特許 6449216 ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ａｌｐｅｓｔｒｉｓ）の地上部のアルコール抽出物、その生産方法、およびそれを含む化粧用または皮膚科用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6449216

(24)【登録日】2018年12月14日

(45)【発行日】2019年1月9日

(54)【発明の名称】ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ａｌｐｅｓｔｒｉｓ）の地上部のアルコール抽出物、その生産方法、およびそれを含む化粧用または皮膚科用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/9789 20170101AFI20181220BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20181220BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20181220BHJP

   A61K 36/28 20060101ALI20181220BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20181220BHJP

   A61P 17/18 20060101ALI20181220BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/9789

   A61Q19/02

   A61Q19/08

   A61K36/28

   A61P17/16

   A61P17/18ZNA

【請求項の数】20

【外国語出願】

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2016-228983(P2016-228983)

(22)【出願日】2016年11月25日

(65)【公開番号】特開2017-105761(P2017-105761A)

(43)【公開日】2017年6月15日

【審査請求日】2018年2月23日

(31)【優先権主張番号】1561400

(32)【優先日】2015年11月26日

(33)【優先権主張国】FR

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】508283406

【氏名又は名称】シャネル パフュームズ ビューテ

(73)【特許権者】

【識別番号】513148473

【氏名又は名称】セントレ ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ サイエンティフィック‐セエンエールエス‐

(73)【特許権者】

【識別番号】516355391

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ド ニース ソフィア アンティポリ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100128761

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 恭子

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ホルデリス セルジュ

(72)【発明者】

【氏名】トゥロムール アネ

(72)【発明者】

【氏名】ベルリン イリナ

(72)【発明者】

【氏名】フェルナンデ ザヴィエル

(72)【発明者】

【氏名】キャサル アレクサンドル

(72)【発明者】

【氏名】グリラリ ヨハネス

(72)【発明者】

【氏名】ラーメルマン インゴ

(72)【発明者】

【氏名】グルバー フローリアン

(72)【発明者】

【氏名】ナルツ マリー−ソフィー

【審査官】 田中 雅之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５１１５６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０７２９２３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５０７０１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０００４３０２（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ８／００− ８／９９

Ａ６１Ｑ １／００−９０／００

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／０６

Ａ６１Ｋ ３６／０７−３６／９６０８

Ａ６１Ｐ １７／１６

Ａ６１Ｐ １７／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下のステップ、
ａ）ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部を少なくとも１種類のアルコール溶媒で抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた前記混合物を少なくとも１０時間インキュベートするステップと、
ｃ）ｂ）で得られた前記インキュベートされた混合物をろ過するステップと、
ｄ）得られた前記ろ液から前記溶媒を除去し、次いで、ステップａ）で用いられる前記少なくとも１種類のアルコール溶媒と異なる他のアルコール溶媒に最終希釈するステップと
を含む、方法によって入手可能なソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。

【請求項2】

ステップａ）の前記アルコール溶媒は、１個から４個までの炭素原子を含む一価アルコールであることを特徴とする、請求項１に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。

【請求項3】

ステップａ）の前記アルコール溶媒はエタノールであることを特徴とする、請求項１または２に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。

【請求項4】

ステップａ）の前記抽出は、２から６時間の間の時間にわたって、４０℃から６０℃の間の温度で実行されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。

【請求項5】

前記地上部は、花、葉、茎およびその混合物から選択されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。

【請求項6】

ステップｂ）の前記インキュベーションは、１２時間から３０時間の間の時間にわたって、２℃から１０℃の間の温度で実行されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。

【請求項7】

ステップｃ）およびｄ）の間に、ｃ）で得られた前記ろ液を漂白するステップを追加することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。

【請求項8】

漂白が活性炭に吸着させることにより行われ、続いて脱色されたろ液をろ過するステップが行われる、請求項７に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。

【請求項9】

ステップｄ）の前記除去は蒸発によって行われ、次いで、最終希釈が１，３−プロパンジオールで実行されることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。

【請求項10】

以下のステップ、
ａ）予め乾燥させてすりつぶした、ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の花、葉および茎の混合物を４０℃から６０℃の間の温度で、２時間から５時間、エタノールで抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた前記混合物を少なくとも１２時間、２℃から６℃の間の温度でインキュベートするステップと、
ｃ）ｂ）で得られた前記インキュベートされた混合物をろ過して、ろ液を得るステップと、
− ｃ）で得られた前記ろ液を活性炭に吸着させることにより漂白するステップと、次いで
− 前記脱色されたろ液を２０μｍ膜でろ過するステップと、
ｄ）得られた前記ろ液から蒸発によって前記エタノールを除去し、次いで１，３−プロパンジオールに最終希釈するステップと
を含む、方法によって得ることができることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。

【請求項11】

以下のステップ、
ａ）ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部を少なくとも１種類のアルコール溶媒で抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた混合物を少なくとも１０時間インキュベートするステップと、
ｃ）ｂ）で得られたインキュベートされた混合物をろ過するステップと、
ｄ）ｃ）で得られた混合物から溶媒を除去し、次いで、ステップａ）で用いられる前記少なくとも１種類のアルコール溶媒と異なる他のアルコール溶媒に最終希釈するステップと
を含む、ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部を抽出する方法。

【請求項12】

請求項１から１０のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を含む、老化による皮膚の変化を予防および／または軽減するための薬剤。

【請求項13】

請求項１から１０のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を含む、脱色素剤。

【請求項14】

請求項１から１０のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を含む、皮膚の微小循環を改善するための薬剤。

【請求項15】

請求項１から１０のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を含む、抗酸化剤。

【請求項16】

化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル中に、請求項１から１０のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を含む、化粧用または皮膚科用組成物。

【請求項17】

局所経路による施用に適していることを特徴とする、請求項１６に記載の化粧用または皮膚科用組成物。

【請求項18】

請求項１から１０のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を含む、上皮を再生するための薬剤。

【請求項19】

請求項１から１０のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を含む、皮膚の色および／または輝きおよび／または血色の均一性を改善するための薬剤。

【請求項20】

請求項１から１０のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を含む、くすんだおよび／または輝きのない皮膚の外観を予防し、皮膚に滑らかで輝きのある血色を与えるための薬剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部の抽出物、その生産方法、それを含む化粧用または皮膚科用組成物、ならびにさまざまな化粧品としての使用に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚は、表面に最も近い方から順に、上皮、真皮および皮下組織である、主に３つの層から成る。
上皮は皮膚の保護に大きく貢献し、皮膚の適切な機能を維持する。

