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特許6450894生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】6450894
(24)【登録日】2018年12月14日
(45)【発行日】2019年1月9日
(54)【発明の名称】生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法
(51)【国際特許分類】
D04H 3/16 20060101AFI20181220BHJP
D04H 3/015 20120101ALI20181220BHJP
D04H 3/016 20120101ALI20181220BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20181220BHJP
A61L 27/58 20060101ALI20181220BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20181220BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20181220BHJP
【ＦＩ】
D04H3/16
D04H3/015
D04H3/016
A61L27/22
A61L27/58
C12M1/00 C
C12N5/071
【請求項の数】18
【全頁数】28
(21)【出願番号】特願2018-555291(P2018-555291)
(86)(22)【出願日】2018年6月15日
(86)【国際出願番号】JP2018022988
【審査請求日】2018年10月30日
(31)【優先権主張番号】特願2017-120759(P2017-120759)
(32)【優先日】2017年6月20日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2018-49476(P2018-49476)
(32)【優先日】2018年3月16日
(33)【優先権主張国】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】390018153
【氏名又は名称】日本毛織株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】599029420
【氏名又は名称】田畑 泰彦
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】特許業務法人池内・佐藤アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】田畑 泰彦
(72)【発明者】
【氏名】上杉 昭二
(72)【発明者】
【氏名】尾井 政夫
(72)【発明者】
【氏名】早乙女 俊樹
(72)【発明者】
【氏名】中村 耕一郎
【審査官】
春日 淳一
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１４／１９６５４９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２００３−１２５７５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１４／１９２８０３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２０１５−５０１３４３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｄ０４Ｈ１／００−１８／０４
Ａ６１Ｌ２７／２２
Ａ６１Ｌ２７／５８
Ｃ１２Ｍ１／００
Ｃ１２Ｎ５／０７１
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体適合ポリマーを主成分とする生体適合長繊維不織布であって、
前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、長さ方向で繊維直径が変化しており、
前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、繊維交点が少なくとも部分的に溶着しており、
前記生体適合長繊維不織布は加熱脱水架橋されており、
水に濡れてもへたらず、水に濡れると透明になることを特徴とする生体適合長繊維不織布。
前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、長さ方向で繊維直径が変化しており、
前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、繊維交点が少なくとも部分的に溶着しており、
前記生体適合長繊維不織布は加熱脱水架橋されており、
水に濡れてもへたらず、水に濡れると透明になることを特徴とする生体適合長繊維不織布。
【請求項2】
前記生体適合長繊維は、平均繊維直径（Ｄ）が１〜７０μｍの範囲にあり、Ｄ±０．５Ｄの範囲で繊維直径が変化している請求項１に記載の生体適合長繊維不織布。
【請求項3】
前記生体適合長繊維は、実質的に未延伸状態である請求項１又は２に記載の生体適合長繊維不織布。
【請求項4】
前記生体適合長繊維不織布は、１．０ｋＰａの圧縮応力時の圧縮変形率が４０％以下である請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布。
【請求項5】
前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、架橋前は水溶性である請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布。
【請求項6】
前記生体適合ポリマーは、ゼラチン、コラーゲンおよびこれらの修飾体からなる群から選ばれる少なくとも一つの水溶性高分子である請求項１〜５のいずれかに記載の生体適合長繊維不織布。
【請求項7】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布の製造方法であって、
生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、
前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、
前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、前記繊維形成した繊維を集積させて不織布とし、
前記生体適合長繊維不織布を真空凍結乾燥し、その後加熱脱水架橋することを特徴とする生体適合長繊維不織布の製造方法。
生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、
前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、
前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、前記繊維形成した繊維を集積させて不織布とし、
前記生体適合長繊維不織布を真空凍結乾燥し、その後加熱脱水架橋することを特徴とする生体適合長繊維不織布の製造方法。
【請求項8】
前記紡糸液の温度は、紡糸液が流動する温度以上、かつ生体適合ポリマーの分解温度以下である請求項７に記載の生体適合長繊維不織布の製造方法。
【請求項9】
前記圧力流体の噴射圧力は０．０５〜０．５ＭＰａであり、前記圧力流体の温度は前記紡糸液の温度±３０℃である請求項７又は８に記載の生体適合長繊維不織布の製造方法。
【請求項10】
前記紡糸液の粘度は、温度６０℃において５００〜３０００ｍＰａ・ｓである請求項７〜９のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布の製造方法。
【請求項11】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布を細胞培養用立体足場とすることを特徴とする細胞培養用立体足場。
【請求項12】
前記足場の厚みが０．２ｍｍ以上であり、足場内部でも細胞が生存する請求項１１に記載の細胞培養用立体足場。
【請求項13】
請求項１１又は１２に記載の細胞培養用立体足場を使用した細胞培養方法であって、
前記足場に細胞を播種した後、細胞播種した足場を液体培地中に入れて、細胞培養することを特徴とする細胞培養方法。
前記足場に細胞を播種した後、細胞播種した足場を液体培地中に入れて、細胞培養することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項14】
前記足場の厚みが０．２ｍｍ以上であり、足場内部でも細胞が生存する請求項１３に記載の細胞培養方法。
【請求項15】
前記液体培地を攪拌、循環及び振とうから選ばれる少なくとも一つの手段で流動させながら細胞培養する請求項１３又は１４に記載の細胞培養方法。
