特許 6453243 ホモシスチン尿症を処置するためのシスタチオニンβ−シンターゼ酵素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6453243

(24)【登録日】2018年12月21日

(45)【発行日】2019年1月16日

(54)【発明の名称】ホモシスチン尿症を処置するためのシスタチオニンβ−シンターゼ酵素

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/00 20060101AFI20190107BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20190107BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20190107BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20190107BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20190107BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20190107BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20190107BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20190107BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190107BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20190107BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/00ZNA

   A61K38/43

   A61P25/00

   A61P19/10

   A61P27/02

   A61P9/10 101

   A61P11/00

   A61P19/00

   A61P43/00 111

   !C12N15/52 Z

【請求項の数】25

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2015-555429(P2015-555429)

(86)(22)【出願日】2014年1月29日

(65)【公表番号】特表2016-506727(P2016-506727A)

(43)【公表日】2016年3月7日

(86)【国際出願番号】US2014013602

(87)【国際公開番号】WO2014120770

(87)【国際公開日】20140807

【審査請求日】2016年12月19日

(31)【優先権主張番号】61/758,138

(32)【優先日】2013年1月29日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13/803,804

(32)【優先日】2013年3月14日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】308032460

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】クラウス， ジャン ピー．

(72)【発明者】

【氏名】マジタン， トーマス

(72)【発明者】

【氏名】バブリル， エレス

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００３／１０６９７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 MILTON HARRIS J，NATURE REVIEWS. DRUG DISCOVERY，英国，NATURE PUBLISHING GROUP，２００３年 ３月 １日，V2 N3，P214-221

【文献】 Biochemistry, 2006年，Vol.45，p.11021-11029

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

Ａ６１Ｋ ３８／４３

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ａ６１Ｐ １１／００

Ａ６１Ｐ １９／００

Ａ６１Ｐ １９／１０

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ２７／０２

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ１２Ｎ １５／５２

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）カルボキシル末端短縮を含む、配列番号０２またはそのホモログの短縮型アミノ酸配列であって、該短縮は、アミノ酸残基４１４〜５５１、４４２〜５５１、４８９〜５５１、４９７〜５５１、５２４〜５５１、５３４〜５５１もしくは５４４〜５５１のいずれかである、短縮型アミノ酸配列と；
（ｂ）配列番号０２またはそのホモログのアミノ酸配列のアミノ酸１５位のシステインからセリンへの変異と
を含む、単離されたシスタチオニン−β−シンターゼ（ＣＢＳ）ポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、１つまたは複数のポリエチレングリコール分子に共有結合されている、単離されたシスタチオニン−β−シンターゼ（ＣＢＳ）ポリペプチド。

【請求項2】

前記短縮は、カルボキシル末端アミノ酸残基４１４〜５５１の欠失を含む、請求項１に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。

【請求項3】

アミノ末端アミノ酸残基２〜３９もしくは１〜７０の欠失から選択される遺伝子操作された短縮をさらに含む、請求項１〜２のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。

【請求項4】

前記単離されたＣＢＳポリペプチドは配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。

【請求項5】

前記ポリエチレングリコール分子は、分子量２０００ダルトン以上を有する、請求項１に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。

【請求項6】

前記ポリエチレングリコール分子は、５〜８０ｋＤの範囲の分子量を有する、請求項５に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。

【請求項7】

前記ポリエチレングリコール分子は、１０〜４０ｋＤの範囲の分子量を有する、請求項５に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。

【請求項8】

前記ポリエチレングリコール分子は、ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−０２０ＭＡ、ＭＥ−４００ＭＡ、ＧＬ２−４００ＭＡ、ＧＬ４−４００ＭＡ、ＧＬ２−８００ＭＡ、ＭＥ−０５０ＧＳ、ＭＥ−２００ＧＳ、ＭＥ−２００ＡＬもしくはＭＥＰＡ−２０Ｔである、請求項５に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。

【請求項9】

前記ポリエチレングリコール分子は、ＮＨＳ、アミン、およびモノアルデヒドからなるアルデヒド、モノ酸のモノエステル、モノアミン、モノチオール、モノジスルフィド、モノブロモフェニルカーボネート、モノクロロフェニルカーボネート、モノフルオロフェニルカーボネート、モノニトロフェニルカーボネート、モノカルボニルイミダゾール、モノヒドラジド、モノヨードアセトアミド、モノマレイミド、モノオルトピリジルジスルフィド、モノオキシム、モノフェニルグリオキサール、モノチアゾリジン−２−チオン、モノチオエステル、モノトリアジンならびにモノビニルスルホンからなる群より選択される結合基によって、前記単離されたＣＢＳポリペプチドに結合される、請求項５〜８のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。

【請求項10】

前記単離されたＣＢＳポリペプチドは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）の非存在下で活性である、請求項１〜９のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。

【請求項11】

治療上有効量の請求項１〜１０のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチド、またはそのホモログおよび薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤を含む、薬学的組成物。

【請求項12】

前記組成物が、前記組成物の投与の２４時間後に、最初の活性のうちの７０％以上を保持する、請求項１１に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

前記組成物は、埋込型浸透圧ポンプ、静脈内注射、皮下注射、もしくは腹腔内注射による投与のために製剤化されている、請求項１１に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

前記組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される適切な用量である、請求項１３に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

前記組成物を個体に投与することが、シスタチオニンもしくはシステインの上昇を必要とする前記個体においてシスタチオニンもしくはシステインを上昇させる、請求項１１に記載の薬学的組成物。

【請求項16】

前記組成物は、抗凝固剤、スタチン、もしくは緩やかなタンパク質制限食、アネトールジチオールチオン（ａｎｅｔｈｏｌｅ ｄｉｔｈｉｏｌｅｔｈｉｏｎｅ）もしくはベタインのうちの１種以上と一緒の投与のために製剤化されている、請求項１５に記載の薬学的組成物。

【請求項17】

前記組成物は、埋込型浸透圧ポンプ、静脈内注射、皮下注射、もしくは腹腔内注射による投与のために製剤化されている、請求項１５に記載の薬学的組成物。

【請求項18】

前記単離されたＣＢＳポリペプチドは、最大２０ｍｇ／ｋｇまでの適切な用量である、請求項１５〜１７のいずれかに記載の薬学的組成物。

【請求項19】

上昇したホモシステイン、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびＳ−アデノシルホモシステイン、ならびに低いシスタチオニンおよびシステインレベルと関連する疾患、障害、もしくは状態の処置もしくは改善における使用のための組成物であって、該組成物は、薬学的に有効な量の、請求項１〜１０のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチドを含む、医薬組成物。

【請求項20】

上昇したホモシステインと関連する前記疾患、障害、もしくは状態は、精神遅滞、骨粗鬆症、水晶体偏位、後側弯症、脳卒中、心筋梗塞、もしくは肺塞栓症である、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記組成物は、アネトールジチオールチオンもしくはベタインと一緒の投与のために製剤化されている、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記組成物が、１日に２回行われるベタイン投与と一緒の投与のために製剤化されている、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項23】

上昇したホモシステインと関連する疾患、障害、もしくは状態の予防における使用のための組成物であって、該組成物は、薬学的に有効な量の、請求項１〜１０のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチドを含む、医薬組成物。

【請求項24】

前記単離されたＣＢＳポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸１５位のシステインからセリンへの変更を含む、請求項８に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。

【請求項25】

単離されたヒト短縮化シスタチオニン−β−シンターゼ（ｈｔＣＢＳ）変異体ポリペプチドであって、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸１５位の変異を含み、前記単離されたｈｔＣＢＳ変異体ポリペプチドは、ＭＥ−０２０ＭＡ、ＭＥ−４００ＭＡ、ＧＬ２−４００ＭＡ、ＧＬ２−８００ＭＡ、ＧＬ４−４００ＭＡ、ＭＥ−０５０ＧＳ、ＭＥ−２００ＧＳ、ＭＥ−２００ＡＬおよびＭＥＰＡ−２０Ｔからなる群より選択される少なくとも１つのＰＥＧ分子でＰＥＧ化されている、単離されたヒト短縮化シスタチオニン−β−シンターゼ（ｈｔＣＢＳ）変異体ポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の引用）
この出願は、2013年１月２９日に出願された米国仮出願第61/758,138号および2013年３月１４日に出願された米国本出願第13/803,804号（これらの各々の開示は、参考として援用される）の利益を主張する。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、一般に、血清ホモシステイン（Ｈｃｙ）濃度を有意に低下させ得、かつシスタチオニンおよびシステインのような下流代謝産物の生成を増大させ得るヒトシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）の形態を含む、酵素補充療法に適した組成物に関する。このような組成物は、ホモシスチン尿症およびホモシステイン再メチル化障害のような状態もしくは疾患の処置のために使用され得る。

【背景技術】

【0003】

（発明の背景）
ＣＢＳは、含硫置換基移動経路における中心的な酵素であり、真核生物におけるホモシステイン（Ｈｃｙ）代謝に必須の役割を果たす（Ｍｕｄｄら、２００１， ｉｎ Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， ８ Ｅｄ．， ｐｐ． ２００７−２０５６， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。上記ＣＢＳ酵素は、セリンおよびホモシステインのピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ；ビタミンＢ_６）依存性縮合を触媒して、シスタチオニンを形成し、次いで、上記シスタチオニンは、別のＰＬＰ依存性酵素、シスタチオニンγ−リアーゼによってシステインを生成するために使用される。ある種の遺伝的変異の結果として、ＣＢＳ活性が劇的に低下しているかもしくは存在しない場合、Ｈｃｙは、組織および血中に蓄積する。含硫置換基移動経路を有する哺乳動物細胞では、ＣＢＳは、Ｈｃｙからメチオニンへの再メチル化、またはシステインの生合成におけるもう１つの使用の間で重要な調節的位置を占める。

【0004】

健康な正常個体では、ＨｃｙからシスタチオニンへのＣＢＳ媒介性変換は、システイン（Ｃｙｓ）へのメチオニン（Ｍｅｔ）代謝の律速的な中間工程である。ビタミンＢ_６は、このプロセスに必須の補酵素である。ＣＢＳ酵素においてある種の遺伝的変異を有する個体では、Ｈｃｙからシスタチオニンへの変換は、遅いかもしくは存在せず、酵素基質（Ｈｃｙ）の血清濃度の上昇およびその酵素生成物（シスタチオニン；Ｃｔｈ）の血清濃度の対応する減少を生じる。Ｈｃｙの上昇した血清レベルの臨床状態、およびその付随した尿への排出は、まとめて、ホモシスチン尿症として公知である。

【0005】

ホモシスチン尿症の有病率に関する概算は、広く変動している。新生児スクリーニングのデータおよび臨床的確認から、１：２００，０００〜１：３３５，０００の生児出生の幅でもたらされる（Ｍｕｄｄら、２００１）。デンマーク、ドイツ、ノルウェイおよびチェコ共和国における新生児のＤＮＡスクリーニング研究からの近年の証拠から、真の発生率は、約１：６，０００程度の高さであり得ることが見出された（Ｇａｕｓｔａｄｎｅｓら、１９９９， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． １３４０：１５１３； Ｌｉｎｎｅｂａｎｋら、２００１， Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ． ８５：９８６； Ｒｅｆｓｕｍら、２００４， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ５０：３； Ｓｏｋｏｌｏｖａら、２００１， Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．１８：５４８）。さらに、近年の研究からは、ＣＢＳ欠乏ホモシスチン尿症（ＣＢＳＤＨ）個体は、精神系もしくは心血管系いずれかの合併症を併発しているが、代表的には診断の助けになる特徴的な結合組織欠損がないことに起因して、目下診断未確定であることが示された（Ｌｉ ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｔ， １９９９， Ｐａｔｈｏｌ． ３１：２２１； Ｌｉｎｎｅｂａｎｋら、２００３， Ｊ． Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌ． Ｄｉｓ． ２６： ５０９； Ｍａｃｌｅａｎら、２００２， Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ． １９：６４１）。ＣＢＳＤＨと関連する主な健康問題としては、以下が挙げられる：未処置のおよび部分的に処置した個体において高死亡率を生じる、血栓症への素因を有する心血管疾患；進行性近視および水晶体偏位を伴う視覚系に影響を及ぼす結合組織問題；マルファン体型、骨粗鬆症、および側弯症によって特徴付けられる骨格に影響を及ぼす結合組織問題；ならびに精神遅滞および発作を含む、中枢神経系問題。

【0006】

ＣＢＳ関連ホモシスチン尿症の治療的解決は、ＣＢＳ遺伝子に存在する変異のタイプに依存する。ＣＢＳ遺伝子の約１６０の病原性の変異が、今日までヒトにおいて同定されてきた。ＣＢＳＤＨと関連する病原性の変異の性質には、機能的三分法がある。変異の１つのグループは、「ピリドキシン応答性」として分類され、ここでは、ＣＢＳ酵素機能は、高用量ビタミンＢ_６治療によって回復され得る。この処置は有効であり得るが、これら個体における病的な事象を常に緩和するわけではなく、その事象のうちのいくつかは、時間を経ればこれら個体において起こりさえする。機能的変異の第２のグループは、Ｓ−アデノシルメチオニンによる翻訳後アップレギュレーションに応答するそれらの能力が欠損している「Ｃ末端ＣＢＳ変異体」によって代表される。このクラスの変異を有する個体は、通常、表現型のうちで精神遅滞および結合組織の側面を欠いている。このクラスは、４０歳齢を前に特発性の血栓性の事象の後に血漿Ｈｃｙレベルの測定をした後に検出される（Ｍａｃｌｅａｎら、２００２， Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．１９： ６４１−５５）。ＣＢＳＤＨ変異の最後のグループは、「古典的ホモシスチン尿症」であり、これは、上記疾患の最も重症の形態を表す。個体のこれら後者２つのグループに関しては、ビタミンＢ_６治療は、分離して、血清Ｈｃｙレベルを有効に下げない。

【0007】

ホモ接合性ＣＢＳ欠損症の病態生理は、疑いもなく複雑であるが、終末組織傷害の基本的煽動因子（ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｉｎｓｔｉｇａｔｏｒ ｏｆ ｅｎｄ−ｏｒｇａｎ ｉｎｊｕｒｙ）は、血清Ｈｃｙの極端な上昇であるというコンセンサスがある。Ｈｃｙの血中濃度および組織濃度の顕著な上昇の毒性は、多くの生物学的プロセスに影響を及ぼす、Ｈｃｙ自体のもしくはその代謝産物（例えば、Ｈｃｙ−チオラクトン）に由来する分子反応性および生物学的効果の結果として起こり得る（Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉら、２００８， ＦＡＳＥＢ Ｊ ２２： ４０７１−６）。慢性的血小板凝集における異常、血管パラメーターの変化、および内皮機能不全は、全て、ホモシスチン尿症を有する個体において説明されてきた。

【0008】

現在では、３つの処置選択肢が、ＣＢＳＤＨの処置に関して存在する：
１）ビタミンＢ_６応答性個体においてはビタミンＢ_６の薬理学的用量を使用するＣＢＳ活性のうちの残っている活性の増大；
２）Ｍｅｔの摂取を厳しく制限した食事によって血清Ｈｃｙを下げること；および
３）ＨｃｙからＭｅｔへのベタイン媒介性変換による解毒、従って、血清Ｈｃｙ濃度の低下。

