特許 6449448 ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根又はそれらの画分を有効成分として含有する神経変性障害の治療及び予防のための医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6449448

(24)【登録日】2018年12月14日

(45)【発行日】2019年1月9日

(54)【発明の名称】ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根又はそれらの画分を有効成分として含有する神経変性障害の治療及び予防のための医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/65 20060101AFI20181220BHJP

   A61K 36/232 20060101ALI20181220BHJP

   A61K 36/233 20060101ALI20181220BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20181220BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20181220BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20181220BHJP

   A61K 31/12 20060101ALI20181220BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20181220BHJP

   A61K 31/357 20060101ALI20181220BHJP

   A61K 31/37 20060101ALI20181220BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20181220BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20181220BHJP

   A23L 2/52 20060101ALN20181220BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALN20181220BHJP

   A61K 125/00 20060101ALN20181220BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/65

   A61K36/232

   A61K36/233

   A61P43/00 121

   A61P43/00 105

   A61P29/00

   A61P43/00 107

   A61P25/16

   A61K31/12

   A61K31/7048

   A61K31/357

   A61K31/37

   A61K31/704

   A23L33/105

   !A23L2/00 F

   !C12Q1/02ZNA

   A61K125:00

【請求項の数】11

【全頁数】86

(21)【出願番号】特願2017-513810(P2017-513810)

(86)(22)【出願日】2015年9月16日

(65)【公表番号】特表2017-529344(P2017-529344A)

(43)【公表日】2017年10月5日

(86)【国際出願番号】KR2015009717

(87)【国際公開番号】WO2016043517

(87)【国際公開日】20160324

【審査請求日】2017年4月25日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0124860

(32)【優先日】2014年9月19日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2015-0130107

(32)【優先日】2015年9月15日

(33)【優先権主張国】KR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】514277938

【氏名又は名称】ユニバーシティ インダストリー コオペレイション グループ オブ キョンヒ ユニバーシティ

(73)【特許権者】

【識別番号】515330661

【氏名又は名称】トンア・エスティー・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｄｏｎｇ−Ａ ＳＴ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム ヨンミ

(72)【発明者】

【氏名】オ ミョンソク

(72)【発明者】

【氏名】ホン ソン−ピョ

(72)【発明者】

【氏名】ソン ミウォン

(72)【発明者】

【氏名】チョン ジンソク

(72)【発明者】

【氏名】チャン へファ

(72)【発明者】

【氏名】キム ウンジン

(72)【発明者】

【氏名】リュ ジャヨン

(72)【発明者】

【氏名】チョ ヨンウン

(72)【発明者】

【氏名】トゥ シャオフェイ

(72)【発明者】

【氏名】チョ サンジン

(72)【発明者】

【氏名】キム ジョンス

(72)【発明者】

【氏名】キム ビョンムン

【審査官】 渡部 正博

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５０１０１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第２０１１−０１２５７０６（ＫＲ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第２０１０−００６０２７９（ＫＲ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０３７７２２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ａ２３Ｌ ３３／００−３３／２９

Ａ２３Ｌ ２／００−２／４６

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ボタンの根皮（モウトン・ラディシス・コルテックス）、アンジェリカ・ダフリカの根（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス）、及びミシマサイコの根（ブプレウリ・ラディクス）の混合物の抽出物を有効成分として含む、パーキンソン病を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項2】

前記抽出物は水、Ｃ_１〜Ｃ_４低級アルコール、又はその混合物を溶媒として用いて抽出される、請求項１に記載のパーキンソン病を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項3】

前記低級アルコールがエタノール、メタノール、又はブタノールである、請求項１に記載のパーキンソン病を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項4】

ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合物の抽出物の有機溶媒画分を有効成分として含む、パーキンソン病を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項5】

前記有機溶媒がクロロホルム、ヘキサン、酢酸エチル、及びブタノールからなる群から選択される１つ又は複数の溶媒である、請求項４に記載のパーキンソン病を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項6】

前記抽出物又はその画分が、
式１により表されるペオノール（２’−ヒドロキシ−４’−メトキシアセトフェノン）、式２により表されるペオニフロリン、
式３により表されるペオニフロリゲノン（［（２ｓ，３ａｓ，５ｓ，７ａｒ，８ｓ）−３ａ−ヒドロキシ−７ａ−メチル−６−オキソヘキサヒドロ−２，５−メタノ−１，３−ベンゾジオキソール−８−イル］メチルベンゾエート）、
式４により表されるイムペラトリン（９−［（３−メチル−２−ブテン−１−イル）オキシ］−７ｈ−フロ［３，２−ｇ］［１］ベンゾピラン−７−オン）、
式５により表されるサイコサポニンＡ（（３β，４α，１６β）−１３，２８−エポキシ−１６，２３−ジヒドロキシオレアン−１１−エン−３−イル−６−デオキシ−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラシド）、
式６により表されるサイコサポニンＢ２（（３ｂ，４ａ，１６ａ）−１６，２３，２８−トリヒドロキシオレアナ−１１，１３（１８）−ジエン−３−イル−６−デオキシ−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、
式７により表されるサイコサポニンＢ４（（３β，１１α，１６α）−１６，２３，２８−トリヒドロキシ−１１−メトキシオレアン−１２−エン−３−イル−６−デオキシ−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、及び、
式８により表されるサイコサポニンＤ（（３ｂ，４ａ，１６ａ）−１３，２８−エポキシ−１６，２３−ジヒドロキシオレアン−１１−エン−３−イル−６−デオキシ−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）：

【化1】

からなる群から選択される１つ又は複数の化合物を含む、請求項１又は請求項４に記載のパーキンソン病を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項7】

前記抽出物又はその画分がミトコンドリア機能障害、小胞体ストレス、又は炎症応答を阻害する、請求項１又は請求項４に記載のパーキンソン病を予防又は治療するための医薬組成物。

【請求項8】

ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合物の抽出物又はその有機溶媒画分を有効成分として含む、パーキンソン病を改善又は予防するための健康機能食品。

【請求項9】

前記有機溶媒がクロロホルム、ヘキサン、酢酸エチル、及びブタノールからなる群から選択される１つ又は複数の溶媒である、請求項８に記載の健康機能食品。

【請求項10】

前記抽出物又はその画分が、
式１により表されるペオノール、
式２により表されるペオニフロリン、
式３により表されるペオニフロリゲノン、
式４により表されるイムペラトリン、
式５により表されるサイコサポニンＡ、
式６により表されるサイコサポニンＢ２、
式７により表されるサイコサポニンＢ４、及び、
式８により表されるサイコサポニンＤ：

【化2】

からなる群から選択される１つ又は複数の化合物を含む、請求項８に記載の健康機能食品。

【請求項11】

前記抽出物又はその画分がミトコンドリア機能障害、小胞体ストレス、又は炎症応答を阻害する、請求項８に記載のパーキンソン病を改善又は予防するための健康機能食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ボタンの根皮（Moutan Root Bark：ボタンピ）（モウトン・ラディシス・コルテックス（Moutan Radicis Cortex））、アンジェリカ・ダフリカの根（Angelica Dahurica Root：ビャクシ）（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス（Angelicae Dahuricae Radix））及びミシマサイコの根（Bupleurum Root：サイコ）（ブプレウリ・ラディクス（Bupleuri Radix））からなる群から選択される２種類以上の混合抽出物又はそれらの画分を有効成分として含有する神経変性障害の治療及び予防のための医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

過去２０年に亘り、神経変性障害を伴う患者は世界中で急速に増加している。神経変性障害の治療において、最も重要な工程は予防である。しかし、疾患の原因は今も明らかにわかっていないことから、治療方法について更に研究する必要がある。神経変性障害に共通した病理学的現象は、中枢神経系細胞の死滅である。他の器官の細胞と異なり、中枢神経系細胞は細胞死の後に再生することはほぼ不可能であり、機能の永久的な消失を生じる。これまでに開発されたこのような脳疾患の治療方法は主に、神経細胞自体の細胞死の機構の分析及び分析に基づいた細胞死の予防に注目している。アルツハイマー病及びパーキンソン病における最近の基礎研究及び臨床試験の結果によると、脳の炎症応答がニューロンの死の主な原因である。現実には、脳疾患患者の髄液において、炎症メディエーター及び活性酸素の増加が確認されている。また、多くの小膠細胞の活性化が脳障害の領域において観察され、脳の炎症がパーキンソン病の主な原因であることが示された。それゆえ、神経膠細胞による脳の炎症を阻害することが神経変性障害を治療する目的となっている。しかし、これまでに開発されている治療剤は、疾患の症状の調節にのみ有効であるが、神経変性障害自体の治療に有効ではない。現代社会において常に晒されている多くの環境汚染物質及び汚染物質により生じる遺伝子の突然変異が神経変性障害を生じる。それゆえ、従来の神経変性障害の予防剤及び治療剤とは完全に異なる概念に基づいたものを開発する必要がある。

【0003】

神経変性障害には、アルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、ハンチントン病、及び脊髄損傷等がある。このような疾患のうち、パーキンソン病は６０歳以上の韓国人の１％〜２％及び８５歳以上の韓国人の４％〜５％が罹患する２番目に多く見られる神経変性障害である。最近では、パーキンソン病は４０代〜５０代の中年層の韓国人に急速に増加している。これまでの報告では、パーキンソン病は、中脳にある黒質及び線条体のドーパミン作動性ニューロンの死滅を生じることでドーパミンが欠失することにより誘導されると思われている。ドーパミン作動性ニューロンの選択的な死滅の理由は未だに説明がついていない。そのため、有効な治療剤及び診断用試薬が未だに開発されていない。パーキンソン病は、無表情、筋強剛、振戦、湾曲姿勢、及び寡動のような症状を示す。

【0004】

最近では、ミトコンドリアの機能不全がパーキンソン病を含む種々の神経変性疾患の原因である可能性があることが提言されている。家族性パーキンソン病（家族性ＰＤ）の原因遺伝子として、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成に関与する遺伝子、並びにミトコンドリアの外膜に存在するＰＡＲＫ１／４（α−シヌクレイン）、ＰＡＲＫ２（パーキン）、ＰＡＲＫ６（ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１、ＰＩＮＫ１）、ＰＡＲＫ７（ＤＪ−１）、及びＰＡＲＫ８（ロイシンリッチリピートキナーゼ２、ＬＲＲＫ２）並びにミトコンドリアの内膜に存在するＰＡＲＫ１３（ＨＴＲＡ２／０ＭＩ）等のタンパク質分解に関与する遺伝子が同定された（非特許文献１）。ＰＩＮＫＩ、パーキン、及びＤＪ−１は、ミトコンドリアのネットワーク構造を補助する分裂及び融合のようなミトコンドリア動態における作用に関与している（非特許文献２）。

【0005】

パーキンソン病全体の９５％となる孤発性パーキンソン病（孤発性ＰＤ）は、ミトコンドリア活性の機能損傷も特徴とする。パラコート及びロテノン等の殺虫剤／除草剤は、ミトコンドリアの電子伝達系を抑制することでミトコンドリアの活性に損傷を与える原因物質として知られている。パーキンソン病の動物モデルの確立に使用されるＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）及びその代謝産物ＭＰＰ＋は、ミトコンドリア電子伝達系複合体１の選択的阻害剤として知られている。この例として、ミトコンドリア機能不全によるドーパミン作動性ニューロンの選択的死滅がパーキンソン病の原因となる可能性があり、同時にミトコンドリア活性を回復させることがパーキンソン病の治療の重要な目的となり得ることが示唆されている。

【0006】

細胞内顆粒である小胞体は、リボソームが付着している粗面小胞体（粗面ＥＲ、ＲＥＲ）及び滑面小胞体（滑面ＥＲ、ＳＥＲ）に分類される。粗面小胞体の主な機能はタンパク質合成である。細胞内タンパク質のおよそ１／３が粗面小胞体内で合成される。その一方で、種々の脂質及びステロイドホルモンが滑面小胞体内で合成される。滑面ＥＲはまた、細胞内カルシウム濃度を調節する重要な役割を担う。しかし、種々の理由によるタンパク質の異常なフォールディング（folding：折畳み）が小胞体ストレスと呼ばれる小胞体の機能的障害を引き起こす。小胞体ストレスが続くと、アポトーシス及び大量の活性酸素種（ＲＯＳ）の形成が種々のシグナル伝達を介して増加し、細胞障害を生じる。小胞体ストレスはまた、ミトコンドリア障害が介在するメタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、及び脂質異常症とともにアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、ハンチントン病、及び脊髄損傷等の神経変性障害の原因であることが報告されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。

【0007】

ボタンの根皮（モウトン・ラディシス・コルテックス）は、パエオニア・スフルティコサ・アンドリューズ（Paeonia suffruticosa Andrews）の根皮であり、ペオノール、ペオニフロリン、オキシペオニフロリン、及び没食子酸又はペオニフロリゲノンを含有する植物薬である。東洋医学では、ボタンの根皮が弛緩、鎮痛、消炎に、また炎症性疾患の治療に有効であることが知られている。最近では、ボタンの根皮は抗菌作用、消炎作用、抗酸化作用、及び老化防止作用があることが知られ、種々の混合物の一成分として脳疾患の治療における効能が報告されている。

【0008】

アンジェリカ・ダフリカの根（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス）は、韓国、中国、及び日本に自生する二年草〜三年草であるアンジェリカ・ダフリカ・ベンサム・エト・フッカー・フィリウス（Angelica dahurica Bentham et Hooker f.：ヨロイグサ）又はアンジェリカ・ダフリカ・ベンサム・エト・フッカー・フィリウス変種フォルモサナ・シャン・エット・ユアン（Angelica dahurica Bentham et Hooker f. var. formosana Shan et Yuan）の乾燥根である。アンジェリカ・ダフリカの根の主な生物活性化合物は、イムペラトリン、イソイムペラトリン、オキシポイセダニン、フェロプテリン、及びビアカンゲリコールである。東洋医学では、アンジェリカ・ダフリカの根の種々の作用が知られている。特に、発汗の軽減、鎮静、疼痛の軽減、寒気の軽減、頭痛の軽減、又は歯痛の軽減に有効であることが知られている。しかし、ミトコンドリア機能の改善及び小胞体ストレスの緩和にアンジェリカ・ダフリカの根が関与することで、ニューロン疾患の治療効果を改善させることについての報告はない。

【0009】

ミシマサイコの根（ブプレウリ・ラディクス）はブプレウラム・ファルカツム・リンネ（Bupleurum falcatum Linne）又はその変種（ウムベリフェラエ（Umbelliferae））の根を指す薬草である。

【0010】

ミシマサイコの根の主な薬理作用には、解熱作用、鎮静作用、鎮痛作用、抗菌作用、抗ウイルス作用、及び消炎作用等の種々の薬理作用がある。ミシマサイコの根の主な薬理作用は、解熱作用、鎮静作用、鎮痛作用、抗菌作用、抗ウイルス作用、及び消炎作用である。