【請求項16】
前記細胞培養中に、前記足場は消失し、培養した細胞及び前記細胞が産生する細胞外マトリクスと置き換わる請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項17】
前記足場をピンセットで把持して細胞シートと積層する工程を含む請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項18】
前記足場の厚さは０．２ｍｍ以上であり、密度が０．８ｇ／ｃｍ3以上である請求項１７に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は医療用及び細胞培養の足場用として好適な生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法に関する。【背景技術】
【0002】
繊維シートは、有孔度や比表面積の高さから、医療用及び細胞培養の足場等に有用である。特にゼラチンはこれまでにも医療に広く用いられてきた材料であり、医療機器、医薬品添加剤としての前例があり、生体適合性、細胞親和性、生体吸収性は実証済みである。ゼラチンからなる繊維は、安全性が高く、ゼラチンの化学架橋の程度によって、数日から数か月にわたる生体吸収期間のコントロールや、硬さのコントロールが可能である。例えばゼラチンの綿状成形物は、実際に医療用途において局所止血材として実用化されている。ゼラチン繊維からなる３次元成形体が多く報告されている。例えば、ゼラチンをエレクトロスピニング法で繊維化し、不織布とすることが特許文献１に提案されている。特許文献２には、ゼラチンとポリエチレングリコール等の水溶性直鎖状高分子を含む水溶液を、空気中に押し出して紡糸することが提案されている。特許文献３には、ゼラチン溶液を凝固浴に吐出させてゲル状繊維とし、取り出して延伸し、残存する溶液を除去することが提案されている。【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２０１４−０５５１９号公報
【特許文献2】特開２０１２−１６７３９７号公報
【特許文献3】特開２００５−１２０５２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかし、前記のような従来技術で得られたゼラチン繊維からなる３次元構造体（綿あるいは不織布に代表される）は、力学特性が劣り、水膨潤時の強度が小さく、細胞培養に用いた時に細胞の増殖とともに成形体が変形し、成形体内部の細胞増殖に必要な孔構造がなくなることが問題となっている。このように、医療用及び細胞培養の足場等に有用な成形性と成形安定性の高い不織布としては、細胞培養時に、その内部構造を維持できることが必要不可欠な材料特性であり、そのための力学特性を持つことが必須となっている。【0005】
本発明は、前記従来の問題を解決するため、医療用及び細胞培養の足場等に有用な成形性と成形安定性の高い生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法を提供する。【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の生体適合長繊維不織布は、生体適合ポリマーを主成分とする生体適合長繊維不織布であって、前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、長さ方向で繊維直径が変化しており、前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、繊維交点が少なくとも部分的に溶着しており、水に濡れてもへたらず、水に濡れると透明になることを特徴とする。【0007】
本発明の生体適合長繊維不織布の製造方法は、前記の生体適合長繊維不織布の製造方法であって、生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、得られた生体適合長繊維を集積させて不織布とすることを特徴とする。【0008】
本発明の細胞培養用立体足場は、前記の生体適合長繊維不織布を細胞培養用立体足場とすることを特徴とする。【0009】
本発明の細胞培養方法は、前記の細胞培養用立体足場を使用した細胞培養方法であって、前記足場に細胞を播種した後、細胞播種した足場を液体培地中に入れて、細胞培養することを特徴とする。【発明の効果】
【0010】
本発明の細胞培養用立体足場は、生体適合ポリマーを主成分とする生体適合長繊維不織布で構成され、前記不織布を構成する生体適合長繊維は、連続する１本の繊維から構成され、一例として長さが数十メートルから数百メートルであり、長さ方向で繊維直径が変化しており、前記不織布を構成する生体適合長繊維は、繊維交点が部分的に溶着していることにより、医療用及び細胞培養の立体足場等に有用な成形性と成形安定性を提供できる。すなわち、生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は太さ斑があり、部分的に溶着していることにより、生体適合長繊維不織布はブリッジ構造となり、嵩高く低密度であり、所望の形状に成形しやすく、かつ成形安定性も高いものとなり、水に濡れてもへたらない。このことが、細胞培養時の不織布の３次元構造の変化や内部構造（空隙）の変化を抑制する。このため、細胞が生体適合長繊維不織布全体に均一に分布して増殖し、細胞の３次元組織化が達成される。通常、細胞が三次元化することにより内部に存在する細胞は、栄養酸素不足で死滅することが問題となっている。しかしながら、本発明のゼラチン長繊維等の生体適合長繊維で構成された不織布で培養された細胞３次元組織体内部の細胞は、死滅せず、細胞からのタンパク質などの正常な生理学的産生による細胞外マトリクス形成が認められた。この理由として、不織布材料がゼラチンハイドロゲル等の生体適合ハイドロゲルであることから、ハイドロゲル層を通しての外部からの栄養酸素の供給が得られたことが考えられる。以前から報告されているハイドロゲル以外の繊維からなる不織布は、このような効果は認められていない。本発明の生体適合長繊維不織布が、ハイドロゲル繊維による不織布であること、不織布作製方法の改良により、水を含んだ場合でもその力学強度が高まり、細胞培養時における不織布の変形の抑制、内部構造（空隙）の維持、細胞親和性の高い生体適合長繊維を用いていることなどの特徴が重なり、細胞の生理学的環境が整えられたことで、細胞培養時に不織布内側及び外側で細胞が増殖でき、細胞の３次元組織化が可能となったと考えられる。細胞の３次元組織化は、細胞研究及び創薬研究に必要な技術である。細胞一つ一つに比べて、細胞が３次元的に相互作用することによって、細胞の機能が増強され、体内での細胞機能に近づくことが分かっているからである。また、本発明の生体適合長繊維不織布は、ハイドロゲルからなる嵩高な三次元材料であり、水や液体培地を含ませて膨潤して足場として使用すると、培養液と酸素が、不織布内のハイドロゲル繊維材料を通して足場全体に回りやすく、栄養と酸素が足場全体に細胞へ効率よく供給され、立体的な細胞培養が可能となる。本発明の生体適合長繊維不織布は、水に濡れても腰が強くしっかりしているため、前記液体培地を攪拌、循環及び振とうから選ばれる少なくとも一つの手段で流動させながら細胞培養することもできる。また、水に濡れると透明であり、顕微鏡観察しやすい。この透明性は、培養液中で倒立顕微鏡により足場の内部まで観察できる程度の透明性である。倒立顕微鏡で観察できる程度の透明性があれば、培養状態を確認でき、好都合である。さらに、不織布は長繊維で構成されているため、繊維が脱落する等の異物混入やごみの発生リスクも低い。加えて、生体適合性もある。また、本発明の生体適合性長繊維不織布の一例では、架橋したハイドロゲルから構成されるため、ハイドロゲルをリン酸緩衝液などで膨潤させる際に、ｂＦＧＦ等の薬剤を加えることで、ハイドロゲル内部に薬剤を取り込ませ、薬剤を徐放する担体としても使用することが可能である。従って本発明の生体適合長繊維不織布は、医療用や細胞培養の足場として好適である。本発明の製造方法は、前記生体適合長繊維不織布をコンタミ等がなく、衛生的にかつ効率よく合理的に製造できる。【図面の簡単な説明】
【0011】
【図15】図１５は実施例４のゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて細胞培養を８日間行った時、足場の内部まで、細胞が侵入していることを示すヘマトキシリンエオジン染色した足場切片の光学顕微鏡写真である。光学顕微鏡観察した写真（１０倍）を蛍光顕微鏡のソフトウェア上で連結し、全体像とした。
【図17】図１７は比較例２のポリプロピレン不織布を足場として用いて細胞培養を４日間行った時、細胞が足場の外側までしか侵入していないことを示すヘマトキシリンエオジン染色した足場切片の光学顕微鏡写真（４倍）である。
