特許 6448614 コンフォメーション特異的抗体の発生および使用のための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6448614

(24)【登録日】2018年12月14日

(45)【発行日】2019年1月9日

(54)【発明の名称】コンフォメーション特異的抗体の発生および使用のための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20181220BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20181220BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20181220BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20181220BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20181220BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20181220BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20181220BHJP

   G01N 33/577 20060101ALI20181220BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   C07K16/46

   A61P25/00 101

   A61P25/28

   A61P9/10 101

   A61K39/395 N

   G01N33/53 D

   G01N33/577 B

【請求項の数】31

【全頁数】51

(21)【出願番号】特願2016-502309(P2016-502309)

(86)(22)【出願日】2014年3月14日

(65)【公表番号】特表2016-515129(P2016-515129A)

(43)【公表日】2016年5月26日

(86)【国際出願番号】US2014027017

(87)【国際公開番号】WO2014152157

(87)【国際公開日】20140925

【審査請求日】2017年2月23日

(31)【優先権主張番号】61/792,588

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】303036197

【氏名又は名称】ベス イスラエル デアコネス メディカル センター インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(74)【代理人】

【識別番号】100169971

【弁理士】

【氏名又は名称】菊田 尚子

(74)【代理人】

【識別番号】100169579

【弁理士】

【氏名又は名称】村林 望

(72)【発明者】

【氏名】ルー，クン，ピン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ，シャオ，チェン

【審査官】 田名部 拓也

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／１４９３３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／００２８９００（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Nakamura, K. et al.，Cis phosphorylated tau as the earliest detectable pathogenic conformation in Alzheimer disease, offering novel diagnostic and therapeutic strategies，Prion，２０１３年 ３月 １日，Vol. 7，pp. 117-120

【文献】 Nakamura, K. et al.，Proline isomer-specific antibodies reveal the early pathogenic tau conformation in Alzheimer's disease，Cell，２０１２年，Vol. 149，pp. 232-244

【文献】 Nakamura, K. et al.，Prion，２０１３年 ３月 １日，Vol. 7，pp. 117-120

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００ − １９／００

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

それぞれ配列番号１〜３の重鎖相補性決定領域(CDR)1、CDR2及びCDR3配列を含む重鎖可変領域とそれぞれ配列番号４〜６の軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を含む軽鎖可変領域とを含む、単離されたコンフォメーション特異的結合部分であって、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(pT231-tau)のcisコンフォメーションに特異的に結合する、前記結合部分。

【請求項2】

前記重鎖可変領域が配列番号２２の配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域が配列番号２３の配列を含む、請求項１記載の単離された結合部分。

【請求項3】

それぞれ配列番号７〜９の重鎖相補性決定領域(CDR)1、CDR2及びCDR3配列を含む重鎖可変領域とそれぞれ配列番号１０〜１２の軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を含む軽鎖可変領域とを含む、単離されたコンフォメーション特異的結合部分であって、リン酸化トレオニン231-タウタンパク質(pT231-tau)のcisコンフォメーションに特異的に結合する、前記結合部分。

【請求項4】

前記重鎖可変領域が配列番号２４の配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域が配列番号２５の配列を含む、請求項３記載の単離された結合部分。

【請求項5】

前記結合部分が抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１〜４のいずれか１項記載の単離された結合部分。

【請求項6】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントが一本鎖抗体である、請求項５記載の単離された結合部分。

【請求項7】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントがキメラ抗体、ヒト化抗体又はそれらの抗原結合フラグメントである、請求項５又は６記載の単離された結合部分。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項記載の結合部分と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【請求項9】

前記結合部分がモノクローナル抗体である、請求項８記載の医薬組成物。

【請求項10】

必要とされる被験体においてタウオパチー、外傷性脳傷害(TBI)又は脳卒中を治療するための請求項８又は９記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記タウオパチーが、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症(CTE)、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性、リティコ・ボディグ病、縺れ優位認知症、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ピック病、皮質基底核変性症及びアルツハイマー病から成る群より選択される、請求項１０記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記被験体が前記タウオパチーの素因を有するか又は初期段階にある、請求項１０又は１１記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記タウオパチーの素因又は初期段階が、前記被験体から得られたサンプルでcis pT231-tauのレベルの上昇又はcis：trans pT231-tauの比の増加により決定される、請求項１２記載の医薬組成物。

【請求項14】

CSF t-tau、pT181-tau、Aβ42又はApoE4のレベルを決定することをさらに含む、請求項１３記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記サンプルが、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水及び脳脊髄液(CSF)から成る群より選択される、請求項１３記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記被験体が、繰り返された脳外傷の病歴により素因が与えられる、請求項１３記載の医薬組成物。

【請求項17】

請求項１〜７のいずれか１項記載の結合部分を用いて治療された被験体において治療反応をモニターする方法であって、前記被験体から得られたサンプルでcis pT231-tauのレベル又はcis：trans pT231-tauの比を決定することを含み、cis pT231-tauのレベル又はcis：trans pT231-tauの比の減少が、前記結合部分に有効な治療反応をもたらす、前記方法。

【請求項18】

CSF t-tau、pT181-tau、Aβ42又はApoE4のレベルを決定することをさらに含む、請求項１７記載の方法。

【請求項19】

CSF t-tau、pT181-tau、Aβ42又はApoE4の前記レベルが減少する、請求項１８記載の方法。

【請求項20】

前記サンプルが、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水及び脳脊髄液(CSF)から成る群より選択される、請求項１７記載の方法。

【請求項21】

タウオパチーを有する又はその素因を有するとしての被験体の診断を補助するためのキットの製造における請求項１〜７のいずれか１項記載の結合部分の使用であって、前記診断を補助することが、
a．前記被験体から得られたサンプルでcis pT231-tauのレベル又はcis：trans pT231-tauの比を決定することと、
b．前記サンプルのcis pT231-tauの前記レベル又はcis：trans pT231-tauの比を正常参照サンプルと比較することであって、前記正常参照サンプルと比較して、cis pT231-tauのレベルの上昇又はcis：trans pT231-tauの比の増加が、前記タウオパチーを有する又はその素因を有するとしての前記被験体の診断において補助する、比較することと、
を含む、前記使用。

【請求項22】

前記キットが、前記タウオパチーを有する又はその素因を有するとして同定された被験体に請求項１〜７のいずれか１項記載の結合部分を投与するための説明書をさらに含む、請求項２１記載の使用。

【請求項23】

前記サンプルが、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水及び脳脊髄液(CSF)から成る群より選択される、請求項２１記載の使用。

【請求項24】

それぞれ配列番号１３〜１５の重鎖相補性決定領域(CDR)1、CDR2及びCDR3配列を含む重鎖可変領域とそれぞれ配列番号１６〜１８の軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を含む軽鎖可変領域とを含む、単離されたコンフォメーション特異的結合部分であって、pT231-tauのtransコンフォメーションに特異的に結合する、前記結合部分。

【請求項25】

前記重鎖可変領域が配列番号２６の配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域が配列番号２７の配列を含む、請求項２４記載の単離された結合部分。

【請求項26】

前記結合部分が抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項２４又は２５記載の単離された結合部分。

【請求項27】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項２６記載の単離された結合部分。

【請求項28】

前記抗体又はその抗原結合フラグメントが一本鎖抗体又は抗体フラグメントである、請求項２６又は２７記載の単離された結合部分。

【請求項29】

請求項２４〜２８のいずれか１項記載の結合部分と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【請求項30】

前記結合部分がモノクローナル抗体である、請求項２９記載の医薬組成物。

【請求項31】

a．pT231-tauのcisコンフォメーションに特異的に結合する、請求項１〜７のいずれか１項記載の結合部分と、
b．pT231-tauのtransコンフォメーションに特異的に結合する、請求項２４〜２８のいずれか１項記載の結合部分と、
c．タウオパチーを有する又はその素因を有するとして被験体を診断するためのa．の結合部分及びb．の結合部分を使用するための説明書と、
を含む、タウオパチーを有する又はその素因を有するとして被験体を診断するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９２，５８８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の出願日に基づく特典を主張する。

【0002】

連邦政府委託研究に関する陳述
本発明は、助成金番号：Ｒ０１ＡＧ０３９４０５、Ｒ０１ＣＡ１６７６７７、およびＲ０１ＣＡ１２２４３４に基づいて政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に関する一定の権利を有する。

【0003】

一般的には、本発明は、コンフォメーション特異的抗体またはそのフラグメントの発生および使用のための方法および組成物に関する。

【背景技術】

【0004】

タンパク質のリン酸化は、タンパク質のコンフォメーションの変化を誘導する主要な細胞シグナリング機序である。たとえば、プロリン残基の直前にある特異的なセリン残基またはトレオニン残基（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフ）のリン酸化は、細胞内の中心的なレギュレート機序である。プロリン残基の独自の立体化学は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフのペプチジルプロリル結合が２つの異なるコンフォメーション状態（すなわち、ｃｉｓコンフォメーションまたはｔｒａｎｓコンフォメーション）をとりうることを意味する。ペプチジルプロリルｃｉｓ／ｔｒａｎｓイソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフのｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化を特異的に触媒することにより、これらのタンパク質の構造を２つの識別可能なコンフォメーション間でレギュレートする。

【0005】

Ｐｉｎ１は、特定のリン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（ｐＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）モチーフのｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化を特異的に触媒するＰＰＩアーゼである。リン酸化特異的ＰＰＩアーゼとしてＰｉｎ１が同定されたことにより、新しいシグナリング機序が理解されることとなった。この機序によれば、Ｐｉｎ１は、リン酸化後のその基質のコンフォメーションを触媒的にレギュレートして、タンパク質の機能をさらに制御する。さらに、Ｐｉｎ１は、複数の機序により厳重にレギュレートされ、Ｐｉｎ１のデレギュレーションは、いくつかのヒト疾患で中心的な役割を果たす。

【0006】

アルツハイマー病（ＡＤ）の有病率は、２０５０年までに世界的に４倍になるおそれがあるが、現在のところ、有効な治療は存在しない。脳内におけるＡＤの特徴的な病変は、Ａβペプチドで構成された老人斑およびリン酸化ｔａｕ（ｐ−ｔａｕ）の神経原線維の縺れである。ｔａｕ関連病態（タウオパチー）は、ＡＤにおいてニューロンおよび記憶の進行性喪失と良好に相関し、Ａβ病態を伴わない多くの他のタウオパチーの決定的な特徴でもある。Ａβペプチドに対する能動免疫および受動免疫は、臨床試験に達したが、ｐ−ｔａｕに対する免疫療法は、かなり遅れをとってきた。縺れのあるｐ−ｔａｕエピトープに対する能動免疫または受動免疫が、マウスモデルにおいてｔａｕ凝集体の低減および記憶欠損の改善をもたらし、タウオパチーが、ニューロンからニューロンに疾患を広げる可能性があるという最近の知見から、ｐ−ｔａｕ免疫療法は、ＡＤを治療する有望な新しい方法であることが示唆される。しかしながら、縺れが形成されるかなり前にニューロンの機能不全が起こるので、主要な課題は、ＡＤにおいてタウオパチーおよび記憶喪失をもたらす初期病原性イベントのみを標的とする免疫療法を開発することである。

【0007】

ＡＤのタウオパチーのごく初期のイベントは、とくにＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフ上のｔａｕ過剰リン酸化であり、これは、微小管破壊および神経毒性を引き起こす。ｔａｕのリン酸化Ｔｈｒ２３１−Ｐｒｏモチーフ（ｐＴ２３１−ｔａｕ）は、２つの識別可能なｃｉｓおよびｔｒａｎｓコンフォメーションで存在し、プロリルイソメラーゼＰｉｎ１は、それらの変換を加速してタウオパチーを阻害することが見いだされてきた。Ｐｉｎ１ヌルマウスは、年齢依存性タウオパチーを呈したが、Ｐｉｎ１過剰発現は、ＡＤのマウスモデルにおいてタウオパチーを阻害する。ヒトＭＣＩおよびＡＤニューロンにおいて、Ｐｉｎ１は、複数の機序により阻害されるが、そのダウンレギュレーションを防止するＰｉｎ１ ＳＮＰは、遅延ＡＤ発症に関連する。１９ｐ１３．２に位置するヒトＰｉｎ１は、遅発ＡＤに関連すること、ｐＴ２３１−ｔａｕは、縺れる前のニューロン中の連続ｐ−ｔａｕエピトープの開始位置に存在すること、しかもＣＳＦ ｐＴ２３１−ｔａｕは、記憶喪失と相関し、ＭＣＩからＡＤへの移行を設定し、かつＡＤと前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）とを識別する、初期バイオマーカーであることもまた、見いだされてきた。したがって、ｐＴ２３１−ｔａｕは、ＡＤにおいてごく初期の疾患開始イベントである。

【0008】

戦争から戻った退役軍人は、脳震盪を複数回受けたアスリートですでに報告された神経変性疾患と同一の明瞭な外傷性脳傷害（ＴＢＩ）の特徴を経験する。これらの人々のＴＢＩは、既知の治療が存在しない重篤な神経変性障害である慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）の発生の引き金となりうると思われる。ＣＴＥの神経病理学的な特徴は、アルツハイマー病（ＡＤ）および他のタウオパチーに見られる特徴的な病変と同様に、神経原線維の縺れ（タウオパチー）として過剰リン酸化ｔａｕ（ｐ−ｔａｕ）が広範にわたり異常に蓄積することである。したがって、ｐ−ｔａｕに対する免疫療法は、タウオパチーを治療するための新しい選択肢であることが明らかにされつつある。より特定的には、タウオパチーをもたらす初期の縺れる前の病原性ｔａｕ修飾を標的として、ｐ−ｔａｕのｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションに特異的に結合するコンフォメーション特異的抗体の必要性が、当技術分野に存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、単離されたコンフォメーション特異的結合部分、任意選択で、抗体またはモノクローナル抗体を特徴とし、結合部分は、配列番号１〜３を有する１つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号４〜６を有する１つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む。一実施形態では、単離された結合部分は、配列番号１〜３を有する２つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号４〜６を有する２つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む。第２の実施形態では、単離された結合部分は、配列番号１〜３を有する重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号４〜６を有する軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む。第３の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号２２の重鎖タンパク質配列と、配列番号２３の軽鎖タンパク質配列と、を含む。

【0010】

本発明はまた、単離されたコンフォメーション特異的結合部分、任意選択で、抗体またはモノクローナル抗体を特徴とし、結合部分は、配列番号７〜９を有する１つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１０〜１２を有する１つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む。一実施形態では、単離された結合部分は、配列番号７〜９を有する２つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１０〜１２を有する２つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む。第２の実施形態では、単離された結合部分は、配列番号７〜９を有する重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１０〜１２を有する軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む。第３の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号２４の重鎖タンパク質配列と、配列番号２５の軽鎖タンパク質配列と、を含む。

