特許 6449220 毛包新生

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6449220

(24)【登録日】2018年12月14日

(45)【発行日】2019年1月9日

(54)【発明の名称】毛包新生

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/077 20100101AFI20181220BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20181220BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20181220BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/077ZNA

   C12N5/10

   C12N15/09 Z

【請求項の数】16

【全頁数】63

(21)【出願番号】特願2016-253496(P2016-253496)

(22)【出願日】2016年12月27日

(62)【分割の表示】特願2013-515559(P2013-515559)の分割

【原出願日】2011年6月17日

(65)【公開番号】特開2017-93451(P2017-93451A)

(43)【公開日】2017年6月1日

【審査請求日】2017年1月25日

(31)【優先権主張番号】61/344,258

(32)【優先日】2010年6月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508331350

【氏名又は名称】ザ ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】ラジェシュ サンガパザム

(72)【発明者】

【氏名】トーマス エヌ．ダーリング

(72)【発明者】

【氏名】シャオウェイ リ

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，２００８年，vol.105, no.9，pp.3539-3544

【文献】 Cell Stem Cell，２００９年，vol.5, no.3，pp.279-289

【文献】 J. Med. Genet.，２０１０年，vol.47, no.3，pp.182-189

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変されたヒト間葉系細胞を含む組成物であって、前記改変されたヒト間葉系細胞が、野生型のヒト間葉系細胞と比較して、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、およびＦＬＣＮのうちの少なくとも１つが少なくとも９０％低下し、ここで、組成物がヒト上皮細胞を含まないが、ヒト毛包を誘導することができる、上記組成物。

【請求項2】

Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｋ、Ｅｒｋ、Ｒｓｋ１、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、Ｒｈｅｂ、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ｍＬＳＴ８、Ｓ６Ｋ１、リボソームタンパク質Ｓ６、ＳＫＡＲ、ＳＲＥＢＰ１、ｅＩＦ４ｅ、ＩＫＫｂｅｔａ、Ｍｙｃ、Ｒｕｎｘ１、ＣＤ１３３、ＣＤ１０、ネスチン、アルカリホスファターゼ、およびｐ２７のうちの少なくとも１つが、アップレギュレートされ、および／または
ＣＹＬＤ、ＭＥＮ１、ＮＦ１、ＰＴＥＮ、ＰＲＡＳ４０、４Ｅ−ＢＰ１、ＧＳＫ３、およびＤｅｐｔｏｒのうちの少なくとも１つが、ダウンレギュレートされる、
請求項１記載の組成物。

【請求項3】

前記改変されたヒト間葉系細胞が、バート−ホッグ−デューベ症候群、ブルック−スピーグラー症候群、カウデン症候群、多発性内分泌腺腫１型、神経線維腫症、または複合型結節硬化症に関連する腫瘍由来である、請求項１記載の組成物。

【請求項4】

前記改変されたヒト間葉系細胞が、線維血管腫、線維毛包腫、線維性斑、前額部斑、毛包母斑、インフンディブローマ、イスシミコーマ、毛包周囲線維腫、脂腺母斑、器官母斑、汗管腫、粒起革様斑、毛盤腫、毛髪上皮腫、毛芽細胞腫、毛根鞘腫、毛包腺腫、炎症性硬結、または爪周囲線維腫由来である、請求項１記載の組成物。

【請求項5】

前記改変されたヒト間葉系細胞が、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、またはＦＬＣＮに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む、野生型のヒト間葉系細胞である、請求項１記載の組成物。

【請求項6】

前記改変されたヒト間葉系細胞が、マトリックスを備える、請求項１記載の組成物。

【請求項7】

前記マトリックスが、コラーゲンマトリックス、または基質マトリックスである、請求項６記載の組成物。

【請求項8】

前記マトリックスが、Ｉ型コラーゲンマトリックスである、請求項７記載の組成物。

【請求項9】

前記改変されたヒト間葉系細胞が、真皮線維芽細胞、毛乳頭細胞、表皮鞘細胞、または間葉系幹細胞である、請求項１記載の組成物。

【請求項10】

ヒト毛包を誘導することができる細胞の、それを必要とする患者への移植に使用するための皮膚移植用製剤または皮内注射用製剤を製造するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項11】

前記患者が、部分層の皮膚欠損、全層の皮膚欠損、創傷、火傷、傷跡、または脱毛の患者である、請求項１０記載の組成物。

【請求項12】

前記改変されたヒト間葉系細胞が患者由来である、請求項１０または１１記載の組成物。

【請求項13】

前記組成物がエクリン腺を誘導する、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の組成物。

【請求項14】

前記組成物が皮脂腺を誘導する、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の組成物。

【請求項15】

前記改変されたヒト間葉系細胞が、マイクロスフィア中に存在する、請求項１〜１４のいずれか１項記載の組成物。

【請求項16】

前記マイクロスフィアが、毛乳頭培地とケラチン細胞無血清培地の１：１混合物中に、新生児包皮線維芽細胞と新生児包皮ケラチン細胞（それぞれ最大約３０，０００の細胞）の混合物を含む細胞集塊を含み、前記細胞集塊は、最大約４週間、インキュベートされる、請求項１５記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権出願の情報
本出願は、２０１０年６月１８日に出願された米国仮出願第６１／３４４，２５８号の優先権を主張し、これらの全内容は、参照によって本明細書中に組み込まれる。

【0002】

特許に係る政府の権利の表明
本発明は、一部において、米国政府から支援を受けてなされた。したがって、政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0003】

発明の分野
本発明は、十分に形成されたヒト毛包を誘導することができる、皮膚代替物に関する。また、本発明は、ヒト毛包の新生を誘導するための方法および組成物にも関する。一部の実施態様において、本発明は、全層または部分層の皮膚欠損、創傷、火傷、傷跡、および完全なまたは部分的な脱毛の治療に使用することができる。

【背景技術】

【0004】

髪および皮膚に関する研究は、再生医療の最先端にあり続けている。皮膚代替物は、生体組織工学の原理を用いて開発されている、最初の製品の１つであり、また、これらのベンチャーの成功は、複数の市販製品の臨床利用で明らかである。さらに、植毛は、男性および女性の化粧療法の中で最も急成長している領域のうちの１つである。

【0005】

主な皮膚損傷を治療するための現在の臨床的な「至適基準」は、分層自家移植片（ｓｐｌｉｔ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｓｋｉｎ ａｕｔｏｇｒａｆｔ）の利用を含み、これは、患者の一方の箇所から他方の箇所に真皮の一部を有する表皮を移植することを含む。但し、創傷を被覆するのに不十分なドナー皮膚が存在する場合、皮膚代替物を使用してもよい。今日利用可能な皮膚代替物は、組成が変化したが、この皮膚代替物は、一般に、非生物コラーゲンマトリックス、および角化細胞と腺維芽細胞の種々の組合せを含む。例えば、アプリグラフ（ＡＰＬＩＧＲＡＦ）（登録商標）（オーガノジェネシス（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）社製、カントン、マサチューセッツ州）は、一般に利用可能な最も臨床的に成功した複合皮膚代替物であることが報告され、これは、同種異型新生児ケラチン細胞で被覆したウシＩ型コラーゲン中の同種異型新生児腺維芽細胞からなる。

【0006】

しかしながら、一般に利用可能な皮膚代替物は、正常な皮膚のすべての機能を果たすことができるとは限らない。例えば、一般に利用可能な皮膚代替物を使用しても毛包新生はみられず、これは、患者におけるこれらの利用を制限する。毛包およびこれらに関連する皮脂腺は、外観、皮膚水和、障壁形成、および病原体からの保護にとって重要である。さらに、毛包は、創傷治癒中に動員され得る表皮幹細胞を保存する。したがって、毛包を有する皮膚は、毛包のない皮膚よりも迅速に治癒する。さらに、毛包を欠く皮膚に存在し得る幹細胞は、表皮の表層に位置し、軽微な外傷による損失、および紫外線光による損傷を受けやすい細胞を形成する。したがって、正常な毛包新生に関与する治療は、正常な皮膚機能および外観の回復のための非常に広い用途を見出す。

【0007】

種々の医薬および手術の選択は、皮膚に正常な髪の成長を回復するのに有効である。医薬の選択は、一般に、現存する無活動の毛包を刺激するミノキシジルまたはフィナステリド等の薬剤の利用を含む。手術の選択は、一般に、身体の一部から毛包を含む組織を採取することと、髪が失われた部位に毛包を移植することとを含む。しかしながら、いずれのアプローチも毛包新生を生じない。その代わりに、これらのアプローチは共に、皮膚に現存する毛包を必要とし、このことは、特定の患者におけるこれらの適用可能性を制限する。

【0008】

毛包新生の現在の方法は、ドナーからレシピエントの表皮に誘導性の毛乳頭（ＤＰ）または表皮鞘（ｄｅｒｍａｌ ｓｈｅａｔｈ）（ＤＳ）細胞を含む組織を移植することを含む。例えば、ＤＳおよびＤＰ細胞は、マウスおよびラットから単離されており、上皮細胞と組み合わせ、動物に移植するか、または注入して、毛包新生を誘導する。しかしながら、ヒト細胞は、毛包誘導におけるげっ歯動物細胞ほど強健でないことが分かった。また、複雑な試験系が、ヒトの毛包形成を促進するために考案されている。これらの系には、チャンバーアッセイ、皮下注射アッセイ、サンドイッチおよび皮膚弁移植アッセイが含まれる（Ｏｈｙａｍａらの文献：Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９：８９−９９（２０１０）を参照のこと）。毛包様構造は、チャンバーアッセイにおいて、マウス間葉系細胞およびヒト表皮細胞のキメラ構築物を使用して形成され（Ｅｈａｍａらの文献：Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１２７：２１０６−１５（２００７）を参照のこと）、また、成人ヒト頭皮のＤＰ細胞は、皮膚弁移植モデルを使用して、マウス胚表皮中の毛包を誘導することを示した（Ｑｉａｏらの文献：Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．，４：６６７−７６（２００９）を参照のこと）。チャンバーアッセイとサンドイッチアッセイの近年の比較は、ヒトＤＰ細胞の毛包誘導能のスクリーニングにおいて、同等の有用性を示した（Ｉｎｏｕｅらの文献：Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ，１９０：１２０−１０（２００９）を参照のこと）。

【0009】

しかしながら、これらの系は、調査ツールとして非常に有益であるが、これらの方法によって生産された毛包が、ヒト構築物に十分でなく（しかし、その代りに、キメラげっ歯動物／ヒト構築物では十分である）、十分に開発されておらず、誤った解剖箇所の毛幹を含み、長期移植生存および正常な毛包周期を示さず、および／または皮脂腺を含む毛包を形成しないので、これらは臨床有用性を欠く。さらに、かかる方法によって生産された毛包は、可変的で制御できない方向に成長する傾向があり、不自然な外観の髪を生ずる。したがって、かかる方法によって生産された毛包は、毛包を欠く皮膚におけるヒトの毛包新生に有用でない。さらに、毛包を形成するヒト包皮ケラチン細胞の性能が報告されている（Ｅｈａｍａら）が、毛乳頭／表皮鞘細胞（これらは、髪誘導に特定される）を使用する場合であっても、培養成人ヒト線維芽細胞を使用して、ヒトの毛包を発生させることはできなかった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、形態学的に正確で、十分に開発されたヒト毛包を発生させることができる方法および組成物の必要性が存在する。かかる方法および組成物は、全層または部分層の皮膚欠損、創傷、火傷、傷跡および脱毛の治療条件に有用である。本発明は、髪新生および再生が可能な細胞組成物の提供によって、これらの必要性を満たす。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、上皮細胞と改変間葉系細胞とを含む皮膚代替物であって、改変間葉系細胞が、野生型間葉系細胞と比較して、低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能、増加したｍＴＯＲＣ１機能、および／または低下したｍＴＯＲＣ２機能を有する、皮膚代替物を提供する。

【0012】

また、本発明は、ヒト毛包を誘導することができる細胞を移植する方法も提供する。一実施態様において、この方法は、患者の間葉系細胞に皮下送達または皮内送達することを含み、かつ改変間葉系細胞が、野生型間葉系細胞と比較して、低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能、増加したｍＴＯＲＣ１機能、および／または低下したｍＴＯＲＣ２機能を有する。別の実施態様において、この方法は、患者に上皮細胞を送達することをさらに含む。さらに別の実施態様において、この方法は、患者に本発明の皮膚代替物を移植することを含む。

【0013】

一実施態様において、患者は、全層もしくは部分層の皮膚欠損、創傷、火傷、傷跡、または脱毛を有する。別の実施態様において、この方法は、エクリン腺の形成を誘導する。さらに別の実施態様において、この方法は、皮脂腺の形成を誘導する。

【0014】

一実施態様において、野生型間葉系細胞と比較して、少なくとも１つのＴＳＣ１／ＴＳＣ２の負の調節因子の機能が増加し（例えば、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を阻害するタンパク質のアップレギュレートによって）、および／または、少なくとも１つのＴＳＣ１／ＴＳＣ２の正の調節因子の機能が低下している（例えば、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を刺激するタンパク質のダウンレギュレートによって）ので、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能は、直接的または間接的に低下している。別の実施態様において、低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体によって、ｍＴＯＲＣ１の機能は増加しているか、ｍＴＯＲＣ２の機能は低下しているか、またはこれらの両方である。

【0015】

一実施態様において、ＴＳＣ１もしくはＴＳＣ２のダウンレギュレート；ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を阻害するか、もしくは低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用する、阻害タンパク質のアップレギュレート；または、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を刺激するか、もしくは増加したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用する、刺激タンパク質のダウンレギュレートによって、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２の機能は低下し、ｍＴＯＲＣ１の機能は増加し、および／またはｍＴＯＲＣ２の機能は低下する。一実施態様において、刺激タンパク質は、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＣＹＬＤ、ＬＫＢ１、ＦＬＣＮ、ＭＥＮ１、ＮＦ１、ＰＴＥＮ、ＰＲＡＳ４０、４Ｅ−ＢＰ１、ＧＳＫ３、およびＤｅｐｔｏｒのうちの少なくとも１つから選択される。別の実施態様において、阻害タンパク質は、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｋ、Ｅｒｋ、Ｒｓｋ１、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、Ｒｈｅｂ、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ｍＬＳＴ８、Ｓ６Ｋ１、リボソームタンパク質Ｓ６、ＳＫＡＲ、ＳＲＥＢＰ１、ｅＩＦ４ｅ、ＩＫＫｂｅｔａ、Ｍｙｃ、Ｒｕｎｘ１、およびｐ２７のうちの少なくとも１つから選択される。一実施態様において、ＴＳＣ２はダウンレギュレートされる。別の実施態様において、ＦＬＣＮはダウンレギュレートされる。さらに別の実施態様において、ＴＳＣ２およびＦＬＣＮは共に、ダウンレギュレートされる。

【0016】

一実施態様において、改変間葉系細胞は、良性付属器腫瘍由来である。さらに別の実施態様において、改変間葉系細胞は、線維血管腫、線維毛包腫、線維性斑、前額部斑（ｆｏｒｅｈｅａｄ ｐｌａｑｕｅ）、毛包母斑、インフンディブローマ、イスシミコーマ（ｉｓｔｈｍｉｃｏｍａ）、毛包周囲線維腫（ｐｅｒｉｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｆｉｂｒｏｍａ）、脂腺母斑、器官母斑、汗管腫、粒起革様斑、毛盤腫、毛髪上皮腫、毛芽細胞腫、毛根鞘腫、毛包腺腫、炎症性硬結、または爪周囲線維腫由来である。更なる別の実施態様において、改変間葉系細胞は、バート−ホッグ−デューベ症候群（Ｂｉｒｔ−Ｈｏｇｇ−Ｄｕｂｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ブルック−スピーグラー症候群（Ｂｒｏｏｋｅ−Ｓｐｉｅｇｌｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、カウデン症候群（Ｃｏｗｄｅｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、多発性内分泌腺腫１型、神経線維腫症、または複合型結節硬化症に関連する腫瘍由来である。

【0017】

一実施態様において、改変間葉系細胞は、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を低下させ、ｍＴＯＲＣ１機能を増加させ、および／またはｍＴＯＲＣ２機能を低下させるように改変された、野生型の間葉系細胞である。別の実施態様において、野生型間葉系細胞は、真皮線維芽細胞、毛乳頭細胞、表皮鞘細胞、人工多能性幹細胞、または間葉系幹細胞である。さらに別の実施態様において、野生型間葉系細胞は、真皮線維芽細胞である。

【0018】

一実施態様において、野生型間葉系細胞は、少なくとも１つのＴＳＣ１／ＴＳＣ２の負の調節因子の機能が増加するか、および／または少なくとも１つのＴＳＣ１／ＴＳＣ２の正の調節因子の機能が低下することによって、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を低下させるように改変される。別の実施態様において、野生型の間葉系細胞では、低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体によって、ｍＴＯＲＣ１の機能が増加しているか、ｍＴＯＲＣ２の機能が低下しているか、またはこれらの両方である。

【0019】

一実施態様において、野生型間葉系細胞では、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能が低下し、ｍＴＯＲＣ１の機能が増加し、および／またはｍＴＯＲＣ２の機能が、ＴＳＣ１もしくはＴＳＣ２のダウンレギュレート；ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を阻害するか、もしくは低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用する、阻害タンパク質のアップレギュレート；または、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を刺激するか、もしくは増加したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用する、刺激タンパク質のダウンレギュレートによって低下する。

【0020】

一実施態様において、改変は、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２の正の調節因子、または増加したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体をコードする遺伝子を抑制することを含む。一実施態様において、遺伝子サイレンシングは、標的遺伝子に対して、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＲＮＡｉと、野生型間葉系細胞を処理することによって行うことができる。さらに別の実施態様において、改変は、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２の負の調節因子、または低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体をコードする遺伝子を過剰発現させることを含む。一実施態様において、過剰発現は、構造的に活性のあるプロモーターの制御下で、遺伝子を含む発現ベクターにより野生型間葉系細胞を安定的にトランスフェクトすることによって行うことができる。

【0021】

別の実施態様において、間葉系細胞は、成長因子遺伝子によってトランスフェクトされるか、またはＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を低下させるか、もしくは低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用する成長因子（インシュリン、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、およびＫＧＦ等）によって処理することができる。さらに別の実施態様において、間葉系細胞は、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を低下させるか、または低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用する組換え型タンパク質によって処理することができる。別の実施態様において、細胞は、転写因子ＰＰＡＲＧ（ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体ガンマ）のアゴニストである、チアリジンジオン（ｔｈｉａｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）（ロシグリタゾンおよびピオグリタゾンを含む）等の、転写因子の発現を増加させる薬剤によって処理することができる。

【0022】

一実施態様において、間葉系細胞は、マイクロスフィアに導入される。別の実施態様において、マイクロスフィアは、毛乳頭培地とケラチン細胞無血清培地の１：１混合物中に、新生児包皮腺維芽細胞と新生児包皮ケラチン細胞（それぞれ約３０，０００の細胞）とを混合し、細胞集塊を約４週間、インキュベートすることによって、形成される。別の実施態様において、間葉系細胞はマトリックスを備える。さらに別の実施態様において、マトリックスは、コラーゲンマトリックス、または基質マトリックスである。更なる別の実施態様において、マトリックスは、Ｉ型コラーゲンマトリックスである。さらに別の実施態様において、マトリックスは、ラットＩ型コラーゲンマトリックス、ウシＩ型コラーゲンマトリックス、またはヒトＩ型コラーゲンマトリックスである。

【0023】

一実施態様において、上皮細胞は、種々の供給源からの１以上の上皮細胞を含む。別の実施態様において、上皮細胞は、ケラチン細胞、またはケラチン細胞様細胞である。さらに別の実施態様において、ケラチン細胞は、新生児包皮ケラチン細胞である。

【0024】

一実施態様において、間葉系細胞および上皮細胞は、同じドナー由来である。別の実施態様において、ドナーは患者である。さらに別の実施態様において、間葉系細胞および上皮細胞は、異なるドナー由来である。更なる別の実施態様において、間葉系細胞または上皮細胞のいずれかのドナーは、患者である。

【0025】

添付図面は、本明細書の一部に組み込まれ、かつこれを構成し、本発明の説明と共に、本発明の複数の非限定実施態様を示し、本発明の原理について説明するのに有用である。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】Ａは、患者の線維性前額部斑の写真である。Ｂは、新生児包皮ケラチン細胞によって被覆したＴＳＣ２ヌル皮膚過誤腫の腺維芽細胞様細胞を含む、本発明の皮膚代替物の組織染色された断面である。Ｃは、新生児包皮ケラチン細胞によって被覆したＴＳＣ２ヌル皮膚過誤腫の腺維芽細胞様細胞を含む、本発明の皮膚代替物を移植したマウスの写真である。Ｄは、新生児包皮ケラチン細胞によって被覆したＴＳＣ２ヌル皮膚過誤腫の腺維芽細胞様細胞を含む、本発明の皮膚代替物において成長する毛包微小解剖の概略図である。

【0027】

【図2】図２は、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的）のネットワークの概略図である。

【0028】

【図3】Ａは、ＴＳＣ患者の正常な皮膚の組織染色された断面である。Ｂは、ＴＳＣ患者の前額部斑の組織染色された断面である。Ｃは、ＴＳＣ患者の正常な皮膚の抗リン酸化Ｓ６免疫組織染色された断面である。Ｄは、ＴＳＣ患者の前額部斑の抗リン酸化Ｓ６免疫組織染色された断面である。Ｅは、ＴＳＣ患者の正常な皮膚の抗Ｋｉ−６７免疫組織染色された断面である。Ｆは、ＴＳＣ患者の前額部斑の抗Ｋｉ−６７免疫組織染色された断面である。Ｇは、ＴＳＣ患者の正常な皮膚の抗ＣＤ６８免疫組織染色された断面である。Ｈは、ＴＳＣ患者の前額部斑の抗ＣＤ６８免疫組織染色された断面である。Ｉは、ＴＳＣ患者の正常な皮膚の抗ＣＤ３１免疫組織染色された断面である。Ｊは、ＴＳＣ患者の前額部斑の抗ＣＤ３１免疫組織染色された断面である。

【0029】

【図4】図４は、正常な皮膚（Ａ）、前額部斑からのＴＳＣ皮膚過誤腫（Ｂ）、線維血管腫（Ｃ）、および爪周囲線維腫（Ｄ）の組織染色である。

【0030】

【図5】Ａは、ＴＳＣ２ヌル腺維芽細胞様細胞のＴＳＣ２遺伝子の一部の配列解析である。Ｂは、標準細胞およびＴＳＣ２ヌル腺維芽細胞様細胞のマイクロサテライトヌクレオチド反復多型（Ｄ１６Ｓ２９１、Ｄ１６Ｓ５２１、およびＤ１６Ｓ６６３）の解析である。Ｄ１６Ｓ２９１のプライマー対は、フォワードプライマー、５’ＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡＡＴＣ３’（配列番号１）と、リバースプライマー、５’ＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＡＴＧＡＡＣＣ３’（配列番号２）である。Ｄ１６Ｓ５２１のプライマー対は、フォワードプライマー、５’ＡＧＣＧＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＴＡＡＡＡＡ３’（配列番号３）と、リバースプライマー、５’ＴＡＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＧＣＣＴＴＡＣＧ３’（配列番号４）である。Ｄ１６Ｓ６６３のプライマー対は、フォワードプライマー、５’ＧＴＣＴＴＴＣＴＡＧＧＡＡＴＧＡＡＡＴＣＡＴ３’（配列番号５）と、リバースプライマー、５’ＡＴＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＡＴＣＴ３’（配列番号６）である。Ｃは、毛包上皮下部を包含する腫瘍異種移植片表皮鞘の顕微解剖である。Ｄは、ＴＳＣの正常な腺維芽細胞（「正常」）、ＴＳＣ２ヌル腺維芽細胞様細胞（「腫瘍」）、および腫瘍異種移植片のレーザー顕微解剖した毛包上皮（「ＦＥ」）、または表皮鞘（「ＤＳ」）領域から増幅したＴＳＣ２のエキソン１０のＢｓｍＡ１制限酵素消化の結果を示す、１０％ＴＢＥゲルである。

【0031】

【図6】Ａは、標準細胞の細胞溶解物、およびＴＳＣ患者の前額部斑のウェスタンブロットである。ブロットは、アクチン（対照）、リン酸化Ｓ６Ｋ１（ｐＳ６Ｋ１）、非リン酸化Ｓ６Ｋ１、リン酸化リボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６）、およびラパマイシン治療の機能としてのＳ６の発現のレベルを示す。Ｂは、標準細胞、およびラパマイシン治療の機能としてのＴＳＣ患者の前額部斑細胞の細胞増殖データを示す、棒グラフである。

【0032】

【図7】図７は、標準細胞の細胞溶解物、ＴＳＣ患者の前額部斑、および線維血管腫のウェスタンブロットである。ブロットは、アクチン（対照）、ＴＳＣ２（チュベリン）、リン酸化Ｓ６（ｐＳ６）、および非リン酸化Ｓ６の発現のレベルを示す。

【0033】

【図8】Ａは、ＴＳＣの正常な腺維芽細胞と、ヒト新生児包皮ケラチン細胞によって作製された移植片の組織染色である。Ｂは、ＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞と、ヒト新生児の包皮ケラチン細胞を含む移植片の組織染色である。

【0034】

【図9】Ａは、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物の皮脂腺および毛幹を有する成長期の毛包の組織染色である（縮尺バー＝１３０μｍ）。Ｂは、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物のヒト毛幹を有する毛包の縦断面の組織染色である（縮尺バー＝１３０μｍ）。Ｃは、成長期の毛包の断面の組織染色であり、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物の外毛根鞘、内毛根鞘、毛幹、および皮脂腺を示す（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｄは、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物の毛乳頭、下部表皮鞘、有糸分裂像を有するマトリックス、内毛根鞘、および外毛根鞘を有する毛球の組織染色である（縮尺バー＝３５μｍ）。ＥおよびＦは、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物の抗ＣＯＸ ＩＶ抗体免疫組織染色された上皮細胞および真皮細胞である（縮尺バー：図９Ｅ＝１３０μｍ、図９Ｆ＝３５μｍ）。ＧおよびＨは、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物の毛包上皮を含む表皮細胞のインサイチュハイブリダイゼーションであり、核（青色）によってハイブリダイズされた、ヒトＹ染色体（赤色）の蛍光プローブを示す（縮尺バー：図９Ｇ＝１３０μｍ、図９Ｈ＝２０μｍ）。ＩおよびＪは、抗ネスチン抗体免疫組織染色された断面である。染色細胞は、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物の毛乳頭および下部表皮鞘領域由来である（縮尺バー：図８Ｉ＝６５μｍ、図８Ｊ＝３５μｍ）。Ｋは、抗ベルシカン抗体免疫組織染色された断面である。染色細胞は、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物の成長期の毛包の毛乳頭および下部表皮鞘領域由来である（縮尺バー＝６５μｍ）。Ｌは、アルカリホスファターゼ染色された断面であり、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物の毛包の毛乳頭および下部鞘領域の酵素活性を示す（縮尺バー＝６５μｍ）。Ｍは、抗Ｋｉ−６７抗体免疫組織染色された断面である。染色細胞は、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物の表皮の基底層および毛包マトリックス由来である（縮尺バー＝６５μｍ）。ＮおよびＯは、抗ケラチン１５抗体免疫組織染色された断面である。染色細胞は、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物の毛包漏斗より下にある外毛根鞘の基底層である（縮尺バー＝６５μｍ）。Ｐは、抗ケラチン７５抗体免疫組織染色された断面である。染色細胞は、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物の毛包付随層（ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｌａｙｅｒ）である（縮尺バー＝６５μｍ）。