【図19】図１９は同、実施例４のゼラチン長繊維不織布を足場として用いて細胞培養を１２日間行った時の足場内の酸素状態を低酸素マーカーによって観察した蛍光観察顕微鏡写真（明度の高い部分（白色に近い部分）：低酸素部位）（２０倍）である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の生体適合長繊維不織布は、長繊維で構成される不織布である。繊維の長さは数メートル〜数千メートルが好ましい。長繊維はメルトブロー法で製造できる。本発明で用いるメルトブロー法は、生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口から押し出し、ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて乾式でダイレクトに繊維化し、得られた生体適合長繊維を集積させて不織布にすることから、コンタミ（夾雑物）の発生は防止され、衛生的に製造できる。この長繊維は非分割繊維であり、紡糸後に分割などの処理はされていない。この不織布は紡糸後に繊維を集積（堆積）させる時に繊維同士が、水分を含んだ状態で積層されるため、溶着したり互いに絡んで一体化されている。繊維を堆積させる際の捕集距離を変えることで、容易に不織布密度を変えることができる。【0013】
これに対して従来のメルトブロー法は、紡糸液のノズル吐出口の周囲から圧力空気を噴射するため、紡糸液が圧力空気噴射口に漏れ出すことがあり、長期間溜まった紡糸液が製品中にコンタミ（夾雑物）となって入り込み、製品汚染になってしまう現象がみられた。【0014】
本発明において、生体適合長繊維不織布は生体適合ポリマーを主成分とする。ここで主成分とは、生体適合ポリマーを９０質量％以上含むことを言う。１０質量％以下の成分は、架橋剤、薬剤、他の添加剤等であってもよい。実質的に１００質量％の生体適合ポリマーであってもよい。生体適合ポリマーは市販品を使用できる。【0015】
前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、長さ方向で繊維直径が変化している。長さ方向で繊維直径が変化することは、ノズルから吐出した紡糸液を圧力流体（例えば、圧空）に随伴させて紡糸するため、圧力流体の乱れ（乱流）により生ずる。また、長さ方向で繊維直径が変化することは、複数のノズルを使用した時に各ノズルの吐出速度及び／又は圧力流体の流速が異なる際にも生ずる。【0016】
前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、繊維交点が部分的に溶着している。この部分的溶着は、圧力流体によって吹き飛ばされたゼラチン長繊維等の生体適合長繊維が堆積する際に、完全に固化していない状態の時に発現する。この部分的溶着により、生体適合長繊維不織布はブリッジ構造となり、嵩高く低密度であり、所望の形に成形しやすく、かつ成形安定性も高いものとなる。本発明において、「繊維交点が少なくとも部分的に溶着している」とは、生体適合長繊維不織布が水に濡れてもへたらない程度に溶着していることを意味し、生体適合長繊維不織布が水に濡れてもへたらない程度に繊維交点の一部が溶着してもよく、繊維交点の全部が溶着してもよい。【0017】
前記生体適合長繊維は、平均繊維直径（Ｄ）が１〜７０μｍの範囲にあり、Ｄ±０．５Ｄの範囲で繊維直径が変化していることが好ましい。平均繊維直径（Ｄ）のさらに好ましい範囲は５〜６０μｍである。前記生体適合長繊維の直径とその変化の度合いが前記のとおりであると、医療用及び細胞培養の足場等にさらに有用である。本発明において、「平均繊維直径」及び「その変化の度合い」は、それぞれ、生体適合長繊維不織布の走査型電子顕微鏡写真（500倍）から任意に選択した５０本の繊維の直径の平均値及びその変化の度合いを意味する。【0018】
前記生体適合長繊維は、実質的に未延伸状態であることが好ましい。前記において、実質的に未延伸状態とは、機械的延伸を受けていない状態をいう。ノズルから吐出した紡糸液を圧空に随伴させて吹き飛ばすと繊維は細くなるが、実質的に未延伸状態である。【0019】
前記生体適合長繊維不織布は、水に濡れてもへたらない。本発明において、「水に濡れてもへたらない」とは、生体適合長繊維不織布の水で飽和状態まで膨潤した後における１．０ｋＰａの圧縮応力時の圧縮変形率（以下において、単に「圧縮変形率」とも記す。）が４０％以下であることを意味する。前記飽和状態とは、水が最大限に含まれた状態であり、水の含有量が一定限度にとどまりそれ以上増えない状態を意味する。前記生体適合長繊維不織布の圧縮変形率は、４０％以下であることが好ましく、３５％以下であることがより好ましく、３０％以下がさらに好ましい。なお、前記生体適合長繊維不織布の圧縮変形率の下限は特に限定されないが、例えば、１％以上であることが好ましく、５％以上であることがより好ましい。また、前記生体適合長繊維不織布は、水に濡れてもへたらない観点から、水で飽和状態まで膨潤した後における初期弾性率（以下において、単に「初期弾性率」とも記す））が０．３０ｋＰａ以上であることが好ましく、より好ましくは０．３５ｋＰａ以上であることが好ましい。なお、前記生体適合長繊維不織布の初期弾性率の上限は特に限定されないが、例えば、２０ｋＰａ以下であることが好ましく、１０ｋＰａ以下であることがより好ましい。本発明において、圧縮変形率は、水で飽和状態まで膨潤した後の生体適合長繊維不織布において、無荷重の時の厚さを（Ｈ１）とし、１．０ｋＰａの圧縮応力時の厚さを（Ｈ２）とした場合、下記式で算出したものである。水で膨潤した後の圧縮変形率が上述した範囲であると、水に濡れてもへたらない。本発明において、初期弾性率は、ひずみ１〜５％の圧縮弾性率を意味する。圧縮試験は、後述のとおりに行う。圧縮変形率（％）＝１００−｛（Ｈ２／Ｈ１）×１００｝
【0020】
前記生体適合長繊維不織布は、水に濡れると透明になる。この透明性は、培養液中で倒立顕微鏡により足場の内部まで観察できる程度の透明性である。倒立顕微鏡で観察できる程度の透明性があれば、培養状態を確認でき、好都合である。具体的には、本発明において、「水に濡れると透明になる」とは、水で飽和状態まで膨潤した後の生体適合長繊維不織布（厚さ１．５ｍｍ）の波長４００〜８００ｎｍの範囲における平均透過率が１０％以上であることを意味する。水で飽和状態まで膨潤した後の生体適合長繊維不織布（厚さ１．５ｍｍ）の波長４００〜８００ｎｍの範囲における平均透過率は、好ましくは１５％以上であり、より好ましくは２０％以上である。【0021】
前記生体適合長繊維不織布は、シート状に形成されているのが好ましい。シート状であれば様々な形状に成形できる。【0022】
前記生体適合長繊維不織布は、架橋しているのが好ましい。これにより形態安定性及び耐熱性を保てる。架橋は加熱脱水架橋が生体安全性のために好ましい。また、架橋前の生体適合長繊維又は生体適合ポリマーは水溶性であるのが好ましい。生体適合ポリマーが水溶性であると、紡糸液として水溶液の状態で紡糸でき、生体に対する安全性を高くすることができる。【0023】
前記生体適合ポリマーは、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸、ムコ多糖、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子およびこれらの修飾体からなる群から選ばれる少なくとも一つのポリマーであるのが好ましい。ここで、「修飾体」とは、水溶性を損なわない程度に分子末端や側鎖等を変性することを意味する。これらは水（加熱水を含む）に溶解しやすく、溶液紡糸が可能で、繊維形成後にゲル化し、架橋させることができ、形態安定性の高い不織布に形成できることから好ましい。この中でもゼラチンがより好ましい。【0024】
本発明の生体適合長繊維不織布の製造方法は、生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、得られた生体適合長繊維を集積させて不織布とする。本発明において、生体適合長繊維不織布の製造に用いる製造装置は、生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出す手段と、前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射する手段と、前記押し出された紡糸液が前記圧力流体に随伴されて形成される生体適合長繊維を集積させる手段を含む。圧力流体噴射口は、ノズル吐出口とは独立にかつ非接触状態で後方に配置されているため、紡糸液が混入することはない。このため、製品にコンタミが混入することを防止できる。【0025】
前記紡糸液の温度は、紡糸液が流動する温度以上、かつ生体適合ポリマーの分解温度未満であることが好ましい。紡糸液が流動する温度以上でないと紡糸することはできず、生体適合ポリマーの分解温度以上であると分解物が製品に混入する恐れがある。【0026】