【0011】

本発明の一態様では、以上に記載の単離された結合部分は、リン酸化トレオニン２３１−タウタンパク質（ｐＴ２３１−ｔａｕ）のｃｉｓコンフォメーションに特異的に結合する。本発明の他の態様では、以上に記載の単離されたモノクローナル抗体は、一本鎖抗体またはその抗体フラグメントである。さらに他の態様では、単離されたモノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。本発明のすべての態様において、単離された結合部分は、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物の形態に製剤化される。

【0012】

他の態様では、本発明はまた、タウオパチー、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、または脳卒中を治療する方法を特徴とし、本方法は、必要とされる被験体に、タウオパチー、ＴＢＩ、または脳卒中を治療するのに十分な量で、以上に記載の結合部分を投与することを含み、モノクローナル抗体は、ｐＴ２３１−ｔａｕのｃｉｓコンフォメーションに特異的に結合する。

【0013】

本発明はさらに、本明細書に記載の結合部分を用いて治療された被験体において治療反応をモニターする方法を特徴とし、本方法は、ａ．）被験体から得られたサンプルでｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕのレベルまたはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比を決定することと、任意選択で、ｂ．）ＣＳＦ ｔ−ｔａｕ、ｐＴ１８１−ｔａｕ、Ａβ４２、またはＡｐｏＥ４のレベルを決定することであって、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕのレベルもしくはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比の減少が結合部分に有効な治療反応をもたらす、および／またはＣＳＦ ｔ−ｔａｕ、ｐＴ１８１−ｔａｕ、Ａβ４２、もしくはＡｐｏＥ４のレベルが減少する、決定することと、を含む。

【0014】

本発明はまた、タウオパチーを有するまたはその素因を有すると被験体を診断する方法を特徴とし、本方法は、ａ．）被験体から得られたサンプルでｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕのレベルまたはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比を決定することと、ｂ．）サンプル中のｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕのレベルまたはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比を正常な参照サンプルと比較することであって、正常な参照サンプルと比較して、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕのレベルの上昇またはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比の増加が、タウオパチーを有するまたはその素因を有すると被験体を診断することにつながって、本発明に係る結合部分が被験体に投与され、結合部分が、タウオパチーを治療するのに十分な量でｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕに特異的に結合する、比較することと、を含む。

【0015】

本発明のすべての態様において、タウオパチーは、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性、リティコ・ボディグ病、縺れ優位認知症、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ピック病、皮質基底核変性症、およびアルツハイマー病からなる群から選択される。特定の態様では、被験体は、タウオパチーの素因を有するかまたはタウオパチーの初期段階にあり、タウオパチーの素因または初期段階は、被験体から得られたサンプルでｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕのレベルの上昇またはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比の増加により決定される。他の態様では、タウオパチーの素因または初期段階はまた、ＣＳＦ ｔ−ｔａｕ、ｐＴ１８１−ｔａｕ、Ａβ４２、またはＡｐｏＥ４のレベルにより決定される。さらに他の態様では、被験体は、繰り返された脳外傷の病歴により素因が与えられる。本発明のすべての態様において、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水、および脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群から選択される。

【0016】

本発明はさらに、単離されたコンフォメーション特異的結合部分、任意選択で、抗体またはモノクローナル抗体を特徴とし、結合部分は、配列番号１３〜１５を有する１つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１６〜１８を有する１つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む。一実施形態では、単離された結合部分は、配列番号１３〜１５を有する２つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１６〜１８を有する２つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む。第２の実施形態では、単離された結合部分は、配列番号１３〜１５を有する重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１６〜１８を有する軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む。第３の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号２６の重鎖タンパク質配列と、配列番号２７の軽鎖タンパク質配列と、を含む。

【0017】

本発明はまた、単離されたコンフォメーション特異的結合部分、任意選択で、抗体またはモノクローナル抗体を特徴とし、結合部分は、配列番号１９〜２１を有する１つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体を含む。一実施形態では、単離された結合部分は、配列番号１９〜２１を有する２つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体を含む。第２の実施形態では、単離された結合部分は、配列番号１９〜２１を有する軽鎖可変領域またはその変異体を含む。第３の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号２８の軽鎖タンパク質配列を含む。

【0018】

本発明の特定の態様では、以上に記載の単離された結合部分は、ｐＴ２３１−ｔａｕのｔｒａｎｓコンフォメーションに特異的に結合する。他の態様では、単離されたモノクローナル抗体は、一本鎖抗体またはその抗体フラグメントである。さらに他の態様では、単離されたモノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。他の態様では、以上に記載の結合部分は、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物として製剤化される。

【0019】

最後に、本発明はまた、ｐＴ２３１−ｔａｕのｃｉｓコンフォメーションに特異的に結合する本明細書に記載の結合部分と、ｐＴ２３１−ｔａｕのｔｒａｎｓコンフォメーションに特異的に結合する本明細書に記載の結合部分と、タウオパチーを有するまたはその素因を有すると被験体を診断するための結合部分の使用に関する説明書と、を含む、タウオパチーを有するまたはその素因を有すると被験体を診断のためのキットを特徴とする。

【0020】

「アジュバント」とは、免疫系の刺激を引き起こす１種以上の物質を意味する。これとの関連では、アジュバントは、１種以上のワクチン抗原または抗体に対する免疫反応を増強するために使用される。アジュバントは、ワクチンの投与前に、ワクチンとの組合せで、またはワクチンの投与後に、被験体に投与されうる。アジュバントとして使用される化学化合物は例としては、アルミニウム化合物、油、ブロックポリマー、免疫刺激性複合体、ビタミンおよびミネラル（たとえば、ビタミンＥ、ビタミンＡ、セレン、およびビタミンＢ１２）、キルＡ（サポニン）、細菌および菌類の細胞壁成分（たとえば、リポ多糖、リポタンパク質、および糖タンパク質）、ホルモン、サイトカイン、ならびに共刺激因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0021】

「十分な量」とは、障害（たとえば、タウオパチー、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、脳卒中、または他の神経障害）に罹患している被験体に投与した時、障害に関連する症状の定性的または定量的な低減を引き起こすのに十分な量を意味する。

【0022】

「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、多重特異的抗体、および抗体フラグメントを意味する。抗体は、たとえば、コンフォメーション特異的抗体（たとえば、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフ（ここで、Ｘａａは、アミノ酸である）のｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションに結合する抗体）でありうる。抗体は、抗原に特異的に結合する。抗体はまた、非免疫グロブリン結合ポリペプチドでありうる。

【0023】

「抗原」とは、抗体が選択的に結合可能な分子を意味する。標的抗原は、タンパク質（たとえば、抗原ペプチド）、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するもしくは合成の化合物でありうる。標的抗原は、ポリペプチド（たとえば、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフ（たとえば、リン酸化もしくは非リン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフ）を含有するポリペプチド）またはペプチド模倣体（たとえば、Ｘａａ−ホモプロリンモチーフ（たとえば、リン酸化もしくは非リン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ホモプロリンモチーフ）を含有するポリペプチド）でありうる。抗原はまた、動物において免疫反応を発生するために動物に投与されうる。

【0024】

「結合親和性」とは、分子（たとえば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（たとえば、抗原または抗原ペプチド）と間の全非共有結合相互作用の強度を意味する。とくに指定がないかぎり、本明細書で用いられる場合、「結合親和性」とは、結合対（たとえば、抗体と抗原）のメンバー間の特異的相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。分子ＸとそのパートナーＹとの親和性は、一般的には、解離定数（Ｋｄ）により表現可能である。親和性は、本明細書に記載のものを含めて、当技術分野で公知の標準的方法により測定可能である。低親和性複合体は、一般的には抗原から容易に解離する傾向のある抗体を含有し、高親和性複合体は、一般的にはより長い持続時間にわたり抗原への結合を維持す傾向のある抗体を含有する。

【0025】

「結合部分」とは、抗体（たとえば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体）、ヒト抗体、抗体フラグメント、レセプター、リガンド、非免疫グロブリン結合ポリペプチド、あるいは標的分子（たとえば、ポリペプチド、タンパク質（たとえば、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕもしくはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ）、もしくはそれらを含むコンジュゲート）にまたは標的分子（たとえば、細胞表面抗原、たとえば、レセプターもしくはリガンド）を担持する細胞もしくは組織に特異的に結合する作用剤の小分子部分を意味する。

【0026】

「生物学的サンプル」または「サンプル」とは、固体および流体のサンプルを意味する。生物学的サンプルとしては、細胞、細胞のタンパク質もしくは膜抽出物、血液、またはたとえば腹水もしくは脳液（たとえば脳脊髄液（ＣＳＦ））をはじめとする生物学的流体が挙げられる。固体の生物学的サンプルの例としては、糞便、直腸、中枢神経系、骨、乳房組織、腎臓組織、子宮頸部、子宮内膜、頭部または頸部、胆嚢、耳下腺組織、前立腺、脳、下垂体、腎臓組織、筋肉、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、脾臓、膵臓、甲状腺組織、心臓組織、肺組織、膀胱、脂肪組織、リンパ節組織、子宮、卵巣組織、副腎組織、精巣組織、扁桃、および胸腺から採取されたサンプルが挙げられる。生物学的流体サンプルの例としては、血液、血清、ＣＳＦ、精液、前立腺液、精漿、尿、唾液、痰、粘液、骨髄、リンパ液、および涙から採取されたサンプルが挙げられる。サンプルは、たとえば、静脈穿刺および外科生検を含めて、標準的方法により取得されうる。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、針生検により取得された、乳房、肺、結腸、または前立腺の組織サンプルである。

【0027】

「コンフォメーション特異的抗体」とは、その相補的抗原の特定のコンフォメーション（たとえば、コンフォメーション異性体またはコンフォーマー）を認識してそれに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである。たとえば、本明細書に記載されるように、コンフォメーション特異的抗体は、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのｃｉｓコンフォメーション（たとえば、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ）には特異的に結合しうるが、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのｔｒａｎｓコンフォメーション（たとえば、ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ）には特異的に結合しないであろう。ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸残基（たとえば、セリンまたはトレオニン）である。この場合、コンフォメーション特異的抗体は、たとえば、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのｔｒａｎｓコンフォメーションよりもｃｉｓコンフォメーションに対して少なくとも１０〜１００倍の親和性を有するであろう。反対に、コンフォメーション特異的抗体は、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのｔｒａｎｓコンフォメーションには特異的に結合しうるが、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのｃｉｓコンフォメーションには特異的に結合しないであろう。ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸残基（たとえば、セリンまたはトレオニン）である。特定の実施形態では、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフは、リン酸化されうる（すなわち、ｐＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）。

【0028】

「障害」とは、本明細書に記載の本発明に係る方法に従って治療、阻害、診断、またはスクリーニングが可能な病態を意味する。

【0029】

「フラグメント」とは、核酸またはポリペプチドの全長の少なくとも、たとえば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上を含有する、核酸またはポリペプチド（たとえば抗体）の一部を意味する。核酸フラグメントは、たとえば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、４５００、もしくは５０００ヌクレオチド、またはそれ以上、核酸の全長までのヌクレオチドを含有しうる。ポリペプチドフラグメントは、たとえば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは５００アミノ酸、またはそれ以上、ポリペプチドの全長までのアミノ酸を含有しうる。本発明に係る治療方法に有用なフラグメントとしては、たとえば、生物学的活性を維持するコンフォメーション特異的抗体のフラグメント（たとえば、特異的コンフォメーション状態に結合するフラグメント）が挙げられる。フラグメントは、本明細書に記載されるようにおよび当技術分野で公知のように修飾可能である。

【0030】

「ヒト化抗体」とは、所定の抗原に結合可能な免疫グロブリンアミノ酸配列変異体またはそのフラグメントを意味する。抗体は、軽鎖とさらには重鎖の少なくとも可変ドメインとの両方を含有しうる。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４の領域を含みうる。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域（ＦＲ）と、非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、を含む。

【0031】

一般的には、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含みうる（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、またはＦｖ）。この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含みうる。「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とは、免疫グロブリンの各軽鎖内および各重鎖内の可変領域の３つの超可変配列を意味する。「フレームワーク領域」とは、免疫グロブリン内軽鎖および重鎖の３つの超可変配列の両側に位置するアミノ酸の配列を意味する。たとえば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）、ならびに米国特許第４，８１６，５６７号明細書および同第５，５３０，１０１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0032】

本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を意味する（すなわち、集団を構成する個別の抗体は、副次量で存在する可能性のある天然に存在する突然変異以外は同一である）。モノクローナル抗体は、きわめて特異的であり、単一の抗原部位を対象とする。さらに、典型的には異なる決定基（たとえばエピトープ）を対象とする異なる抗体を含む従来の（たとえばポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られた抗体の特性を意味し、いかなる特定の方法による抗体の産生も必要とみなすべきではない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（たとえば、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５を参照されたい）により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されうるか、または組換えＤＮＡ法（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）により作製されうる。たとえば、モノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８，１９９１）およびＭａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，１９９１）に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されうる。

【0033】

「神経障害」とは、発生異常、障害、傷害、または毒素から生じる神経系の構造または機能の擾乱を意味する。例示的な神経障害としては、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認識障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋ジストロフィー、皮質基底核変性症、拳闘家認知症、ダウン症候群、前頭側頭型認知症、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病、ピック病、プリオン病、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、痙攣性疾患（たとえば、癲癇）、血管性認知症、加齢性認知症、頭部外傷、脳卒中、神経繊維腫症、レビー小体病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、末梢神経症、および黄斑変性が挙げられる。

【0034】

「薬学的に許容可能な担体」とは、治療される被験体に生理学的に許容可能であると同時に、一緒に投与される組成物（たとえば、コンフォメーション特異的抗体）の治療性を維持する担体を意味する。例示的な薬学的に許容可能な担体物質の１つは、生理食塩水である。他の生理学的に許容可能な担体およびそれらの製剤は、当業者に公知であり、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）に記載されている。

【0035】

「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ポリペプチドフラグメント」、または「ペプチド」とは、翻訳後修飾（たとえば、グリコシル化またはリン酸化）があるか、天然に存在するポリペプチドもしくはペプチドの全部もしくは一部を構成するか、または天然に存在しないポリペプチドもしくはペプチドを構成するか、にかかわらず、３個以上のアミノ酸残基の任意の鎖を意味する。ポリペプチドまたはペプチドは、物理的、機械的、または化学的な方法を利用して、細胞成分からポリペプチドを取り出した場合、「単離された」または「実質的に純粋」と言われる。「単離されたポリペプチド」（たとえば、単離された抗体）、「実質的に純粋なポリペプチド」、または「実質的に純粋な単離されたポリペプチド」は、典型的には、少なくとも６０重量％が、天然で会合している、タンパク質および天然に存在する有機分子でない場合、細胞成分から取り出されて実質的に純粋であるとみなされる。ポリペプチドは、重量基準で、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の純度でありうる。実質的に純粋なポリペプチド（たとえば、実質的に純粋な抗体またはそのフラグメント）は、標準的技術により、たとえば、天然源（たとえば、細胞系または生物学的流体）からの抽出により、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、またはポリペプチドの化学合成により、取得されうる。純度は、任意の適切な方法により、たとえば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析により、測定可能である。他の選択肢として、ポリペプチドは、ヒトが介入することにより改変された場合、天然の部位ではない位置に配置された場合、または１種以上の細胞内に導入された場合、単離されたとみなされる。