【0035】

【図10】Ａは、抗ＨＬＡ抗体免疫組織染色された断面である。染色された細胞は、線維血管腫および新生児包皮ケラチン細胞のＴＳＣ２ヌル腺維芽細胞様細胞を含む皮膚代替物の真皮、表皮および毛包である（縮尺バー＝６５μｍ）。Ｂは、線維血管腫の新生児包皮ケラチン細胞およびＴＳＣ２ヌル腺維芽細胞様細胞を含む移植片の凍結切片に加えたときの、表皮および毛包上皮の核にハイブリダイズするヒトＹ染色体に対する蛍光プローブのインサイチュハイブリダイゼーションである（縮尺バー＝６５μｍ）。

【0036】

【図11】Ａは、ＴＳＣ患者の正常な腺維芽細胞を含む異種移植片の抗ＣＯＸ ＩＶ抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｂは、ＴＳＣ患者の正常な腺維芽細胞を含む異種移植片の抗ＣＯＸ ＩＶ抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｃは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル腺維芽細胞を含む異種移植片の抗ＣＯＸ ＩＶ抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｄは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル腺維芽細胞を含む異種移植片の抗ＣＯＸ ＩＶの抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｅは、ＴＳＣ患者の正常な腺維芽細胞を含む異種移植片の抗ｐＳ６抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｆは、ＴＳＣ患者の正常な腺維芽細胞を含む異種移植片の抗ｐＳ６抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｇは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞を含む異種移植片の抗ｐＳ６抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｈは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞を含む異種移植片の抗ｐＳ６抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｉは、ＴＳＣ患者の正常な線維芽細胞を含む異種移植片の抗Ｋｉ−６７抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｊは、ＴＳＣ患者の正常な線維芽細胞を含む異種移植片の抗Ｋｉ−６７抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｋは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞を含む異種移植片の抗Ｋｉ−６７抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｌは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞を含む異種移植片の抗Ｋｉ−６７抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｍは、ＴＳＣ患者の正常な線維芽細胞を含む異種移植片の抗Ｆ４ ８０抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｎは、ＴＳＣ患者の正常な線維芽細胞を含む異種移植片の抗Ｆ４ ８０抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｏは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞を含む異種移植片の抗Ｆ４ ８０抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｐは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞を含む異種移植片の抗Ｆ４ ８０抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｑは、ＴＳＣ患者の正常な線維芽細胞を含む異種移植片の抗ＣＤ３１抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｒは、ＴＳＣ患者の正常な線維芽細胞を含む異種移植片の抗ＣＤ３１抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｓは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞を含む異種移植片の抗ＣＤ３１抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。Ｔは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞を含む異種移植片の抗ＣＤ３１抗体免疫組織染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した（縮尺バー＝３５μｍ）。

【0037】

【図12】Ａは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞または正常な線維芽細胞を含む異種移植片の全真皮面積に対する、ヒト特異性抗ＣＯＸ−ＩＶ抗体と反応的な真皮細胞の平均数を示す、棒グラフである。異種移植片は、示されるように、ラパマイシンによって処置したマウス、またはラパマイシンによって処置していないマウスから採取した。結果は、平均±ＳＥ（^＊＊＝ｐ＜０．０１）である。Ｂは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞または正常な線維芽細胞を含む異種移植片の全真皮面積に対する、ヒト特異性抗ｐＳ６抗体と反応的な真皮細胞の平均数を示す、棒グラフである。異種移植片は、示されるように、ラパマイシンによって処置したマウス、またはラパマイシンによって処置していないマウスのそれぞれのグループから採取した。結果は、平均±ＳＥ（^＊＊＝ｐ＜０．０１、^＊＊＊＝ｐ＜０．００１）である。Ｃは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞または正常な線維芽細胞を含む異種移植片の全表皮面積に対する、蛍光強度として定量化した、表皮における抗ｐＳ６抗体の陽性染色の平均強度を示す。異種移植片は、示されるように、ラパマイシンによって処置したマウス、またはラパマイシンによって処置していないマウスから採取した。結果は、平均±ＳＥ（^＊＊＝ｐ＜０．０１、^＊＊＊＝ｐ＜０．００１）である。Ｄは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞または正常な線維芽細胞を含む異種移植片の表皮の長さに対する、抗Ｋｉ−６７抗体と反応的な非毛包表皮細胞の平均数を示す、棒グラフである。異種移植片は、示されるように、ラパマイシンによって処置したマウス、またはラパマイシンによって処置していないマウスから採取した。結果は、平均±ＳＥ（^＊＊＝ｐ＜０．０５）である。Ｅは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞または正常な線維芽細胞を含む異種移植片の全真皮面積に対する、抗Ｆ４／８０抗体と反応的な真皮細胞の平均数を示す、棒グラフである。異種移植片は、示されるように、ラパマイシンによって処置したマウス、またはラパマイシンによって処置していないマウスから採取した。結果は、平均±ＳＥ（^＊＊＊＝ｐ＜０．００１）である。Ｆは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞または正常な線維芽細胞を含む異種移植片の真皮面積当たりの血管の数として表した、抗ＣＤ３１陽性血管の平均数および面積を示す、棒グラフである。異種移植片は、示されるように、ラパマイシンによって処置したマウス、またはラパマイシンによって処置していないマウスから採取した。結果は、平均±ＳＥ（^＊＊＝ｐ＜０．０１、^＊＊＊＝ｐ＜０．００１）である。Ｇは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞または正常な線維芽細胞を含む異種移植片のそれぞれの血管の平均断面積として表した、抗ＣＤ３１陽性血管の平均数および面積を示す、棒グラフである。異種移植片は、示されるように、ラパマイシンによって処置したマウス、またはラパマイシンによって処置していないマウスから採取した。結果は、平均±ＳＥ（^＊＊＊＝ｐ＜０．００１）である。Ｈは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞または正常な線維芽細胞を含む異種移植片内の血管面積と真皮面積の割合として表した、抗ＣＤ３１陽性血管の平均数および面積を示す、棒グラフである。異種移植片は、示されるように、ラパマイシンによって処置したマウス、またはラパマイシンによって処置していないマウスから採取した。結果は、平均±ＳＥ（^＊＊＊＝ｐ＜０．００１）である。

【0038】

【図13】Ａは、ＴＳＣ患者の正常な線維芽細胞を含む異種移植片のＨＬＡ免疫化学染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した。Ｂは、ＴＳＣ患者の正常な線維芽細胞を含む異種移植片のＨＬＡ免疫化学染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した。Ｃは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞を含む異種移植片のＨＬＡ免疫化学染色された断面である。異種移植片は、ビヒクルで処置したマウスから採取した。Ｄは、ＴＳＣ患者のＴＳＣ２ヌル線維芽細胞を含む異種移植片のＨＬＡ免疫化学染色された断面である。異種移植片は、ラパマイシンで処置したマウスから採取した。

【0039】

【図14】図１４は、ＴＳＣ患者の正常な線維芽細胞またはＴＳＣ２ヌル線維芽細胞を含む異種移植片の真皮面積に対する、異種移植片の真皮の蛍光強度のパラメーターとして、ＨＬＡ確実性を定量化する棒グラフである。異種移植片は、示されるように、ラパマイシンによって処置したマウス、またはラパマイシンによって処置していないマウスから採取した（^＊＊＝ｐ＜０．０１）。

【0040】

【図15】図１５は、移植１７週後のＴＳＣ皮膚過誤腫のＴＳＣ２ヌル細胞を含む皮膚代替物のインサイチュハイブリダイゼーションである。ＤＡＰＩ染色は、青色の細胞の核を示す。Ｃｙ３は、水平方向の矢印を付した下部表皮鞘のＣｙ３標識細胞、および隣接する垂直方向の矢印を付したＣｙ３標識真皮線維芽細胞で赤色のヒト特異性動原体プローブである。ＦＩＴＣは、矢印を付したＦＩＴＣ標識内皮細胞で緑色のマウス特異性動原体プローブである。マージ（ＭＥＲＧＥ）は、これらの３つの像の結合である。

【0041】

【図16】図１６は、ｓｈＲＮＡベクターによって安定的に形質導入された新生児包皮線維芽細胞の蛍光顕微鏡の像（左側パネル）、および位相差顕微鏡の像（右側パネル）を示す。細胞は、ＧＡＰＤＨｓｈ対照、非標的ｓｈＲＮＡ対照（ｓｈを抑制しない）、またはＴＳＣ２ノックダウンベクター（ＴＳＣ２ｓｈ１、ＴＳＣ２ｓｈ２、ＴＳＣ２ｓｈ３）によって形質導入された。

【0042】

【図17】図１７は、非標的ｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＮＴ）、ＴＳＣ２（ＴＳＣ２、一番上のバンド）のレベルを示すＴＳＣ２ノックダウンベクター（ｓｈＴＳＣ２）、リン酸化リボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６）、全リボソームタンパク質Ｓ６（Ｓ６）、およびチューブリン負荷対照によって形質導入された包皮線維芽細胞の細胞溶解物のウェスタンブロットである。

【0043】

【図18】Ａは、４つの継代培養（Ｐ＝４）および正常な線維芽細胞（Ｐ＝４）でのＴＳＣ患者の皮膚腫瘍のＴＳＣ２ヌル細胞の単層培養におけるアルカリホスファターゼ活性（ＡＰ）染色（青色）である。Ｂは、初期継代培養（Ｐ＝４）および後期継代培養（Ｐ＝７）での正常なヒト毛乳頭細胞、および改変間葉系細胞（ｓｈＴＳＣ２によって形質導入された新生児包皮線維芽細胞）の単層培養におけるＡＰ活性の染色（青色）である。ＤＰ＝正常なヒト毛乳頭細胞；ｓｈＮＴ＝対照ｓｈＲＮＡによって形質導入された包皮線維芽細胞；ｓｈＴＳＣ２＝ＴＳＣ２ ｓｈＲＮＡによって形質導入された包皮線維芽細胞。

【0044】

【図19】図１９は、非テンプレート対照（ＮＴ）と比較した、ＴＳＣ２（ｓｈＴＳＣ２）のノックダウンによるレンチウイルス粒子によって安定的に形質導入された毛乳頭細胞（ＤＰ）、または新生児包皮線維芽細胞（ＮＦＦ）の単層培養におけるＡＰ活性の染色（青色）である。ＮＴ＝対照ｓｈＲＮＡ；ｓｈＴＳＣ２＝ＴＳＣ２ ｓｈＲＮＡ；ＤＰ＝毛乳頭細胞；ＮＦＦ＝新生児包皮線維芽細胞；４倍および１０倍は拡大レベルを示す。

【0045】

【図20】図２０は、対照、およびＦＬＣＮ遺伝子を抑制するように標的化された３つの異なる配列（ＦＬＣＮ１、ＦＬＣＮ２、およびＦＬＣＮ３）として、いずれかの非標的配列（ＮＴ）を有するレンチウイルス粒子によって安定的に形質導入された新生児包皮線維芽細胞の単層培養（Ｐ＝３）におけるＡＰ活性の染色（青色）である。ＮＴ＝対照ｓｈＲＮＡ；ｓｈＦＬＣＮ１、ｓｈＦＬＣＮ２、およびｓｃＦＬＣＮ３＝３つの異なるＦＬＣＮ ｓｈＲＮＡ；ｓｈＦＬＣＮ１２３＝全３つのＦＬＣＮサイレンシング配列の組合せ。

【0046】

【図21】図２１は、インビトロでの懸滴培養毛包分析の結果を示し、Ａは、１：１の比率のＴＳＣ２ノックダウンベクター（ｓｈＴＳＣ２）および新生児包皮ケラチン細胞（ＮＦＫ）によって形質導入された新生児包皮線維芽細胞からなる集塊であり、ヘマトキシロンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色される。Ｂは、１：１の比率の非標的対照ベクター（ＮＴ）およびＮＦＫによって形質導入された新生児包皮線維芽細胞からなる集塊であり、Ｈ＆Ｅで染色される。Ｃは、１：１の比率のＴＳＣ２ノックダウンベクター（ｓｈＴＳＣ２）およびＮＦＫによって形質導入された新生児包皮線維芽細胞からなる集塊であり、抗パンサイトケラチン抗体で染色される。Ｄは、１：１の比率の非標的対照ベクター（ＮＴ）およびＮＦＫによって形質導入された新生児包皮線維芽細胞からなる集塊であり、抗パンサイトケラチン抗体で染色される。Ｅは、１：１の比率のＴＳＣ２ノックダウンベクター（ｓｈＴＳＣ２）およびＮＦＫによって形質導入された新生児包皮線維芽細胞からなる集塊であり、抗パンサイトケラチン抗体で染色され、蛍光顕微鏡検査法を用いて視覚化される。髪繊維様構造体の自己蛍光に矢印を付す。

【0047】

【図22】図２２は、真皮−表皮複合体（皮膚代替物）における毛包様構造体のインビトロでの髪形成を示す。Ａは、複合体を気液界面に供してから４日後の皮膚等価物のヘマトキシロンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）分析を示す。複合体は、形質導入され、ＴＳＣ２ノックダウンベクターを安定的に発現させる新生児包皮線維芽細胞（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中１ｍｇ／ｍＬのラット尾部１型コラーゲン、および１×１０^６のケラチン細胞で被覆された）からなる。像を１０倍の対象レンズで撮影した。Ｂは、複合体を気液界面に供してから８日後のＨ＆Ｅで染色された皮膚代替物である。像を１０倍の対象レンズで撮影した。Ｃは、複合体を気液界面に供してから４日後の抗パンサイトケラチン抗体で染色された皮膚代替物である。像を１０倍の対象レンズで撮影した。Ｄは、複合体を気液界面に供してから８日後の抗パンサイトケラチン抗体で染色された皮膚代替物である。像を１０倍の対象レンズで撮影した。Ｅは、複合体を気液界面に供してから４日後の抗パンサイトケラチン抗体で染色された皮膚代替物である。像を４倍の対象レンズで撮影した。

【0048】

【図23】図２３は、移植１０週後にサンプリングされた真皮−表皮複合体のヘマトキシロンおよびエオシン染色された断面を示す。複合体は、ｓｈＲＮＡによってＴＳＣ２に形質導入された毛乳頭細胞、Ｉ型コラーゲン、および正常な新生児包皮ケラチン細胞からなっていた。Ａは、複数の毛包を含む移植片の低出力の（４０倍）像である。Ｂは、毛包漏斗（右側）、および近位の（球状体上の（ｓｕｐｒａｂｕｌｂａｒ））毛包（左側）の中程度出力の（１００倍）像である。Ｃは、近位の毛包の高出力の（４００倍）像であり、外毛根鞘および内毛根鞘、ならびに着色された毛幹皮質を示す。Ｄは、初期の皮脂腺発達および着色された髪繊維を有する毛包漏斗の高出力の像である。

【発明を実施するための形態】

【0049】

Ｉ．定義
本明細書に使用する、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈に明確に示されない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、またはこれらの変形が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかに使用される限度において、かかる用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に、包括的であることが意図される。

【0050】

本明細書に使用する、「約」および「およそ」という用語は、一部において、どのように測定されるか、または決定されるかに依存する（すなわち、測定システムの限界）、当業者によって決定される特定の値の許容し得る誤差の範囲内を意味する。例えば、「約」は、当該技術分野の実施ごとに、１〜１．５の標準偏差、または１〜２の標準偏差を意味する場合がある。また、「約」とは、所定の値の２０％、１０％、５％または１％以下の範囲を意味する場合がある。また、特に、生体系または生物学的過程に関して、この用語は、値の１桁以下、５倍以下、および２倍以下を意味する場合がある。特定の値が、出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値の許容し得る誤差の範囲内を意味する、「約」という用語が想定される。

【0051】

本明細書に使用する「アポクリン腺」という用語は、好酸性の細胞質と鼻先端（ａｐｉｃａｌ ｓｎｏｕｔ）を有する立方上皮細胞が並ぶ、広く拡張したルーメンを有するコイル状で管状の分泌部、および顕著な基底膜に基づく筋上皮細胞の外側不連続層を有した、皮膚の腺を指す。

【0052】

本明細書に使用する「組成物」という用語は、治療活性成分、および当該技術分野において従来の薬学的に許容し得、かつ治療目的で対象への投与に適切なキャリアまたは賦形剤等のキャリアを含む、混合物を指す。治療活性成分には、本発明の間葉系細胞が含まれ得る。別の実施態様において、「組成物」という用語は、本発明の皮膚代替物を指し、これは、以下にさらに詳細に説明する。さらに、本発明の組成物は、マトリックスを含み得、これは、以下に定義する。

【0053】

本明細書に使用する「毛乳頭」という用語は、毛包真皮乳頭（すなわち、毛包基部における間葉系細胞の凝縮状態）を指す。

【0054】

本明細書に使用する「低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能」という用語は、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体のレベル、機能、活性、および／または効果のダウンレギュレーションを指し、ＴＳＣ１もしくはＴＳＣ２のいずれかのダウンレギュレーション、またはＴＳＣ１もしくはＴＳＣ２の上流の調節因子の機能の変化によって、生じ得る。

【0055】

さらに、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体の機能は、その下流の標的、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２に影響を与える他のタンパク質によって模倣することができる。したがって、低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用するタンパク質のアップレギュレート、および／または増加したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用するタンパク質のダウンレギュレートによって、ｍＴＯＲＣ１機能が増加するか、ｍＴＯＲＣ２機能が低下するか、またはこれらの両方をもたらし、野生型の間葉系細胞と比較したかかる変化は、本発明の一実施態様に望まれる。

【0056】

低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能、増加したｍＴＯＲＣ１機能、および／または低下したｍＴＯＲＣ２機能は、次に示すものによって生じ得る：（１）ＴＳＣ１および／またはＴＳＣ２をダウンレギュレートすること；（２）ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を阻害するか、もしくは低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用する阻害タンパク質をアップレギュレートすること；または、（３）ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を刺激するか、もしくは増加したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用する刺激タンパク質をダウンレギュレートすること。増加したかまたは低下した機能の模擬体には、ｍＴＯＲシグナリングネットワークにおけるＴＳＣ１／ＴＳＣ２の下流のｍＴＯＲＣ１またはｍＴＯＲＣ２活性に影響を与える、他の分子が含まれる。

【0057】

本発明の一実施態様には、少なくとも１つの刺激タンパク質（例えば、ＬＫＢ１、ＮＦ１、ＰＴＥＮ、ＣＹＬＤ、ＦＬＣＮ、ＰＲＡＳ４０、４Ｅ−ＢＰ１、ＧＳＫ３、およびＭＥＮ１）の機能低下、および／または少なくとも１つの阻害タンパク質（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｋ、Ｅｒｋ、Ｒｓｋ１、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、Ｒｈｅｂ、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ｍＬＳＴ８、Ｓ６Ｋ１、リボソームタンパク質Ｓ６、ＳＫＡＲ、ＳＲＥＢＰ１、ｅＩＦ４ｅ、ＩＫＫｂｅｔａ、Ｍｙｃ、Ｒｕｎｘ１、およびｐ２７）の機能増加が含まれる。これらの改変はすべて、「低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能、増加したｍＴＯＲＣ１機能、および／または低下したｍＴＯＲＣ２機能」という用語に包含される。

【0058】

本明細書に使用する「エクリン腺」という用語は、皮膚の汗腺を指す。エクリン腺は、次に示す２つの解剖部分からなる：（１）分泌コイル、皮下組織との接続において深い真皮に位置し、明瞭な錐状体細胞および暗色細胞からなり、十分に区画形成された基底膜に基づく筋上皮細胞の単一の外側不連続層を囲む；および、（２）直線状皮内部と表皮内螺旋状部（表皮内汗管）からなる分泌部、および内在する筋上皮層を有さない小さな立方細胞の二重層。

【0059】

本明細書に使用する「内皮細胞」という用語は、血管の内壁に並ぶ、特殊な細胞を指す。

【0060】

本明細書に使用する「表皮細胞」という用語は、皮膚の表皮由来の細胞を指す。表皮細胞は、上皮細胞の１種である。表皮細胞の一例には、ケラチン細胞、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、およびメルケル細胞が含まれるが、これらに限定されない。

【0061】

本明細書に使用する「上皮細胞」という用語は、外側（皮膚）、粘膜、および身体の腔内と管腔に並ぶ、細胞を指す。特定の実施態様において、「上皮細胞」という用語は、重層扁平上皮細胞を指す。大部分の上皮細胞は、細胞構成要素の先端基部の偏りを示す。上皮細胞は、一般に、形状、およびこれらの特性によって分類される。例えば、扁平上皮細胞は、薄く、主として核によって区画形成された不規則な平坦形状を有する。扁平上皮細胞は、一般に、食道等の体腔の表面に並ぶ。特殊な扁平上皮は、血管（内皮細胞）、および心臓（中皮細胞）に並ぶ。立方上皮細胞は、立方体形状であり、これらの核を通常中心に有する。立方上皮細胞は、一般に、隠れているか、または吸収組織（例えば、腎臓細管、腺管、膵臓外分泌腺）にみられる。円柱状上皮細胞は、広いというよりも長く、また、細長い核は通常、細胞の基部に近い。また、これらの細胞は、絨毛様突起と呼ばれる小さな突起も有し、これは、細胞の表面積を増加させる。円柱状上皮細胞は、一般に、感覚器と同様に、胃腸の裏側を形成する。

【0062】

本明細書に使用する「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体の生産に必要な核酸コード配列を指す。ポリペプチドの所望の機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等）が保持される限り、ポリペプチドは、全長コード配列またはコード配列の任意の部分によって、コードすることができる。また、この用語は、構造遺伝子のコード領域も包含し、配列は、一方の端で約１ｋｂの距離の５’および３’末端のコード領域に隣接しており、その結果、「遺伝子」という用語は、全長ｍＲＮＡの長さに対応する。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。これらの配列は、「隣接」配列または領域と呼ばれる。５’隣接領域は、遺伝子の転写を制御するか、またはこれに影響を及ぼすプロモーターおよびエンハンサー等の調節配列を含み得る。３’隣接領域は、転写終了、転写後切断、およびポリアデニル化を指示する配列を含み得る。

【0063】

「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形態を共に包含する。遺伝子のゲノムの形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる、非コード配列で遮断されたコード領域を含み得る。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子の一部であり、エンハンサー等の調節要素を含み得る。イントロンは、核または一次転写産物から除去されるか、または「切り出される」ので、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写において不在である。ｍＲＮＡは、翻訳中に機能して、発生期のポリペプチドにおいて、アミノ酸の配列または順番を特定する。

【0064】

本明細書に使用する、「遺伝子ノックダウン」および「遺伝子サイレンシング」という用語は、１以上の遺伝子の発現を低減させる技術を指す。かかる遺伝子ノックダウン法には、ゲノムＤＮＡを変異させて、遺伝子転写もしくは翻訳を低減させるかまたは排除すること、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用する標的二本鎖切断の発生、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド等の試薬によってゲノムＤＮＡを処理することが含まれるが、これらに限定されない。本明細書に使用する「アンチセンスヌクレオチド」という用語は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡの一部と実質的に同一の（または実質的に相補的な）核酸分子を指す。アンチセンスヌクレオチドには、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短干渉ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）等の短い相補的な二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に使用する「発現を阻害するのに十分な量」という用語は、ｍＲＮＡまたは標的遺伝子から生じたタンパク質のレベルまたは安定性を低減させるのに十分なアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度または量を指す。本明細書に使用する「発現を阻害する」とは、タンパク質および／または標的遺伝子からのｍＲＮＡ産物のレベルの不足または顕著な減少を指す。阻害は、一時的かまたは恒久的であり得、用途に依存する。減少は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の減少であり得る。

【0065】

本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの変異体を包含する。ＲＮＡとＤＮＡ塩基配列を比較する場合に、チミンとのウラシルの置換を考慮に入れると、本明細書に使用する、アンチセンスオリゴヌクレオチドに適用される「実質的に同一」および「実質的に相補的」という用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１本鎖のヌクレオチド配列が、標的遺伝子の２０以上の連続したヌクレオチドと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であることを意味し、これは、ストリンジェントな条件（以下に定義する）下で標的遺伝子にハイブリダイズする。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的遺伝子の間の１００％の配列同一性は、本発明を実施するのに要求されない。本発明は、遺伝子操作もしくは合成、遺伝子突然変異、株多型、または進化分岐により期待され得る配列変異を許容することができる。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１、２以上のヌクレオチドの標的遺伝子によるミスマッチを含み得る。「２０以上のヌクレオチド」という用語は、標的遺伝子のコード配列または全長の標的遺伝子まで、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、１５００、または２０００の連続した塩基である、標的遺伝子の一部を意味する。

【0066】

また、「遺伝子ノックダウン」および「遺伝子サイレンシング」という用語は、１以上の遺伝子によって発現させたタンパク質の機能が低減される技術も指す。かかる遺伝子ノックダウン法には、ゲノムＤＮＡを変異させて、タンパク質機能を低減させるかまたは排除すること、タンパク質機能に干渉するか、またはこれを阻害する試薬によって細胞を処理することが含まれるが、これらに限定されない。本明細書に使用する、「機能を阻害するのに十分な量」という用語は、細胞のタンパク質機能のレベルを低減させるのに十分な試薬の濃度または量を指す。本明細書に使用する「機能阻害」とは、細胞におけるタンパク質機能のレベルの不足または顕著な減少をいう。

【0067】

本明細書に使用する「毛包」という用語は、髪が成長することができる表皮の管状の凹凸を指す。毛包は、正確な解剖箇所に毛幹を含み、長期移植生存、正常な毛包周期、および皮脂腺を示す。

【0068】

本明細書に使用する「髪の再生」という用語は、髪成長の成長期に入るための現存する無活動の毛包の刺激を指す。また、この用語は、無傷の無活動の毛包から始めるのではない、毛包残存物または毛包成分からの髪形成の刺激（例えば、顕微解剖した毛乳頭および毛包上皮の移植、または引き抜いた後の髪の成長）も指す。

【0069】

本明細書に使用する「髪新生」という用語は、毛包が先に存在しない皮膚、または所望の数の毛包よりも少ない数を有する皮膚に毛包が以前に存在しなかった箇所での、新たな毛包成長の刺激を指す。

【0070】

本明細書に使用する「ケラチン細胞」という用語は、表皮基底膜に接する基底細胞から扁平上皮細胞への細胞分裂および層化を受ける、皮膚表皮中の上皮細胞（毛包上皮中の細胞を含む）を指す。ケラチン細胞は、ケラチンを発現させる。

