、ヒト化抗体＃５は４０％以上の活性を示し、ヒト化抗体＃９、ヒト化抗体＃１、ヒト化抗体＃０、ヒト−ウサギキメラ抗体、抗体＃８は３５％以上の活性を示したのに対して、比較抗体１〜４８は全て２０％以下であり、陰性コントロール群はいずれも８％以下であった。

【0239】

以上の結果から、ヒト化抗体＃０〜＃１０及びヒト−ウサギキメラ抗体は、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、メラノーマ、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌又は頭頸部癌に対して、比較抗体より有意に強い抗腫瘍効果を示すことが明らかになった。

【0240】

また、ヒト化抗体＃０〜＃１０及びヒト−ウサギキメラ抗体は、ＷＯ２０１０／０１６５２６、ＷＯ２０１１／０９６５１７、ＷＯ２０１１／０９６５２８、ＷＯ２０１１／０９６５１９、ＷＯ２０１１／０９６５３３、ＷＯ２０１１／０９６５３４、ＷＯ２０１１／０９６５３５、ＷＯ２０１３／０１８８８６、ＷＯ２０１３／０１８８９４、ＷＯ２０１３／０１８８９２、ＷＯ２０１３／０１８８９１、ＷＯ２０１３／０１８８８９、ＷＯ２０１３／０１８８８３、ＷＯ２０１３／１２５６３６、ＷＯ２０１３／１２５６５４、ＷＯ２０１３／１２５６３０、ＷＯ２０１３／１２５６４０、ＷＯ２０１３／１４７１６９、ＷＯ２０１３／１４７１７６の実施例に記載の全てのＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体よりも、上記記載の乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、メラノーマ、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌又は頭頸部癌に対して有意に強い抗腫瘍活性を示した。

【0241】

なお、抗腫瘍効果は、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体、エフェクター細胞及びクロミウム５１を取り込ませた標的細胞を混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式^＊により算出した癌細胞株に対する細胞障害活性を示した結果である。

【0242】

^＊式：細胞障害活性（％）＝（ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体及びエフェクター細胞を加えた際の標的細胞からのクロミウム５１遊離量−標的細胞からのクロミウム５１自然遊離量）÷（１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量−標的細胞からのクロミウム５１自然遊離量）×１００。

【0243】

実施例６−１：重鎖定常領域中のアミノ酸が置換されたヒト化抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の作製
実施例３で得たヒト化抗体＃０、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０の重鎖定常領域中の一部アミノ酸が置換された配列番号３３に記載の重鎖定常領域を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体（以下改Ｉ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体と記載する）の作製を行った。上記重鎖定常領域と配列番号７で表される重鎖可変領域を有する重鎖アミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、これを常法に従って哺乳類細胞発現用ベクターに挿入した。また、配列番号１１で表される軽鎖可変領域のアミノ酸をコードするＤＮＡをヒトＩｇＧ１の軽鎖定常領域をコードする遺伝子が挿入された哺乳類細胞発現用ベクターに挿入されたものを準備した。作製した２つの組み換え発現ベクターを常法に従って哺乳類細胞に導入してヒト化抗体＃０の改Ｉ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０の培養上清を得た。さらに実施例３に記載のヒト化抗体＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０についても上記と同様の方法で改Ｉ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０を含む培養上清をそれぞれ得た。得られた改Ｉ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各培養上清を常法に従ってＨｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（−）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを調製した。

【0244】

次に実施例３で得たヒト化抗体＃０、＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０の重鎖定常領域中の一部アミノ酸が置換された配列番号３４記載の重鎖定常領域を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体（以下改ＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体と記載する）の作製を行った。上記重鎖定常領域と配列番号７で表される重鎖可変領域を有する重鎖アミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、これを常法に従って哺乳類細胞発現用ベクターに挿入した。また、上記で作製した、配列番号１１で表される軽鎖可変領域のアミノ酸をコードするＤＮＡをヒトＩｇＧ１の軽鎖定常領域をコードする遺伝子が挿入された哺乳類細胞発現用ベクターに挿入したものを準備した。これら２つの組み換え発現ベクターを常法に従って哺乳類細胞に導入して改ＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０の培養上清を得た。さらに実施例３に記載のヒト化抗体＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０についても上記と同様の方法で改ＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０を含む培養上清をそれぞれ得た。得られた改ＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各培養上清を常法に従ってＨｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（−）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを調製した。