【0003】

皮膚の老化および光老化、ならびにそれに関連する変化は、さまざまに現れる場合があり、これらの中で
− 上皮および／または真皮のレベルでの組織の損失による、堅さおよび弾力性の消失、
− 上皮のレベルでの微小循環の減少および細胞再生の遅れによる、輝きの消失
− 色素斑の出現、および／または
− 角質層におけるバリア機能の衰退および表皮再生の遅れに起因する乾燥肌
を挙げることができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

したがって、老化および／または老化と関連がある生理的機構の変化による皮膚の変化の一連の原因に働きかけることができる、多機能性で活性のある薬剤を提供する必要がある。

【0005】

今回、本出願人は、特定の方法によって得られたソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物が、生理的機構の刺激または阻害によって、皮膚の老化ならびに皮膚の色素沈着および微小循環に関して興味深い効果を示すことを見つけた。実際に、例によって実証されたように、本発明に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物は、興味深い化粧品特性をもつ。特に抗ＭＭＰ３および抗ＭＭＰ９効果によって、皮膚の老化を抑制することができ、抗酸化物質特性をもち、皮膚の微小循環を活性化し、脱色素作用をもつ。複製老化を遅延することができ、乳頭層線維芽細胞の網状層線維芽細胞への移行を防止し、老化マーカーの発現を減少させるので、本発明に記載の抽出物は皮膚の抗老化効果をも有する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

したがって、第１の態様によると、本発明は、以下のステップ、
ａ）ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部を少なくとも１種類のアルコール溶媒で抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた混合物を少なくとも１０時間インキュベートするステップと、
ｃ）ｂ）で得られたインキュベートされた混合物をろ過するステップと、
ｄ）得られたろ液から溶媒を除去し、次いで他のアルコール溶媒に最終希釈するステップと
を含む、方法によって得ることができるソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物に関する。したがって、本出願において、そのような抽出物は、本発明に記載の抽出物と呼ばれる。

【0007】

本発明は、以下のステップ、
ａ）ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部を少なくとも１種類のアルコール溶媒で抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた混合物を少なくとも１０時間インキュベートするステップと、
ｃ）ｂ）で得られたインキュベートされた混合物をろ過するステップと、
ｄ）得られたろ液から溶媒を除去し、次いで他のアルコール溶媒に最終希釈するステップと
を含む、ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部を抽出する方法にも関する。

【0008】

本発明は、化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル中に、本発明に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を含む、化粧用または皮膚科用組成物にも関する。「化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル」は、皮膚、粘膜および付属器官に適合する溶剤を意味する。好ましくは、本発明に記載の化粧用または皮膚科用組成物は、局所経路による施用に適している。

【0009】

本発明に記載の抽出物を得る方法は、したがって、以下のステップ、
ａ）ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部を少なくとも１種類のアルコール溶媒で抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた混合物を少なくとも１０時間インキュベートするステップと、
ｃ）ｂ）で得られたインキュベートされた混合物をろ過するステップと、
ｄ）得られたろ液から溶媒を除去し、次いで他のアルコール溶媒に最終希釈するステップと
を含む。

【発明を実施するための形態】

【0010】

用いる原料は、ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部からなる。

【0011】

ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）はキク科（Asteraceae）の黄色い花の植物であり、プロヴァンス・アルプ・コートダジュール地域圏で特に見られる。ソリダゴ属（Solidago）はキク科（Asteraceae）の一部を形成する。一般にアキノキリンソウ（ソリダゴ（solidago）、ゴールデンロッド（goldenrod）またはゴールデンロッド（golden rod））と呼ばれるソリダゴ・ウィルガウレア種（Solidago virgaurea L）を含む１５６から３７７種までを含む。スモールソリダゴ（Small Solidago）、スモールゴールデンロッド（Small Goldenrod）、またはアルパインゴールデンロッド（Alpine Goldenrod）と呼ばれるソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）（Waldst. & Kit）グレムリ（Gremli）亜種は、ソリダゴ・アルペストリス（Solidago alpestris Waldst. & Kit）という異名をもつ。
直線状で紫色の花茎をもつ、耐寒性草本植物である。葉は、多少毛で覆われ、縁が鋸刃のようになり、単一、互生、卵形および皮針形である。黄色い花は、順番に一つにかたまって配置された６から１２個の花をもつ頭状花序で集合している。７月から９月までに開花する。果実は黄色く円筒形の痩果である。
アルペストリス（alpestris）亜種は、サイズが小さいこと（１ｍに対して５から３０ｃｍ）、頭状花数が少なく、さらに少し大きいこと、および高地に生育するという事実が、主要なソリダゴ・ウィルガウレア（Solidago virgaurea）種とは異なる。亜種のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）は季節の最後に、がれおよび石の斜面に出現する。北ヨーロッパの山岳地帯の、標高１４００から２８００メートルの間に生育する。

【0012】

本発明に記載の目的の亜種とは異なる他の亜種がある。特に、アキノキリンソウ（Solidago virgaurea subsp. asiatica Kitam. ex Hara）があり、アキノキリンソウ（（Solidago japonica var. japonica）および（Solidago japonica Kitam.））の異名をもつ。この亜種アキノキリンソウ（Solidago virgaurea subsp. asiatica Kitam. ex Hara）は３５から８５ｃｍあり、８月から１１月に開花する。それは、日本、韓国、ロシア、中国およびフィリピンに分布する。

【0013】

本発明に従って用いるソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部は、一般的に花、葉、茎およびその混合物から選択される。好ましくは、用いられる地上部は、ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の花、葉および茎の混合物である。好ましくは、これらの地上部をまず乾燥し、次いで通常の方法ですりつぶし、または粉砕する。
ステップａ）において、地上部は、例えば、
− Ｃ_１〜Ｃ_４一価アルコール、例えばメタノール、エタノールまたはイソプロパノール、および
− ジオール、例えばプロピレングリコール、１，３−プロパンジオールまたはジプロピレングリコール、から選択される
１種または複数のアルコール溶媒による抽出にかける。
好ましくは、アルコール溶媒は、２個から４個までの炭素原子を含む一価アルコールであり、より好ましくは、エタノールである。
抽出は、一般に地上部を、１種または複数種の前述の溶媒に、例えば室温から８０℃までの範囲の温度で、約３０分から８時間、浸漬または穏やかに撹拌することによって実行される。好ましくは、ステップａ）の抽出は２から６時間の間の時間にわたって、４０℃から６０℃の間の温度で実行される。