【0011】

本発明者らは、食用ハーブから神経変性障害に対する治療剤を開発することを試みた。その結果、本発明者らは、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物が同時にミトコンドリアの機能障害を回復させ、小胞体ストレスを緩和し、炎症応答を阻害する作用を有し、これらの作用がそれぞれの単体抽出物が示す作用よりもかなり大きいことを見つけた。上記混合物の抽出物が、パーキンソン病モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの運動協調性を大幅に改善し、ドーパミン作動性ニューロンに対する保護作用を示したことから、本発明者らはボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合物の抽出物又はそれらの画分が、神経変性障害を治療及び予防するための医薬組成物の有効成分として有用であり得ることを確認し、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Nat. Clin. Pract. Neurol 2, 136−146, 2006

【非特許文献2】PLoS Biol. 6, e1000298, 2010

【非特許文献3】Lindholm et al., 2006

【非特許文献4】Penas et al., 2007

【非特許文献5】Yoshida, 2007

【非特許文献6】Zhang et al., 2006

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明の目的は、ボタンの根皮（モウトン・ラディシス・コルテックス）、アンジェリカ・ダフリカの根（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス）、及びミシマサイコの根（ブプレウリ・ラディクス）からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物又はそれらの画分を有効成分として含む神経変性障害を治療又は予防するための医薬組成物並びにこれらの抽出物又はそれらの画分を含む神経変性障害を改善又は予防するための健康機能食品を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上記の目的を実現するために、本発明は、ボタンの根皮（モウトン・ラディシス・コルテックス）、アンジェリカ・ダフリカの根（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス）、及びミシマサイコの根（ブプレウリ・ラディクス）からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物を有効成分として含む神経変性障害を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。

【0015】

本発明はまた、上記混合物の抽出物の有機溶媒画分を有効成分として含む神経変性障害を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。

【0016】

本発明はまた、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物を有効成分として含む神経変性障害を改善又は予防するための健康機能食品を提供する。

【0017】

本発明はまた、上記混合物の抽出物の有機溶媒画分を有効成分として含む神経変性障害を改善又は予防するための健康機能食品を提供する。

【0018】

本発明はまた、ボタンの根皮（モウトン・ラディシス・コルテックス）、アンジェリカ・ダフリカの根（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス）、及びミシマサイコの根（ブプレウリ・ラディクス）からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物の薬学的に有効な用量を被験体に投与する工程を含む神経変性障害を治療又は予防するための方法を提供する。

【0019】

本発明はまた、神経変性障害の治療又は予防に使用するための、ボタンの根皮（モウトン・ラディシス・コルテックス）、アンジェリカ・ダフリカの根（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス）、及びミシマサイコの根（ブプレウリ・ラディクス）からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物を含む医薬組成物を提供する。

【0020】

本発明はまた、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物の有機溶媒画分の薬学的に有効な用量を被験体に投与する工程を含む神経変性障害を治療又は予防するための方法を提供する。

【0021】

さらに、本発明は、神経変性障害の治療又は予防に使用するための、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物の有機溶媒画分を含む医薬組成物を提供する。

【発明の効果】

【0022】

パーキンソン病モデルにおいて、同時にミトコンドリア機能障害、小胞体ストレス、及び炎症応答を誘発されたとき、ボタンの根皮（モウトン・ラディシス・コルテックス）、アンジェリカ・ダフリカの根（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス）、及びミシマサイコの根（ブプレウリ・ラディクス）からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物が、単体抽出物の１．５倍程強力に、細胞内ＡＴＰレベルを増加させ、損傷したミトコンドリア膜の電位を回復させ、ＲＯＳ生成を抑制することができる。本発明の混合物の抽出物はまた、パーキンソン病動物モデルにおいて、運動協調性の改善及びドーパミン作動性ニューロンの保護にかなり有効であることから、本発明の混合物の抽出物又はその画分を、神経変性障害の予防及び治療のための医薬組成物の有効成分として効果的に使用することができることが確認された。

【0023】

本発明の好ましい実施形態の応用は、添付の図面を参照することによって最もよく理解される。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）投与による、パーキンソン病動物モデルを構築するプロセスを示す概略図である。詳細には、１：１：１の比のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根から構成される混合物の９０％エタノール抽出物の凍結乾燥物を３％ＨＰＭＣに溶解させ、これを１日１回、１４日間、被験マウスに投与した（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ）（経口、ｐ．ｏ．）。実験の８日目から、経口投与の３時間後に、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）をマウスに３０ｍｇ／ｋｇの用量にて、５日間投与し（腹腔内、ｉ．ｐ．）、パーキンソン病動物モデルを構築した。作製したマウスモデルを挙動試験に使用した。動物を屠殺し、細胞分析及びウェスタンブロット法を行った。

【図2】６−ＯＨＤＡ（６−ヒドロキシドーパミン）投与による、パーキンソン病動物モデルを構築するプロセスを示す概略図である。詳細には、１６μｇの６−ＯＨＤＡ（６−ヒドロキシドーパミン）を２μｌの０．１％アスコルビン酸に希釈し、これを定位手術により被験マウスに１回注射し、パーキンソン病動物モデルを構築した。手術の１週間後に、１：１：１の比のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根から構成された混合物の９０％エタノール抽出物の凍結乾燥物を水に溶解させ、これを３ｍｇ／ｋｇの用量にて１日１回、７日間マウスに投与した（経口、ｐ．ｏ．）。作製したマウスモデルを挙動試験に使用した。動物を屠殺し、細胞分析及びウェスタンブロット法を行った。

【図3】ロテノン投与による、パーキンソン病動物モデルを構築するプロセスを示す概略図である。詳細には、１：１：１の比のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根から構成される混合物の９０％エタノール抽出物の凍結乾燥を水に溶解させ、これを１０ｍｇ／ｋｇの用量にて１日１回、６週間ラットに投与した（経口、ｐ．ｏ．）。経口投与の１週間後に、ロテノンを２．５ｍｇ／ｋｇの用量にて１日１回、５週間、ラットに注射し（腹腔内、ｉ．ｐ．）、パーキンソン病動物モデルを構築した。作製したラットモデルを挙動試験に使用した。動物を屠殺し、細胞分析及びウェスタンブロット法を行った。

【図4】ＬＰＳ（リポ多糖）投与による、パーキンソン病動物モデルを構築するプロセスを示す概略図である。詳細には、１：１：１の比のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根から構成された混合物の９０％エタノール抽出物の凍結乾燥物を水に溶解させ、これを１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの用量にて１日１回、３日間マウスに投与した（経口、ｐ．ｏ．）。最終投与後に、ＬＰＳ（リポ多糖）を５ｍｇ／ｋｇの用量にてマウスに１回投与し（腹腔内、ｉ．ｐ．）、パーキンソン病動物モデルを構築した。作製したマウスモデルを抗脳炎症効能試験に使用した。

【発明を実施するための形態】

【0025】

以下に、本発明を詳細に説明する。

【0026】

本発明は、ボタンの根皮（モウトン・ラディシス・コルテックス）、アンジェリカ・ダフリカの根（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス）、及びミシマサイコの根（ブプレウリ・ラディクス）からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物を有効成分として含む神経変性障害を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。

【0027】

本発明はまた、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物の有機溶媒画分を有効成分として含む神経変性障害を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。

【0028】

ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根を１：０．２〜５：０．２〜５の重量比（ｗ：ｗ：ｗ）にて混合することが好ましい。より好ましくは、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根を１：０．５〜２：０．５〜２の比（ｗ：ｗ：ｗ）にて、最も好ましくは１：１：１の比（ｗ：ｗ：ｗ）にて混合するが、必ずしもそれらに限定されない。

【0029】

ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される２つの材料を、好ましくは１：０．２〜５の重量比（ｗ：ｗ）、より好ましくは１：０．５〜２の比（ｗ：ｗ）、最も好ましくは１：１の比（ｗ：ｗ）にて混合するが、必ずしもそれらに限定されない。

【0030】

上記混合物の抽出物を、水、Ｃ_１〜Ｃ_４低級アルコール又はそれらの混合物を溶媒として用いて抽出することが好ましく、この時、上記低級アルコールはエタノール、メタノール又はブタノールであることが好ましい。

【0031】

混合物の抽出物を、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される少なくとも２つの材料から構成される混合物から抽出することが好ましいが、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の各抽出物のうちの少なくとも２つの抽出物から構成される混合物から抽出することができる。

【0032】

上記混合物の抽出物を以下の工程：
１）ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択されるこれらの材料の少なくとも２つから構成される混合物に抽出溶媒を添加した後、抽出する工程と、
２）工程１）の抽出物を濾過する工程と、
３）工程２）において得られた濾液を減圧下において濃縮した後、乾燥させる工程と、
を含む方法により作製することが好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。

【0033】

上記方法において、工程１）のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根は、購入するか又は栽培する。

【0034】

上記方法において、抽出物を抽出する方法は、濾過、熱水抽出、アンフルラージュ、還流抽出、及び超音波抽出等のこれらの従来法のいずれかのものである。

【0035】

この方法において、工程３）の減圧下における濃縮は、真空濃縮器又は真空ロータリーエバポレーターを用いて行われることが好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。本明細書に記載の乾燥は、低圧乾燥、真空乾燥、沸騰乾燥（boiling drying）、噴霧乾燥、又は凍結乾燥により行われることが好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。

【0036】

上記画分は、有機溶媒を添加することにより抽出物から作製されることが好ましい。本明細書に記載の有機溶媒は、ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル、及びブタノールからなる群から選択される１つ又は複数の溶媒が好ましく、ブタノールがより好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。

【0037】

上記抽出物は、式１により表されるペオノール（２’−ヒドロキシ−４’−メトキシアセトフェノン）、式２により表されるペオニフロリン、式３により表されるペオニフロリゲノン（［（２ｓ，３ａｓ，５ｓ，７ａｒ，８ｓ）−３ａ−ヒドロキシ−７ａ−メチル−６−オキソヘキサヒドロ−２，５−メタノ−１，３−ベンゾジオキソール−８−イル］メチルベンゾエート）、式４により表されるイムペラトリン（９−［（３−メチル−２−ブテン−１−イル）オキシ］−７ｈ−フロ［３，２−ｇ］［１］ベンゾピラン−７−オン）、式５により表されるサイコサポニンＡ（（３β，４α，１６β）−１３，２８−エポキシ−１６，２３−ジヒドロキシオレアン−１１−エン−３−イル−６−デオキシ−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラシド）、式６により表されるサイコサポニンＢ２（（３ｂ，４ａ，１６ａ）−１６，２３，２８−トリヒドロキシオレアナ−１１，１３（１８）−ジエン−３−イル−６−デオキシ−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、式７により表されるサイコサポニンＢ４（（３β，１１α，１６α）−１６，２３，２８−トリヒドロキシ−１１−メトキシオレアン−１２−エン−３−イル−６−デオキシ−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、及び式８により表されるサイコサポニンＤ（（３ｂ，４ａ，１６ａ）−１３，２８−エポキシ−１６，２３−ジヒドロキシオレアン−１１−エン−３−イル−６−デオキシ−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）：

【化1】

からなる群から選択される１つ又は複数の化合物を含有することが好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。

【0038】

上記抽出物はミトコンドリア機能障害、小胞体ストレス、又は炎症応答を阻害することが好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。

【0039】

本明細書に記載の神経変性障害は認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、ルーゲーリッグ病（筋萎縮性側索硬化症）、及び脊髄損傷からなる群から選択されることが好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。

【0040】

本発明の好ましい実施形態において、本発明者らは、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、又はミシマサイコの根の単体抽出物の作用を確かめるために、機能障害を誘発させたニューロン細胞の回復を調べた。

【0041】

その結果、ボタンの根皮の単体抽出物がミトコンドリアの機能障害に対する回復作用を有し（表２〜表７を参照のこと）、その一方で、アンジェリカ・ダフリカの根の単体抽出物が小胞体ストレスに対する回復作用を有する（表８〜表１３を参照のこと）ことを確認した。ミシマサイコの根の単体抽出物が炎症の回復作用を有する（表１４〜表２０を参照のこと）ことも確認された。

【0042】

パーキンソン病細胞モデルにおいて、本発明によるボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択されるこれらの材料の少なくとも２つから構成される混合物の抽出物はＡＴＰレベルの回復作用を示し、活性酸素種の生成を抑制した。詳細には、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合物の抽出物は、ミトコンドリアの機能障害に対する顕著な回復作用を示した（表２１〜表２３を参照のこと）。

【0043】

本発明者らはまた、パーキンソン病細胞モデルの細胞機能に対する、混合比に応じたボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合物の抽出物の回復作用を調べた。その結果、これらのハーブ材料を１：１：１の比（ｗ：ｗ：ｗ）にて混合するとき、細胞機能回復作用が最も効率的であった（表２４〜表２６を参照のこと）。本発明者らはまた、パーキンソン病細胞モデルの細胞機能に対する、エタノール濃度に応じたボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合エタノール抽出物の回復作用を調べた。その結果、９０％エタノールを用いて抽出された混合物の抽出物で処理すると、この組み合わされた、細胞機能の回復作用が最も顕著に増加した（表２８〜表３０を参照のこと）。水抽出物、メタノール抽出物、及びブタノール抽出物と比べ、エタノール抽出物は最も顕著に回復作用を増加させることができた（表３１〜表３３を参照のこと）。

【0044】

１：１：１の比（ｗ：ｗ：ｗ）のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合物から調製した混合９０％エタノール抽出物の作用を確かめるため、細胞機能障害を誘発させたニューロン細胞株の回復作用を調べた。その結果、混合物の抽出物がミトコンドリアの機能障害、小胞体ストレス、及び炎症の回復作用を示したことが確認された（表３４〜表３８を参照のこと）。

【0045】

さらに、パーキンソン病に対する、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を確かめるため、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）、ロテノン、及びリポ多糖（ＬＰＳ）を使用して構築されたパーキンソン病動物モデルを使用した。混合物の抽出物を、ＭＰＴＰの処置により構築したパーキンソン病マウスモデルに投与した後に挙動試験を行った。その結果、本発明の混合物の抽出物を処置しなかった動物モデルと比べ、パーキンソン病モデルの運動協調性が改善された。本発明の混合物の抽出物はまた、ドーパミン作動性ニューロンに対する保護作用及び線条体（ＳＴ）、黒質（ＳＮ）、及び小脳におけるシグナル伝達系の障害に対する回復作用を有することを確認した（表３９〜表４７を参照のこと）。挙動試験はまた、６−ＯＨＤＡの処置により構築されたパーキンソン病マウスモデルも用いて行われた。その結果、本発明の混合物の抽出物は、運動協調性の改善作用並びに線条体及び黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの保護効果を有することを確認した（表４８〜表５２を参照のこと）。挙動試験はまた、ロテノンの処置により構築されたパーキンソン病マウスモデルも用いて行われた。その結果、ロテノンにより抑制された運動機能は改善し、黒質におけるパーキンソン病の主な病因因子であるα−シヌクレインオリゴマーの蓄積が減少した（表５３〜表５４を参照のこと）。その一方で、ＬＰＳの投与により構築された神経炎症マウスモデルにおいて、黒質及び海馬内で誘導された小膠細胞及び星状膠細胞の活性化は、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合物の抽出物により阻害され、その部位における消炎作用を示すことが示唆された（表５５〜表５８を参照のこと）。