【0036】

本発明に係るペプチドおよびポリペプチドは、以上に定義されたように、すべての「模倣体」および「ペプチド模倣体」の形態を含む。「模倣体」および「ペプチド模倣体」という用語は、本発明に係るペプチド（たとえば抗原ペプチド）またはポリペプチドと実質的に同一の構造特性および／または機能特性を有する合成化学化合物を意味する。模倣体は、全体がアミノ酸の合成非天然アナログで構成されうるか、または天然アミノ酸とアミノ酸の非天然アナログとのキメラ分子でありうる。模倣体はまた、置換により模倣体の構造や活性が実質的に改変されないかぎり、任意の量の保存的置換を取り込みうる。

【0037】

「減少」とは、２０％以上、５０％以上、または７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の全低減を引き起こす能力を意味する。治療用途では、「減少」とは、障害（たとえば、タウオパチー、ＴＢＩ、または脳卒中）に関連するポリペプチドまたはタンパク質のレベルの低減を意味しうる。診断用途またはモニタリング用途では、「減少」とは、診断アッセイまたはモニタリングアッセイにより検出されたタンパク質または核酸のレベルの減少を意味しうる。

【0038】

「上昇または増加」とは、正常サンプルまたは参照サンプルの対照と比較して、遺伝子発現またはタンパク質発現の増加を意味する（たとえば、対照または正常参照サンプルと比較して、少なくとも２倍、たとえば、約２倍〜約１５０倍、たとえば、５倍〜１５０倍、５倍〜１００倍、１０倍〜１５０倍、１０倍〜１００倍、５０倍〜１５０倍、５０倍〜１００倍、７５倍〜１５０倍、または７５倍〜１００倍に増加）。遺伝子発現またはタンパク質発現の増加または減少は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の有用な方法を用いて決定可能である（たとえば、ＰＣＲ、ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡにより決定される）。

【0039】

「参照」とは、比較目的に使用される任意のサンプル、標準、またはレベルを意味する。「正常参照サンプル」は、障害（たとえば、タウオパチー、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、脳卒中、または他の神経障害）の発生前に同一の被験体から採取された先行サンプル、障害を有してない被験体、障害の治療を受けて好結果が得られた被験体からのサンプル、または既知の正常濃度の精製参照ポリペプチドのサンプルでありうる。「参照の標準またはレベル」とは、参照サンプルから得られた値または数を意味する。正常参照の標準またはレベルは、次の基準：年齢、体重、疾患の病期、および全身の健康状態の少なくとも１つが被験体のサンプルに一致した正常被験体から得られた値または数でありうる。一例では、たとえば、障害の指標となるポリペプチドまたは障害の指標となるポリペプチドのコンフォメーションの正常参照レベルは、血清サンプル中５ｎｇ／ｍｌ未満、血清サンプル中４ｎｇ／ｍｌ未満、３ｎｇ／ｍｌ未満、２ｎｇ／ｍｌ未満、または１ｎｇ／ｍｌ未満である。「陽性参照」のサンプル、標準、または値は、次の基準：年齢、体重、疾患の病期、および全身の健康状態の少なくともの１つが被験体のサンプルに一致した、障害（たとえば、タウオパチー、ＴＢＩ、脳卒中、または他の神経障害）を有することが知られている被験体から得られたサンプル、標準、値、または数である。たとえば、障害の指標となるポリペプチドなどの陽性参照値は、５ｎｇ／ｍｌ血清超、１０ｎｇ／ｍｌ血清超、２０ｎｇ／ｍｌ超、３０ｎｇ／ｍｌ超、４０ｎｇ／ｍｌ超、または５０ｎｇ／ｍｌ血清超である。

【0040】

「特異的に結合する」とは、もう１つの分子（たとえば抗原）を認識しそれに結合するが、そのほかの分子を実質的に認識せずそれに結合しない分子（たとえば抗体）を意味する。一例では、ｐＴ２３１−ｔａｕのｃｉｓコンフォメーションに特異的に結合する抗体は、ｐＴ２３１−ｔａｕのｔｒａｎｓコンフォメーションには特異的に結合しない。特定の分子（たとえば、ポリペプチド、ポリペプチド上のエピトープ、またはポリペプチドのコンフォメーション）「への特異的結合」、「に特異的に結合する」、または「に特異的な」という用語は、本明細書で用いられる場合、たとえば、結合の対象となる分子に対して少なくとも約１０^−４Ｍ、１０^−５Ｍ、１０^−６Ｍ、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０^−１１Ｍ、１０^−１２Ｍ、またはそれ以上のＫ_ｄを有する分子により呈示されうる。

【0041】

「特異的に結合する」という用語はまた、分子（たとえば抗体）が、特定のポリペプチド（たとえば、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフを含有するポリペプチド（ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸残基（たとえば、セリンまたはトレオニン）である））、特定のポリペプチド上のエピトープ、または特定のポリペプチドのコンフォメーション（たとえば、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのｃｉｓコンフォメーション、たとえば、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ）に結合するが、いかなる他のポリペプチド、ポリペプチドエピトープ、またはポリペプチドコンフォメーション（たとえば、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのｔｒａｎｓコンフォメーション、たとえば、ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ）にも実質的に結合しない、結合をも意味する。たとえば、コンフォメーション特異的抗体は、たとえば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフの一方のコンフォメーション（たとえば、ｃｉｓコンフォメーション）に対する親和性が、他方のコンフォメーション（たとえば、ｔｒａｎｓコンフォメーション）に対する親和性の、たとえば、少なくとも１０〜１００倍の親和性（たとえば、１０^１倍、１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍、１０^７倍、１０^８倍、１０^９倍、または１０^１０倍の親和性）を有しうる。

【0042】

「被験体」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、たとえば、ウシ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ヒツジ科動物、またはネコ科動物を含む哺乳動物を意味するが、これらに限定されるものではない。

【0043】

「治療する」とは、治療目的で医薬組成物を投与することまたは被験体の病態を改善するためにすでに障害に罹患している被験体に治療を施すことを意味する。「タウオパチー、ＴＢＩ、または脳卒中を治療する」とは、タウオパチー、ＴＢＩ、または脳卒中に関連する症状が、たとえば、緩和されるか、低減されるか、治癒されるか、または寛解状態になることを意味する。

【0044】

「変異体ＣＤＲ」とは、ＣＤＲが単一アミノ酸位置で変化されうるか（たとえば、１、２、３、４、５個、もしくはそれ以上のアミノ酸置換）または重鎖および軽鎖の異なるＣＤＲで組み合わされうる（たとえば、重鎖のＣＤＲ１および３と軽鎖のＣＤＲ１および２との組合せ）ことを意味する。そのような変異体は、本明細書に記載の置換（例示的な置換または好ましい置換のいずれか）を有しうる。変異体ＣＤＲは、好ましくは、本明細書に記載の提示された抗体間で保存された残基を保持すると同時に、抗体間で変化することが示された残基に変化を有するであろう。変異体ＣＤＲを含有する結合部分は、本明細書に記載のｐ−Ｔａｕエピトープのｃｉｓ（またはｔｒａｎｓ）コンフォメーションに特異的に結合する能力を維持するであろう。

【0045】

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞モデル、ｅｘ ｖｉｖｏ、およびマウスモデルにおいて、Ｐｉｎ１を操作してＡＤに関連するＳＮＰを分析することにより示されるように、ｐＴ２３１−ｔａｕのＰｉｎ１触媒ｃｉｓ→ｔｒａｎｓ異性化が、アルツハイマー病（ＡＤ）においてタウオパチーを防ぐことを示すチャートである。

【図2】ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ特異的抗体の発生により、ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕが、正常ｔａｕ機能を喪失させて、毒性機能を取得すること、および軽度認識障害（ＭＣＩ）およびＡＤにおいてタウオパチーおよび記憶喪失をもたらす初期病原性コンフォメーションであることが明らかにされることを示すチャートである。Ｐｉｎ１は、非病理学的ｔｒａｎｓに変換することにより、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの蓄積を防止する。

【図3A-E】ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発生に関するデータを示している。ｃｉｓ（図３Ａ、３Ｂ）およびｔｒａｎｓ（図３Ｃ）ｐＴ２３１−ｔａｕマウスｍＡｂの２つの各ハイブリドーマクローンは、マウスを免疫する抗原としてｐＴ２３１−Ｐｉｐ ｔａｕペプチドを用いて取得された。図３Ｄは、Ｐｉｎ１分解を誘導する小分子を用いて確認された、免疫ブロット上でｐＴ２３１−ｔａｕを認識するｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｍＡｂの能力を示している（Ｃｐｄ１は、Ｃｐｄ１Ｅよりも強力であり、不活性Ｃｐｄ１Ａアナログが対照として使用されている）。図３Ｅは、アイソタイプ決定ＥＬＩＳＡキットを用いて決定されるｍＡｂの免疫グロブリンアイソタイプを示している。

【図4A-I】ヒトＡＤおよびＣＴＥの進行時、とくに神経炎で優位なのはｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｐ−ｔａｕであることを示す免疫染色結果である。異なるＩｇＧサブタイプを有するｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｍＡｂを用いて、同一のヒト脳セクションを二重免疫染色した。ｔｒａｎｓ ｐ−ｔａｕは、正常対照でさえも非常に限られた数のニューロンの細胞体に局在化されたが（ＢおよびＣ）、ｃｉｓ ｐ−ｔａｕは、ＡＤおよびＣＴＥの進行時、初期に現れて、蓄積され、神経炎に局在化された（パネルＢ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、およびＩ）。

【図5A-E】ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｍＡｂが、予想されたニューロン区画に局在化し、ｃｉｓ ｍＡｂが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでｐＴ２３１依存的にｔａｕレベルを低減したことを示す結果である。図５Ａおよび５Ｂでは、ＳＹ５Ｙ細胞をｔａｕおよびｐ２５／Ｃｋｄ５でトランスフェクトし、続いて、ｍＡｂを培地に添加し、その後、抗マウス抗体による染色に付した（円を囲む明るいスミア）。ｃｉｓ ｍＡｂは、神経炎に達することが示され（図５Ａ）、ｔｒａｎｓ ｍＡｂは、細胞体に達することが示された（図５Ｂ）。図５Ｃは、ｐ２５／Ｃｄｋ５をＳＹ５Ｙ細胞に共トランスフェクトした時のみ、ｃｉｓ ｍＡｂが、Ｔ２３１Ａでない内因性および外因性のｔａｕのｔａｕレベルを低減したことを示すブロットである。図５Ｄは、ｃｉｓ ｍＡｂが、ｅｘ ｖｉｖｏでＴａｕ−Ｔｇマウス脳切片でｔａｕを低減したことを示すブロットである。図５Ｅは、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ ｍＡｂを用いたときまたは用いないときの血清枯渇ＳＹ５Ｙ細胞を示すブロットである。ｃｉｓ ｍＡｂは、強力にｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを低減し、一方、ｔｒａｎｓ ｍＡｂは、ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを低減した。ＩｇＧの重鎖および軽鎖は、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｍＡｂが細胞に進入したことを示した。また、アクチンは、ローディングコントロールであった。

【図6A-E】ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｍＡｂが、ｐ−ｔａｕおよび血清枯渇により誘導される微小管破壊および神経毒性を強力に抑制したこと示す結果である。図６Ａは、ｐ２５、Ｃｄｋ５、およびｔａｕ＋ＧＦＰでトランスフェクトされたＳＹ５Ｙ細胞を示し、図６Ｂおよび６Ｃは、ＧＦＰ−ｔａｕまたはＴ２３１Ａ ｔａｕ突然変異体でトランスフェクトされたＳＹ５Ｙ細胞を示している。続いて、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ ｍＡｂが添加され、その後、微小管（ＭＴ）および微小管破壊に関して核（図６Ａ）および神経毒性（図６Ｂ）の免疫染色に付した。図６Ｃで、経時的生細胞共焦点イメージングにより、免疫染色の結果を確認した。図６Ｄは、７２時間にわたりｃｉｓまたはｔｒａｎｓ ｍＡｂの存在下で血清枯渇に付されたＳＹ５Ｙ細胞のＭＴの免疫染色画像である。図６Ｅは、７２時間にわたりｃｉｓまたはｔｒａｎｓ ｍＡｂの存在下で血清枯渇に付されたＳＹ５Ｙ細胞の神経毒性を示す細胞形態の免疫染色画像である。

【図7A-B】ＡＤ患者において一貫して上昇したｃｉｓ／ｔｒａｎｓ比を有するＣＳＦ ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの優位な存在を示している。図７Ａは、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ 抗体を用いてＥＬＩＳＡによりアッセイされた８名の健全な対照および５名の進行ＡＤ患者からの脳脊髄液（ＣＳＦ）中のｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを示している。図７Ｂは、ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ比を示している（ｎｄ：検出可不可およびｎａ：該当なし）。

【図8】Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４９：２３２−２４４，２０１２にすでに記載されているように７４％ｃｉｓ ｐＴ２３１−Ｐｉｐ ｔａｕペプチドでマウスを免疫した実験から発生された、２つのｃｉｓ ｍＡｂ（＃１１３、＃７４）（それぞれ配列番号２３および２５）および２つのｔｒａｎｓ ｍＡｂ（＃２５、＃６９）（それぞれ配列番号２７および２８）の軽鎖のアライメントを示している。ＣＤＲ１〜３は、ＣＤＲ１〜３と記されたボックスで表されている。陰影付きボックスは、類似の残基を表し、白地のボックスは、同一残基を表す。

【図9】マウスがＮａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４９：２３２−２４４，２０１２にすでに記載されているように７４％ｃｉｓ ｐＴ２３１−Ｐｉｐ ｔａｕペプチドで免疫した実験から発生された、２つのｃｉｓ ｍＡｂ（＃１１３、＃７４）（それぞれ配列番号２２および２４）および１つのｔｒａｎｓ ｍＡｂ（＃２５）（配列番号２６）の重鎖のアライメントを示している。ＣＤＲ１〜３は、ＣＤＲ１〜３と記されたボックスで表されている。陰影付きボックスは、類似の残基を表し、白地のボックスは、同一残基を表す。

【図10】脳卒中後の損傷脳領域のニューロンで優位なのはｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｐ−ｔａｕであることを示す一連の免疫染色結果である。異なるＩｇＧサブタイプを有するｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｍＡｂを用いて、同一のマウス脳セクションを二重免疫染色した。ｃｉｓ ｐ−ｔａｕ（より明るい色）は、損傷領域にのみ初期に現れたが、非損傷領域に現れなかった。

【図11】ＴＢＩ／ＣＴｅおよびＭＣＩ／ＡＤにおいてｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ ｍＡｂがどのようにタウオパチーの早期の診断および治療に使用されうるかを示すチャートである。