【0014】

ステップａ）で得られた混合物を、次いで少なくとも１０時間インキュベートする。すなわち、これがステップｂ）である。好ましくは、ステップｂ）のインキュベーションは、１２時間から３０時間の間の時間にわたって、２℃から１０℃の間の温度で実行される。より好ましくは、インキュベーションは、１２時間から１５時間、約４℃の温度で実行される。

【0015】

ステップｂ）の最後に得られた、インキュベートされた混合物を、次いでろ過し、不溶性物質を除去する。すなわち、これがステップｃ）である。好ましくは、ｂ）で得られた抽出物のろ過は、１００μｍの膜で実行される。液体のろ液が得られる。

【0016】

最終的に、液体のろ液中に存在する溶媒を除去し、次いでろ液残留物を他のアルコール溶媒で希釈する。すなわち、これがステップｄ）である。ステップａ）で用いられるアルコール溶媒と異なるため、ステップｄ）で用いられるアルコール溶媒は、「他のアルコール溶媒」と呼ばれる。この制限を考慮に入れ、アルコール溶媒は、一般的にステップａ）と同一の群、すなわちＣ_１〜Ｃ_４一価アルコールおよびジオールから選択される。
好ましくは、ステップｄ）の溶媒の除去は、蒸発によって行われる。好ましくは、最終希釈はジオール中であり、好ましくは、１，３−プロパンジオールである。

【0017】

好ましくは、ステップｃ）およびｄ）の間に、ｃ）で得られたろ液を漂白するステップを追加する。漂白は、ろ液中に存在する色素を活性炭に吸着させることによって行ってよい。この漂白ステップに続いて、得られた脱色されたろ液の、特に２０μｍ膜での、ろ過のステップを行ってよい。

【0018】

好ましくは、本発明に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物は、以下のステップ、
ａ）予め乾燥させてすりつぶした、ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の花、葉および茎の混合物を４０℃から６０℃の間の温度で、２時間から５時間、エタノールで抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた混合物を少なくとも１２時間、２℃から６℃の間の温度でインキュベートするステップと、
ｃ）ｂ）で得られたインキュベートされた混合物をろ過して、ろ液を得るステップと、
− ｃ）で得られたろ液を活性炭に吸着させることにより漂白するステップと、次いで
− 脱色されたろ液を２０μｍ膜でろ過するステップと、
ｄ）得られたろ液から蒸発によってエタノールを除去し、次いで１，３−プロパンジオールに最終希釈するステップと
を含む、方法によって得ることができる。

【0019】

有利には、本発明に従って用いる抽出物は透明色である。
さらに、前記抽出物は、エマルションの形の化粧用または皮膚科用組成物において、活性を得るために必要な濃度で通常直面する製剤問題の原因となることなく、および高濃度の場合に通常の方法によって得られた植物抽出物と対照的に暗色にはならずに、使用可能なほど十分に高濃度である。
したがって、本発明に記載の抽出物は、化粧用または皮膚科用組成物を調製するために、直接用いてよい。

【0020】

さらなる態様によると、本発明は、抗酸化物質、および／または脱色素剤、および／または皮膚の微小循環を改善するため、および／または老化による皮膚の変化を予防および／または軽減するための薬剤としての、本発明に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物の化粧品としての使用に関する。

【0021】

実際に、有利なことに、本発明に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物は、特に老化による皮膚の変化に関連する、予防または修復の生理的機構に関していくつかの重要な活性をもつ、ということがわかった。

【0022】

したがって、本発明は、より詳細には、メラニン合成を阻害する薬剤としての、本発明に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物の化粧品としての使用に関する。

【0023】

本発明に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物は、角化細胞によるＶＥＧＦおよびサイトカインＩＬ１αの分泌に関して有利な活性をもつので有利であることもわかった。皮膚において、ＶＥＧＦまたは血管内皮細胞増殖因子は、皮膚血管新生における主要な因子である。上皮は、増殖する角化細胞によって大量に分泌されたＶＥＧＦの重要な供給源である。ＶＥＧＦのｍＲＮＡは、正常な角化細胞によって、組織内のその場および細胞培養の両方で発現される。高齢者においてでさえ、ＶＥＧＦは内皮細胞の恒常性および血管新生刺激に反応する能力を維持することが示された（Watanabe Y. et al., 1997, Oncogene 14:2025-2032頁）。さらに、紫外線放射への曝露後、ＶＥＧＦの減少が観察された（Photochem. Photobiol., 1999; 70(4):674-9頁）。

【0024】

本発明は、ＶＥＧＦの分泌を活性化するための薬剤として、および／または角化細胞によるＩＬ１αの分泌を阻害するための薬剤としての、本発明に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物の使用にも関する。

【0025】

本発明は、より詳細には、特にメタロプロテアーゼ、特にＭＭＰ３およびＭＭＰ９への阻害作用によって、老化による皮膚の変化を予防および／または軽減するための、本発明に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物の化粧品としての使用にも関する。したがって、本発明に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物をマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性を阻害するための薬剤として用いてもよい。マトリックスメタロプロテアーゼは、皮膚の生理的リモデリングに関連して細胞外マトリックスを分解する酵素であるが、年齢および紫外線放射への曝露は、特定のＭＭＰ、特にＭＭＰ３およびＭＭＰ９の活性を高める効果をもつ。その結果、細胞外マトリックスの分解が進み、皮膚組織がたるみ、しわが形成される（Ageing Res. Rev., 2002, 1(4):705-20頁、J. Invest. Dermatol, 2001, 117(5):1218-24頁）。

【0026】

さらなる態様によれば、本発明は、化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル中に、本発明に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を含む、化粧用または皮膚科用組成物にも関する。好ましくは、前記抽出物は、化粧用または皮膚科用組成物中に、組成物の総重量の０．００１から１０％の割合で、組成物の総重量の特に０．０１から１０％、好ましくは、０．１から１０％の割合で存在する。前記化粧用または皮膚科用組成物は、局所経路による施用に特に適していてもよい。