【0071】

本明細書に使用する「ケラチン細胞様細胞」という用語は、ケラチンを発現させ、重層扁平上皮形成能または毛包上皮形成能を有する、細胞を指す。ケラチン細胞様細胞は、皮膚細胞もしくは他の器官（骨髄もしくは気管等）、または幹細胞機能を有する細胞（胚性幹細胞を含む）か、もしくは多能性幹細胞を誘導する細胞由来であり得る。

【0072】

本明細書に使用する、「マトリックス」および「基質」という用語は、水和されたゲル様細胞支持体を形成することができる天然または合成の細胞外マトリックス様組成物を指す。細胞は、マトリックスおよび基質内、またはこれらの上に堆積することができる。マトリックスおよび基質は、構造機能および接着機能を共に有する１以上の線維性タンパク質を含み得る。かかるタンパク質には、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ならびにコラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＩが含まれるが、これらに限定されない。または、もしくはさらに、マトリックスおよび基質は、タンパク質に共有結合した多糖鎖を含んだプロテオグリカン分子を含み得る。かかるプロテオグリカンには、ヒアルロナン結合タンパク質、ヘパリン硫酸結合タンパク質、コンドロイチン結合タンパク質、ケラチン硫酸結合タンパク質、およびデルマチン硫酸結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。

【0073】

本明細書に使用する「間葉系細胞」という用語は、毛包からの毛乳頭および結合組織鞘の細胞に類似する毛包形成潜在能または誘導能を有する多能性細胞を指す。間葉系細胞は、通常、ビメンチンを発現させる中胚葉結合組織細胞と考えられるが、所定の属性を有する細胞は、誘導された神経冠でもあり得る。間葉系細胞は、次に示す１以上の供給源から単離することができる：自家細胞のための患者の皮膚または粘膜；同種異型細胞のためのドナーの皮膚または粘膜；正常な皮膚または粘膜；付属器腫瘍を有する皮膚；および、他の組織（例えば、脂肪、骨髄）。間葉系細胞には、線維芽細胞、毛乳頭細胞、表皮鞘細胞、爪線維芽細胞（ｏｎｙｃｈｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）（爪単位の線維芽細胞）、歯髄細胞、歯周靱帯細胞、神経冠細胞、付属器腫瘍細胞、人工多能性幹細胞、ならびに骨髄、臍帯血、臍帯、脂肪、および他の器官からの間葉系幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。

【0074】

本明細書に使用する、「形態学的に正確で」および「十分に開発された」という用語は、毛包基部に位置する毛包および毛乳頭の遠心端から現われる上皮フィラメントを有した正常な形態を有する、毛包を指す。また、毛包は、毛包基部で増殖する細胞も有し、外毛根鞘および内毛根鞘、角皮および皮質の同心層も有する。毛包は、外毛根鞘の正常な分化を示し、毛幹および皮脂腺を有する。髪は、正常な周期を経て、上皮幹細胞構成要素を含む。

【0075】

本明細書に使用する「突然変異」という用語は、遺伝子のコード配列の変化を指す。突然変異には、ミスセンス突然変異、フレームシフト突然変異（すなわち、挿入および欠失）、スプライス部位突然変異、ナンセンス突然変異（すなわち、早期終止コドン）、および遺伝子自体の欠失が含まれる。

【0076】

本明細書に使用する、「遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列」という用語、または「遺伝子コード化」等のその変形は、遺伝子のコード領域、または遺伝子産物（すなわち、ポリペプチド）をコードする核酸配列を含む、核酸配列を意味する。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ形態に存在し得る。ＤＮＡ形態に存在する場合、ヌクレオチド配列は、一本鎖（すなわち、センス鎖）かまたは二本鎖であり得る。転写の適切な開始、および／または初期ＲＮＡ転写の正確な処理を可能にするのに必要な場合、エンハンサー／プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の適切な制御要素は、遺伝子のコード領域のすぐ近くに配置されてもよい。または、コード領域は、内因性のエンハンサー／プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナル等、または内因性および外因性の制御要素の組合せを含み得る。

【0077】

本明細書に使用する「薬学的に許容し得るキャリア」という用語は、従来型の無毒な固形物、半固形物、または液状充填物、希釈剤、封入材料、製剤補助物、または賦形剤を指す。薬学的に許容し得るキャリアは、利用される用量および濃度においてレシピエントに無毒であり、製剤の他の原料と相溶性がある。

【0078】

本明細書に使用する、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を指すのに区別しないで使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、置換されたそのアルファ−アノマー型、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオアート、メチルホスホナート、および／または天然に存在するおよび天然に存在しない類似体もしくはこれらの誘導体を含み得る。また、この用語には、野生型配列の天然に存在するおよび天然に存在しない変異体も含まれる。変異体には、野生型配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の挿入、付加、欠失、または置換が含まれ得る。一部の実施態様において、アミノ酸残基の１０％未満は、変異体のタンパク質産物に組み換えられる。別の実施態様において、アミノ酸残基の５％未満は組み換えられる。挿入および欠失変異体には、対応する野生型配列の長さの９０％、９５％、１０５％、または１１０％であるポリヌクレオチドが含まれる。

【0079】

本明細書に使用する「皮脂腺」という用語は、皮脂腺起源の出芽として生じる、毛包依存性腺を指す。皮脂腺は、丸い細胞（脂肪細胞）の複数の小葉からなり、脂質含有液胞で充填され、小さく暗色の胚芽細胞の単層に囲まれる。小葉は、短い管に集中し、これは、変性した脂肪細胞の脂質内容物を毛包に移す。

【0080】

本明細書に使用する、「皮膚代替物」、「皮膚等価物」、「真皮−表皮複合体」、および「皮膚移植片」という用語は、完全なもしくは部分的な、一時的なもしくは恒久的な、損傷した皮膚の交換の目的で使用され、解剖学的にもしくは機能的にヒト皮膚と一部の類似性を有する、生産物を指す。本発明の文脈では、これらの用語は、上皮細胞のインビトロ由来の培養物と組み合わせた、アップレギュレートされたＴＳＣ１／ＴＳＣ２ネットワークを有する間葉系細胞のインビトロ由来の培養物を指す。皮膚代替物には、生物工学によって作製された皮膚等価物、生体組織工学によって作製された皮膚、生体組織工学によって作製された皮膚構築物、生体皮膚代替物、生物工学によって作製された皮膚代替物、皮膚代替バイオ皮膚構築物、生存皮膚交換物、真皮−表皮複合体、および生物工学によって作製された代替組織が含まれるが、これらに限定されない。

【0081】

本明細書に使用する、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、ポリヌクレオチドが、標的配列だけでなく、最小数の他の配列にもハイブリダイズする条件を指す。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、Ｎａ^２＋またはＫ^２＋の無機陽イオンを有する塩の低濃度（＜０．１５Ｍ）（すなわち、低いイオン強度）、ハイブリダイズされた複合体のＴｍよりも低く、２０℃〜２５℃よりも高い温度（すなわち、標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度）、およびホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、または洗浄剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の変性剤の存在下が含まれる。Ｔｍ値は、次に示す方程式によって算出することができる：核酸が１ＭのＮａＣｌの水溶液中にある場合、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎとＹｏｕｎｇの文献：「核酸ハイブリダイゼーションにおける定量フィルターハイブリダイゼーション（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」［１９８５］を参照のこと）。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、４倍塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約６５〜７０℃のハイブリダイゼーション、４倍ＳＳＣと５０％ホルムアミド中で約４２〜５０℃のハイブリダイゼーション後に、約６５〜７０℃で、１倍ＳＳＣ中での１回以上の洗浄、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡでのハイブリダイゼーション、６０℃で１２〜１６時間ハイブリダイゼーション後に、０．１％ＳＤＳおよび０．１％ＳＳＣによって、６０℃で１５〜６０分間の洗浄、ならびに、５倍ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ_２ＰＯ_４Ｈ_２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨで７．４に調整したｐＨ）、０．５％ＳＤＳ、５倍のデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）試薬、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液で、４２℃のハイブリダイゼーション後、４２℃で、０．１倍ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中での洗浄が含まれるが、これらに限定されない。

【0082】

本明細書に使用する「トランスフェクション」という用語は、真核細胞への外来ＤＮＡの導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、原形質融合、レトロウイルス感染、およびバイオリスティクスを含む、当該技術分野で公知の種々の手段によって行うことができる。また、トランスフェクションには、複製不適当なレトロウイルスベクターによって行われた外来ＤＮＡの導入も含まれ、これも、形質導入またはウイルス形質導入と呼ばれる。「安定したトランスフェクション」、または「安定的にトランスフェクトされた」という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外来ＤＮＡの導入および組込みを指す。「一時的なトランスフェクション」、または「一時的にトランスフェクトされた」という用語は、細胞への外来ＤＮＡの導入であって、外来ＤＮＡが、トランスフェクトされた細胞のゲノムに組み込まれないものを指す。外来ＤＮＡは、数日間、一時的にトランスフェクトされた細胞の核を維持する。この間に、外来ＤＮＡは、調節制御され、染色体中の内因性遺伝子の発現が調節される。

【0083】

本明細書に使用する「治療」という用語は、所定の薬理学効果および／または生理学効果を得るための、ヒトを含む哺乳動物における症状の管理または矯正の適用を指す。治療には、例えば、失われたか、欠けているか、不完全な機能を回復するかもしくは修復すること、または効果のない過程を刺激することによって、症状を抑制すること、その進行を阻止すること、または症状を緩和することが含まれる。

【0084】

本明細書に使用する「発毛促進性の（ｔｒｉｃｈｏｇｅｎｉｃ）」という用語は、細胞の毛包誘導能、および／または毛包形態形成促進能（すなわち、毛包形成（ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ））を指す。

【0085】

本明細書に使用する、「野生型」および「通常の」という用語は、天然に存在する供給源における遺伝子、遺伝子産物、またはシグナリングネットワークの特性を有する、遺伝子、遺伝子産物、またはシグナリングネットワークを指す。野生型遺伝子、遺伝子産物、またはシグナリングネットワークは、個体で最も頻繁にみられ、このため、任意に設計された「通常の」または「野生型」の形態である。対照的に、「改変された」、「突然変異体」、および「変異体」という用語は、対応する野生型のものと比較した場合、配列および／または機能特性の改変（すなわち、変更された特性）を示す、遺伝子、遺伝子産物、またはシグナリングネットワークを指す。天然に存在する供給源から天然に存在する突然変異体を単離することができ、これは、対応する野生型の遺伝子、遺伝子産物、またはシグナリングネットワークと比較して、これらが変更された特性を有するという事実によって同定されることに留意する。

【0086】

ＩＩ．本発明の皮膚代替物
驚くべきことに、良性付属器腫瘍から採取された細胞が発毛促進性であることが分かった。具体的には、アップレギュレートされたｍＴＯＲＣ１／ＴＳＣ１／ＴＳＣ２シグナリングネットワークを示す間葉系細胞は、毛包を誘導することができる。かかる毛包は、Ｃｈｕｏｎｇらの文献：「幹細胞生物工学の時代における毛包の定義（Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｇｅ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１２７：２０９８−１００（２００７）によって提案された基準に従って完成される。毛包は、毛包基部に位置する毛包および毛乳頭の遠心端から現われる上皮フィラメントを有した正常な形態を有する。毛包は、毛包基部で増殖する細胞を有し、外毛根鞘および内毛根鞘、角皮および皮質の同心層を有する。毛包は、外毛根鞘の正常な分化を示し、毛幹および皮脂腺を有する。髪は、正常な周期を経て、上皮幹細胞構成要素を含む。

【0087】

したがって、本発明は、髪新生が可能な細胞組成物を提供する。一実施態様において、本発明は、上皮細胞と改変間葉系細胞とを含む皮膚代替物であって、改変間葉系細胞が、野生型間葉系細胞と比較して、低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能、増加したｍＴＯＲＣ１機能、および／または低下したｍＴＯＲＣ２機能を有する、皮膚代替物を提供する。本発明の別の実施態様は、改変間葉系細胞であって、改変間葉系細胞が、野生型間葉系細胞と比較して、低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能、増加したｍＴＯＲＣ１機能、および／または低下したｍＴＯＲＣ２機能を有し、かつ改変間葉系細胞が、患者自身の上皮細胞と相互作用することができる、改変間葉系細胞を提供する。

【0088】

一実施態様において、組成物は、良性付属器腫瘍から単離された発毛促進性間葉系細胞を含み、これは、野生型細胞に対して「改変された」と考えることができる。または、生毛細胞（ｔｒｉｃｈｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）は、通常の間葉系細胞または野生型間葉系細胞と比較して、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を低下させること、ｍＴＯＲＣ１機能を増加させること、および／またはｍＴＯＲＣ２機能を低下させることによって、人工的に作製してもよい。本発明の間葉系細胞では、ＴＳＣ１もしくはＴＳＣ２のダウンレギュレート；ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を阻害するか、もしくは低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用する、阻害タンパク質のアップレギュレート；または、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を刺激するか、もしくは増加したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用する、刺激タンパク質のダウンレギュレートによって、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２の機能は低下し、ｍＴＯＲＣ１の機能は増加し、および／またはｍＴＯＲＣ２の機能は増加する。

【0089】

Ａ．哺乳動物の皮膚の一般的特性
哺乳動物の皮膚は、表皮と呼ばれる外側層と、真皮と呼ばれる中間層の２つの第一の層を含む。表皮は、有糸分裂によって表皮の深い層に形成され、次いで、表面まで移動する、ケラチン細胞を主として含み、ケラチン細胞は結局屑する。真皮は、毛包、皮脂腺、汗腺、アポクリン腺、神経、リンパ管、および血管を含んだ種々の構造体を含む。

【0090】

毛包形態形成は、胚形成時において多くは子宮内で生じる。毛包形成は、表皮プラコードの外観から始まり、これは、新しい毛包の位置を示す。その後、間葉系細胞（すなわち、誘導型多能性細胞）は、表皮プラコードより下にある真皮に凝集し始める。間葉系細胞凝集物は、被覆したプラコードのケラチン細胞にシグナルを送り、その後、真皮の下方に増殖し始める。表皮のケラチン細胞が間葉系細胞凝集物に達すると、細胞は、一連の分化と増殖の過程を経て、結局、成熟した毛包を形成する。

【0091】

成熟した毛包は、毛乳頭（ＤＰ）、表皮鞘（ＤＳ）、毛包上皮、および毛幹の４つの主要部分を含む（図１Ｄ）。ＤＰは、毛幹を生ずる髪マトリックスに隣接する毛包の基部または毛包球に位置する。ＤＳは、結合組織から構成され、毛包を覆う。毛包上皮には、外毛根鞘および内毛根鞘が含まれる。毛幹は、毛包基部から皮膚の外部の表皮まで延びるタンパク質構造体である。

【0092】

毛包は、成長（成長期）、退行（退行期）、および静止（休止期）の期間を通じて、繰り返し循環する、動的な小器官である。毛包下部は、逆行するか、または再成長し、真皮の間葉系細胞と表皮細胞の間の複雑な相互作用によって、各周期で再生する。連続的に再形成した部分の上の下部毛包の恒久的部分は、わずかに毛包から突き出るので、「膨出（ｂｕｌｇｅ）」と呼ばれる。膨出は、毛包、皮脂腺、および表皮を形成することができる多能性細胞を含む。患者の年齢、成長期および退行期の毛包周期は、短くなり、毛包は、休止期への急速な変化を経験する。その結果、正常な髪は、微細なうぶ毛に徐々に代わり、一部の患者において、細胞は、これらの発毛促進特性を完全に失う場合がある。

【0093】

Ｂ．本発明に使用する皮膚細胞
本発明の皮膚代替物は、（１）改変間葉系細胞、または（２）改変間葉系細胞および上皮細胞のいずれかを含む。皮膚代替物が改変間葉系細胞を含み、上皮細胞を含まない実施態様において、間葉系細胞は、患者の上皮細胞と相互作用して、毛包を生ずる。皮膚代替物が改変間葉系細胞と上皮細胞とを含む実施態様において、改変間葉系細胞および上皮細胞は、皮膚代替物に供され、患者の上皮細胞と相互作用してか、または相互作用しないで、毛包を生ずる。

【0094】

１．間葉系細胞
一般に、間葉系細胞（すなわち、誘導型多能性細胞）の供給源が、本発明に有用である。したがって、本発明は、毛包形成誘導能または潜在能を有する特定の供給源の細胞の使用に限定されない。実際、本発明は、毛包を誘導することができる種々の細胞系および供給源の使用を考慮する。間葉系細胞は、通常、ビメンチンを発現させる中胚葉結合組織細胞と考えられるが、これらの属性を有するビメンチン発現細胞は、誘導された神経冠でもあり得る。細胞の供給源には、毛乳頭の誘導型多能性細胞、および毛包の結合組織鞘が含まれる。間葉系細胞は、次に示す１以上の供給源から単離することができる：自家細胞のための患者の皮膚または粘膜；同種異型細胞のためのドナーの皮膚または粘膜；正常な皮膚；付属器腫瘍を有する皮膚；および、他の組織（例えば、脂肪、骨髄等）。間葉系細胞の一例には、線維芽細胞、毛乳頭細胞、表皮鞘細胞、爪線維芽細胞（爪単位の線維芽細胞）、歯髄細胞、歯周靱帯細胞、神経冠細胞、付属器腫瘍細胞、人工多能性幹細胞、ならびに骨髄、臍帯血、臍帯、脂肪、および他の器官からの間葉系幹細胞が含まれる。

【0095】

２．上皮細胞
一般に、扁平上皮に階層化することができる上皮細胞または細胞系の供給源が、本発明に有用である。したがって、本発明は、扁平上皮に分化することができる、特定の供給源の細胞の使用に限定されない。実際、本発明は、重層扁平上皮に分化することができる、種々の細胞系および供給源の使用を考慮する。細胞の供給源には、初期および不死化ケラチン細胞、ケラチン細胞様細胞、ならびに、ヒトおよび死後硬直ドナーから得られるケラチン細胞様細胞への分化能を有する細胞（Ａｕｇｅｒらの文献：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−−Ａｎｉｍａｌ ３６：９６−１０３；および、米国特許第５，９６８，５４６号および同第５，６９３，３３２号）、新生児包皮（Ａｓｂｉｌｌらの文献：Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７（９）：１０９２−９７（２０００）；Ｍｅａｎａらの文献：Ｂｕｒｎｓ ２４：６２１−３０（１９９８）；米国特許第４，４８５，０９６号；同第６，０３９，７６０号；および、同第５，５３６，６５６号）、およびＮＭ１細胞等の不死化ケラチン細胞系（Ｂａｄｅｎの文献：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２３（３）：２０５−２１３（１９８７））、ＨａＣａＴ細胞（Ｂｏｕｃａｍｐらの文献：Ｊ．ｃｅｌｌ．Ｂｏｉｌ．１０６：７６１−７７１（１９８８））；ならびに、ＮＩＫＳ細胞（細胞系ＢＣ−１−Ｅｐ／ＳＬ；米国特許第５，９８９，８３７号；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２１９１）が含まれる。

【0096】

また、上皮細胞は、次に示すものからも得ることができる：患者の皮膚もしくは粘膜（自家）、ドナー皮膚もしくは粘膜（同種異型）、表皮細胞系、幹細胞由来の表皮細胞、初期もしくは継代表皮細胞、気管、および血液単核球細胞もしくは循環幹細胞由来の細胞。また、これらの供給源の上皮細胞のサブポピュレーションは、例えば、幹細胞特性により細胞数を増やすことによって使用することもできる。上皮細胞は、ケラチンを発現させるか、またはケラチンを発現させるのを誘導し、重層扁平上皮および／または毛包上皮形成能を有する。

【0097】

一部の実施態様において、上皮細胞は、２つの異なる供給源由来である。例えば、本発明は、自家ケラチン細胞と共に、不死化ケラチン細胞を使用して実施してもよい。不死化細胞と自家細胞の相対比率は、１：９９、５：９５、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、または９０：１０であり得る。このように、自家ケラチン細胞の数を低減してもよい。不死化ケラチン細胞は、例えば、細胞を遺伝子組み換えして、成長因子または血管新生因子を発現させることによって、増強し、皮膚治癒を促進してもよい。移植後の一時点に不死化ケラチン細胞を除去することを目標とするように、不死化ケラチン細胞を改変することができる。一実施態様において、具体的には、いわゆる「自殺遺伝子」を使用することができ、また、細胞が薬物療法に応じて死ぬように、細胞を遺伝子組み換えすることができる。（Ｖｏｇｌｅｒらの文献：「効果的な精製のための改変双シストロン性ＣＤ２０／ｔＣＤ３４ベクター、および養子免疫療法のための遺伝子組換え型Ｔ細胞のインビボ除去（Ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ＣＤ２０／ｔＣＤ３４ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．ｄｏｉ：１０．１０３８（２０１０年５月１１日）（オンライン電子出版）；および、Ｓｃａｉｆｅらの文献：「移植片対宿主病のレンチウイルスベクターの新たな適用（Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｔｏｗａｒｄｓ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ）」，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｊｕｎ；９（６）：７４９−６１を参照のこと）。

【0098】

３．細胞の単離
間葉系細胞および上皮細胞は、適切な方法を用いて、皮膚または粘膜の試料または皮膚腫瘍から単離することができる。例えば、間葉系細胞は、組織外植片から細胞の移動によって単離してもよい。かかる方法の一例は、実施例３でさらに詳細に説明する。または、細胞を、皮膚または粘膜の試料または皮膚腫瘍から解離して、間葉系細胞および上皮細胞を単離することができる。かかる方法の一例は、実施例３でさらに詳細に説明する。さらに、上皮細胞は、多能性幹細胞を誘導して、上皮細胞に分化することによって単離することができる。かかる方法の一例は、実施例７でさらに詳細に説明する。

【0099】

単離した細胞は、当業者に公知の適切な培地で増殖させることができる。例示的な培地は、実施例６で詳細に論じる。試料は、当業者に公知の方法に基づいて、髪誘導細胞で富化することができる。例えば、細胞は、実施例５で非常に詳細に論じるように、ＣＤ１３３、ＣＤ１０、またはネスチン等の適切な細胞マーカーの存在に基づいて、選択してもよい。または、実施例５で非常に詳細に論じるように、ＢＭＰ２、４、５、または６、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ、インシュリン、ＦＧＦ２、ＫＧＦ等の成長因子を加えて、毛乳頭細胞を含む髪誘導細胞を維持し富化してもよい。また、細胞は、実施例８で非常に詳細に論じる、細胞接着および細胞選別法を用いて、これらの毛包分化能を強化してもよい。

【0100】

Ｃ．ＴＳＣ１／ＴＳＣ２およびｍＴＯＲシグナリングネットワーク
本発明の皮膚代替物に使用する改変間葉系細胞は、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２およびｍＴＯＲシグナリングネットワークに対して自然に発生する改変を有するか、または、これを設計して、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２およびｍＴＯＲシグナリングネットワークの改変を形成する。したがって、「改変された」という用語は、野生型の細胞と比較して、このネットワークへの自然に発生し、および設計された変化を包含する。

【0101】

ＴＳＣ１およびＴＳＣ２の遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子である。ＴＳＣ１は、染色体９ｑ３４に位置し、ハマルチンと呼ばれる１４０ｋＤａのタンパク質をコードするのに対し、ＴＳＣ２は、染色体１６ｐ１３．３に位置し、チュベリンと呼ばれる２００ｋＤａのタンパク質をコードする。ハマルチン（ＴＳＣ１とも呼ばれる）、およびチュベリン（ＴＳＣ２とも呼ばれる）は、会合して、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体と呼ばれるヘテロ二量体タンパク質複合体を形成する。ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体は、本明細書中でＴＳＣ１／ＴＳＣ２およびｍＴＯＲシグナリングネットワークと呼ばれるものにシグナリングネットワークのネットワークを結合する、中心ハブとして機能する。

【0102】

ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体は、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的）ネットワークの一部である、ｍＴＯＲＣ１の阻害機能によって本発明におけるその効果を発揮すると考えられる。また、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体は、ｍＴＯＲＣ２の機能を刺激するとも考えられる。ｍＴＯＲネットワークは、成長調節および増殖制御を中心に関係する。図２は、ｍＴＯＲネットワークの概要の概略図を示す。ｍＴＯＲは、キナーゼのホスホイノシチド−３−キナーゼ関連（ＰＩ３Ｋ関連）ファミリーのメンバーである。構造的および機能的に明瞭な２つのｍＴＯＲ含有複合体が哺乳動物細胞で同定されている（ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ）。

【0103】

ＴＳＣ１／ＴＳＣ２タンパク質複合体は、ｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方の上流に機能する。ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体は、小さなＧタンパク質Ｒｈｅｂ（脳に濃縮するＲａｓの同族体）を不活性化し、これによって、ｍＴＯＲＣ１を消極的に調節する、ＴＳＣ２タンパク質によってＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）機能を示す。対照的に、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体は、積極的にｍＴＯＲＣ２を調節する。

【0104】

また、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体、ならびに個々のＴＳＣ１およびＴＳＣ２タンパク質は、多くの他のシグナリングネットワークと相互作用する。例えば、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体は、ＩｎＲ（インシュリン様受容体）、ＰＴＥＮ（染色体１０で欠失したリン酸塩およびテンシン相同体）、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ）、ならびにＳ６Ｋ１（７０ｋＤａのリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ）を含む、ＩｎＲシグナルの成分と相互作用する。さらに、ＴＳＣ１は、タンパク質ＤＯＣＫ７、エズリン／ラジキシン／モエシン、ＦＩＰ２００、ＩＫＫｂｅｔａ、Ｍｅｌｔｅｄ、メルリン、ＮＡＤＥ（ｐ７５ＮＴＲ）、ＮＦ−Ｌ、Ｐｌｋ１、およびＴＢＣ７と相互作用する。ＴＳＣ２は、１４−３−３（アイソフォームベータ、イプシロン、ガンマ、イータ、シグマ、タウ、およびゼータ）、Ａｋｔ、ＡＭＰＫ、ＣａＭ、ＣＲＢ３／ＰＡＴＪ、サイクリンＡ、サイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄｓｈ、ＥＲａｌｐｈａ、Ｅｒｋ、ＦｏｘＯ１、ＨＥＲＣ１、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＳＣＰ−７０、ＨＳＰ７０−１、ＭＫ２、ＮＥＫ１、ｐ２７ＫＩＰ１、Ｐａｍ、ＰＣ１、ＰＰ２Ａｃ、ラバプチン−５（Ｒａｂａｐｔｉｎ−５）、Ｒｈｅｂ、ＲｘＲａｌｐｈａ／ＶＤＲ、およびＳＭＡＤ２／３と相互作用する。タンパク質ａｘｉｎ、Ｃｄｋ１、サイクリンＢ１、ＧＡＤＤ３４、ＧＳＫ３、ｍＴＯＲ、およびＲＳＫ１は、ＴＳＣ１およびＴＳＣ２との共免疫沈殿が示されている。キナーゼＣｄｋ１およびＩＫＫｂｅｔａは、ハマルチンをリン酸化する。Ｅｒｋ、Ａｋｔ、ＭＫ２、ＡＭＰＫ、およびＲＳＫ１は、ＴＳＣ２をリン酸化する。また、ＧＳＫ３は、ＴＳＣ１およびＴＳＣ２を共にリン酸化する。したがって、これらの種々のタンパク質、およびこれらの関連するシグナリングネットワークは、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２およびｍＴＯＲシグナリングネットワークの一部と考えられる。