前記圧力流体の噴射圧力は０．０５〜０．５ＭＰａであるのが好ましい。前記の範囲であれば、ノズル吐出口から空気中に押し出された紡糸液を吹き飛ばして繊維化できる。また、前記圧力流体の温度は前記紡糸液の温度近辺が好ましく、より好ましくは、圧力流体の温度は紡糸液の温度±５０℃であり、さらに好ましくは紡糸液の温度±３０℃とする。この状態であればノズル吐出口から空気中に押し出された紡糸液は急冷されず、流動状態で繊維化され、その後空気中で冷却されて固体の繊維が形成される。【0027】
前記紡糸液の粘度は、温度６０℃において５００〜３０００ｍＰａ・ｓであるのが好ましい。粘度が前記範囲であれば、繊維化するのに都合がよい。【0028】
前記生体適合長繊維不織布は、真空凍結乾燥し、その後、架橋させることが好ましい。真空凍結乾燥するのは、生体適合長繊維（生体適合ポリマー）の変質を防いで急速に乾燥させるためである。その後、架橋させるのは、形態安定性のために好ましい。架橋は、化学試薬を用いた架橋、加熱脱水架橋、光架橋、紫外線、電子線、放射線等のエネルギー線架橋等でもよい。加熱脱水架橋の温度は生体ポリマーの種類によって異なるが、例えば、ガラス転移点以上軟化点以下が好ましい。ゼラチン長繊維の加熱脱水架橋温度は１００〜１６０℃が好ましい。【0029】
以下、ゼラチン長繊維不織布を例に挙げて説明する。ゼラチン長繊維不織布は、医療用不織布又は細胞培養の足場用に好適である。ゼラチン自体は生体適合性、生分解性があり、長繊維不織布であると使い勝手が良い。【0030】
ゼラチン長繊維不織布の製造方法は、下記の工程を含む。１．準備工程
（１）ゼラチンを加熱水に溶解する。溶解温度（加熱水の温度）は２０〜９０℃が好ましい。溶解した後、フィルトレーションして異物やごみなどを除去してもよい。
（２）その後、減圧又は真空脱泡して溶解空気を除去してもよい。
２．本工程
（１）加熱したゼラチン水溶液（紡糸液）を紡糸機のノズルから吐出する。
（２）前記ノズル周囲から圧力流体を供給し、前記吐出したゼラチン水溶液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させる。
（３）得られたゼラチン長繊維を集積させてゼラチン長繊維不織布とする。
３．後工程
（１）ゼラチン長繊維不織布を真空凍結乾燥する。
（２）乾燥したゼラチン長繊維不織布は所定の大きさにカットし、所定の形状に成形してもよい。成形はプレス成形等を使用できる。
（３）ゼラチン長繊維不織布を架橋させる。架橋は、加熱脱水架橋、熱架橋、電子線架橋、γ線等の放射線架橋、紫外線架橋等を採用できる。
（４）所定形状のゼラチン長繊維不織布、又はシートは滅菌する。滅菌はエチレンオキサイドガス滅菌、水蒸気、電子線照射、γ線等の放射線照射等を使用できる。電子線照射、γ線等の放射線照射の場合は、滅菌とともに架橋を同時にすることもできる。
４．使用時の滅菌
医療用及び細胞培養の足場等に使用する際の準備工程として、エチレンオキサイド滅菌、または蒸気滅菌してもよい。架橋後のゼラチン長繊維不織布は蒸気滅菌できる。
【0031】
前記加熱したゼラチン水溶液（紡糸液）の温度は２０〜９０℃であることが好ましい。前記の範囲であればゼラチンは安定したゾル状態を維持できる。また、前記加熱したゼラチン水溶液のゼラチン濃度は、ゼラチン水溶液を１００質量％とした時、３０〜５５質量％であることが好ましい。さらに好ましい濃度は３５〜５０質量％である。前記の濃度であれば安定したゾル状態を維持できる。前記加熱したゼラチン水溶液（紡糸液）の粘度は５００〜３０００ｍＰａ・ｓが好ましい。前記の粘度であれば安定した紡糸ができる。【0032】
前記圧力流体の温度は、ゼラチン水溶液（紡糸液）の場合は８０〜１２０℃が好ましい。圧力流体の流速及び周囲雰囲気の温度にもよるが、前記の温度範囲であれば安定した紡糸ができる。圧力流体は空気を使用することが好ましく、圧力は０.１〜１ＭＰａが好ましい。【0033】
本発明の細胞培養用立体足場は、前記生体適合長繊維不織布を使用して作製する。一例として、架橋させた後の不織布（シート）を所定の形に打ち抜くなどして成形し、細胞培養用足場とする。或いは、所定の液体培地で膨潤した後に、目的の細胞培養用足場とする。前記液体培地で膨潤する前（乾燥状態）の足場の厚さは０．２ｍｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．３ｍｍ以上１０ｍｍ以下である。厚さが前記の範囲であれば、水又は液体培地で膨潤した後にピンセットで把持する際に、形状維持性が高いとともに、屈曲しにくくハンドリング性が良好になる。また、積層培養に用いる場合、液体培地で膨潤する前（乾燥状態）の足場の密度は、０．８ｇ／ｃｍ3以上が好ましく、より好ましくは１．０ｇ／ｃｍ3以上１．３ｇ／ｃｍ3以下である。密度が前記の範囲であれば、積層培養に用いる場合、水又は液体培地で膨潤した後にピンセットで把持する際に、形状維持性が高いとともに、屈曲しにくくハンドリング性が良好になる。【0034】
前記足場を用いた細胞培養は、特に限定されないが、例えば、下記のように行うことができる。まず、目的とする細胞を液体培地中に、所定の濃度で懸濁し、細胞懸濁液を準備するとともに、同様の液体培地にゼラチン長繊維不織布製の足場等の生体適合長繊維不織布製の足場を入れ、所定時間（例えば３０分間）静置して、十分に膨潤させる。次に、膨潤させた生体適合長繊維不織布製の足場を、チューブや培養皿中に入れ、ここに細胞懸濁液を加え、インキュベーター中のシェイカー上で振盪し、細胞播種する。細胞懸濁液は、１種の細胞の懸濁液であってもよく、２種以上の複数種の異なる細胞の懸濁液であってもよい。すなわち、細胞播種は、単一細胞を播種してもよく、異なる細胞種を同時に播種することで行っても良い。細胞播種後、リン酸緩衝液で生体適合長繊維不織布製の足場を洗浄し、未接着の細胞を除去し、細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場を得る。細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場をプレートや培養皿に移し、液体培地を加え、所定条件（例えば温度３７℃、５％ＣＯ2）のインキュベーター中で静置培養してもよい。液体培地は、２〜３日毎に交換してもよい。或いは、細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場を培養容器に配置し、細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場が浸るまで、液体培地を加え、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中に置いたマグネティックスターラー上で液体培地を撹拌して循環させながら、撹拌培養してもよい。３〜４日毎に、液体培地を半分量除き、等量の新たな液体培地を加えることで、培地交換を行ってもよい。或いは、細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場を培養容器に配置し、細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場が浸るまで、液体培地を加え、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中で振とうさせながら培養してもよい。３〜４日毎に、液体培地を半分量除き、等量の新たな液体培地を加えることで、培地交換を行ってもよい。本発明の生体適合長繊維不織布及び生体適合長繊維不織布を用いた細胞培養用立体足場は、水に濡れると透明になる。この透明性は、培養液中で倒立顕微鏡により足場の内部まで観察できる程度の透明性である。倒立顕微鏡で観察できる程度の透明性があれば、培養状態を確認でき、好都合である。上記のように生体適合長繊維不織布製足場に細胞を播種し、細胞培養を行うと、後述するように３次元細胞凝集体が得られる。得られた３次元細胞凝集体は、単一の細胞の細胞シート又は複数種の細胞の細胞シートと組み合わせて用いることができる。【0035】
また、生体適合長繊維不織布製の足場を複数枚積層させて、細胞培養を行ってもよい。例えば、細胞培養して得られた細胞シートと、液体培地で膨潤させた生体適合長繊維不織布製の足場を交互に複数枚積層させて細胞培養を行うことができる。積層培養を行う際、ハンドリング性を高める観点から、上述したとおり、積層培養に用いる場合、液体培地で膨潤する前（乾燥状態）の足場の厚さは０．２ｍｍ以上であり、密度は、０．８ｇ／ｃｍ3以上であることが好ましい。複数枚細胞培養する方法では細胞シートが同一の細胞種に限られることはなく、複数種の細胞からなる細胞シート及び複数種の異なる細胞の細胞シートを積層して共培養してもよい。【0036】
次に図面を用いて説明する。図１は本発明の一実施例で得られたゼラチン長繊維不織布の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ，日立走査型顕微鏡Ｓ−２６００Ｎ、１００倍）の写真である。図２は同、ゼラチン長繊維不織布の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ，日立走査型顕微鏡Ｓ−２６００Ｎ、５００倍）の写真である。不織布を構成するゼラチン長繊維は長さ方向で繊維直径が変化していることが分かる。また、不織布を構成するゼラチン長繊維は、繊維交点が部分的に溶着していることも確認できる。【0037】