【0027】

有利には、前記化粧用または皮膚科用組成物は、粉末、エマルション、マイクロエマルション、ナノエマルション、懸濁液、溶液、ローション、クリーム、水性ゲルまたは水性アルコールゲル、ムース、セラム、エアロゾル用の溶液または分散液、または脂質小胞の分散液の形態であってよい。

【0028】

エマルションの場合、油中水型または水中油型エマルションであってよい。

【0029】

本発明に記載の化粧用または皮膚科用組成物は、さまざまな成分および投与方法に応じて選択される溶媒を含んでもよい。

【0030】

例として、水（好ましくは脱塩水）、エタノールなどのアルコール、またはエトキシジグリコールまたはジエチレングリコールモノメチルエーテルなどのジエチレングリコールエーテルを挙げることができる。

【0031】

前記化粧品組成物は、この分野で普通の少なくとも１つの添加物、例えば皮膚軟化剤または保湿剤、ゲル化剤および／または増粘剤、界面活性剤、油、活性剤、染料、防腐剤、抗酸化物質、活性剤、有機または無機粉末、日焼け止め剤および香料から選択される少なくとも１つの化合物を含んでもよい。

【0032】

特に、前記組成物は以下を含んでよい。
− 例えばグリセリン、グリコール、ＫＦ６０１１（Ｓｈｉｎ Ｅｔｓｕ）という名称で販売されているような水可溶性シリコーン、およびＲｅｓｐｌａｎｔａホホバ（Ｒｅｓ ｐｈａｒｍａ）という名称で販売されているような水可溶性ホホバから選択することができる、１つまたは複数の皮膚軟化剤または保湿剤。
前記皮膚軟化剤または保湿剤は、組成物の総重量に対して０から３０重量％、好ましくは２から１０重量％程度の含有量で、組成物中に存在することができる。
− 例えば、セルロース誘導体、植物由来のゴム（グアー、イナゴマメ、アルギン酸塩、カラギーナン、ペクチン）、微生物由来のゴム（キサンタン）、粘土（Ｌａｐｏｎｉｔｅ）、ＩＮＣＩ名「アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ｖｐコポリマー」および「アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／メタクリル酸ベヘネス−２５コポリマー」で識別される原料（例えばＣｌａｒｉａｎｔによってＡｒｉｓｔｏｆｌｅｘ ＡＶＣおよびＨＭＢという名称で販売されている）から選択される、１つまたは複数のゲル化剤および／または水相の増粘剤。

【0033】

前記ゲル化剤および／または増粘剤は、組成物の総重量に対して０から１０重量％程度の含有量で、組成物中に存在してよい。
− 好ましくは非イオン性の、組成物の総重量に対して０から８％、好ましくは０．５から３重量％程度の含有量で存在する、１つまたは複数の界面活性剤。
− 室温で液体であり、一般に油と呼ばれる、揮発性または非揮発性、炭化水素含有またはシリコーン含有、直鎖状、環状または分岐状である、例えばイソドデカン、シクロペンタジメチルシロキサン、ジメチコン、イソノナン酸イソノニルまたはテトライソステアリン酸ペンタエリスリチル、組成物の総重量に対して、好ましくは０から約１０重量％、好ましくは０．５から５重量％の割合である、１つまたは複数の脂質。
− 生物活性をもち、例えばビタミン、微量元素、アラントイン、植物性タンパク質および植物性抽出物から選択される、天然または合成由来の、１つまたは複数の活性剤。
− 例えば、ポンソーのジナトリウム塩、アリザリングリーンのジナトリウム塩、キノリンイエロー、アマランスのトリナトリウム塩、タルトラジンのジナトリウム塩、ローダミンのモノナトリウム塩、フクシンのジナトリウム塩、またはキサントフィルなどの、好ましくは、組成物の総重量に対して０から約２重量％の割合である、１つまたは複数の水可溶性染料。

【0034】

化粧品で通常用いられる他の添加物、特に本技術分野で周知の防腐剤、抗酸化物質または香料は、本発明に記載の組成物中に存在してもよい。

【0035】

当業者は、これらすべての可能性のある添加物から、組成物に添加することになる添加物の特質および量の両者を、組成物がその特性のすべてを保持するように選択することができる。

【0036】

本発明は、以下の実施例によって示されるが、それに限定されるものではない。

【実施例1】

【0037】

本発明によるソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物の調製
本発明によるソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を、以下のステップ、
ａ）乾燥してすりつぶしたソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部（花、葉および茎）を５０℃の温度で３時間、エタノールで抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた混合物を、一晩、４℃でインキュベートするステップと、
ｃ）ｂ）で得られた抽出物を、１００μｍ膜でろ過するステップと、
− ｃ）で得られた液体ろ液を活性炭（乾燥した植物の２％に相当する量で存在する）への色素の吸着によって漂白し、次いで、
− 脱色されたろ液を２０μｍ膜でろ過するステップと、
ｄ）蒸発によってエタノールを除去し、次いで１，３−プロパンジオールに最終希釈する（溶媒の９０％）ステップと
を含む、方法によって調製する。

【0038】

このようにして得られた抽出物を、以下の実施例２から６において、「ゴールデンロッド（Goldenrod）」と呼ぶ。

【実施例2】

【0039】

正常なヒト角化細胞およびメラニン細胞におけるゴールデンロッドの細胞毒性試験
プロトコール
若いドナーから得られた正常なヒト表皮角化細胞およびメラニン細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を、９６ウェルプレートで２４時間、添加培養培地（それぞれＫＧＭ２およびＭＧＭ２培地＋ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＭｉｘ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）中で、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。次いで、細胞を、異なる濃度のゴールデンロッドと共に、基本培地（添加物なし）中で２４時間（角化細胞）、または添加培地中で５日間（メラニン細胞）、インキュベートした。細胞毒性を、生細胞が無色／黄色のテトラゾリウム塩を暗褐色のホルマザン誘導体へ還元する能力に基づいた、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。細胞をテトラゾリウムと共に３７℃で３０分間インキュベートし、形成されたホルマザンの吸光度を４９０ｎｍで読み取った。