【0009】

これら３つの治療の各々は、血清Ｈｃｙ濃度を低下させることを目的とする。ビタミンＢ_６非応答性ＣＢＳＤＨに罹患した個体の標準的処置は、代謝フォーミュラ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｏｒｍｕｌａ）およびＣｙｓ（これは、この状態においては条件付き必須アミノ酸となっている）を補充したＭｅｔ制限食からなる。肉、乳製品および天然タンパク質が高い他の食品の摂取は、禁止される。アミノ酸および微量栄養素を含むおいしくない合成の代謝フォーミュラを毎日摂ることが、続発性栄養失調を防止するために必要とされる。ベタイン（商品名：ＣＹＳＴＡＤＡＮＥ^ＴＭ， 別名：トリメチルグリシン）の補充はまた、標準治療である。ベタインは、肝臓においてベタイン−ホモシステインメチルトランスフェラーゼによって触媒されるＨｃｙからＭｅｔへの再メチル化のメチルドナーとして働く（Ｗｉｌｃｋｅｎら、１９８３， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３０９：， （８）， ４４８−５３）。食事のコンプライアンスは、一般に不十分であり、最適なケアおよび資源が提供される医療施設においてすら不十分であり、このノンコンプライアンスは、ホモシスチン尿症の生命を脅かす合併症の発生に関する重大な影響を有する。

【0010】

上記の節に記載される証拠は、以下の点でまとめられる：
・未処置のホモシスチン尿症は、血管構造、結合組織、および中枢神経系に高い割合で合併症を有する。
・血清Ｈｃｙを低下させる処置（例えば、厳しくＭｅｔを制限する食事およびベタイン）は、十分に実行されれば、関連する臨床的問題を減少させる。認知能力の改善は、乳児期における処置の開始を必要とする。
・食事に伴うコンプライアンスは、一様に不十分である。新生児期に治療を開始している個体では、コンプライアンスの喪失は青年期に起こる。新生児期の後に治療を開始している個体では、コンプライアンスは全年齢で実にひどい。現在の処置アプローチが極端に困難であることは、食事によって防止可能な生命を脅かす症状を経験し、それでもなおこの処置を厳守することはできない個体をみれば、最も容易に明白である。
・食事のコンプライアンスの失敗は、増大した血清Ｈｃｙ、致死的かつ身体を無能力にする（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｔｉｎｇ）事象を含む、血管組織および結合組織の合併症の再燃を引き起こし、重篤な副作用（例えば、脳浮腫（過剰な血清Ｍｅｔ濃度による）もしくは重篤な栄養失調（必須アミノ酸の欠如による）の危険がある。
・最も有効な治療ストラテジーは、ビタミンＢ_６応答性ホモシスチン尿症にピリドキシンを与える場合に明らかであるように、酵素活性を増大させることである。このストラテジーは、変異状態に起因して、ビタミンＢ_６非応答性個体では可能ではなく、これら個体における増大した酵素活性は、外因性酵素の送達、すなわち、酵素補充療法（ＥＲＴ）（ホモシスチン尿症を処置するために一度も試みられてこなかったストラテジー）に依存する。
・実証された効力のある上記３つの現在の処置ストラテジー：（１）ビタミンＢ_６応答性個体においてピリドキシンで酵素活性を増大させること；（２）Ｍｅｔ制限食によって蓄積している代謝産物を減少させること；および（３）ベタイン処置においてベタイン−ホモシステインメチルトランスフェラーゼの酵素活性による解毒、のうち、全ては、血漿中の総Ｈｃｙの低下が共通している（Ｗａｌｔｅｒ，ら、１９９８， Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １５７（Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｓ７１−６）。

【0011】

さらに、ヒト患者で使用される全ての現在の処置ストラテジー（ホモシスチン尿症の部分集合にのみ適しているＢ６補充を除く）に関して、ホモシステインの低下は、ＣｔｈもしくはＣｙｓの増大に付随しない。下流の代謝産物の欠損よりむしろ、過剰なＨｃｙが、臨床症状の原因であるということが未だ確立されていないので、ホモシステインを減少させることに制限される現在の治療は、強くかつ有効な処置選択肢を提供するには不十分であり得る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｇａｕｓｔａｄｎｅｓら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（１９９９）１３４０：１５１３

【非特許文献2】Ｌｉｎｎｅｂａｎｋら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．（２００１）８５：９８６

【非特許文献3】Ｒｅｆｓｕｍら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．（２００４）５０：３

【非特許文献4】Ｓｏｋｏｌｏｖａら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．（２００１）１８：５４８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

従って、ホモシスチン尿症を有する個体にとってより有効な処置ストラテジーが、当該分野で未だに必要である。

【課題を解決するための手段】

【0014】

（発明の要旨）
本明細書で示されるように、本発明は、ホモシスチン尿症を有する個体において血清Ｈｃｙを特に低下させるための組成物、具体的には、組成物および方法を提供する。メチオニンが挙げられるが、これに限定されない代謝産物（例えば、システインおよびシスタチオニン）の実質的に正常なレベルを回復させる組成物、具体的には、薬学的組成物もまた提供される。本明細書でより具体的に記載されるように、ホモシスチン尿症の酵素補充療法（ＥＲＴ）のための試薬および方法が提供され、ここで天然の酵素の改変形態が、インビボでの改善された安定性、活性、および医療的有用性を特に提供することによってその薬学的許容性を改善するために、組換え操作されている。

【0015】

第１の局面において、本発明は、配列番号０２を含む単離されたＣＢＳポリペプチドを提供し、ここで上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、化学的改変を含み、アミノ末端、カルボキシル末端、もしくはアミノ末端およびカルボキシル末端の両方において全長ヒトＣＢＳタンパク質の遺伝子操作された短縮物である。一実施形態において、本発明は、組換えヒトＣＢＳを構成するヒトＣＢＳの操作された改変体を提供し、ここでそのＣ末端調節領域は除去されている（例えば、ｒｈＣＢＳΔＣ−このｒｈＣＢＳΔＣは、カルボキシル末端において１３８残基が短縮化されており、全長タンパク質の５５１アミノ酸のうちのアミノ酸１〜４１３を含む）（配列番号３）。いくつかの実施形態において、上記ｒｈＣＢＳΔＣの種は変異されており、好ましい実施形態において、上記短縮型変異体ＣＢＳは、ｒｈＣＢＳΔＣ−Ｃ１５Ｓ（もしくは「Ｃ１５Ｓ」と省略され、このＣ１５Ｓは、カルボキシル末端において１３８残基が短縮されている；ｒｈＣＢＳΔＣと同じ）（配列番号１３）であり、ここで上記ＣＢＳアミノ酸配列中の１５位のシステイン残基は、セリンに変更されている。特定の実施形態において、本明細書で開示されるのは、化学的に、特に、Ｃ末端短縮型組換えヒトＣＢＳ（特に、ｒｈＣＢＳΔＣ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の共有結合によって改変されている短縮型組換えヒトＣＢＳの種を含む。これらＰＥＧ化された種は、それぞれ、ＰＥＧ−ｒｈＣＢＳΔＣもしくはＰＥＧ−Ｃ１５Ｓといわれる。本明細書に示されるように有用な、特に治療的に有用なこれら組成物（改変された組換え酵素）および方法は、ホモシスチン尿症を有する個体が、制限が非常に少ない食事（例えば、毎日、１ｋｇあたり２ｇ以上のタンパク質の摂取）を享受し、有意に低下したＨｃｙ血漿レベルおよび実質的に正常化した、メチオニンが挙げられるが、これに限定されない代謝産物レベル（例えば、システインおよびシスタチオニン）を有し、長期間の臨床的改善をもたらすことが可能である。

【0016】

本発明は、有利なことには、個体が、許容できないノンコンプライアンス率を有する極端な制限食を使用せずに、血清Ｈｃｙレベルの良好なコントロールを達成できる。上記短縮型の種、特に、変異されている（特に、上記Ｃ１５Ｓ変異体）か、ＰＥＧ化されているか、または変異されかつＰＥＧ化されている種の使用は、有利なことには、個体において改善された代謝が付随し得るので、有意に低下した血清Ｈｃｙ濃度と特に関連して、罹患率および死亡率の低下に反映されるように、臨床転帰が改善され得る。

【0017】

本明細書で開示されるように、上記Ｃ１５Ｓ変異ヒトＣＢＳ種は、有利なことには、インビボでの医療的有用性（例えば、検出可能なレベルの凝集なし）が有意に増大したコンホメーションをとっている。上記Ｃ１５Ｓ変異ヒトＣＢＳ種はまた、非常に再現性のある発現、精製、およびＰＥＧ化パターンを示し、上記Ｃ１５Ｓ変異は、凝集物の形成を低減するので、回収を改善することによって収量を改善し、より一貫性がありかつ再現性のあるＰＥＧ化を可能にする。これら局面は、インビボでの有用性という以前に、工程に特に関連する品質という点に関しても有用であり得る。

【0018】

本明細書で開示されるように、上記ＰＥＧ化した種は、有利なことには、非ＰＥＧ化短縮型改変体、特に、上記ｒｈＣＢＳΔＣもしくはＣ１５Ｓ種と比較して、増大したサイズを有する。ここで上記ＰＥＧ化した種は、クリアランスが低下しているか、もしくは遅くなっている。さらに、ＰＥＧでの化学的改変は、タンパク質の表面にある潜在的な免疫原性エピトープを隠し、タンパク質分解酵素が上記タンパク質に近づくのを妨げる。ＰＥＧ化はまた、有利なことには、上記ｒｈＣＢＳΔＣタンパク質の物理化学的特性を変化させ、従って、その有効性を顕著に減ずることなく、その生体分布、安定性、および溶解度を改変する。

【0019】

本発明のこれらおよび他の特徴ならびに利点は、添付の特許請求の範囲とともに、以下の発明の詳細な説明からより十分に理解される。特許請求の範囲は、そこでの記載によって定義されるのであって、本発明説明に示される特徴および利点の具体的な考察によって定義されるのではないことが注意される。

【0020】

以下の、本発明の実施形態の詳細な説明は、以下の図面とともに読まれる場合に、最も良く理解され得る。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
配列番号０２またはそのホモログ、改変体もしくは変異体を含む、単離されたシスタチオニン−β−シンターゼ（ＣＢＳ）ポリペプチドであって、ここで該単離されたＣＢＳポリペプチドは、化学的に改変されており、アミノ末端、カルボキシル末端もしくは、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方において、全長ヒトＣＢＳタンパク質の短縮を含む、単離されたシスタチオニン−β−シンターゼ（ＣＢＳ）ポリペプチド。
（項目２）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、Ｃ末端残基３８３〜５５１、３９７〜５５１、４１４〜５５１、４４２〜５５１、４８９〜５５１、４９７〜５５１、５２４〜５５１、５３４〜５５１もしくは５４４〜５５１の欠失である遺伝子操作された短縮物である、項目１に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目３）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、Ｃ末端残基４１４〜５５１の欠失を含む、項目２に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目４）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、Ｎ末端残基２〜３９もしくは１〜７０の欠失から選択される遺伝子操作された短縮物である、項目１〜３のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目５）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、アミノ酸１５位のシステインからセリンへの変更を含む、項目１に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目６）
アミノ酸１５位のシステインからセリンへの変更を含む上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、Ｃ末端残基３８３〜５５１、３９７〜５５１、４１４〜５５１、４４２〜５５１、４８９〜５５１、４９７〜５５１、５２４〜５５１、５３４〜５５１もしくは５４４〜５５１の欠失から選択される遺伝子操作された短縮物である、項目５に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目７）
アミノ酸１５位のシステインからセリンへの変更を含む上記単離されたＣＢＳポリペプチドはまた、Ｃ末端残基４１４〜５５１の欠失を含む（配列番号１３）、項目６に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目８）
配列番号０２もしくはそのホモログを含む単離されたＣＢＳポリペプチドであって、ここで該単離されたＣＢＳポリペプチドは、アミノ酸１５位のシステインからセリンへの変更を含み、該単離されたＣＢＳポリペプチドは、化学的に改変されている、単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目９）
上記ＣＢＳポリペプチドは、１つまたは複数のポリエチレングリコール分子に共有結合されている、項目１〜８のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目１０）
上記ポリエチレングリコール分子は、非分枝状および分枝状のポリエチレングリコールから選択される、項目９に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目１１）
上記ポリエチレングリコール分子は、分子量２０００ダルトン以上を有する、項目１０に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目１２）
上記ポリエチレングリコール分子は、５〜８０ｋＤの範囲の分子量を有する、項目１１に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目１３）
上記ポリエチレングリコール分子は、好ましくは、１０〜４０ｋＤの範囲の分子量を有する、項目１１に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目１４）
上記ポリエチレングリコール分子は、ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−０２０ＭＡ、ＭＥ−４００ＭＡ、ＧＬ２−４００ＭＡ、ＧＬ４−４００ＭＡ、ＧＬ２−８００ＭＡ、ＭＥ−０５０ＧＳ、ＭＥ−２００ＧＳ、ＭＥ−２００ＡＬもしくはＭＥＰＡ−２０Ｔである、項目１１に記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目１５）
上記ポリエチレングリコール分子は、ＮＨＳ、アミン、およびモノアルデヒドからなるアルデヒド、モノ酸のモノエステル、モノアミン、モノチオール、モノジスルフィド、モノブロモフェニルカーボネート、モノクロロフェニルカーボネート、モノフルオロフェニルカーボネート、モノニトロフェニルカーボネート、モノカルボニルイミダゾール、モノヒドラジド、モノヨードアセトアミド、モノマレイミド、モノオルトピリジルジスルフィド、モノオキシム、モノフェニルグリオキサール、モノチアゾリジン−２−チオン、モノチオエステル、モノトリアジンならびにモノビニルスルホンからなる群より選択される結合基によって、ＣＢＳに結合される、項目８〜１４のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目１６）
上記ＣＢＳポリペプチドは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）の非存在下で活性である、項目１〜１５のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチド。
（項目１７）
項目１〜１６のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチドを含み、治療上有効量の上記ポリペプチド、そのホモログ、改変体もしくは変異体および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤を含む、薬学的組成物。
（項目１８）
２４時間後に、投与された上記組成物の最初の活性のうちの７０％以上を保持する、項目１〜１７のいずれかに記載の薬学的組成物。
（項目１９）
２４時間後に、投与された上記組成物の最初の活性のうちの７０％以上を保持する、項目１７に記載の薬学的組成物。
（項目２０）
上記ＣＢＳポリペプチドは、１つまたは複数のポリエチレングリコール分子に共有結合される、項目１７〜１９のいずれかに記載の薬学的組成物。
（項目２１）
項目１〜２０のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチドの投与を含む、ホモシステインの減少を必要とする個体においてホモシステインを減少させるための方法。
（項目２２）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、埋込型浸透圧ポンプ、静脈内注射、皮下注射、もしくは腹腔内注射によって投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、皮下注射によって投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、埋込型浸透圧ポンプによって投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、一定量の該単離されたＣＢＳポリペプチドを含み、ここで０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇが投与される、項目２１〜２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
シスタチオニンもしくはシステインの上昇を必要とする個体においてシスタチオニンもしくはシステインを上昇させるための方法であって、該方法は、項目１〜２０のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチドの投与を含む、方法。
（項目２７）
抗凝固剤、スタチン、もしくは緩やかなタンパク質制限食、アネトールジチオールチオン（ａｎｅｔｈｏｌｅ ｄｉｔｈｉｏｌｅｔｈｉｏｎｅ）もしくはベタインのうちの１種以上の投与をさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、埋込型浸透圧ポンプ、静脈内注射、皮下注射、もしくは腹腔内注射によって投与される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、静脈内注射によって投与される、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、浸透圧ポンプによって投与される、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、一定量の該単離されたＣＢＳポリペプチドを含み、ここで最大２０ｍｇ／ｋｇまでが、必要とする個体に投与される、項目２６〜３０のいずれかに記載の方法。
（項目３２）
上昇したホモシステイン、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびＳ−アデノシルホモシステイン、ならびに低いシスタチオニンおよびシステインレベルと関連する疾患、障害、もしくは状態を処置もしくは改善するための方法であって、該方法は、薬学的に有効な量の、項目１〜２０のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチドを、処置もしくは改善を必要とする個体に投与する工程を含む、方法。
（項目３３）
上昇したホモシステインと関連する上記疾患、障害、もしくは状態は、精神遅滞、骨粗鬆症、水晶体偏位、後側弯症、脳卒中、心筋梗塞、もしくは肺塞栓症である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、一定量の該単離されたＣＢＳポリペプチドを含み、ここで最大２０ｍｇ／ｋｇまでが、非経口注射によって投与される、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、一定量の該単離されたＣＢＳポリペプチドを含み、ここで最大２０ｍｇ／ｋｇまでが、埋込型浸透圧ポンプによって投与される、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
アネトールジチオールチオンもしくはベタインの投与をさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
ベタイン投与は、１日に２回行う、項目３２に記載の方法。
（項目３８）
上昇したホモシステインと関連する疾患、障害、もしくは状態を予防するための方法であって、該方法は、薬学的に有効な量の、項目１〜２０のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチドを、予防を必要とする個体に投与する工程を含む、方法。
（項目３９）
上昇したホモシステインと関連する上記疾患、障害、もしくは状態は、精神遅滞、骨粗鬆症、水晶体偏位、後側弯症、脳卒中、心筋梗塞、もしくは肺塞栓症である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
上記単離されたＣＢＳポリペプチドは、一定量の該単離されたＣＢＳポリペプチドを含み、ここで最大２０ｍｇ／ｋｇまでが、必要とする個体に投与される、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
アネトールジチオールチオンもしくはベタインの投与をさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
ベタイン投与は、１日２回行われる、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
上昇したホモシステインと関連する疾患、障害、もしくは状態を処置もしくは改善するための医薬の製造のための、項目１〜２０のいずれかに記載の単離されたＣＢＳポリペプチドの使用。
（項目４４）
上昇したホモシステインと関連する上記疾患、障害、もしくは状態は、精神遅滞、骨粗鬆症、水晶体偏位、後側弯症、脳卒中、心筋梗塞、もしくは肺塞栓症である、項目４３に記載の使用。
（項目４５）
上記医薬は、アネトールジチオールチオンもしくはベタインをさらに含む、項目４３に記載の使用。
（項目４６）
緩やかなタンパク質制限食への制限をさらに含む、項目４３に記載の使用。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1-1】図１は、ｒｈＣＢＳΔＣ ＰＥＧ化後のインビボでの血漿酵素保持時間の増強に関する実験証拠を図示する。図１は、ｒｈＣＢＳΔＣおよびＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの１回の投与後の薬物動態プロフィールおよびインビボでのそれらの安定性に関する証拠を提供する。図１ａは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５ｍｇ／ｋｇ 体重のヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）を腹腔内（ＩＰ）経路、血管内（ＩＶ）経路もしくは皮下（ＳＱ）経路によって注射した実験の結果を示す棒グラフである。各々５匹のマウスの２つの実験群（１および２と表示される）を、各注射経路に使用した（合計ｎ＝３０）。各注射経路につき、血液を、注射後０時間、１時間、８時間および２４時間で群１から集め、注射後１時間、４時間、１０時間、および４８時間で、群２から集めた。血漿を、放射活性アッセイ（実施例１に記載されるとおり）を使用して、ＣＢＳ活性について分析した。図１ｂは、循環からのＣＢＳクリアランスを追跡する、図１ａに記載されるとおりの各群の２匹の代表的マウスに由来する血漿中のＣＢＳのウェスタンブロット分析の結果の写真である。１２％ ゲルでのＣＢＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ単離およびポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜へのウェスタンブロッティングの後に、この膜を、ウサギポリクローナル抗ｈＣＢＳ抗体、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した二次抗ウサギ抗体でプローブし、そのバンドを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔ＃ ３４０７７）で可視化した。図１ｃは、５ｍｇ／ｋｇ 体重のＭＥ０２０ＭＡ−もしくはＧＬ４−４００ＭＡ−ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣまたは非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣを、ＳＱ経路でマウスに注射した実験の結果を示す棒グラフである。ＭＥ０２０ＭＡは、ＭＥ０２０ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ＧＬ４−４００ＭＡは、ＧＬ４−４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ｒｈＣＢＳΔＣは、非改変ｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表す。各処置アームは、示された時点で、実施例２に記載されかつ図１Ａに示されるように、採血した５匹のマウスの２群からなった（合計３０匹のマウス）。血漿を、放射活性アッセイを使用して、ＣＢＳ活性に関して分析した。