【図12A-E】ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｍＡｂが、栄養枯渇などのニューロンストレス後、微小管破壊、ニューロン死、およびアポトーシスを誘導するｐ−ｔａｕの能力を効率的に中和したことを示す結果である。栄養枯渇は、ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを誘導し、異性体は両方とも、それらのそれぞれのｍＡｂ治療により、効率的に除去された（図１２Ａ）。ｃｉｓ ｍＡｂは、ストレス誘導微小管破壊（図１２Ｂ）、生細胞および死細胞の色素染色によればニューロン死（図１２Ｃ）、およびＰＡＲＰ切断（図１２Ｄ）またはアネキシンＶ ＦＣＡＳ（図１２Ｅ）によればアポトーシスを効率的に阻害したが、ｔｒａｎｓ ｍＡｂはこれらの表現型を増強した。

【図13A-B】ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｍＡｂが、レシピエントニューロンにおいて神経毒性を誘導する分泌ｃｉｓ ｐ−ｔａｕを完全ブロックしたことを示す結果である。栄養枯渇の４８時間後、ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｐ−ｔａｕが培養培地中に分泌された（図１３Ａ）。４８時間で捕集された細胞培養培地を、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ ｍＡｂまたは対照と共にインキュベートし、続いて、プロテインＧを用いてｍＡｂを除去し、その後、レシピエントニューロンに３日間添加した（図１３Ｂ）。

【図14】ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｍＡｂが、レシピエントニューロンにおいて神経毒性を誘導するヒトＡＤ脳溶解物を完全ブロックしたことを示す一連の免疫染色結果である。ヒトＡＤ脳溶解物を、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ ｍＡｂと共にインキュベートし、続いて、プロテインＧを用いてｍＡｂを除去し、その後、レシピエントニューロンに３日間添加した。

【図15A-D】ＴＢＩマウス脳において、ｃｉｓ ｐ−ｔａｕが、ＴＢＩの重症度を増加させ、他のｔａｕエピトープよりもかなり前に現れることを示す結果である。図１５Ａは、異なる落錘高さでＴＢＩを引き起こした２週間後の脳サンプルの免疫ブロッティングより示したとき、ｃｉｓ ｐ−ｔａｕがＴＢＩの重症度と共に増加することを示すブロットである。図１５Ｂおよび１５Ｃは、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ ｐ−ｔａｕおよびＤＮＡの免疫染色することより示したとき、ｔｒａｎｓではなくロバストなｃｉｓ ｐ−ｔａｕが、ＴＢＩ後、時間依存的に現れることを示す免疫染色結果である。図１５Ｄは、ＴＢＩの２週間後、ＡＴ８、ＴＧ３、ＡＴ１００、またはＰＨＦ１ではなく、ロバストなｃｉｓ ｐ−ｔａｕが脳内に存在することを示している。

【図16A-C】マウス脳において、ｃｉｓ ｍＡｂが、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ誘導を効率的に排除し、単一の重篤なＴＢＩ後、細胞死を阻害したことを示す結果である。ビオチンｃｉｓ ｍＡｂのＩＰまたはＩＶ注射の７２時間後、ビオチンｃｉｓ ｍＡｂに対してマウス脳セクションを染色した（図１６Ａ）。３匹のマウスを単一の重篤なＴＢＩに付し、ｃｉｓ ｍＡｂまたは対照ＩｇＧで４日ごとに３回治療し、続いて、ＴＢＩの２週間後、ｃｉｓ ｐ−ｔａｕおよび全ｔａｕ（図１６Ｂ）またはアポトーシスのマーカーとしての切断ＰＡＲＰ（図１６Ｃ）に対して免疫ブロットした。

【図17A-B】ｃｉｓ ｍＡｂが、単一の重篤なＴＢＩ後、微小管破壊、ミトコンドリア破壊、および強迫性行動障害を効率的に回復させたことを示す結果である。マウスを単一の重篤なＴＢＩに付し、ｃｉｓ ｍＡｂまたは対照ＩｇＧで２週間にわたり４日間ごとに３回治療して、電子顕微鏡法に供し（図１７Ａ）、次いで、２ヶ月間にわたり毎週１回行動試験に供した（図１７Ｂ）。

【発明を実施するための形態】

【0047】

一般的には、本発明は、コンフォメーション特異的抗体またはそのフラグメントの発生および使用のための方法および組成物に関する。発明者は、ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕが、ＡＤにおいてタウオパチーおよび記憶喪失もたらすきわめて初期の病原性コンフォメーションであることを見いだした。発明者は、ｃｉｓ ｐ−ｔａｕが対照脳脊髄液（ＣＳＦ）中では検出不能であること、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐ−ｔａｕの両方がＡＤにおいて上昇し、ｃｉｓレベルがｔｒａｎｓレベルよりも高く、ｃｉｓ：ｔｒａｎｓ比がＡＤ患者において増加しかつ類似していることを示す定量的ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。これらの結果は、本明細書に記載のコンフォメーション特異的抗体の発生と共に、内部対照としてｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを用いてｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを検出することにより、初期病原性病期でＡＤおよび他のタウオパチーを診断し治療する新規な方法を提供する。

【0048】

ＰＰＩアーゼおよびＰＰＩアーゼ基質のｃｉｓ／ｔｒａｎｓコンフォメーション
プロリンは、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションのいずれかをとる能力に関してユニークなアミノ酸残基である。その異性化のエネルギー障壁（εｕ＝１４〜２４ｋｃａｌ ｍｏｌ−１）が比較的大きいため、非触媒異性化は、低速プロセスであるが、ＰＰＩアーゼにより加速されうる。ＰＰＩアーゼは、タンパク質のフォールディングを促進し、例としては、シクロフィリン（Ｃｙｐｓ）、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、およびパルブリン様ＰＰＩアーゼ（たとえば、Ｅｓｓ１およびＰｉｎ１）が挙げられる。

【0049】

Ｐｉｎ１（ＮＩＭＡ（ｎｅｖｅｒ ｉｎ ｍｉｔｏｓｉｓ Ａ）−１と相互作用するタンパク質）は、特定のポリペプチドのリン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（ｐＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）モチーフを特異的に異性化する。これが重要であるのは、プロリン指向キナーゼ（たとえば、プロリン残基の前にある特定のＳｅｒ／Ｔｈｒ残基をリン酸化するプロテインキナーゼ）およびホスファターゼが、コンフォメーション特異的であり、一般的には、ｔｒａｎｓコンフォメーションにのみ作用するからである。Ｐｉｎ１は、Ｎ末端ＷＷドメインとＣ末端ＰＰＩアーゼドメインとを含む２ドメイン構造を有し、構造−機能分析から、特異的ｐＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフに対するＰｉｎ１のユニークな基質特異性は、ＷＷドメインとＰＰＩアーゼドメインとの両方により提供される相互作用に起因することが示された。Ｐｉｎ１のＰＰＩアーゼ活性は、たとえば、成長シグナル反応、細胞周期進行、細胞ストレス反応、ニューロン機序、および免疫反応のレギュレーションを促進する。

【0050】

異性化可能なモチーフをそれぞれ含有するＰｉｎ１の例示的基質を表１に列挙する。基質の異性化の機能的帰趨も列挙する。

【0051】

【表1】

【0052】

リン酸化非依存性プロリル異性化の重要性も実証された。たとえば、ＰＰＩアーゼＣｙｐＡは、Ｃｒｋタンパク質の位置Ｇｌｙ２３７−Ｐｒｏ２３８でプロリル結合のｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化を触媒する。リン酸化非依存的に異性化される他のＰＰＩアーゼ基質としては、ステロイドレセプター、ｃ−Ｍｙｂ、Ｈ３Ｐ３０、Ｈ３Ｐ３８、Ｉｔｋ、５−ヒドロキシトリプタミン３型（５−ＨＴ３）レセプター、ファージｔｉｐタンパク質Ｇ３Ｐ、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）ビリオンのＧａｇポリタンパク質、細胞内カルシウム放出チャネル、ＣｒｋＩＩ／ＣｒｋＬタンパク質、中心体タンパク質５５ｋＤａ（Ｃｅｐ５５）、レトロウイルスＲｅｌタンパク質、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）Ｔａｘオンコプロテイン、Ｓｔａｔ３、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、Ｎｏｔｃｈ、ＦＡＫ、ＦＯＸＯ、ＰＭＬ、Ｃ／ＥＢＰ、およびＳＭＲＴが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＰＰＩアーゼ活性のデレギュレーション（たとえば、ＰＰＩアーゼ活性のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション（たとえば、ＰＰＩアーゼ活性の増加または減少））は、たとえば、ＰＰＩアーゼ基質に存在するＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフのｃｉｓまたはｔｒａｎｓ含有率の増加をもたらしうる。これは、ＰＰＩアーゼ基質の機能に影響を及ぼしうるとともに、たとえば、細胞増殖障害、神経障害、喘息、老化関連障害、およびタウオパチーの発生をもたらしうる（図１および２たとえば、を参照されたい）。

【0053】

コンフォメーション特異的抗体
本発明には、コンフォメーション特異的抗体またはそのフラグメントの発生および使用のための方法および組成物が記載されている。コンフォメーション特異的抗体は、たとえば、ポリペプチドのｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションに特異的に結合しうる。特定の実施形態では、本発明に係るコンフォメーション特異的抗体は、ポリペプチドのリン酸化または非リン酸化Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションに結合しうる（たとえば、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕまたはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ）。Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフは、ポリペプチドのリン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフでありうる（たとえば、Ｐｉｎ１基質、たとえば、ｐＴ２３１−ｔａｕ）。コンフォメーション特異的抗体のその抗原（たとえば、Ｐｉｎ１基質、たとえば、ｐＴ２３１−ｔａｕ）への結合は、障害または障害の進行の治療、診断、またはモニタリングに有用でありうる。

【0054】

治療目的の抗体の調製および使用の方法は、本明細書に記載されており、たとえば、米国特許第６，０５４，２９７号明細書、同第５，８２１，３３７号明細書、同第６，３６５，１５７号明細書、および同第６，１６５，４６４号明細書、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３５４７３号パンフレット、ならびに米国特許出願第１３／５０４，７００号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0055】

抗原
本発明に係るコンフォメーション特異的抗体は、たとえば、リン酸化もしくは非リン酸化Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフ（ここで、Ｘａａは、特定のコンフォメーション（たとえば、ｃｉｓもしくはｔｒａｎｓコンフォメーション）またはｃｉｓおよびｔｒａｎｓコンフォメーションの混合で固定される任意のアミノ酸残基（たとえば、セリンまたはトレオニン）である）を含有する免疫原性抗原（たとえば、抗原ペプチド）、またはｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化の可能な任意の他のモチーフもしくはアミノ酸配列を用いて、発生されうる。たとえば、本発明に係るリン酸化または非リン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ含有抗原ペプチドのｃｉｓまたはｔｒａｎｓの含有率は、スティル・ウィッティヒ転位およびアイルランド・クライゼン転位（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６８：２３４３−２３４９，２００３（参照により本明細書に組み込まれる））による（Ｚ）および（Ｅ）−アルケン模倣体の立体選択的合成により固定されうる。他の選択肢として、本発明に係るリン酸化または非リン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ含有抗原ペプチドのｃｉｓまたはｔｒａｎｓの含有率は、プロリンアミノ酸残基をプロリンアナログで置換することにより、増加または固定されうる。プロリンアナログとしては、ホモプロリン、ピペコリン酸（Ｐｉｐ）、ジメチルプロリン（ＤＭＰ）、アゼチジン−２−カルボキシル酸（Ａｚｅ）、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−プロリン（ＴＢＰ）、ｔｒａｎｓ−４−フルオロ−Ｌ−プロリン（ｔ−４Ｆ−Ｐｒｏ）、およびｃｉｓ−４−フルオロ−Ｌ−プロリン（ｃ−４Ｆ−Ｐｒｏ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。所与の抗原のｃｉｓまたはｔｒａｎｓの含有率は、たとえば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析により分析されうる。

【0056】

本発明に係る抗原ペプチドは、リン酸化または非リン酸化Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフを含有しうる。ここで、Ｘａａは、ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化が可能な任意のアミノ酸残基（たとえば、セリンまたはトレオニン）である。抗原ペプチドは、プロリン残基をプロリンアナログの代わりに用いて、Ｐｉｎ１基質のＸａａ−Ｐｒｏモチーフのアミノ酸残基（それらの例は表１に提供されている）を含有しうる。抗原ペプチドはまた、全長ポリペプチドのＸａａ−Ｐｒｏモチーフのアミノ酸残基を含有しうる。抗原ペプチドは、全長ポリペプチドのＸａａ−Ｐｒｏモチーフの周りに追加の残基をさらに含みうる。たとえば、抗原ペプチドは、全長ポリペプチドのＸａａ残基のＮ末端に３〜１０アミノ酸残基と、全長ポリペプチドのプロリンのＣ末端に３〜１０アミノ酸残基と、を含みうる。本発明に係る抗原ペプチドは、たとえば、少なくとも４、５、６、７、または８アミノ酸残基長でありうる。抗原ペプチドは、８〜２０アミノ酸残基長（たとえば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸残基長）でありうるか、または２０アミノ酸残基長を超えうる。

【0057】

そのような抗原は、当業者に公知のさまざまな方法のいずれかにより、産生および精製されうる。抗原ペプチドは、たとえば、固相化学合成、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳、または組換え技術により、産生および精製されうる。抗原ペプチドは、任意選択で、担体タンパク質に化学結合されうるか、またはペプチドは、抗原性を増加させるために融合タンパク質として発生されうる。抗原ペプチドは、コンフォメーション特異的抗体の産生を誘導する能力に基づいてスクリーニングされうる。これに関連して、そのようなスクリーニング技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、または他の免疫アッセイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0058】

コンフォメーション特異的抗体の産生に有用な例示的抗原としては、リン酸化または非リン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ホモプロリン、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｉｐ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ＤＭＰ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ａｚｅ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ＴＢＰ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ ｔ−４Ｆ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ ｃ−４Ｆ−Ｐｒｏモチーフを含有する抗原が挙げられる。そのような抗原の特定例としては、たとえば、ｐＴ６６８−ＰｉｐおよびｐＴ６６８−ＤＭＰ ＡＰＰペプチド（ＶＤＡＡＶ−ｐＴ６６８−Ｐｒｏ−ＥＥＲＨＬＳＫ）、ｐＴ２３１−Ｐｉｐ ｔａｕペプチド、およびｐＴ２３１−ＤＭＰ ｔａｕペプチド（ＫＶＡＶＶＲ−ｐＴ２３１−Ｐｒｏ−ＰＫＳＰＳ）が挙げられる。また、他の例示的抗原が、米国特許出願公開第２００８／００５８２７６号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。そのようなペプチドは、たとえば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（たとえば、ウサギまたはマウスモノクローナル抗体）を発生させるために、抗原として使用されうる。

【0059】

好ましい実施形態では、本発明に係る抗原は、以下の配列を有する可変領域に結合するであろう。

【0060】

コンフォメーション特異的抗体の発生および精製
本発明に係る抗原は、当技術分野で公知の任意の方法により、たとえば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または組換えコンフォメーション特異的抗体を発生するために、使用されうる。これらの方法としては、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５ ａｎｄ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６）ならびにＣａｍｐｂｅｌｌ（“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，”ｉｎ Ｂｕｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）により記載された免疫学的方法、さらにはＨｕｓｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１，１９８９）により記載された組換えＤＮＡ法が挙げられる。