【0040】

結果
ゴールデンロッドの細胞毒性を０．１から０．０１２５％の間の異なる濃度で評価した（以下の表１）。

【0041】

【表1】

【0042】

ゴールデンロッドは、角化細胞に対して試験したすべての濃度で非毒性であったが、メラニン細胞に対しては０．１％で毒性があった。

【実施例3】

【0043】

ゴールデンロッドの抗酸化活性の評価
プロトコール
ゴールデンロッドがフリーラジカル（ヒドロキシル、ハロゲン化誘導体、ペルオキシ亜硝酸およびスーパーオキシドラジカル）を捕捉する能力、すなわち抗酸化能力を判定するために、製造業社の取扱説明書に従って、ホラシンに依存する化学発光試験ＡＢＥＬ（登録商標）１を用いた（Ｋｎｉｇｈｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｉｍｉｔｅｄ）。簡潔に言えば、さまざまな濃度の成分を、フリーラジカルと結合すると光を発する、周知の発光タンパク質であるホラシンとインキュベートした。抽出物がヒドロキシルラジカル、ハロゲン化誘導体ラジカル、ペルオキシ亜硝酸、およびスーパーオキシドのそれぞれを捕捉する能力を判定するための陽性対照として、Ｄ−マンニトール、アルブミン、ビタミンＥおよびＬ−アスコルビン酸を用いた。
すべての定量を５回反復し、平均値を決定した。成分の抗酸化能力を、未処理対照を０％として表し、活性成分の存在および非存在でのアッセイの間に観察されたホラシンの発光ピークの減少の割合±ＳＤで表した。

【0044】

結果
得られた結果を以下の表２に示す。
試験したすべての濃度で、ゴールデンロッドは、ヒドロキシルラジカル、ハロゲン化ラジカルおよびペルオキシ亜硝酸に対して、陽性対照として用いた化合物の試験した最も高い濃度に相当する、かなりの抗酸化活性をもつ。スーパーオキシドを捕獲する活性の割合の用量依存的な減少が、ゴールデンロッドの濃度の減少と共に観察された。

【0045】

【表2】

【実施例4】

【0046】

細胞外マトリックスのメタロプロテイナーゼ３および９の活性に及ぼすゴールデンロッドの効果の蛍光アッセイによる判定
プロトコール
ＭＭＰ３およびＭＭＰ９の活性に及ぼすゴールデンロッドの効果を評価するために、酵素（それぞれＢｉｏｍｏｌ ＳＥ−１０９およびＳＥ−２４４）を異なる濃度のゴールデンロッドと、各濃度５連でインキュベートした。ＤＭＳＯ（Ｂａｃｈｅｍ Ｈ−２３００、Ｍ−２０５５）に溶解した各ＭＭＰ酵素に特異的な蛍光基質を添加することによって、酵素反応を誘導した。酵素反応を分光光度法によって１時間監視し、ＭＭＰ３は３６０／４６０ｎｍの波長で、またはＭＭＰ９は３２０／４０５ｎｍの波長で励起／放射させた後、蛍光を測定した。結果を反復の平均±ＳＤで表し、１００％を示す未処理の対照に対するＭＭＰの活性の割合で示した。対照として、ＭＭＰの活性を阻害するために、ＥＤＴＡを用いた。

【0047】

結果
ＭＭＰ酵素は、細胞外マトリックスの分解に関与することが知られ、したがって皮膚の力学特性に加齢の影響を及ぼす。
こうして、本発明人は、ゴールデンロッドがＭＭＰ３およびＭＭＰ９の活性を阻害する能力を判定した。
表３に示すデータは、試験した最も高い濃度である０．１％で、ゴールデンロッドがＭＭＰ３およびＭＭＰ９の活性の両方を阻害すること示す。

【0048】

これらの結果は、ゴールデンロッドが細胞外マトリックスの分解を制限し、したがって皮膚の健全性を保存し得ることを示す。

【0049】

【表3】

【実施例5】

【0050】

培養下の正常なヒト角化細胞によるＶＥＧＦおよびＩＬ１αの分泌に及ぼすゴールデンロッドの効果のＥＬＩＳＡアッセイによる評価
プロトコール
２４時間、基本培地中でさまざまな濃度のゴールデンロッドで処理する前に、角化細胞を６ウェルプレートで２４時間、添加培地（ＫＧＭ２基本培地＋ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＭｉｘ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）で培養した。角化細胞によって培養培地に分泌されたＶＥＧＦおよびＩＬ１αのレベルを、製造業社の取扱説明書に従い、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって決定した。活性成分の存在または非存在下で培養した少なくとも２種類の角化細胞ドナーについて、標的タンパク質の分泌レベルを評価した。ＶＥＧＦおよびＩＬ１αのレベルをそれぞれ増加させることが知られたＴＧＦβおよびＵＶＢを、陽性対照として用いた。
示した結果は、生物学的３連の平均値±ＳＤであり、対照（１００％を示す）に対する割合で示した。

【0051】

結果
２種類の特定の生物学的標的、
− 皮膚の炎症および老化に関与する周知のサイトカイン、ＩＬ１α、および
− 微小血管新生を促進し、したがって皮膚の栄養および酸素の供給を改善する増殖因子、ＶＥＧＦ
の角化細胞の分泌レベルに及ぼすゴールデンロッドの効果を評価した。

【0052】

ゴールデンロッド抽出物は、用量依存的にＩＬ１αの分泌を阻害し、０．０１２５％の濃度において最大効果が観察され（５４．１±１４．６％）、ＵＶＢは未処理細胞（１００％）に対してＩＬ１αを促進する（１６６±２０．６％）。
０．１％のゴールデンロッドで処理した角化細胞の評価は、未処理細胞（１００％）に対してＶＥＧＦの分泌の増加（２０５．４±２０．３％）を示した。１種類のドナーから得られた、示した結果は、それでも試験した両ドナーを代表するものである。

【0053】

したがって、ゴールデンロッドは、炎症誘発性ＩＬ１αを阻害するために効果的な成分であり、一方ＶＥＧＦを刺激し、皮膚の栄養および酸素供給を提供し、このことは皮膚の老化を抑制する可能性がある、と結論づけることができる。