【図1-2】図１は、ｒｈＣＢＳΔＣ ＰＥＧ化後のインビボでの血漿酵素保持時間の増強に関する実験証拠を図示する。図１は、ｒｈＣＢＳΔＣおよびＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの１回の投与後の薬物動態プロフィールおよびインビボでのそれらの安定性に関する証拠を提供する。図１ａは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５ｍｇ／ｋｇ 体重のヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）を腹腔内（ＩＰ）経路、血管内（ＩＶ）経路もしくは皮下（ＳＱ）経路によって注射した実験の結果を示す棒グラフである。各々５匹のマウスの２つの実験群（１および２と表示される）を、各注射経路に使用した（合計ｎ＝３０）。各注射経路につき、血液を、注射後０時間、１時間、８時間および２４時間で群１から集め、注射後１時間、４時間、１０時間、および４８時間で、群２から集めた。血漿を、放射活性アッセイ（実施例１に記載されるとおり）を使用して、ＣＢＳ活性について分析した。図１ｂは、循環からのＣＢＳクリアランスを追跡する、図１ａに記載されるとおりの各群の２匹の代表的マウスに由来する血漿中のＣＢＳのウェスタンブロット分析の結果の写真である。１２％ ゲルでのＣＢＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ単離およびポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜へのウェスタンブロッティングの後に、この膜を、ウサギポリクローナル抗ｈＣＢＳ抗体、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した二次抗ウサギ抗体でプローブし、そのバンドを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔ＃ ３４０７７）で可視化した。図１ｃは、５ｍｇ／ｋｇ 体重のＭＥ０２０ＭＡ−もしくはＧＬ４−４００ＭＡ−ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣまたは非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣを、ＳＱ経路でマウスに注射した実験の結果を示す棒グラフである。ＭＥ０２０ＭＡは、ＭＥ０２０ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ＧＬ４−４００ＭＡは、ＧＬ４−４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ｒｈＣＢＳΔＣは、非改変ｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表す。各処置アームは、示された時点で、実施例２に記載されかつ図１Ａに示されるように、採血した５匹のマウスの２群からなった（合計３０匹のマウス）。血漿を、放射活性アッセイを使用して、ＣＢＳ活性に関して分析した。

【図2】図２は、ＣＢＳ活性の安定なレベルが、反復ＳＱ投与後に達成されることを示す棒グラフである。ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣでの注射は、インビボでのＣＢＳ活性の増大を示したが、非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣでの注射はそうならなかった。ＧＬ４−４００ＭＡは、ＧＬ４−４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ｒｈＣＢＳΔＣは、非改変ｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５ｍｇ／ｋｇ 体重の非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣ（ｎ＝５）もしくはＧＬ４−４００ＭＡ ｒｈＣＢＳΔＣ（ｎ＝５）を０時間、２４時間、４８時間（矢印）で注射し、示された時点で採血した。血漿を、実施例１ｃに記載される放射活性得アッセイを使用して、ＣＢＳ活性について分析した。

【図3-1】図３は、ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの１回の注射が、血漿中で、ホモシステインを減少させシスタチオニンを増大させるという実験証拠を図示する。図３ａは、ｒｈＣＢＳΔＣのＰＥＧ改変が、活性化ＰＥＧの示されたタイプで改変されたｒｈＣＢＳΔＣの１回のＳＱ投与後に、ＣＢＳ酵素活性の全身の存在を長期化することを示すグラフである。このグラフは、２７匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを９つの実験群に分けた実験（ｎ＝３）の結果を示す。各実験群に、ＳＱ経路によって、５ｍｇ／ｋｇ 体重の、示されたＰＥＧ分子でＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣを注射したか、または非ＰＥＧ化酵素を注射した。ＭＥ０２０ＭＡは、ＭＥ０２０ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ＭＥ０５０ＧＳは、ＭＥ０５０ＧＳでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ＭＥ２００ＧＳは、ＭＥ２００ＧＳでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、２００ＭＡ０Ｂは、２００ＭＡ０ＢでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ＭＥ４００ＭＡは、ＭＥ４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ＧＬ２４００ＭＡは、ＧＬ２４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ＧＬ４４００ＭＡは、ＧＬ４４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ＧＬ２８００ＭＡは、ＧＬ２８００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ｒｈＣＢＳΔＣは、非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表す。血液サンプルを、示された時点で採取し、ＣＢＳ酵素活性を、実施例１ｃに記載されるとおりの放射活性アッセイを使用して決定した。データは、標準偏差（ＳＴＤ）付きのヒストグラムとして、および散布図として示される。

【図3-2】図３は、ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの１回の注射が、血漿中で、ホモシステインを減少させシスタチオニンを増大させるという実験証拠を図示する。図３ｂは、ＨＯマウス血漿中のＨｃｙ、Ｃｔｈ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔレベルにおける天然の日中変動を示す棒グラフである。その結果は、２４時間サイクル全体を通じて示された時点で血液を採取した６匹のＨＯマウスの平均値である（ホモシスチン尿症のＨＯマウスモデルは、Ｍａｃｌｅａｎら、２０１０， Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｍｅｔａｂ． １０１： １５３−６２に記載されるとおり）。血漿アミノ酸レベルを、実施例１ｅに記載されるとおりの各時点につき、Ｓｔａｂｌｅ−Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ-Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙによって決定した。図３ｃは、非ＰＥＧ化酵素（レーン４）とともに電気泳動によって分離し、クーマシーブルーで染色したＭＥ−４００ＭＡ（レーン１）、ＧＬ４−４００ＭＡ（レーン２）もしくはＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ（レーン３）でＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣの電気泳動分析の結果の写真である（Ｍは、分子量標準を示す）。ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの各々に関する比活性（Ｓ．Ａ．）は、表中に示される。

【図3-3】図３ｄおよび図３ｅは、ＨＯマウスに、示されたＰＥＧ分子でＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣを時間０で１回、ＳＱ経路によって注射し、時間０（注射前）、注射から２４時間後、４８時間後および７２時間後に採血した実験の結果を示す棒グラフである。上記群の各々（ｎ＝５〜６）に関する血漿ホモシステイン（ｄ）およびシスタチオニン（ｅ）のレベルを示す。図３Ｄおよび図３Ｅに関して、ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂは、ＭＥ−２００ＭＡ０ＢでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を示し、ＭＥ−４００ＭＡは、ＭＥ−４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を示し、ＧＬ４−４００ＭＡは、ＧＬ４−４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を示す。

【図4-1】図４は、ＣＢＳ処置の中止は、アミノ酸レベルが処置前のレベルに戻ることを許容し、ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの反復注射の再開は、ホモシステインおよびシスタチオニンの血漿レベルに対して有意に影響を及ぼし、正常のシステインレベルに回復するという実験証拠を図示する。６匹のＨＯマウスに、０日目、１日目、２日目、３日目および４日目に、ＧＬ４−４００ＭＡ ＰＥＧでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣを注射し、続いて、１０日間の休薬期間、その後、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目および１８日目に（矢印で示される）に再度注射した。血漿サンプルを、以下の日に（常に注射前に）採取した：０日目、２日目、４日目、５日目、１１日目、１４日目、１６日目、１８日目、１９日目、２４日目および３１日目。比較のために、同じ注射レジメンを、非ＰＥＧ化酵素が注射される５匹のＨＯマウスにおいて行った。血漿代謝産物レベルを、実施例１ｅに記載されるように決定した。各個々のＨＯマウスに関して、図４ａは、ホモシステインの結果を示すグラフであり、図４ｂは、シスタチオニン血漿濃度の結果を示すグラフである。図４ｃは、この研究全体を通じて処置したＨＯマウスに由来する血漿中のホモシステインおよびシスタチオニンの平均濃度を示すグラフである。図４ｄは、この研究全体を通じての、非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣと比較して（時間０のパーセンテージとして示される）、血漿ホモシステインレベルに対するＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの効果を示すグラフである。ＧＬ４−４００ＭＡは、ＧＬ４−４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ｒｈＣＢＳΔＣは、非改変ｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表す。図４ｅは、この研究全体を通じて、非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣと比較して、血漿システインレベルに対するＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの効果を示すグラフである。ＧＬ４−４００ＭＡは、ＧＬ４−４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ｒｈＣＢＳΔＣは、非改変ｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表す。

【図4-2】図４は、ＣＢＳ処置の中止は、アミノ酸レベルが処置前のレベルに戻ることを許容し、ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの反復注射の再開は、ホモシステインおよびシスタチオニンの血漿レベルに対して有意に影響を及ぼし、正常のシステインレベルに回復するという実験証拠を図示する。６匹のＨＯマウスに、０日目、１日目、２日目、３日目および４日目に、ＧＬ４−４００ＭＡ ＰＥＧでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣを注射し、続いて、１０日間の休薬期間、その後、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目および１８日目に（矢印で示される）に再度注射した。血漿サンプルを、以下の日に（常に注射前に）採取した：０日目、２日目、４日目、５日目、１１日目、１４日目、１６日目、１８日目、１９日目、２４日目および３１日目。比較のために、同じ注射レジメンを、非ＰＥＧ化酵素が注射される５匹のＨＯマウスにおいて行った。血漿代謝産物レベルを、実施例１ｅに記載されるように決定した。各個々のＨＯマウスに関して、図４ａは、ホモシステインの結果を示すグラフであり、図４ｂは、シスタチオニン血漿濃度の結果を示すグラフである。図４ｃは、この研究全体を通じて処置したＨＯマウスに由来する血漿中のホモシステインおよびシスタチオニンの平均濃度を示すグラフである。図４ｄは、この研究全体を通じての、非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣと比較して（時間０のパーセンテージとして示される）、血漿ホモシステインレベルに対するＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの効果を示すグラフである。ＧＬ４−４００ＭＡは、ＧＬ４−４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ｒｈＣＢＳΔＣは、非改変ｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表す。図４ｅは、この研究全体を通じて、非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣと比較して、血漿システインレベルに対するＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの効果を示すグラフである。ＧＬ４−４００ＭＡは、ＧＬ４−４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ｒｈＣＢＳΔＣは、非改変ｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表す。