【0061】

簡潔に述べると、本発明に係る抗原は、アジュバントと組み合わせて、宿主動物（たとえば、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、またはニワトリに投与されうる。そのような抗原の投与は、皮下注射または筋肉内注射をはじめとするさまざまな方法のいずれかにより達成されうるが、これらに限定されるものではない。投与後、宿主動物で産生された抗体価の結果をモニターする。これは、抗血清を単離しつつ（たとえば、遠心分離により）、当技術分野で周知のさまざまな技術のいずれかにより行われうる（たとえば、慣例的な採血）。その後、たとえば、ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントのｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションに対して結合親和性を有する抗体の存在に関してスクリーニングされうる。所望の抗体のスクリーニングは、たとえば、放射線免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫アッセイ、免疫ラジオメトリックアッセイ、ゲル内拡散沈降反応、ｉｎ ｓｉｔｕ免疫アッセイ（たとえば、コロイド金、酵素、または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈殿反応、凝集アッセイ（たとえば、ゲル内凝集アッセイまたは赤血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイをはじめとする技術により達成されうる。

【0062】

宿主動物から得られる抗血清は、本発明に用いられる抗体を誘導するために、アフィニティー精製されうる。抗血清は、分離カラム上に抗血清を導入するなどの従来技術により精製されうる。本発明に係る抗原は、コンフォメーション特異的抗体を単離および精製するために、カラム上に固定されうる。たとえば、ｃｉｓ特異的抗体を発生するために使用されたＳｅｒ／Ｔｈｒ−ＤＭＰモチーフを含有する抗原ペプチドをカラム上に固定して、得られたｃｉｓ特異的抗体を、たとえば、ｔｒａｎｓコンフォメーションの抗体から、精製するために使用しうる。次いで、カラムを洗浄して、カラム上に固定された抗原に対して特異性を有していない抗体を除去するとともに、最終的に、残留するコンフォメーション特異的抗体をカラムから溶出させうる。次いで、単離されたコンフォメーション特異的抗体を当業者に公知の従来の手法により貯蔵しうる。

【0063】

他の選択肢として、コンフォメーション特異的抗体の同定のために、抗体ライブラリー（たとえば、ナイーブ抗体ライブラリー、合成抗体ライブラリー、半合成抗体ライブラリー、またはコンビナトリアルライブラリー）をスクリーニングしうる。そのようなライブラリーは、いくつかの供給元（たとえば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、Ｇｅｎｅｔａｓｔｉｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｃｉｆｉｃ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｒｉｃｈｌａｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、およびＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＡＧ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ（たとえば、ＨｕＣａｌ ＧＯＬＤ））から市販されている。たとえば、米国特許第６，６９６，２４８号明細書、同第６，７０６，４８４号明細書、同第６，８２８，４２２号明細書、および同第７，２６４，９６３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0064】

抗体ライブラリーのスクリーニングは、たとえば、ファージディスプレイ、選択的感染性ファージ、ポリソーム技術、および酵素活性またはタンパク質安定性のアッセイ系をはじめとする当業者に公知の方法の１つを用いて、行われうる。所望の性質を有する抗体は、たとえば、対応する核酸配列の配列決定により、アミノ酸の配列決定により、または質量分析により、同定可能である。最適化は、サブ配列を異なる配列（たとえば、ランダム配列）に置き換えてからスクリーニング工程を１回以上繰り返すことにより、行われる。抗体は、たとえば、標的分子（たとえば、標的分子のｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーション）に対する最適化された親和性もしくは特異性、最適化された発現収率、最適化された安定性、または最適化された溶解性に関してスクリーニングされうる。

【0065】

本発明に係るコンフォメーション特異的抗体は、たとえば、その相補的抗原の特定のコンフォメーション（たとえば、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーション）を認識してそれに特異的に結合する。たとえば、本明細書に記載されるように、コンフォメーション特異的抗体は、ポリペプチドのリン酸化または非リン酸化Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフ（たとえば、Ｐｉｎ１基質、たとえば、ｐＴ２３１−ｔａｕのＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフ）のｃｉｓコンフォメーションに特異的に結合しうるが、ポリペプチドのリン酸化または非リン酸化Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのｔｒａｎｓコンフォメーションには特異的に結合しないであろう。この場合、コンフォメーション特異的抗体とその抗原との間のＫｄは、たとえば、少なくとも約１０^−４Ｍ、１０^−５Ｍ、１０^−６Ｍ、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０−^１１Ｍ、もしくは１０^−１２Ｍ、またはそれ以上である。結合特異性に加えて、コンフォメーション特異的抗体は、たとえば、一方のコンフォメーション（たとえば、ｃｉｓコンフォメーション）に対する親和性が、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフの他方のコンフォメーション（たとえば、ｔｒａｎｓコンフォメーション）に対する親和性の少なくとも１０〜１００倍であろう。コンフォメーション特異的抗体は、たとえば、一方のコンフォメーション（たとえば、ｃｉｓコンフォメーション）に対する親和性が、他方のコンフォメーション（たとえば、ｔｒａｎｓコンフォメーション）に対する親和性の少なくとも１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、または１０^１０倍でありうる。

【0066】

本発明はまた、本発明に係る方法に従って発生させたいくつかの新しいモノクローナル抗体に基づく抗体を特徴とする。これらの抗体およびそれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を以下に示す。

【0067】

したがって、本発明は、本発明に係る診断および治療の方法における、以上に列挙したｔｒａｎｓまたはｃｉｓ特異的抗体（またはそれから誘導される抗体）の使用を特徴とする。たとえば、本発明は、以上の各抗体の重鎖または軽鎖のいずれか（または両方）の１、２、または３個のＣＤＲを有するモノクローナル抗体（たとえば、ヒト化抗体またはヒト抗体）を特徴とする。これらのＣＤＲは、本明細書で説明されるように、フレームワーク領域（たとえば、ヒトフレームワーク）に組込み可能である。さらに、これらのＣＤＲは、変化させうる（たとえば、１、２、３、４、５またはそれ以上の）アミノ酸置換を含有する。そのような変異体は、以下の表２に示されるように置換（例示的または好ましいのいずれか）を有しうる。

【0068】

【表2】

【0069】

追加としてまたは他の選択肢として、変異体は、図８および９に示される置換を含有しうる。そのような変異体は、好ましくは、提示された抗体間で保存される残基を保持すると同時に、抗体間で変化するように示された残基の変化を有するであろう（残基は、以上の表に従ってまたは図に提示された代替残基を用いて、置換可能である）。変異体はまた、重鎖および軽鎖のＣＤＲの組合せを含みうる。たとえば、変異体は、重鎖のＣＤＲ１および３と、軽鎖のＣＤＲ１および３、またはＣＤＲ１および２、またはＣＤＲ２および３、重鎖のＣＤＲ１および２と、軽鎖のＣＤＲ１および３、またはＣＤＲ１および２、またはＣＤＲ２および３、重鎖のＣＤＲ２および３と、軽鎖のＣＤＲ１および３、またはＣＤＲ１および２、またはＣＤＲ２および３、軽鎖のＣＤＲ１および３と、重鎖のＣＤＲ１および３、またはＣＤＲ１および２、および／またはＣＤＲ２および３、軽鎖のＣＤＲ１および２と、重鎖のＣＤＲ１および３、またはＣＤＲ１および２、またはＣＤＲ２および３、軽鎖のＣＤＲ２および３と、重鎖のＣＤＲ２および３、ＣＤＲ１および３、またはＣＤＲ１および２、あるいはそれらの組合せを含みうる。すべての場合において、以上の抗体の変異体は、本明細書に記載のｐＴａｕエピトープのｃｉｓ（またはｔｒａｎｓ）コンフォメーションに特異的に結合する能力を維持する。

【0070】

ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する種々の方法が、当技術分野で公知である。たとえば、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有しうる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「輸入」残基として参照され、典型的には、「輸入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒら（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５，１９８６、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−７，１９８８、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−６，１９８８）の方法に従って、ヒト抗体の対応する配列を超可変領域配列で置換することにより、行うことが可能である。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、無傷ヒト可変ドメインよりも実質的に小さい部分が非ヒト種の対応する配列により置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、少なくともいくつかの超可変領域残基さらには他の可変領域残基が、齧歯動物抗体中の類似の部位の残基により置換されるヒト抗体である。

【0071】

ヒト化抗体の製造に使用される軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するのに重要でありうる。いわゆる「最良当てはめ」法に従って、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対して、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列がスクリーニングされる。次いで、齧歯動物のものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして許容される。たとえば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６−３０８，１９９３、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７，１９８７を参照されたい。他の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列から得られる特定のフレームワークが使用される。いくつかの異なるヒト化抗体に、同一のフレームワークを使用しうる。たとえば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５−９，１９９２、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−３２，１９９３を参照されたい。

【0072】

さらに、抗原に対する高親和性および他の有利な生物学的性質を保持しながら抗体をヒト化することが、一般に重要である。この目標を達成するために、一方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列および種々の概念上のヒト化産物の分析プロセスにより調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者の熟知するところである。選択された候補免疫グロブリン配列の予想三次元コンフォメーション構造を例示および表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析（すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析）が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大などの所望の抗体特性が達成されるように、レシピエントからＦＲ残基を選択し組み合わせて、配列を輸入することが可能である。一般的には、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与する。

【0073】

ヒト抗体
本発明に係るヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列と、既知のヒト定常ドメイン配列と、を組み合わせることにより構築可能である（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−８，１９９２、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７，１９９１）。他の選択肢として、本発明に係るヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法により作製可能である。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は、たとえば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１−５，１９８４、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５，１９９１により記載されている。

【0074】

現在、内因性免疫グロブリン産生の不在下で免疫化によりヒト抗体の全レパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（たとえば、マウス）を生産することが可能である。たとえば、キメラマウスおよび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失は、内因性抗体産生の完全阻害をもたらすと記載されている。そのような生殖系列突然変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジによるヒト抗体の産生をもたらすであろう。たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１−５，１９９３、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−８，１９９３、Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３−４０，１９９３を参照されたい。

【0075】

また、非ヒト抗体たとえば齧歯動物抗体からヒト抗体を誘導するために、遺伝子シャフリングを使用することも可能である。この場合、ヒト抗体は、出発非ヒト抗体と類似の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によれば、本明細書に記載のファージディスプレイ技術により取得される非ヒト抗体フラグメントの重鎖または軽鎖の可変領域のいずれかが、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えられ、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖまたはＦａｂキメラの集団が形成される。抗原による選択により、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖまたはＦａｂが単離される。この場合、ヒト鎖は、初期ファージディスプレイクローン中の対応する非ヒト鎖の除去により、破壊された抗原結合部位を回復する。すなわち、エピトープは、ヒト鎖パートナーの選択を支配（インプリント）する。残りの非ヒト鎖を置き換えるべくプロセスを繰り返した場合、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開国際公開第９３／０６２１３号パンフレットを参照されたい）。ＣＤＲ移植による非ヒト抗体の伝統的ヒト化とは異なり、この技術は、非ヒト起源のＦＲ残基もＣＤＲ残基も有していない完全ヒト抗体を提供する。

【0076】

抗体フラグメント
本発明はまた、無傷抗体の一部を含む、好ましくはその抗原結合領域を含む抗体フラグメントを特徴とする。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖフラグメント、ダイアボディー、線状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体が挙げられる。

【0077】

抗体のパパイン消化により、それぞれ単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、容易に結晶化する能力を反映した名称をもつ残りの「Ｆｃ」フラグメントと、を産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有して依然として抗原の架橋が可能なＦ（ａｂ’）_２フラグメントが得られる。

【0078】

Ｆｖは、完全抗原結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。一実施形態では、２つの鎖Ｆｖ種は、密な非共有結合会合状態の１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、２つの鎖Ｆｖ種のものに類似した「二量体」構造で軽鎖および重鎖が会合するように、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインが、可撓性ペプチドリンカーにより共有結合されうる。各可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するのは、この配置のものである。全体として、６つのＨＶＲが、抗体への抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、全結合部位よりも低い親和性であるが、抗原を認識してそれに結合する能力を有する。

【0079】

Ｆａｂフラグメントは、重鎖および軽鎖の可変ドメインを含有し、さらに、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基が追加されている点でＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する表記である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントは、最初に、それらの間にヒンジシステインを有する対をなすＦａｂ’フラグメントとして産生された。また、抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。

【0080】

一本鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般的には、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにする。ｓｃＦｖのレビューについては、たとえば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。

【0081】

ダイアボディーは、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントであり、フラグメントは、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一の鎖上の２つのドメイン間で対合できないほど短いリンカーを用いることにより、ドメインを他の鎖の相補的ドメインに対合させ、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディーは、２価または二重特異的でありうる。ダイアボディーは、たとえば、欧州特許第４０４，０９７号明細書、ＰＣＴ公開国際公開第１９９３／０１１６１号パンフレット、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−３４，２００３、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８，１９９３に、より完全に記載されている。また、トリアボディーおよびテトラボディーが、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−３４，２００３に記載されている。

【0082】

抗体フラグメントは、酵素消化などの伝統的な手段または組換え技術により発生されうる。特定の状況下では、全長抗体ではなく抗体フラグメントを使用することが有利である。フラグメントのサイズをより小さくすれば、迅速なクリアランスが可能になるので、固形腫瘍の処置の改善につながりうる。特定の抗体フラグメントのレビューについては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４，２００３を参照されたい。

【0083】

抗体フラグメントの産生のために、種々の技術が開発されてきた。伝統的には、これらフラグメントは、無傷抗体のタンパク質分解消化により誘導されてきた（たとえば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１７，１９９２、およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１−３，１９８５を参照されたい）。しかしながら、これらのフラグメントは、現在、組換え宿主細胞により直接に産生することが可能である。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＳｃＦｖ抗体フラグメントはすべて、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの分泌が可能であるので、これらのフラグメントを多量に容易に産生することが可能である。抗体フラグメントは、抗体ファージライブラリーから単離可能である。他の選択肢として、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、化学結合させてＦ（ａｂ’）_２フラグメントを形成することが可能である（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−７，１９９２）。他の方法では、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離される。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含むｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、米国特許第５，８６９，０４６号明細書に記載されている。抗体フラグメントを産生するための他の技術は、当業者には明らかであろう。

【0084】

治療用製剤
本発明に係るコンフォメーション特異的抗体は、タウオパチー、ＴＢＩ、または脳卒中の治療、阻害、または予防に使用されうる。コンフォメーション特異的抗体はまた、タウオパチー、ＴＢＩ、または脳卒中の症状を改善するために使用されうる。

【0085】

本発明に係るコンフォメーション特異的抗体は、さまざまな方法で製剤化し投与することが可能である（たとえば、特異的適応症に対する既知の経路、たとえば、限定されるものではないが、外用、経口、皮下、静脈内、気管支注射、脳内、鼻腔内、経真皮、腹腔内、筋肉内、肺内、腟内、直腸内、動脈内、病変内、非経口、脳室内、または眼内）。たとえば、コンフォメーション特異的抗体を含有する医薬組成物は、経口投与に供される丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤、もしくは持続放出錠剤、静脈内投与もしくは皮下投与に供される液剤、局所投与に供されるポリマーもしくは他の持続放出媒体、または外用投与に供される軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、またはパッチ剤の形態をとりうる。