【実施例6】

【0054】

培養下の正常なヒトメラニン細胞におけるメラニン量に及ぼすゴールデンロッドの効果の判定
プロトコール
高いフォトタイプの２種類のドナーから得られた正常なヒト表皮メラニン細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を、９６ウェルプレートで、添加培地（ＭＧＭ２基本培地＋ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＭｉｘ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）で培養した。細胞を、さまざまな濃度のゴールデンロッド（０．０５から０．０６２５％）を含む増殖培地で５日間インキュベートした。
その後、培養培地を除去し、細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した。細胞内メラニンの抽出のため、細胞を１Ｍ ＮａＯＨに溶解し、毎分１２０００回転で５分間遠心分離し、透明な上清の吸光度を４９０ｎｍで測定した。５９５ｎｍの、ウェルあたりの総タンパク質に対して、メラニン量を正規化した（Ｂｉｏｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏｒａｄ）。
１００％に固定された未処理対照の割合として、結果を示す。

【0055】

結果
メラニンは、ヒト皮膚の発色団であり、上皮のメラニン細胞によって合成され、皮膚の色の主な原因となる。皮膚の色素沈着に及ぼすゴールデンロッドの可能性のある効果を、処理および未処理細胞におけるメラニンの化学的定量によって評価した。
０．１％の濃度のゴールデンロッドは、メラニン細胞のメラニン量を、未処理細胞に比して２１．９±１．９％阻害する。

【0056】

本試験から、ゴールデンロッドは培養された正常なヒトメラニン細胞のメラニン量を調節し、したがって皮膚の色素沈着のレベルを減少させ得る（したがって脱色素剤として作用する）ことがわかる。

【実施例7】

【0057】

初代ヒト線維芽細胞（ＨＤＦ）の複製寿命に及ぼすゴールデンロッドの効果の判定
プロトコール
Ｅｖｅｒｃｙｔｅ（Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）によって供給された、４９歳、５８歳および６５歳の３人の異なる女性ドナーの腹壁形成術から、初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を単離した。４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１０％ ウシ胎仔血清を添加した、Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＤＭＥＭ培地Ｆ１２／Ｈａｍ（１：１）で、３７℃および７％ＣＯ_２で細胞を培養した。連続継代のために、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％トリプシン／０．０２％ ＥＤＴＡと共に、５〜８分インキュベートした。遊離した細胞をゴールデンロッドを含む培地に再懸濁し、培地中で０．００６２５％の最終濃度に達するようにした。細胞懸濁液１ｍｌ中の生細胞数を、Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて自動的に決定した。

【0058】

結果
ゴールデンロッドの存在下で、ＨＤＦの連続継代による連続培養は、細胞の複製寿命を１０．８％延長した（データは示さない）。

【実施例8】

【0059】

ゴールデンロッドによるＨＤＦ細胞の連続処理の、乳頭層線維芽細胞の網状層線維芽細胞への移行（ＰＲＴ）に及ぼす効果の判定
プロトコール
実施例７に記載したように、ＨＤＦを連続して継代し、光学顕微鏡での細胞形態の視覚的検査、および乳頭層表現型（ＰＤＰＮ）および網状層表現型（ＴＧＭ２）のマーカーの定量によって、ＰＲＴについて分析した。次に、製造業社の取扱説明書に従って、ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＲＮＡを単離した。単離したＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量し、ＮＣｏｄｅ ＶＩＬＯ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、３００ｎｇをｃＤＮＡへ転写した。Ｓｏｌｉｓ ＢｉｏＤｙｎｅ（Ｔａｒｔｕ、Ｅｓｔｏｎｉａ）のＨＯＴ ＦＩＲＥＰｏｌ ＥｖａＧｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ Ｐｌｕｓ（ＮＯ ＲＯＸ）を用いて、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）をＲｏｔｏｒＧｅｎｅ−６０００ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）で行った。ｍＲＮＡの発現をＧＡＰＤＨの発現に対して正規化した。用いたマーカーおよびプライマーは、以下である。
ＴＧＭ２：ｆｗｄ−ＧＧＣＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＣ（配列番号１）およびｒｅｖ−ＡＧＧＡＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＣＧＣＴ（配列番号２）、
ＰＤＰＮ：ｆｗｄ−ＧＣＡＴＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＣＣＡＡＣＴ（配列番号３）およびｒｅｖ−ＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＡＧＧＧＣＧ（配列番号４）、
ＧＡＰＤＨ（対照）：ｆｗｄ−ＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡ（配列番号５）およびｒｅｖ−ＴＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧ（配列番号６）。

【0060】

結果
ゴールデンロッドの非存在下でＨＤＦ細胞の連続継代による連続培養は、ＨＤＦの乳頭層形態の減少を導き、一方、ゴールデンロッドの存在下では維持された（データは示さない）。
このことは、ゴールデンロッドの存在下で細胞を培養すると、未処理細胞に対して、マーカーＴＧＭ２（網状層マーカー）の発現は低く、一方、マーカーＰＤＰＮ（乳頭層マーカー）の発現は高い（データは示さない）という事実によって確認される。
ゴールデンロッドは、ＨＤＦの乳頭層表現型から網状層表現型への移行を遅らせると結論づけられる。
若い皮膚はより多数の乳頭層ＨＤＦを含むので、このことは、ゴールデンロッドが、皮膚の若い表現型を維持することを助ける場合があることを再度示唆する。

【実施例9】

【0061】

ゴールデンロッドによるＨＤＦ細胞の連続処理の老化マーカーに及ぼす効果の判定
プロトコール
実施例７に記載したように、ＨＤＦを連続して継代し、β−ガラクトシダーゼ（β−ＳＡ−ｇａｌ）と組み合わせた標識によって、老化を試験した。次に、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、２％ ホルムアルデヒド／０．２％ グルタルアルデヒドで１０分間固定した。細胞を１×ＰＢＳで２回、染色緩衝液（１００ｍＭ クエン酸／２００ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ６．０）で１回洗浄し、染色溶液（５ｍＭ フェリシアン化カリウム、５ｍＭ フェロシアン化カリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌ、染色緩衝液に希釈した）で３７℃で、２４時間インキュベートした。各ウェルについて、１０枚の写真をウェルの無作為の位置で撮影し、１実験からの画像を無作為化し、１人の技師が盲検下で数えた。さらに、実施例９のように、以下の老化マーカー（Ｐ２１）および若い細胞（ＳＮＥＶ）のプライマー、
ｐ２１^Ｃｉｐ１／^ＷＡＦ１（ＣＤＫＮ１Ａ）：ｆｗｄ−ＧＧＣＧＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＡＣＡＧＡＴＴ（配列番号７）およびｒｅｖ−ＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＧＧＧＴＡＴ（配列番号８）、
ＳＮＥＶ^{ｈＰｒｐ１９／ｈＰｓｏ４}（ＰＲＰＦ１９）：ｆｗｄ−ＡＡＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＣＡＡＧＡＡＧ（配列番号９）およびｒｅｖ−ＣＧＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＣ（配列番号１０）
を用いてｑＰＣＲを実行し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに対して再正規化した。