図３は本発明の一実施例で得られた長繊維不織布（縦３５ｍｍ、横２５ｍｍ、厚さ０．９５ｍｍ）の写真である。本発明の生体適合長繊維不織布の製造方法によれば、長尺シート状の不織布が得られるが、細胞培養用立体足場にする場合の取り扱い性を考慮して、一例として前記の大きさにすることができる。【0038】
図４は本発明の一実施例で使用する不織布製造装置の模式的説明図である。不織布製造装置１０において、加温槽１に入れた生体適合ポリマーを含む紡糸液２をノズル吐出口３から空気中に押し出す。加温槽１にはコンプレッサー４により、所定の圧力をかけておく。１２は保温容器である。また、ノズル吐出口３の後方に位置し、ノズル吐出口３とは非接触状態の流体噴射口５から前方に向けて圧力流体７を噴射させる。流体噴射口５にはコンプレッサー６から圧力流体（例えば圧空）が供給される。流体噴射口５とノズル吐出口３との距離は５〜３０ｍｍが好ましい。
押し出された紡糸液は圧力流体７に随伴されて長繊維８となり、巻き取りロール１１上で長繊維不織布９となって堆積される。この時、堆積された長繊維は水分を含んでいたり、完全には固化していないので、繊維交点の少なくとも一部において接している繊維が互いに溶着する。なお、巻き取りロール以外でもネット等で長繊維を捕集し堆積して不織布にしてもよい。
【0039】
図２１は一実施例の生体適合長繊維不織布製の足場を用いて撹拌培養を行う際の細胞培養装置の模式的説明図である。この撹拌培養試験装置２０は、スピナーフラスコ２１内に攪拌棒２２と攪拌子２３を備えており、攪拌棒２２を回転させることにより、液体培地２４が攪拌される。液体培地２４内には例えば２２ゲージ針２５に通した生体適合長繊維不織布製の足場２６を入れ、細胞培養する。フラスコ内には所定の雰囲気ガスを送り込んでもよい。培養液は攪拌以外に、振とうさせてもよく、循環させてもよい。このように細胞培養すると、短期で、大きな３次元細胞凝集体が得られ、その凝集体内部で、細胞は高生存率となる。また、得られた３次元細胞凝集体は、ゼラチン長繊維不織布等の生体適合長繊維不織布製の足場が消失し、細胞及び細胞が産生する細胞外マトリクスと置き換わることもある。さらに、得られた３次元細胞凝集体は、高強度を示す。このようにして得られた３次元細胞凝集体は、その他の単一の細胞の細胞シート又は複数種の細胞の細胞シートと適宜に組み合わせて用いることができる。【0040】
図３６は本発明の一実施例の生体適合長繊維不織布製の足場を複数枚積層して細胞培養する工程説明図である。（ａ）に示されているように、所定の液体培地３０を入れた培養皿３１に所定の濃度の細胞懸濁液３２を播種し、所定の時間（例えば１０日間）静置培養して、（ｂ）に示されているように、細胞シート３３を作製する。次に、ピペットの液流によって、細胞シート３３を、（ｃ）に示されているように、培養皿から剥離する。培養皿３１から液体培地３０を除去した後、所定の液体培地中で所定時間（例えば３０分）膨潤させておいた生体適合長繊維不織布製の足場３４をピンセットで把持して入れ、（ｄ）に示されているように、剥離された細胞シート３３の上に載せる。次に、（ｅ）に示されているように、それらを上から所定の圧力３５（例えば１ｋＰａ）で数秒押すことで、細胞シート３３と足場３４を一体化できる。細胞シート３３と足場３４が一体化したものをピンセットで把持して、（ｆ）に示されているように、複数枚積層する。このようにして３次元化した大きな細胞の塊を作製する。従来は、足場をピペットで吸い上げて積層しており、手間暇がかかるうえ、成功率も低く、熟練を要するという問題があった。これに比較して、本発明のゼラチン長繊維不織布製の足場等の生体適合長繊維不織布製の足場はピンセットで把持できるので、取扱性は飛躍的に向上できる。ピンセットで把持する操作は、例えば、図６−９に示すとおりに行う。図３６では細胞シートと足場を積層して複数枚細胞培養する方法を説明しているが、細胞懸濁液を所定の液体培地で所定時間膨潤したゼラチン長繊維不織布製の足場に播種し、所定時間細胞培養して得られた細胞培養後の足場を複数枚積層して、３次元化した大きな細胞の塊を作製してもよい。この所定時間細胞培養して得られた細胞培養後の足場は、足場内部に細胞が浸潤してもよい。また細胞が足場表面に留まるように培養し細胞シート様の構造となってもよい。複数枚細胞培養する方法では細胞シートが同一の細胞種に限られることはなく、複数種の細胞からなる細胞シート及び複数種の異なる細胞の細胞シートを積層して共培養してもよい。【実施例】
【0041】
以下、実施例を用いてさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。【0042】
測定方法は下記のとおりである。＜繊維直径＞
生体適合長繊維不織布の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日立走査型顕微鏡Ｓ−２６００Ｎ、５００倍)の写真から任意に選択した５０本の繊維を用いて、平均繊維直径及びその変化の度合いを測定した。
＜その他＞
後述のとおり、ＪＩＳ又は業界の規定する測定方法に従って測定した。
【0043】
（実施例１）ゼラチンとして新田ゼラチン社製（ゼリー強度２６２ｇ 原料：アルカリ処理牛骨）を使用し、ゼラチン：水＝３：５の質量比（ゼラチン濃度３７．５質量％）とし、温度６０℃で溶解した。６０℃における粘度は９６０〜９７０ｍＰａ・ｓであった。このゼラチン水溶液を紡糸液とし、図４に示す不織布製造装置を使用して長繊維不織布を製造した。紡糸液の温度は６０℃、ノズル直径（内径）２５０μｍ、吐出圧０．３ＭＰａ、ノズル高さ５ｍｍ、エアー圧力０．３ＭＰａ、エアー温度１００℃、流体噴射口５とノズル吐出口３との距離は２０ｍｍ、捕集距離１００ｃｍとし、巻き取りローラ１１で長繊維不織布９を巻き取った。
次いで、長繊維不織布は真空凍結乾燥し（−８０℃、１３Ｐａ、７２時間）、その後、加熱脱水架橋させた。架橋条件は温度１４０℃、４８時間とした。
【0044】
得られた実施例１の不織布を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日立走査型顕微鏡Ｓ−２６００Ｎ）で観察し、その結果を図１（１００倍）及び図２（５００倍）に示した。図２の生体適合長繊維不織布の走査型電子顕微鏡写真（５００倍）から任意に選択した５０本の繊維直径を測定したところ、前記不織布を構成する長繊維の平均繊維直径は５１μｍであり、５１±２０μｍの範囲で繊維直径が変化していた。また、図１〜２に示すように構成繊維は、繊維交点において部分的に溶着していた。【0045】
得られた実施例１の不織布を、直径φ４ｍｍの円柱状に打ち抜いた。打ち抜いた不織布サンプルを、３７℃の精製水中で、１晩静置し、飽和状態になるまで十分に膨潤させ、ピンセットで持った際の形状維持性を確認した。その結果を図５に示した。図５に示されているように、実施例１の不織布は膨潤後の形態維持性が良好であり、膨潤後にピンセットで持っても、形状を維持しておりハンドリング性に優れていた。また、膨潤させた不織布サンプルの直径を計測後、（株）山電製クリープメータ物性試験システムＲＥ２−３３００５Ｃにて、厚さ（Ｈ１）を測定し、直径φ４０ｍｍのプランジャーを用い、０．０５ｍｍ／ｓｅｃで圧縮した。ひずみ１〜５％の圧縮弾性率（kＰａ）及び、ひずみ１０％、２０％、３０％の中間圧縮応力（kＰａ）を測定した。また、無荷重時の厚さ（ひずみ０％）を基準とし、圧縮応力１ｋＰａ時の厚さの変化率（ひずみ率）を算出し、圧縮変形率とした。ひずみ１〜５％の圧縮弾性率（kＰａ）は初期弾性率に該当する。また、プレートリーダー社製、型番「Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ｉ３」）を用いて、膨潤させた不織布サンプル（厚み１．５ｍｍ）の波長範囲４００〜８００ｎｍにおける透過率を１０ｎｍ間隔で測定し、４００〜８００ｎｍの範囲における平均透過率を算出した。【0046】
（実施例２）吐出圧０．１５ＭＰａとした以外は実施例１と同様にして不織布を作製し、実施例１と同様にして物性を測定した。
【0047】
（実施例３）吐出圧０．２ＭＰａとした以外は実施例１と同様にして不織布を作製し、実施例１と同様にして物性を測定した。
【0048】
（実施例４）吐出圧０．１ＭＰａとし、エアー圧力０．２ＭＰａ、捕集距離５０ｃｍとした以外は実施例１と同様にして不織布を作製し、実施例１と同様にして物性を測定した。
【0049】
（実施例５）不織布の作製時間を増やし、膨潤後、無荷重時での厚さが３．０３ｍｍになるようにした以外は、実施例４と同様に不織布を作製し、実施例１と同様にして物性測定をした。
【0050】