【0086】

コンフォメーション特異的抗体の連続全身注入または定期的注射を用いて、タウオパチー、ＴＢＩ、または脳卒中を治療または予防することが可能である。治療は、１日から被験体の寿命までの期間（たとえば、１〜１００日間、１〜６０日間）にわたり、または障害の症状が低減もしくは除去されるまで、継続可能である。投与量は、障害の重症度または障害の症状に依存して異なる。また、持続放出システムおよび半透性留置型薄膜デバイスは、本発明に係る医薬組成物を送達するための手段として有用である。他の実施形態では、組成物は、局所的に、たとえば、吸入により投与され、この投与は、定期的に繰返し可能である。

【0087】

治療用製剤は、当技術分野で公知の標準的方法を用いて、所望の純度を有する活性成分と、任意選択の生理学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤と、を混合することにより、凍結乾燥製剤または水性溶液剤の形態で調製される（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡを参照されたい）。許容可能な担体としては、たとえば、生理食塩水、緩衝剤、たとえば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸、アスコルビン酸をはじめとする抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、たとえば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン、親水性ポリマー、たとえば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、たとえば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン、単糖、二糖、および他の炭水化物、たとえば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン、キレート化剤、たとえば、ＥＤＴＡ、糖アルコール、たとえば、マンニトールもしくはソルビトール、塩形成対イオン、たとえば、ナトリウム、および／または非イオン性界面活性剤、たとえば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはＰＥＧが挙げられる。

【0088】

任意選択で、ただし、好ましくは、製剤は、薬学的に許容可能な塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくは生理的濃度で含有する。任意選択で、本発明に係る製剤は、薬学的に許容可能な保存剤を含有可能である。いくつかの実施形態では、保存剤の濃度は、０．１〜２．０％ｖ／ｖの範囲内である。好適な保存剤としては、製薬技術分野で知られたものが挙げられる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、およびプロピルパラベンは、好ましい保存剤である。任意選択で、本発明に係る製剤は、薬学的に許容可能な界面活性剤を含みうる。好ましい界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。好ましい界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ−２０およびプルロニック酸（Ｆ６８）が挙げられる。好適な界面活性剤濃度は、たとえば、０．００５〜０．０２％である。

【0089】

本発明に係るコンフォメーション特異的抗体は、治療上有効量で被験体に投与される。好ましくは、抗体は、非経口投与されるか、または持続注入により静脈内投与される。用量および投与レジメンは、障害の重症度および被験体の全身の健康状態に依存する。投与される抗体の量は、典型的には、約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、好ましくは０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ被験体体重の範囲内である。

【0090】

非経口投与に供する場合、コンフォメーション特異的抗体は、薬学的に許容可能な非経口媒体を加えて単位投与量の注射可能な形態（たとえば、溶液、懸濁液、または乳濁液）で製剤化される。そのような媒体は、本質的に非毒性かつ非治療性である。そのような媒体の例としては、たとえば、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。非水性媒体、たとえば、固定油およびオレイン酸エチルを使用することも可能である。リポソームを担体として使用しうる。媒体は、副次量の添加剤、たとえば、等張性および化学的安定性を向上させる物質、（たとえば、緩衝剤および保存剤）を含有しうる。抗体は、典型的には、約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度でそのような媒体中に製剤化される。

【0091】

所要の投与量は、投与経路の選択、製剤の性質、被験体の障害の性質、被験体の背格好、体重、表面積、年齢、および性別、投与されている他の薬剤、および被験体の医師の判断に依存する。入手可能なポリペプチドおよびフラグメントがさまざまであること、および種々の投与経路の効率が異なることを考慮して、必要とされる投与量の広範な変動が予想される。たとえば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも多くの投与量を必要とすると予想されよう。これらの投与レベルの変動は、当技術分野で周知のように、最適化の標準的経験的手順を用いて調整可能である。投与は、単回または複数回でありうる（たとえば、２、３、６、８、１０、２０、５０、１００、１５０回、またはそれ以上の投与回数）。組成物は、任意の時点で投与可能である（たとえば、障害もしくは障害に関連する病態の診断もしくは検出の後（たとえば、当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載の診断方法を用いて）、または障害を発生するリスクのある被験体に対して障害の診断前）。好適な送達媒体（たとえば、高分子マイクロ粒子または留置型デバイス）中への抗体の取込みは、とくに経口送達に供する場合、送達効率を増加させうる。

【0092】

抗体の投与を必要とする任意の障害の治療に好適な放出特性を有する製剤で、コンフォメーション特異的抗体の持続放出投与が望まれる場合、抗体のマイクロカプセル化が想定されうる。持続放出のためのポリペプチドのマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン−２、およびＭＮ ｒｇｐ１２０を用いて行われてきた（たとえば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７９５−７９９，１９９６、Ｙａｓｕｄａ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｔｈｅｒ．２７：１２２１−１２２３，１９９３、Ｈｏｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７５５−７５８ １９９０、Ｃｌｅｌａｎｄ，“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”ｉｎ“Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．４３９−４６２，１９９５、国際公開第９７／０３６９２号パンフレット、国際公開第９６／４００７２号パンフレット、国際公開第９６／０７３９９号パンフレット、および米国特許第５，６５４，０１０号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

【0093】

持続放出製剤としては、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用いて開発されたものが挙げられる。ＰＬＧＡ（乳酸およびグリコール酸）の分解生成物は、人体からの急速なクリアランスが可能である。さらに、このポリマーの分解性は、その分子量および組成に依存して、何ヵ月間〜何年間かにわたり調整可能である（たとえば、Ｌｅｗｉｓ，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒ，”ｉｎ Ｍ．Ｃｈａｓｉｎ ａｎｄ Ｄｒ．Ｌａｎｇｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−４１，１９９０を参照されたい）。

【0094】

本発明で使用される抗体はまた、他の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列、たとえば、Ｆｃ配列または追加の治療用分子（たとえば、化学療法剤）に融合されたコンフォメーション特異的抗体を含むキメラ分子を形成するように修飾されうる。

【0095】

本発明に係るコンフォメーション特異的抗体は、単独でまたはキットとして他の治療用化合物との組合せでパッケージ化されうる。例としては、たとえば、１つの丸剤、２つの丸剤、粉末剤（任意選択で丸剤または錠剤と組み合わされる）、坐剤、バイアル中の液剤、または２つの外用クリーム剤を含有するキットが挙げられるが、これらに限定されるものではない。キットは、単位用量を患者に投与するのを支援する任意選択のコンポーネント、たとえば、粉末形態を再構成するためのバイアル、注入用のシリンジ、カスタマイズされたＩＶ送達システム、またはインヘラーを含みうる。そのほかに、単位用量キットは、組成物の調製および投与のための説明書を含有しうる。キットは、一被験体用の単回使用単位用量、特定の被験体用の複数回用量として製造されうるか（たとえば、一定用量で、もしくは治療の進行に伴って個別の化合物の効力が変化しうるように）、またはキットは、複数の被験体への投与に好適な複数回用量を含有しうる（たとえば、「バルクパッケージ化」）。キットのコンポーネントは、カートン、ブリスターパック、ボトル、チューブ、またはバイアルに集合されうる。

【0096】

適応症
本発明に係る抗体は、たとえばｐ−Ｔａｕのｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションいずれかが病理学的に高レベルであることにより特徴付けられる障害を治療するのに有用である。そのような治療は、たとえばｐ−Ｔａｕのｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションいずれかが病理学的に高レベルであるとして同定される患者（たとえば、本明細書に記載の方法により診断された患者）で、またはそのような病理学的レベルに関連することが知られている疾患と診断された患者で、使用可能である。そのような障害としては、神経障害、たとえば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認識障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋ジストロフィー、皮質基底核変性症、拳闘家認知症、ダウン症候群、前頭側頭型認知症、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病、ピック病、プリオン病、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、痙攣性疾患（たとえば、癲癇）、血管性認知症、加齢性認知症、頭部外傷、脳卒中、神経繊維腫症、レビー小体病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、末梢神経症、および黄斑変性が挙げられる。本発明に係る抗体により治療可能な他の障害としては、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、進行性核上性麻痺、前頭側頭葉変性、リティコ・ボディグ病、縺れ優位認知症、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎が挙げられる。

【0097】

診断
本発明は、本明細書に記載の障害（たとえば、タウオパチー、ＴＢＩ、または脳卒中）を治療、診断、およびその進行をモニターする方法および組成物を特徴とする。方法および組成物は、たとえば、リン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフを、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーション（たとえば、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕおよび／またはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ）で、含有するＰｉｎ１基質（またはその任意のフラグメントもしくは誘導体、たとえば、ｐＴ２３１−ｔａｕ）の検出および測定を含みうる。本方法は、正常参照と比較してｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションのｐＴ２３１−ｔａｕの絶対レベルの測定を含みうる。５ｎｇ／ｍｌ未満、４ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ）、または１ｎｇ／ｍｌ血清未満のｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションのｐＴ２３１−ｔａｕの血清中レベルは、障害（たとえば、タウオパチー）と診断された患者において転帰良好と予測されると考えられる。５ｎｇ／ｍｌ超、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、または５０ｎｇ／ｍｌのｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションの基質の血清中レベルは、障害とすでに診断された被験体において転帰不良と診断されると考えられる。

【0098】

特定のコンフォメーションの基質（たとえば、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションのｐＴ２３１−ｔａｕ）の相対レベルに基づく診断では、障害（たとえば、タウオパチー）の被験体は、たとえばｃｉｓコンフォメーションの基質の量の変化（たとえば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加）、またはｃｉｓおよびｔｒａｎｓコンフォメーションの比の変化を示すであろう。正常参照サンプルは、たとえば、障害もしくは障害を示唆する症状の発生前の同一の被験体から採取された先行サンプル、障害を有していない被験体からのサンプル、障害の症状を有していない被験体からのサンプル、または既知の正常濃度（すなわち、障害の指標とならない）の所与のコンフォメーションの精製参照ポリペプチドのサンプルでありうる。

【0099】

本発明はまた、軽度認識障害（ＭＣＩ）、タウオパチー（たとえば、ＡＤ、ＣＴＥ）、またはＴＢＩに対する被験体の早期診断または素因を特徴とする。方法および組成物は、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕおよびｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比の検出および測定を含む。ｃｉｓ ｐＴ２３１のレベルまたはｃｉｓ：ｔｒａｎｓの比の上昇は、被験体がＡＤのリスクがあることを示唆し、そのような被験体集団は、本明細書に記載のｃｉｓ ｐＴ２３１ｔａｕ標的免疫療法が奏効するであろう。本発明に係る初期の診断およびモニタリングの方法はまた、潜在臨床試験で患者の治療反応を評価するのに有用である。ｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比の減少は、療法がＭＣＩ、タウオパチー（たとえば、ＡＤ、ＣＴＥ）、またはＴＢＩを標的として有効であることを示唆するであろう。そのような早期診断は、神経障害のなんらかの症状が現れる前に（たとえば、脳外傷（たとえば、繰り返された脳外傷）または神経疾患の家族歴を有することが分かっているもしくは疑われる患者で行うことが可能である。

【0100】

標準的方法を用いて、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水、または脳脊髄液（ＣＳＦ）をはじめとする任意の体液で基質のレベルを測定しうるが、これらに限定されるものではない。そのような方法としては、免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、および定量的酵素免疫アッセイ技術が挙げられる。

【0101】

診断目的で、コンフォメーション特異的抗体を標識しうる。抗体の標識は、検出可能な物質を抗体に結合（たとえば、物理的結合）することによる抗体の直接標識、さらには直接標識される他の試薬と反応させることによる抗体の間接標識を包含するために意図される。たとえば、抗体は、被験体における存在および位置を標準的イメージング技術により検出可能な放射性マーカーまたは蛍光マーカーで標識可能である。

【0102】

本明細書に記載の診断方法は、単独で、または障害（たとえば、タウオパチー）の存在もしくは重症度のより正確な診断のために、本明細書に記載の任意の他の診断方法との組合せで、使用可能である。そのような障害を診断するための追加の方法の例としては、たとえば、他のバイオマーカー（たとえば、ＣＳＦ ｔ−ｔａｕ、ｐＴ１８１−ｔａｕ、Ａβ４２、またはＡｐｏＥ４）のレベルの決定、被験体の既往歴の調査、組織の免疫組織化学的染色、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、または培養成長が挙げられる。

【0103】

診断用キット
本発明はまた、診断検査キットを提供する。たとえば、診断検査キットは、ポリペプチド（たとえば、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕまたはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ、それらのフラグメントに特異的に結合するコンフォメーション特異的抗体）と、ポリペプチド（たとえば、抗体）とｐ−Ｔａｕとの結合を評価するおよび／または検出するためのコンポーネントと、を含みうる。他の選択肢として、キットは、被験体サンプルの血清、血液、またはＣＳＦに存在するｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕまたはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを検出するために、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕポリペプチドもしくはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕポリペプチド、またはｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕフラグメントもしくはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕフラグメントを含みうる。他の例では、本発明に係る診断用キットは、正常対照に存在するレベルなどの参照と比較して、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕまたはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕポリペプチドのレベルの変化を同定するために使用されうる。そのようなキットは、陽性参照または正常対照参照の指標となる参照サンプルまたは標準曲線を含みうる。

【0104】

検出のために、抗体またはｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕまたはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１ポリペプチドのいずれを標識し、抗体またはｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕまたはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１ポリペプチドのいずれかを基材に結合すると、抗体とｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕまたはｔｒａｎｓ ｐＴ２３１ポリペプチドとを結合させた後、基材に結合された標識の量を決定することにより、ポリペプチド−抗体相互作用を確定することが可能である。抗体−基材相互作用を検出するために、従来の免疫アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）を使用してもよく、本発明に係るキットで提供することが可能である。本発明に係るポリペプチドは、血液、血漿、ＣＳＦ、血清などの生物学的サンプルで検出可能である。

【0105】

診断用キットは、キットを使用するための説明書を含みうる。一例では、キットは、タウオパチー（たとえば、ＡＤ、ＣＴＥ）、ＴＢＩ、および／もしくはＭＣＩ、またはそれらが発症するリスクを診断するためのキットを使用するための説明書を含有する。さらに他の例では、キットは、治療処置をモニターするためのキットの使用、投与レジメン、またはタウオパチー（たとえば、ＡＤ、ＣＴＥ）、ＴＢＩ、および／もしくはＭＣＩを発生するリスクがある被験体、に関する説明書を含有する。