【図4-3】図４は、ＣＢＳ処置の中止は、アミノ酸レベルが処置前のレベルに戻ることを許容し、ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの反復注射の再開は、ホモシステインおよびシスタチオニンの血漿レベルに対して有意に影響を及ぼし、正常のシステインレベルに回復するという実験証拠を図示する。６匹のＨＯマウスに、０日目、１日目、２日目、３日目および４日目に、ＧＬ４−４００ＭＡ ＰＥＧでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣを注射し、続いて、１０日間の休薬期間、その後、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目および１８日目に（矢印で示される）に再度注射した。血漿サンプルを、以下の日に（常に注射前に）採取した：０日目、２日目、４日目、５日目、１１日目、１４日目、１６日目、１８日目、１９日目、２４日目および３１日目。比較のために、同じ注射レジメンを、非ＰＥＧ化酵素が注射される５匹のＨＯマウスにおいて行った。血漿代謝産物レベルを、実施例１ｅに記載されるように決定した。各個々のＨＯマウスに関して、図４ａは、ホモシステインの結果を示すグラフであり、図４ｂは、シスタチオニン血漿濃度の結果を示すグラフである。図４ｃは、この研究全体を通じて処置したＨＯマウスに由来する血漿中のホモシステインおよびシスタチオニンの平均濃度を示すグラフである。図４ｄは、この研究全体を通じての、非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣと比較して（時間０のパーセンテージとして示される）、血漿ホモシステインレベルに対するＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの効果を示すグラフである。ＧＬ４−４００ＭＡは、ＧＬ４−４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ｒｈＣＢＳΔＣは、非改変ｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表す。図４ｅは、この研究全体を通じて、非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣと比較して、血漿システインレベルに対するＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの効果を示すグラフである。ＧＬ４−４００ＭＡは、ＧＬ４−４００ＭＡでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表し、ｒｈＣＢＳΔＣは、非改変ｒｈＣＢＳΔＣ酵素を表す。

【図5】図５は、ヒト短縮型ＣＢＳ調製物（ｒｈＣＢＳΔＣ）の凝集の程度の変動性を示す。図５Ａは、ｒｈＣＢＳΔＣの種々のバッチ（１１２、１３、７、２７および２８）でのクーマシーブルー染色した４−１５％未変性ゲルである。ｒｈＣＢＳΔＣのテトラマー形態（Ｔ）とｒｈＣＢＳΔＣのダイマー形態（Ｄ）との間の種々の比、および凝集したＣＢＳのより高次の形態にも注意のこと。Ｍは、分子量マーカーを示す。図５Ｂは、図５Ａ中でｒｈＣＢＳΔＣバッチ１１２および２８に関して認められるバンドが、実際にＣＢＳ関連であることを示す、未変性ゲルのゲル中ＣＢＳ活性アッセイである。繰り返すと、ｒｈＣＢＳΔＣのテトラマー形態（Ｔ）とｒｈＣＢＳΔＣのダイマー形態（Ｄ）との間の種々の比、および凝集したＣＢＳのより高次の形態に注意のこと。図５Ｃは、ＰＥＧ化後に形成される２つのＰＥＧ化種の間で（ＰＥＧ化（＋）レーンにおいて）種々の比を示す２つの異なるｒｈＣＢＳΔＣバッチのＭＥ−２００ＭＡ０ＢでのＰＥＧ化（＋）を示す一方で、非改変ｒｈＣＢＳΔＣサブユニットのみが、ＰＥＧ試薬が添加されなかった場合に（非ＰＥＧ化（−）レーンに）存在するＳＤＳ ＰＡＧＥゲル（１２％）である。

【図6A】図６は、ヒトＣ１５Ｓ変異体ＣＢＳがダイマーを形成するのみであることを示す。図６Ａは、ダイマー（Ｄ）およびテトラマー（Ｔ）、ならびにより高次のオリゴマー形態を形成する組換えヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）とは対照的に、Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳが、ダイマーのみを形成することを示す未変性ゲルである。ＴＣＥＰ（還元剤）は、Ｃ１５Ｓ変異体のオリゴマー状態に影響を及ぼさない。Ｍは、分子量マーカーを示す。図６Ｂは、Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳの種々のバッチ（５１、６０および７３）を示す未変性ゲルであり、これは、ヒトＣ１５Ｓ変異体ＣＢＳが、ＰＥＧなし（−）およびＭＥ−２００ＭＡ０ＢでのＰＥＧ化の後（＋）のｒｈＣＢＳΔＣおよび組換えヒト二重短縮型（バッチＲＣ−２−７６；ｒｈＣＢＳΔＣの残基２〜３９のさらなる欠失を有する構築物）とは対照的に、ダイマーのみを再現可能に形成することを実証する。Ｃ１５Ｓもしくは二重短縮型構築物のいずれかのＰＥＧ化は、ｒｈＣＢＳΔＣとは対照的に、ＰＥＧ化バンド間での類似の比を有する均一かつ再現性のあるバンドを生じる。図６Ｃは、変性ＳＤＳ ＰＡＧＥを使用する以外は図６Ｂと同じである。Ｃ１５Ｓは、組換えヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）とは異なる再現性のあるＰＥＧ化パターンを生じる。これはまた、ｒｈＣＢＳΔＣでの再現性のないＰＥＧ化パターンを示す図５Ｃに匹敵する。

【図6B】図６は、ヒトＣ１５Ｓ変異体ＣＢＳがダイマーを形成するのみであることを示す。図６Ａは、ダイマー（Ｄ）およびテトラマー（Ｔ）、ならびにより高次のオリゴマー形態を形成する組換えヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）とは対照的に、Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳが、ダイマーのみを形成することを示す未変性ゲルである。ＴＣＥＰ（還元剤）は、Ｃ１５Ｓ変異体のオリゴマー状態に影響を及ぼさない。Ｍは、分子量マーカーを示す。図６Ｂは、Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳの種々のバッチ（５１、６０および７３）を示す未変性ゲルであり、これは、ヒトＣ１５Ｓ変異体ＣＢＳが、ＰＥＧなし（−）およびＭＥ−２００ＭＡ０ＢでのＰＥＧ化の後（＋）のｒｈＣＢＳΔＣおよび組換えヒト二重短縮型（バッチＲＣ−２−７６；ｒｈＣＢＳΔＣの残基２〜３９のさらなる欠失を有する構築物）とは対照的に、ダイマーのみを再現可能に形成することを実証する。Ｃ１５Ｓもしくは二重短縮型構築物のいずれかのＰＥＧ化は、ｒｈＣＢＳΔＣとは対照的に、ＰＥＧ化バンド間での類似の比を有する均一かつ再現性のあるバンドを生じる。図６Ｃは、変性ＳＤＳ ＰＡＧＥを使用する以外は図６Ｂと同じである。Ｃ１５Ｓは、組換えヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）とは異なる再現性のあるＰＥＧ化パターンを生じる。これはまた、ｒｈＣＢＳΔＣでの再現性のないＰＥＧ化パターンを示す図５Ｃに匹敵する。

【図6C】図６は、ヒトＣ１５Ｓ変異体ＣＢＳがダイマーを形成するのみであることを示す。図６Ａは、ダイマー（Ｄ）およびテトラマー（Ｔ）、ならびにより高次のオリゴマー形態を形成する組換えヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）とは対照的に、Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳが、ダイマーのみを形成することを示す未変性ゲルである。ＴＣＥＰ（還元剤）は、Ｃ１５Ｓ変異体のオリゴマー状態に影響を及ぼさない。Ｍは、分子量マーカーを示す。図６Ｂは、Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳの種々のバッチ（５１、６０および７３）を示す未変性ゲルであり、これは、ヒトＣ１５Ｓ変異体ＣＢＳが、ＰＥＧなし（−）およびＭＥ−２００ＭＡ０ＢでのＰＥＧ化の後（＋）のｒｈＣＢＳΔＣおよび組換えヒト二重短縮型（バッチＲＣ−２−７６；ｒｈＣＢＳΔＣの残基２〜３９のさらなる欠失を有する構築物）とは対照的に、ダイマーのみを再現可能に形成することを実証する。Ｃ１５Ｓもしくは二重短縮型構築物のいずれかのＰＥＧ化は、ｒｈＣＢＳΔＣとは対照的に、ＰＥＧ化バンド間での類似の比を有する均一かつ再現性のあるバンドを生じる。図６Ｃは、変性ＳＤＳ ＰＡＧＥを使用する以外は図６Ｂと同じである。Ｃ１５Ｓは、組換えヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）とは異なる再現性のあるＰＥＧ化パターンを生じる。これはまた、ｒｈＣＢＳΔＣでの再現性のないＰＥＧ化パターンを示す図５Ｃに匹敵する。

【図7A】図７は、ｒｈＣＢＳΔＣ（図７Ａ）およびＣ１５Ｓ変異体（図７Ｂ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す。図７は、Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳがダイマーとしてのみ存在するというさらなる指摘を提供する。なぜならそれは、５つの種々の精製バッチから再現性のある１つのピークを生じるからである（図７Ｂ）。図７ＡにおけるｒｈＣＢＳΔＣの６つの種々のパターンおよび図７ＢにおけるＣ１５Ｓ ＣＢＳの１つのピークに注意のこと。

【図7B】図７は、ｒｈＣＢＳΔＣ（図７Ａ）およびＣ１５Ｓ変異体（図７Ｂ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す。図７は、Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳがダイマーとしてのみ存在するというさらなる指摘を提供する。なぜならそれは、５つの種々の精製バッチから再現性のある１つのピークを生じるからである（図７Ｂ）。図７ＡにおけるｒｈＣＢＳΔＣの６つの種々のパターンおよび図７ＢにおけるＣ１５Ｓ ＣＢＳの１つのピークに注意のこと。

【図8】図８は、２匹のＨＯマウスでの２０日間にわたるＣ１５Ｓ変異体の連続投与が、血漿ホモシステインの有意なかつ持続した減少を生じることを示す。上記Ｃ１５Ｓ変異体酵素を、ＡＬＺＥＴ（登録商標）ポンプを使用して投与して、反復皮下注射の代わりに、上記酵素をマウスに連続送達した。ＡＬＺＥＴ（登録商標）ポンプ、Ｍｏｄｅｌ １００２（平均ポンプ流量０．２１μｌ／時間（ストック濃度２６．２ｍｇ／ｍＬについて）、平均充填容積１０６．６μｌ。上記マウスを、示された時点で採血し、血漿の単離後、Ｈｃｙを質量分析によって測定した。

【図9】図９は、ＨＯマウスに時間０で単一用量（７．５ｍｇ／ｋｇ）で、ＭＥ−２００ＭＡ０ＢでＰＥＧ化した、ｒｈＣＢＳΔＣ、Ｃ１５Ｓ変異体（Ｃ１５Ｓ）および二重短縮型構築物（二重短縮型）を注射した実験の結果を示す棒グラフである。上記マウスを、時間０（注射前）、注射して２４時間後、４８時間後および７２時間後に採血した。上記群の各々（ｎ＝５〜６）の血漿ホモシステインのレベルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

（詳細な説明）
本明細書で提供されるのは、ヒトシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）の、具体的には、薬学的組成物に適した形態、およびホモシスチン尿症を有する個体を、例えば、酵素補充療法（ＥＲＴ）によって処置するための方法である。

【0023】

ヒトＣＢＳをコードする核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｌ１９５０１を通じて入手可能であり、これら配列はまた、米国特許第５，５２３，２２５号（その全体において本明細書に参考として援用される）に開示されている。ＣＢＳのコード配列は、配列番号１として本明細書で表され、全長ヒトＣＢＳのアミノ酸配列であり、５５１アミノ酸残基を有する配列番号２をコードする核酸配列である。ＣＢＳをコードするゲノムＤＮＡの核酸配列はまた、配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）を通じて、Ｋｒａｕｓ Ｌａｂの下のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ−Ｄｅｎｖｅｒウェブページで公的に入手可能である。

【0024】

本明細書で使用される場合、シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質（ＣＢＳタンパク質）、特に、ヒトＣＢＳタンパク質の単離された短縮型バージョンとしては、精製された短縮型ＣＢＳタンパク質、化学的に切断されかつ組換え生成された短縮型ＣＢＳタンパク質、および他のタンパク質と会合した単離されたＣＢＳタンパク質が挙げられ得るが、これらに限定されない。より具体的には、単離されたタンパク質は、本発明によれば、その天然の環境から単離された（すなわち、ヒトによる操作に供された）タンパク質（ポリペプチドもしくはペプチドを含む）であり、例えば、精製タンパク質、部分精製タンパク質、組換え生成タンパク質、および合成により生成されたタンパク質を含み得る。よって、「単離された」とは、タンパク質が精製された程度を反映しない。本発明の単離された短縮型ＣＢＳタンパク質は、細胞（例えば、細菌細胞）において組換え生成され得る。さらに、および例示すると、「ヒト短縮型ＣＢＳタンパク質」とは、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）に由来する短縮型ＣＢＳタンパク質（本明細書で示されるとおり）またはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来する天然に存在するＣＢＳタンパク質の構造（例えば、配列）およびおそらく機能の知識から別の方法で生成されたＣＢＳタンパク質をいう。言い換えると、ヒト短縮型ＣＢＳタンパク質は、本明細書で詳細に記載されるように、生物学的に活性な短縮型ヒトＣＢＳタンパク質を含む。

【0025】

本明細書で使用される場合、用語「改変体」もしくは「変異体」は、天然に存在するタンパク質もしくはペプチド（すなわち、「プロトタイプ」もしくは「野生型」タンパク質）に対する変更によって、上記天然に存在するタンパク質もしくはペプチドとは異なるが、上記天然に存在する形態の基本的タンパク質および側鎖構造を維持するタンパク質もしくはペプチドをいうために使用される。このような変更としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１個、２〜３個、もしくはさらに数個のアミノ酸側鎖における変更；１個、２〜３個、もしくは数個のアミノ酸における変更（例えば、１５位のシステインをセリンに；Ｃ１５Ｓ）；１もしくは２〜３個の原子の立体化学の変更；ならびに／または小さな誘導体化（メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化（ｐａｌｍｉｔａｔｉｏｎ）、アミド化および／もしくはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加が挙げられるが、これらに限定されない）。「改変体」もしくは「変異体」は、上記天然に存在するタンパク質もしくはペプチドと比較して、増強したか、低下したか、変化したか、もしくは本質的に類似の特性を有し得る。特定の実施形態において、本発明は、上記天然に存在するＣＢＳタンパク質のＣ末端欠失を有する短縮型ＣＢＳタンパク質を提供する。

【0026】

本明細書で使用される場合、用語「ホモログ」もしくは「オルソログ」とは、先祖が共通しているタンパク質配列もしくはＤＮＡ配列をいい、異なる種において本質的に同じタンパク質もしくはＤＮＡ配列であり得る。ホモログおよびオルソログタンパク質および遺伝子は、しばしば、それぞれ、類似のアミノ酸およびヌクレオチド配列、または高い配列類似性を有する（例えば、相同なタンパク質は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上のアミノ酸配列類似性を有し得る）。

【0027】

本発明に従うＣＢＳのタンパク質発現レベルを測定するための方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：分離媒体（例えば、ゲル電気泳動）におけるタンパク質のクーマシーブルーもしくは銀染色、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、他の免疫学ベースのアッセイ；タンパク質の特性に基づくアッセイ（酵素アッセイ、リガンド結合もしくは他のタンパク質パートナーとの相互作用が挙げられるが、これらに限定されない）。結合アッセイはまた、当該分野で周知である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器は、２つのタンパク質の間の複合体の結合定数を決定するために使用され得る。上記複合体の解離定数は、緩衝液がチップの上を通り過ぎる時間に対する屈折率の変化をモニターすることによって決定され得る。１つのタンパク質への別のタンパク質の結合を測定するための他の適切なアッセイは、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のようなイムノアッセイ、または蛍光、ＵＶ吸収、円偏光二色性、もしくは核磁気共鳴（ＮＭＲ）を通じて上記タンパク質の分光特性もしくは光学特性の変化をモニターすることによる結合の決定が挙げられる。