（実施例６）不織布の作製時間を減らし、膨潤後、無荷重時での厚さが０．６９ｍｍになるようにした以外は、実施例４と同様に不織布を作製し、物性測定に用いた不織布サンプルの直径φ６ｍｍにした以外は、実施例１と同様にして物性測定をした。
【0051】
（比較例１）比較例１として、熱架橋後のゼラチンスポンジ（ファイザー株式会社、商品名「ゼルフォーム」）を任意の厚さにスライスした後、直径φ４ｍｍに打ち抜き、３７℃の精製水中で、１晩静置し、飽和状態になるまでに十分に膨潤させ、実施例１と同様に物性測定した。
【0052】
以上の条件及び結果は表１にまとめて示す。また、実施例２〜４のゼラチン長繊維不織布、比較例１のゼラチンスポンジ、及び実施例６のゼラチン長繊維不織布を精製水中で膨潤させ、ピンセットで持った際の形状維持性を確認した結果を図６〜９、３７にそれぞれ示した。図６〜９、３７から分かるように、実施例２〜４のゼラチン長繊維不織布も、実施例１のゼラチン長繊維不織布と同様、膨潤後の形態維持性が良好であり、膨潤後にピンセットで持っても、形状を維持しておりハンドリング性に優れていた。一方、比較例１のゼラチンスポンジは、膨潤後の形態維持性が悪く、膨潤後にピンセットで持った場合、形状が崩れていた。【0053】
【表1】
【0054】
表１から明らかなとおり、比較例１のゼラチンスポンジは、膨潤前後での厚さを対比すると、膨潤後の方が薄くなった。また、比較例１のゼラチンスポンジは、圧縮特性において、圧縮弾性率が低く、またひずみに伴い、圧縮応力変化が小さいことから、非常に変形しやすく、腰がなかった。一方で、本発明の各実施例のゼラチン長繊維不織布は、膨潤前後の厚さを対比すると、膨潤後の方が、厚くなった。ゼラチンスポンジと比較して、圧縮弾性率が約１．２〜３．０倍高かった。さらに繊維直径が太いほど、ひずみに伴い、圧縮応力が増大しており、変形に強かった。また、１．０ｋＰａの圧縮応力時の圧縮変形率（ひずみ率）は、ゼラチンスポンジは５６．８％と大きく変形するが、実施例のゼラチン長繊維不織布は、３５％以下であり、腰が強かった。【0055】
（実施例Ａ１）本実施例は、静置培養による細胞培養試験の例である。実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場（乾燥時の厚さ１．２ｍｍ、密度 ０．４４ｇ／ｃｍ3、直径４ｍｍ）を用いて細胞の静置培養を行った。
１．試験の内容
（１）細胞培養
（a）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、液体培地中（ウシ胎児血清１０質量％、ペニシリンストレプトマイシン１質量％を含むαＭＥＭ培地）に、２．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう懸濁し、細胞懸濁液を準備した。
（ｂ）エチレンオキサイドガス滅菌後のゼラチン長繊維不織布製の足場を、液体培地に３０分間静置して、十分に膨潤させた。
（ｃ）膨潤させたゼラチン長繊維不織布製の足場を、１５ｍＬのＰＰチューブ中に入れ、ここに細胞懸濁液２００μＬを加え、３７℃インキュベーター中で、オービタルシェイカー上で、３００ｒｐｍ、６時間振盪し、細胞播種した。
（ｄ）細胞播種後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でゼラチン長繊維不織布製の足場を洗浄し、未接着の細胞を除去し、１２ウェルプレートにピンセットで移し、液体培地３ｍＬを加え、温度３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中で静置培養した。液体培地は、２〜３日毎に交換した。
（２）培養時の観察
細胞培養中の足場を、ルーチン倒立顕微鏡（カールツァイスマイクロスコピー社製の「Ｐｒｉｍｏ Ｖｅｒｔ」）で観察、撮影した。
（３）細胞数
培養した足場をリン酸緩衝液（ｐＨ7.4）で洗浄し、３７℃の、０．２ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウムを含んだ３０ｍＭの塩化ナトリウム−クエン酸溶液（ＳＳＣ溶液）３００μＬ中で、２４時間、３００ｒｐｍで撹拌し、細胞を回収した。回収した細胞の分散液１００μＬに、３０ｍＭの塩化ナトリウム−クエン酸溶液（ＳＳＣ溶液）４００μＬを加え、得られた溶液に核染色剤であるＨｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８（ナカライテスク社）を１μＬ／ｍＬとなるよう加えた。得られた溶液をＥｘ３５５ｎｍ、Ｅｍ４６０ｎｍで蛍光強度測定し、細胞数既知の溶液から得られた標準線から、細胞数を求めた。
（４）足場内の細胞分布
培養した足場をリン酸緩衝液で洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、さらにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。洗浄後、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン社）で包埋後、凍結状態で、円柱状の足場の直径と垂直方向に、切片を作製した。凍結切片をヘマトキシリンエオジン染色し、足場内の細胞分布の仕方を光学顕微鏡（株式会社キーエンス社製、型番「ＢＺ−Ｘ７１０」）観察した。
（５）足場内の低酸素状態の評価
細胞培養中の液体培地を取り除き、新たに加えたαＭＥＭ培地に、Ｈｙｐｏｘｉａ Ｐｒｏｂｅ ＬＯＸ−１（ＯＲＧＡＮＯＧＥＮＩＸ社）を所定量加え、一晩インキュベートした。培養中の足場を、蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス製の「ＢＺ−Ｘ７１０」）で、Ｅｘ５１０−５６０ｎｍ、Ｅｍ５８０ｎｍで蛍光観察した。Ｉｍａｇｅ Ｊでコントラストを調整した。
【0056】
（実施例Ａ２）実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場に代わりに、実施例２で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用いた以外は、実施例Ａ１に記載のとおりに細胞培養を行った。
【0057】
（比較例Ａ１〜Ａ３）実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場に代わりに、比較例１のゼラチンスポンジ製の足場（比較例Ａ１）、比較例２として繊維径４０μｍのポリプロピレン長繊維不織布製の足場（比較例Ａ２）、比較例３として繊維径２μｍのポリ乳酸長繊維不織布製の足場（比較例Ａ３）を用いた以外は、実施例Ａ１に記載のとおりに細胞培養を行った。
【0058】
２．結果（１）細胞培養及び培養時の観察性
図１０に実施例４のゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて細胞培養した時の細胞播種直後の倒立顕微鏡観察写真（２０倍）を示し、図１１に同培養７日目の倒立顕微鏡観察写真（２０倍）を示した。図１０及び図１１から分かるように、実施例４のゼラチン長繊維不織布製の足場は、培養液中で透明で、細胞培養の様子が観察できた。また、細胞播種後は、ゼラチン長繊維の交点に細胞接着が見られ、培養７日目には繊維間隙を細胞が覆い尽くした。一方、比較例１のゼラチンスポンジの足場を用いた比較例Ａ１（図１２）、比較例２のポリプロピレン不織布製の足場を用いた比較例Ａ２（図１３）、比較例３のポリ乳酸不織布製の足場を用いた比較例Ａ３で（図１４）は、細胞培養時に光が足場を透過せず、細胞の状態を観察できなかった。実施例で得られたゼラチン長繊維不織布を用いた足場は、細胞培養しながら細胞形態の観察が可能であるため、研究用途に使いやすいことが確認できた。
（２）細胞数
表２及び図２０に実施例２で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場及び実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用いた場合の細胞増殖データのデータを示す。実施例４のゼラチン長繊維不織布製の足場を用いた場合は、培養７日目で、細胞播種後の約３．５倍、培養１４日目で細胞播種後の約８．２倍、培養２１日目で細胞播種後の約１９．５倍に細胞増殖した。
【0059】
【表2】
【0060】
（３）足場内の細胞分布図１５に、実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて８日間細胞培養した後の足場切片のヘマトキシリンエオジン染色し、光学顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察した写真をソフトウェア上で連結）を示し、図１６にその部分拡大写真（１０倍）を示した。図１５及び図１６から明らかなように、本発明の実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場不織布製の足場を用いて細胞培養した時、足場の内部まで、細胞が侵入していた。一方、比較例２のポリプロピレン不織布製の足場を用いた比較例Ａ２では、細胞侵入は足場の外側までであった（図１７：倍率４の写真）。図１５〜１７において、濃色に見える部分は細胞核である。