【0105】

これらのうち、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＦＬＣＮ、ＭＥＮ１、およびＰＴＥＮは、以下に論じる、皮膚の付属器腫瘍に対して遺伝性素因を有する種々の症候群に共有される。

【0106】

１．ＴＳＣ１／ＴＳＣ２の機能を低下させるための方法、および低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体をダウンレギュレートするための方法
ＴＳＣ１／ＴＳＣ２の機能は、ｍＴＯＲＣ１の機能を増加させ、および／またはｍＴＯＲＣ２の機能を低下させることができる、当業者に公知の方法によって低下させることができる。これは、ＴＳＣ１またはＴＳＣ２を直接ダウンレギュレートすることによって、および／または、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を刺激するか、もしくは増加したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体（例えば、ＣＹＬＤ、ＬＫＢ１、ＦＬＣＮ、ＭＥＮ１、ＮＦ１、ＰＴＥＮ、ＰＲＡＳ４０、４Ｅ−ＢＰ１、ＧＳＫ３、もしくはＤｅｐｔｏｒ）として作用する、刺激タンパク質のダウンレギュレートによって、実行することができる。

【0107】

例えば、細胞は、刺激タンパク質をコードする遺伝子に指示された、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短干渉ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）等の短い相補的な二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）によって、処理することができる。当業者は、正常な間葉系細胞中でノックダウン遺伝子発現の標準手順を用いることができる。例えば、レンチウイルス粒子を使用して、カスタムクローン化短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を間葉系細胞に送達することができる。かかる方法の詳細な説明は、実施例２および４に提供する。

【0108】

または、もしくはさらに、遺伝子療法に基づく方法を用いて、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、および／またはＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を刺激する刺激タンパク質をダウンレギュレートすることができる。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ等のジンクフィンガータンパク質を使用して、ＴＳＣ１もしくはＴＳＣ２遺伝子に、またはＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を刺激する刺激タンパク質をコードする遺伝子に、標的二本鎖切断を発生させることができる。相同性のない端部接続過程によって、かかる二本鎖切断は、標的遺伝子の機能的なノックアウトを形成する。

【0109】

また、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、および／または刺激タンパク質は、これらのタンパク質をコードする遺伝子を突然変異させて、タンパク質機能を排除することによって、阻害することもできる。さらに、ＴＳＣ１またはＴＳＣ２の機能は、特定の相互作用するタンパク質の発現を減少させることによって、間接的に調節することもできる。例えば、Ａｋｔリン酸化からＴＳＣ２を保護することによってｍＴＯＲＣ１を抑制するタンパク質である、ポリシスチン−１の発現をノックダウンすること（Ｄｅｒｅ Ｒ．らの文献：「ポリシスチン−１のカルボキシ末端は、ＴＳＣ２の局在化を調節して、ｍＴＯＲを抑制する（Ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔａｉｌ ｏｆ ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｎ−１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＳＣ２ ｔｏ ｒｅｐｒｅｓｓ ｍＴＯＲ）」，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，５（２）：ｅ９２３９（２０１０））が、ＴＳＣ２機能を低下させると予想される。別のアプローチは、上流または下流に相互作用するタンパク質を調節するタンパク質の発現をノックダウンすることである。例えば、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の欠損によって、ｍＴＯＲＣ１の活性化が生じ、Ｄｅｐｔｏｒをノックダウンすることが、ｍＴＯＲＣ１機能を増加させると予想される。または、細胞は、刺激タンパク質の機能を減少させる化学物質または分子によって処理することができる。例えば、ＴＳＣ２は、ＡＭＰＫによって活性化され、化合物Ｃまたはスニチニブ等のＡＭＰＫを阻害する薬剤（Ｌａｄｅｒｏｕｔｅ Ｋ．Ｒ．らの文献「ＳＵ１１２４８（スニチニブ）は、哺乳動物の５’−ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性を直接阻害する（ＳＵ１１２４８（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ） ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ５’−ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＡＭＰＫ））」，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．，１０（１）（２０１０））は、ＴＳＣ２機能を低下させることができる。

【0110】

２．ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を阻害するか、または低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用する阻害タンパク質をアップレギュレートするための方法
ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を阻害するか、または低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体として作用するタンパク質の機能は、ｍＴＯＲＣ１の機能を増加させ、および／またはｍＴＯＲＣ２の機能を低下させることができる、当業者に公知の方法によって、増加させることができる（例えば、Ｏｒｔｉｚ−Ｕｒｄａ，Ｓ．らの文献：「遺伝子操作された線維芽細胞の注入は、再生ヒト表皮水疱症皮膚組織を矯正する（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ｃｏｒｒｅｃｔｓ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ Ｂｕｌｌｏｓａ Ｓｋｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ）」，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１１（２）：２５１−２５５（２００３）を参照のこと）。例えば、阻害タンパク質の機能は、強いプロモーターでノックして、阻害タンパク質をコードする遺伝子の発現を促進することによって、増加させることができる。かかる方法の詳細な説明は、実施例４に提供する。

【0111】

または、細胞は、遺伝子に指示されたｄｓＲＮＡによって処理することができ、その産物は、阻害タンパク質の発現または機能を抑制する。また、阻害タンパク質の機能は、阻害タンパク質をコードする遺伝子を突然変異させて、構造的に活性のあるタンパク質にすることによって増加させることもできる。または、実施例４で詳細に説明するように、阻害タンパク質は、細胞に直接送達することができる。

【0112】

３．良性付属器腫瘍
上に論じるように、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２およびｍＴＯＲシグナリングネットワークの改変は、自然に発生し得る。これらの自然に発生する改変は、良性付属器腫瘍に存在し得る。したがって、良性付属器腫瘍は、本発明による改変間葉系細胞の十分な供給源を提供すると考えられる。

【0113】

良性付属器腫瘍は、次に示す、正常な皮膚に存在する種々の型の付属器上皮のうちの１つへの形態分化を示す、非悪性皮膚腫瘍である。（１）毛包脂腺単位（すなわち、毛幹、毛包、および皮脂腺）；（２）エクリン汗腺；および、（３）アポクリン汗腺。良性付属器腫瘍は、通常、多分葉化され、対称で滑らかな境界を有し、通常、腫瘍壊死または潰瘍形成がなく、上皮細胞の均一な集団を有する。異型性（すなわち、細胞異常）は通常ない。また、有系分裂活性は、一般に最小である。密な線維性間質反応が、これらの腫瘍で頻繁に生じる。

【0114】

良性付属器腫瘍の一例には、線維血管腫、アポクリン／エクリン母斑、類基底の表皮増殖、類基底毛包過誤腫、軟骨様汗管腫、円柱腫、癒着性毛根鞘腫、癒着性毛髪上皮腫、線維毛包腫、線維性斑、毛包皮脂嚢胞性過誤腫（ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｓｅｂａｃｅｏｕｓ ｃｙｓｔｉｃ ｈａｍａｒｔｏｍａ）、前額部斑（図１Ａ）、毛包母斑、単純汗腺棘細胞腫、汗腺腫、乳頭状汗腺腫、汗腺嚢腫、インフンディブローマ、表皮内炎症性硬結、イスシミコーマ、ヤーダッソーン脂腺母斑、小結節性汗腺腫、真皮間葉系細胞損傷に重なる器官母斑、乳頭状腺腫、毛包周囲線維腫、毛の腫瘍（ｐｉｌａｒ ｔｕｍｏｒ）、棘細胞腫、毛母腫、炎症性硬結、増殖性毛母腫、増殖性外毛根鞘嚢腫、脂腺増殖症、脂腺腫（ｓｅｂａｃｅｏｍａ）、脂腺腺腫、脂腺上皮腫、脂腺増殖症、脂腺母斑、毛包脂腺腫（ｓｅｂａｃｅｏｕｓ ｔｒｉｃｈｏｆｏｌｌｉｃｕｌｏｍａ）、脂腺腫瘍、粒起革様斑、汗腺腫、多発性脂腺嚢腫、管状乳頭状汗腺腫（ｓｔｕｂｕｌｏｐａｐｉｌｌａｒｙ ｈｉｄｒａｄｅｎｏｍａ）、乳頭状汗管嚢胞腺腫、シリンゴフィブロアデノーマ（ｓｙｒｉｎｇｏｆｉｂｒａｄｅｎｏｍａ）、シリンゴフィブロアデノーマ（ｓｙｒｉｎｇｏｆｉｂｒｏａｄｅｎｏｍａ）、汗管腫、外毛根鞘嚢腫、毛根鞘腫、毛包腺腫（ｔｒｉｃｈｏａｄｅｎｏｍａ）、毛芽細胞腫、毛芽細胞線維腫（ｔｒｉｃｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｍａ）、毛盤腫、毛髪上皮腫、毛包腫、管状アポクリン腺腫、管状乳頭状汗腺腫（ｔｕｂｕｌｏｐａｐｉｌｌａｒｙ ｈｉｄｒａｄｅｎｏｍａ）、および爪周囲線維腫が含まれるが、これらに限定されない。

【0115】

これらの条件のうち、線維血管腫、線維性前額部斑、線維毛包腫、毛盤腫、および毛包周囲線維腫は、互いに最も類似しているものである。これらは、組織機能および免疫組織機能を共有する。さらに、爪周囲線維腫および粒起革様斑は、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２異常を共有する。

【0116】

また、良性付属器腫瘍には、バート−ホッグ−デューベ症候群、ブルック−スピーグラー症候群、カウデン症候群（ＣＳ）、家族性類基底毛包過誤腫症候群（ｆａｍｉｌｉａｌ ｂａｓａｌｏｉｄ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｈａｍａｒｔｏｍａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、多発性内分泌腺腫１型（ＭＥＮ１）、神経線維腫症（ＮＦ１）、ポイツ・イェガース症候群（Ｐｅｕｔｚ−Ｊｅｇｈｅｒｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＰＪＳ）、または複合型結節硬化症（ＴＳＣ）に関連する腫瘍も含まれるが、これらに限定されない。

【0117】

良性付属器腫瘍は、多種多様な種類の細胞からなり、ある皮膚組織を目立たせる傾向を有した、無秩序で過度の細胞増殖を示す。例えば、毛根鞘腫と呼ばれるＣＳにみられる腫瘍は、毛包の外側の鞘に類似する厚くなった上皮を示す。線維血管腫と呼ばれるＴＳＣにみられる腫瘍は、乳頭状真皮および／または付属器周囲真皮の過形成であると考えられる。神経線維腫と呼ばれるＮＦ１にみられる腫瘍は、過剰な量の神経および線維組織を示す。そして、黒子と呼ばれるＰＪＳにみられる腫瘍は、黒血球過形成を示す。

【0118】

最も良性の付属器腫瘍症候群は、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体を介してシグナルを送る遺伝子の突然変異によって生じる。例えば、ＴＳＣ１またはＴＳＣ２のいずれかの突然変異によって、多重の常染色体優性障害である、結節硬化（ＴＳＣ）が生じる。連鎖解析は、家族性ＴＳＣにおいて、障害を生ずるおよそ半分の突然変異がＴＳＣ１で生じ、さらに半分がＴＳＣ２で生じることを示唆する。対照的に、散発性ＴＳＣでは、ＴＳＣ２での突然変異は、ＴＳＣ１での突然変異よりも約５倍頻度が高い。ＴＳＣ２突然変異を有する患者は、ＴＳＣ１遺伝子の突然変異を有する患者よりも重度な障害を受けると考えられる。ＴＳＣ遺伝子の突然変異スペクトルは、非常に不均一であり、突然変異のホットスポットは発見されていない。

【0119】

ＴＳＣは、６０００人の出生中約１人に障害を及ぼし、発作、認知機能障害、ならびに腎臓、心臓、皮膚、肺および脳における腫瘍様成長の進行が特徴である。皮膚損傷は、ほぼすべての患者の幼児期に生じ、これには、線維血管腫、爪周囲線維腫、石灰化網膜過誤腫、皮質結節、腎臓血管筋脂肪腫、白斑、線維性前額部斑、顔面線維血管腫、および粒起革様斑が含まれる。ＴＳＣの重症度および生活の質へのその影響は、非常に可変的である。罹患の最も大きな原因は、脳腫瘍（皮質結節）であり、これは、障害を受けた患者の８０〜９０％で発作をもたらし、障害を受けた患者の半分超で、行動障害（多くは自閉症）をもたらす。

【0120】

また、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体は、他の遺伝子の突然変異によって生じる良性付属器腫瘍症候群にも役割を果たす。例えば、ポイツ・イェガース症候群（ＰＪＳ）は、ＬＫＢ１腫瘍抑制遺伝子の突然変異によって生じ、腸における過誤腫ポリープ、ならびに唇および口腔粘膜上の色素過剰斑が特徴である。ＬＫＢ１タンパク質は、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）をリン酸化し、活性化する、セリン／トレオニンキナーゼであり、これは、次に、ＴＳＣ２をリン酸化し活性化する。ＰＪＳは、１２０，０００人の出生中約１人に障害を及ぼす。

【0121】

同様に、カウデン症候群（ＣＳ）、バナヤン−ライリー−ルバルカバ症候群（Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｒｉｌｅｙ−Ｒｕｖａｌｃａｂａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＢＲＲＳ）、プロテウス症候群（ＰＳ）、およびレルミット−デュクロ疾患（Ｌｈｅｒｍｉｔｔｅ−Ｄｕｃｌｏｓ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＬＤＤ）はすべて、常染色体優性過誤腫症候群であり、また、すべては、ＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子の突然変異に関与する。ＰＴＥＮ活性の欠損は、Ａｋｔ活性を増加させ、ＴＳＣ２をダウンレギュレートする。ＣＳは、２００，０００人中約１人に生じる。ＢＲＲＳは、過誤腫性ポリープ症として現われる稀な過成長症候群である。ＰＳは、世界中の約１００〜２００人に障害を及ぼし、身体の半分を超える腫瘍が伴った皮膚過成長および異常な骨成長をもたらす。そして、ＬＤＤは、世界中のおよそ２００人に障害を及ぼし、小脳の過誤腫として現われる。

【0122】

さらに、神経線維腫症１型（ＮＦ１）は、ＮＦ１遺伝子の突然変異によって生じ、良性神経線維腫および悪性末梢神経鞘腫瘍の進行が特徴である。ＮＦ１は、ニューロフィブロミンをコードし、これは、Ｒａｓ−ＧＴＰアーゼ−活性化タンパク質として機能する。Ｒａｓは、細胞において多くの機能を有し、このうちの１つは、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２複合体を阻害することである。ＮＦ１は、３０００人の患者中約１人に生じ、障害を受けた患者は、認知障害、骨変形、および虹彩の過誤腫性損傷を示す場合がある。神経線維肉腫（悪性シュワン鞘腫）は、障害を受けた患者の３％〜１５％で進行し、深刻な神経線維腫に関係することが多い。

【0123】

更なる一例として、常染色体優性遺伝性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）の９０％は、ＰＫＤ１遺伝子の突然変異によって生じる。ＴＳＣ１は、ＰＣ１の局在化に必要であり、ＡＤＰＫＤに相乗的な役割を果たすと考えられる。ＡＤＰＫＤは、すべての腎臓における複数の包嚢の存在が特徴であり、世界中の４００人の患者中約１人から１，０００人の患者中約１人に生じる。また、ＡＤＰＫＤは末期腎臓病にも関係する。

【0124】

したがって、ｍＴＯＲＣ１／ＴＳＣ１／ＴＳＣ２シグナリングネットワークは、複数の異なる良性付属器腫瘍症候群で一般的な関係を提供する。

【0125】

ＩＩＩ．本発明の組成物を製造する方法
本発明の組成物には、皮膚代替物と注射用製剤が共に含まれる。

【0126】

Ａ．皮膚代替物
本発明の皮膚代替物は、先行技術の皮膚代替物とは異なる細胞型を含むが、先行技術の公知の方法（図１Ｂ）によって調製してもよい。例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｓらの文献：「設計されたヒト皮膚のインビボ移植（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２８９：４２５−３０（２００５）は、インビトロで皮膚代替物を作製する方法を開示する。さらに、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ ＲＶらの文献：「皮膚再建に使用可能の組織によって設計された皮膚バイオ構築物の総説（Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｋｉｎ ｂｉｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｏｒ ｓｋｉｎ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）」，Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，７（４３）：２２９−５８（２０１０）は、皮膚代替物の調製に使用することができる種々のアプローチの総説を提供する。また、例示的な方法は実施例９にも提供する。

【0127】

一実施態様において、生毛細胞を含む組成物は、皮膚代替物の形で提供される。一部の実施態様において、皮膚代替物は、生毛細胞（または、線維芽細胞を有する生毛細胞、内皮細胞、および／または他の支持間葉系細胞）と、基質またはマトリックスとを組み合わせ、次いで、上皮細胞で構築物を被覆することによって、形成される。移植前に、上皮細胞を部分的にまたは完全に誘導して、代替物の表面に空気を曝露することによって、重層扁平上皮および角化層を形成することができる。

【0128】

別の実施態様において、生毛細胞は、マトリックスと組み合わせる前に培養することができる。別の実施態様において、細胞−マトリックス混合物は、上皮細胞と組み合わせる前に培養する。別の実施態様において、生毛細胞は、基質またはマトリックスに導入するのではなく、基質またはマトリックスの上かまたは下で増殖させ、これは、上皮細胞で被覆される。

【0129】

別の実施態様において、生毛細胞は、基質／マトリックス／足場に導入されるか、もしくは挿入される前に、または基質／マトリックス／足場に設置する前に、最初にマイクロスフィアにされ、これは、上皮細胞で被覆される。マイクロスフィアは、上皮細胞を有するか、もしくは上皮細胞のない、またはマトリックスを有するか、もしくはマトリックスのない、生毛細胞からなり得る。マイクロスフィアにマトリックスがある場合、マイクロスフィアは、真皮足場による組成物と同じかまたは異なる。マイクロスフィアが入れられる基質／マトリックス／足場は、付加的な線維芽細胞、内皮細胞、および／または他の支持間葉系細胞を有するか、またはこれらがなくてもよい。マイクロスフィアの間隔は、無作為であるか、または正常なヒト皮膚中の毛包の間隔を繰り返す間隔であってもよい。

【0130】

別の実施態様において、生毛細胞（または、線維芽細胞を有する生毛細胞、もしくは他の支持間葉系細胞）は、表皮構築物とは別に製造される真皮構築物に使用され、この２つは、患者に連続して移植される。表皮構築物の使用の代替として、培地またはフィブリン糊中に細胞のエアゾールを使用して、上皮細胞を、移植された真皮構築物上に噴霧してもよい。

【0131】

基質／マトリックス／足場に使用することができる化合物には、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブリン、ヒアルロナンもしくはヒアルロン酸、フィブロネクチン、キトサン、セルロース、絹フィブロイン、およびアルギンが含まれる。これらの化合物は、ヒト、ラット、ブタ、もしくはウシ由来；か、甲殻類（ｃｒｕｓｔａｃｅｏｎ）、菌類（キトサン）、植物、もしくは藻類（セルロース）由来；であるか、または、細菌もしくは他の生物体中の組換え型として発現させたタンパク質であり得る。また、これらの化合物は、髪ケラチン−コラーゲン海綿、フィブロネクチン機能ドメインと結合したヒアルロナン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸／キトサンハイブリッドナノファイバー膜、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）コラーゲンナノファイバー膜、絹フィブロインおよびアルギン、ポリビニルアルコール／キトサン／フィブロイン海綿混合物、テガダーム−ナノファイバー構築物、細菌セルロース、ＩＣＸ−ＳＫＮ皮膚移植交換物（インターサイテックス（ＩｎｔｅｒＣｙｔｅｘ）社製、ケンブリッジ、英国）、コラーゲン−グリコサミノグリカン−キトサン、ナノ酸化チタン−キトサン複合体（コラタンプ（Ｃｏｌｌａｔａｍｐ）（登録商標）（ユーサファーマ（ＥＵＳＡＰｈａｒｍａ）社製、ラングホーン、ペンシルベニア州）、脱アセチルキチンもしくは植物セルロース移動膜等を改良するか、または組み合わせることもできる。さらに、足場も、ヒト、ブタ、またはウシの無細胞真皮、腱、または粘膜下組織であってもよく、これらは、凍結乾燥し、架橋し、網目状とするか、または上述の化合物のうちのいずれかと組み合わせることができる。足場は、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（商標）（ＢＤバイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製）か、または線維芽細胞もしくは他の細胞由来の細胞外マトリックス等の複合混合物であり得る。また、マトリックス、基質、または足場も、シリコーン、ポリシロキサン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ナイロン、ポリアクティブ（ＰｏｌｙＡｃｔｉｖｅ）（商標）マトリックス（オクトプラス（ＯｃｔｏＰｌｕｓ）社製、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）（ポリエチレンオキシドテレフタラート、およびポリブチレンテレフタラート）、ならびに生物分解性ポリウレタンマイクロファイバーを含む、合成材料からなるか、またはこれらを導入することができる。

【0132】

皮膚代替物は、１回の使用の準備ができている１０％ＣＯ_２／空気大気、およびアガロース栄養培地を備える、大量のゲージポリエチレンバッグに密閉して供することができる。皮膚代替物は、使用するまで、６８°Ｆ〜７３°Ｆ（２０℃〜２３℃）で密封したバッグに保存することができる。皮膚代替物は、円板（例えば、直径およそ７５ｍｍ、および厚さ０．７５ｍｍ）として供することができる。アガロース輸送培地（ａｇａｒｏｓｅ ｓｈｉｐｐｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）は、アガロース、Ｌ−グルタミン、ヒドロコルチゾン、ヒト組換え型インシュリン、エタノールアミン、Ｏ−ホスホリルエタノールアミン、アデニン、亜セレン酸、ＤＭＥＭ粉末、ＨＡＭのＦ−１２粉末、重炭酸ナトリウム、塩化カルシウム、および注射用蒸留水を含み得る。皮膚代替物は、場合により、プラスチックトレーに、またはバッグ内の細胞培養皿に保存してもよい。皮膚代替物は、ポリカーボネート膜に基づいて、表皮（光沢のない、マット仕上げ）層を上に向け、真皮（光沢仕上げ）層を下に向けて、包装することができる。

【0133】

Ｂ．注射用製剤または移植用製剤
本発明には、注射用製剤または移植用製剤が含まれる。これらの製剤は、当業者に公知の方法によって調製することができる。例示的な方法は、実施例９に提供する。一実施態様において、間葉系細胞は、無菌食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）、ハンクスの平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、プラズマライト（Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ）Ａ、またはＲＰＭＩ等の注入に適切なバッファーに含まれる。一実施態様において、間葉系細胞は、マイクロスフィアに導入される。別の実施態様において、間葉系細胞は、マトリックスまたは基質を備える。マトリックスは、メチルセルロース、コラーゲン、キトサン、ヒアルロン酸、ゼラチン、アルギン、フィブリン、フィブロネクチン、またはアガロース等の天然高分子であり得る。マトリックスは、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（商標）、または合成高分子等の複合混合物であり得る。別の実施態様において、間葉系細胞は、注入または移植前にマトリックスまたは基質を有するか、またはこれらのない上皮細胞と組み合わせる。

【0134】

一実施態様において、生毛細胞を含む組成物は、髪の成長が更なる培養物なしで望まれる部位に、皮下にまたは皮内に注入するか、または移植することができる。実施例３Ｂに説明する解離方法によって調製された細胞は、バッファーに再懸濁させ、直接注入されるか、または注入または移植前に、マイクロスフィアに最初に導入することができる。培地中の細胞は、２４時間以上、氷上で、または長期保存のために液体窒素で凍結することができる。低温保存において、細胞は、１０％ＤＭＳＯ、７０％ＤＭＥＭ、および２０％ウシ胎仔血清の溶液に入れる。細胞は、１ｍｌ当たり１０万〜１０００万の細胞濃度のクライオバイアルに入れ、制御冷凍庫に凍結され、注入または移植時まで−１８０℃で保存される。すべての解凍された細胞の生存率は、使用前に、８５％を超えることを確認し得る。

【0135】

生毛細胞を含む組成物は、レシピエント皮膚または創傷に注入するか、または移植することができる。また、組成物は、患者または次の移植の適用前に、移植片（真皮−表皮複合体を含む分層植皮片もしくは皮膚代替物、および表皮構築物もしくは細胞噴霧と組み合わせた真皮構築物）に注入するか、または移植することもできる。別の実施態様において、生毛細胞を含む組成物は、注入または移植前に培養することができる。

【0136】

ＩＶ．本発明の皮膚代替物を投与する方法
本発明は、本発明の皮膚代替物を投与する少なくとも２つの方法を提供する。本発明の皮膚代替物は、患者に移植することができ（図１Ｃ）、また、この皮膚代替物は、患者に注入することができる。このため、本発明は、患者のヒト毛包を誘導することができる細胞を患者に移植するための方法を提供する。

【0137】

Ａ．本発明による治療の恩恵を受ける患者
本発明の組成物は、全層または部分層の皮膚欠損、皮膚の失活、創傷、潰瘍、化学火傷または熱傷、傷跡、および、先天的にもしくは後天的に、完全なもしくは部分的な髪、皮脂腺、もしくはエクリン腺の異常を有する患者を治療するのに有用である。皮膚損傷は、表皮、部分層、および全層の３つのカテゴリーに分類される。表皮のみが影響を受け、これが傷跡を残さずに、迅速に再生するので、表皮の損傷は、特殊な外科治療を必要としない。部分層の創傷は、表皮および真皮に影響を与える。かかる創傷は、一般に、創傷の縁からの上皮化によって治癒し、傷端、毛包、または汗腺の基底のケラチン細胞は、移動して、損傷領域を被覆する。全層の損傷は、上皮再生要素の完全な破壊が特徴である。この型の損傷は、傷端のみの上皮化と共に、拘縮によって治癒する。部分層の損傷および全層の損傷は、皮膚移植を必要とすることが多い。

【0138】

また、本発明の組成物は、手術傷を治療するために使用することもできる。例えば、巨大母斑（黒あざ）等の大きな皮膚損傷の除去は、独力で治癒することができず、また、分層自家皮膚移植片（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｓｐｌｉｔ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｓｋｉｎ ｇｒａｆｔ）には非常に大きい傷を残す。本発明の組成物は、かかる損傷を治療するのに有用である。

【0139】

脱毛の最も一般的な形態は、男性ホルモン性脱毛症と呼ばれる進行性の薄毛状態である。脱毛は、身体の任意の部分に生じる場合があり、幾つかの要因から発生し得る。例えば、牽引性脱毛症は、ポニーテールまたはコーンロウに過度の力で髪を引っ張る人において最も一般的にみられる。円形脱毛症は、１箇所のみの脱毛（単発型円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ ｍｏｎｏｌｏｃｕｌａｒｉｓ））を生じるか、全身のすべての髪の損失（汎発型円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｓ））を生じ得る、自己免疫疾患である。また、甲状腺機能低下症、腫瘍、および皮膚派生物（包嚢等）も、局所的な脱毛症を誘導する。さらに、脱毛は、化学療法、放射線治療、出産、大手術、中毒、真菌感染、および重篤なストレスによってもたらされる場合もある。さらに、鉄分欠乏は、薄毛の一般的な原因である。脱毛の多くの事例では、毛包は、周期を停止し、無活動段階に入っている。他の事例では、毛包は、完全に失われるか、またはそもそも形成されない。