【0028】

ある種の局面において、ＣＢＳ改変体は、本明細書または米国特許第７，４８５，３０７号および同第８，００７，７８７号（両方とも、本明細書に参考として援用される）に記載される、Ｎ末端欠失もしくは改変（例えば、Ｎ末端残基２〜３９もしくは１〜７０の欠失）とＣ末端欠失もしくは改変（例えば、Ｃ末端残基３８３〜５５１、３９７〜５５１、４１４〜５５１、４４２〜５５１、４８９〜５５１、４９７〜５５１、５２４〜５５１、５３４〜５５１もしくは５４４〜５５１の欠失）との任意の組み合わせを含み得る。別の実施形態において、さらなる改変は、野生型ＣＢＳ配列に対して所定の％同一性を提供するために、他のアミノ酸残基の改変によって達成され得る。特定の実施形態において、Ｃ末端調節領域が除去されている本発明のヒトＣＢＳ改変体は、短縮型組換えヒトＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）ホモダイマー酵素（配列番号３）である。他の実施形態において、本発明のヒトＣＢＳ改変体は、アミノ酸１５位のシステインがセリンに変異した（Ｃ１５Ｓ）ｒｈＣＢＳΔＣ（配列番号１３）である。

【0029】

本発明の他の実施形態において、本明細書に記載されるＣＢＳ改変体のうちのいずれかは、Ｎ末端にわずか１もしくは２個の非ＣＢＳアミノ酸残基を有する（すなわち、上記改変体は、天然に存在するヒトシスタチオニンβ−シンターゼアミノ酸配列の残基でない、Ｎ末端にわずか１もしくは２個のアミノ酸残基をその位置に含む）。このような改変体は、例えば、以下に記載される組換えＣＢＳ生成のための新規な方法を使用して生成され得る。

【0030】

さらなる実施形態において、本発明の上記のＣＢＳ改変体のうちのいずれか（任意の短縮型ＣＢＳタンパク質を含む）は、配列番号２によって示される野生型アミノ酸配列に対して少なくとも約５０％同一、もしくは少なくとも約５５％同一、もしくは少なくとも約６０％同一、もしくは少なくとも約６５％同一、もしくは少なくとも約７０％同一、もしくは少なくとも約７５％同一、もしくは少なくとも約８０％同一、もしくは少なくとも約８５％同一、もしくは少なくとも約９０％同一、もしくは少なくとも約９５％同一、もしくは少なくとも約９６％同一、もしくは少なくとも約９７％同一、もしくは少なくとも約９８％同一、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な短縮物を含む；特に、非ヘム結合もしくは非Ｓ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）結合を含み、ここで上記改変体は、触媒活性のままである（例えば、ここでＣＢＳのある種の短縮型形態は、ＡｄｏＭｅｔの存在下で全長ＣＢＳよりさらに活性であり得る）。特定の実施形態において、本発明のヒトＣＢＳ改変体は、そのＣ末端調節領域が除去されている短縮型組換えヒトＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）ホモダイマー酵素である（配列番号３）。他の実施形態において、本発明のヒトＣＢＳ改変体は、アミノ酸１５位のシステインがセリンに変異した短縮型組換えヒトＣＢＳ酵素である（配列番号１３）。

【0031】

ある種の実施形態において、本発明のＣＢＳタンパク質は、配列番号２と１００％未満同一であるアミノ酸配列、特に、米国特許第８，００７，７８７号に示されるとおりの短縮改変体のアミノ酸配列を有するその短縮型実施形態、ならびに特に、本明細書に示される配列番号３および配列番号１３であるアミノ酸配列を含み、具体的実施形態において、米国特許第８，００７，７８７号に示されるとおりの短縮改変体、ならびに特に、本明細書に示される配列番号３および配列番号１３を刻んで、９９％未満の配列同一性、９８％未満の配列同一性、９７％未満の配列同一性、９６％未満の配列同一性、９５％未満の配列同一性、９４％未満の配列同一性、９３％未満の配列同一性、９２％未満の配列同一性、９１％未満の配列同一性、９０％未満の配列同一性などを有するアミノ酸配列を含む。

【0032】

本明細書で使用される場合、別段特定されなければ、パーセント（％）同一性への言及は、以下が挙げられるが、これらに限定されない配列アラインメントツールもしくはプログラムを使用して行われる相同性の評価をいう：（１）アミノ酸検索のためのｂｌａｓｔｐおよび核酸検索のためのｂｌａｓｔｎと、標準的なデフォルトパラメーター（ここでクエリー配列がデフォルトによって低複雑性領域についてフィルタに掛けられる）を使用する、ＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴ相同性検索；（２）ＢＬＡＳＴ ２アラインメント（以下に記載されるパラメーターを使用する）；（３）および／もしくは標準的なデフォルトパラメーターを使用するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｔｅｒａｔｅｄ ＢＬＡＳＴ）。ＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ ２との間の標準的パラメーターにおけるいくらかの差異に起因して、２つの特定の配列が、ＢＬＡＳＴ ２プログラムを使用して有意な相同性を有すると認識され得るのに対して、クエリー配列としての配列のうちの１つを使用してＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴで行われる検索は、最上位の適合において２番目の配列を同定しない可能性があることが注意される。さらに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、「プロフィール」検索の自動化された使いやすいバージョンを提供し、これは、配列ホモログを探すために感度の高い方法である。上記プログラムは、ギャップ付きのＢＬＡＳＴデータベース検索を最初に行う。上記ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、位置特異的スコアマトリクス（これは、データベース検索の次の回のためにクエリー配列を置換する）を構築するために戻される任意の重要なアラインメントからの情報を使用する。従って、％同一性がこれらプログラムのうちのいずれかを使用することによって決定され得ることは、理解されるべきである。

【0033】

ＣＢＳ誘導体は、本発明の範囲に含まれる。このような誘導体は、ＣＢＳポリペプチドがポリマーに連結されている、化学的に改変されたＣＢＳポリペプチド組成物である。選択されるポリマーは、代表的には、これが結合される上記タンパク質が水性環境において沈殿せず、上記ＣＢＳ酵素が生物学的流体（例えば、生理学的環境）の中で生物学的に活性であるように、水溶性である。上記ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分枝状であっても非分枝状であってもよい。ＣＢＳポリペプチドポリマーの範囲内に含まれるのは、ポリマーの混合物である。具体的実施形態において、最終製品調製物の治療的使用のために、上記ポリマーは、薬学的に受容可能である。

【0034】

上記水溶性ポリマーもしくはその混合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、低分子量デキストラン（例えば、約６ｋＤａの））、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリサリチル酸、およびポリビニルアルコールからなる群より選択され得る。共有結合したＣＢＳポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る二官能性ＰＥＧ架橋分子もまた、本発明によって包含される。一実施形態において、上記ポリエチレングリコール分子は、非分枝状および分枝状のポリエチレングリコールから選択され、ここで上記ポリエチレングリコール分子は、２０００ダルトン以上の分子量を有する。別の実施形態において、上記ポリエチレングリコール分子は、２〜１００ｋＤ、５〜８０ｋＤもしくは１０〜４０ｋＤの範囲の分子量を有し得る。さらに別の実施形態において、上記ポリエチレングリコール分子は、ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ、ＭＥ−０２０ＭＡ、ＭＥ−４００ＭＡ、ＧＬ２−４００ＭＡ、ＧＬ４−４００ＭＡ、ＧＬ２−８００ＭＡ、ＭＥ−０５０ＧＳ、ＭＥ−２００ＧＳ、ＭＥ−２００ＡＬもしくはＭＥＰＡ−２０Ｔから選択される。

【0035】

特定の実施形態において、本発明は、短縮型組換えヒトＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）ホモダイマー酵素を提供し、ここでそのＣ末端調節領域は除去され（配列番号３）、本明細書で示される「ＰＥＧ化種」を含め、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での共有結合によって化学的に改変されている。本発明の他の実施形態において、本発明のヒトＣＢＳ改変体は、短縮型組換えヒトＣＢＳ酵素であり、ここでアミノ酸１５位のシステインは、セリンに変異しており（配列番号１３）、本明細書で示される「ＰＥＧ化種」を含め、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での共有結合によって化学的に改変されている。

【0036】

上記改変されたＰＥＧ化種を生成するために、上記ＰＥＧ化反応において使用される種々のＰＥＧ試薬の具体的実施形態は、表１に同定される。

【0037】

【表1】

ＣＢＳポリペプチドのＰＥＧ化は、当該分野で公知のＰＥＧ化反応のうちのいずれかによって行われ得る。ＰＥＧ化は、以下に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（もしくは類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応もしくはアルキル化反応によって行われ得る。アシル化反応に関しては、上記選択されるポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化に関しては、上記選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは水中で安定である）、またはそのモノＣ_１−Ｃ_１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である。一実施形態において、上記ポリエチレングリコール分子は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、アミン、およびモノアルデヒドからなるアルデヒド、モノ酸のモノエステル、モノアミン、モノチオール、モノジスルフィド、モノブロモフェニルカーボネート、モノクロロフェニルカーボネート、モノフルオロフェニルカーボネート、モノニトロフェニルカーボネート、モノカルボニルイミダゾール、モノヒドラジド、モノヨードアセトアミド、モノマレイミド、モノオルトピリジルジスルフィド、モノオキシム、モノフェニルグリオキサール、モノチアゾリジン−２−チオン、モノチオエステル、モノトリアジンならびにモノビニルスルホンから選択される結合基によってＣＢＳに結合される。

【0038】

本明細書での使用のための１つの水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧと略される）である。本明細書で使用される場合、ポリエチレングリコールは、他のタンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの形態のうちのいずれか（例えば、モノ−（Ｃ_１−Ｃ_１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコール）を包含することが意味される。

【0039】

一般に、化学的誘導体化は、生物学的に活性な物質と活性化ポリマー分子とを反応させるために使用される任意の適した条件下で行われ得る。ＰＥＧ化ＣＢＳポリペプチドを調製するための方法は、一般に、（ａ）上記ポリペプチドとポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステル、アミン、アルデヒド、もしくはマレイミド誘導体）とを、ＣＢＳポリペプチドが１以上のＰＥＧ基と結合される条件下で反応させる工程、および（ｂ）上記反応生成物を得る工程を包含する。一般に、上記アシル化反応に最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きくなるほど、ポリ−ＰＥＧ化生成物のパーセンテージが大きくなる。１つの特定の局面において、上記ＣＢＳポリペプチド誘導体は、アミノ末端において単一のＰＥＧ部分を有する。特定の実施形態において、本発明によって提供されるＰＥＧ化ＣＢＳ酵素は、上記組成物中の各酵素サブユニットに共有結合された、平均約１〜約１０、より具体的には、２〜約５、およびより具体的には、３〜５のＰＥＧ分子を有する。

【0040】

本発明のタンパク質は、好ましくは、「実質的に純粋な」形態において回収、獲得、および／もしくは使用される。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」とは、本発明に従って、インビトロ、エキソビボもしくはインビボでの上記タンパク質の有効な使用を可能にする純度をいう。本発明に従うインビトロ、エキソビボもしくはインビボでの方法において有用なタンパク質に関しては、それは、本発明によって開示される方法におけるその使用を妨害し得るかもしくは妨害するか、またはそれが本発明によって開示される方法において使用される場合に、ＣＢＳタンパク質（ホモログを含む）とともに含めるのに少なくとも望ましくない、夾雑物、他のタンパク質および／もしくは化学物質を実質的に含まない。このような方法は、酵素反応（例えば、シスタチオニンの生成）、治療組成物の調製、治療組成物での投与、および全ての他の本明細書で開示される方法を含む。「実質的に純粋な」タンパク質は、本明細書で言及されるように、任意の方法によって（すなわち、天然供給源からの直接精製、組換えもしくは合成によって）生成され得、他のタンパク質成分から精製されたタンパク質であり、その結果、上記タンパク質は、所定の組成物中の全タンパク質のうちの重量あたり少なくとも約８０％ 重量を構成し（例えば、上記ＣＢＳタンパク質は、溶液／組成物／緩衝液中の上記タンパク質のうちの約８０％である）、そしてより好ましくは、所定の組成物中の全タンパク質の重量あたり、少なくとも約８５％、およびより好ましくは、少なくとも約９０％、およびより好ましくは、少なくとも約９１％、およびより好ましくは、少なくとも約９２％、およびより好ましくは、少なくとも約９３％、およびより好ましくは、少なくとも約９４％、およびより好ましくは、少なくとも約９５％、およびより好ましくは、少なくとも約９６％、およびより好ましくは、少なくとも約９７％、およびより好ましくは、少なくとも約９８％、およびより好ましくは、少なくとも約９９％の重量を構成する。組換え細菌において生成された上記ＣＢＳタンパク質もしくはその短縮型改変体の実施形態において、用語「精製された」もしくは「実質的に純粋な」は、リポポリサッカリドおよび他の発熱性化合物からの精製を包含することが理解される。

【0041】

組換えＤＮＡ技術の使用が、例えば、宿主細胞内での核酸分子のコピー数、それら核酸分子が転写される効率、その得られた転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、トランスフェクトされた核酸分子の発現の制御を改善し得ることは、当業者によって認識される。さらに、プロモーター配列は、天然のプロモーターと比較して、発現レベルを改善するために遺伝的に操作され得る。

【0042】

核酸分子の発現を制御するために有用な組み換え技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１以上の宿主細胞染色体への核酸分子の組み込み、プラスミドへのベクター安定化配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換もしくは改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）の置換もしくは改変、宿主細胞のコドン使用法に対応するための核酸分子の改変、および転写物を不安定化する配列の欠失。

【0043】

さらなる局面において、本発明は、ヒトシスタチオニン−β−シンターゼを組換え生成および精製するための方法に関する。上記方法は、米国特許第８，００７，７８７号および具体的には本明細書中の配列番号４に示されるとおりのヒトＣＢＳ酵素もしくはまたは短縮型もしくは変異型改変体をコードする核酸配列を発現ベクターへとクローニングする工程を包含する。ある種の実施形態において、上記ヒトＣＢＳコード配列は、微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に最適化されたコドンを利用するように改変される。他の実施形態において、上記ベクターは、以下を含む：（ａ）融合パートナー（例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、もしくはＧＳＴ））を発現される予定の核酸配列に連結するクローニング部位、および（ｂ）ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（例えば、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼといわれる融合タンパク質としてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能）もしくは類似の切断部位を使用するプロテアーゼのための、上記組換え融合タンパク質の発現後に上記ＣＢＳタンパク質から融合パートナーを切断するための、プロテアーゼ切断認識部位。本発明の一部として、上記発現ベクターは、第１に、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼによって切断され得るＣＢＳ融合タンパク質の発現を生じるＣＢＳコード核酸配列の特異的導入のために遺伝的に改変され、その結果、１つのみのさらなる非ＣＢＳ、Ｎ末端アミノ酸残基を有するＣＢＳタンパク質が、生成される。この結果は、市販のベクターにおける非改変マルチクローニング部位を使用しても可能ではない。上記ＣＢＳコード核酸配列は、遺伝的に改変されたベクターに導入され、その組換え融合タンパク質は、従来の方法もしくはＣＢＳ生成に適したもの（例えば、米国特許第５，６３５，３７５号（前出）を参照のこと）を使用して、発現および精製され、最終的に、その融合パートナーおよび非ＣＢＳアミノ酸残基のうちの１つを除く全てが上記ＣＢＳタンパク質から切断され、ヒト治療適用における使用に理想的な、高度に精製されたほぼ完全にヒト組変えＣＢＳタンパク質を残す。特に有利な実施形態において、ヒトＣＢＳタンパク質をコードするヌクレオチドは、これが組換えで作製される組換え細胞のコドン使用頻度へと操作される。このような実施形態の非限定的例は、ＣＢＳコード核酸がＥ．ｃｏｌｉでの最適な組換え発現のために適合された、配列番号４として本明細書に示される。