【0046】

本発明のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合物の抽出物は、ミトコンドリア機能障害に対する回復作用、小胞体ストレスに対する緩和作用を示し、また同時に炎症応答に対する阻害作用を示しており、これらの作用はｉｎ ｖｉｔｒｏでの単体抽出物において示された作用と比べ著しく改善しており、またパーキンソン病動物モデルにおいて、混合物の抽出物は運動協調性に対する改善作用及びドーパミン作動性ニューロンに対する保護作用を顕著に示していることから、本発明の混合物の抽出物又はその画分は、神経変性障害を治療及び予防するための医薬組成物の有効成分として有用であり得る。

【0047】

本発明の組成物は、経口的に又は非経口的に投与され、一般的な医薬製剤の形態で使用され得る。すなわち、本発明の組成物は、一般的に使用される希釈剤、又は充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤及び界面活性剤等の賦形剤と混合することによって経口又は非経口投与用に調製され得る。

【0048】

経口投与用の固形製剤は、錠剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤及びカプセル剤である。これらの固形製剤は、１つ又は複数の化合物と、デンプン、炭酸カルシウム、ショ糖又は乳糖、ゼラチン等の１つ又は複数の好適な賦形剤とを混合することによって調製される。単純な賦形剤以外に、滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク等を使用することができる。経口投与用液体製剤は、懸濁剤、液剤、乳剤及びシロップ剤であり、上述の製剤は、水及び液体パラフィン等の一般的に使用される単純な希釈剤に加えて湿潤剤、甘味料、香料及び保存剤等の様々な賦形剤を含有することができる。

【0049】

非経口投与用製剤は、滅菌水溶液、水不溶性賦形剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥調製剤及び坐剤である。水不溶性添加剤及び懸濁剤は、有効な化合物（単数又は複数）に加えて、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステル等を含有し得る。坐剤は、有効な化合物（単数又は複数）に加えて、ウィテップゾール、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチン等を含有し得る。

【0050】

本発明の組成物を経口又は非経口により投与することができ、非経口投与として、好ましくは、外表皮塗布、腹腔内注射、直腸内注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、子宮内注射、及び脳室内注射が例示される。これらの中で外表皮塗布がより好ましい。

【0051】

本発明の組成物を薬学的に有効な用量にて投与することが好ましい。本明細書に記載の「薬学的に有効な用量」という用語は、適用可能な濃度、合理的な濃度、又は危険を伴う濃度（risky concentration）の、疾患を処置するのに十分な量を示す。用量を、疾患の種類、疾患の重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与頻度及び投与経路、排泄量、治療期間、併用治療薬、並びに医薬分野において関連すると考えられる他の要因等の多くの要因を考慮して決定することができる。本発明の組成物を単独又は他の薬物と合わせて投与することができる。併用治療が必要な場合、投与を段階的に又は同時に行うことができる。組成物を単回又は複数回投与することができる。上記要因を全て考慮すること、また副作用がなく、最大効果を得ることができる最小量を投与することは重要であるが、当業者であれば容易に決定することができる。

【0052】

本発明の化合物の有効用量を、体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与頻度、投与方法、排泄量、及び疾患の重症度に応じて決定することができる。投与量は、１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり３０ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは５０ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇであり、投与頻度は１日１回〜６回が好ましい。しかし、有効用量は、患者の投与経路、肥満の重症度、性別、体重、及び年齢等に応じて増量又は減量させることができることから、上記有効用量はいかなる態様においても本発明を限定することはできない。

【0053】

本発明の組成物を単独で投与又は外科手術、ホルモン療法、化学療法、及び生物学的調節剤と合わせて処置することができる。

【0054】

本発明はまた、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物を有効成分として含む神経変性障害を改善又は予防するための健康機能食品を提供する。

【0055】

本発明はまた、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物の有機溶媒画分を有効成分として含む神経変性障害を改善又は予防するための健康機能食品を提供する。

【0056】

ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根を１：０．２〜５：０．２〜５の重量比（ｗ：ｗ：ｗ）にて混合することが好ましい。より好ましくは、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根を１：０．５〜２：０．５〜２の比（ｗ：ｗ：ｗ）にて、最も好ましくは１：１：１の比（ｗ：ｗ：ｗ）にて混合するが、必ずしもそれらに限定されない。

【0057】

ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される２つの材料を、好ましくは１：０．２〜５の重量比（ｗ：ｗ）にて、より好ましくは１：０．５〜２の比（ｗ：ｗ）にて、最も好ましくは１：１の比（ｗ：ｗ）にて混合するが、必ずしもそれらに限定されない。

【0058】

上記混合物の抽出物は水、Ｃ_１〜Ｃ_４低級アルコール、又はそれらの混合物を溶媒として用いて抽出することが好ましく、この時、低級アルコールはエタノール、メタノール、又はブタノールであることが好ましい。

【0059】

混合物の抽出物を、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される少なくとも２つの材料から構成される混合物から抽出することが好ましいが、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の各抽出物のうちの少なくとも２つの抽出物から構成される混合物から抽出することができる。

【0060】

上記混合抽出物は、式１により表されるペオノール、式２により表されるペオニフロリン、式３により表されるペオニフロリゲノン、式４により表されるイムペラトリン、式５により表されるサイコサポニンＡ、式６により表されるサイコサポニンＢ２、式７により表されるサイコサポニンＢ４、及び式８により表されるサイコサポニンＤからなる群から選択される１つ又は複数の化合物を含有することが好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。

【0061】

上記混合物の抽出物はミトコンドリア機能障害、小胞体ストレス、及び炎症応答を阻害することが好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。

【0062】

本明細書に記載の神経変性障害は、認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、ルーゲーリッグ病（筋萎縮性側索硬化症）、及び脊髄損傷からなる群から選択されることが好ましく、またパーキンソン病がより好ましいが、必ずしもそれらに限定されない。

【0063】

本発明のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合物の抽出物は、ミトコンドリア機能障害に対する回復作用、小胞体ストレスに対する緩和作用を示し、また同時に炎症応答に対する阻害作用を示しており、これらの作用はｉｎ ｖｉｔｒｏでの単体抽出物において示された作用と比べ著しく改善しており、またパーキンソン病動物モデルにおいて、混合物の抽出物は運動協調性に対する改善作用及びドーパミン作動性ニューロンに対する保護作用を示していることから、本発明の混合物の抽出物又はその画分は、神経変性障害を改善及び予防するための健康機能食品の有効成分として有用であり得る。

【0064】

本発明はまた、薬学的に有効な用量の、ボタンの根皮（モウトン・ラディシス・コルテックス）、アンジェリカ・ダフリカの根（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス）、及びミシマサイコの根（ブプレウリ・ラディクス）からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物を被験体に投与する工程を含む神経変性障害を治療又は予防するための方法を提供する。

【0065】

本発明はまた、神経変性障害の治療又は予防に使用するための、ボタンの根皮（モウトン・ラディシス・コルテックス）、アンジェリカ・ダフリカの根（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス）、及びミシマサイコの根（ブプレウリ・ラディクス）からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物を含む医薬組成物を提供する。

【0066】

本発明はまた、薬学的に有効な用量の、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物の有機溶媒画分を被験体に投与する工程を含む神経変性障害を治療又は予防するための方法を提供する。

【0067】

さらに本発明は、神経変性障害の治療又は予防に使用するための、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根からなる群から選択される２種類以上の混合物の抽出物の有機溶媒画分を含む医薬組成物を提供する。

【0068】

本発明のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合物の抽出物は、ミトコンドリア機能障害に対する回復作用、小胞体ストレスに対する緩和作用を示し、また同時に炎症応答に対する阻害作用を示しており、これらの作用はｉｎ ｖｉｔｒｏでの単体抽出物において示された作用と比べ著しく改善しており、またパーキンソン病動物モデルにおいて、混合物の抽出物は運動協調性に対する改善作用、ドーパミン作動性ニューロンに対する保護作用、及び消炎作用を示していることから、本発明の混合物の抽出物又はその画分は、神経変性障害を治療及び予防するための医薬組成物の有効成分として有用であり得る。

【実施例】

【0069】

以下の実施例に示すように、本発明の実際に現在好ましい実施形態を説明する。

【0070】

しかし、当業者であれば、本開示を考慮した上で本発明の趣旨及び範囲内の変更及び改善がなされ得ることが理解されるだろう。

【0071】

実施例１：ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根それぞれの単体抽出物の調製
＜１−１＞ボタンの根皮のエタノール抽出物の調製
９０％エタノールをボタンの根皮（モウトン・ラディシス・コルテックス；Jeungdo Herb Medicine Co.、韓国）に添加した後、室温にて１１０分間抽出を行った。エタノール抽出物は、抽出物を濾過することによって調製した。得られた抽出物を凍結乾燥させ、保存した。使用時に、抽出物を緩衝液に溶解させた。抽出物の指標物質成分として、ペオノールを用いて純度を確認した。

【0072】

＜１−２＞アンジェリカ・ダフリカの根のエタノール抽出物の調製
９０％エタノールをアンジェリカ・ダフリカの根（アンジェリカ・ダフリカ・ラディクス；Jeungdo Herb Medicine Co.、韓国）に添加した。アンジェリカ・ダフリカの根のエタノール抽出物を実施例＜１−１＞に記載のものと同様に調製した。アンジェリカ・ダフリカの根抽出物の指標物質成分として、イムペラトリンを用いて純度を確認した。

【0073】

＜１−３＞ミシマサイコの根のエタノール抽出物の調製
９０％エタノールをミシマサイコの根（ブプレウリ・ラディクス；Jeungdo Herb Medicine Co.、韓国）に添加した。ミシマサイコの根のエタノール抽出物を実施例＜１−１＞に記載のものと同様に調製した。ミシマサイコの根抽出物の指標物質成分として、サイコサポニンＡを用いて純度を確認した。

【0074】

実施例２：ボタンの根皮及びアンジェリカ・ダフリカの根の混合抽出物の調製
ボタンの根皮及びアンジェリカ・ダフリカの根を１：５、１：１、又は１：０．２の比（ｗ：ｗ）にて混合し、これに９０％エタノールを添加した後、室温にて１１０分間抽出を行った。ボタンの根皮及びアンジェリカ・ダフリカの根の混合エタノール抽出物は、抽出物を濾過することによって調製した。得られた混合エタノール抽出物を凍結乾燥し、保存した。使用時に、抽出物を水又は緩衝液に溶解させた。混合抽出物の指標物質成分として、ペオノール及びイムペラトリンを用いて純度を確認した。

【0075】

実施例３：ボタンの根皮及びミシマサイコの根の混合抽出物の調製
ボタンの根皮及びミシマサイコの根を１：５、１：１、又は１：０．２の比（ｗ：ｗ）にて混合し、これに９０％エタノールを添加した後、室温にて１１０分間抽出を行った。ボタンの根皮及びミシマサイコの根の混合エタノール抽出物は、抽出物を濾過することによって調製した。得られた混合エタノール抽出物を凍結乾燥し、保存した。使用時に、抽出物を緩衝液に溶解させた。混合抽出物の指標物質成分として、ペオノール及びサイコサポニンＡを用いて純度を確認した。

【0076】

実施例４：アンジェリカ・ダフリカの根及びミシマサイコの根の混合抽出物の調製
アンジェリカ・ダフリカの根及びミシマサイコの根を１：５、１：１、又は１：０．２の比（ｗ：ｗ）にて混合し、これに９０％エタノールを添加した後、室温にて１１０分間抽出を行った。アンジェリカ・ダフリカの根及びミシマサイコの根の混合エタノール抽出物は、抽出物を濾過することによって調製した。得られた混合エタノール抽出物を凍結乾燥し、保存した。使用時に、抽出物を緩衝液に溶解させた。混合抽出物の指標物質成分として、イムペラトリン及びサイコサポニンＡを用いて純度を確認した。

【0077】

実施例５：ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合抽出物の調製
＜５−１＞ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合エタノール抽出物の調製
ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根を以下の表１に示す比にて混合し、これに１０％の、３０％の、５０％の、７０％の、又は９０％のエタノールを添加した後、室温にて、１１０分間抽出を行った。ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の混合エタノール抽出物は、抽出物を濾過することによって調製した。得られた混合エタノール抽出物を凍結乾燥し、保存した。使用時に、抽出物を緩衝液に溶解した。混合抽出物の指標物質成分として、ペオノール、サイコサポニンＡ、及びイムペラトリンを用いて純度を確認した。

【0078】

【表1】

【0079】

＜５−２＞ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合水抽出物の調製
ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根を１：１：１の比（ｗ：ｗ：ｗ）にて混合し、これに水を添加した。ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合水抽出物を実施例＜５−１＞に記載のものと同様に調製した。

【0080】

＜５−３＞ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合メタノール抽出物の調製
ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根を１：１：１の比（ｗ：ｗ：ｗ）にて混合し、これに９０％メタノールを添加した。ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合メタノール抽出物を実施例＜５−１＞に記載のものと同様に調製した。

【0081】

＜５−４＞ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合ブタノール抽出物の調製
ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根を１：１：１の比（ｗ：ｗ：ｗ）にて混合し、これに９０％ブタノールを添加した。ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合ブタノール抽出物を実施例＜５−１＞に記載のものと同様に調製した。

【0082】

実験実施例１：ボタンの根皮抽出物及びその活性成分の細胞内効能の評価
＜１−１＞細胞生存率におけるボタンの根皮抽出物及びその活性成分の作用
本発明のボタンの根皮抽出物及びその活性成分の細胞内効能を評価するため、ヒト神経芽細胞腫細胞の細胞毒性を調べた。

【0083】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ改変イーグル培地及びハムＦ１２；Gibco、米国）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を２．５×１０^４細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、１．０μｇ／ｍｌの濃度の、実施例＜１−１＞において調製したボタンの根皮抽出物若しくはその活性成分であるペオノール、ペオニフロリン、又はペオニフロリゲノンで４時間処理した。細胞を回収し、細胞生存率を、カルセインを用いて測定した。上記抽出物又はその活性成分で処理しない代わりにＤＭＳＯで処理した正常対照細胞と比べて生存率が上昇又は低下した細胞の生存率を算出し、百分率（％）で表した。

【0084】

その結果、以下の表２に示すように、正常細胞のボタンの根皮抽出物及びその活性成分は、細胞毒性を示さなかった（表２）。

【0085】

【表2】

【0086】

＜１−２＞ミトコンドリア障害により誘発された細胞死に対するボタンの根皮抽出物及びその活性成分の阻害作用
ミトコンドリア機能障害の回復に対するボタンの根皮抽出物及びその有効成分の作用を調べるため、ＭＴＴアッセイを行い、細胞内のミトコンドリア複合体１の障害に対する回復作用を確かめた。