【0140】

本発明の組成物および方法は、毛包の成長を必要とする症状を治療するのに有用である。また、一実施態様において、この方法は、エクリン腺も誘導する。さらに、別の実施態様において、この方法は、皮脂腺を誘導する。

【0141】

Ｂ．皮膚代替物の投与
さらに別の実施態様において、この方法は、患者に本発明の皮膚代替物を移植することを含む。本発明の皮膚代替物は、当業者に公知の適切な方法によって投与することができる。

【0142】

１．移植片部位の調製
移植片部位は、当業者に公知の方法によって調製することができる。例示的な方法は、実施例１２に提供する。移植片部位は、損傷した皮膚（例えば、部分層もしくは全層の化学火傷、熱傷、皮膚の裸出、または皮膚の失活）、皮膚の部分的かもしくは完全な欠損による創面（例えば、皮膚が裸出したか、潰瘍化した部位）、手術傷（例えば、良性または悪性皮膚腫瘍の切除後の）、または先天的な皮膚（例えば、先天性皮膚形成不全症）もしくは後天性の皮膚（例えば、任意の原因による傷跡のある皮膚）、毛包、皮脂腺、および／またはエクリン腺の減少、異常、もしくは欠損を有する皮膚であり得る。一部の実施態様において、移植片部位は、水、抗菌性洗浄剤、またはアルコール溶液（アルコール綿球等）によって洗浄される。別の実施態様において、所望のパターンの髪は、外科用マーカーによって移植片部位上で抜かれる。別の実施態様において、局所麻酔薬が患者に投与される。更なる麻酔を必要とする事例では、ガス、静脈内、または神経ブロック麻酔薬を患者に投与することができる。

【0143】

更なる実施態様において、現存する皮膚組織、失活した組織、痂皮、傷端もしくは潰瘍端、または瘢痕組織は、当該技術分野における標準技術を用いて除去される。可能な場合、皮膚感染または悪化条件は、移植片の適用前に解決する必要がある。局所的にまたは全身に投与された抗微生物剤、抗真菌剤、および抗ウイルス剤を、皮膚代替物の投与前後しばらくの間（例えば、１週間）、使用して、感染の危険性を低減させることができる。

【0144】

皮膚代替物は、非細胞毒性溶液によって創傷を徹底的に洗浄した後、清浄で創面切除された皮膚表面に適用することができる。創面切除は、健全で、生存可能な、出血組織まで及び得る。適用前に、止血を行うことができる。創面切除前に、創傷を、無菌食塩水によって徹底的に浄化して、遊離した細片および壊死組織を除去することができる。組織ニッパー、外科用メス、またはキューレットを使用して、角質増殖、および／または壊死組織と細片を創傷表面から除去することができる。潰瘍辺縁は、ソーサー効果（ｓａｕｃｅｒ ｅｆｆｅｃｔ）を有するように、創面切除することができる。創面切除後、創傷は、無菌食塩水で徹底的に浄化され、穏やかにガーゼで乾燥することができる。傷端の創面切除または修正によって生じる分泌または出血は、緩やかな圧力（必要であれば、血管の結紮、電気焼灼、化学焼灼、またはレーザー）の使用によって、停止することができる。大量の滲出物は、皮膚代替物に代わり、接着を低減し得る。滲出物は、適切な臨床治療によって最小化され得る。例えば、創傷が粘着性を有するまで、室温または４２℃以内の無菌空気を創傷に吹きつけてもよい。滲出物が持続する場合、皮膚代替物を浸透させて、皮膚代替物を穿孔して排出することによって滲出させることができる。

【0145】

２．皮膚代替物の適用
種々の臨床的方法を、患者に皮膚代替物を適用するのに用いることができる。皮膚代替物は、治療する欠陥のサイズ、痛みレベル、および全身麻酔の必要性により、外来患者診療室、または手術室で適用することができる。例示的な方法は、実施例１１および１２に説明する。皮膚代替物の適用前に、施術者は、皮膚代替物の有効期限を再検討し、ｐＨを確認し、視覚的に観察し、臭いをかいで、細菌汚染物質または粒子状物質等の汚染物質がないことを確認することができる。皮膚代替物は、使用直前まで、制御温度６８°Ｆ〜７３°Ｆ（２０℃〜２３℃）で、ポリエチレンバッグに保存することができる。

【0146】

施術者は、密封したポリエチレンバッグを切開することができ、また、皮膚代替物が、細胞培養皿またはプラスチックトレーに提供される場合、皮膚代替物は、無菌技術による無菌領域に移すことができる。細胞培養皿またはプラスチックトレーが存在する場合、トレーまたは細胞培養皿の蓋を外すことができ、また、施術者は、皮膚代替物の表皮および真皮層の配向に注意し得る。無菌非外傷性器具を使用して、施術者は、およそ０．５インチの皮膚代替物をトレーまたは細胞培養皿の壁からそっと離して移すことができる。皮膚代替物を持ち上げる場合、施術者は、皮膚代替物の下の膜を穿孔しないか、またはこれを持ち上げないように注意し、プラスチックトレーが存在する場合、当該膜をトレーに残存させる必要がある。

【0147】

無菌の手袋をはめた手で、施術者は、一方の人差し指を皮膚代替物の剥離部分の下に挿入し、他方の人差し指を使って、デバイスの端に沿って別の箇所の皮膚代替物をつかむことができる。２箇所に皮膚代替物を保持し、施術者は、スムーズな動きで、トレーまたは細胞培養皿から皮膚代替物全体を持ち上げることができる。過度に折り重なる場合、皮膚代替物は、無菌トレー中の温かい無菌食塩水上に浮かす（表皮表面を上にして）ことができる。

【0148】

真皮層（中間付近の光沢層）が、皮膚代替物の部位と直接接触するように、皮膚代替物を配置することができる。

【0149】

塩水で湿らせた綿塗布用具を使用して、施術者は、部位上の皮膚代替物を滑らかにし、このため、気泡もしわが寄った端もなくすることができる。皮膚代替物が適用部位よりも大きい場合、超過した皮膚代替物は、包帯に付着するのを防ぐために、切り取ることができる。皮膚代替物が適用部位よりも小さい場合、不足が充足されるまで、複数の皮膚代替物を互いに隣接させて適用することができる。

【0150】

皮膚代替物は、適切な臨床用包帯で固定することができる。縫合または試料は必要ではないが、移植片面に移植片を係留するために、一部の事例に使用してもよい。包帯は、適用部位への皮膚代替物の接触を確実にし、かつ移動を防ぐために使用することができる。治療上の圧縮を移植片部位に適用することができる。一部の事例において、移植された四肢を固定して、皮膚代替物と適用部位の間の剪断力を最小化することが必要な場合がある。包帯は、週に一度、または、必要であれば、これより頻繁に交換することができる。

【0151】

皮膚代替物の付加的な適用は、特定の事例において必要であり得る。付加的な適用前に、先の皮膚移植片または皮膚代替物の非接着性残存物は、穏やかに除去する必要がある。治癒組織または接着皮膚代替物は適所に残してもよい。部位は、皮膚代替物の付加的な適用前に、非細胞毒性溶液によって浄化することができる。一実施態様において、付加的な皮膚代替物は、先の皮膚代替物が接着していない領域に適用することができる。

【0152】

Ｃ．生毛細胞の注入
本発明の生毛細胞は、当業者に公知の適切な方法によって注入することができる。例示的な方法は、実施例１１に説明する。一実施態様において、この方法は、低下したＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能、増加したｍＴＯＲＣ１機能、および／または低下したｍＴＯＲＣ２機能を有する、改変間葉系細胞を、患者に、皮下送達または皮内送達することを含む。別の実施態様において、この方法は、患者に上皮細胞を送達することをさらに含む。細胞は、懸濁剤、またはマイクロスフィアとして送達することができる。懸濁剤を注入する場合、それぞれの注入部位は、５０〜２，０００の細胞を送達することができる。マイクロスフィアを注入する場合、それぞれの注入部位は、１以上のマイクロスフィアを送達することができる。

【0153】

１．移植片部位の調製
移植片部位は、水、抗菌性洗浄剤、またはアルコール溶液（アルコール綿球等）によって洗浄することができる。別の実施態様において、所望のパターンの髪は、各注入部位を示すアウトライン法またはピクセル処理法（ｐｉｘｉｌａｔｅｄ ｆａｓｈｉｏｎ）のいずれかで、外科用マーカーによって移植片部位上で抜かれる。また、紙テンプレートまたは他の材料のテンプレートも、注入パターンを示す注入部位に適用することができるか、または、注入物を、グリッドにロボット工学もしくは複数の注入口を備えたデバイスを使用することによって、正確な間隔で送達することができる。別の実施態様において、局所麻酔薬を患者に投与することができる。更なる麻酔を必要とする事例では、ガス、静脈内、神経ブロック麻酔薬を患者に投与することができる。

【0154】

２．注入方法、用量、および投与頻度
注入物は、皮下注射または皮内注射のための当業者に公知の技術によって投与することができる。１，０００〜２０，０００細胞／ｍｌの濃度を注入物に使用することができる。０．０５〜０．１ｍｌの容積を、１４〜３０ゲージ針を有する１〜３ｍｌの注射器を使用して、各注射部位に注射することができる。かかる実施態様において、皮膚はぴんと張られ、また、針は、皮膚と５°〜３０°の角度の傾斜で挿入される。その後、細胞は、緩やかな圧力を徐々に注入され、針は除去され、また、緩やかな圧力は、漏出を防ぎ、かつ吸収を促進するためにかけられる。

【0155】

注入は、患者の安心のために、または付加的な毛包が連続投与後に生じ得るので、しばらくの間、繰り返してもよい。かかる事例では、投与は、１週、２週、３週、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、または６ヶ月、間隔を置いてもよい。

【0156】

前述の複数の実施態様は、以下に示す非限定的な実施例に示す。但し、本発明の別の実施態様は、本明細書に開示する発明の詳説および実施を考慮して、当業者に明らかである。例示的なものとしてのみ、詳説および実施例が考慮されることが意図され、また、特許請求の範囲に記載するように、本発明を限定するものではない。さらに、本明細書に引用された参照はすべて、引用によりこれらの全体に組み込まれるものと考えられる。

【実施例】

【0157】

Ｖ．実施例
実施例１：ＴＳＣ患者の皮膚代替物の調製および評価
線維性前額部斑、線維血管腫、および爪周囲線維腫を含むＴＳＣ皮膚過誤腫は、真皮および／または毛包周囲線維芽細胞様細胞、ならびに上皮における変化を含む。ＴＳＣと診断された患者を、施設内倫理委員会に承認されたプロトコール、全国心臓肺臓血液学会（ＮＩＨ）の００−Ｈ−００５１に登録した。ＴＳＣ患者の線維血管腫、爪周囲線維腫、線維性斑、および正常と考えられる皮膚の試料を得て、二分化し、一方の部分をルーチン病理に使用し、また、他方を、凍結切片または細胞培養に使用した。

【0158】

Ａ．正常組織試料および腫瘍組織試料の組織学的および免疫組織化学的比較
正常および腫瘍患者の試料間の組織学的相違（図３Ａおよび３Ｂ）および免疫組織化学的相違を、比較用のベースラインによって特性評価した。簡潔には、試料のパラフィン切片を脱パラフィン化し、２０分間、１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で沸騰させることによって、抗原回復の処理をした。凍結切片を、−２０℃で１０分間、アセトンに固定した。ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）（登録商標）レッドまたはＤＡＢ基質（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を有する、特異的抗体およびベクタスタチン（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ）ＡＢＣキットを使用して、メーカーの手順に従って（ＤＡＢペルオキシダーゼ褐色基質によるＡＢＣ西洋わさびペルオキシダーゼ染色を使用した、Ｋｉ−６７染色を除く）、切片の細胞マーカーを染色した。ポジティブ染色法の相対強度を、オリンパスＢＸ４０光学顕微鏡（オリンパス社製、メルヴィル、ニューヨーク州）、およびオープンラボ（Ｏｐｅｎｌａｂ）４．０ソフトウェア（インプロビジョン（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）社製、レキシントン、マサチューセッツ州）を使用して、定量化した。

【0159】

パラフィン包埋患者試料中の血管を、ＣＤ３１（アブカム（Ａｂｃａｍ）社製、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に対するウサギポリクローナル抗体によって染色した。陽性の血管の数および面積を測定し、合計面積によって標準化した。試料中の細胞増殖を、Ｋｉ−６７（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、フェルモント、カリフォルニア州）に対するウサギモノクローナル抗体を使用して、免疫染色することによって検出した。Ｋｉ−６７陽性細胞を、オリンパスＢＸ４０光学顕微鏡（オリンパス社製、メルヴィル、ニューヨーク州）を使用して、数え、表皮の長さによって標準化した。腫瘍関連マクロファージを、ラット抗マウスＦ４／８０抗体（アブカム社製）による免疫組織化学染色によって、試料中で検出した。真皮中のマクロファージ含量を、２０倍対象レンズを使用して、各切片の３つのランダム面積を計測し、面積により標準化することによって測定した。ＣＤ６８陽性単核食細胞を、ＡＢＣキット（ベクター社製）、および抗ＣＤ６８抗体（Ｍ０８１４、ダコサイトメーション（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）社製）を使用して、免疫組織化学染色によって確認した。そして、上昇したｍＴＯＲＣ１機能を、リン酸化リボソームタンパク質Ｓ６（抗ｐＳ６、２２１１、細胞シグナリング）を免疫染色することによって決定した。

【0160】

線維性斑は、正常な皮膚と比較して、大きな細胞、コラーゲン構造の変化、および血管の増加を示した（図３Ａおよび３Ｂ）。また、ＴＳＣ線維性斑の線維芽細胞様細胞は、線維血管腫および爪周囲線維腫のように、正常な線維芽細胞と比較して、リン酸化リボソームタンパク質Ｓ６で免疫反応性も示し（図３Ｃおよび３Ｄ）、線維性斑が、正常な皮膚と比較して、増加したｍＴＯＲ機能を示すことを示した。さらに、線維性斑の表皮は、ｐＳ６で、正常な皮膚よりも高い免疫反応性（図３Ｃおよび３Ｄ）、並びに正常な皮膚よりも大きな増殖（図３Ｅおよび３Ｆ）を示した。これは、ＴＳＣ２ヌル細胞により放出されたパラクリン因子によって、もたらされたと考えられる。過誤腫線維芽細胞様細胞および表皮細胞におけるこれらの変化は、ＣＤ６８陽性単核食細胞（図３Ｇおよび３Ｈ）と、ＣＤ３１陽性血管（図３Ｉおよび３Ｊ）の２つの付加的な細胞構成要素の劇的な増加が伴った。試験は、組織試料で終了した。

【0161】

総合すると、これらの試験は、前額部斑がすべて、線維血管腫および爪周囲線維腫のように、ＴＳＣが正常であると考えられる皮膚と比較して、増加したｍＴＯＲＣ１機能、ＣＤ３１陽性血管、ＣＤ６８陽性単核食細胞、および増殖する（すなわち、Ｋｉ−６７陽性）表皮細胞を含むことを示した。

【0162】

Ｂ．腫瘍組織試料および正常組織試料における毛包の分析
正常な皮膚中の毛包と比較して、線維性斑および線維血管腫中の毛包は、可変的に拡大し、延び、または、数が多いと考えられるが、爪周囲線維腫は、厚くなった表皮を有するが、毛包を有さなかった（図４Ａ〜４Ｄ）。この観察は、ヘマトキシロンおよびエオシンによる組織切片染色に基づく。線維血管腫中の毛包は、可変的に肥大したか、延びたか、または未熟であった。爪周囲線維腫には、毛包構造体がなかった。

【0163】

Ｃ．腫瘍細胞におけるＴＳＣ２およびｍＴＯＲＣ１機能の分析
線維芽細胞を、生体試料を小さな断片に切断し、これらを、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した１ｍｌのＤＭＥＭ中の３５ｍｍ培養皿に載置して、組織を被覆することによって、線維血管腫、爪周囲線維腫、前額部斑、および正常と考えられる皮膚生体試料から単離した。細胞が移動して、培養皿を被覆するまで、培地を週に２回交換した。その後、細胞を二次培養のために採取した。

【0164】

ＰＣＲ、制限消化、および配列確認によって、単離した細胞のＴＳＣ２発現を分析した。簡潔には、培養細胞から単離したＤＮＡを、メーカーが提供するマグネシウム含有バッファー中ＡｍｐｌｉＴａｑ金ＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製）を使用して、ＴＳＣ２のエキソン１０の増幅に使用した。熱サイクルを次に示すように行った：９５℃、３０秒間の変性、５９℃、１分間のアニーリング、および７２℃、１分間の伸長、その後、３４回循環し、７２℃、１分間の最終伸長。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ産物を、電気泳動によって分離し、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）によって、精製した。精製ＤＮＡを、ＡＢＩ・プリズム・ビッグダイ・ターミネーター・ｖ３．１・サイクル・シークエンシング・キット・ビッグダイ・ターミネーター・ｖ３．１・サイクル・シークエンシング・キット（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔｓ ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製）を備えた３１３０ｘｌジェネティックアナライザー（３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して、ＵＳＵ ＢＩＣゲノム分裂ＤＮＡシーケエンスサービス（ＵＳＵ ＢＩＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ−ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ）によって配列した。

【0165】

シークエンシング用のＰＣＲプライマーは、次に示すとおりであった：５’ＴＧＧＴＧＴＣＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＧＴＣＣ３’（配列番号７）、および５’ＡＧＧＡＧＣＣＧＴＴＣＧＡＴＧＴＴ３’（配列番号８）。線維性前額部斑のＴＳＣ２ヌル細胞のシークエンシングは、ＴＳＣ２遺伝子のナンセンス突然変異を示した。具体的には、エキソン１０の位置１０７４におけるＧは、Ａに変異され、トリプトファンの正常なＵＧＧコドンを終止コドンＵＧＡに変換した（図５Ａ）。また、細胞は、ＴＳＣ２遺伝子に隣接する３つのマイクロサテライトマーカーでヘテロ接合性の欠損を示し（図５Ｂ）、細胞のホモ接合またはヘミ接合をエキソン１０で点突発変異させた。点突発変異は、ＰＣＲ増幅腫瘍ＤＮＡのＢｓｍＡ１切断における新しい制限部位を導入した（図５Ｃ）。正常な患者の線維芽細胞は、突然変異を含まなかった（図５Ｄ）。

【0166】

また、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ産物も、制限酵素消化によって分析した。酵素消化分析においてエキソン１０を増幅するのに使用した、ＰＣＲプライマーは、次に示すとおりであった：５’ＡＡＧＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＴ３’（配列番号９）、および５’ＧＧＣＣＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴ３’（配列番号１０）。ＢｓｍＡ１制限部位を導入するＧ→Ａ点突発変異の存在を確認するために、２μｌのＰＣＲ増幅ＤＮＡを、１０倍バッファー４（ＮＥＢ）、２μｌのＢｓｍＡ１（ＮＥＢ）、および１２μｌの水と混合した。この混合物を、５５℃で一晩、インキュベートし、消化ＰＣＲ産物および未消化ＰＣＲ産物の試料を、１０％ＴＢＥゲル中で、１００ボルトの電気泳動によって分離した。切断を、ゲル中のバンドの移動パターンに基づいて決定した。

【0167】

また、血清飢餓条件下で、細胞のリボソームタンパク質Ｓ６の超リン酸化も分析した。細胞（１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中５×１０^５細胞）を、６０ｍｍの皿に接種する。翌日、培地を、無血清ＤＭＥＭと交換した。さらに３７℃で２４時間培養後、細胞を、タンパク質抽出バッファー（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ−４０、２０ｍＭ ＮａＦ、２．５ｍＭ Ｎａ_２Ｐ_４Ｏ_７、１ｍＭβ−グリセロリン酸、１ｍＭベンズアミジン、１０ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスファート、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド中に溶解した。等量の全タンパク質を含む試料を、１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル中で分離し、０．４５μｍインビトロロン（Ｉｎｖｉｔｒｏｌｏｎ）（商標）ＰＶＤＦ膜（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）に移した後、抗リン酸−Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ ２３５／２３６）、または抗Ｓ６リボソームタンパク質一次抗体（細胞シグナリング）、ホースラディシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギ二次抗体（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、英国）、およびスーパー・シグナル・ウエスト・ピコ化学発光検出キット（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（ピアスケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社製、ロックフォード、イリノイ州）を使用して、イムノブロッティングを行った。バンド強度を、コダックキャプチャーＤＣ２９０画像システム（Ｋｏｄａｋ Ｃａｐｔｕｒｅ ＤＣ ２９０ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）（イーストマンコダック（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）社製、ロチェスター、ニューヨーク州）を使用して、測定した。

【0168】

また、細胞は、ｍＴＯＲＣ１を阻害するラパマイシンによって処理した。具体的には、ＴＳＣ皮膚腫瘍細胞または正常と考えられる線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で、９６穴プレート（ウエル当たり２０００細胞）に載置した。翌日、培地を、ラパマイシンを３日間、０．２ｎＭ、２ｎＭ、もしくは２０ｎＭ添加したか、または未添加の１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに交換した。その後、細胞数を、ＭＴＴ細胞増殖アッセイキット（セルタイター（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ）（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、マディソン、ウイスコンシン州））を使用して、評価した。これらの試験は、ラパマイシンが、ｍＴＯＲＣ１活性化を阻止し（図６Ａ）（上述するように、ｍＴＯＲＣ１活性化を、下流分子Ｓ６のリン酸化によって測定した）、患者の正常と考えられる皮膚の線維芽細胞の一対の試料よりも大きくなる程度まで、ＴＳＣ２ヌル線維芽細胞のインビトロ増殖を減少させることを示した（図６Ｂ）。ラパマイシンがｍＴＯＲＣ１の特異的な阻害剤であるので、これらの結果は、Ｓ６のリン酸化が、ＴＳＣ２ヌル細胞のｍＴＯＲＣ１の活性化によることを確認する。

【0169】

要約すると、これらの結果は、一部の試料が、ＴＳＣ２の発現の劇的な低下と、対応するｍＴＯＲＣ１の構造的な活性化を示した。４つの線維性斑のうちの３つ、６５の線維血管腫のうちの３つ、および４１の爪周囲線維腫のうちの８つから増殖した線維芽細胞様細胞では、ＴＳＣ２タンパク質発現は、検出不能であったか、または辛うじて検出することができ、ｍＴＯＲＣ１は、構造的に活性があった（図７）。純粋か、または高純度のＴＳＣ２ヌル細胞が存在する試料を得るために、培養線維芽細胞様細胞を、ＴＳＣ２発現およびｍＴＯＲＣ１活性化の欠損についてスクリーニングをした。これらの細胞は、下記に説明する異種移植片に使用した。

【0170】

Ｄ．ＴＳＣ皮膚過誤腫の異種移植片モデル
広範囲に使用されているインビトロで構築した真皮−表皮複合体の系を、移植に適応させた。メラノサイトを伴うケラチン細胞を、４℃で一晩、ディスパーゼ（ベクトン・ディキンソン・ラボウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）社製、ベッドフォード、マサチューセッツ州）で処理することによって、身元不明の正常な新生児包皮から単離した。表皮シートを真皮シートから分離し、次いで、３７℃で２０分間、０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）によって消化させた。細胞を回収し、これをウシ下垂体抽出物、および組換え型上皮成長因子を添加した、ケラチン細胞無血清培地（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）中の組織培養皿に載置した。

【0171】

女性患者から採取したＴＳＣ２ヌル皮膚腫瘍細胞、またはＴＳＣ２正常線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中１ｍｇ／ｍＬのラット尾部１型コラーゲン（ＢＤバイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製、ベッドフォード、マサチューセッツ州）と混合することによって、皮膚代替物を作製した。この混合物を、ウエル当たり０．５×１０^６の細胞密度で、６穴トランスウエル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）プレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製、コーニング、ニューヨーク州）に入れた。細胞混合物を３日間培養し、次いで、培養ケラチン細胞を、ウエル当たり１×１０^６の細胞密度で加えた。その後、構築物を、０．１％ＦＢＳを含む、ＤＭＥＭとハムのＦ１２（ＧＩＢＯ／インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、グランドアイランド、ニューヨーク州）の３：１混合物に浸漬し、２日間培養した。培養後、液体の一部を除去することによって、ケラチン細胞を気液界面に供し、移植前にさらに２日間、１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭおよびハムのＦ１２（１：１）中で培養した。

【0172】

６〜８週齢の老齢の雌Ｃｒ：ＮＩＨ（Ｓ）−ｎｕ／ｎｕマウス（ＦＣＲＤＣ、フレデリック、メリーランド州）を使用して、外科手術室でマウスに移植した。Ｏ_２とイソフルランの混合物（２〜４％）によって吸入麻酔を使用して、マウスに麻酔をかけた。マウス背部の移植領域を評価し、皮膚を、ポビジン（ｐｏｖｉｄｉｎｅ）および７０％エタノールによって洗浄後、彎鋏を使用して除去した。皮膚代替物を、正確な解剖配向で移植片面に配置し、無菌ヘトロラタムガーゼで被覆し、包帯で固定した。その後、マウスを再び目覚めさせた後、無菌ケージに移した。包帯を週２回交換し、４週後に除去した。

【0173】

移植８〜１７週後屠殺したマウスにおいて、ＴＳＣの正常な線維芽細胞を含む移植片は、毛包のない皮膚を形成した（図８Ａ）。特定のＴＳＣ皮膚腫瘍のＴＳＣ２ヌル細胞を含む移植片は、毛包を形成し（図８Ｂ、表１）、ＴＳＣ皮膚腫瘍細胞が、包皮ケラチン細胞において毛包新生を誘導することを示唆した。

【0174】

【表1】

【0175】

移植片中の毛包は、適切な間隔を置き、解剖学的に完成した。表皮鞘に囲まれた毛幹、皮脂腺、内毛根鞘、および外毛根鞘の同心層、ならびに毛乳頭、髪マトリックス、および皮質を有する毛球は、すべて存在した（図９Ａ〜９Ｄ）。毛包は、これらが得られた領域を模倣した。例えば、顔面の皮膚におけるように、多くの毛包が、成長期（成長）ではなく、退行期（退行）および休止期（静止）にあり、これは、頭皮毛包においてより一般的である（図８Ｂ）。さらに、毛幹は、前額部または鼻から採取した細胞の移植片の皮膚表面から目視することができなかった（図１Ｃ）。これらの結果は、間葉系細胞の供給源が、これらの最終目標（すなわち、頭皮の間葉系細胞は、脱毛した頭皮を治療するのに使用し、腕の間葉系細胞は、腕の火傷を治療するのに使用する）を反映する場合、本発明が最適な結果をもたらし得ることを示唆する。