【0044】

本発明のいくつかの局面は、本明細書で記載されるＣＢＳ改変体のうちのいずれかを含む、インビトロでシスタチオニンもしくはシステインを生成して、硫化水素をインビトロで除去もしくは生成するための、またはインビボでの治療的使用のための（例えば、ホモシスチン尿症およびこれに関する状態を処置もしくは予防するための）組成物を含む。従って、本発明の別の実施形態は、米国特許第８，００７，７８７号に、および具体的には、本明細書に記載されるとおりの配列番号３もしくは配列番号１３に示されるように、単離されたＣＢＳタンパク質および特に、その短縮型改変体を含む組成物に関する。上記組成物は、代表的には、薬学的に受容可能なキャリアも含む。上記組成物およびそれらの成分は、本明細書に記載される発明のインビトロでのもしくは治療的な実施形態のうちのいずれかにおいて使用され得る。

【0045】

本明細書で使用される場合、「ＨＯ」マウスは、マウスｃｂｓ遺伝子が不活性化され、ヒトＣＢＳプロモーターの制御下でヒトＣＢＳ導入遺伝子の低レベル発現を示す、古典的なホモシスチン尿症の新たなマウスモデルである。このマウスモデルは、Ｈｃｙ、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、およびＳ−アデノシルホモシステインの血漿レベルおよび組織レベル両方の重篤な上昇、ならびにシステインの血漿レベルおよび肝臓レベルの付随した低下を示す。Ｍａｃｌｅａｎら、２０１０ Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｍｅｔａｂ． １０１：１５３−６２）を参照のこと。

【0046】

本発明の組成物は、シスタチオニンおよびシステインをインビトロで生成するために、またはＣＢＳ活性の増大に利益を受ける個体（例えば、ホモシスチン尿症を有する個体）を処置するために有用である。

【0047】

本発明によれば、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的に受容可能な賦形剤および／もしくは薬学的に受容可能な送達ビヒクルを含み、これらは、適切なインビトロ、エキソビボもしくはインビボでの部位への、上記組成物の投与における使用に適している。適切なインビトロ、インビボもしくはエキソビボでの部位は、好ましくは、ＣＢＳ活性を調節することが望ましい任意の部位である。薬学的に受容可能なキャリアは、本発明のタンパク質もしくは組換え核酸分子を、培養物もしくは個体の中の標的細胞もしくは組織に上記タンパク質もしくは組換え核酸分子が達したときに、上記タンパク質もしくは組換え核酸分子がその標的（例えば、ＣＢＳの基質）と相互作用し得る形態に維持し得る。

【0048】

本発明の適切な賦形剤は、輸送するかもしくは輸送を助けるが、組成物を細胞に特異的に標的化しない賦形剤もしくは処方を含む（非標的化キャリアとも本明細書でいわれる）。薬学的に受容可能な賦形剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水、リン酸緩衝化食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス溶液、他の水性の生理的緩衝液、油、エステルおよびグリコール。水性キャリアは、例えば、化学的安定性および等張性を増強することによって、レシピエントの生理学的条件に近づけるために必要な適切な補助物質を含み得る。本発明の組成物は、従来の方法によって滅菌および／もしくは凍結乾燥され得る。

【0049】

薬学的に受容可能なキャリアの１つのタイプは、本発明の組成物を個体もしくは培養物へとゆっくりと放出し得る徐放性製剤を含む。本明細書で使用される場合、徐放性製剤は、徐放性ビヒクル中に本発明の化合物（例えば、タンパク質（ホモログを含む）、抗体、核酸分子、もしくは摸倣物）を含む。適切な徐放性ビヒクルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリクス、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ（例えば、ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプ）、拡散デバイス、リポソーム、リポスフェア、および経皮送達システム。本発明の他のキャリアとしては、個体に投与した際に、固体もしくはゲルをその場で形成する液体が挙げられる。具体的実施形態において、キャリアはまた、生分解性（すなわち、生体分解性）である。上記化合物が組換え核酸分子である場合、適切なキャリアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リポソーム、ウイルスベクターもしくは他のキャリア（リボザイム、金粒子、ポリ−Ｌ−リジン／ＤＮＡ−分子結合体、および人工染色体が挙げられる）。天然脂質含有キャリアとしては、細胞および細胞膜が挙げられる。人工脂質含有キャリアとしては、リポソームおよびミセルが挙げられる。

【0050】

本発明のキャリアは、個体における特定の部位に標的化するために改変され得、それによって、その部位に本発明のタンパク質を標的化し利用し得る。標的化し得る薬学的に受容可能なキャリアはまた、本明細書で「送達ビヒクル」もしくは「標的化キャリア」といわれ得る。適切な改変としては、上記送達ビヒクルの脂質部分の化学式を操作することおよび／または好ましい部位もしくは標的部位（例えば、好ましい細胞タイプ）に送達ビヒクルを特異的に標的化し得る標的化薬剤をビヒクルへ導入することが挙げられる。「標的部位」とは、組成物の送達が望まれる個体における部位をいう。あるいは、上記薬学的に受容可能なキャリアは、動物に（好ましくは、ヒト）、血漿もしくは血清中に上記ＣＢＳタンパク質を送達するために適した薬剤を含み得る。適切な標的化化合物は、特定の部位において別の分子を選択的に（すなわち、特異的に）結合得るリガンドを含む。このようなリガンドの例としては、抗体、抗原、レセプターおよびレセプターリガンドが挙げられる。上記送達ビヒクルの脂質部分の化学式の操作は、上記送達ビヒクルの、細胞外もしくは細胞内への標的化を調節し得る。例えば、化学物質が、リポソームが、特定の電荷特性を有する特定の細胞と融合するように、上記リポソームの脂質二重層の電荷を変化させるリポソームの脂質式に付加され得る。具体的実施形態において、本発明のリポソームは、例えば、当業者に公知のタンパク質送達法において一般に使用されるそれらリポソームを含む。リポソームと本発明のタンパク質との複合体化は、当該分野で標準的な方法を使用して達成され得る。

【0051】

さらに別の局面において、本発明は、ＣＢＳの発現および／もしくは活性を調節することによって、生物学的プロセス（シスタチオニン生成を含む）を調節するための方法に関する。この実施形態は、一般に、ＣＢＳの発現および生物学的活性によって媒介されるかまたはこれらと関連するシスタチオニンの生成を調節する方法において有用な、米国特許第８，００７，７８７号に、および具体的には本明細書で記載される配列番号３もしくは配列番号１３に示されるとおりのＣＢＳ改変体、特に、その短縮型ＣＢＳ改変体のうちの１以上を含む治療組成物の使用（例えば、投与）を含み得る。

【0052】

従って、一実施形態において、本発明の方法は、動物もしくはヒト個体におけるシスタチオニン生成を調節し、ここで上記個体は、シスタチオニン生成の調節に影響を受けやすい疾患（例えば、ホモシスチン尿症およびこれに関する状態／症状（例えば、水晶体偏位、骨格障害、精神遅滞ならびに早発の動脈硬化症および血栓症）から防御されるかもしくはこれらの処置がなされる。本明細書で使用される場合、語句「疾患から防御される」とは、上記疾患の症状を低減する；上記疾患の発生を減少させる、および／もしくは上記疾患の重症度を低減することをいう。個体の防御は、本発明の治療組成物が、個体に投与した場合に、疾患の症状、徴候もしくは原因を緩和することによって、上記疾患を発生しないようにするおよび／または上記疾患を治癒もしくは処置する能力に言及し得る。よって、個体を疾患から防御することは、疾患発生を防止する（予防的処置）、および疾患を有するか、または疾患の初期症状もしくは後期ステージの症状を経験している個体を処置する（治療的処置）の両方を含む。用語「疾患」とは、個体の通常の健康状態からの何らかの逸脱をいい、疾患症状が存在する場合の状態、および逸脱（例えば、非限定的な例においては、感染、遺伝子変異、および遺伝的欠陥などが挙げられる）が起こってしまっているが、症状がまだ発現していない（例えば、疾患前の状態）状態を含む。

【0053】

より具体的には、本明細書で記載されるとおりの治療組成物は、本発明の方法によって個体に投与される場合、好ましくは、上記疾患の緩和（例えば、上記疾患の少なくとも１つの症状もしくは臨床的発現の低減）、上記疾患の除去、原発性疾患の発生から生じる二次疾患の緩和、または上記疾患の予防を含み得る結果を生じる。さらなる局面において、上記治療組成物の投与は、哺乳動物における含硫置換基移動の下流代謝産物の蓄積の増大を含み得る結果を生じ得る。

【0054】

本発明によれば、有効な投与プロトコル（すなわち、有効な様式で治療組成物を投与すること）は、好ましくは、上記個体が、（例えば、疾患予防によって、または進行中の疾患の１以上の症状を緩和することによって）上記疾患から防御されるように、上記個体において所望の効果（例えば、上記個体におけるシスタチオニン−β−シンターゼの活性の増大、またはシスタチオニンを形成するための、セリンおよびホモシステインの縮合の増大）を生じる適切な用量パラメーターおよび投与様式を含む。有効な用量パラメーターは、特定の疾患について当該分野で標準的な方法を使用して決定され得る。このような方法としては、例えば、生存率の決定、副作用（すなわち、毒性）および疾患の進行もしくは退縮が挙げられる。

【0055】

本発明によれば、適切な単一用量サイズは、個体におけるシスタチオニンもしくはシステインの通常のタンパク質摂取もしくは形成で、個体に関してＣＢＳ活性の増大またはＨｃｙレベルの制御、または適切な期間にわたって１回以上投与される場合、個体における状態の少なくとも１つの症状の改善を生じる用量である。用量は、処置されている疾患に依存して変動し得る。当業者は、個体のサイズおよび投与経路に基づいて、所定の個体に対して適切な単一用量サイズを容易に決定し得る。

【0056】

本発明のある種の実施形態において、本発明の治療組成物の適切な単一用量は、本発明の治療組成物を投与しなかった個体（すなわち、所定のコントロール個体もしくは測定値）と比較して、上記組成物の投与前の個体と比較して、または特定の疾患、個体タイプおよび組成物について確立された標準と比較して、任意の投与経路によって投与した場合、上記のようにＣＢＳ活性を増大させる量である。投与される治療組成物は、長期にわたって酵素として活性である。この期間は、好ましくは、２４時間を超える。その化学的に改変された治療組成物は、２４時間後に、上記投与された組成物の初期活性のうちの７０％以上を保持する。より好ましくは、上記投与される治療組成物の酵素として有効な活性の期間は、４８時間を超える。さらにより好ましくは、上記投与される治療組成物の有効な酵素活性の期間は、７２時間を超える。ある種の実施形態において、上記治療組成物は、１日あたり数回（例えば、２回もしくは３回以上）、またはより低い頻度で投与され得る（１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回もしくはより低い頻度が挙げられるが、これらに限定されない）。他の実施形態において、上記治療組成物は、数日、数週間もしくは数ヶ月の過程にわたって連続して投与され得る。本発明の別の実施形態において、本発明の治療組成物の適切な用量は、ベタイン（例えば、ＣＹＳＴＡＤＡＮＥ（登録商標））、かなり緩やかなタンパク質制限食（ｒｅｌａｘｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｄｉｅｔ）、抗凝固剤、もしくはスタチンとともに投与され得る。

【0057】

上記で考察されるように、本発明の治療組成物は、上記組成物を細胞、組織、および／もしくは全身へと、個体に送達するために有効な様式で個体に投与され、それによって所望の結果が、上記組成物の投与の結果として達成される。適切な投与プロトコルとしては、任意のインビボもしくはエキソビボでの投与プロトコルが挙げられる。好ましい投与経路は、予防もしくは処置される予定の状態のタイプ；上記組成物が核酸ベースであるか、タンパク質ベースであるか、もしくは細胞ベースであるかどうか；および／または標的細胞／組織に依存して、当業者に明らかである。タンパク質に関しては、インビボ投与の方法は、非経口投与を含み、具体的には、浸透圧ポンプ投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、節内投与（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、冠動脈内投与、動脈内投与（例えば、頚動脈へ）、皮下投与、関節内投与、脳室内投与（intraventricular ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、および組織への直接注射が挙げられるが、これらに限定されない。送達経路の組み合わせが使用され得、いくらかの例においては、上記組成物の治療効果を増強し得る。

【0058】

上記の投与経路（静脈内、腹腔内、皮内、筋肉内投与または浸透圧ポンプを介するものを含む）の多くは、当該分野で標準的な方法を使用して行われ得る。

【0059】

局所投与の一方法は、直接注射による。直接注射技術は、手術によってアクセス可能な細胞もしくは組織、および特に、身体表面もしくはその付近に組成物を投与するために特に有用である。標的細胞の領域内に局所的に組成物を投与することは、上記組成物を、上記標的細胞もしくは組織から数センチメートルおよび好ましくは数ミリメートルで注射することをいう。

【0060】

局所投与の別の方法は、１以上の浸透圧ポンプ（例えば、ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプ）の使用による。上記ポンプは、長期間（例えば、数週間もしくは数ヶ月）にわたって薬物の一定の送達を可能にする。埋込型浸透圧ポンプは、手術によってアクセス可能な細胞、組織もしくは被験体、および特に、身体の表面もしくはその付近に組成物を投与するために特に有用である。被験体の標的細胞もしくは組織の領域内に局所的に組成物を投与することは、上記組成物を含む浸透圧ポンプを、上記標的細胞もしくは組織から数センチメートルおよび好ましくは、数ミリメートルで埋め込むことをいう。

【0061】

本発明の方法において、治療組成物は、脊椎動物綱、哺乳動物（霊長類、齧歯類、家畜および家庭内のペットが挙げられるが、これらに限定されない）の任意のメンバーに投与され得る。家畜としては、消費されるかまたは有用な製品を生成する動物（例えば、羊毛を作るためのヒツジ）が挙げられる。防御するのに好ましい個体としては、ヒトが挙げられる。

【0062】

本発明のいくつかの局面は、単離されたＣＢＳポリペプチドもしくは非凝集ＣＢＳ誘導体を作製するために本明細書で記載されるＣＢＳ改変体のうちのいずれかの使用を含む。

【0063】

本明細書で記載および／もしくは引用される各参考文献は、その全体において参考として援用される。 以下の実施例は、例示目的で提供されるのであって、本発明の範囲を限定するとは意図しない。