【0087】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙは、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１、ダルベッコ改変イーグル培地及びハムＦ１２；Gibco、米国）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を１．０μｇ／ｍｌの濃度の、実施例＜１−１＞において調製したボタンの根皮の９０％エタノール抽出物若しくはその活性成分であるペオノール、ペオニフロリン、又はペオニフロリゲノンで処理した後、４時間培養した。次いで、細胞を５０μｇ／ｍｌのアトラジン（２−クロロ−４−（エチルアミン）−６−（イソプロピルアミン）−ｓ−トリアジン、ＡＴＺ）で処理した後、２４時間培養し、ミトコンドリアの機能不全を誘発させた。機能不全のミトコンドリアを含む細胞を、０．２ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド、ＭＴＴ；Sigma、米国）で処理した後、４時間培養した。次いで、生存細胞によって形成されるＭＴＴホルマザン沈殿物を１００μｌの０．０４Ｎ ＨＣｌ／イソプロパノールに溶解させた。ＯＤ_５４０をＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Molecular Devices、米国）を用いて測定した。ミトコンドリア複合体１の障害を、抽出物又はその活性成分を用いず、ＤＭＳＯで処理した正常対照群と比べて障害レベルが増加又は低下したかのいずれかを見ることで確認した。その一方で、５０μｇ／ｍｌのアトラジンでのみ処理し、ミトコンドリア障害を誘発させ、抽出物又はその活性成分では処理しなかったものを陰性対照群とした。その後、ＭＴＴアッセイを上記と同様に行った。

【0088】

その結果、以下の表３に示すように、アトラジンにより誘発されたミトコンドリア障害は、ボタンの根皮の９０％エタノール抽出物、ペオノール、ペオニフロリン、又はペオニフロリゲノンの処理により正常レベルに回復した（表３）。

【0089】

【表3】

【0090】

＜１−３＞ミトコンドリア障害に起因するＡＴＰ消失に対するボタンの根皮抽出物及びその活性成分の回復作用
ミトコンドリア機能障害の回復に対するボタンの根皮抽出物及びその有効成分の作用を調べるため、ＡＴＰアッセイを行い、細胞内のＡＴＰ消失に対する回復作用を確かめた。

【0091】

詳細には、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験実施例＜１−２＞に記載のものと同様に培養し、これを５０μｇ／ｍｌのアトラジンで処理し、ミトコンドリアの機能不全を誘発させた。次いで、機能不全のミトコンドリアを含む細胞から得られた細胞溶解物１００μｌを、ＡＴＰ生物発光体細胞アッセイキット（Sigma、米国）を用いて１００μｌのルシフェリン−ルシフェラーゼと混合した後、２０℃にて１０分間培養した。上清を得た。蛍光シグナルを、ＬＢ９５０１Ｌｕｍａｔルミノメーター（Berthold、ドイツ）を用いて測定した。細胞非含有培地を含有する対照ウェルの蛍光をバッググランドとして使用した。測定値はバックグランドを減算することにより算出し、ＡＴＰ量をタンパク質濃度に正規化した。本発明の抽出物又はその活性成分で処理しない代わりにＤＭＳＯでのみ処理したものを正常対照とした。結果は全て、正常対照に対する％として表し、細胞内ＡＴＰレベルを表した。５０μｇ／ｍｌのアトラジンでのみ処理し、ミトコンドリア障害を誘発させ、抽出物又はその活性成分では処理しなかったものを陰性対照とした。細胞内ＡＴＰレベルを上記と同様に測定した。

【0092】

その結果、以下の表４に示すように、アトラジンにより誘発させたミトコンドリア障害はボタンの根皮の９０％エタノール抽出物、ペオノール、ペオニフロリン、又はペオニフロリゲノンの処理により正常レベルに回復した（表４）。

【0093】

【表4】

【0094】

＜１−４＞ボタンの根皮抽出物及びその活性成分によるパーキンソン病又はミトコンドリアに関与する遺伝子の発現
ミトコンドリア機能障害の回復に対する本発明のボタンの根皮抽出物及びその活性成分の作用を調べるため、ミトコンドリア遺伝子により合成されたシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＩＩ（ＣＯＸ ＩＩＩ）遺伝子及び家族性パーキンソン病の原因遺伝子の１つであるＰａｒｋ７（ＤＪ−１）の発現量を、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定した。

【0095】

詳細には、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験実施例＜１−２＞に記載のものと同様に培養し、ミトコンドリア機能不全を誘発させた。次いで、機能不全のミトコンドリアを含む細胞をＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen、米国）に懸濁させ、そこから製造業者のプロトコルに従い、全ＲＮＡを抽出した。全ｃＤＮＡを、抽出したＲＮＡを１μｇ用いて合成した。ＰＣＲを、以下の表５に挙げたフォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下において合成したｃＤＮＡを鋳型として用い、必要な最適条件下にてＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９７００（Applied Biosystem、米国）を用いて行い、ＣＯＸ ＩＩＩ遺伝子及びＰａｒｋ７（ＤＪ−１）遺伝子を増幅させた。増幅させたＰＣＲ生成物に１．５％アガロースゲルの電気泳動を行った。相対濃度をＵＶ下にて画像濃度計（Ａｌｐｈａ Ｅａｓｅ ＦＣソフトウェア；Alpha Innotech、米国）を用いて測定した。ｍＲＮＡ量は、１８Ｓ ｒＲＮＡ量と比較することにより標準化した。本発明の抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、その代わりに、ＤＭＳＯでのみ処理したものを正常対照とした。５０μｇ／ｍｌのアトラジンでのみ処理し、ミトコンドリア障害を誘発させ、抽出物又はその活性成分では処理しなかったものを陰性対照とした。遺伝子発現量を上記と同様に調べた。

【0096】

【表5】

【0097】

その結果、表６及び表７に示すように、ミトコンドリア遺伝子により合成されたＣＯＸ ＩＩＩ及び家族性パーキンソン病の原因遺伝子の１つであるＰａｒｋ７（ＤＪ−１）の発現の減少は、ともに正常レベルに回復した（表６及び表７）。

【0098】

【表6】

【0099】

【表7】

【0100】

実験実施例２：アンジェリカ・ダフリカの根抽出物及びその活性成分の細胞内効能の評価
＜２−１＞細胞生存率におけるアンジェリカ・ダフリカの根抽出物及びその活性成分の作用
本発明のアンジェリカ・ダフリカの根抽出物及びその活性成分の細胞内効能を評価するため、ヒト神経芽細胞腫細胞における細胞毒性を調べた。

【0101】

詳細には、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験実施例＜１−１＞に記載のものと同様に培養した。培養した細胞を２．５×１０^４細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を１．０μｇ／ｍｌの実施例＜１−２＞において調製したアンジェリカ・ダフリカの根抽出物又は０．５μｇ／ｍｌ若しくは１．０μｇ／ｍｌのその活性成分であるイムペラトリンで４時間処理した。細胞を回収し、細胞生存率を、カルセインを用いて測定した。上記抽出物又はその活性成分で処理しない代わりにＤＭＳＯで処理した正常対照群の細胞生存率と比べて増加又は低下した細胞生存率を算出し、百分率（％）として表した。

【0102】

その結果、表８に示すように、アンジェリカ・ダフリカの根抽出物及び０．５μｇ／ｍｌの濃度のイムペラトリンは正常細胞において細胞毒性を引き起こさなかった。しかし、１μｇ／ｍｌの濃度のイムペラトリンは低レベルの毒性を引き起こした（表８）。

【0103】

【表8】

【0104】

＜２−２＞小胞体ストレスにより誘発された細胞死に対するアンジェリカ・ダフリカの根抽出物及びその活性成分の阻害作用
本発明のアンジェリカ・ダフリカの根抽出物及びその活性成分が小胞体ストレスの回復を誘導することができるか否かを調べるため、ＭＴＴアッセイを、Ｎ−グリコシル化を阻害することにより小胞体ストレスを誘発することが知られているツニカマイシン（Ｔｕｎｉ）の処理により、又はカルシウムホメオスタシスを破壊することにより小胞体ストレスを誘発することが知られているタプシガルギン（Ｔｈａｐ）の処理により誘発された小胞体ストレスを有する細胞に行い、生存細胞におけるミトコンドリア複合体１の障害の回復を確かめた。

【0105】

詳細には、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験実施例＜１−２＞に記載のものと同様に培養した。細胞を１．０ｕｇ／ｍｌの実施例＜１−２＞において調製したアンジェリカ・ダフリカの根抽出物又は０．５μｇ／ｍｌ若しくは１．０μｇ／ｍｌのそれらの活性成分であるイムペラトリンで処理した後、４時間培養した。細胞を０．５μｇ／ｍｌのタプシガルギン（Ｔｈａｐ）又は１μｇ／ｍｌのツニカマイシン（Ｔｕｎｉ）で処理した後、２４時間培養し、小胞体ストレスを誘発させた。次いで、ＭＴＴアッセイを実験実施例＜１−２＞に記載のものと同様に行った。細胞内のミトコンドリア複合体１の障害が、抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯで処理した正常対照細胞と比べて増加したか又は低下したかを調べた。小胞体ストレスを引き起こすよう、０．５μｇ／ｍｌのタプシガルギン又は１μｇ／ｍｌのツニカマイシンで処理したが、抽出物又はその活性成分では処理ないものを陰性対照とし、その後ＭＴＴアッセイを上記と同様に行った。

【0106】

その結果、表９及び表１０に示すように、タプシガルギン又はツニカマイシンにより引き起こされた小胞体ストレスにより誘発されたミトコンドリアの機能障害及び細胞死は、アンジェリカ・ダフリカの根の９０％エタノール抽出物及びイムペラトリンの処理により正常レベルに回復した（表９及び表１０）。

【0107】

【表9】

【0108】

【表10】

【0109】

＜２−３＞小胞体ストレスに起因するＡＴＰ消失に対するアンジェリカ・ダフリカの根抽出物及びその活性成分の回復作用
小胞体ストレスの回復に対するアンジェリカ・ダフリカの根抽出物及びその活性成分の作用を調べるため、ＡＴＰアッセイを行い、細胞内のＡＴＰ消失に対する回復作用を確かめた。

【0110】

詳細には、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験実施例＜２−２＞に記載のものと同様に培養し、小胞体ストレスを誘発させた。次いで、細胞内ＡＴＰレベルを実験実施例＜１−３＞に記載のものと同様に測定した。本発明の抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯでのみ処理したものを正常対照とした。結果は全て、細胞内ＡＴＰレベルを正常対照の％として表した。抽出物又は活性成分で処理しなかったが、０．５μｇ／ｍｌのタプシガルギン又は１．０μｇ／ｍｌのツニカマイシンでのみ処理し、小胞体ストレスを誘発させたものを陰性対照とした。次いで、細胞内ＡＴＰレベルを上記と同様に測定した。

【0111】

その結果、表１１に示すように、タプシガルギン又はツニカマイシンにより引き起こされた小胞体ストレスにより誘発された、ヒト神経芽細胞腫細胞のミトコンドリアの機能障害及び細胞死は、アンジェリカ・ダフリカの根の９０％エタノール抽出物及びイムペラトリンの処理により正常レベルに回復した（表１１）。

【0112】

【表11】

【0113】

＜２−４＞アンジェリカ・ダフリカの根抽出物及びその活性成分による小胞体ストレスマーカー遺伝子の発現
小胞体ストレスの回復に対する本発明のアンジェリカ・ダフリカの根抽出物及びその活性成分の作用を調べるため、小胞体ストレスマーカー遺伝子のＧＲＰ７８及びＸＢＰ１ｐの発現量を測定した。

【0114】

詳細には、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験実施例＜２−２＞に記載のものと同様に培養し、小胞体ストレスを誘発させた。次いで、実験実施例＜１−４＞に記載のものと同様に小胞体ストレスを有する細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った後、ＵＶ下にて１．５％アガロースゲルの電気泳動を行い、ＧＲＰ７８遺伝子及びＸＢＰ１ｐ遺伝子の発現量を調べた。本発明の抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯでのみ処理したものを正常対照とした。抽出物又は活性成分で処理しなかったが、０．５μｇ／ｍｌのタプシガルギンでのみ処理し、小胞体ストレスを誘発させたものを陰性対照とした。次いで、小胞体ストレスマーカー遺伝子の発現を上記と同様に確かめた。

【0115】

その結果、表１２及び表１３に示すように、小胞体ストレスマーカー遺伝子のＧＲＰ７８及びＸＢＰ１ｐの発現量は、アンジェリカ・ダフリカの根の９０％エタノール抽出物及びイムペラトリンの処理により細胞内に誘発した小胞体ストレスを有する細胞において正常レベルに回復した（表１２及び表１３）。

【0116】

【表12】

【0117】

【表13】

【0118】

実験実施例３：ミシマサイコの根抽出物及びその活性成分の細胞内効能の評価
＜３−１＞細胞生存率におけるミシマサイコの根抽出物及びその活性成分の作用
本発明のミシマサイコの根抽出物及びその活性成分の細胞内効能を評価するため、マウス小膠細胞の細胞毒性を調べた。

【0119】

詳細には、マウス小膠細胞株であるＢＶ２を、１０％ＦＢＳを補充した１：１のＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地；Gibco、米国）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を２．５×１０^４細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、１．０μｇ／ｍｌの濃度の、実施例＜１−３＞において調製したミシマサイコの根の９０％エタノール抽出物、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＢ２、サイコサポニンＢ４、又はサイコサポニンＤを用いて４時間処理した。細胞を回収し、細胞生存率を、カルセインを用いて測定した。上記抽出物又はその活性成分で処理しない代わりにＤＭＳＯで処理した正常対照細胞の生存率と比べて増加又は低下した細胞の生存率を算出し、百分率（％）として表した。

【0120】

その結果、以下の表１４に示すように、ミシマサイコの根抽出物及びその活性成分は、正常細胞において細胞毒性を示さなかった（表１４）。

【0121】

【表14】

【0122】

＜３−２＞炎症応答により誘発した細胞死に対するミシマサイコの根抽出物及びその活性成分の阻害作用
炎症応答に対する本発明のミシマサイコの根抽出物及びその有効成分の阻害作用を調べるため、ＭＴＴアッセイを、リポ多糖（ＬＰＳ）により誘発させた炎症応答を有する細胞に行い、生存細胞内のミトコンドリア複合体１の障害に対する回復作用を確かめた。

【0123】

詳細には、ＢＶ２細胞を実験実施例＜３−１＞に記載のものと同様に培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、１．０μｇ／ｍｌの濃度の、実施例＜１−３＞において調製したミシマサイコの根の９０％エタノール抽出物、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＢ２、サイコサポニンＢ４、又はサイコサポニンＤで処理した後、４時間培養した。次いで、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で処理した後、２０時間培養し、炎症応答を誘発させた。ＭＴＴアッセイを実験実施例＜１−２＞に記載のものと同様に炎症応答を誘発させた細胞に行った。ミトコンドリア複合体１の障害を、障害レベルが抽出物又はその活性成分を用いずにＤＭＳＯで処理した正常対照群と比べて増加したか又は低下したかを見ることで確認した。その一方で、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳでのみ処理し、炎症応答を誘発させ、抽出物又はその活性成分では処理しなかったものを陰性対照群とした。次いで、ＭＴＴアッセイを上記と同様に行った。