（４）足場内の酸素分圧
図１８に、実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて１２日間細胞培養を行った時の足場の光学顕微鏡観察写真（２０倍）を示した。図１９に、実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて細胞培養を１２日間行った後の足場内の酸素状態を低酸素マーカーによって観察した蛍光観察顕微鏡写真（明度の高い部分（白色に近い部分）：低酸素部位）（２０倍）を示した。実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場は、図１８の光学顕微鏡観察写真で繊維と同定できる部位にて、低酸素マーカーによる蛍光強度が弱いことから（図１９）、繊維内を酸素が拡散していることが確認できた。本発明の実施例で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場は、構成繊維が部分的に溶着し、水に濡れてもへたらないことから、酸素がゼラチン長繊維不織布製の足場全体に行きわたり、立体足場として有用であった。
【0061】
（実施例Ａ３）本実施例は、撹拌培養による細胞培養試験の例である。
１．試験の内容
（１）ゼラチン長繊維不織布の作製
実施例５で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場（乾燥時の厚さ１．６ｍｍ、密度０．４４ｇ／ｃｍ3、直径４ｍｍ）を用いて撹拌培養による細胞培養を行った。
（２）細胞培養
上記で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用い、上述の静置培養と同様の細胞播種方法にて、細胞播種した。図２１に示す装置を用いて、細胞播種したゼラチン長繊維不織布製の足場２６を、２２ゲージの滅菌針２５に複数個刺し、足場２６間の距離が２ｍｍとなるよう調整した。ゼラチン長繊維不織布製の足場２６を刺した２２Ｇ針２５をスピナーフラスコ２１の上部のゴム栓に刺し、固定した。ゼラチン長繊維不織布製の足場が浸るまで、液体培地を加え、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中に置いたマグネティックスターラー上で、１００ｒｐｍで撹拌し、培養液を撹拌させた。３〜４日毎に、液体培地を半分量除き、等量の新たな液体培地を加えることで、培地交換を行った。
（３）細胞生死の確認
培養中の足場を、リン酸緩衝液で洗浄した。リン酸緩衝液に、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）０．７５μＬ／ｍＬ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）２μＬ／ｍＬとなるよう、溶液を調整した。２４ウェルプレート中に置いた足場に、上記溶液を１ｍＬ加え、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、溶液を除去し、リン酸緩衝液を１ｍＬ加え、３７℃で５分間インキュベートすることで、洗浄した。洗浄後の足場を、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン社）で包埋後、凍結状態で、円柱状の足場の直径と垂直方向に、切片を作製した。蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス製、型番「ＢＺ−Ｘ７１０」）を用い、生細胞をＥｘ：４７０ｎｍ、Ｅｍ：５２５ｎｍ、死細胞をＥｘ：５４５ｎｍ、Ｅｍ：６０５ｎｍで蛍光観察した。
（４）脱細胞処理
培養した足場をリン酸緩衝液で洗浄し、３７℃の、０．２ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウムを含んだ３０ｍＭの塩化ナトリウム―クエン酸（ＳＳＣ）溶液３００μＬ中で、２４時間、３００ｒｐｍで撹拌し、細胞を抽出し、脱細胞処理を行った。
（５）細胞分布
撹拌培養後の足場及び脱細胞処理を行った足場を、リン酸緩衝液で洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、さらにリン酸緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン社）で包埋後、凍結状態で、円柱状の足場の直径と垂直方向になるように、切片を作製した。凍結切片をヘマトキシリンエオジン染色し、足場内の細胞分布の仕方を光学顕微鏡（株式会社キーエンス製、型番「ＢＺ−Ｘ７１０」）で観察した。
（６）足場の強度測定
細胞培養後の足場及び脱細胞処理後の足場の直径を計測し、（株）山電製のクリープメータ物性試験システムＲＥ２−３３００５Ｃにて、厚さを測定し、φ４０ｍｍのプランジャーを用い、０．０５ｍｍ／ｓｅｃの速度で圧縮した。ひずみ１〜５％の圧縮弾性率（ｋＰａ）及び、ひずみ１０％、２０％、３０％の中間圧縮応力（ｋＰａ）を測定した。また無荷重時（ひずみ０％）を基準とし、圧縮応力１ｋＰａ時のひずみを寸法変化率とした。
【0062】
２．結果（１）撹拌培養による足場形状の変化
培養日時の経過により、ゼラチン長繊維不織布製の足場の形状が変化した。図２２に、培養中の足場を、横方向からデジタルカメラで撮影した写真を示した。図２３に、培養後、足場一つ分を切り出した、細胞足場の外観写真を示した。図２４に、脱細胞処理した細胞足場の写真を示した。撹拌培養により、ゼラチン長繊維不織布製の足場は、培養７日目で、ゼラチン長繊維不織布製の足場の角が取れ、１４日目以降で直径が小さくなり、白く濁った。培養２５日目には、２ｍｍ間隔で針に配置した足場同士が繋がり、一体となった。細胞培養後の足場は、脱細胞処理を行っても形状を維持していた。
（２）細胞の分布
図２５に、実施例Ａ３において、１４日間撹拌培養した後の足場の切片（足場断面）をヘマトキシリンエオジン染色し、光学顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。図２６に、その端部における部分拡大写真（２０倍）を示した。図２５及び２６から明らかなように、細胞が足場内部まで侵入しており、特に足場の端部では、細胞がより高密度に増殖していた。図２５、２６において、濃色に見える部分は細胞核である。
図２７に、実施例Ａ３において、１４日間撹拌培養後、脱細胞処理した後の足場の切片をヘマトキシリンエオジン染色し、端部を光学顕微鏡で観察した（２０倍）を示した。細胞が高密度で増殖した足場端部では、足場を取り除いた後も、ゼラチン繊維間に組織が残存しており、細胞が細胞外マトリクスを産生していることが分かった。
図２８に、実施例Ａ３において、２５日間撹拌培養した後の足場の切片をヘマトキシリンエオジン染色し、光学顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。図２９に、その端部における部分拡大写真（２０倍）を示した。図２８及び２９から明らかなように、細胞が組織中心部まで高密度に増殖した。図２８、２９において、濃色に見える部分は細胞核である。
図３０に、実施例Ａ３において、２５日間撹拌培養後、脱細胞処理した後の足場の切片をヘマトキシリンエオジン染色し、光学顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。図３１に、その端部及び中心部における部分拡大写真（２０倍）を示した。図３０及び３１より明らかなように、培養２５日目には、ゼラチン繊維が見られず、細胞外マトリクスのみが見られるため、細胞が高密度に凝集する中で、ゼラチン長繊維不織布が分解し、細胞が産生した細胞外マトリクスとすべて置き換わったことが分かった。
（３）細胞生死
図３２に、実施例Ａ３において、１４日間撹拌培養した後の足場の切片の生細胞を蛍光顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。生細胞部位にて、蛍光強度が強いため、明度の高い部位（白色に近い部位）が、生細胞である。
図３３に、実施例Ａ３において、１４日間撹拌培養した後の足場の切片の死細胞を蛍光顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。死細胞部位にて、蛍光強度が強いため、明度の高い部位（白色に近い部位）が、死細胞部位である。
図３２〜３３より明らかなように、ゼラチン長繊維不織布内部では、生細胞が多くみられ、死細胞がほぼ見られない。ゼラチン長繊維不織布を細胞培養足場とすることで、３次元の細胞凝集体においても、組織中心部で細胞が、高い生存率を示すことが分かった。