【0176】

毛幹は、マウス毛の規則的に間隔を置いたエアポケットを欠き、これは、ヒト由来起源のものと一致する。抗ヒトＣＯＸ ＩＶ抗体による免疫組織化学検査を行って、毛包由来の種を確認した。簡潔には、異種移植片のパラフィン切片を脱パラフィン化し、上述するように、患者の組織試料を、抗原回復のために処理した。次いで、切片を、マウスＣＯＸ ＩＶを認識しない、抗ＣＯＸ−ＩＶ ３Ｅ１１抗体（セル・シグナリング・テクノロジー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製、ダンバーズ、マサチューセッツ州）のメーカーの説明書に従って、染色した。免疫反応性は、異種移植片の毛包、上皮、および真皮にみられた（図９Ｅおよび９Ｆ）が、マウス皮膚ではみられなかった（データは示されない）。同様の結果が、パン−ヒトＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体を使用して得られ（図１０Ａ）、正常な皮膚において、予想どおりに、毛包上皮よりも毛包内表皮を強く染色した。

【0177】

ヒトＹ染色体のプローブを使用し、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを行って、ヒト包皮ケラチン細胞（男性由来）と、女性患者のＴＳＣ２ヌル細胞を識別した。簡潔には、ＣＥＰ Ｙ（ＤＹ２１）染色体スペクトルオレンジプローブ（バイシス（Ｖｙｓｉｓ）、ダウナーズ（Ｄｏｗｎｅｒｓ）ＩＬ６０５１５）を使用して、Ｙ染色体ＦＩＳＨを、メーカーのプロトコールに従って、行った。このプローブは、表皮および毛包上皮中の核にハイブリダイズしたが、真皮細胞の核（図９Ｇおよび９Ｈ）、または隣接する正常なマウス皮膚（図示せず）にはハイブリダイズしなかった。これらの結果は、包皮ケラチン細胞が誘導して、正常な毛包を構成する、複数の細胞構成要素に分化したことを示し、改めて毛包誘導を確認した。

【0178】

誘導された毛包の正常性を、十分に成長したヒト毛包の特異的なコンパートメントのマーカーを使用して、免疫組織化学検査によってさらに確認した。簡潔には、異種移植片のパラフィン切片を脱パラフィン化し、上述するように、抗原回復のために処理した。次いで、切片を、抗ヒトネスチン抗体（ＡＢ５９２２、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製）、抗ヒトベルシカン抗体（ＰＡ１−１７４８Ａ、サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、ロックフォード、イリノイ州）、抗Ｋｉ−６７抗体（ＲＭ−９１０６、サーモサイエンティフィック社製）、抗ヒトケラチン１５抗体（ＰＣＫ−１５３Ｐ、コバンス（Ｃｏｖａｎｃｅ）社製）、および抗サイトケラチン７５抗体（ＧＰ−Ｋ６ｈｆ、プロゲンバイオテクニク（Ｐｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）社製）によって染色した。

【0179】

毛乳頭および下部表皮鞘の領域中の細胞は、ネスチン（図９Ｉおよび９Ｊ）、およびベルシカン（図９Ｋ）で正常な染色を示した。Ｋｉ−６７における免疫反応性は、髪マトリックスの領域に集中し（図９Ｍ）、これは、強健な毛幹形成を有した活性のある典型的な成長期の増殖であった。膨出領域に位置する毛包幹細胞のマーカーである、ケラチン１５は、ヒト線維血管腫にみられるように、外毛根鞘の基底層に局在化した（図９Ｎおよび９Ｏ）。そして、付随層のマーカーである、ケラチン７５における免疫反応性は、正常なヒトの髪にみられるように、内外毛根鞘と外毛根鞘の細胞の単層に存在した（図９Ｐ）。したがって、形態および免疫組織化学基準によって、十分に成長したヒトの髪は、異種移植された皮膚に存在した。

【0180】

また、切片のアルカリホスファターゼ活性も分析した。簡潔には、凍結切片を、１０分間、アセトンに固定し、次いで、０．１％トゥイーン２０添加１倍ＰＢＳによって洗浄した。切片を、予備平衡化バッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮｇＣｌ_２、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、０．１％トゥイーン２０）と、湿潤室で、室温で１５分間、インキュベートした。現像液（ＢＭパープルＡＰ基質、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製、インディアナポリス、インディアナ州）を、暗色湿潤室で２時間、組織に適用した。次いで、この反応を、ＰＢＳ中の２０ｍＭ ＥＤＴＡによって停止し、切片を、ベクタマウント（ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ）（商標）ＡＱ水性封入剤（ベクター社製）と共に搭置した。毛乳頭および下部表皮鞘の領域中の細胞は、正常なアルカリホスファターゼ活性を示した（図９Ｉ）。これは、移植されたＴＳＣ２ヌル細胞が、表皮鞘／毛乳頭細胞の適切な箇所において、予想どおりに、アルカリホスファターゼ活性を示すことを示す。

【0181】

異種移植片中の細胞の遺伝的同一性を調査して、誘導された毛包の毛乳頭／下部表皮鞘領域中のＴＳＣ２ヌル細胞の存在を決定した。簡潔には、上述するように、異種移植片の切片を顕微解剖し、制限酵素分析のためにＤＮＡを抽出した。これらの試験は、毛乳頭／下部表皮鞘の領域の細胞において突然変異ＤＮＡを示したが、毛包上皮ではこれを示さなかった（図５Ｃおよび５Ｄ）。この領域、および毛包内真皮（データに示さない）中のＴＳＣ２ヌル細胞の存在は、ＴＳＣ腫瘍線維芽細胞様細胞が、真皮線維芽細胞、または毛乳頭／表皮鞘細胞の機能を示すことができる多能性先祖細胞であることを示した。

【0182】

また、異種移植片モデルを使用して、ＴＳＣ２ヌル細胞が、上の腫瘍組織試料にみられた細胞学的および生化学的変化を誘導することができるか否かについて判断した。簡潔には、ＴＳＣ腫瘍細胞（ｎ＝２７）、またはＴＳＣの正常な線維芽細胞（ｎ＝２７）を移植したマウスに、ラパマイシン（２ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝２９）、または等量のビヒクル（０．９％ＮａＣｌ、５％ポリエチレングリコール、および５％トゥイーン８０）（ｎ＝２５）のいずれかを、移植後５週で開始して１２週間隔日の腹腔内注射によって供した。マウスを、最後の注射２４時間後に屠殺し、移植片を採取し、それぞれの移植片の半分の一方を、パラフィン包埋のために調製し、他方を凍結切片のために調製した。パラフィン切片を、血管（ＣＤ３１）（図１１Ｑ〜１１Ｔ）、リボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化（ｐＳ６）（図１１Ｅ〜１１Ｈ）、およびヒト細胞（ＣＯＸ−ＩＶ）の持続性（図１１Ａ〜１１Ｄ）のために染色した。凍結切片を、細胞増殖（Ｋｉ−６７）（図１１Ｉ〜１１Ｌ）、および腫瘍関連マクロファージ（Ｆ４／８０）（図１１Ｍ〜１１Ｐ）のために染色した。

【0183】

ラパマイシンによって処置したマウス、またはラパマイシンによって処置していないマウスにおいて、腫瘍移植片と正常移植片の間のサイズまたは外観に全体的な相違はなかった。ビヒクルによって処置したマウスにおいて、腫瘍移植片の真皮中のＣＯＸ ＩＶ陽性細胞の数は、正常移植片と同様であった（図１１Ａ、１１Ｃおよび１２Ａ）。しかしながら、ビヒクルによって処置した腫瘍移植片は、正常移植片よりもｐＳ６に対して免疫反応性がある真皮細胞および表皮細胞の数が多かった（図１１Ｅ、１１Ｇ、１２Ｂおよび１２Ｃ）。さらに、ビヒクルによって処置した腫瘍移植片の表皮は、正常な移植片よりもＫｉ−６７陽性細胞の数が多かった（図１１Ｉ、１１Ｋおよび１２Ｄ）。また、ビヒクルによって処置した腫瘍移植片は、正常移植片と比較して、ＣＤ６８陽性単核食細胞の数、ならびにＣＤ３１陽性血管の密度、サイズ、および血管面積が増加した（図１１Ｑおよび１１Ｓ）。他の患者の線維性斑、線維血管腫、および爪周囲線維腫のＴＳＣ２ヌル細胞を使用し、ＴＳＣの正常な線維芽細胞から構築した正常移植片と比較して、質的に同様の変化がみられた。腫瘍移植片および正常移植片が共に、同じ新生児包皮ケラチン細胞を使用して発生したので、これらの結果は、ＴＳＣ２ヌル細胞が、ＴＳＣ皮膚腫瘍の過誤腫性機能を誘導するのに十分であることを示す。

【0184】

ヒト抗ＨＬＡクラスＩ（図１３Ｃ、Ｄ）またはＣＯＸ−ＩＶ抗体（図１１Ｃ、Ｄ）による染色によって決定されるように、ラパマイシン処置によって、腫瘍異種移植片中のヒト真皮細胞の数が減少したが、腫瘍細胞は、処置を通して持続した。ラパマイシンは、正常な異種移植片に対して細胞数に有意な影響がなかった（図１３および１４）。処置終了時のＴＳＣ２ヌル細胞の持続性を、採取後、腫瘍異種移植片の顕微解剖した真皮、および腫瘍異種移植片から増殖した線維芽細胞の突然変異ＤＮＡの存在によって確認した（データは示さない）。真皮細胞および表皮細胞におけるｐＳ６免疫反応性の損失によって示されるように、ＴＳＣ２ヌル細胞は、ラパマイシンのインビボ浸透にもかかわらず、持続した（図１１Ｅおよび１１Ｇ）。ラパマイシン処置によって、腫瘍移植片中のＫｉ−６７陽性表皮細胞の数、単核食細胞の数、ならびに血管密度、サイズ、および合計面積が減少した（図１１および１２）。これらの結果は、ラパマイシンを摂取する患者にみられたＴＳＣ皮膚損傷の赤みおよびサイズの減少によって、抗腫瘍細胞効果および抗血管新生作用が共に生じ得ることを示唆する。ラパマイシンの抗血管新生作用は、血管内皮の直接的な阻害、および／またはＴＳＣ２ヌル細胞による血管新生因子放出の減少、もしくは血管新生促進単核球の動員の減少等の間接的な阻害によるものであると考えられる。ラパマイシンは、毛包、毛包密度、または毛包径による移植片の割合に影響を及ぼさなかった（表１）。毛包パラメーターに対する効果の不足は、毛包の誘導がｍＴＯＲＣ１に依存しないか、または毛包新生の開始後、ラパマイシンに効果がなかったことを示すものと考えられる。

【0185】

ヒトまたはマウスＤＮＡに特異的なプローブを使用する、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを行って、ＴＳＣ２ヌル細胞およびヒトのケラチン細胞を使用して、異種移植片においてヒト細胞とマウス細胞を区別した（図１５）。前に、４μｇの凍結切片を風乾させた後、３７℃で２０分間、２倍ＳＳＣバッファー中でインキュベートした。エタノール中での連続脱水後、切片を、１０ｍＭ ＨＣｌと０．００６％ペプシンによって、３７℃で２．５分間、処理し、ＰＢＳによって２回洗浄し、脱水し、風乾させた。切片を、７０％ホルムアミド、２倍ＳＳＣ中で、７０℃で２分間、変性させ、プローブ混合物（１０．５μＬのハイブリダイゼーションバッファー、および２μＬのプローブ）と３７℃で一晩、ハイブリダイズする前に脱水した。試料を、２倍ＳＳＣ／５０％ホルムアミドによって、３７℃で２回洗浄し、各目標領域上で、１０μＬのＤＡＰＩ（ベクターラボラトリーズ社製）を適用することによって、対比染色した。使用するプローブは、濃縮ヒトパン動原体塗料１６９５−Ｃｙ３−０２（カタログＮｏ．ＳＦＰ３３３９）、および濃縮マウスパン動原体染料−ＦＩＴＣ １６９７−ＭＦ−０２（カタログＮｏ．ＭＦ−０２）（オープンバイオシステム（Ｏｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社製）であった。ＤＡＰＩ染色は、細胞の核が、左下側角部の管内皮に、毛包上皮、および毛乳頭／表皮鞘細胞を含んだ毛包球を含むことを示した。Ｃｙ３ヒト特異的動原体プローブは、下部表皮鞘（水平方向の矢印）および隣接する真皮線維芽細胞（垂直方向の矢印）の細胞を含む、毛包球中の細胞に印をつけた。ＦＩＴＣマウス特異的動原体プローブは、内皮細胞を標識した（矢印）。結合した像は、毛包上皮、表皮鞘、および毛乳頭の細胞が、ヒト由来であることを示した（矢印）。これらの結果は、毛包が、表皮および真皮構成要素（毛乳頭と表皮鞘）の両方において、ヒト由来であることを示す。

【0186】

Ｅ．要約および結論
本実施例は、毛包新生が可能な皮膚代替物を開示する。また、本実施例は、結節硬化複合体（ＴＳＣ）における皮膚過誤腫の異種移植片モデルの開発についても開示する。患者の正常と考えられる皮膚の線維芽細胞ではなく、ヒトＴＳＣ皮膚過誤腫から増殖したＴＳＣ２ヌル線維芽細胞様細胞は、模倣ＴＳＣ過誤腫の組織的変化を刺激し、正常なヒト包皮ケラチン細胞を誘導して、毛包を形成した。毛包は、周期的に間隔を置き、正確に配向し、皮脂腺、毛幹、内毛根鞘、および外毛根鞘を十分に備え、また、幹細胞の付随層および膨出領域のマーカーを発現させた。毛包下部（すなわち、毛球）周囲のＴＳＣ２ヌル細胞は、幹細胞マーカーネスチンを含む、表皮鞘および毛乳頭のマーカーを発現させた。腫瘍異種移植片は、増加したｍＴＯＲＣ１機能、血管新生、および被覆する表皮細胞の増殖を含む、ＴＳＣ皮膚過誤腫の機能を要約した。ラパマイシン（ｍＴＯＲＣ１阻害剤）による処置は、これらのパラメーターを標準化し、腫瘍細胞の数を減少させたが、毛包サイズまたは密度を変化させなかった。

【0187】

これらの試験は、混乱した組織アーキテクチャーの過誤腫が、胎児の組織成長時において正常にみられる誘導能を有する細胞から生じることを示す。したがって、本実施例は、ＴＳＣ２ヌル線維芽細胞様細胞が、ＴＳＣ皮膚過誤腫を誘発する細胞であり、血管新生をシミュレートして、毛包新生を誘導することができることを示す。幹細胞マーカーの発現、およびこれらの細胞による髪の誘導能の保持は、ＴＳＣ２機能の欠損が、真皮中の多能性前駆細胞の分化を変化させることを示唆する。マウスでは、放射神経膠におけるＴＳＣ２の欠損は、前駆細胞プールを増加させ、ニューロンを減少させる。一方、造血幹細胞中のＴＳＣ１の欠失は、顆粒細胞−単球前駆細胞を増加させ、巨大核細胞赤血球前駆細胞を減少させる。線維血管腫および線維性斑のＴＳＣ２ヌル細胞は、毛包形態形成および再生成を調査するためのツールである。ＴＳＣ皮膚腫瘍が通常出生後に発生するという事実は、他の毛包過誤腫の発生に関与するＴＳＣ１／ＴＳＣ２ネットワーク、および／またはシグナリングネットワークに影響を与える薬剤を使用することによって、毛包誘導細胞を形成するかまたは増強する可能性を示唆する。

【0188】

実施例２：ＴＳＣ２およびＦＬＣＮノックダウン試験
立証された発毛促進能を有する細胞にみられたＴＳＣ２発現の欠損を模倣するために、ｓｈＲＮＡを使用して、培養した線維芽細胞および毛乳頭細胞中のＴＳＣ２発現をノックダウンした。さらに、バート−ホッグ−デューベ症候群患者が、ＴＳＣ皮膚過誤腫に類似する皮膚過誤腫の形成をもたらすＦＬＣＮ機能の欠損を有するため、ｓｈＲＮＡも使用して、培養した線維芽細胞および毛乳頭細胞中のＦＬＣＮ発現をノックダウンした。以下に論じるように、ＴＳＣ２およびＦＬＣＮのノックダウンは、細胞の発毛促進性を増強した。

【0189】

Ａ．遺伝子ノックダウン
野生型間葉系細胞（すなわち、真皮線維芽細胞および毛乳頭細胞）を、ｓｈＲＮＡを使用し、ＴＳＣ２の発現をノックダウンすることによって、ＴＳＣ２に改変して、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を低下させ、ｍＴＯＲＣ１機能を増加させた。さらに、野生型間葉系細胞を、ｓｈＲＮＡを使用し、ＦＬＣＮの発現を減少させることによって、ＦＬＣＮに改変して、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の欠損を模倣した。ＴＳＣ２を標的としたヘアピン配列を含む、ｐＧＩＰＺ−レンチウイルスｓｈＲＮＡｍｉｒベクターを有する市販のレンチウイルス粒子（オープンバイオシステム社製）を、ＴＳＣ２発現のノックダウンに使用した。ＦＬＣＮを標的としたヘアピン配列を含む、ｐＧＩＰＺ−レンチウイルスｓｈＲＮＡｍｉｒベクターを有する市販のレンチウイルス粒子（オープンバイオシステム社製）を、ＦＬＣＮ発現のノックダウンに使用した。新生児包皮線維芽細胞またはヒト毛乳頭細胞を、レンチウイルス粒子によって形質導入し、その後、形質導入４８時間後に開始するプロマイシン選択（２μｇ／ｍｌ）をした。ｓｈＲＮＡを安定的に発現させる細胞（ＧＦＰ発現によって決定する）を、プールし、プロマイシン中に維持した。公知の哺乳動物遺伝子に対して相同性のない非標的ｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＮＴ、ＮＴ）を含む、ｐＧＩＰＺレンチウイルスを、負の対照としてノックダウン試験に使用した。

【0190】

図１６は、ＴＳＣ２ノックダウン試験からの安定的にトランスフェクトされたすべての包皮線維芽細胞におけるＧＦＰの良好な発現を示す。細胞はすべて、少なくとも１１の継代培養において恒久的な形質導入が維持された。ウェスタンブロット分析は、形質導入によって、ＴＳＣ２の９０％を超えるノックダウンが生じることを確認した（図１７、一番上のバンド）。同じ結果は、ＴＳＣ２ノックダウンベクターによって形質導入された毛乳頭細胞にみられた（データは示さない）。さらに、ＦＬＣＮノックダウン粒子は、１００％の線維芽細胞を形質導入した（データは示さない）。したがって、事実上、細胞はすべて、関心のある遺伝子をノックダウンするのに使用したベクターによって形質導入され、標的遺伝子の発現は、実質的に低減された。

【0191】

Ｂ．ｍＴＯＲＣ１シグナリングに対するＴＳＣ２ノックダウンの影響
安定的にトランスフェクトされたＴＳＣ２ノックダウン包皮線維芽細胞でウェスタンブロット分析を行って、ＴＳＣ２発現が、ｍＴＯＲＣ１を介するシグナリングの活性化がみられる程度に十分に減少するか否かについて判断した。図１７は、血清飢餓条件下におけるリボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６）の超リン酸化によって示すように、ＴＳＣ２ノックダウンには、過剰に活性のあるｍＴＯＲＣ１シグナリングが伴ったことを示す。すべてのＳ６は不変であり、チューブリン対照は、比較可能な量のタンパク質が、異なるレーンにロードしたことを確認した。同様の結果は、複製の形質導入で得られた（データは示さない）。したがって、ＴＳＣ２発現は、ｍＴＯＲＣ１を介するシグナリングを活性化する方法で、良好にノックダウンされた。

【0192】

これらの結果は、ＴＳＣ２発現を減少させることによってか、またはＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能の模擬体の発現を減少させることによって、野生型間葉系細胞を改変して、ＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を低下させ、ｍＴＯＲＣ１機能を増加させることができることを示す。

【0193】

Ｃ．発毛促進（ｔｒｉｃｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）の分析
毛包の形成を誘導する細胞（生毛細胞）は、アルカリホスファターゼを発現させる。アルカリホスファターゼは、毛乳頭細胞のマーカーであり、高いアルカリホスファターゼ活性を有する毛乳頭細胞は、インビボにおいて、高い毛包誘導能を有する。したがって、培養形質導入細胞において、アルカリホスファターゼ活性を測定して、ＴＳＣ２またはＦＬＣＮ発現のノックダウンによって、生毛細胞の数が増加するか否かについて判断した。図１８に示すように、ヒト毛乳頭細胞は、初期継代培養時において高いアルカリホスファターゼ活性を有し、これは、その後の継代培養に伴って急速に低下する。対照的に、非標的ベクター（ｓｈＮＴ）ではなく、ｓｈＴＳＣ２を有する正常なヒト線維芽細胞を形質導入して、アルカリホスファターゼ活性が増加し、この増加は、数回の継代培養において維持された。全体として、アルカリホスファターゼ活性は、ＴＳＣの正常な線維芽細胞よりもＴＳＣ２ヌル細胞で高く、ＴＳＣ２ノックダウン細胞において発毛促進活性を示した。ＴＳＣ２がヒト毛乳頭細胞でノックダウンされる場合（図１９）と、ＦＬＣＮが真皮線維芽細胞にノックダウンされる場合（図２０）、同様の結果が得られた。したがって、ＴＳＣ２またはＦＬＣＮのノックダウンによる細胞は、アルカリホスファターゼ（発毛促進性毛乳頭細胞のマーカー）の細胞活性の増加を示した。

【0194】

Ｄ．ハンギングボールアッセイ（ｈａｎｇｉｎｇ ｂａｌｌ ａｓｓａｙ）における毛包新生の分析
インビトロ毛包分析を用いて、懸滴細胞培養物における毛包組織および構造対形成に対するＴＳＣ２のノックダウンの影響を決定した。簡潔には、改変間葉系細胞（ＴＳＣ２（ｓｈＴＳＣ２）または非テンプレート（ＮＴ）対照のノックダウンによる新生児包皮線維芽細胞（ＮＦＦ））から作製した、３０，０００の細胞の懸滴培養物を、毛乳頭培地とケラチン細胞無血清培地の１：１混合物（１０μｌ）中の新生児包皮ケラチン細胞（ＮＦＫ）（各細胞集塊当たり３０，０００の細胞）と組み合わせた。細胞集塊を、懸滴して、４週間、インキュベーターでインキュベートした。懸滴培養物をヘマトキシロンおよびエオシンで分析し、抗パンサイトケラチン抗体によって免疫組織化学検査を行って、選択的にケラチン細胞を確認した。

【0195】

図２１は、ＴＳＣ２ノックダウンｓｈＲＮＡまたは非テンプレート（ＮＴ）対照によって形質導入されたケラチン細胞および線維芽細胞を使用して、懸滴培養物で形成された構造体を比較する。ＴＳＣ２ノックダウン細胞による集塊は、線維芽細胞周囲のケラチン細胞と共に、大きな組織を示す傾向があった（図２１Ａおよび２１Ｃ）が、ＮＴ対照は、依然として混乱する傾向があった（図２１Ｂおよび２１Ｄ）。髪繊維様構造体がＴＳＣ２ノックダウン培養物にみられた。これらの細胞集塊では、正常なヒトの髪と同じ緑色の自動蛍光を発する、屈折繊維様構造体が形成した（図２１Ｅ）。ＴＳＣ２ノックダウン細胞によるこれらの集塊は、以下に論じるように、毛包形成のために、皮膚に移植されるか、または移植片に導入することができる。

【0196】

Ｅ．真皮−表皮複合体移植片における毛包新生の分析
形質導入した、および安定的にＴＳＣ２ノックダウンベクターを発現させる、新生児包皮線維芽細胞（ＮＦＦ）または毛乳頭細胞を使用して、真皮−表皮複合体を発生させた。細胞を、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中１ｍｇ／ｍＬのラット尾部１型コラーゲンと混合し、ウエル当たり０．５×１０^６の細胞密度で、６穴トランスウエルプレートに加えた。真皮構築物を、３日間、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で成長させた。ｓｈＴＳＣ２で形質導入されたＮＦＦの５つの３０，０００細胞懸滴マイクロスフィアを、真皮構築物上に静置し、１×１０^６のケラチン細胞で被覆した。真皮−表皮複合体を、４日間、０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭとハムのＦ１２（３：１）の混合物中で浸漬させてインキュベートし、その後、複合体を、気液界面に供し、皮膚等価物を、４日間または８日間、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭとハムのＦ１２（１：１）の混合物中で成長させた後、１０％ホルマリンに固定した。次いで、皮膚等価物を、ヘマトキシロンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）によって分析し、免疫組織化学検査を、抗パンサイトケラチン抗体によって行った。

【0197】

図２２に示すように、コラーゲンゲル中の正常なヒトケラチン細胞および線維芽細胞からなる真皮−表皮複合体は、真皮等価物を被覆する重層扁平上皮を形成し、真皮表皮接合部は、ケラチン細胞の陥入なしで適正に水平であった。しかしながら、ＴＳＣ２のノックダウンによる線維芽細胞を使用した、４日目（図２２Ａ）にケラチン細胞の管状の陥入が形成し、８日目に、これらの陥入が、パレード様配列（ｐａｌｌｉｓａｄｉｎｇ）ケラチン細胞の周縁部によって多細胞を拡大させ（図２２Ｂ）、成長する毛包と外観において類似した。免疫組織化学検査は、これらの構造体が真皮等価物に陥入することを示し（図２１Ｃ〜Ｅ）、これらが上皮細胞であることを示した。したがって、ＴＳＣ２のノックダウンは、真皮−表皮複合体における毛包様構造体のインビトロ形成を促進する。

【0198】

Ｆ．真皮−表皮複合体を移植したマウスにおける毛包新生の分析
マウス移植試験を行って、ＴＳＣ２のノックダウンが、インビボにおいて毛包の形成を促進するか否かについて判断した。簡潔には、新生児包皮線維芽細胞および毛乳頭を形質導入し、上述するように、ＴＳＣ２ノックダウンベクターまたは非標的ベクターのいずれかを選択した。細胞を、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中１ｍｇ／ｍＬのラット尾部１型コラーゲン（ＢＤバイオサイエンシーズ社製、ベッドフォード、マサチューセッツ州）と混合し、ウエル当たり０．５×１０^６の細胞密度で、６穴トランスウエルプレート（コーニング社製、コーニング、ニューヨーク州）に加えた。真皮構築物を、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で３日間成長させ、１×１０^６のケラチン細胞で被覆した。真皮−表皮複合体を、２日間、０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭとハムのＦ１２（３：１）の混合物中で浸漬させてインキュベートし、その後、複合体を気液界面に供し、移植前にさらに２日間、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭとハムのＦ１２（１：１）の混合物中で成長させた。