【実施例】

【0064】

（実施例１：細菌における短縮型ＣＢＳタンパク質の生成）
（ａ．細菌における短縮型ＣＢＳタンパク質の組換え発現）
非保存領域の特定の部分を欠いている短縮型ヒトＣＢＳ改変体（ｒｈＣＢＳΔＣ；配列番号３）を構築し、先に記載されたＥ．ｃｏｌｉベースの発現系（Ｋｏｚｉｃｈ ａｎｄ Ｋｒａｕｓ， １９９２， 前出）を使用して過剰発現させた。上記短縮型ヒトＣＢＳタンパク質改変体ｒｈＣＢＳΔＣをコードする構築物（ｒｈＣＢＳΔＣをコードするＤＮＡは、配列番号４に示される）を、ｐＫＫ３８８．１にクローニングされたＣＢＳ全長コード配列（配列番号１）を含む先に記載されたｐＨＣＳ３ ＣＢＳ発現構築物（Ｋｏｚｉｃｈ ａｎｄ Ｋｒａｕｓ， １９９２， Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ． １：１１３−１２３）の改変によって生成した。Ｃ末端欠失構築物を生成するために、所望のヌクレオチド残基にわたるＣＢＳ ｃＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ生成物の５’末端および３’末端それぞれにＳｐｈ ＩおよびＫｐｎ Ｉ部位を組みこんだプライマーを使用して増幅した。次いで、全てのＰＣＲ生成物をＳｐｈ ＩおよびＫｐｎ Ｉで切断し、Ｓｐｈ ＩおよびＫｐｎ Ｉで消化したｐＨＣＳ３ベクターへのライゲーションによってクローニングした。Ｓｐｈ Ｉ部位は、上記ＣＢＳ ｃＤＮＡに、アンチセンスプライマーハイブリダイゼーション部位の直ぐ上流（配列番号１と番号付けされているＣＢＳ ｃＤＮＡによれば、塩基対位置１０１２）に天然に存在する。次いで、そのようにして生成されたＰＣＲ生成物をＮｃｏ ＩおよびＳｐｈ Ｉで消化し、同じ酵素で切断したｐＨＣＳ３プラスミドに連結した。

【0065】

【化1】

最後に、上記構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へと形質転換した。上記構築物の真正を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙ５．５配列決定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＶｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ Ｔｏｗｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｖ３．１ ＤＮＡシーケンサーを使用するＤＮＡ配列決定によって、製造業者の説明書に従って検証した。

【0066】

ＣＢＳ欠失変異体の細菌発現分析に関しては、ＣＢＳ短縮型変異体構築物を有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞の増殖、発現の誘発および粗製細胞溶解物の生成を、以前に記載されるように行った（Ｍａｃｌｅａｎら、２００２， Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ． １９：６４１−５５）。

【0067】

代替の方法もまた使用して、ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターにおいて配列最適化した短縮型ヒトＣＢＳ酵素（ｒｈＣＢＳΔＣ；配列番号３）を作製した。全長（５５１ ａａ）ヒトＣＢＳコード配列を、細菌発現のために最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（ＮＪ， ＵＳＡ）によってＥｃｏＲＶ制限酵素での消化後に、ｐＵＣ５７ベクターにクローニングした。次いで、上記ＣＢＳ配列を、プライマーＡ１およびＡ２を使用するＰＣＲによって増幅して、上記短縮型酵素（ａａ １−４１３）をコードする配列を生成した：

【0068】

【化2】

次いで、上記ＰＣＲ生成物を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡから市販されている）に連結した。ｐＥＴ−２８ａ（＋）の最適なＮｃｏＩ部位へのクローニングは、ＣＢＳ野生型配列（プロリンの代わりにアラニンをコードする）と比較して、Ｇ→Ｃ変異を生じる。よって、プライマーＢ１およびＢ２を利用する部位指向性変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して、プロリンをコードする野生型配列を再生した：

【0069】

【化3】

同じストラテジーを使用して、以下のプライマーを使用してＣ１５Ｓ変異体（Ｔ→Ａ変異）を生成した：

【0070】

【化4】

最適化されたｒｈＣＢＳΔＣおよびＣ１５Ｓ変異体ポリヌクレオチド構築物の両方の全配列を、配列決定することによって検証した。

【0071】

上記短縮型ＣＢＳの発現は、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターの中の上流Ｔ７プロモーターによって制御され、ＤＥ３細菌への形質転換およびＩＰＴＧによる誘発を要する。

【0072】

（ｂ．配列最適化した短縮型ヒトＣＢＳ酵素の発現）
上記短縮型ヒトＣＢＳをコードする配列を有するｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターを、ＤＥ３細菌、すなわち、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）もしくはＢＬ−２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシン耐性クローンを選択し、さらに使用するために、−８０℃においてストックグリセロールとして維持した。

【0073】

ストックグリセロールからの細菌を、３０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含む５ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で、２７５ＲＰＭの回転振盪機上で３７℃において一晩増殖させた。翌朝、１ｍｌの一晩培養物を、３０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含む１００ｍｌ Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に添加し、上記のように一晩増殖させた。次いで、１０ｍｌの一晩培養物を、以下の補充物を含む１リットルのＴＢ培地に添加した：
・０．００１％のチアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
・０．００２５％のピリドキシン−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
・０．３ｍＭ δ−（アミノレブリン酸）（δ−ＡＬＡ） ｐＨ８．０
・１５０μＭ 塩化第二鉄
・３０μｇ／ｍｌのカナマイシン 。

【0074】

上記１リットル培養物を、次いで、ＯＤ_６００が約０．６〜０．７の値に達するまで３０℃において２７５ＲＰＭの回転振盪機上で増殖させ、タンパク質発現を、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することによって誘発した。発酵をさらに１６時間継続した。次いで、細胞を、１０分間、４℃での６０００ ＲＣＦ遠心分離によって回収し、氷冷０．９％ ＮａＣｌで洗浄し、上記のように再度遠心分離し、−８０℃で凍結した。

【0075】

次いで、アリコート（ペレット１ｇあたり４．４５ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ＝７．２、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＰＬＰ））を、上記細胞ペレットに添加し、後者を、細胞の凝集物が見えなくなるまでＤｏｕｎｃｅホモジナイザー中でホモジナイズした。次いで、上記ホモジネートを、リゾチーム（２ｍｇ／ｍｌ 最終）で処理し、１時間４℃において振盪プラットフォーム上でインキュベートし、超音波処理して粘性を下げ、５３，０００ ＲＣＦで遠心分離した。次いで、可溶性画分を含む上清を、−８０℃で貯蔵した。

【0076】

発現レベルを、ゲル電気泳動、続いて、クーマシーゲル染色によって検証し、比活性を放射活性アッセイによって決定した。

【0077】

（ｃ．ＣＢＳアッセイ）
ＣＢＳ活性を、標識基質として［^１４Ｃ］セリンを使用する先に記載された放射性同位体アッセイによって決定した（Ｋｒａｕｓ， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １４３，３８８−３９４）。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質として使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ， １９７６， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２， ２４８−２５４）によって決定した。活性の１単位は、１時間３７℃で、１μｍｏｌのシスタチオニンの形成を触媒するＣＢＳの量として定義される。

【0078】

（ｄ．変性および未変性ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング）
変性条件および未変性条件両方の下でのＣＢＳサンプルのウェスタンブロット分析を、以前に記載されたように行った（Ｍａｊｔａｎら、２０１０ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１０； ２８５（２１）：１５８６６−７３）。

【0079】

（ｅ．血漿代謝産物の決定）
Ｓｔａｂｌｅ−Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ-Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ法を使用して、Ａｌｌｅｎら、１９９３， Ｓｅｒｕｍ ｂｅｔａｉｎｅ Ｎ， Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ ｃｏｂａｌａｍｉｎ ａｎｄ ｆｏｌａｔｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｂｏｒｎ ｅｒｒｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ４２： １４４８-１４６０に実質的に開示されるように、マウス血漿中での含硫アミノ酸代謝化合物（ｓｕｌｆｕｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）のレベルを測定した。

【0080】

（実施例２：インビボでの血漿保持時間は、ｒｈＣＢＳΔＣ ＰＥＧ化の後に増強される）
血液循環中のｒｈＣＢＳΔＣの保持時間および活性を評価するために実験を行い、この実験でＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５ｍｇ／ｋｇ 体重のｒｈＣＢＳΔＣを、腹腔内（ＩＰ）、血管内（ＩＶ）もしくは皮下（ＳＱ）経路によって注射した。過剰な採血を回避するために、各々５匹のマウスの２つの実験群（１および２と称する）を、各注射経路に使用した（合計ｎ＝３０）。各注射経路に関して、群１から、注射して０時間後、１時間後、８時間後および２４時間後に、ならびに群２から、注射して１時間後、４時間後、１０時間後、および４８時間後に血液を集めた。動物を、顎下採血のために、単回使用ランセットで出血させ、ゲル（Ｔｅｒｕｍｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＮＪ， ＵＳＡ）入りのＣａｐｉｊｅｃｔ Ｔ−ＭＬＨＧヘパリンリチウム（１２．５ ＩＵ）チューブの中に血液を集めた。次いで、チューブを１２００Ｇで１０分間、遠心分離し、続いて、１．５ｍｌチューブに血漿を集め、−８０℃で貯蔵した。

【0081】

血漿を、実施例１に示される放射活性アッセイを使用して、ＣＢＳ活性について分析した。示された時点での注射した酵素のＣＢＳ酵素活性を、図１ａに示す。ＩＰおよびＩＶ経路に関しては、ピーク活性を注射して１時間後に記録したのに対して、ＳＱ経路に関しては、活性は、ＳＱ区画から循環への放出がよりゆっくりであることに起因して、注射して４時間後にピークに達した。興味深いことに、注射して８〜１０時間後、上記活性は、全ての注射経路に関して同等になり、注射して２４〜４８時間後には、活性はほぼなかった。

【0082】

循環からのｒｈＣＢＳΔＣクリアランスが、上記で示されるようにインビボでの活性の迅速な喪失に寄与し得るかをモニターするために、上記の各群から２匹の代表的マウスの血漿タンパク質を、電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ヒトＣＢＳ抗体と反応させて、循環からのＣＢＳクリアランスを追跡した。図１ｂに示されるように、循環からのｒｈＣＢＳΔＣの漸進的なクリアランスは、注射後の時間の関数として起こり、注射後２４時間との早期に酵素は検出されなくなった。よって、ｒｈＣＢＳΔＣのクリアランスは、インビボでの活性の観察された迅速な喪失に寄与する。

【0083】

ｒｈＣＢＳΔＣの保持時間を長くするために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子（ＰＥＧ化）によって、ＭＥ−０２０ＭＡもしくはＧＬ４−４００ＭＡ ＰＥＧで酵素を改変した。活性化ＰＥＧ誘導体を、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）から購入した。ＰＥＧ化を、製造業者の説明書に従って行った。例えば、ＣＢＳ（５ｍｇ／ｍｌ）のＳＨ基へのＰＥＧマレイミド誘導体のカップリングを、１００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ＝６中で一晩、４℃において行った。ＰＥＧ分子 対 ＣＢＳタンパク質のモル比は、活性化ＰＥＧ誘導体に依存して、１０：１もしくは５：１であった。

【0084】

ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの活性を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５ｍｇ／ｋｇ 体重のＭＥ０２０ＭＡ−もしくはＧＬ４−４００ＭＡ−ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣ、または非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣを、ＳＱ経路によって注射した。各処置アームは、５匹のマウスの２群（合計３０匹のマウス）からなり、上記に記載されるように採血した。血漿を、実施例１に示される放射活性アッセイを使用して、ＣＢＳ活性について分析した。注射して２４時間後および４８時間後に、ＰＥＧ化酵素の２つの形態について有意な活性を検出し、ＧＬ４−４００ＭＡ ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣ活性は、図１ｃに示されるように、２４時間でピークに達した。このことは、これら同じ時点で低いかもしくは活性なしを示す非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣとは際だって対照的であった。これら結果は、ｒｈＣＢＳΔＣ酵素のＰＥＧ化がインビトロおよびインビボの両方でその活性を長期化するにあたって有効であることを示した。

【0085】

（実施例３：ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣでの反復注射レジメンは、ＣＢＳ活性の蓄積をインビボで示したが、非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣでのレジメンは示さなかった）
循環からのタンパク質の迅速なクリアランス速度は、より高い血漿濃度を維持するために、注射の回数を増やすことによって回避され得る。よって、反復注射レジメンを、非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣおよびＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの両方で試験した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５ｍｇ／ｋｇ 体重の非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣ（ｎ＝５）もしくはＧＬ４−４００ＭＡ ｒｈＣＢＳΔＣ（ｎ＝５）を０時間、２４時間、４８時間で注射し（図２の矢印）、示された時点で採血した。血漿を、実施例１に示される放射活性アッセイを使用して、ＣＢＳ活性について分析した。図２に示されるように、非ＰＥＧ化酵素の反復注射は、循環において酵素活性の蓄積をもたらさず、各注射の２４時間後には、ほぼ活性を生じなかった。対照的に、ＰＥＧ化酵素の活性は、２回の注射の後にピークに達し、プラトーに達した。

【0086】

（実施例４：ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの単回注射は、血漿中で、ホモシステインを低下させ、シスタチオニンを増大させた）
先の実施例を、野生型マウスにおいで行い、注射したｒｈＣＢＳΔＣのクリアランスおよび活性の特徴付け、ならびにＰＥＧ化酵素と非ＰＥＧ化酵素との間の比較に焦点を当てた。ＰＥＧ化が循環時間を長期化することをいったん確立した後、ＰＥＧ化ＣＢＳ酵素分子の種々のレパートリーを、野生型マウスにおいてまず試験し、次いで、ホモシスチン尿症のマウスモデルにおいて評価した。

【0087】

種々のＰＥＧ分子で改変したｒｈＣＢＳΔＣ酵素のレパートリーを、最良のＰＥＧ化ストラテジーを決定するために、野生型マウスにおいて試験した。２７匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、９つの実験群（ｎ＝３）に分けた。各実験群に、ＳＱ経路によって、５ｍｇ／ｋｇ 体重の、図３に示されるＰＥＧ分子でＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣを注射したか、または非ＰＥＧ化酵素を注射した。血液サンプルを、図３に示された時点で採取し、ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣ活性を、実施例１に示される放射活性アッセイを使用して決定した。データは、図３Ａにおいて、標準偏差（ＳＴＤ）付きのヒストグラム、および散布図として示される。一般に、より高分子量のＰＥＧ（ＧＬ２８００ＭＡは８０ｋＤａ；ＭＥ−４００ＭＡおよびＧＬ２−４００ＭＡは４０ｋＤａ；ならびにＭＥ２００−ＭＡ０Ｂは２０ｋＤａ）でのＰＥＧ化は、２０ｋＤａ未満のサイズであった分子でのＰＥＧ化後に観察されたものより大きな曝露をもたらし、システイン残基（マレイミド反応基の使用を示すために「ＭＡ」によって示される）を標的化した化学を使用するＰＥＧ化が、一般に、他の化学を利用するＰＥＧ化後に観察されたものより大きな曝露をもたらす。