【0106】

被験体モニタリング
本明細書に記載の診断方法はまた、治療時に障害（たとえば、ＭＣＩ、ＴＢＩ、タウオパチー、たとえば、ＡＤ、ＣＴＥ）の進行をモニターするために、または治療用化合物の投与量を決定するために、使用可能である。一実施形態では、たとえばｃｉｓまたはｔｒａｎｓコンフォメーションのｐＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフを有するポリペプチド（例えばｐＴ２３１−ｔａｕ）のレベルは、障害を診断し、障害の治療もしくは管理をモニターする方法として、繰返し測定される。被験体における障害の進行をモニターするために、いくつかの時間点で被験体サンプルを取得し、次いで、比較しうる。たとえば、診断方法を用いて、治療前、治療時、治療後、被験体をモニターすることが可能である。この例では、本発明に係るコンフォメーション特異的抗体を用いて、被験体においてｃｉｓコンフォメーションのｐＴ２３１−ｔａｕのレベルを厳密にモニターし、ｃｉｓコンフォメーションのｐＴ２３１−ｔａｕのレベルが治療時に減少し始めたら、障害を治療するための治療レジメンを、臨床医により決定されるように変更可能である（たとえば、治療剤の投与量を変化させたり、または異なる治療剤を投与したりしうる）。本発明に係るモニター方法はまた、たとえば、被験体において特定の薬剤または療法の有効性を評価したり、投与量を決定したり、または感染の進行、状態、もしくは病期を評価したりするのに使用されうる。

【実施例】

【0107】

実施例１：ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発生およびそれらのＤＮＡ配列の決定
ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕマウスｍＡｂを発生するために、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４９：２３２−２４４，２０１２に記載されるように、７４％のｃｉｓ ｐＴ２３１−Ｐｉｐ ｔａｕペプチドを用いてマウスを免疫した。この手順により４８０のハイブリドーマクローンを産生し、次いで、特徴付けた。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４９：２３２−２４４，２０１２に記載されるｃｉｓ（ｐＴ２３１−Ｄｍｐ）もしくはｔｒａｎｓ（ｐＴ２３１−Ａｌａ）にロックされた野生型ｃｉｓ＋ｔｒａｎｓ（ｐＴ２３１−Ｐｒｏ）または非リン酸化（Ｔ２３１−Ｐｒｏ）であるｐＴ２３１−ｔａｕペプチドを用いてＥＬＩＳＡによりスクリーニングされた最初の９６のハイブリドーマ培養上清のうち、野生型およびｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕペプチドを認識したが、ｔｒａｎｓも非リン酸化も認識しなかった２つのｃｉｓハイブリドーマクローン＃１１３および＃７４を同定し（図３Ａ、３Ｂ）、野生型およびｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕペプチドを認識したが、ｃｉｓも非リン酸化も認識しなかった２つのｔｒａｎｓハイブリドーマクローン＃２５および＃６９を同定した（図３Ｃ）。ｍＡｂの重鎖および軽鎖のＣＤＲを含む核酸配列およびタンパク質配列を以下に示す。さらに、不活性Ｃｐｄ１Ａを対照として、Ｐｉｎ１阻害剤Ｃｐｄ１およびそれほど活性でない１Ｅで処理された細胞内で、ｃｉｓ ｍＡｂ＃１１３およびｔｒａｎｓ ｍＡｂ＃２５により検出したとき、ｃｉｓは安定であったが、ｔｒａｎｓは減少した（図３Ｄ）。図３Ｅは、アイソタイプ決定ＥＬＩＳＡキット（Ｅａｇｌｅ）を用いて決定したとき、ｍＡｂのＩｇＧのサブクラスを示している。ｍＡｂの重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列は、Ｂｒａｄｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ １６：４６５−４７５，１９９５に記載の５’ＲＡＣＥ ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて決定された。ＢＬＡＳＴ検索から、これらの４つのｍＡｂクローンが完全に新規であることが示された。予測タンパク質配列は、フレームワーク領域では高度に保持されているが、相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３では明確に異なる（図８および９）。とくに、２つのｃｉｓ ｍＡｂクローンは、２つのｔｒａｎｓ ｍＡｂ中には存在しないいくつかの保存残基を含有した。また、その逆も同様であった（図８および９）。

【0108】

実施例２：ｔｒａｎｓではなくロバストなｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕが、ＭＣＩ／ＡＤおよびＣＴＥの脳において軸索に初期に現れ、病気の進行に伴ってさらに蓄積した
ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕがＡＤおよびＣＴＥの脳においていつどこで現れるかを調べるために、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｍＡｂ、続いて、アイソタイプ二次抗体を用いて、脳セクションの二重免疫染色を行った。ｔｒａｎｓ ｍＡｂは、正常脳でさえも少数のニューロンの細胞体でのみ染色し、ｃｉｓ ｍＡｂは、正常脳を染色しなかったが、ＭＣＩニューロンの直線状神経突起でロバストにシグナルが検出とれ、さらにＡＤニューロンの歪んだ神経突起に蓄積し局在した（図４Ａ〜４Ｃ）。注目すべきことに、このパターンは、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ １４９：２３２−２４４，２０１２）に記載のポリクローナルｃｉｓおよびｔｒａｎｓ抗体により検出されたものに類似しており、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｍＡｂの特異性が確認されるだけでなく、ヒトＭＣＩおよびＡＤにおいて初期病原性コンフォメーションを標的とするのはｔｒａｎｓではなくｃｉｓであることが示唆される。Ｄｒ．ＭｃＫｅｅ（Ｌｉｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ １６０：３０２−３０７，２０１０、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３：３９５１−３９６２，２０１３）により提供された８名の運動家および８名の退役軍人に関連するＣＴＥの染色脳セクションから、ｔｒａｎｓではなくロバストなｃｉｓ ｐ−ｔａｕが、ＩＩ期に神経突起で容易に検出され、ＩＩＩ期にさらに蓄積したことが示された（図４Ｄ〜４Ｉ）。これらのｃｉｓ陽性神経突起は、軸索マーカー神経細線維または樹状突起マーカーＭＡＰ２と共染色することにより、軸索であることが確認された。注目すべきことに、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐ−ｔａｕの両方を有しているニューロンは非常に稀であったので、それらはｉｎ ｖｉｖｏで容易に相互変換されることが裏付けられる。したがって、ｃｉｓは、ＡＤおよびＣＴＥにおいてごく初期に現れる。

【0109】

実施例３：ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｍＡｂは、ニューロンに進入してさまざまなニューロン区画に達し、ｃｉｓ ｍＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでｐＴ２３２依存的にｔａｕレベルを低減した
ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｍＡｂがニューロンに進入して予想されたニューロン区画に達することが可能であるかを調べるために、ヒトＳＹ５Ｙニューロンをｔａｕ、ｐ２５／Ｃｄｋ５（ｔａｕキナーゼ）、またはベクター対照でトランスフェクトし、続いて、培養培地にｍＡｂを４８時間添加し、その後、二次抗体または免疫ブロッティングのみを用いて免疫染色した。ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｍＡｂは両方とも、ニューロンだけでなく、さまざまなニューロン区画で容易に検出された。ｃｉｓ ｍＡｂは、神経突起で主に検出されたが、ｔｒａｎｓ ｍＡｂは、ＭＣＩおよびＡＤの脳で予想されるとおり（図４）、細胞体で主に検出された（図５Ａおよび５Ｂ）。さらに興味深いことに、ｃｉｓ ｍＡｂは、ｐ２５／Ｃｄｋ５過剰発現後にのみ、内因性および外因性のｔａｕの全レベルを有意に低減し、ｔａｕ Ｔ２３１Ａ突然変異体には明らかな影響を及ぼさなかった（図５Ｃ）。また、ヒト野生型Ｔａｕ−Ｔｇマウス海馬スライスの培養培地にｃｉｓ ｍＡｂを添加したところ、ｔａｕレベルが劇的に低減した（図５Ｄ）。それに加えて、ＳＹ５Ｙニューロンを外傷性脳傷害（ＴＢＩ）に類似したストレス条件である血清枯渇に付した時、ＳＹ５Ｙニューロンにおいて、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕが、血清枯渇により時間依存的に顕著に増加したが、そのような増加は、ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｍＡｂにより効率的に抑止されたことが判明した（図５Ｅ）。したがって、ｃｉｓ ｍＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでｔａｕレベルを低減した。

【0110】

実施例４：ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｍＡｂが、ニューロンにおいてｐ−ｔａｕにより誘導される微小管破壊および神経毒性を強力に抑制した
ｃｉｓ ｍＡｂが、微小管破壊および神経毒性を誘導するｐ−ｔａｕの能力に影響を及ぼしうるか調べるために、ＳＹ５Ｙ細胞をｐ２５／Ｃｄｋ５、ｔａｕ、およびＧＦＰで共トランスフェクトし、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ ｍＡｂを４８〜７２時間添加し、続いて、チューブリンおよびＤＮＡの免疫染色を行った（図６Ａ）。それに加えて、ＳＹ５ＹニューロンをＣｄｋ５−ｐ２５およびＧＦＰ−ｔａｕまたはそのＴ２３１Ａ突然変異体で共トランスフェクトし、次いで、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ ｍＡｂを添加し、続いて、細胞形態および神経毒性を調べるために生細胞共焦点イメージングを行った（図６Ｂおよび６Ｃ）。両方のアッセイから、ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｍＡｂが、ニューロンにおいてｐ−ｔａｕにより誘導される微小管破壊（図６Ａ）および神経毒性（図６Ｂおよび６Ｃ）を強力に抑制することが明確に示された。ほとんどのＧＦＰ−ｔａｕ陽性細胞は、対照細胞およびｔｒａｎｓ ｍＡｂ処理細胞において死滅し、微小管（ＭＴ）ネットワークは、核の周りに圧潰された（図６Ａ）。ほとんどのｃｉｓ ｍＡｂ処理ＧＦＰ−ｔａｕ陽性細胞は、神経突起のＭＴネットワークでさえも、良好に生存した図６Ｂ、図６Ｃの矢印）。培養培地に添加した時、ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｍＡｂはまた、血清枯渇により誘導されるＳＹ５ＴＹニューロンの微小管破壊および神経毒性を効率的に抑制した（図６Ｄおよび６Ｅ）。

【0111】

実施例５：ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕは、ＡＤ患者において細胞外脳脊髄液（ＣＳＦ）に顕著に存在する
ＣＳＦ ｐＴ２３１−ｔａｕは、初期ＡＤバイオマーカーである。ＣＳＦ ｐＴ２３１−ｔａｕのコンフォメーションをアッセイするために、ＣＳＦにおいて、検出抗体としてｃｉｓまたはｔｒａｎｓ Ａｂを用いてＩＮＮＯＴＥＳＴ ｈＴａｕ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）によりｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを測定した。８つすべての対照ＣＳＦにおいて、検出可能なｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕは存在しなかったが、８つののうちの３つで少量のｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕが検出された（図７Ａ）。これは、ｔｒａｎｓが神経原線維の縺れ（ＮＦＴ）に関連していないので、予想されうることである。注目すべき点として、進行性ＡＤ患者では、ｔｒａｎｓおよびとくにｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕは、脳組織（図４）で見られるものに一致して、顕著に増加した（図７Ａ）。さらに、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓのレベルには広範な個体間変動が存在したが、ｃｉｓ：ｔｒａｎｓの比は、ＡＤ患者間で非常に類似していた（図７Ｂ）。

【0112】

実施例６：ＴＢＩマウスモデルにおいて脳傷害およびその広がりを停止するｃｉｓ ｔａｕ ｍＡｂの能力および顕著なＴＢＩを有する患者を同定する血清中ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕレベルの能力の評価
Ｐｉｎ１触媒コンフォメーション変化を可視化するために、第一ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ抗体を形成する革新的ペプチド化学を開発した（図１１）。注目すべきことに、ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕは、ＭＣＩニューロンに初期に現れ、さらに、ＡＤの進行に伴って変性ニューロンのみの軸索中に蓄積し、認知障害と良好に相関する。さらに、ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕは、その正常微小管集合能力を喪失させ、毒性機能を取得し、脱リン酸化および分解に耐性であり、かつ凝集を起こしやすい（図１１）。したがって、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕは、ＭＣＩおよびＡＤにおいて初期病原性イベントである。発明者は、この度、ニューロンさらにはマウスＴＢＩ脳においてそれぞれのｐ−ｔａｕ異性体を排除するのにきわめて有効な中和ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を開発した。

【0113】

単一重篤ＴＢＩマウスを治療すべくｃｉｓ ｔａｕ ｍＡｂを用いて得られた我々の有望な有効性の結果を考慮して、発明者は、脳、ＣＳＦ、および血清中のｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを追跡し、ｃｉｓ ｍＡｂ治療後の種々の時点で行動および病理学的変化との関係を調べることにより、さまざまな重症度で繰り返された温和なＴＢＩのマウスモデルにおいて、脳傷害およびその広がりを停止するｃｉｓ ｔａｕ ｍＡｂの能力およびその投与要件を体系的に評価した。

【0114】

血清中ｔａｕレベルがＴＢＩ重症度３８〜４１と相関すると思われること、および我々の暫定的結果から、ｔｒａｎｓを対照として用いて、ｃｉｓ ｐ−ｔａｕが全ｔａｕよりも良好なバイオマーカーでありうることを考慮して、発明者は、重篤なＴＢＩ直後の３０〜５０名の患者および対応する対照において、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐ−ｔａｕならびに全ｔａｕをアッセイする我々のＥＬＩＳＡをさらに改善する。これは、最終的には、ｃｉｓ ｔａｕ ｍＡｂ療法でＴＢＩ患者を同定するための感度の高い方法を提供できる可能性がある。

【0115】

予想される結果として、革新的なコンフォメーション特異的バイオマーカーが得られ、タウオパチーにおいてごく初期に分泌される毒性ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕに対するおよび免疫療法がもたらされ、ＴＢＩ、ＣＴＥ、およびＡＤ患者において初期段階でタウオパチーおよび記憶喪失を停止または防止するユニークな機会が得られるであろう。

【0116】

実施例７：ｃｉｓ ｍＡｂは、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ誘導を効率的に排除するだけでなく、種々のニューロンストレス下で、軸索微小管破壊、ミトコンドリア輸送障害、および最終的にはアポトーシスを誘導する能力を中和する
発明者は、生（緑色）／死（赤色）細胞アッセイキット（Ａｂｃａｍ）およびアネキシン５ＦＡＣＳ（図１２Ａ〜１２Ｅ）より示されるように、低酸素や栄養枯渇などの種々のニューロンストレスが時間依存的にｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕをロバストに誘導し、次いで、ＭＴネットワークの破壊および最終的にアポトーシスによる細胞死を誘導することを見いだした。また、我々の生細胞ビデオ撮影から、時間依存的ＭＴ破壊およびミトコンドリアの軸索輸送の異常（データは示されていない）が確認された。注目すべき点として、ｃｉｓ ｍＡｂ治療は、ｃｉｓ ｐ−ｔａｕ誘導をほぼ完全に排除し、さらに軸索ＭＴ破壊、ミトコンドリア輸送障害、およびアポトーシスを効率的にレスキューし、一方、ｔｒａｎｓ ｍＡｂは、ｔｒａｎｓ ｐ−ｔａｕを除去し、クロス枯渇を伴うことなく表現型を促進した（図１２）。アポトーシスを誘導するｃｉｓ ｐ−ｔａｕの能力は、カスパーゼおよびアポトーシスがヒトＡＤニューロンに存在するというこれまでの証拠と一致する（Ｇｅｒｖａｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９７：３９５−４０６，１９９９）。同様に、ｃｉｓ ｐ−ｔａｕを排除するｃｉｓ ｍＡｂの能力は、ｃｉｓ ｐ−ｔａｕがｔｒａｎｓよりも安定であり（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４９：２３２−２４４，２０１２）、タンパク質分解のために抗体複合体がＴＲＩＭ２１により認識される（Ｍａｌｌｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０７：１９９８５−１９９８５９０，２０１０；ＭｃＥｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ３３：８０３−８０９，２０１１）という我々の知見と一致する。