【0245】

実施例６−２：重鎖定常領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の作製
次に、実施例３で得たヒト化抗体＃０、＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０の重鎖定常領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体（以下改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体と記載する）を以下の方法にて得た。常法に従ってＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースへと変換する反応を触媒しない酵素であるＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）遺伝子を組み込んだネオマイシン耐性遺伝子を含む哺乳類細胞発現ベクターを遺伝子導入試薬ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて哺乳類細胞株ＣＨＯ細胞に導入した。上記遺伝子を導入したＣＨＯ細胞をＧ−４１８を含んだ培養液で培養してＲＭＤが発現しているＣＨＯ細胞のｓｔａｂｌｅ ｐｏｏｌを作製した。このｓｔａｂｌｅ ｐｏｏｌから限外希釈法によってＲＭＤが恒常的に発現しているＣＨＯ細胞を７個クローニングした。クローニングした７個の各ＲＭＤ−ＣＨＯ細胞でのＲＭＤ遺伝子発現量を定量ＰＣＲ法で１週間おきに３回評価し、ＲＭＤ遺伝子が恒常的に安定発現しているＣＨＯ細胞（ＲＭＤ−ＣＨＯ細胞）を選定した。恒常的にＲＭＤを発現する上記ＲＭＤ−ＣＨＯ細胞へ、実施例３と同様に、配列番号７で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子と、配列番号１１で表される軽鎖可変領域のアミノ酸をコードする遺伝子とを、それぞれヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域が挿入された哺乳類細胞発現用ベクターとヒトＩｇＧ１の軽鎖定常領域が挿入された哺乳類細胞発現用ベクターをそれぞれ常法に従って導入して、改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０を含む培養上清を得た。さらに実施例３に記載のヒト化抗体＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０についても上記と同様の方法で改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０を含む培養上清をそれぞれ得た。得られた改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各培養上清を常法に従ってＨｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（−）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを調製して改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０を含む抗体組成物を得た。同様にして改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１〜＃１０を含む抗体精製物を得た。精製されたこれら抗体組成物中に含まれる重鎖定常領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の割合をＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で評価した結果いずれも８０％以上であった。

【0246】

上記ＲＭＤ−ＣＨＯ細胞へ、実施例３と同様に、配列番号７で表される重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子と、配列番号１１で表される軽鎖可変領域のアミノ酸をコードする遺伝子とを、それぞれヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域が挿入されたハイグロマイシン耐性遺伝子を含む哺乳類細胞発現用ベクターとヒトＩｇＧ１の軽鎖定常領域が挿入されたハイグロマイシン耐性遺伝子を含む哺乳類細胞発現用ベクターをそれぞれ常法に従って導入した上記細胞を、ハイグロマイシンＢを含んだ培養液で培養して、改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０を発現するｓｔａｂｌｅ ｐｏｏｌを作製した。このｓｔａｂｌｅ ｐｏｏｌから限外希釈法で改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０を恒常的に安定発現する細胞を作製した。各細胞が産生する改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む精製された抗体組成物中に含まれる重鎖定常領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の割合をＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で評価した結果いずれも８０％以上であった。

【0247】

実施例６−３：重鎖定常領域中のアミノ酸が置換され、かつ重鎖定常領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の作製
次に、実施例３に記載のヒト化抗体＃０、＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０の重鎖定常領域中の一部アミノ酸が置換された配列番号３４記載の重鎖定常領域を有し、且つ抗体の重鎖定常領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体（以下改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体と記載する）の作製を行った。実施例６−２で作製した恒常的にＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）を発現するＲＭＤ−ＣＨＯ細胞へ、実施例６−１で作製した変異型重鎖定常領域と配列番号７で表されるヒトＩｇＧ１の重鎖可変領域を有する重鎖アミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成しこれを常法に従って挿入した哺乳類細胞発現用ベクターと、配列番号１１で表される軽鎖可変領域のアミノ酸をコードするＤＮＡを合成し、ヒトＩｇＧ１の軽鎖定常領域のアミノ酸をコードする遺伝子が挿入された哺乳類細胞発現用ベクターを導入してヒト化抗体＃０の改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０の培養上清を得た。さらに実施例３に記載のヒト化抗体＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０についても上記と同様の方法で改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０を含む培養上清をそれぞれ得た。得られた改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各培養上清を常法に従ってＨｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（−）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過して改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０を含む抗体組成物を得た。同様にして改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１〜＃１０を含む抗体精製物を得た。精製されたこれら抗体組成物中に含まれる重鎖定常領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の割合をＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で評価した結果いずれも８０％以上であった。