【0124】

その結果、以下の表１５に示すように、ＬＰＳにより誘発させた炎症応答は、ミシマサイコの根の９０％エタノール抽出物、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＢ２、サイコサポニンＢ４、又はサイコサポニンＤの処理により正常レベルに回復した（表１５）。

【0125】

【表15】

【0126】

＜３−３＞ミシマサイコの根抽出物及びその活性成分による一酸化窒素（ＮＯ）依存性の炎症応答の減少
炎症応答に対する本発明のミシマサイコの根抽出物及びその活性成分の回復作用を調べるため、グリース法を行い、細胞培養培地の亜硝酸塩／硝酸塩（ＮＯ_ｘ）の濃度を測定した。

【0127】

詳細には、ＢＶ２細胞を実験実施例＜３−１＞に記載のものと同様に培養し、炎症応答を誘発させた。次いで、１００μｌの細胞培養培地を得て、これに、５％スルファニルアミド及び２％ナフチルエチレンジアミンを含有する塩酸を含む１００μｌのグリース試薬を添加した後、暗室にて３０分間反応させた。反応が完了すると、ＯＤ_５４０をＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Versamax、米国）を用いて測定した。培地内の一酸化窒素の濃度を、亜硝酸ナトリウムの標準較正曲線を用いて算出した。抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯで処理したものを正常対照とした。１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳでのみ処理し、炎症応答を誘発させたが、抽出物又は活性成分では処理しなかったものを陰性対照とした。次いで、一酸化窒素濃度の減少作用を上記と同様に調べた。

【0128】

その結果、表１６に示すように、ミシマサイコの根の９０％エタノール抽出物、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＢ２、サイコサポニンＢ４、及びサイコサポニンＤがＬＰＳ介在性のＮＯ生成を抑制する作用を有することが確認された（表１６）。

【0129】

【表16】

【0130】

＜３−４＞ミシマサイコの根抽出物及びその活性成分による炎症応答マーカー遺伝子の発現
炎症応答の回復に対する、本発明のミシマサイコの根抽出物及びその活性成分の作用を調べるため、炎症応答マーカー遺伝子誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、及びＮＦ−ｋＢ ｐ６５／ＲｅＩＡの発現量を測定した。

【0131】

詳細には、ＢＶ２細胞を実験実施例＜３−１＞に記載のものと同様に培養し、炎症応答を誘発させた。次いで、ＲＴ−ＰＣＲを実験実施例＜１−４＞に記載のものと同様に細胞に行った後、ｉＮＯＳ遺伝子、ＩＬ−６遺伝子、及びＮＦ−ｋＢ ｐ６５／ＲｅＩＡ遺伝子の発現量の定量的分析を行った。本発明の抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯでのみ処理したものを正常対照とした。抽出物又は活性成分で処理しなかったが、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳでのみ処理し、炎症応答を誘発させたものを陰性対照とした。次いで、炎症応答マーカー遺伝子の発現を上記と同様に確かめた。

【0132】

その結果、表１７〜表１９に示すように、炎症応答マーカー遺伝子のｉＮＯＳ、ＩＬ−６、及びＮＦ−ｋＢ ｐ６５／ＲｅＩＡの発現量は、ミシマサイコの根の９０％エタノール抽出物、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＢ２、サイコサポニンＢ４、及びサイコサポニンＤの処理により細胞内に誘発した炎症応答を有する細胞において正常レベルに回復した（表１７〜表１９）。

【0133】

【表17】

【0134】

【表18】

【0135】

【表19】

【0136】

＜３−５＞ミシマサイコの根抽出物及びその活性成分による活性酸素種（ＲＯＳ）生成の減少
炎症応答に対する、本発明のミシマサイコの根抽出物及びその活性成分の回復作用を調べるため、細胞内ＲＯＳの濃度を、２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ）を用いて測定した。

【0137】

詳細には、ＢＶ２細胞を実験実施例＜３−１＞に記載のものと同様に培養し、炎症応答を誘発させた。次いで、炎症応答を誘発させた細胞を１μＭのＤＣＦ−ＤＡ及び０．０５μＭのビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）で処理した後、３７℃にて１時間染色した。染色後、ＤＣＦ−ＤＡの蛍光強度を４８５ｎｍ／５３５ｎｍにて測定し、ビスベンズイミドの蛍光強度を３３５ｎｍ／４６０ｎｍにて測定した。ＤＣＦ−ＤＡ／ビスベンズイミドの比を基に、ＲＯＳを定量化した。増加又は低下のいずれかのＲＯＳ量を抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯで処理した正常対照のＲＯＳ量と比較し、結果を％として表した。１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳでのみ処理し、炎症応答を誘発させたが、抽出物又はその活性成分では処理しなかったものを陰性対照とした。次いで、ＲＯＳの生成を上記と同様に調べた。

【0138】

その結果、表２０に示すように、本発明のミシマサイコの根の９０％エタノール抽出物、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＢ２、サイコサポニンＢ４、及びサイコサポニンＤが、炎症応答及びストレスにより引き起こされたＤＣＦ−ＤＡ介在性のＲＯＳ生成を減少させる作用を有することを確認した（表２０）。

【0139】

【表20】

【0140】

実験実施例４：上記のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の少なくとも２つを含む混合抽出物の細胞内効能の評価
＜４−１＞パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア活性に対する上記のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の少なくとも２つを含む混合抽出物の回復作用
パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア活性に対する上記のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の少なくとも２つを含む混合物の抽出物の回復作用を調べるため、パーキンソン病細胞モデルのミトコンドリア活性指標物質を試験した。

【0141】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例２において調製したボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根との混合９０％エタノール抽出物、実施例３において調製したボタンの根皮とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物、実施例４において調製したアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物、又は実施例＜５−１＞において調製したボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、細胞を、１ｍＭの濃度の１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）で処理した後、２４時間培養した。その結果、パーキンソン病細胞モデルが構築された。次いで、細胞生存率を、カルセインを用いて実験実施例＜１−１＞に記載のものと同様に測定した。上記抽出物又はその活性成分で処理しない代わりにＤＭＳＯで処理した正常対照細胞の細胞生存率と比べて増加又は低下した細胞生存率を算出し、百分率（％）として表した。１ｍＭのＭＰＰ＋でのみ処理し、抽出物又はその活性成分では処理していないパーキンソン病細胞モデルを構築した。次いで、細胞生存率も、上記と同様に正常対照の細胞生存率と比較することにより、増加又は低下のいずれかを算出したものを陰性対照とした。

【0142】

その結果、表２１に示すように、ＭＰＰ＋により引き起こされたミトコンドリア活性の減少に応じたパーキンソン病細胞モデルの細胞生存率は、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、またはミシマサイコの根のエタノール抽出物の処理により６５％〜７０％に回復した。その一方で、ボタンの根皮とミシマサイコの根との混合物の抽出物、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根との混合物の抽出物、及びアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の処理により回復作用は増大し、７７％〜８１％に達した。特に、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物で処理したときの回復作用は、９２．８４％と最も高いものであった（表２１）。

【0143】

【表21】

【0144】

＜４−２＞パーキンソン病細胞モデルにおける、ＡＴＰ消失に対する上記のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の少なくとも２つを含む混合抽出物の回復作用
パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア機能障害の回復に対する上記のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の少なくとも２つを含む混合物の抽出物の作用を調べるため、ＡＴＰアッセイを行い、細胞内のＡＴＰ消失に対する回復作用を確かめた。

【0145】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例２において調製したボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根との混合９０％エタノール抽出物、実施例３において調製したボタンの根皮とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物、実施例４において調製したアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物、又は実施例＜５−１＞において調製したボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、細胞内ＡＴＰレベルを実験実施例＜１−３＞に記載のものと同様に測定した。細胞内ＡＴＰレベルの増加又は低下を、抽出物又は活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯでのみ処理した正常対照の細胞内ＡＴＰレベルと比較することにより算出した。１ｍＭのＭＰＰ＋でのみ処理したが、抽出物又は活性成分では処理はしないものを陰性対照とし、その後、ＡＴＰレベルの回復を上記と同様に調べた。陰性対照に１ｍＭのＭＰＰ＋のみを処置し、抽出物又はその活性成分を処置していないパーキンソン病細胞モデルを構築した。次いで、細胞内ＡＴＰレベルに対する回復作用を上記と同様に調べた。

【0146】

その結果、表２２に示すように、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）により引き起こされたミトコンドリア活性の低下に応じた細胞内ＡＴＰ消失は、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、又はミシマサイコの根の９０％エタノールの単体抽出物の処理により、正常群のレベルの最大６８％〜６９％まで回復した。その一方で、回復率は、ボタンの根皮とミシマサイコの根との混合物の抽出物、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根との混合物の抽出物、及びアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の処理により最大７８％〜８３％まで増加した。特に、回復率は、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物で処理したときの最大９５．８２％が最も高いものであった（表２２）。

【0147】

【表22】

【0148】

＜４−３＞パーキンソン病細胞モデルにおける、上記のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、及びミシマサイコの根の少なくとも２つを含む混合物の抽出物による活性酸素種（ＲＯＳ）生成の減少
パーキンソン病細胞モデルにおける、ボタンの根皮とミシマサイコの根との混合物の抽出物、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根との混合物の抽出物、アンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物、及びボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の処理に応じたミトコンドリア機能障害により引き起こされたＲＯＳ生成の減少作用を調べるため、細胞内ＲＯＳの濃度を、２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ）を用いて測定した。

【0149】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例２において調製したボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根との混合９０％エタノール抽出物、実施例３において調製したボタンの根皮とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物、実施例４において調製したアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物、又は実施例＜５−１＞において調製したボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、ＲＯＳを実験実施例＜３−５＞に記載のものと同様にＤＣＦ−ＤＡ／ビスベンズイミドの比を基に定量化した。増加又は低下したかのいずれかのＲＯＳレベルを抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯで処理した正常対照のＲＯＳレベルと比較し、結果を正常対照の％として表した。陰性対照とするパーキンソン病細胞モデルを、１ｍＭのＭＰＰ＋のみを処置したが、抽出物又はその活性成分を処置しないことにより構築した。次いで、ＲＯＳ生成の減少作用を上記と同様に調べた。

【0150】

その結果、表２３に示すように、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）により引き起こされたミトコンドリア活性の低下に起因するＲＯＳ生成は、ボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、又はミシマサイコの根の９０％エタノールの単体抽出物の処理の後に、正常レベルの１４４％〜１４６％と大きく回復した一方で、ＲＯＳ生成は、ボタンの根皮とミシマサイコの根との混合物の抽出物、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根との混合物の抽出物、及びアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の処理の後に正常レベルの１２０％〜１３２％と大きく回復した。特に、ＲＯＳ生成はボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の処理によりほぼ正常レベルの１０８．２０％まで回復し、上記混合物の抽出物が最も高い回復作用を有することが示唆された（表２３）。

【0151】

【表23】

【0152】

実験実施例５：様々な混合比に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の細胞内効能の評価
＜５−１＞パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア活性に対する様々な混合比に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の回復作用
パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア活性に対する様々な混合比に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の回復作用を調べるため、ミトコンドリア活性の指標物質を初めに確かめ、回復作用を比較した。

【0153】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例５において調製した様々な混合比のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、およびミシマサイコの根との種々の混合９０％エタノール抽出物で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、細胞生存率を、カルセインを用いて実験実施例＜１−１＞に記載のものと同様に測定した。上記抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯで処理した正常対照群の細胞生存率と比べて増加又は低下した細胞生存率を算出し、百分率（％）として表した。陰性対照とするパーキンソン病細胞モデルを、１ｍＭのＭＰＰ＋のみを処置し、抽出物又はその活性成分を処置せずに構築した。次いで、上記と同様に、正常対照群の細胞生存率と比べて増加又は低下した細胞生存率を算出し、百分率（％）として表した。

【0154】

その結果、表２４に示すように、１−メチル−４−フェニルピリジニウムにより引き起こされたミトコンドリア活性の減少が、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物（１：１：１）の抽出物で処理した後に正常対照の９３．２２％とかなり回復し、最も高いものであった（表２４）。

【0155】

【表24】

【0156】

＜５−２＞パーキンソン病細胞モデルにおける、細胞内ＡＴＰ消失に対する様々な混合比に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の回復作用
パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア機能障害の回復に対する様々な混合比に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の作用を調べるため、ＡＴＰアッセイを行い、細胞内ＡＴＰ消失に対する回復作用を確かめた。

【0157】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例５において調製した様々な混合比のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、およびミシマサイコの根との種々の混合９０％エタノール抽出物で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、細胞内ＡＴＰレベルを実験実施例＜１−３＞に記載のものと同様に測定した。上記抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯで処理した正常対照群の細胞内ＡＴＰレベルと比べて増加又は低下した細胞内ＡＴＰレベルを算出し、百分率（％）として表した。陰性対照とするパーキンソン病細胞モデルを、１ｍＭのＭＰＰ＋のみを処置し、抽出物又はその活性成分を処置せずに構築した。次いで、細胞内ＡＴＰ消失に対する回復作用を上記と同様に確かめた。

【0158】

その結果、表２５に示すように、１−メチル−４−フェニルピリジニウムにより引き起こされた細胞内ＡＴＰ消失は、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物（１：１：１）の抽出物で処理した後に正常対照の９４．１０％とかなり回復し、最も高いものとなった（表２５）。

【0159】

【表25】

【0160】

＜５−３＞パーキンソン病細胞モデルにおける、様々な混合比に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の活性酸素種（ＲＯＳ）生成の減少作用
パーキンソン病細胞モデルにおける、様々な混合比に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の回復作用を調べるため、２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ）を用いて細胞内ＲＯＳの濃度を測定した。

【0161】

詳細には、マウス小膠細胞株であるＢＶ２を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例５において調製した様々な混合比のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、およびミシマサイコの根との種々の混合９０％エタノール抽出物で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、ＲＯＳを実験実施例＜３−５＞に記載のものと同様にＤＣＦ−ＤＡ／ビスベンズイミドの比を基に定量化した。増加又は低下したかのいずれかのＲＯＳレベルを抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯで処理した正常対照のＲＯＳレベルと比較し、結果を正常対照の％として表した。陰性対照とするパーキンソン病細胞モデルを、１ｍＭのＭＰＰ＋のみを処置したが、抽出物又はその活性成分を処置しないことにより構築した。次いで、ＲＯＳ生成の減少作用を上記と同様に調べた。

【0162】

その結果、表２６に示すように、１−メチル−４−フェニルピリジニウムにより引き起こされたミトコンドリア活性の低下に起因するＲＯＳ生成が、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物（１：１：１）の抽出物で処理した後に正常対照の１０６．２３％と大きく回復し、最も高いものとなった（表２６）。

【0163】

【表26】

【0164】

実験実施例６：エタノール濃度に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物（１：１：１、ｗ：ｗ：ｗ）の細胞内効能の評価
＜６−１＞エタノール濃度に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物（１：１：１、ｗ：ｗ：ｗ）における活性成分の変化
エタノール濃度に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物における活性成分の変化を調べた。