【0062】

結果
ゴールデンロッドの存在下でＨＤＦの連続継代による連続培養は、細胞の連続継代の間で試験したすべての時間で、老化した細胞の約５０％の減少を導く（データは示さない）。このことは、老化した細胞のマーカーとしてのｐ２１のｍＲＮＡレベルの降下、および若い細胞のマーカーとしてのＳＮＥＶのｍＲＮＡレベルの増加に反映される（Voglauer et al., 2006）。
このことは、細胞が複製老化へ入ることを遅らせる、ゴールデンロッドの活性を再度確認する。

【実施例10】

【0063】

ストレスの影響下での早老のＨＤＦ（ＨＤＦ ＳＩＰＳ）における老化マーカーに及ぼすゴールデンロッドでの急性処理の効果の判定
プロトコール
０日目に細胞を３５００個／ｃｍ^２で播き、１〜４日目および７〜１１日目に、１００μＭ Ｈ_２Ｏ_２で１日あたり１時間処理し、次いで通常の増殖培地に回収した。０日目に静止対照細胞を同一密度で播き、培地を１週間に２回交換した。１１日目の最後のＨ_２Ｏ_２処理の直後に、ゴールデンロッドでの処理を行った。

【0064】

実施例１０のように、β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）と組み合わせた標識によって、ＨＤＦ ＳＩＰＳを老化について試験した。実施例１０のようにｑＰＣＲを行った。さらに、製造業社の取扱説明書に従って、ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ｋｉｔを用いてＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で単離されたＲＮＡの品質を管理した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００を用いて、ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｃｏｎｓｔａｎｃｅ、Ｇｅｎｎａｎｙ）によって次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を行った。

【0065】

結果
ゴールデンロッドでの急性処理は、ＨＤＦ ＳＩＰＳのＳＡ−βＧａｌ陽性を、４日目に約４４％および１１日目に８０％減少する（データは示さない）。このことは、ｐ２１のｍＲＮＡの減少、ならびにＳＮＥＶのｍＲＮＡの陽性調節に付随して起こる。実際に、ゴールデンロッドで処理した静止細胞およびＳＩＰＳの全ゲノムのｍＲＮＡ転写プロファイルの主成分分析（ＰＣＡ）の原理は、未処理細胞に対して、ゴールデンロッドがトランスクリプトームプロファイルを、静止細胞プロファイルへ変換する効果をもつことを示す。より正確には、マトリックスを分解する、炎症誘発性老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）のいくつかの因子のｍＲＮＡの転写は、ＩＬ−１１、ＣＸＣＬ８（ＩＬ８）、ＩＦＩ３０（ＧＩＬＴ）、およびＣＣＬ２の例によって示されるように、減少する。
総合すると、これらの結果は、細胞老化へ入る間に生じ皮膚老化の原因となる重要な機能変化を、ゴールデンロッドが再変換できることを示唆する。

【実施例11】

【0066】

ＨＤＦ ＳＩＰＳ細胞の長期生存に及ぼすゴールデンロッドによる急性処理の効果の判定
プロトコール
０日目に細胞を３５００個／ｃｍ^２でＴ７５培養フラスコに播き、１〜４日目および７〜１１日目に、１００μＭ Ｈ_２Ｏ_２で１日あたり１時間処理し、その後通常の増殖培地に回収した。０日目に静止対照細胞を同一密度で播き、培地を１週間に２回交換した。１１日目の最後のＨ_２Ｏ_２処理の直後に、ゴールデンロッドでの処理を行った。実施例７に記載したように、細胞数を決定した。

【0067】

結果
ＨＤＦ ＳＩＰＳのゴールデンロッドへの４日間の曝露は、細胞毒性効果を示さない（データは示さない）。しかし、ゴールデンロッドへの３５日以上の曝露は、３０％程度の老化した細胞（ＳＥＳＣ）の選択的除去の活性をもたらし、一方静止細胞（対照）は有意な量の細胞死を示さない。
このことは、ゴールデンロッドの長期使用は、老化した細胞の数を選択的に減少させる可能性があることを示す。

【実施例12】

【0068】

ＨＤＦ ＳＩＰＳの長期生存に及ぼすゴールデンロッドによる急性処理の効果の判定
プロトコール
個人ドナーの新生児包皮由来の初代ヒト角化細胞（ＫＣ）を、ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ（Ｔｒｏｉｓｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、０．１ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＥＧＦ、５μｇ／ｍｌ インスリン、０．５μｇ／ｍｌ ヒドロコルチゾン、０．４％ ウシ下垂体抽出物、５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシンおよび５０ｎｇ／ｍｌ アンフォテリシンＢを添加したＫＣ増殖培地（ＫＧＭ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＵＳＡ）で培養した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ９６システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離し、全ＲＮＡの９００ｎｇをｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ）で逆転写した。ｑＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｌｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて行った。標的遺伝子の発現を、β−２ミクログロブリンの発現に対して正規化した。プライマーの配列は、以下である（５’−３’）。
Ｂ２Ｍｆ ａｔｇａｇｔａｔｇｃｃｔｇｃｃｇｔｇｔｇ（配列番号１１）；Ｂ２Ｍｒ：ｃａａｔｃｃａａａｔｇｃｇｇｃａｔｃｔ（配列番号１２）；
ｐ１６ｉｎｋ４Ａｆ：ｃａａｃｇｃａｃｃｇａａｔａｇｔｔａｃｇ（配列番号１３）；ｐ１６ｉｎｋ４Ａｒ：ａｃｃａｇｃｇｔｇｔｃｃａｇｇａａｇ（配列番号１４）；
ＭＭＰ１＿５２４ｆ：ｇｇｔｃｔｃｔｇａｇｇｇｔｃａａｇｃａｇ（配列番号１５）；ＭＭＰ１＿７２０ｒ：ｃｃｇｃａａｃａｃｇａｔｇｔａａｇｔｔｇ（配列番号１６）。
ストレス実験のために、０日目に細胞を１５００個／ｃｍ^２で播き、２、５および６日目にパラコート（ＰＱ）（８０ｐｍ）で２４時間処理した。１日目および４日目に、ゴールデンロッド処理を、未処理細胞またはパラコート処理細胞に実行した。