【0199】

６〜８週齢の老齢の雌Ｃｒ：ＮＩＨ（Ｓ）−ｎｕ／ｎｕマウス（ＦＣＲＤＣ、フレデリック、メリーランド州）に、Ｏ_２とイソフルランの混合物（２〜４％）によって、麻酔をかけた。マウス背部の移植領域を慎重に評価し、彎鋏を使用して皮膚を除去した。複合体を、正確な解剖配向で移植片面に配置し、無菌ヘトロラタムガーゼで被覆し、包帯で固定した。包帯を週２回交換し、４週後に除去した。併せて、３９匹のマウスに移植した（６匹のマウス：非標的対照ｓｈＲＮＡを有する新生児包皮線維芽細胞；１４匹のマウス：ＴＳＣ２ ｓｈＲＮＡを有する新生児包皮線維芽細胞；６匹のマウス：非標的対照ｓｈＲＮＡを有する毛乳頭；および、１３匹のマウス：ＴＳＣ２ ｓｈＲＮＡを有する毛乳頭）。移植１０週後にサンプリングした６匹のマウスでは、ｓｈＴＳＣ２線維芽細胞は、サンプリングした３匹のマウスのうちの１匹において毛包様構造体を誘導し、また、ｓｈＴＳＣ２毛乳頭細胞は、サンプリングした３匹のマウスのうちの１匹において毛包を誘導した（図２３）。結果は、出願時において他のマウスでは出ていない。

【0200】

Ｇ．結論
ｓｈＲＮＡのレンチウイルス形質導入を用いた、本実施例に示す結果は、ＴＳＣ２またはＦＬＣＮの欠損によって、線維芽細胞の発毛促進能が増強するという概念実証を提供する。

【0201】

実施例３：付属器腫瘍または正常ヒト皮膚からの間葉系細胞の単離
間葉系細胞は、次に示す１以上の供給源から単離することができる：自家細胞のための患者の皮膚または粘膜；同種異型細胞のためのドナーの皮膚または粘膜；正常な皮膚または粘膜；付属器腫瘍を有する皮膚；および、他の組織（例えば、脂肪、骨髄）。試料サイズが十分に大きい場合（すなわち、１ｃｍ^３以上）、線維芽細胞は、酵素消化によって単離することができる。

【0202】

Ａ．細胞移動方法
細胞は、細胞移動方法を用いる皮膚試料または皮膚腫瘍から単離することができる。外植片から細胞移動によって間葉系細胞を単離するために、皮膚試料を小さな断片に切断し、これを、１ｍＬまたは５ｍＬの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭまたは間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ；ロンザグループ（Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ）社製、スイス）を収容した、３５ｍｍまたは１００ｍｍの無菌皿に移す。プレートを、３７℃で、５％ＣＯ_２インキュベーターにインキュベートする。十分な数の間葉系細胞がみられるまで、培地を週２回度交換する。組織片から移動する細胞を、倒立顕微鏡を使用して、規則的にモニターする。間葉系細胞が、外植片（培養開始およそ２〜３週後）間の皿表面の大部分を占める場合、間葉系細胞を二次培養する。細胞を、二次培養のために採取し、小さな組織片を、多くの細胞を単離するために、新しい皿に移し、細胞が組織からこれ以上移動しなくなるまで、外植片の移動を１０回より多く繰り返す。各移動からの細胞を、初期継代培養で液体窒素中に保存する。

【0203】

Ｂ．２つの代替的な細胞解離方法
皮膚試料または皮膚腫瘍からの細胞解離を、間葉系細胞を単離するのに使用することができる。本方法によれば、皮膚試料（１×１ｃｍ）を、４℃で、６０ｍｍ皿で、３ｍｌのディスパーゼによって一晩処理する。または、試料を、室温で３０分間、０．２５％トリプシンによって処理してもよい。真皮を表皮シートから分離し、小さな断片に切断する。試料を、１０ｍＬの酵素溶液（１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２．７５ｍｇ／ｍＬ細菌コラゲナーゼ、１．２５ｍｇ／ｍＬヒアルロニダーゼ、および０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮアーゼＩを添加したリヒターの改良ＭＥＭインシュリン培地（ＲＰＭＩ）を含む、ＨＥＰＥＳ）が入った５０ｍＬ遠心分離管中で、室温で３時間、インキュベートする。インキュベーション後、組織を、１０回を上下にピペッティングすることによって、機械的に解離する。細胞懸濁液を、無菌ナイロンメッシュによってろ過して、組織断片を除去し、室温で１０分間、４００×ｇで遠心分離する。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１０ｍｌの培地（間葉系幹細胞増殖培地、または１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ等）中に再懸濁させ、７５ｃｍ^２培養皿に移す。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養し、培地を２４時間後に交換して、非接着性物質を除去する。

【0204】

皮膚試料または皮膚腫瘍からの細胞解離のための代替アプローチは、ＰＢＳ中で真皮を３回洗浄し、小さな断片（２〜３ｍｍ^３）に細かく切断し、３７℃、穏やかな振盪条件（５０〜５５ｒｐｍ）下で、４ｍｌ／ｇ組織中、クロストリジウム・ヒストリチウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）コラゲナーゼ（ＣＨＣ）抽出物（ワージントンバイオケミカル（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）社製、レークウッド、ニュージャージー州）を含むＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）溶液で消化することである。インキュベーション後、消化物を、開口したフィルタチャンバー（ＮＰＢＩ、エマー−コンパスキューム、オランダ）によってろ過し、フィルタを１０ｍｌ培地によって２回洗浄する。湿潤組織重量を消化前後に測定して、組織消化効率を算出する。細胞懸濁液を、２５０×ｇで１０分間、遠心分離し、上清を吸引し、また、細胞を細胞培養培地中に再懸濁させる。算出室を使用して、細胞濃度を、３つの個別に採取した試料で３回測定し（単離細胞収率）、生存率をトリパンブルー（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）排除法によって評価する。細胞を、３つの独立したフラスコで、５×１０^４または１０×１０^４細胞／ｃｍ^２の密度で培養物に接種する。２４時間後、接着した細胞の割合を、フレームグラッバーイメージプリンターを備えるビデオカメラに接続した倒立顕微鏡を使用して、評価する。

【0205】

Ｃ．毛乳頭（ＤＰ）／表皮鞘（ＤＳ）間葉系細胞の単離
毛乳頭細胞は、顕微解剖によってヒト頭皮試料から単離し、その後、３７℃で３０分間、穏やかな撹拌によって、コラゲナーゼによって処理することができる。毛乳頭細胞の富化は、トルイジンブルー染色を使用するか、または、細胞核内の桿のための細胞の検査によって、確認することができる。細胞は、２〜３日ごとに交換した、チャンの培地とケラチン細胞調整培地の１：１混合物で増殖させることができる。

【0206】

表皮鞘細胞は、ヒト皮膚試料をさいの目に切り、次いで、コラゲナーゼによって試料を酵素的に解離することによって、正常なヒト成人皮膚から単離することができる。酵素解離は、皮膚外植片を使用するよりも短期間で多くの細胞を提供する。さらに、細胞生存率および増殖は、自家移植のための真皮等価物を生成するのに十分である。表皮鞘細胞は、４℃で３０分間、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１０抗体を有する細胞をインキュベートし、その後、細胞選別することによって、同定することができる。

【0207】

また、ＤＰおよびＤＳ細胞は、ハンクスバッファー中で３回、各回１０分間、正常なヒト頭皮組織（１×１ｃｍ）を洗浄し、約０．３〜０．５ｃｍ幅のストリップに切断し、そして、真皮および皮下脂肪の界面で切断することによって、単離することもできる。皮下組織を、４℃で１６〜１８時間、３〜５ｍｌの０．５％ディスパーゼ（シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社、セントルイス、ミズーリ州）と共にインキュベートする。毛包を皮膚脂肪から引き抜く。上皮を、緩やかな圧力を１組のマイクロピンセットの先端にかけることによって、表皮鞘から押し出す。次いで、表皮鞘を、毛乳頭の柄が顕微鏡制御下で消化されるまで、３７℃で６〜８時間、１０％ＦＢＳを含むエングル最小必須培地（ＭＥＭ）（ＩＣＮバイオメディカルズ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）社製、オローラ、オハイオ州、米国）中０．２％コラゲナーゼＤ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製、ドイツ）で、インキュベートする。線維鞘が完全に消化され、乳頭状突起がちょうど消化開始されるときに、酵素消化を停止する。ハンクスを加え、懸濁液を、２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、これを３回繰り返す。ペレットを再懸濁させ、２００ｒｐｍで５分間、低速で遠心分離し、これを３回繰り返し、培養上清中にＤＳ細胞を残す。真皮乳頭を、低速遠心分離によって残留物から完全に単離する。最終的な毛乳頭ペレットを、単離細胞なしで再懸濁させ、１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地中の外植片培養物のための培地を収容した２５ｍｌフラスコに移す。培養物を５日間インキュベートし、培地を毎週２回交換する。

【0208】

その後、単離した毛乳頭および表皮鞘細胞を、適切な培地にインキュベートして、毛乳頭および表皮鞘のマーカーの誘導または維持について試験することができる。

【0209】

Ｄ．皮膚から皮膚由来前駆体または神経冠細胞を得るための方法を用いる、間葉系細胞の単離
ヒト間葉系細胞を、皮膚由来前駆体として、同様の方法を用いて単離する（Ｂｉｅｒｎａｓｋｉｅ，Ｊ．Ａ．らの文献：「皮膚由来前駆体（ＳＫＰ）の単離、およびこれらのシュワン細胞子孫の分化と富化（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（ＳＫＰｓ） ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｉｒ Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｇｅｎｙ）」，Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １（６）：２８０３−２８１２（２００６））。簡潔には、ヒト皮膚試料または皮膚腫瘍を、ＨＢＳＳ中で洗浄し、３〜５ｍｍ^２の大きさの小さな断片に切断し、２５ｍｌのブレンドザイム（Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ）溶液（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）を充填した１０ｃｍプラスチック組織培養皿で、４℃で２４〜４８時間、消化する。表皮を、微細なピンセットを使用して、内在する真皮から剥離し、単離した真皮組織を、カミソリ刀を使用して１〜２ｍｍ^２の断片に細かく切断する。ヒト真皮のこれらの小さな断片を、５〜１０ｍｌの新しいブレンドザイム溶液を収容した１５ｍｌ円錐管に収集する。また、ＤＮアーゼＩ（１つの４００μｌアリコート）を懸濁液に加えて、細胞凝集を低減させることもできる。組織の最も効果的な消化のために、試料を、３７℃で１〜２時間、穏やかに撹拌することができる。消化終了時に、１０％ＦＢＳ添加２０ｍｌ洗浄用培地を加えて、ブレンドザイムを不活性化させる。１，２００ｒ．ｐ．ｍ．で、６〜８分間、組織試料を遠心分離して、細胞および皮膚断片をすべてペレット化する。酵素および培地を含む上清を廃棄する。新しい洗浄用培地（３〜５ｍｌ）を加え、１０ｍｌのディスポーザブルプラスチックピペットを使用して、ペレットを解離する。懸濁液を、１，２００ｒ．ｐ．ｍで２０秒間、遠心分離して、大きな皮膚断片をペレット化する。上清を、５０ｍｌ収集管に収集し、冷凍する。組織ペレットを、組織片が厚くなり、細胞がこれ以上する遊離しなくなるまで、粉砕手段を繰り返すための新しい培地中で解離する。解離した細胞懸濁液を、７０μｍ細胞ストレーナを通して５０ｍｌ円錐管に入れ、１，２００ｒ．ｐ．ｍ．で７分間、遠心分離する。細胞ペレットを、２％Ｂ２７添加物（インビトロゲン社製）添加洗浄用培地中に再懸濁させる。再懸濁液の容積は、ペレットのサイズに依存して、５ｍｌ〜２０ｍｌの媒体であり、細胞収率の定量化を簡潔にするために調整することができる。解離した真皮細胞を、７５ｃｍ^２フラスコで、３０ｍｌの増殖培地（０．１％ペニシリン／ストレプトマイシン、４０μｇ／ｍｌフンギゾン、４０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、２％Ｂ２７添加物を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１））、および２５ｃｍ^２フラスコで１０ｍｌに希釈する。細胞を、球状のコロニーを形成させるために、継代培養なしで、７〜１４日間培養し、培地を４〜５日ごとに交換する。

【0210】

実施例４：改変間葉系細胞の発生
Ａ．遺伝子ノックダウン
ノックダウン遺伝子発現、例えば、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＣＹＬＤ、ＬＫＢ１、ＦＬＣＮ、ＭＥＮ１、ＮＦ１、ＰＴＥＮ、ＰＲＡＳ４０、４Ｅ−ＢＰ１、ＧＳＫ３もしくはＤｅｐｔｏｒ、カスタムクローン化ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のレンチウイルス粒子、またはｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ−ＣＭＶ−ｔＧＦＰベクター（シグマ社製）における非標的ｓｈＲＮＡ対照を、メーカーの説明書に従って、使用することができる。パイロット試験において、細胞を６穴プレート（２×１０^５細胞／ウエル）に載置し、２４時間、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに培養する。培地を、８μｇ／ｍｌのヘキサジメトリンを添加した、示される遺伝子または対照ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子（０、１、２、５、１０もしくは２０ＭＯＩ）に対するｓｈＲＮＡを含む、２ｍｌの新しい１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭと交換し、一晩インキュベートする。ウイルス粒子を含む培地を除去し、細胞を、１０〜１４日間、プロマイシンによる選択２４時間前に、新しい完全培地中で培養する（滴定は、０．５〜１０μｇ／ｍｌのプロマイシンによって９６穴プレート中で１×１０^４細胞を処理することによって、使用前に行うことができる）。プロマイシンを含む培地を３日ごとに交換する。プロマイシン耐性細胞コロニーを収集し、更なる分析のために培養する。遺伝子発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲまたはウェスタンブロットによって測定する。遺伝子ノックダウン後の細胞を評価するために、形質導入された細胞を、プロマイシン選択後にプールする。形質導入された細胞における標的タンパク質のレベルを、ウェスタンブロットによって測定し、１、１０、２０、３０および４０継代培養の対照ｓｈＲＮＡ細胞と比較する。

【0211】

または、もしくはさらに、遺伝子療法を遺伝子発現のノックダウンに用いることができる。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、ＴＳＣ１もしくはＴＳＣ２遺伝子において、またはＴＳＣ１／ＴＳＣ２機能を刺激するタンパク質をコードする遺伝子において、標的二本鎖切断を発生することができる（例えば、Ｌｅｅらの文献：Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２０：８１−８９（２０１０）；Ｈａｎｄｅｌらの文献：Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１１：２８−３７（２０１１）；Ｈｏｌｔらの文献：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２８：８３９−４７（２０１０）；および、Ｌｅｄｆｏｒｄの文献：Ｎａｔｕｒｅ，４７１：１６（２０１１）を参照のこと）。簡潔には、単離した細胞を、一般に関心の高い遺伝子のコード領域の最初の２／３を標的とする、コンポＺｒ（ＣｏｍｐｏＺｒ）（登録商標）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）社製）（または、他の適切なヌクレアーゼ）によって、処理することができる。ＺＦＮをインシリコで設計し、細胞分析で試験して、標的部位を切断するＺＦＮを同定し、また、１組のＺＦＮを使用のために選択する。ＺＦＮは、ＺＦＮプラスミドもしくはｍＲＮＡ転写のヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、または脂質系トランスフェクションを用いて、細胞に送達することができる。また、ＺＦＮを、レンチウイルス等のウイルスベクターを使用して送達することもできる。ヌクレオフェクションにおいて、約８０％の集密度の５×１０^６〜１０×１０^６の細胞を、トリプシン処理し、メーカーの説明書に従って、ヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）キット（アマクサバイオシステムズ（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製）を使用して、約５μｇの各ＺＦＮコードプラスミドによってトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ等の培地に維持する。ミスマッチ特異的切断分析（Ｃｅｌ−１が、変性−復元後の野生型および変異型ＤＮＡ鎖のヘテロ二本鎖を切断する、サーベイヤー（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）エンドヌクレアーゼ分析（Ｃｅｌ−１；トランスゲノミクス（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）社製）等）を用いて、ノックアウトによる細胞の割合を決定することができる。ノックアウトによる細胞の純粋な集団または富化された集団を得るために、細胞をクローン化することができる。または、ＧＦＰまたはプロマイシンプラスミド等の遺伝子を、ＺＦＮによるＴＳＣ１またはＴＳＣ２ノックアウト時の相同組換えによって、挿入することができる。これによって、ＦＡＣＳを使用して、細胞を選別するか、または抗生物質選択を用いて、富化することができる。処理細胞の標的タンパク質のレベルを、ウェスタンブロットによって測定し、対照の未処理細胞と比較することができる。

【0212】

また、形質導入された細胞を、ｍＴＯＲＣ１シグナリングに対するノックダウンの影響について分析することもできる。これは、ウェスタンブロットにより形質導入された細胞におけるホスホ−Ｓ６発現を測定することによって、達成され、１、１０、２０、３０および４０継代培養で対照ｓｈＲＮＡ細胞と比較することができる。Ｗｎｔシグナリングが髪形態形成時に活性があるので、Ｗｎｔシグナリングに対するノックダウンの影響も評価することができる。これは、特異的抗体（セル・シグナリング・テクノロジー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製）を使用するウェスタンブロットにより、ベータ−カテニンおよびＧＳＫ３のレベルを測定することによって行うことができる。ＷＮＴネットワークは、成長時に表皮プラコードにおいて活性があり、また、ＷＮＴタンパク質は、真皮凝縮物を誘導して形成するシグナルの一部と考えられる（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｊ．らの文献：「Ｗｎｔシグナリングは、毛乳頭の髪誘導活性を維持する（Ｗｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ Ｈａｉｒ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ）」，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４（１０）：１１８１−１１８５（２０００）；Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈ．らの文献：「ベータ−カテニン経路を介するＷｎｔシグナリングは、維持するのに十分であるが、回復しない、毛乳頭細胞の成長期の特性（Ｗｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ Ｍａｉｎｔａｉｎ，ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｒｅｓｔｏｒｅ，Ａｎａｇｅｎ−Ｐｈａｓｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌｓ）」，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １２２（２）：２３９−２４５（２００４））。

【0213】

Ｂ．遺伝子誘導
ヒト間葉系細胞を、標準手順を用いて、構造的に活性のあるプロモーターの制御下で、ｍＴＯＲネットワークを活性化するか、または毛包関連遺伝子（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｋ、Ｅｒｋ、Ｒｓｋ１、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、Ｒｈｅｂ、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ｍＬＳＴ８、Ｓ６Ｋ１、リボソームタンパク質Ｓ６、ＳＫＡＲ、ＳＲＥＢＰ１、ｅＩＦ４ｅ、ＩＫＫｂｅｔａ、Ｍｙｃ、Ｒｕｎｘ１、またはｐ２７）の安定した発現のために、トランスフェクトすることができる（Ｏｒｔｉｚ−Ｕｒｄａ，Ｓ．らの文献：「遺伝子操作線維芽細胞の注入は、再生ヒト表皮水疱症皮膚組織を矯正する（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ｃｏｒｒｅｃｔｓ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ Ｂｕｌｌｏｓａ Ｓｋｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ）」，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１１（２）：２５１−２５５（２００３））。簡潔には、ＣＭＶ ＩＥプロモーターを使用して、遺伝子を、ＢｇｌＩＩ断片として、２８５ｂｐのΦＣ３１ａｔｔＢ配列を、プラスミドｐｃＤＮＡａｔｔＢを作製するバックボーンベクターｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏのＢｇｌＩＩ部位に挿入することによって、ストレプトマイセスファージΦＣ３１インテグラーゼ支援安定化組込みプラスミドに導入することができる。ＩＲＥＳおよびブラストシジン（ｂｌａｓｔｏｃｉｄｉｎ）の抵抗配列を、ｐｃＤＮＡａｔｔＢのＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ部位に挿入され、プラスミドｐｃＤＮＡａｔｔＢ−ＩＢを形成する、鈍化ＳｎａＢＩ−ＮｈｅＩ断片として、ｐＷＺＬ芽細胞ベクターから除去することができる。次いで、示される遺伝子のうちの１つを増幅し、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＩ（鈍化）／ＢａｍＨＩ断片として、ｌａｃＺ遺伝子によって、ｐｃＤＮＡａｔｔＢ−ＩＢのＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ（鈍化）／ＢａｍＨＩ部位にそれぞれクローン化する。この手順は、関心のある遺伝子ａｔｔＢおよびｐｌａｃＺ−ａｔｔＢを含む伝達性プラスミドを作製する。その後、構築されたベクターを、ΦＣ３１インテグラーゼコードプラスミドによってヒト間葉系細胞に同時トランスフェクトする。簡潔には、ヒト間葉系細胞を、改良ポリブレン衝撃を用いて、ｐＩｎｔおよび関心のある遺伝子ａｔｔＢおよびｐｌａｃＺ−ａｔｔＢによってトランスフェクトする。初期ヒト間葉系細胞を、７０〜８０％の集密状態まで、３５ｍｍプレートに培養し、次いで、改良ポリブレン衝撃によってトランスフェクトする。ポリブレントランスフェクションにおいて、７６０ｍｌの増殖培地を、トランスフェクトされるプラスミドと混合し、この混合物を激しく撹拌する。ＨＢＳＳ中３．８ｍｌの１ｍｇ／ｍｌの臭化ヘキサジメトリン（アルドリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社製、ミルウォーキー、ウイスコンシン州）を加え、再度撹拌する。この混合物を６時間、細胞に被覆する。培地を吸引した後、増殖培地混合物中で２８％ＤＭＳＯ（シグマケミカル社製、セントルイス、ミズーリ州）を細胞に適用する。細胞を９０秒間インキュベートした後、ＤＭＳＯを吸引し、１０％仔ウシ血清を含むＰＢＳと交換する。プレートを２回洗浄し、細胞を、３７℃で一晩、新しい増殖培地にインキュベートする。選択のために、トランスフェクション３日後の細胞に、培地中でブラスチシジン（４μｇ／ｍｌ）を１０日間供する。遺伝子導入効率を、免疫蛍光顕微鏡検査法およびイムノブロットアッセイによって確認する。１０日間の選択後、間葉系細胞コロニーをトリプシン処理し、限界希釈法でサブクローン化して、高い増殖性クローンを得る。

【0214】

Ｃ．インビトロにおける細胞へのタンパク質送達
ｍＴＯＲネットワーク活性化または毛包関連タンパク質を、記載する方法を用いてヒト間葉系細胞に送達することができる（Ｗｅｉｌｌ，Ｃ．Ｏ．らの文献：「細胞内タンパク質送達のための実用的アプローチ（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５６（１），４１−４８（２００８））。細胞を、タンパク質送達時に、およそ７０〜８０％の集密度に到達させるために、載置する。２４穴プレートの１ウエルに、０．５〜８μｇの精製タンパク質を、滅菌条件下で、１．５ｍｌのマイクロ遠心管中の１００μｌのＨｅｐｅｓバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈する。それぞれの遠心管で、１〜８μｌのタンパク質送達試薬プルシン（ＰＵＬＳｉｎ）（商標）（イルキルシュ（Ｉｌｌｋｉｒｃｈ）社製、フランス）を、タンパク質溶液に加える。ボルテックスによる簡単な均質化後、タンパク質／試薬混合物を、室温で１５分間、インキュベートして、複合体を形成させる。細胞を１ｍｌのＰＢＳによって洗浄し、９００μｌの無血清培地を、それぞれのウエルに加える。それぞれのウエルへの複合体の添加後、プレートを、穏やかに混合し、さらに３７℃でインキュベートする。４時間後、インキュベートした培地を除去し、１ｍｌの新しい完全培地（血清を含む）と交換する。タンパク質送達を、免疫細胞化学検査によって、即時にまたは後で分析する。

【0215】

実施例５：髪の誘導性による細胞の富化
Ａ．細胞マーカーに基づく分離
実施例３Ｂにおける一方のプロトコールに説明するように、皮膚組織を調製する。細胞を、０．２５％トリプシンおよび５ｍＭ ＥＤＴＡ（シグマ社製）を含む溶液を使用して、７日後に採取し、細胞マーカーＣＤ−１０に基づく髪誘導細胞のために富化する。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ−１０抗体（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製）を、４℃で３０分間、線維芽細胞とインキュベートする。０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳによって細胞を洗浄後、ＢＤバイオサイエンス社製のＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターを使用して、細胞を選別する。

【0216】

または、細胞を、室温で３０分間、抗ＣＤ１０／ＲＰＥ抗体（１×１０^６の細胞１０ｍｌ；ダコ（ＤＡＫＯ）社製、グロストラップ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ）、デンマーク；クローンＳＳ２／３６）で標識する。標識細胞を、ＰＢＳ、２％ウシ血清アルブミンによって洗浄し、室温で３０分間、抗ＰＥマイクロビーズ（１０ｍｌ／１０^６の細胞；ミルテニイバイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）社製、ベルギシュグラドバッハ、ドイツ）とインキュベートし、メーカーのプロトコールに従って、ＭｉｎｉＭＡＣＳセパレーター（ミルテニイバイオテック社製）に配置したＭＡＣＳカラムによって分離する。

【0217】

Ｂ．所望の細胞の増殖の促進、不要な細胞の増殖の阻害／致死に基づく分離
ＢＭＰ２、４、５もしくは６、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ、ＦＧＦ２、ＫＧＦ、または他のもの等の成長因子を、成長培地に加えて、毛乳頭細胞を含む髪誘導細胞を維持し富化することができる。毛乳頭細胞を、増加したＷＮＴタンパク質、またはＷＮＴによって促進されたシグナル伝達の効果を模倣する薬剤の存在下で培養する。本方法は、上に論じる、ＷＮＴシグナリングが髪形態形成時に活性があるという発見に基づく（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｊ．らの文献：「Ｗｎｔシグナリングは、毛乳頭の髪誘導活性を維持する（Ｗｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ Ｈａｉｒ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ，）」，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４（１０）：１１８１−１１８５（２０００）；Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈ．らの文献：「ベータ−カテニン経路を介するＷｎｔシグナリングは、維持するのに十分であるが、回復しない、毛乳頭細胞の成長期の特性（Ｗｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｂｅｔａ−Ｃａｔｅｎｉｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ Ｍａｉｎｔａｉｎ，ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｒｅｓｔｏｒｅ，Ａｎａｇｅｎ−Ｐｈａｓｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌｓ）」，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １２２（２）：２３９−２４５（２００４））。