【0165】

詳細には、１０％、３０％、５０％、７０％、及び９０％の様々な濃度の抽出溶媒のエタノールをボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物（１：１：１、ｗ：ｗ：ｗ）に添加した後、実施例＜５−１＞に記載のものと同様に抽出した。得られた混合抽出物はＨＰＬＣを用いた定量的分析に進んだ。

【0166】

その結果、表２７に示すように、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物（１：１：１）は、最も高いペオノール、ペオニフロリン、サイコサポニンＡ、及びイムペラトリンの含量を示した（表２７）。

【0167】

【表27】

【0168】

＜６−２＞パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア活性に対する、エタノール濃度に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物（１：１：１、ｗ：ｗ：ｗ）の回復作用
パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア活性に対する、エタノール濃度に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物（１：１：１）の抽出物の回復作用を調べるため、ミトコンドリア活性の指標物質をパーキンソン病細胞モデルにおいて試験した。

【0169】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、様々な濃度のエタノールを用いて、１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例＜５−１＞において調製されたボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、およびミシマサイコの根の混合エタノール抽出物（１：１：１）で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、細胞生存率を、カルセインを用いて実験実施例＜１−１＞に記載のものと同様に測定した。上記抽出物又はその活性成分で処理しない代わりにＤＭＳＯで処理した正常対照の細胞生存率と比べて増加又は低下した細胞生存率を算出し、百分率（％）として表した。陰性対照とするパーキンソン病細胞モデルを、１ｍＭのＭＰＰ＋のみを処置し、抽出物又はその活性成分を処置せずに構築した。次いで、細胞生存率も、上記と同様に正常対照の細胞生存率と比較することにより、増加又は低下のいずれかを測定した。

【0170】

その結果、表２８に示すように、１−メチル−４−フェニルピリジニウムにより減少したミトコンドリア活性は、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物（１：１：１）で処理した後に、正常対照の９５．０２％とかなり回復し、最も高ものとなった（表２８）。

【0171】

【表28】

【0172】

＜６−３＞パーキンソン病細胞モデルにおける、ＡＴＰ消失に対するエタノール濃度に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物抽出物（１：１：１、ｗ：ｗ：ｗ）の回復作用
パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア機能障害に対するエタノール濃度に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物（１：１：１、ｗ：ｗ：ｗ）の抽出物の回復作用を調べるため、ＡＴＰアッセイを行い、細胞内ＡＴＰ消失に対する回復作用を確かめた。

【0173】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、様々な濃度のエタノールを用いて、１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例＜５−１＞において調製したボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、およびミシマサイコの根の混合エタノール抽出物（１：１：１）で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、細胞内ＡＴＰレベルを実験実施例＜１−３＞に記載のものと同様に測定した。細胞内ＡＴＰレベルの増減を、抽出物又は活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯでのみ処理した正常対照の細胞内ＡＴＰレベルと比べることにより算出した。上記抽出物又はその活性成分で処理しない代わりにＤＭＳＯで処理した正常対照細胞の細胞内ＡＴＰレベルと比べて増加又は低下した細胞内ＡＴＰレベルを算出し、百分率（％）として表した。陰性対照とするパーキンソン病細胞モデルを、１ｍＭのＭＰＰ＋のみを処置し、抽出物又はその活性成分を処置せずに構築した。次いで、細胞内ＡＴＰレベルに対する回復作用を上記と同様に調べた。

【0174】

その結果、表２９に示すように、１−メチル−４−フェニルピリジニウムにより減少したミトコンドリア活性は、混合９０％エタノール抽出物で処理した後に、正常対照の９６．４５％とかなり回復し、最も高いものとなった（表２９）。

【0175】

【表29】

【0176】

＜６−４＞パーキンソン病細胞モデルにおける、エタノール濃度に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合エタノール抽出物（１：１：１）による活性酸素種（ＲＯＳ）生成の減少
パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア機能障害により引き起こされたＲＯＳ生成に対する、エタノール濃度に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合エタノール抽出物（１：１：１）の減少作用を調べるため、２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ）を用いて細胞内ＲＯＳの濃度を測定した。

【0177】

詳細には、マウス小膠細胞株であるＢＶ２を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を、１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、様々な濃度のエタノールを用いて、１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例５において調製した様々な混合比のボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、およびミシマサイコの根の種々の混合エタノール抽出物で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、ＲＯＳを実験実施例＜３−５＞に記載のものと同様にＤＣＦ−ＤＡ／ビスベンズイミドの比を基に定量化した。増加又は低下したかのいずれかのＲＯＳレベルを抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯで処理した正常対照のＲＯＳレベルと比較し、結果を正常対照の％として表した。陰性対照とするパーキンソン病細胞モデルを、１ｍＭのＭＰＰ＋のみを処置し、抽出物又はその活性成分を処置せずに構築した。次いで、ＲＯＳ生成の減少作用を上記と同様に調べた。

【0178】

その結果、表３０に示すように、１−メチル−４−フェニルピリジニウムにより減少したミトコンドリア活性は、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物（１：１：１）で処理した後に、正常対照の１０５．０６％と大きく回復し、最も高いものとなった（表３０）。

【0179】

【表30】

【0180】

実験実施例７：抽出溶媒の種類に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の細胞内効能の評価
＜７−１＞パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア活性に対する抽出溶媒の種類に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の回復作用
パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア活性に対する抽出溶媒の種類に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の回復作用を調べるため、パーキンソン病細胞モデルにおいてミトコンドリア活性の指標物質を試験した。

【0181】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を、１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、様々な濃度のエタノールを用いて、１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例＜５−１＞において調製したボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、およびミシマサイコの根の混合エタノール抽出物（１：１：１）で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、細胞生存率を、カルセインを用いて実験実施例＜１−１＞に記載のものと同様に測定した。上記抽出物又はその活性成分で処理しない代わりにＤＭＳＯで処理した正常対照細胞の細胞生存率と比べて増加又は低下した細胞生存率を算出し、百分率（％）として表した。陰性対照とするパーキンソン病細胞モデルを、１ｍＭのＭＰＰ＋のみを処置し、抽出物又はその活性成分を処置せずに構築した。次いで、細胞生存率も、上記と同様に正常対照の細胞生存率と比較することにより、増加又は低下のいずれかを測定した。

【0182】

その結果、表３１に示すように、１−メチル−４−フェニルピリジニウムにより減少したミトコンドリア活性は、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物で処理した後に、正常対照の９３．０９％とかなり回復し、最も高いものとなった（表３１）。

【0183】

【表31】

【0184】

＜７−２＞パーキンソン病細胞モデルにおける、細胞内ＡＴＰ消失に対する、抽出溶媒の種類に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の回復作用
パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア機能障害に対する抽出溶媒の種類に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の回復作用を調べるため、ＡＴＰアッセイを行い、細胞内ＡＴＰ消失に対する回復作用を確かめた。

【0185】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、様々な抽出溶媒を用いて、１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例５において調製したボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、およびミシマサイコの根の混合抽出物（１：１：１）で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、細胞内ＡＴＰレベルを実験実施例＜１−３＞に記載のものと同様に測定した。上記抽出物又はその活性成分で処理しない代わりにＤＭＳＯで処理した正常対照細胞の細胞内ＡＴＰレベルと比べて増加又は低下した細胞内ＡＴＰレベルを算出し、百分率（％）として表した。陰性対照とするパーキンソン病細胞モデルを、１ｍＭのＭＰＰ＋のみを処置し、抽出物又はその活性成分を処置せずに構築した。次いで、細胞内ＡＴＰレベルに対する回復作用を上記と同様に調べた。

【0186】

その結果、表３２に示すように、１−メチル−４−フェニルピリジニウムにより減少したミトコンドリア活性は、混合９０％エタノール抽出物で処理した後に、正常対照の９５．９０％とかなり回復し、最も高いものとなった（表３２）。

【0187】

【表32】

【0188】

＜７−３＞パーキンソン病細胞モデルにおける、抽出溶媒の種類に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物による活性酸素種（ＲＯＳ）生成の減少
パーキンソン病細胞モデルにおける、ミトコンドリア機能障害により引き起こされたＲＯＳ生成に対する、抽出溶媒の種類に応じたボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の減少作用を調べるため、細胞内ＲＯＳの濃度を２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ）を用いて測定した。

【0189】

詳細には、マウス小膠細胞株であるＢＶ２を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞に、様々な抽出溶媒を用いて、１μｇ／ｍｌの濃度の、実施例５において調製したボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、およびミシマサイコの根の混合抽出物で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、ＲＯＳを実験実施例＜３−５＞に記載のものと同様にＤＣＦ−ＤＡ／ビスベンズイミドの比を基に定量化した。増加又は低下したかのいずれかのＲＯＳレベルを抽出物又はその活性成分で処理しなかったが、ＤＭＳＯで処理した正常対照のＲＯＳレベルと比較し、結果を正常対照の％として表した。陰性対照とするパーキンソン病細胞モデルを、１ｍＭのＭＰＰ＋のみを処置し、抽出物又はその活性成分を処置せずに構築した。次いで、ＲＯＳ生成の減少作用を上記と同様に調べた。

【0190】

その結果、表３３に示すように、１−メチル−４−フェニルピリジニウムにより減少したミトコンドリア活性は、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物で処理した後に、正常対照の１０６．８２％と大きく回復し、最も高いものとなった（表３３）。

【0191】

【表33】

【0192】

実験実施例８：ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の細胞内効能の評価
＜８−１＞ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物によるミトコンドリア活性の改善
本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の細胞内効能を評価するために、ヒト神経芽細胞腫細胞において、ミトコンドリア生合成の代表的なマーカーであるＴＦＡＭ及びＨ２ＡＸの発現量をウェスタンブロット法により測定した。

【0193】

詳細には、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に接種した後、５％ＣＯ_２／９５％空気（Ｏ_２）のインキュベーターにおいて３７℃にて培養した。次いで、培養した細胞を１×１０^５細胞／ウェルの密度にて血清非含有培地に移した。細胞を、１．０μｇ／ｍｌの濃度の、実施例＜５−１＞において調製したボタンの根皮、アンジェリカ・ダフリカの根、およびミシマサイコの根の混合９０％エタノール抽出物（１：１：１）の凍結乾燥物で処理した後、４時間培養した。培養が完了すると、パーキンソン病細胞モデルが実験実施例＜４−１＞に記載のものと同様に構築された。次いで、処理前の細胞を０．５ｍＭのＭＰＰ＋で処理した後、２４時間培養し、ミトコンドリアの機能不全を誘発させた。細胞内タンパク質を細胞から得た後、ウェスタンブロット法を行い、ＳＴＡＴタンパク質（Ｓ７２７及びＹ７０５）のリン酸化、ＡＫＴタンパク質（Ｔ３０８及びＳ４７３）のリン酸化、並びにＴＨ、ＴＦＡＭ、及びＨ２ＡＸタンパク質の発現量を調べた。βアクチンを、発現の比較のための対照タンパク質として使用した。本発明の抽出物では処理しなかったが、ＤＭＳＯで処理したものを正常対照とした。０．５ｍＭのＭＰＰ＋でのみ処理し、ミトコンドリア障害を引き起こさせたものを陰性対照とした。この時の陰性対照は本発明の抽出物では処理しなかった。

【0194】

その結果、表３４に示すように、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物を、１．０μｇ／ｍｌの濃度にて細胞に施すと、ＳＴＡＴタンパク質（Ｙ７０５）のリン酸化、ＡＫＴタンパク質（Ｔ３０８及びＳ４７３）のリン酸化、並びにＴＨ、ＴＦＡＭ、及びＨ２ＡＸの発現量は、ほぼ正常レベルに回復した（表３４）。

【0195】

【表34】

【0196】

＜８−２＞ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物による小胞体ストレスマーカー遺伝子の発現
小胞体ストレスの回復に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の作用を調べるため、小胞体ストレスマーカー遺伝子であるＧＲＰ７８及びＸＢＰ１ｐの発現量を測定した。

【0197】

詳細には、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、実験実施例＜２−２＞に記載のものと同様に培養し、小胞体ストレスを誘発させた。次いで、実験実施例＜１−４＞に記載のものと同様に、小胞体ストレスを有する細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った後、ＵＶ下にて１．５％アガロースゲルの電気泳動を行い、ＧＲＰ７８遺伝子及びＸＢＰ１ｐ遺伝子の発現量を調べた。本発明の抽出物で処理しなかったが、ＤＭＳＯでのみ処理したものを正常対照とした。抽出物又は活性成分で処理しなかったが、０．５μｇ／ｍｌのタプシガルギンでのみ処理し、小胞体ストレスを誘発させたものを陰性対照とした。次いで、小胞体ストレスマーカー遺伝子の発現を上記と同様に確かめた。

【0198】

その結果、表３５及び表３６に示すように、小胞体ストレスマーカー遺伝子であるＧＲＰ７８及びＸＢＰ１ｐの発現量は、１．０μｇ／ｍｌの濃度の、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物の処理により、細胞内に小胞体ストレスを誘発した細胞において正常レベルに回復した（表３５及び表３６）。

【0199】

【表35】

【0200】

【表36】

【0201】

＜８−３＞ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の消炎作用及び抗酸化作用
炎症応答に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物の回復作用を調べるため、グリース法を行い、２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ）を用いて、細胞培養培地における亜硝酸塩／硝酸塩（ＮＯ_ｘ）の濃度及び細胞内ＲＯＳの濃度を測定した。

【0202】

詳細には、ＢＶ２細胞を実験実施例＜３−１＞に記載のものと同様に培養し、炎症応答を誘発させた。次いで、１００μｌの細胞培養培地を得て、これに５％スルファニルアミド及び２％ナフチルエチレンジアミンを含有する塩酸を含む１００μｌのグリース試薬を添加した後、暗室において３０分間反応させた。反応が完了すると、ＯＤ_５４０を、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Versamax、米国）を用いて測定した。培地中の一酸化窒素の濃度を、亜硝酸ナトリウムの標準的な較正曲線を用いて算出した。ＲＯＳ濃度を測定するため、細胞を１μＭのＤＣＦ−ＤＡ及び０．０５μＭのビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）で処理した後、３７℃にて１時間染色した。染色後、ＤＣＦ−ＤＡの蛍光強度を４８５ｎｍ／５３５ｎｍにて測定し、ビスベンズイミドの蛍光強度を、３３５ｎｍ／４６０ｎｍにて測定した。ＤＣＦ−ＤＡ／ビスベンズイミドの比を基に、ＲＯＳを定量化した。増加又は低下のいずれかのＲＯＳ量を、抽出物で処理していないが、ＤＭＳＯで処理した正常対照のＲＯＳ量と比較し、結果を％として表した。１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳでのみ処理し、炎症応答を誘発させたが、抽出物又はその活性成分では処理しなかったものを陰性対象とした。次いで、上記と同様に、一酸化窒素濃度の減少作用及びＲＯＳ濃度の減少作用を調べた。

【0203】

その結果、表３７に示すように、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物が、ＬＰＳ介在性のＮＯ生成を減少させる作用（表３７）及び炎症応答及びストレスにより引き起こされたＤＣＦ−ＤＡ介在性ＲＯＳ生成を減少させる作用（表３８）を有することを確認した。