【0069】

結果
初代ＫＣを培養皿に播き、ＰＱ、またはゴールデンロッド、または両方で処理した。培養皿あたり合計３７５００細胞を０日目に播き、処理３および７日目に細胞計数を得た。対照細胞に対して計数し、細胞分裂因子を補正した、細胞数の平均値は、
− 未処理対照細胞では、３日目に７２０，０００、７日目に８，２９５，０００、
− ＰＱで処理した細胞では、３日目に４０５，０００、７日目に５４６，６６６、
− ゴールデンロッドで処理した細胞では、３日目に８２５，０００、７日目に８，４００，０００、および
− ＰＱおよびゴールデンロッドで処理した細胞では、３日目に５１０，０００、７日目に１，２４５，０００細胞であった。
このことは、ゴールデンロッドが酸化的ストレスの影響下で、細胞増殖の減少を防止しないことを示す。
細胞老化のよく記載された誘導剤であるパラコートでの処理は、ＭＭＰ１およびｐ１６ＩＮＫ４ａの発現を誘導する。
Ｐ１６ＩＮＫ４ａは、細胞老化のマーカー遺伝子であり、その発現は、細胞周期が停止した場合、正に調節される。
ＭＭＰ１は、多くの場合老化した細胞によって分泌されるマトリックスメタロプロテアーゼである。
パラコートに加えてゴールデンロッドが与えられた場合、ｍＲＮＡの発現レベルは、対照遺伝子（β−２−ミクログロブリン）に対して減少する。このことは、細胞周期の停止および老化に関連する遺伝子の発現に及ぼすパラコートの効果を、ゴールデンロッドが中和することを示す。

【実施例13】

【0070】

化粧品組成物
７Ａ−油／水クリームゲルエマルション

【0071】

【表4】

【0072】

７ｂ−油／水クリームエマルション

【0073】

【表5】

【0074】

これらの組成物を、毎日、朝および／または夜、皮膚に施用してよい。

また、本発明は以下を提供する。［１］ 以下のステップ、
ａ）ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部を少なくとも１種類のアルコール溶媒で抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた前記混合物を少なくとも１０時間インキュベートするステップと、
ｃ）ｂ）で得られた前記インキュベートされた混合物をろ過するステップと、
ｄ）得られた前記ろ液から前記溶媒を除去し、次いで他のアルコール溶媒に最終希釈するステップと
を含む、方法によって入手可能なソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。
［２］ ステップａ）の前記アルコール溶媒は、１個から４個までの炭素原子を含む一価アルコール、好ましくはエタノールであることを特徴とする、［１］に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。
［３］ ステップａ）の前記抽出は、２から６時間の間の時間にわたって、４０℃から６０℃の間の温度で実行されることを特徴とする、［１］または［２］に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。
［４］ 前記地上部は、花、葉、茎およびその混合物から選択されることを特徴とする、［１］から［３］のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。
［５］ ステップｂ）の前記インキュベーションは、１２時間から３０時間の間の時間にわたって、２℃から１０℃の間の温度で実行されることを特徴とする、［１］から［４］のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。
［６］ ステップｃ）およびｄ）の間に、好ましくは活性炭に吸着させることにより、ｃ）で得られた前記ろ液を漂白するステップ、続いて脱色されたろ液をろ過するステップを追加することを特徴とする、［１］から［５］のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。
［７］ ステップｄ）の前記除去は蒸発によって行われ、次いで、最終希釈が１，３−プロパンジオールで実行されることを特徴とする、［１］から［６］のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。
［８］ 以下のステップ、
ａ）予め乾燥させてすりつぶした、ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の花、葉および茎の混合物を４０℃から６０℃の間の温度で、２時間から５時間、エタノールで抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた前記混合物を少なくとも１２時間、２℃から６℃の間の温度でインキュベートするステップと、
ｃ）ｂ）で得られた前記インキュベートされた混合物をろ過して、ろ液を得るステップと、
− ｃ）で得られた前記ろ液を活性炭に吸着させることにより漂白するステップと、次いで
− 前記脱色されたろ液を２０μｍ膜でろ過するステップと、
ｄ）得られた前記ろ液から蒸発によって前記エタノールを除去し、次いで１，３−プロパンジオールに最終希釈するステップと
を含む、方法によって得ることができることを特徴とする、［１］から［７］のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物。
［９］ 以下のステップ、
ａ）ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部を少なくとも１種類のアルコール溶媒で抽出するステップと、
ｂ）ａ）で得られた混合物を少なくとも１０時間インキュベートするステップと、
ｃ）ｂ）で得られたインキュベートされた混合物をろ過するステップと、
ｄ）ｃ）で得られた混合物から溶媒を除去し、次いで他のアルコール溶媒に最終希釈するステップと
を含む、ソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部を抽出する方法。
［１０］ 老化による皮膚の変化を予防および／または軽減するための、［１］から［８］のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物の化粧品としての使用。
［１１］ 脱色素剤としての、［１］から［８］のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物の化粧品としての使用。
［１２］ 皮膚の微小循環を改善するための薬剤、および／または上皮を再生するため、皮膚の色および／または輝きおよび／または血色の均一性を改善するため、くすんだおよび／または輝きのない皮膚の外観を予防し、皮膚に滑らかで輝きのある血色を与えるための薬剤としての、［１］から［８］のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物の化粧品としての使用。
［１３］ 抗酸化物質としての、［１］から［８］のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物の化粧品としての使用。
［１４］ 化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル中に、［１］から［８］のいずれか一項に記載のソリダゴ・ウィルガウレア亜種アルペストリス（Solidago virgaurea subsp. alpestris）の地上部のアルコール抽出物を含む、化粧用または皮膚科用組成物。
［１５］ 局所経路による施用に適していることを特徴とする、［１４］に記載の化粧用または皮膚科用組成物。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]