【0248】

実施例６−１で作製した変異型重鎖定常領域と配列番号７で表されるヒトＩｇＧ１の重鎖可変領域を有する重鎖アミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成しこれを常法に従って挿入したハイグロマイシン耐性遺伝子を含む哺乳類細胞発現用ベクターと、配列番号１１で表される軽鎖可変領域のアミノ酸をコードするＤＮＡを合成し、ヒトＩｇＧ１の軽鎖定常領域のアミノ酸をコードする遺伝子が挿入されたハイグロマイシン耐性遺伝子を含む哺乳類細胞発現用ベクターを導入した上記細胞を、ハイグロマイシンＢを含んだ培養液で培養して、改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０を発現するｓｔａｂｌｅ ｐｏｏｌを作製した。このｓｔａｂｌｅ ｐｏｏｌから限外希釈法で改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０を恒常的に安定発現する細胞を作製した。さらに実施例３に記載のヒト化抗体＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０についても上記と同様の方法で改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１、＃２、＃３、＃４、＃５、＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０を恒常的に安定発現する細胞を作製した。各細胞が産生する改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む精製された抗体組成物中に含まれる重鎖定常領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の割合をＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で評価した結果いずれも８０％以上であった。

【0249】

実施例７：改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の抗原特異性と癌細胞への反応性
実施例６−１〜３で調製した改Ｉ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０、改ＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０、改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各抗体組成物及び改抗ＩＶ型ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各抗体組成物（以下改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体と記載する）のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質への特異的反応性を実施例４と同様の方法で確認した。その結果、陰性コントロールとして用いたＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に反応しないことが確認されているヒトＩｇＧ抗体を添加したウェルの吸光度値は、抗体を添加していないウェルと同等に低値であったのに対して、各改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体をそれぞれ添加したウェルの吸光度値は全て同等に高い値を示した。また、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を固相していないウェルに対して全ての改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体は陰性コントロールと同等の吸光度値しか示さなかった。この結果から、全ての改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体はＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に特異的に反応することが確認された。

【0250】

次に、各改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の各種ヒト癌細胞への反応性を実施例４と同様の方法で確認した。乳癌細胞（ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１）、大腸癌細胞（ＨＴ−２９）、肺癌細胞（ＱＧ５６）、胃癌細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７）、子宮癌細胞（ＨＥＣ−１−Ａ）、前立腺癌細胞（２２Ｒｖ１）、膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ１０．５）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）、卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３）、腎癌細胞（Ｃａｋｉ−２）、脳腫瘍細胞（Ｕ−８７ＭＧ）、膀胱癌細胞（Ｔ２４、ＨＴ−１３７６）、食道癌細胞（ＯＥ３３）、白血病細胞（ＯＣＩ−ＡＭＬ５）、リンパ腫細胞（Ｒａｍｏｓ）、胆嚢癌細胞（ＴＧＢＣ１４ＴＫＢ）、線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）、メラノーマ細胞（Ｇ−３６１）、副腎皮質癌細胞（Ａ−６７３）、ユーイング腫瘍細胞（ＲＤ−ＥＳ）、ホジキンリンパ腫細胞（ＲＰＭＩ１６６６）、中皮腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ２４５２）、多発性骨髄腫細胞（ＩＭ−９）、睾丸癌細胞（ＮＴ／Ｄ１）、甲状腺癌細胞（ＴＴ）、頭頸部癌細胞（ＦａＤｕ）を本評価に用いた。その結果、評価に用いた全ての癌細胞で、各改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の蛍光強度は、陰性コントロールを用いた場合の蛍光強度よりも強かった。以上の結果から、全ての改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体は、ヒト癌細胞膜表面上にあるＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に特異的に反応することが確認された。

【0251】

実施例８：改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の各種ヒト癌細胞に対する抗腫瘍活性
実施例６−１〜６−３で調製した改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体（改Ｉ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０、改ＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０、改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各抗体組成物及び改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各抗体組成物）の各種ヒト癌細胞に対する抗腫瘍効果を実施例５と同様にＡＤＣＣ活性でそれぞれ評価した。陰性コントロールとして、アイソタイプコントロール抗体を添加したウェル、抗体を添加していないウェル及びＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質には反応するが、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現するヒト癌細胞表面に反応性を示さない抗体を添加したウェルを用意した。比較抗体として、改変する前の各抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体であるヒト化抗体＃０〜＃１０を用いた。各抗体は、最終濃度が０．０１〜１μｇ／ｍＬとなるようにＶ底９６穴プレートに添加した。