【0117】

実施例８：ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｍＡｂは、ストレスを受けたニューロンから分泌されるｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕがレシピエントニューロンにおいて神経毒性を誘導するのを効率的に防止した
ＡＤ患者のＣＳＦには豊富なｐＴ２３１−ｔａｕが存在し、培養ニューロンは非従来的機序で培地中にｔａｕを分泌するので、発明者は、ニューロンがストレスを受けてｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐ−ｔａｕを分泌するかを調べた。実際に、ストレスを受けたニューロンは、４０ｈｒでｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを分泌したが、ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを分泌しなかった。７２ｈｒで細胞死となり、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ ｐ−ｔａｕの両方さらにはアクチンが放出され時（図１３Ａ）。より重要なこととして、健常ニューロンに３日間添加した時、ｃｉｓ含有培地は、アポトーシスによりニューロンを死滅させた。ｔｒａｎｓ ｍＡｂではなくｃｉｓ ｍＡｂによる培地の前処理、続いて、プロテインＧによるｍＡｂの枯渇を行ったところ、ニューロン死は完全にレスキューされた（図１３Ｂ）。

【0118】

実施例９：ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｍＡｂは、ヒトＡＤまたはＣＴＥ脳溶解物がレシピエントニューロンにおいて神経毒性を誘導するのを効率的に防止した
また、ヒトＡＤ脳が毒性ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを含有していたか調べるために、発明者は、ヒトＡＤ脳溶解物を培養ニューロンに添加し、レシピエントニューロンにおいてｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを検出した。ただし、対照脳溶解物を使用した時、ｃｉｓ−ｔａｕを添加しなかった。より重要なこととして、正常ではなくＡＤの脳溶解物は、レシピエントニューロンにおいてアポトーシスを誘導する。これは、ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｍＡｂでＡＤ脳溶解物を前処理することにより完全にレスキューされた（図１４）。ヒトＣＴＥ脳溶解物を用いた場合にも、類似の結果が得られた。

【0119】

実施例１０：ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕは、ＴＢＩの重症度に伴って増加し、ＴＢＩマウス脳において縺れ関連エピトープのかなり前に軸索に現れる
ｃｉｓ ｐ−ｔａｕとＴＢＩ重症と度の関係を調べるために、発明者は、スポーツ関連ＴＢＩを模倣して、マウスにおいてさまざまな高さで落錘デバイスを用いてさまざまな重症度の閉鎖性頭部脳傷害を誘導し、ＴＢＩの４８ｈｒ後、脳内のｃｉｓ ｐ−ｔａｕを試験した。ＴＢＩの４８ｈｒ後、ＴＢＩ重症度に伴って、ｃｉｓおよび全ｔａｕは、ロバストに増加した（図１５Ａ）。これは、ｃｉｓ ｐ−ｔａｕが分解に対して耐性があるという我々の知見と一致する。ロバストなｃｉｓ ｐ−ｔａｕはまた、軍事関連ＴＢＩを模倣して爆風誘導ＴＢＩの４８ｈｒ後に見いだされた。時間経過研究から、重篤なＴＢＩ後、驚くべきことに、１２ｈｒｓ後、ｔｒａｎｓではなくｃｉｓ ｐ−ｔａｕは誘導され、時間と共に増加し、少なくとも２週間維持された（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。ｃｉｓ陽性神経突起は、この場合も、樹状突起ではなく軸索であった。注目すべきことに、発明者は、ＡＴ８、ＡＴ１８０、ＴＧ３、ＡＴ１００、ＭＣ１、Ａｌｚ５０、またはＰＨＦ１を含めて、使用したｍＡｂにより、縺れ関連エピトープをなんら見いだすことができなかった（図１５Ｄ）。仮に見いだされたとしても、ＷＴマウスでは、ＴＢＩのかなり後である。

【0120】

実施例１１：ｃｉｓ ｍＡｂは、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕを排除するだけでなく、マウスにおいて重篤ＴＢＩ後、軸索ＭＴ破壊、ミトコンドリア輸送障害、アポトーシスおよび脳機能などを回復した
ｃｉｓ ｍＡｂがＴＢＩマウス脳においてｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕおよびその毒性を導入し排除するかを調べるために、発明者は、最初に、ビオチン化ｃｉｓ ｍＡｂをＢ６マウスの腹腔内または静脈内に投与し、３日後ｃｉｓ ｍＡｂを検出した。注入されたｍＡｂは、脳内で容易に検出された（図９Ａ）。次いで、重篤なＴＢＩ後、４日ごとに２５０μｇのｃｉｓ ｍＡｂを用いて３回にわたりマウスを腹腔内治療しに、１４日後、脳を分析した。注目すべき点として、ｃｉｓ ｍＡｂは、マウス脳においてＴＢＩ誘導ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕ誘導を効率的に防止し、全ｔａｕを低減した（図９Ｂ）。さらに、ｃｉｓ ｍＡｂ治療は、ＰＡＲＰ切断アッセイにより評価したとき、軸索ＭＴ破壊およびミトコンドリア破壊（図１０Ａ）さらにはアポトーシスでさえも効率的に回復したが（図９Ｃ）、対照ＩｇＧではそうはならなかった。

【0121】

ｃｉｓ ｍＡｂが重篤ＴＢＩ後に脳機能を回復したか調べるために、高架式十字迷路を使用した。これは、マウスにおいて不安関連強迫行動をアッセイするために広範に使用される。重篤ＴＢＩの２ヶ月後、ＩｇＧで治療されたマウスは、クローズドアーム活動の減少およびオープンアーム活動の増加を示し、不安関連強迫行動が現れたことから、前頭皮質関連機能不全が示唆されるが、ｃｉｓ ｍＡｂで治療されたマウスおよびｓｈａｍｅマウスは、有意差がなかったことから（図１０Ｂ）、ｃｉｓ ｍＡｂはＴＢＩ誘導脳機能を回復可能であることが示唆される。したがって、ｃｉｓ ｍＡｂは、ニューロンおよびＴＢＩのマウスモデルにおいて、ｃｉｓ ｐ−ｔａｕおよびその神経毒性の排除、ならびに脳機能の回復にきわめて効果的である。これは、ｔａｕ ｍＡｂが脳のニューロンに進入可能であること（Ｙａｎａｍａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ８０（２）：４０２−４１４，２０１３、Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２：５９，２０１１、Ｍｏｈａｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ６９：１１０−１１６，２００２）、およびｍＡｂが細胞内で標的分解をトリガー可能であること（Ｍａｌｌｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０７：１９９８５−１９９８５９０，２０１０、ＭｃＥｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ３３：８０３−８０９，２０１１）が示唆されるこれまでの研究と一致する。

【0122】

他の実施形態
以上の説明から、種々の使用法および条件に合わせて本明細書に記載の発明に変更および修正を加えうることは、明らかであろう。そのような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内にある。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）配列番号１〜３を有する１つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号４〜６を有する１つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む、単離されたコンフォメーション特異的結合部分、任意選択で、抗体またはモノクローナル抗体。
（２）前記結合部分が、配列番号１〜３を有する２つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号４〜６を有する２つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む、（１）に記載の単離された結合部分。
（３）前記結合部分が、配列番号１〜３を有する重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号４〜６を有する軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む、（１）に記載の単離された結合部分。
（４）前記モノクローナル抗体が、配列番号２２の重鎖タンパク質配列と、配列番号２３の軽鎖タンパク質配列と、を含む、（１）に記載の単離された結合部分。
（５）配列番号７〜９を有する１つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１０〜１２を有する１つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む、単離されたコンフォメーション特異的結合部分、任意選択で、抗体またはモノクローナル抗体。
（６）前記結合部分が、配列番号７〜９を有する２つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１０〜１２を有する２つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む、（５）に記載の単離された結合部分。
（７）前記結合部分が、配列番号７〜９を有する重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１０〜１２を有する軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む、（５）に記載の単離された結合部分。
（８）前記モノクローナル抗体が、配列番号２４の重鎖タンパク質配列と、配列番号２５の軽鎖タンパク質配列と、を含む、（１）に記載の単離された結合部分。
（９）前記結合部分が、リン酸化トレオニン２３１−タウタンパク質（ｐＴ２３１−ｔａｕ）のｃｉｓコンフォメーションに特異的に結合する、（１）〜（８）のいずれか一に記載の単離された結合部分。
（１０）前記モノクローナル抗体が一本鎖抗体または抗体フラグメントである、（１）〜（８）のいずれか一に記載の単離された結合部分。
（１１）前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、（１０）に記載の単離された結合部分。
（１２）（１）〜（１１）のいずれか一に記載の結合部分と、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物。
（１３）タウオパチー、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、または脳卒中を治療する方法であって、前記方法が、必要とされる被験体に、前記タウオパチー、ＴＢＩ、または脳卒中を治療するのに十分な量で、（１）〜（８）のいずれか一に記載の結合部分を投与することを含み、前記結合部分が、ｐＴ２３１−ｔａｕのｃｉｓコンフォメーションに特異的に結合する、方法。
（１４）前記タウオパチーが、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性、リティコ・ボディグ病、縺れ優位認知症、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ピック病、皮質基底核変性症、およびアルツハイマー病からなる群から選択される、（１３）に記載の方法。
（１５）前記被験体が、前記タウオパチーの素因を有するかまたは初期段階にある、（１３）に記載の方法。
（１６）前記タウオパチーの素因または初期段階が、前記被験体から得られたサンプルでｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕのレベルの上昇またはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比の増加により決定される、（１５）に記載の方法。
（１７）ＣＳＦ ｔ−ｔａｕ、ｐＴ１８１−ｔａｕ、Ａβ４２、またはＡｐｏＥ４のレベルを決定することをさらに含む、（１６）に記載の方法。
（１８）前記サンプルが、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水、および脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群から選択される、（１６）に記載の方法。
（１９）前記被験体が、繰り返された脳外傷の病歴により素因が与えられる、（１３）に記載の方法。
（２０）（１）〜（８）のいずれか一に記載の結合部分を用いて治療された被験体において治療反応をモニターする方法であって、ａ．前記被験体から得られたサンプルでｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕのレベルまたはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比を決定することと、任意選択で、ｂ．ＣＳＦ ｔ−ｔａｕ、ｐＴ１８１−ｔａｕ、Ａβ４２、またはＡｐｏＥ４のレベルを決定することと、を含み、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕのレベルまたはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比の減少が、前記結合部分に有効な治療反応をもたらす、方法。
（２１）ＣＳＦ ｔ−ｔａｕ、ｐＴ１８１−ｔａｕ、Ａβ４２、またはＡｐｏＥ４の前記レベルが減少する、（２０）に記載の方法。
（２２）タウオパチーを有するまたはその素因を有するとして被験体を診断する方法であって、ａ．前記被験体から得られたサンプルでｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕのレベルまたはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比を決定することと、ｂ．前記サンプルのｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの前記レベルまたはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比を正常参照サンプルと比較することであって、前記正常参照サンプルと比較して、ｃｉｓ ｐＴ２３１−ｔａｕのレベルの上昇またはｃｉｓ：ｔｒａｎｓ ｐＴ２３１−ｔａｕの比の増加が、前記タウオパチーを有するまたはその素因を有するとして前記被験体を診断することにつながる、比較することと、ｃ．前記タウオパチーを治療するのに十分な量で、（１）〜（８）のいずれか一に記載の結合部分を、前記被験体に投与することと、を含む、方法。
（２３）前記サンプルが、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水、および脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群から選択される、（２０）または（２２）に記載の方法。
（２４）配列番号１３〜１５を有する１つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１６〜１８を有する１つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む、単離されたコンフォメーション特異的結合部分、任意選択で、抗体またはモノクローナル抗体。
（２５）前記結合部分が、配列番号１３〜１５を有する２つ以上の重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１６〜１８を有する２つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む、（２４）に記載の単離された結合部分。
（２６）前記結合部分が、配列番号１３〜１５を有する重鎖可変領域またはその変異体と、配列番号１６〜１８を有する軽鎖可変領域またはその変異体と、を含む、（２４）に記載の単離された結合部分。
（２７）前記モノクローナル抗体が、配列番号２６の重鎖タンパク質配列と、配列番号２７の軽鎖タンパク質配列と、を含む、（２４）に記載の単離された結合部分。
（２８）配列番号１９〜２１を有する１つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体を含む、単離されたコンフォメーション特異的結合部分、任意選択で、抗体またはモノクローナル抗体。
（２９）前記結合部分が配列番号１９〜２１を有する２つ以上の軽鎖可変領域またはその変異体を含む、（２８）に記載の単離された結合部分。
（３０）前記結合部分が配列番号１９〜２１を有する軽鎖可変領域またはその変異体を含む、（２８）に記載の単離された結合部分。
（３１）前記モノクローナル抗体が配列番号２８の軽鎖タンパク質配列を含む、（２８）に記載の単離された結合部分。
（３２）前記結合部分がｐＴ２３１−ｔａｕのｔｒａｎｓコンフォメーションに特異的に結合する、（２４）〜（３１）のいずれか一に記載の単離された結合部分。
（３３）前記モノクローナル抗体が一本鎖抗体または抗体フラグメントである、（２４）〜（３１）のいずれか一に記載の単離された結合部分。
（３４）前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、（３３）に記載の単離された結合部分。
（３５）（２４）〜（３４）のいずれか一に記載の結合部分と、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物。
（３６）ａ．ｐＴ２３１−ｔａｕのｃｉｓコンフォメーションに特異的に結合する、（１）〜（８）のいずれか一に記載の結合部分と、ｂ．ｐＴ２３１−ｔａｕのｔｒａｎｓコンフォメーションに特異的に結合する、（２４）〜（３１）のいずれか一に記載の結合部分と、ｃ．タウオパチーを有するまたはその素因を有するとして被験体を診断するためのａ．およびｂ．の結合部分を使用するための説明書と、を含む、タウオパチーを有するまたはその素因を有するとして被験体を診断するためのキット。

【0123】

本明細書に挙げた出版物、特許出願、および特許はすべて、あたかも個々の出版物、特許出願、または特許が具体的かつ個別的に明示されて参照により組み込まれたのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

【0124】

以上の説明から、当業者であれば、本発明の本質的特性を容易に確認することが可能であり、種々の使用法および条件に合わせて本発明に種々の変更および修正を加えることが可能である。したがって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲以内にある。

【図1】

【図2】

【図3A-E】

【図4A-I】

【図5A-E】

【図6A-E】

【図7A-B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A-E】

【図13A-B】

【図14】

【図15A-D】

【図16A-C】

【図17A-B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]