【0088】

ＨＯマウスに対する研究に進む前に、これらマウスにおけるホモシステイン、シスタチオニン、システインおよびメチオニンの毎日の変動を、これら動物におけるこれらアミノ酸の日内変動を決定するためにアッセイした。よって、６匹のＨＯマウスからの血液を、２４時間サイクル全体を通じて図３Ｂに示された時点で採血し、各示された時点について血漿代謝産物レベルを決定した。図３Ｂに示されるように、シスタチオニンおよびシステインのレベルは、２４時間サイクルを通してほとんど一定であった。ホモシステインおよびメチオニンレベルは、朝７：００から午前遅く〜午後早くまで低下する傾向にあった。これは、夜に摂食し、含硫置換基移動経路を介するホモシステイン代謝の能力を欠いている動物に関して一貫していた。よって、全ての注射および採血を、Ｈｃｙレベルが最低であった１５：００（３ＰＭ）に行って、処置によって、Ｈｃｙおよび他の代謝産物のさらなる低下が生じたか否かを決定した。

【0089】

ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの分子量および比活性（Ｓ．Ａ．）は、特徴付けの中心的な特性である。ＭＥ−４００ＭＡ（レーン１， 図３Ｃ）、ＧＬ４−４００ＭＡ（レーン２）もしくはＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ（レーン３）でのＰＥＧ化後に、上記生成物を、１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動によって分離し、非ＰＥＧ化酵素（レーン４）と比較した。得られたゲルを、クーマシーブルーで染色した。上記ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの各々のＳ．Ａ．（Ｕ／ｍｇ）を、表添付の図３Ｃに示す。示されるように、ＰＥＧ化は、Ｓ．Ａ．値に有意な影響は有さず、上記酵素は、ＰＥＧ化前と同程度に活性なままであった。見かけ上の分子量によれば、この実験で使用される条件下でのｒｈＣＢＳΔＣのＰＥＧ化は、ジＰＥＧ化およびトリＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣを生じた。

【0090】

本明細書で記載される実験の全体の目的は、投与されるＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの薬力学的パラメーターを評価することであった。ＣＢＳ欠損ホモシスチン尿症の動物モデルにおいて、血漿ホモシステインの低下および血漿シスタチオニンの増大に特別な重きがおかれた。通常のマウス飼料を与えたＨＯマウスを、酵素補充療法（ＥＲＴ）のこのタイプを試験するためのモデル系として選択した。ＨＯマウスに、時間０で、ＰＥＧ分子（ＧＬ４−４００ＭＡ、ＭＥ−４００ＭＡ、ＭＥ−２００ＭＡ０Ｂ）でＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣを１回注射し、時間０（注射前）、２４時間、４８時間および７２時間で採血した。上記群の各々（ｎ＝５〜６）に関する血漿ホモシステインのレベル（図３Ｄ）およびシスタチオニンのレベル（図３Ｅ）を、示す。図３Ｄに示されるように、ホモシステインレベルは、使用される各ＰＥＧ化形態に対して有意に低下し、シスタチオニンレベル（図３Ｅ）は、時間０と比較して、約６〜７倍増大した。従って、ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの投与は、インビボでホモシステインおよびシスタチオニンレベルに有意かつ正の影響を与えることが見出された。

【0091】

（実施例５：ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの反復注射は、ホモシステインおよびシスタチオニン血漿レベルに有意に影響を及ぼし、正常システインレベルを回復させる）
非ＰＥＧ化およびＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣを、ホモシステインを下げ、かつ低レベルのホモシステインを維持し、ならびにシスタチオニンおよびシステインレベルを増大させる能力について比較する、休薬期間を有する反復注射レジメンを、以下のように行った。６匹のＨＯマウスに、０日目、１日目、２日目、３日目および４日目に、ＧＬ４−４００ＭＡ ＰＥＧでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣを注射し（矢印，図４）、続いて、１０日間の休薬期間を設け、次いで、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目および１８日目に、再び注射した。血漿サンプルを、図４に示された時点で（常に注射の前に）採取した。比較のために、同じ注射レジメンを、非ＰＥＧ化酵素を注射した５匹のＨＯマウスにも行った。血漿代謝産物のレベルを、実施例１ｅに記載されるように、Ｓｔａｂｌｅ−Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ-Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙによって決定した。各マウスに関するホモシステイン（図４ａに示される結果）およびシスタチオニン（図４ｂ）の血漿濃度が示される。各実験群に関するホモシステインおよびシスタチオニンの平均値もまた、示される（図４ｃ中）。図４ａ〜４ｃに示されるように、平均ホモシステイン濃度は、４８時間で１８２μＭから３８μＭへと低下し、週全体にわたって低いままであった。シスタチオニンは、時間０での最初の４．７μＭから４８時間で４２μＭの濃度に達し、第１週の間に高いままであった。休薬期間の間、代謝産物は、それらの初期値に戻った。その後のＣＢＳ注射は、ホモシステインレベルの鋭い低下およびシスタチオニンレベルの上昇を再びもたらした。その後、処置の中止は、再度、これらパラメーターの未処置レベルへの復帰を生じた。

【0092】

非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣと比較して、時間０でのパーセンテージとして図４ｄに示されるように、血漿ホモシステインレベルに対するＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの効果もまた決定した。図４ｄは、ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣとは対照的に、非ＰＥＧ化酵素が血液サンプルが注射して２４時間以上後であった場合に、ホモシステイン濃度に対して明らかな効果を有しなかったことを図示する。これは、非ＰＥＧ化酵素が、循環から迅速に一掃され、注射して２４時間後および４８時間後に有意な活性がなかったことを示す実施例２および３に示される結果と一致する。

【0093】

非ＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣと比較して、血漿システインレベルに対するＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣの効果をまた、同じ実験法を使用して決定した。図４Ｅに示されるように、システインレベルはＰＥＧ化酵素の注射期間の間に正常になった（時間０と比較して２倍）が、非ＰＥＧ化酵素を使用してもシステインレベルの変化は何ら認められなかった。

【0094】

これら結果は、ＨＯマウスにＳＱ投与したＰＥＧ化ｒｈＣＢＳΔＣ酵素が、ホモシステインおよびシスタチオニン濃度に対して有意に正の影響を及ぼし、同時に、システインレベルをそれらの正常値へと回復させることを示した。後者の実験結果は、細胞内含硫置換基移動経路がｒｈＣＢＳΔＣの投与後に活性化されたという指標である。

【0095】

（実施例６：ヒト短縮型ＣＢＳ調製物（ｒｈＣＢＳΔＣ）の凝集の程度の変動性）
未変性ＰＡＧＥゲル（４−１５％ すなわち、ドデシル硫酸ナトリウムのような変性剤の添加なし）を、ｒｈＣＢＳΔＣの種々のバッチ（１１２、１３、７、２７および２８）で行った。図５Ａに示した結果は、種々の調製物がテトラマー（Ｔ）およびダイマー（Ｄ）の種々の比、およびより高次の形態の凝集したＣＢＳを有することを図示する。ゲル中のＣＢＳ活性（図５Ｂ）は、４℃でのタンパク質サンプルに対する電気泳動を行うことによって、未変性ポリアクリルアミドゲルで（活性染色によって）決定した。次いで、上記ゲルを、活性染色溶液（表Ａを参照のこと）中に沈め、３７℃で約１５分間インキュベートした。約１５分後に、ロードした量に依存して、濃灰色のバンド（１−４１３ ＣＢＳ種の約４５ｋＤａダイマー）が出現した。さらに長時間の後に；最大で１時間もしくは室温で一晩で、テトラマーが視認可能になった。このゲル中活性法で未変性ゲルを分析すると、図５Ｂに例示されるように、図５Ａにおいてバッチ１１２および２８で出現しているテトラマー（Ｔ）、ダイマー（Ｄ）、および他のより高次の凝集した形態のｒｈＣＢＳΔＣのバンドがＣＢＳ関連だったことが確認される。

【0096】

【表2】

バッチ２８および１１２、ならびにそれらのＰＥＧ化生成物のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析から、ｒｈＣＢＳΔＣバッチのＭＥ−２００ＭＡ０ＢでのＰＥＧ化は、ＰＥＧ化後に形成される２つのＰＥＧ化バンド（Ｐ）の間で種々の比を示すことが示された（図５Ｃを参照のこと）。従って、凝集を減らし、再現性を増大させる手段が求められた。

【0097】

（実施例７：ヒトＣ１５Ｓ変異体ＣＢＳのみがダイマーを形成する）
システイン（ｒｈＣＢＳΔＣの１５位にある）はカップリングしないので、それは、凝集形成をもたらす考えられる因子と考えられた。従って、新たな組換えプラスミドを、ｒｈＣＢＳΔＣ変異体タンパク質（本明細書でＣ１５Ｓといわれる）を生成するために調製した。ｒｈＣＢＳΔＣを作製するために実施例１ｂで使用した同じストラテジーを、以下のプライマーを使用することによって、Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳ酵素（Ｔ→Ａヌクレオチド変異）を生成するために使用した：

【0098】

【化5】

Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳ短縮型酵素のヌクレオチド配列全体（配列番号１４）を、ヌクレオチド配列決定によって検証した。組換えヒトＣＢＳ短縮型のために実施例１で記載される同じ方法を、Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳ酵素の発現および単離のために使用した。

【0099】

単離されたＣ１５Ｓ ＣＢＳ酵素の未変性ＰＡＧＥは、ダイマー（Ｄ）およびテトラマー（Ｔ）、ならびにより高次のオリゴマー形態を形成した組換えヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）について得られた結果とは異なって、Ｃ１５Ｓ ＣＢＳがダイマーとしてのみ存在することを実証した（図６Ａを参照のこと）。Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳの複数のバッチ（５１、６０および７３）および組換えヒト二重短縮型（バッチＲＣ−２−７６）は、それら両方が、上記組換えヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）とは対照的に、ダイマーのみを形成することを実証した（図６Ｂを参照のこと）。ＭＥ−２００ＭＡ０ＢでのＣ１５ＳのＰＥＧ化は、ＰＥＧ化バンドの間で類似の比を有する均一なかつ再現性のあるバンドを生じた。変性ＳＤＳ ＰＡＧＥは、Ｃ１５Ｓが組換えヒト二重短縮型（バッチＲＣ−２−７６）に類似して再現性のあるＰＥＧ化パターンを生じ、両方が組換えヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）を使用して得られたパターンとは異なることを示した（図６Ｃ）。これはまた、ｒｈＣＢＳΔＣで再現性のないＰＥＧ化パターンを示す図５Ｃに匹敵した。

【0100】

ＣＢＳ調製物のＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーを行った。両方の組換えヒト短縮型ＣＢＳ（ｒｈＣＢＳΔＣ）（図７Ａ）およびＣ１５Ｓ変異体（図７Ｂ）を、Ｙａｒｒａ ＳＥＣ−３０００， ３００×７．８ｍｍサイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， ＣＡ， ＵＳＡ）で分離した。上記カラムを較正し、１００ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ＝６．８中、流速１ｍｌ／分で室温において操作した。図７は、ｒｈＣＢＳΔＣ（図７Ａ）およびＣ１５Ｓ変異体（図７Ｂ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を示す。これら分析は、５つの異なるバッチから再現性のある単一ピークを与えたので、Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳがダイマーとしてのみ存在したという追加の証拠を提供する（図７Ｂを参照のこと）。比較のために、図７ＡにおけるｒｈＣＢＳΔＣの６つの異なるパターンおよび図７ＢにおけるＣ１５Ｓ変異体ＣＢＳの単一ピークに注目のこと。

【0101】

（実施例８：２匹のＨＯマウスにおいて２０日間にわたるＰＥＧ化Ｃ１５Ｓの連続投与は、血漿ホモシステインの減少を生じた）
ＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプは、長期間にわたってＣ１５Ｓ酵素の一定の制御された送達を可能にした。上記Ｃ１５Ｓ ＣＢＳ酵素を、ＡＬＺＥＴ（登録商標）ポンプ（Ｍｉｃｒｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ ＡＬＺＥＴ（登録商標） Ｐｕｍｐ， Ｍｏｄｅｌ １００２． Ｌｏｔ １０２６８−１２）を使用して投与して、反復皮下注射の代わりに、Ｃ１５Ｓ ＣＢＳ酵素をマウスに連続送達した。これら実験において、平均ポンプ送達速度は、０．２１μｌ／時であった；平均充填容積は、１０６．６μｌであった；上記ポンプは、２６．２μｇ／μｌの濃度で約１０６μｌのＰＥＧ化Ｃ１５Ｓ ＣＢＳ酵素が装填された。２匹のＨＯマウスでの２０日間にわたるＣ１５Ｓ ＣＢＳの連続投与は、血漿ホモシステインにおいて初期の有意なおよびその後持続した低下を生じた（図８を参照のこと）。

【0102】

術前および術後の疼痛緩和のために、動物には、ＡＬＺＥＴ（登録商標）ポンプの埋め込み手術の前後４８時間にわたって、ウォーターボトル中のＴＹＬＥＮＯＬ（登録商標）（２ｍｇ／ｍｌ）を随意に与えられた。さらに、動物には、Ｃａｒｐｒｏｆｅｎ ５ｍｇ／ｋｇを、術後４８時間にわたって、皮下に２４時間ごとに与えられた。

【0103】

動物の麻酔および手術のために、イソフルランを吸入によって投与した。マウスを、５％ イソフルランで誘導し、２〜３％で維持した。マウスに麻酔がかかっている間に、彼らは各々、安全キャビネット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｃａｂｉｎｅｔ）中で無菌条件下で埋め込まれた医療グレードのＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透圧ポンプを受けた。ポンプを、頸部の腹側のたるんだ皮膚領域の皮下に埋め込んだ。上記ポンプを埋め込む前に、上記マウスを剃毛し、皮膚領域をＢＥＴＡＤＩＮＥ（登録商標）で準備した。ポンプ埋め込みには、小さな外科的切開（５ｍｍ）を滅菌した鋏で作り出すことが必要であった。その切開を、創傷クリップで閉じた。クリップを、皮膚が完全に治癒した場合に１週間後に外した。ポンプ埋め込み直前および図８に示される時間で、血液サンプルをホモシステインレベルを測定するために採取した。その結果は、この投与様式が、ホモシステインレベルを、毎日のｒｈＣＢＳΔＣ投与によって達成されるのと類似の様式で低下させることを示す。非ＰＥＧ化Ｃ１５Ｓ変異体ＣＢＳを使用して行った類似の実験から、Ｈｃｙ血漿レベルの明らかな低下は生じなかった（結果は示さず）。

【0104】

（実施例９：３種のＰＥＧ化短縮型ヒトＣＢＳ酵素の比較）
図９は、ＨＯマウスに、単一用量（７．５ｍｇ／ｋｇ）で、時間０で、ＭＥ−２００ＭＡ０ＢでＰＥＧ化したｒｈＣＢＳΔＣ、Ｃ１５Ｓ変異体（Ｃ１５Ｓ）および二重短縮型構築物（二重短縮型）を注射した実験の結果を示す棒グラフである。時間０（注射前に）、注射して２４時間後、４８時間後および７２時間後でマウスから採血した。上記群（ｎ＝５〜６）の各々の血漿ホモシステインのレベルを示す。結果は、３種の酵素形態全てが、Ｈｃｙ血漿濃度の匹敵する低下をもたらすことを示す。

【0105】

【表3-1】

【0106】

【表3-2】

【0107】

【表3-3】

【0108】

【表3-4】

本発明を詳細に、およびその具体的実施形態への参照によって記載してきたが、改変およびバリエーションは、添付の特許請求の範囲に定義される発明の範囲から逸脱することなく考えられることは、明らかである。より具体的には、本発明のいくつかの局面は、特に有利として本明細書で同定されるものの、本発明が、本発明のこれら特定の局面に必ずしも限定されないことは予期される。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]