【0252】

標的細胞は、乳癌細胞（ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１）、大腸癌細胞（ＨＴ−２９）、肺癌細胞（ＱＧ５６）、胃癌細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７）、子宮癌細胞（ＨＥＣ−１−Ａ）、前立腺癌細胞（２２Ｒｖ１）、膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ１０．５）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）、卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３）、腎癌細胞（Ｃａｋｉ−２）、脳腫瘍細胞（Ｕ−８７ＭＧ）、膀胱癌細胞（Ｔ２４、ＨＴ−１３７６）、食道癌細胞（ＯＥ３３）、白血病細胞（ＯＣＩ−ＡＭＬ５）、リンパ腫細胞（Ｒａｍｏｓ）、胆嚢癌細胞（ＴＧＢＣ１４ＴＫＢ）、線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）、メラノーマ細胞（Ｇ−３６１）、副腎皮質癌細胞（Ａ−６７３）、ユーイング腫瘍細胞（ＲＤ−ＥＳ）、ホジキンリンパ腫細胞（ＲＰＭＩ１６６６）、中皮腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ２４５２）、多発性骨髄腫細胞（ＩＭ−９）、睾丸癌細胞（ＮＴ／Ｄ１）、甲状腺癌細胞（ＴＴ）、頭頸部癌細胞（ＦａＤｕ）を用いた。１０^６個の上記ヒト癌細胞株をそれぞれ５０ｍＬ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１（パーキンエルマー社製）を加え３７℃で１時間インキュベートした後、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、前記各抗体を添加した９６穴Ｖ底プレートに、１穴あたり２×１０^３個ずつ添加して反応させた。

【0253】

エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核球細胞から常法を用いて分離したヒトＮＫ細胞を用いた。上記各抗体、標的細胞を添加して反応させたＶ底９６穴プレートにヒトＮＫ細胞を、１穴あたり０．４〜２．０×１０^５個添加したものを準備し、３７℃、５％、ＣＯ_２の条件下で４時間反応させた。反応後、障害を受けた癌細胞から放出されるクロミウム５１を含んだ培養上清を各ウェル５０μＬずつ回収して、実施例５と同様の方法で障害を受けた癌細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による癌細胞に対する抗腫瘍効果を算出した。

【0254】

その結果、乳癌細胞（ＢＴ−４７４）に対して、改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体である改Ｉ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０、改ＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０、改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各抗体組成物及び改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各抗体組成物は、それぞれ陰性コントロールに比べて強い抗腫瘍効果を示した。また、比較抗体とした改変する前の抗体（ヒト化抗体＃０〜＃１０）それぞれが示す抗腫瘍効果と同じ抗腫瘍効果を改Ｉ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０、改ＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０ならびに改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各抗体組成物が示す際の抗体濃度は、改変する前の各抗体濃度に比べておよそ１３〜２０分の１の濃度であった。また、改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各抗体組成物が改変する前の抗体と同じ抗腫瘍効果を得る場合には、改変する前の各抗体濃度に比べておよそ１５０分の１の濃度であった。以上の結果から改変型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体（改Ｉ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０、改ＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０、改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０及び改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各抗体組成物）は、改変する前の各抗体に比べて抗腫瘍活性が向上することが判った。また、改ＩＶ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各抗体組成物は、改Ｉ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０、改ＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０及び改ＩＩＩ型抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃０〜＃１０を含む各抗体組成物に比べてより強い抗腫瘍効果が得られることが判った。

【0255】

その他、評価に用いた乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１）、大腸癌細胞（ＨＴ−２９）、肺癌細胞（ＱＧ５６）、胃癌細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７）、子宮癌細胞（ＨＥＣ−１−Ａ）、前立腺癌細胞（２２Ｒｖ１）、膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ１０．５）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）、卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３）、腎癌細胞（Ｃａｋｉ−２）、脳腫瘍細胞（Ｕ−８７ＭＧ）、膀胱癌細胞（Ｔ２４、ＨＴ−１３７６）、食道癌細胞（ＯＥ３３）、白血病細胞（ＯＣＩ−ＡＭＬ５）、リンパ腫細胞（Ｒａｍｏｓ）、胆嚢癌細胞（ＴＧＢＣ１４ＴＫＢ）、線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）、メラノーマ細胞（Ｇ−３６１）、副腎皮質癌細胞（Ａ−６７３）、ユーイング腫瘍細胞（ＲＤ−ＥＳ）、ホジキンリンパ腫細胞（ＲＰＭＩ１６６６）、中皮腫細胞（ＮＣＩ−Ｈ２４５２）、多発性骨髄腫細胞（ＩＭ−９）、睾丸癌細胞（ＮＴ／Ｄ１）、甲状腺癌細胞（ＴＴ）、頭頸部癌細胞（ＦａＤｕ）に対しても同様により強い抗腫瘍効果が得られた。

【産業上の利用可能性】

【0256】

本発明の抗体は、癌の治療及び／又は予防のため有用である。

【0257】

なお、本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]