図３４に、実施例Ａ３において、２５日間撹拌培養した後の足場の切片の生細胞を蛍光顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍）で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。生細胞部位にて、蛍光強度が強いため、明度の高い部位（白色に近い部位）が、生細胞である。
図３５に、実施例Ａ３において、２５日間撹拌培養した後の足場の切片の死細胞を蛍光顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。死細胞部位にて、蛍光強度が強いため、明度の高い部位（白色に近い部位）が、死細胞部位である。
図３４及び３５より明らかなように、ゼラチン長繊維不織布が消失し、細胞と細胞外マトリクスで構成される組織と置き換わった後においても、細胞組織内部では、生細胞が多くみられ、死細胞がほぼ見られなかった。ゼラチン長繊維不織布を足場として細胞培養した時、ゼラチン長繊維不織布が、直径２ｍｍ以上と大きく、かつ高密度の３次元細胞凝集体と置き換わったあとも、高い生存率を示すことが分かった。
（４）足場の強度測定
実施例Ａ３において、撹拌培養した後の足場及び、脱細胞処理した足場の力学特性を表３に示した。ゼラチン長繊維不織布を用い、撹拌培養することで、１-５％弾性率及び中間応力は、いずれも上昇した。ゼラチン長繊維不織布の空隙内、細胞が密に増殖していくことで、強度が向上した。さらにこれらの力学挙動は、脱細胞処理した足場においても、同傾向であり、細胞が産生した細胞外マトリクスが、ゼラチン長繊維不織布の空隙内を満たすことによって、強度が向上した。特に、培養２５日目においては、ゼラチン長繊維不織布が消失し、細胞及び細胞外マトリクスのみからなる細胞凝集体となっているにも関わらず、高強度となっており、細胞が産生した細胞外マトリクスには、エラスチンなどの弾性線維が含まれており、よりヒトの生態環境に近い細胞凝集体となっていると期待できる。
【0063】
【表3】
【0064】
本実施例のゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて撹拌下で細胞培養した結果から、次のことが分かる。（１）培養２５日の短期で、大きさ２ｍｍ以上の３次元細胞凝集体が得られ、その凝集体内部で、細胞は高生存率であった。
（２）得られた３次元細胞凝集体では、ゼラチン長繊維不織布が消失し、細胞及び細胞が産生する細胞外マトリクスと置き換わっていた。
（３）得られた３次元細胞凝集体は、高強度を示した。
【0065】
（実施例Ａ４）本実施例は、積層培養による細胞培養試験の例である。実施例６で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場（乾燥時の厚さ０．２ｍｍ、密度０．８ｇ／ｃｍ3、直径６ｍｍ）を用いて細胞の静置培養を行った。
【0066】
１．細胞培養（１）ゼラチン長繊維不織布製の足場と細胞シートの交互積層
（ａ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、液体培地中（ウシ胎児血清１０質量％、ペニシリンストレプトマイシン１質量％を含むαＭＥＭ培地）に、２．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう懸濁し、細胞懸濁液を準備した。
（ｂ）１２穴のウェルプレートに液体培地を１ｍＬ加え、そこに細胞懸濁液を５０μＬ播種し、１０日間静置培養して細胞シートを作製した。
（ｃ）１０００ｍＬのマイクロピペットを用い、液流によって細胞シートを１２穴のウェルプレートから剥離した。
（ｄ）エチレンオキサイドガス滅菌後のゼラチン長繊維不織布製の足場を、液体培地に３０分間静置して、十分に膨潤させた。
（ｄ）ウェルプレートの培地を抜き、細胞シートの上に膨潤させたゼラチン長繊維不織布製の足場を置いた。ゼラチン長繊維不織布製の足場の上から圧力１．３ｋＰａの圧力をかけて、細胞シートとゼラチン不織布を接着させた。
（ｅ）ピンセットを用いて、同様にして作製した細胞シート・ゼラチン長繊維不織布製の足場の一体物を３層積層させて（図３６−ｆ）、温度３７℃、５％ＣＯ2の条件で６０分間インキュベートして、層同士を接着し一体化した。
（２）積層体の上面の観察
積層後の足場と細胞シートの積層体を、光学顕微鏡（株式会社キーエンス製、型番「ＢＺ−Ｘ７１０」）で観察し、撮影した。
（３）積層体の断面の観察
積層体をリン酸緩衝液で洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、さらにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。洗浄後、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン社）で包埋後、凍結状態で、円柱状の足場の直径と垂直方向に、切片を作製した。凍結切片をヘマトキシリン・エオジン染色し、足場内の細胞分布の仕方を光学顕微鏡（株式会社キーエンス製、型番「ＢＺ−Ｘ７１０」）で観察した。
【0067】
２．結果（１）積層体の観察
図３９に、積層体を上面から観察した顕微鏡写真（４倍）を蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス製、型番「ＢＺ−Ｘ７１０」）のソフトウェア上で連結し、全体像としたものを示した。細胞シートがゼラチン不織布の上面にシワなく重なっていることが確認できた。
図４０にゼラチン長繊維不織布と細胞シートを３層交互に積層した積層体の断面図の顕微鏡写真を示した。ヘマトキシリン・エオジンによって染色された細胞核と細胞質が線状にみられることから、細胞シートの存在が確認できた。また、その細胞シートが一定の間隔を置いて３層みられた。その間隔は膨潤したゼラチン長繊維不織布の厚さ（約０．７ｍｍ）と同等であり、ゼラチン長繊維不織布と細胞シートが交互積層していることが確認できた。
【0068】
（実施例Ｂ１）異なる厚さ（乾燥状態）及び密度（乾燥状態）のゼラチン長繊維不織布を用いて、積層用足場に好ましいゼラチン長繊維不織布を検討した。ハンドリグ性が良好というのは、液体培地で膨潤した後の足場をピンセットで把持した際に形状維持性は良好であるとともに、屈曲しにくいことを意味する。例えば、図５〜８及び図３７は、水又は液体培地で膨潤した後の足場をピンセットで把持した際に形状維持性が良好であとともに、屈曲していない例である。一方、図３８には、ピンセットで把持した際に形状維持性が良好であるが、屈曲している例を示した。ゼラチン長繊維不織布製の足場のハンドリング性を片持ち梁で評価した。直方体の台を試験台とした。片持ち梁となるように、試験片の面積の半分が台座から出るように、台座の端に試験片を置いた。試験片の俯角を測定して４５度以内であればハンドリング性良好（Ａ）、４５度より大きければハンドリング性不良（Ｂ）と判断した。片持ち梁試験において、ハンドリング性良好の例を図４１に示し、ハンドリング性不良の例を図４２に示した。ハンドリング性の結果を図４３に示した。図４３から、ゼラチン長繊維不織布製の足場を液体培地で膨潤させてピンセットで把持する際に、膨潤する前の乾燥状態の厚さが０．２ｍｍ以上、密度は０．８ｇ／ｃｍ3以上が好ましいことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【0069】
本発明の生体適合長繊維不織布は、細胞培養用立体足場に好適であるほか、様々な医療用途にも適用できる。【符号の説明】
【0070】
１ 加温槽２ 紡糸液
３ ノズル吐出口
４，６ コンプレッサー
５ 流体噴射口
７ 圧力流体
８ 長繊維
９ 長繊維不織布
１０ 不織布製造装置
１１ 巻き取りロール
１２ 保温容器
２０ 撹拌培養試験装置
２１ スピナーフラスコ
２２ 攪拌棒
２３ 攪拌子
２４、３０ 液体培地
２５ ２２ゲージ針
２６、３４ 足場
３１ 培養皿
３２ 細胞懸濁液
３３ 細胞シート
３５ 圧力
【要約】
本発明は、生体適合ポリマーを主成分とする生体適合長繊維不織布であって、生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、長さ方向で繊維直径が変化しており、かつ繊維交点が少なくとも部分的に溶着しており、水に濡れてもへたらず、水に濡れると透明になる生体適合長繊維不織布に関する。前記生体適合長繊維不織布は、生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口３から空気中に押し出し、ノズル吐出口３の後方に位置し、ノズル吐出口３とは非接触状態の流体噴射口５から前方に向けて圧力流体７を噴射し、押し出された紡糸液を圧力流体７に随伴させて繊維形成させ、前記繊維形成した長繊維８を集積させて長繊維不織布９とすることで作製することができる。これにより、医療用及び細胞培養の足場等に有用な成形性と成形安定性の高い生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法を提供する。