【0204】

【表37】

【0205】

【表38】

【0206】

実験実施例９：パーキンソン病に対するボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果
＜９−１＞パーキンソン病動物モデルの構築：ＭＰＴＰ誘導性パーキンソン病マウスモデル
図１に示すように、パーキンソン病に対する本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、パーキンソン病動物モデルを構築した（図１）。

【0207】

詳細には、５週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（体重：およそ１９ｇ〜２２ｇ）が分配された後、少なくとも１週間、東亜大学校ＳＴ研究科（Dong−A ST Research Division）の動物研究室において馴化させた。この時、室内温度を２２±２℃に調節し、湿度を５３±３％に制御した。明暗サイクルを１２時間／１２時間に設定した。水及び飼料を自由に摂取させた。馴化の後、マウスを５群に分け、各群に６匹のマウスを割り当てた。実施例＜５−１＞において調製したボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物（１：１：１）の凍結乾燥物を３％ＨＰＭＣに溶解させ、これを１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇの用量にて、１日１回、１４日間マウスに経口投与（経口、ｐ．ｏ．）した。次いで、マウスに、実験の８日目から５日間、経口投与の３時間後に３０ｍｇ／ｋｇの用量にて１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を投与し（腹腔内、ｉ．ｐ．）、パーキンソン病動物モデルを構築した。混合抽出物を含まない３％ＨＰＭＣを５ｍｌ／ｋｇの用量にて投与し、次いで、その後、ＭＰＴＰ非含有ＰＢＳを腹腔内投与したものを正常対照とした。

【0208】

＜９−２＞ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物による、ＭＰＴＰ誘導性パーキンソン病マウスモデルにおける運動協調性の改善
パーキンソン病に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、上記混合物の抽出物の投与後に、ＭＰＴＰ誘導性パーキンソン病マウスモデルを用いて、挙動試験（ポールテスト、ロータロッドテスト）を行った。

【0209】

詳細には、パーキンソン病マウスモデルは、実験実施例＜８−１＞において構築されていた。動物モデルを構築の１４日後に、表面が粗いポール（径：８ｍｍ、高さ：５５ｃｍ）の頂部に配置させた。マウスが完全に下を向き移動する時間を３０秒毎に測定し、これを回転するまでの時間として定義し（Ｔ−ｔｕｒｎ）、マウスが床に到着した時間を測定し、これを移動活動時間（Ｔ−ＬＡ）と定義した。動物を、ｒｐｍを制御することができる回転かごに入れた。動物が転落した時間を測定した（転落潜時）。３％ＨＰＭＣのベヒクルを処置したものを正常対照とした。ＭＰＴＰを３０ｍｇ／ｋｇの用量にて５日間、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）したが、その後、混合物の抽出物を処置しなかったものを陰性対照とした。次いで、対照にポールテストを行い、Ｔ−ｔｕｒｎ及びＴ−ＬＡを測定し、上記と同様にロータロッドテストを行い、転落潜時を測定した。

【0210】

その結果、表３９及び表４０に示すように、ベヒクルを処置した正常対照群と比べ、Ｔ−ｔｕｒｎ及びＴ−ＬＡは、ＭＰＴＰのみを処置した陰性対照において顕著に増加した。その一方で、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物を処置したパーキンソン病マウスモデルにおいて、Ｔ−ｔｕｒｎ及びＴ−ＬＡが減少した（表３９及び表４０）。表４１に示すように、転落潜時は、ＭＰＴＰのみを処置した陰性対照において顕著に減少したが、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物を処置したパーキンソン病マウスモデルにおいて転落潜時は増大したことがロータロッドテストから確認された。それゆえ、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物の処置により、パーキンソン病マウスモデルにおいて運動協調性が回復したことが確認された（表３９〜表４１）。

【0211】

【表39】

【0212】

【表40】

【0213】

【表41】

【0214】

＜９−３＞ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ドーパミン作動性ニューロンに対するボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の保護作用
パーキンソン病に対する本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、本発明の混合物の抽出物を処置したＭＰＴＰ誘導性パーキンソン病マウスモデルの脳組織を得て、この組織の線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）におけるドーパミン作動性ニューロンの保護作用を確かめた。

【0215】

詳細には、実験実施例＜８−２＞の挙動試験を終了したマウスモデルに、筋肉内注射を介して麻酔用のゾレチル（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳを、心臓を介して灌流させた後、脳を摘出した。摘出した脳を４％パラホルムアルデヒドにて再度固定し、次いで、脳が沈積するまで４℃にて３０％スクロース溶液に浸漬させた後、これを凍結させた。凍結させた脳組織をクリオスタットミクロトーム（製品名：ＣＭ３０００、Leica、ドイツ）を用いて、３０μｍの冠状面に切片化し、切片をグリセリン、エチレングリコール、及びＰＢＳを含むストック溶液に４℃にて保存した。切片をカバーガラス上に置き、ＰＢＳを用いて洗浄後、１％Ｈ_２Ｏ_２を含有するＰＢＳを用いて１５分間処理し、組織からペルオキシダーゼ活性を排除した。次いで、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（抗ＴＨ；１：２０００、ウサギ由来；Millipore、米国）を一次抗体として組織に施した後、一晩反応させた。ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として組織に施した後、室温にて９０分間反応させた。反応が完了すると、組織をＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Vector Laboratories、米国）に含まれるアビジンビオチン複合体溶液で処理した後、１時間反応させた。ジアミノベンジジンを用いて発色を誘発させた。ドーパミン細胞の保護作用を調べるため、線条体（ＳＴ）の光学密度を測定し、次いで、黒質（ＳＮ）のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性細胞を計数した。溶媒を処置し、陰性対照に対してＭＰＴＰを３０ｍｇ／ｋｇの用量にて５日間、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）したが、その後、混合物の抽出物を処置しなかったものを正常対照群とした。

【0216】

その結果、表４２に示すように、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合エタノール抽出物を投与したパーキンソン病動物モデルの線条体（ＳＴ）において染色されたＴＨの光学密度は、用量依存的に増大し、抽出物がドーパミン作動性ニューロンに対する保護作用を有することを示唆した。表４３に示すように、黒質（ＳＮ）のＴＨ陽性細胞も、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合エタノール抽出物の投与に応じて、用量依存的に増加した（表４２及び表４３）。

【0217】

【表42】

【0218】

【表43】

【0219】

＜９−４＞ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ドーパミン量に対するボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の作用
パーキンソン病に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、本発明の混合物の抽出物を処置したＭＰＴＰ誘導性パーキンソン病マウスモデルの脳組織を得て、組織内のドーパミンレベルを測定した。

【0220】

詳細には、脳は実験実施例＜８−２＞における挙動試験を終了したマウスから摘出した。ＳＴを摘出した脳から分離した後、ホモジナイズした。ＳＴに過塩素酸（Sigma）を添加した後、培養した。培養したＳＴを濾過し、加圧し、濃縮した。濃縮した抽出物はクロマトグラフィーに進み、ドーパミンレベルを測定した。溶媒を処置し、陰性対照に対して、ＭＰＴＰを３０ｍｇ／ｋｇの用量にて５日間、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）したが、その後、混合物の抽出物を処置しなかったものを正常対照群とした。

【0221】

その結果、表４４に示すように、ドーパミンのレベルは、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合エタノール抽出物を処置していないパーキンソン病動物モデルにおいて顕著に減少したが、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合エタノール抽出物を動物に投与すると顕著に増加した（表４４）。

【0222】

【表44】

【0223】

＜９−５＞ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＴＨ、ミトコンドリア、及びインスリンシグナル伝達系の障害に対するボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の回復作用
パーキンソン病に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、本発明の混合物の抽出物を処置したＭＰＴＰ誘導性パーキンソン病マウスモデルの脳組織を得て、ミトコンドリアマーカーであるＴＨ及びＮＤ９の発現量、並びにインスリンシグナル伝達系マーカーであるＡｋｔ１のリン酸化レベルを測定した。

【0224】

詳細には、黒質（ＳＮ）、線条体（ＳＴ）、及び小脳の切片を実験実施例＜８−３＞に記載のものと同様に得て、それらから脳組織タンパク質を得た。タンパク質を用いてウェスタンブロット法を行い、ＴＨ及びＮＤ９の発現量並びにＡｋｔ１（Ｓ４７３及びＴ３０８）のリン酸化レベルを測定した。この時、βアクチンを発現の比較のための対照タンパク質として使用した。溶媒を処置し、陰性対照に対して、ＭＰＴＰを３０ｍｇ／ｋｇの用量にて５日間、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）したが、その後、混合物の抽出物を処置しなかったものを正常対照群とした。

【0225】

その結果、表４５〜表４７に示すように、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物を１０ｍｇ／ｋｇの用量にて投与した動物モデルにおけるＳＮ、ＳＴ、及び小脳のＴＨ及びＮＤ９の発現量は、ほぼ正常対照のこれらの発現量程の高い正常レベルに回復し、Ａｋｔ１タンパク質のリン酸化レベルも正常レベルに回復した（表４５〜表４７）。

【0226】

【表45】

【0227】

【表46】

【0228】

【表47】

【0229】

実験実施例１０：パーキンソン病に対するボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果
＜１０−１＞パーキンソン病動物モデルの構築：６−ＯＨＤＡ（６−ヒドロキシドーパミン）誘導性パーキンソン病マウスモデル
パーキンソン病に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、パーキンソン病動物モデルを図２に示すように構築した（図２）。

【0230】

詳細には、８週齢の雄のＩＣＲマウス（体重：およそ１９ｇ〜２２ｇ）が分配された後、少なくとも１週間、慶熙大学校薬学科（Kyung Hee University College of Pharmacy）の動物研究室において馴化させた。この時、室内温度を２２±２℃に調節し、湿度を５３±３％に制御した。明暗サイクルを１２時間／１２時間に設定した。水及び飼料を自由に摂取させた。馴化の後、マウスを３群に分け、各群に６匹のマウスを割り当てた。１６μｇの６−ＯＨＤＡ（６−ヒドロキシドーパミン）を、２μｌの０．１％アスコルビン酸に希釈し、これを、定位手術を介して各マウスに注射し、パーキンソン病動物モデルを構築した。実施例＜５−１＞において調製したボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物（１：１：１）の凍結乾燥物を水に溶解させ、これをマウスに、３ｍｇ／ｋｇの用量にて１日１回、７日間、経口投与（経口、ｐ．ｏ．）した。溶媒を処置し、陰性対照に対して、定位手術を介して６−ＯＨＤＡを含有する０．１％アスコルビン酸を注射したものを正常対照群とした。

【0231】

＜１０−２＞６−ＯＨＤＡ誘導性パーキンソン病マウスモデルにおける、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物による運動協調性の改善
パーキンソン病に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、上記混合物の抽出物の投与後に、６−ＯＨＤＡ誘導性パーキンソン病マウスモデルを用いて、挙動試験（ポールテスト、ロータロッドテスト）を行った。

【0232】

詳細には、パーキンソン病マウスモデルは、実験実施例＜９−１＞において構築されていた。動物モデルを構築の７日後に、表面が粗いポール（径：８ｍｍ、高さ：５５ｃｍ）の頂部に配置させた。マウスが完全に下を向き移動する時間を３０秒毎に測定し、これを回転するまでの時間として定義し（Ｔ−ｔｕｒｎ）、マウスが床に到着した時間を測定し、これを移動活動時間（Ｔ−ＬＡ）と定義した。動物を、ｒｐｍを制御することができる回転かごに入れた。動物が転落した時間を測定した（転落潜時）。溶媒を処置し、陰性対照に対して、定位手術を介して６−ＯＨＤＡを含有する０．１％アスコルビン酸を注射したものを正常対照群とした。次いで、対照にポールテストを行い、Ｔ−ｔｕｒｎ及びＴ−ＬＡを測定し、上記と同様にロータロッドテストを行い、転落潜時を測定した。

【0233】

その結果、表４８及び表４９に示すように、溶媒を処置した正常対照群と比べ、Ｔ−ｔｕｒｎ及びＴ−ＬＡは、６−ＯＨＤＡのみを処置した陰性対照群において顕著に増加した。その一方で、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物を処置したパーキンソン病マウスモデルにおいて、Ｔ−ｔｕｒｎ及びＴ−ＬＡが減少した（表４８及び表４９）。表５０に示すように、転落潜時は、６−ＯＨＤＡのみを処置した陰性対照において顕著に減少したが、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物を処置したパーキンソン病マウスモデルにおいて転落潜時は増大したことがロータロッドテストから確認された。それゆえ、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物の処置により、パーキンソン病マウスモデルにおいて運動協調性が回復したことが確認された（表４８〜表５０）。

【0234】

【表48】

【0235】

【表49】

【0236】

【表50】

【0237】

＜１０−３＞ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ドーパミン作動性ニューロンに対するボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の保護作用
パーキンソン病に対する本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、本発明の混合物の抽出物を処置した６−ＯＨＤＡ誘導性パーキンソン病マウスモデルの脳組織を得て、この組織の線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）におけるドーパミン作動性ニューロンの保護作用を確かめた。

【0238】

詳細には、実験実施例＜９−２＞の挙動試験を終了したマウスモデルに、筋肉内注射を介して麻酔用のゾレチル（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳを、心臓を介して灌流させた後、脳を摘出した。摘出した脳を４％パラホルムアルデヒドにて再度固定し、次いで、脳が沈積するまで４℃にて３０％スクロース溶液に浸漬させた後、これを凍結させた。凍結させた脳組織をクリオスタットミクロトーム（製品名：ＣＭ３０００、Leica、ドイツ）を用いて、３０μｍの冠状面に切片化し、切片をグリセリン、エチレングリコール、及びＰＢＳを含むストック溶液に４℃にて保存した。切片をカバーガラス上に置き、ＰＢＳを用いて洗浄後、１％Ｈ_２Ｏ_２を含有するＰＢＳを用いて１５分間処理し、組織からペルオキシダーゼ活性を排除した。次いで、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（抗ＴＨ；１：２０００、ウサギ由来；Millipore、米国）を一次抗体として組織に施した後、一晩反応させた。ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として組織に施した後、室温にて９０分間反応させた。反応が完了すると、組織をＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Vector Laboratories、米国）に含まれるアビジンビオチン複合体溶液で処理した後、１時間反応させた。ジアミノベンジジンを用いて発色を誘発させた。ドーパミン細胞の保護作用を調べるため、線条体（ＳＴ）の光学密度を測定し、次いで、黒質（ＳＮ）のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性細胞を計数した。溶媒を処置し、陰性対照に対して、定位手術を介して６−ＯＨＤＡを含有する０．１％アスコルビン酸を注射したものを正常対照群とした。

【0239】

その結果、表５１及び表５２に示すように、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合エタノール抽出物を投与したパーキンソン病動物モデルの線条体（ＳＴ）において染色されたＴＨの光学密度は、用量依存的に増大し、抽出物がドーパミン作動性ニューロンに対する保護作用を有することを示唆した。黒質（ＳＮ）のＴＨ陽性細胞も、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合エタノール抽出物の投与に応じて、用量依存的に増加した（表５１及び表５２）。