【0218】

代替アプローチは、ヒトＷｎｔ−３ａタンパク質を含む調整培地を調製することである。マウスＬ細胞を、３７℃で、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を添加したＤＭＥＭとＨＡＭ Ｆ１２培地の１：１混合物で培養する。Ｗｎｔ−３ａ ｃＤＮＡによってトランスフェクトされたＬ細胞の確立において、ヒトＷｎｔ−３ａ ｃＤＮＡ（この発現は、ラットホスホグリセロキナーゼ遺伝子のプロモーター（ＰＧＫプロモーター）によって促進され、ウシ成長ホルモン遺伝子の転写ターミネーター配列で終了する）を、ＰＧＫプロモーターによって促進するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）を含むｐＧＫｎｅｏに、挿入することによって、ｐＧＫＷｎｔ−３ａを構築することができる。ＤＮＡ添加１日前に、１．５×１０^６の細胞／プレートの密度で、６０ｍｍ培養皿に載置したＬ細胞に、ｐＧＫＷｎｔ−３ａを、リン酸カルシウム法によって導入する。これらの培養物に、４００ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を、トランスフェクション２日後に加える。次いで、安定的にトランスフェクトされたクローンを選択し、二次培養する。Ｗｎｔ−３ａ産生Ｌ細胞の培養物から調整培地（ＣＭ）を回収するために、これらの細胞を、１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭとＨＡＭ Ｆ１２の１：１混合物を収容した１００ｍｍ皿に、１×１０^６の細胞密度で接種し、４日間培養する。調整培地を採取し、１０００ｇで１０分間、遠心分離し、ニトロセルロース膜によってろ過する。対照として、調整培地を、ｐＧＫｎｅｏのみによってトランスフェクトされたＬ細胞から調製し、上述と同じ条件下で培養することができる。調整培地を使用して、Ｗｎｔ促進髪誘導細胞を得ることができる。簡潔には、１００〜１０００の皮膚間葉系細胞を、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中の１００ｍｍ皿に載置し、２４時間培養する。翌日、培地を、Ｗｎｔ２ａタンパク質を含むＬ細胞調整培地と交換し、３日ごとの培地変更によって２週間培養する。２週後に、細胞クローンを、ヒト皮膚への更なる分析または注入のために回収する。

【0219】

実施例６：特殊な培地または成長因子を使用する増殖時の髪誘導性の維持
ヒトＤＰ細胞の毛包誘導潜在能は、次に示す培地のうちの１つで維持することができる。

【0220】

チャンの培地（Ｃｈａｎｇ Ｈ．Ｃ．らの文献：「ホルモン添加培地で増殖させたヒト羊水細胞：出生前診断での適応性（Ｈｕｍａｎ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ａ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ：ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９（１５）：４７９５−９（１９８２））：簡潔には、基本培地［無血清（ＳＦ）培地］を、１５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１リットル当たり１．２ｇのＮａＨＣＯ_３、４０ｍｇのペニシリン、８ｍｇのアンピシリン、および９０ｍｇのストレプトマイシンを添加した、ダルベッコ−フォークト変法イーグル培地（ＤＶＭＥ培地）とハムのＦ１２培地（Ｆ１２培地）の１：１混合物である。１０の発育促進物質を添加したＳＦ培地を、Ｈ培地（補足培地）と称する。添加した発育促進物質は、次に示すとおりである：トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、セレン（２０ｎＭ）、インシュリン（１０μｇ／ｍｌ）、トリヨードサイロニン（０．１ｎＭ）、グルカゴン（１μｇ／ｍｌ）、線維芽細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（１ｎＭ）、テストステロン（１ｎＭ）、エストラジオール（１ｎＭ）、およびプロゲステロン（１ｎＭ）。

【0221】

ケラチン細胞調整培地（ＫＣＭ）：ケラチン細胞培養物からＫＣＭを回収するために、１０^６の細胞を、１００ｍｍ皿に載置し、１０ｍｌの培地（ＦＢＳまたは成長添加物質を含まない５０％ＫＳＦＭおよび５０％ＤＭＥＭ）で３〜５日間培養する。調整培地を回収し、これを、ヒト皮膚への注入２〜４週前に、皮膚間葉系細胞の培養に使用する。

【0222】

市販の培地または成長因子の利用：間葉系幹細胞培地（インビトロゲン社製）、またはヒト毛包ＤＰ細胞増殖培地（プロモセル（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）社製）を、ヒトＤＰ細胞の培養に使用する。ＢＭＰ６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ、バイオビジョン（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）社製）、またはレプチン（０、１０、もしくは１００ｎｇ／ｍｌ、シグマアルドリッチ社製）等の他の成長因子を、ＤＰ細胞培養に利用することができる。

【0223】

小分子阻害剤の使用：髪を維持するために、誘導型間葉系細胞、ＧＳＫ−３阻害剤、ＢＩＯ（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を１００ｍｍ皿中に１．５μＭ、培地に加える。細胞を二次培養し、ヒト皮膚の更なる分析またはヒト皮膚への注入２週間より前に継代培養する。

【0224】

実施例７：表皮細胞の単離
表皮細胞を次に示す供給源から単離することができる：患者皮膚または粘膜（自家）、ドナー皮膚または粘膜（同種異型）、表皮細胞系、幹細胞由来の表皮細胞、および初期または継代培養された表皮細胞。

【0225】

ケラチン細胞を単離するために、ヒト新生児包皮または成人皮膚組織を、４℃で一晩、ディスパーゼによって処理する。表皮シートを真皮シートから分離し、次いで、３７℃で２０分間、０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡによって消化する。細胞を回収し、ウシ下垂体抽出物、および組換え型上皮成長因子を添加した、ケラチン細胞無血清培地中の組織培養皿に載置した。本方法は、上に論じる、間葉系細胞の細胞解離方法に類似する（すなわち、真皮の切断を、間葉系細胞に使用し、上皮の切断を、表皮細胞に使用する）。

【0226】

または、次に示すプロトコールを用いて、幹細胞を誘導して、表皮細胞に分化することによって、幹細胞を、表皮細胞を発生させるために使用することができる。従来の研究は、幹細胞をＢＭコーティング皿に載置する場合、幹細胞は、ケラチン１４（Ｋ１４）陽性細胞に分化することができる上皮シートを生じさせることを示した。また、これらの研究は、かかる培養物が、上皮先祖細胞（ＥＰＣ）と呼ばれる二次培養で維持される、表皮先祖細胞を含むことも示唆した。高密度で培養する場合、抗体による間接免疫蛍光法によって決定されるように、ＥＰＣは、毛包分化経路に沿って成長し、髪ケラチンを発現させる。幹細胞を誘導して、表皮細胞に分化するために、３５ｍｍ組織培養皿で増殖する幹細胞を、室温で３０分間、マトリゲル（１ｍＬ／３５ｍｍ皿、およそ０．１ｍｇ）でコーティングし、次いで、マトリゲルを、１５％ＤＭＥＭと穏やかに交換する。４日目に、細胞を、インキュベーターで、２〜３分間、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡによって処理する。細胞を、１５ｍＬファルコンチューブに移し、アリコートを除去して、すべての使用可能な細胞を数える。細胞を、ペレット形成のために、７００×ｇで、２〜３分間、遠心分離する。回転時に、細胞を、コールターカウンターを使用して数える。ペレットを１５％ＤＭＥＭによって再懸濁させ、１０^６の細胞／３５ｍｍ皿に載置するために、適切に希釈する。免疫蛍光検査において、細胞を、２２×２２ｍｍのガラス製カバーグラスに載置することができる。

【0227】

実施例８：毛包分化能を有する表皮細胞の富化
Ａ．細胞接着
新生児または成人のヒト皮膚の幹細胞集団を、以前に報告された方法に従って、迅速な接着によって富化することができる。簡潔には、１００ｍｍ細菌プラスチック皿を、１００μｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲンでコーティングし、０．５ｍｇ／ｍｌの熱変性ＢＳＡと３７℃で１時間、インキュベートし、無血清培地中で洗浄する。ケラチン細胞を、１〜５×１０^３細胞／ｍｌの密度で、無血清培地中に再懸濁させる。１０ｍｌの細胞懸濁液を、ＩＶ型コラーゲンをコーティングした皿に加え、この皿を、５台の顕微鏡のあるインキュベーターに戻す。接着した細胞を迅速に採取し、０．４ｍｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（シグマ社製）、５ｍｇ／ｍｌトランスフェリン（シグマ社製）、５ｍｇ／ｍｌインシュリン（シグマ社製）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子（ＥＧＦ）（シグマ社製）、および１０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を添加した、ＦＡＤ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ３：１、ｖ／ｖ、ギブコ）中の更なる培養物において、１×１０^５細胞で再度載置する。皿を、３７℃、１００％の湿度、および５％ＣＯ_２でインキュベーターに載置し、培地を２〜３日ごとに交換する。細胞外マトリックスでコーティングした培養皿に多く接着する、表皮幹細胞は、毛包に形成する高い潜在能を有する。

【0228】

Ｂ．細胞選別
膨出細胞は、磁性ビーズ系によって単離することができる。２つの磁性ビーズ系を組み合わせて、中間毛包懸濁液から膨出ＯＲＳ細胞を単離する。最初に、毛包細胞を、４℃で２０分間、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ２４、ＣＤ３４、ＣＤ７１、およびＣＤ１４６抗体（ＢＮＣ）のカクテルによって染色する。洗浄後、毛包細胞を、４℃で２５分間、抗ＰＥマイクロビーズ（ミルテニイバイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）社製）とインキュベートする。その後、ＰＥ陽性非膨出細胞を、小型ＭＡＣＳ ＭＳカラム（ミルテニイバイオテック社製）を使用して、磁力分離によって除去する。除去手順を３〜５回繰り返して、最大の消耗を確認する。次に、中間毛包細胞を、４℃で２０分間、精製した抗ヒトＣＤ２００マウスｍＡｂとインキュベートし、洗浄し、４℃で３０分間、傾かせて、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ−４５０ヒツジ抗マウスＩｇＧ磁性ビーズ（ダイナルバイオテック（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製）とインキュベートする。その後、正の選別を、ＭＰＣ−Ｌ磁性粒子コンセントレーター（ダイナルバイオテック社製）によって行い、ＣＤ２００陽性細胞を得る。ＣＤ５９陽性細胞を、正の選別対照として同様に回収してもよい。膨出細胞を富化する表皮細胞の調製によって、高い毛包形成能を有することが期待される。

【0229】

実施例９：移植のための細胞の調製
Ａ．皮膚代替物
三次元インビトロ構築物を、本明細書に記載するように、確立された改良法を用いて、移植のために調製する。簡潔には、間葉系細胞を、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中の１ｍｇ／ｍｌ Ｉ型コラーゲン（下記のように、ラットまたはウシ）と混合し、１ｃｍ^２当たり１．５×１０^５細胞の密度で、６穴トランスウエルプレート（コーニング社製、コーニング、ニューヨーク州）に加える。真皮等価物を、上部の１×１０^６のケラチン細胞を等分する４日前に、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で培養する。構築物を、０．１％ＦＢＳを含む、ＤＭＥＭとハムのＦ１２（３：１）（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／インビトロゲン社製、グランドアイランド、ニューヨーク州）の混合物中で２日間、浸漬させて培養し、その後、ケラチン細胞を気液界面に供し、移植前にさらに２日間、１％ＦＢＳを含む、ＤＭＥＭとハムのＦ１２（３：１）の混合物中で培養する。

【0230】

Ｂ．細胞集塊
注入のための細胞凝集物を、懸滴法を用いて形成することができる（Ｑｉａｏ Ｊ．らの文献：「培養ヒト頭皮毛乳頭細胞によって誘導された毛包新生（Ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｃａｌｐ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌｓ）」、Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ ４（５）：６６７−７６（２００９））。簡潔には、ヒト間葉系細胞とケラチン細胞の混合物（１０：１、５：１、１：１、１：５、または１：１０）を、０．２４％メチルセルロースを含むチャンの培地中に懸濁させる。１００ｍｍペトリ皿の底部において、細胞を、２０μｌの液滴（液滴はそれぞれ、４×１０^４細胞を含む）に適用する。液滴が上下逆さまに懸滴するように、ペトリ皿を逆さまにする。懸濁した液滴を、３７℃、５％ＣＯ_２で、インキュベーターでインキュベートする。凝集物の形成を１８〜２０時間以内に終了する。形成において、凝集物を、１５０μｌチャンの培地を収容した９６穴丸底アッセイプレートのウエルに別々に移す。ウエルを、０．２４％メチルセルロース培地で予め覆って、髪の原型（ｐｒｏｔｏ−ｈａｉｒ）の付着を防ぐ。培地を２〜３日毎に交換する。

【0231】

Ｃ．マイクロスフィア
注入のための生物分解性マイクロスフィアを、従来の油／水エマルション、および溶媒蒸発／抽出法を用いて、７５：２５ ＰＬＧＡ（分子量＝１００，０００Ｄａ、バーミンガムポリマーズ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）社製、バーミンガム、アラバマ州）から製造する。簡潔には、６００ｍｇＰＬＧＡを、１２ｍｌの塩化メチレン中に溶解し、０．５％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（分子量＝３０，０００〜７０，０００Ｄａ、シグマ社製）の４００ｍｌ水溶液に加え、室温で一晩、激しく撹拌する。マイクロスフィアを遠心分離によって回収し、蒸留水によって３回洗浄し、５０〜２００μｍ径のサイズに濾す。マイクロスフィアを凍結乾燥し、６時間、紫外線光によって殺菌する。ヒト間葉系細胞（２．５×１０^７細胞）、およびケラチン細胞（６×１０^６の細胞）を、ケラチン細胞のための１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含む３０ｍｌの無血清ＫＧＭ、または間葉系細胞のための１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を収容した、スピナーフラスコ（ベルコガラス（Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ）社製、ヴァインランド、ニュージャージー州）中に、ＰＬＧＡマイクロスフィア（１μｇマイクロスフィア／１０^５細胞）と共に載置し、５０ｒｐｍで２週間、培養する。培地を１日おきに交換する。細胞凝集物を沈降させ、１６ｍｌの培養上清を回収し、遠心分離し、１５ｍｌの上清を除去し、また、１５ｍｌの新しい培地を、１ｍｌの残存上清中の遠心分離した細胞に加える。新しい培地中の細胞をスピナーフラスコに移す。または、アルギン酸ナトリウム中で細胞を懸濁させ、その後、Ｌｉｎ Ｃ．Ｍ．らの文献：「マイクロカプセル化ヒト髪毛乳頭細胞：毛乳頭の代わりになるか？（Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌｓ： ａ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ？）」，Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ．３００（９）：５３１−５（２００８）に記載する、高電圧電気液滴発生器を使用して、球状液滴を形成することによって、細胞集塊を形成してもよい。

【0232】

実施例１０：
生体力学特性、創傷治癒、および長期毛包再生成のための本発明の皮膚代替物の評価
本発明の皮膚代替物を、生体力学特性、創傷治癒、および長期毛包再生成に関して試験することができる。

【0233】

生体力学特性には、皮膚保護機能、皮脂分泌、皮膚引張強さ、経皮水分損失、および皮膚静電容量が含まれる。皮膚静電容量は、コルネオメーター（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ）ＣＭ ８２５ ＰＣ（コーリッジ・アンド・カーザカ・エレクトロニック（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）社製、ケルン、ドイツ）を使用して、測定することができる。経皮水分損失は、テヴァメーター（Ｔｅｗａｅｔｅｒ）ＴＭ ３００（コーリッジ・アンド・カーザカ・エレクトロニック社製、ケルン、ドイツ）によって、測定することができる。皮脂腺の活性を評価するために、一つには、オイルレッドＯ染色、およびレーザー顕微解剖材料のリアルタイムＰＣＲを使用して、ヒト皮脂脂質およびタンパク質の発現を測定することができる。すべてのＲＮＡを、レーザー顕微解剖された皮脂腺、および逆転写されたｍＲＮＡから単離することができる。皮膚引張強さを測定するために、動物を屠殺した後に得られる小さく細長い移植片を、引張計（インストロン（Ｉｎｓｒｏｎ）５５４２引張計、インストロン社製、カントン、マサチューセッツ州）に載置し、ピーク破断荷重を測定することができる。簡潔には、組織ストリップの一部分（およそ０．５ｃｍの切開）を、切開の線に垂直な引張計のつかみ具に配向する。ピーク破断荷重を測定し、破壊された組織の断面積で破断荷重を割ることによって、引張強さ値（１平方センチメートル当たりのキログラム力）に変換する。同じ手順を用いて、引っ張った髪の引張強さを測定することができる。

【0234】

創傷治癒を評価するために、創傷を、移植４〜６週後に移植片に形成することができる。創傷に包帯をしてもよく、また、創傷拘縮および再上皮化を測定するスケールで、１〜２日ごとに連続写真術によって、創傷治癒の割合を決定した。移植片の切片を採取し、マソンのトライコームによって染色し、創傷の中心を通して切断することによって、創傷および傷跡面積、真皮厚さ、ならびに表皮厚さを組織学的に評価することができる。創傷の組織形態測定を行うことができ、また、質的評価は、炎症細胞浸潤、線維芽細胞増殖、コラーゲン形成、および血管新生からなっていた。免疫組織化学検査を用いて、ヒト細胞、細胞増殖（Ｋｉ−６７）、および多くの筋線維芽細胞を確認する。

【0235】

髪周期を、毛周期を通じた再現観察によって裏付けることができる。しかしながら、毛周期が、非頭皮皮膚で約１００日、頭皮で最大数年であるので、試験の進行を、髪を引き抜くこと（例えば、ワックスを使用して）によって促進してもよい。髪の引き抜きは、髪を誘導して、成長期に再度入らせるための十分に立証された方法である。髪引抜き分析を、表皮および毛包膨出領域における標識保持細胞の存在のための表皮幹細胞コンパートメントの評価と組み合わせてもよい。ＢｒｄＵを、毛包新生の終了から６日間、腹腔内に毎日２回注入することができる。１０〜１４週で、移植片の２分の１の髪を引き抜いてもよい。これらの試験によって、標識保持表皮幹細胞の存在と位置、および毛包がある、または毛包のない皮膚を引き抜くことに対するこれらの反応を決定することができる。

【0236】

実施例１１：移植方法
Ａ．複合体の配置
６〜８週齢の老齢の雌Ｃｒ：ＮＩＨ（Ｓ）−ｎｕ／ｎｕマウス（ＦＣＲＤＣ、フレデリック、メリーランド州）に、Ｏ_２とイソフルランの混合物（２〜４％）を使用して、麻酔をかけた。マウス背部の移植領域を慎重に評価し、皮膚を、ポビジンおよび７０％エタノールによって洗浄後、彎鋏を使用して除去した。構築物を、正確な解剖配向で移植片面に配置し、無菌ヘトロラタムガーゼで被覆し、包帯で固定した。マウスを再び目覚めさせた後、無菌ケージに移した。包帯を週２回交換し、４週後に除去した。マウスを移植４〜１８週後に屠殺する。

【0237】

Ｂ．細胞の注入
細胞を、Ｏｒｔｉｚ−Ｕｒｄａらの文献（上述する）に記載するものと同様の方法を用いて、ヒト皮膚に直接注入する。マウス皮膚へのヒト間葉系細胞の注入において、６〜８週齢の老齢の雌Ｃｒ：ＮＩＨ（Ｓ）−ｎｕ／ｎｕマウスに、３０ゲージ針を使用して、１００μｌ ＰＢＳ中に再懸濁させた１０^６の細胞を皮内に注入する。注入を、最初に皮膚を貫通し、その後、表面後方に針を戻し、細胞を可能な限り皮相に注入することによって、行う。これによって、注入領域の中心に境界明瞭な丘疹が形成する。注入８〜１６週後に、生体組織検査および分析をマウス皮膚で行う。

【0238】

Ｃ．細胞の移植
麻酔後、およそ０．５〜１．０ｍｍの幅および長さの小さな切開を、２７ゲージ針を使用して作製する。単一培養した凝集物（髪の原型）を、各切開内の浅い位置に挿入する。挿入後、切開を治癒ために残す。

【0239】

動物または患者に麻酔をかけた後、全層の皮膚創傷（１．５×１．５ｃｍ^２矩形形状）を移植領域に形成する。創縁および自発的創傷拘縮の宿主皮膚細胞の移動を最小化するために、創縁の皮膚を焼灼によって焼き、非再吸収性５−０ナイロン縫合糸（アイリー（ＡＩＬＥＥ）社製、釜山、韓国）によって、隣接する筋肉層に固定する。ＰＬＧＡマイクロスフィアに培養した間葉系細胞（およそ１０^８の細胞／創傷）、およびケラチン細胞（およそ７．５×１０^６の細胞／創傷）を、針のない１ｍＬ注射器を使用して、創傷に移植する。移植後、創傷を、包帯材料テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）（スリーエムヘルスケア（３Ｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）社製、セントポール、ミネソタ州）、および無菌綿ガーゼで覆い、コバン（自己付着性ラップ）スリーエムヘルスケア社製）を使用して、しっかりと固定する。マウスにおいて、抗生物質（セファゾリン、０．１ｍｇ／マウス、ユーハン（Ｙｕｈａｎ）社製、ソウル、韓国）、および鎮痛剤（ブプレノルフィン、０．１ｍｇ／ｋｇ、ハンリムファーマ（Ｈａｎｌｉｍ Ｐｈａｒｍ）社製、ソウル、韓国）をそれぞれ、移植５日後に、筋肉内および皮下に投与する。手術後、マウスを単独で収容し、ＮＩＨの動物実験に関する指針に従って、マウスは人道的な処置を受ける。

【0240】

実施例１２：患者創傷への皮膚代替物の適用
全層または部分層の皮膚欠損、創傷、火傷、傷跡、および完全または部分的な脱毛を示す、患者に、標準術前評価を行って、手術危険度を決定する。皮膚代替物の適用部位には、軟骨、腱、または神経ではなく、真皮、筋膜、筋肉、肉芽組織、骨膜、軟骨膜、腱周囲、および神経周膜等の十分な血液供給がある。創傷は、壊死組織がないことを要する。創傷は、１平方センチメートル当たり１００，０００未満の菌数の細菌によって比較的汚染されていないことを要する。十分な創傷面は、創面切除、包帯交換、および全身的または局所的抗生物質を必要とする。局所的にまたは全身に投与される、抗菌剤、抗真菌剤、および抗ウイルス物質を、皮膚代替物の投与前後の一定期間（例えば、１週間）、使用して、感染の危険性を低減させることができる。創傷の真空支援閉鎖を用いて、移植前に、創傷面の特性を改良することができ、また、移植後にこれを用いることができる。

【0241】

患者は、局所、局部、または全身麻酔を用いて、麻酔をかけられ、移植片部位を、水、抗菌性洗浄剤、またはアルコール溶液（アルコール綿球等）によって洗浄する。現存する皮膚組織、失活した組織、痂皮、傷端もしくは潰瘍端、または瘢痕組織は、当該技術分野における標準技術を用いて除去される。創面切除は、健全で、生存可能な、出血組織まで及び得る。創面切除前に、創傷を、無菌食塩水によって徹底的に浄化して、遊離した細片および壊死組織を除去することができる。組織ニッパー、外科用メスもしくはキューレットを使用して、角質増殖、および／または壊死組織と細片を創傷表面から除去する。潰瘍辺縁は、ソーサー効果を有するように、創面切除することができる。創面切除後、創傷は、無菌食塩水で徹底的に浄化され、穏やかにガーゼで乾燥する。傷端の創面切除または修正によって生じる分泌または出血は、緩やかな圧力の使用によって、停止することができる。他の選択肢には、血管の結紮、電気焼灼、化学焼灼、またはレーザー焼灼が含まれるが、これらのアプローチによって、失活した組織が生じ、これらの使用は最小化にする必要がある。大量の滲出物は、皮膚代替物に代わり、接着を低減し得る。滲出物は、適切な臨床治療によって最小化され得る。例えば、創傷が粘着性を有するまで、室温または４２℃以内の無菌空気を創傷に吹きつけてもよい。滲出物が持続する場合、皮膚代替物を浸透させて、皮膚代替物を穿孔して排出することによって滲出させることができる。

【0242】

皮膚代替物は、非細胞毒性溶液によって創傷を徹底的に洗浄した後、清浄で創面切除された皮膚表面に適用することができる。皮膚代替物の適用前に、施術者は、皮膚代替物の有効期限を再検討し、ｐＨを確認し、視覚的に観察し、臭いをかいで、細菌汚染物質または粒子状物質等の汚染物質がないことを確認することができる。皮膚代替物は、使用直前まで、制御温度６８°Ｆ〜７３°Ｆ（２０℃〜２３℃）で、ポリエチレンバッグに保存することができる。施術者は、密封したポリエチレンバッグを切開することができ、また、皮膚代替物が、細胞培養皿またはプラスチックトレーに提供される場合、皮膚代替物は、無菌技術による無菌領域に移すことができる。細胞培養皿またはプラスチックトレーが存在する場合、トレーまたは細胞培養皿の蓋を外すことができ、また、施術者は、皮膚代替物の表皮および真皮層の配向に注意し得る。無菌非外傷性器具を使用して、施術者は、およそ０．５インチの皮膚代替物をトレーまたは細胞培養皿の壁からそっと離して移すことができる。皮膚代替物を持ち上げる場合、施術者は、皮膚代替物の下の膜を穿孔しないか、またはこれを持ち上げないように注意し、プラスチックトレーが存在する場合、当該膜をトレーに残存させる必要がある。無菌の手袋をはめた手で、施術者は、一方の人差し指を皮膚代替物の剥離部分の下に挿入し、他方の人差し指を使って、デバイスの端に沿って別の箇所の皮膚代替物をつかむことができる。２箇所に皮膚代替物を保持し、施術者は、スムーズな動きで、トレーまたは細胞培養皿から皮膚代替物全体を持ち上げることができる。過度に折り重なる場合、皮膚代替物は、無菌トレー中の温かい無菌食塩水上に浮かす（表皮表面を上にして）ことができる。真皮層（中間付近の光沢層）が、皮膚代替物の部位と直接接触するように、皮膚代替物を配置することができる。塩水で湿らせた綿塗布用具を使用して、施術者は、部位上の皮膚代替物を滑らかにし、このため、気泡もしわが寄った端もなくすることができる。皮膚代替物が適用部位よりも大きい場合、超過した皮膚代替物は、包帯に付着するのを防ぐために、切り取ることができる。皮膚代替物が適用部位よりも小さい場合、不足が充足されるまで、複数の皮膚代替物を互いに隣接させて適用することができる。

【0243】

皮膚代替物は、適切な臨床用包帯で固定することができる。非付着性、半閉塞、吸収性包帯材を使用することが望ましい。移植領域全体に均一に圧力をかける必要がある。縫合またはステープルは必要ではないが、移植片面に移植片を係留する（仮縫合）ために、一部の事例に使用してもよい。除去を必要としないので、５−０の速吸収性グット（ｆａｓｔ ａｂｓｏｒｂｉｎｇ ｇｕｔ）等の吸収性縫合糸が望ましい。包帯は、適用部位への皮膚代替物の接触を確実にし、かつ移動を防ぐために使用することができる。治療上の圧縮を移植片部位に適用することができる。一部の事例において、移植された四肢を固定して、皮膚代替物と適用部位の間の剪断力を最小化することが必要な場合がある。ボルスター包帯は、動作を回避するのが困難な領域、および不規則な輪郭の創傷に有用である。包帯は、週に一度、または、必要であれば、これより頻繁に交換することができる。痛み、臭気、剥離、または合併症の他の兆候は、除去および検査する適用部位に包帯をしていることによって表れるものである。

【0244】

皮膚代替物の付加的な適用は、特定の事例において必要であり得る。付加的な適用前に、先の皮膚移植片または皮膚代替物の非付着性残存物は、穏やかに除去する必要がある。治癒組織または接着皮膚代替物は適所に残してもよい。部位は、皮膚代替物の付加的な適用前に、非細胞毒性溶液によって浄化することができる。一実施態様において、付加的な皮膚代替物は、先の皮膚代替物が接着していない領域に適用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]