【0240】

【表51】

【0241】

【表52】

【0242】

実験実施例１１：パーキンソン病に対する、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果
＜１１−１＞パーキンソン病動物モデルの構築：ロテノン誘導性パーキンソン病ラットモデル
パーキンソン病に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、パーキンソン病動物モデルを図３に示すように構築した（図３）。

【0243】

詳細には、７週齢の雄のＳＤラット（体重：２００ｇ〜２２０ｇ）が分配された後、少なくとも１週間、東亜大学校ＳＴ研究科の動物研究室において馴化させた。この時、室内温度を２２±２℃に調節し、湿度を５３±３％に制御した。明暗サイクルを１２時間／１２時間に設定した。水及び飼料を自由に摂取させた。馴化の後、ラットを３群に分け、各群に６匹のラットを割り当てた。実施例＜５−１＞において調製したボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物（１：１：１）の凍結乾燥物を水に溶解させ、これをラットに１０ｍｇ／ｋｇの用量にて１日１回、６週間、経口投与（経口、ｐ．ｏ．）した。次いで、ラットに、経口投与の１週間後にロテノンを２．５ｍｇ／ｋｇの用量にて１日１回、５週間投与し（腹腔内、ｉ．ｐ．）、パーキンソン病動物モデルを構築した。溶媒を処置し、陰性対照に対して、ロテノンを２．５ｍｇ／ｋｇの用量にて１日１回、５週間、投与した（腹腔内、ｉ．ｐ．）ものを正常対照群とした。

【0244】

＜１１−２＞ロテノン誘導性パーキンソン病ラットモデルにおける、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物による運動協調性の改善
パーキンソン病に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、上記混合物の抽出物の投与後に、挙動試験（円筒試験）をロテノン誘導性パーキンソン病ラットモデルに行った。

【0245】

詳細には、円筒試験を、実験実施例＜１１−１＞において構築したパーキンソン病ラットモデルに行った。ラットを円筒（高さ：３０ｃｍ、径：２０ｃｍ）に入れた。ラットが体を起こし、壁に前脚を置いた回数を５分間計数した。溶媒を処置し、陰性対照に対して、ロテノンを２．５ｍｇ／ｋｇの用量にて１日１回、５週間、腹腔内投与したものを正常対照群とした。同様に、対照群を用いて、ラットが体を起こし、壁に前脚を置いた回数を５分間計数した。

【0246】

その結果、表５３に示すように、ロテノンのみを投与した陰性対照群の起立数は、溶媒のみを処置した正常対照群の起立数と比べ、顕著に減少したが、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物を投与すると増加した（表５３）。

【0247】

【表53】

【0248】

＜１１−３＞ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物によるα−シヌクレイン蓄積の低下
パーキンソン病に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、脳組織を、混合抽出物を処置したロテノン誘導性パーキンソン病ラットモデルから得た。脳組織の黒質（ＳＮ）におけるα−シヌクレインオリゴマーの蓄積パターンを調べた。

【0249】

詳細には、実験実施例＜１１−２＞における挙動試験を終了したラットモデルに、筋肉内注射を介して麻酔用のゾレチル（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳを、心臓を介して灌流させた後、脳を摘出した。摘出した脳を４％パラホルムアルデヒドにおいて再度固定し、次いで、脳が沈積するまで４℃にて３０％スクロース溶液に浸漬させた後、これを凍結させた。凍結させた脳組織をクリオスタットミクロトーム（製品名：ＣＭ３０００、Leica、ドイツ）を用いて、３０μｍの冠状面に切片化し、切片をグリセリン、エチレングリコール、及びＰＢＳに４℃にて保存した。切片をカバーガラス上に置き、ＰＢＳを用いて洗浄後、１％Ｈ_２Ｏ_２を含有するＰＢＳで１５分間処理し、組織からペルオキシダーゼ活性を排除した。次いで、抗α−シヌクレイン抗体（１：２０００；マウス由来、abcam、イングランド）を一次抗体として組織に施した後、一晩反応させた。ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として組織に施した後、室温にて９０分間反応させた。反応が完了すると、組織をＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Vector Laboratories、米国）に含まれるアビジンビオチン複合体溶液で処理した後、１時間反応させた。ジアミノベンジジンを用いて発色を誘発させた。α−シヌクレインオリゴマーの蓄積をα−シヌクレイン陽性細胞を計数することにより測定した。溶媒を処置し、陰性対照に対して、ロテノンを２．５ｍｇ／ｋｇの用量にて１日１回、５週間、腹腔内投与したものを正常対照群とした。

【0250】

その結果、表５４に示すように、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合エタノール抽出物を投与したパーキンソン病動物モデルの黒質（ＳＮ）におけるα−シヌクレイン陽性細胞数が減少した（表５４）。

【0251】

【表54】

【0252】

実験実施例１２：パーキンソン病（脳炎症）に対する、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果
＜１２−１＞神経炎症動物モデルの構築：ＬＰＳ誘導性パーキンソン病マウスモデル
パーキンソン病に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、パーキンソン病動物モデルを図４に示すように構築した（図４）。

【0253】

詳細には、８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（体重：およそ１９ｇ〜２２ｇ）が分配された後、少なくとも１週間、慶熙大学校薬学科の動物研究室に馴化させた。この時、室内温度を２２±２℃に調節し、湿度を５３±３％に制御した。明暗サイクルを１２時間／１２時間に設定した。水及び飼料を自由に摂取させた。馴化の後に、マウスを４群に分け、各群に６匹のマウスを割り当てた。実施例＜５−１＞において調製したボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合９０％エタノール抽出物（１：１：１）の凍結乾燥物を水に溶解させ、これをマウスに１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの用量にて１日１回、３日間経口投与（経口、ｐ．ｏ．）した。次いで、マウスに経口投与後にＬＰＳ（リポ多糖）を５ｍｇ／ｋｇの用量にて投与（腹腔内、ｉ．ｐ．）し、パーキンソン病動物モデルを構築した。溶媒を処置し、陰性対照にＬＰＳを５ｍｇ／ｋｇの用量にて投与したが、その後、混合物の抽出物を処置しなかったものを正常対照群とした。

【0254】

＜１２−２＞ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合抽出物の抗脳炎症作用
パーキンソン病に対する、本発明のボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合物の抽出物のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療効果を調べるため、脳組織を、混合抽出物を処置したパーキンソン病ラットモデルから得た。混合物の抽出物の抗脳炎症作用を上記から得られた脳組織の黒質（ＳＮ）及び海馬の星状膠細胞及び小膠細胞の活性化を調べることにより確かめた。

【0255】

詳細には、実験実施例＜１２−１＞において構築した神経炎症動物モデルに筋肉内注射を介して麻酔用のゾレチル（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳを、心臓を介して灌流させた後、脳を摘出した。摘出した脳を４％パラホルムアルデヒドにおいて再度固定し、次いで、脳が沈積するまで４℃にて３０％スクロース溶液に浸漬させた後、これを凍結させた。凍結させた脳組織をクリオスタットミクロトーム（製品名：ＣＭ３０００、Leica、ドイツ）を用いて、３０μｍの冠状面に切片化し、切片をグリセリン、エチレングリコール、及びＰＢＳに４℃にて保存した。切片をカバーガラス上に置き、ＰＢＳを用いて洗浄後、１％Ｈ_２Ｏ_２を含有するＰＢＳで１５分間処理し、組織からペルオキシダーゼ活性を排除した。次いで、抗ＧＦＡＰ抗体（１：５０００；ウサギ由来、Neuromics、米国）又は抗Ｉｂａ−１抗体（１：１０００；ウサギ由来、ダコ・ジャパン株式会社、日本）を一次抗体として組織に施した後、一晩反応させた。ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として組織に施した後、室温にて９０分間反応させた。反応が完了すると、組織をＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Vector Laboratories、米国）に含まれるアビジンビオチン複合体溶液で処理した後、１時間反応させた。ジアミノベンジジンを用いて発色を誘発させた。ＳＮ及び海馬において活性化した星状膠細胞及び小膠細胞のレベルをＧＦＡＰ及びＩｂａ−１の陽性細胞の数を計数することにより測定した。溶媒を処置し、陰性対照にはＬＰＳを５ｍｇ／ｋｇの用量にて投与し、その後、本発明の混合物の抽出物を処置しなかったものを正常対照群とした。

【0256】

その結果、表５５及び表５６に示すように、パーキンソン病マウスモデルの黒質（ＳＮ）のＬＰＳにより増加したＧＦＡＰ及びｌｂａ−１の陽性細胞が、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合エタノール抽出物を投与することにより用量依存的に減少した。上記の結果は、星状膠細胞及び小膠細胞の活性化が減少し、すなわち脳炎症が減少したことを示した（表５５及び表５６）。表５７及び表５８に示すように、パーキンソン病マウスモデルの海馬の、ＬＰＳにより増加したＧＦＡＰ及びｌｂａ−１の陽性細胞が、ボタンの根皮とアンジェリカ・ダフリカの根とミシマサイコの根との混合エタノール抽出物の投与により用量依存的に減少した。同様に、星状膠細胞及び小膠細胞の活性化が減少し、脳炎症が減少したことが示唆された（表５７及び表５８）。

【0257】

【表55】

【0258】

【表56】

【0259】

【表57】

【0260】

【表58】

【0261】

製造例１：医薬配合物の調製
＜１−１＞粉末の調製
本発明の混合抽出物又はその画分 ０．１ｇ
ラクトース １．５ｇ
タルク ０．５ｇ

【0262】

上記成分の全てを混合して散剤を調製し、散剤を調製する従来法に従って気密性パックに充填した。

【0263】

＜１−２＞錠剤の調製
本発明の混合抽出物又はその画分 ０．１ｇ
ラクトース ７．９ｇ
結晶セルロース １．５ｇ
ステアリン酸マグネシウム ０．５ｇ

【0264】

従来の直打法により、上記成分の全てを混合して錠剤を調製した。

【0265】

＜１−３＞カプセル剤の調製
本発明の混合抽出物又はその画分 ０．１ｇ
コーンスターチ ５ｇ
カルボキシセルロース ４．９ｇ

【0266】

上記成分の全てを混合してカプセル剤を調製し、カプセル剤を調製する従来法に従って硬カプセル剤に充填した。

【0267】

＜１−４＞注射液の調製
本発明の混合抽出物又はその画分 ０．１ｇ
滅菌蒸留水 適量
ｐＨ調整剤 適量

【0268】

上記成分を全て混合し、注射液を調製するための従来法によって、この混合物を２ｍｌ容のアンプルに入れ、このアンプルを滅菌することにより注射液を作製した。

【0269】

＜１−５＞液体製剤の調製
本発明の混合抽出物又はその画分 ０．１ｇ
異性化糖 １０ｇ
マンニトール ５ｇ
精製水 適量

【0270】

上記成分の全てを精製水に溶解した。レモン風味を添加した後、精製水を添加して総容量を１００ｍｌに調整した。この混合物を褐色瓶に入れ、液体製剤を調製する従来法によりそれを滅菌して液体製剤を調製した。

【0271】

製造例２：健康機能食品の調製
＜２−１＞小麦粉食品の調製
本発明の混合物の抽出物又はその画分０．５重量部〜５．０重量部を小麦粉に添加した。従来法に従い、該小麦粉混合物を用いてパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類等の健康増進用食品を調製した。

【0272】

＜２−２＞スープ及びグレービーの調製
本発明の混合物の抽出物又はその画分０．１重量部〜５．０重量部をスープ及びグレービーに添加した。この混合物を用いて従来法により健康増進用の肉製品であるスープ及びグレービーを調製した。

【0273】

＜２−３＞牛挽肉の作製
本発明の混合物の抽出物又はその画分１０重量部と牛挽肉とを従来法に従い混合することにより、健康増進用の牛挽肉を作製した。

【0274】

＜２−４＞乳製品の作製
本発明の混合物の抽出物又はその画分５重量部〜１０重量部を牛乳に添加した。従来法に従い、牛乳混合物を用いてバター及びアイスクリーム等の健康増進用の乳製品を調製した。

【0275】

＜２−５＞禅食（Sun−Sik：ソンシク）の調製
従来法に従って玄米、オオムギ、モチ米及びハトムギ（Yulmu：ジュズダマ）（Job's tears）を糊化し、乾燥し、粉砕して６０メッシュ粉末を得た。

【0276】

従来法に従って黒豆、黒ゴマ及びエゴマを蒸して乾燥させ、粉砕して６０メッシュ粉末を得た。

【0277】

本発明の混合物の抽出物又はその画分を減圧下において濃縮し、噴霧乾燥させて、粉砕し、６０メッシュの乾燥粉末を得た。

【0278】

禅食を穀物と種子と本発明の混合物の抽出物又はその画分との乾燥粉末を以下の比に従って混合することにより作製した。

【0279】

穀物（玄米：３０重量部、ハトムギ：１５重量部、オオムギ：２０重量部）、
種子（エゴマ：７重量部、黒豆：８重量部、黒ゴマ：７重量部）、
本発明の混合物の抽出物又はその画分（３重量部）、
ガノデルマ・ルキドゥム（Ganoderma lucidum：レイシ）（０．５重量部）、
リューマニア・グルチノーザ（Rehmannia glutinosa：アカヤジオウ）（０．５重量部）

【0280】

＜２−６＞健康補助食品の調製
本発明の混合物の抽出物又はその画分 １００ｍｇ
複合ビタミン 適量
ビタミンＡアセテート ７０μｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２μｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０μｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０μｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
ミネラル 適量
硫酸第一鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
一塩基性リン酸カリウム １５ｍｇ
二塩基性リン酸カリウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ

【0281】

ビタミン及びミネラルを健康食品の好ましい組成比率に従って混合した。しかしながら、組成比率を調整することができる。健康食品を調製する従来法に従って構成要素を混合し、その後、健康食品用組成物を従来法に従って調製した。

【0282】

製造例３：健康飲料の調製
本発明の混合抽出物又はその画分 １００ｍｇ
クエン酸 １００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｍｇ
ウメ（プルヌス・ムメ（Prunus mume））抽出物 ２ｍｇ
タウリン １００ｍｇ
精製水 ５００ｍｌまで適量

【0283】

健康飲料を調製する従来法に従って上記構成要素を混合した。混合物を８５℃にて１時間、撹拌しながら加熱し、その後濾過した。濾過物を１ｌの滅菌容器に入れ、密閉して再度滅菌し、滅菌容器を健康飲料用組成物の調製に使用するまで冷蔵庫で保管した。

【0284】

嗜好性飲料に適した構成要素は、好ましい混合比率に従って混合されるが、地域及び国の好み等に応じて組成比率を調整することができる。

【0285】

当業者であれば、上記の明細書に開示された概念及び具体的な実施形態が、本発明と同じ目的で実施される他の実施形態を改変又は設計する基礎として容易に利用し得ることが理解されるだろう。当業者であれば、このような同等の実施形態が添付の特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨及び範囲から逸脱することがないことも理解されるだろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]