特許 6455864 ポリヌクレオチド及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6455864

(24)【登録日】2018年12月28日

(45)【発行日】2019年1月23日

(54)【発明の名称】ポリヌクレオチド及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20190110BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20190110BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20190110BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/11 ZZNA

   C12Q1/6876 Z

   C12Q1/6844 Z

【請求項の数】17

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2013-238119(P2013-238119)

(22)【出願日】2013年11月18日

(65)【公開番号】特開2014-100144(P2014-100144A)

(43)【公開日】2014年6月5日

【審査請求日】2016年11月2日

(31)【優先権主張番号】10-2012-0131026

(32)【優先日】2012年11月19日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】390019839

【氏名又は名称】三星電子株式会社

【氏名又は名称原語表記】Ｓａｍｓｕｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】八田国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】朴 東 賢

(72)【発明者】

【氏名】洪 性 宇

(72)【発明者】

【氏名】朴 卿 希

(72)【発明者】

【氏名】李 妙 龍

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００３−５１５１４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５２７９７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１２０８０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００１／００３９０３９（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的核酸の３’末端に由来する少なくとも二つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、
前記標的核酸の５’末端に由来する少なくとも二つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域、および
前記第２相補領域の５’末端側に、前記標的核酸に対して相補的ではない第３領域を含み、
前記第１相補領域の長さが、２から４残基のヌクレオチドであり、
前記第２相補領域の長さが、６から１２残基のヌクレオチドであり、
前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端側に位置するポリヌクレオチドからなる前記標的核酸を増幅するための逆転写プライマー。

【請求項2】

前記第１相補領域が、前記標的核酸の３’末端のヌクレオチドに由来する２から４残基の連続ヌクレオチドに対して相補的であることを特徴とする請求項１に記載の逆転写プライマー。

【請求項3】

前記第２相補領域が、前記標的核酸の５’末端のヌクレオチドに由来する６から１２残基の連続ヌクレオチドに対して相補的であることを特徴とする請求項１または２に記載の逆転写プライマー。

【請求項4】

前記標的核酸の長さが、１５から２００残基のヌクレオチドであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の逆転写プライマー。

【請求項5】

前記標的核酸が、ＲＮＡであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の逆転写プライマー。

【請求項6】

前記標的核酸が、非コードＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはデキャッピングｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の逆転写プライマー。

【請求項7】

前記第３領域が、プライマー配列、制限酵素認識部位またはプローブ結合部位を含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の逆転写プライマー。

【請求項8】

前記第１相補領域及び前記第２相補領域のうち少なくとも一つが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド類似体を含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の逆転写プライマー。

【請求項9】

前記第３領域が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド類似体を含むことを特徴とする請求項１から２および４から８のいずれか一項に記載の逆転写プライマー。

【請求項10】

標的核酸の３’末端に由来する少なくとも二つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び
前記標的核酸の５’末端に由来する少なくとも二つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域、および
前記第２相補領域の５’末端側に、前記標的核酸に対して相補的ではない第３領域を含み、
前記第１相補領域の長さが、２から４残基のヌクレオチドであり、
前記第２相補領域の長さが、６から１２残基のヌクレオチドであり、
前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端側に位置するポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、前記標的核酸を増幅するための組成物。

【請求項11】

標的核酸の３’末端に由来する少なくとも二つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び
前記標的核酸の５’末端に由来する少なくとも二つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域、および
前記第２相補領域の５’末端側に、前記標的核酸に対して相補的ではない第３領域を含み、
前記第１相補領域の長さが、２から４残基のヌクレオチドであり、
前記第２相補領域の長さが、６から１２残基のヌクレオチドであり、
前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端側に位置するポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、前記標的核酸を増幅するためのキット。

【請求項12】

標的核酸の３’末端に由来する少なくとも二つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び前記標的核酸の５’末端に由来する少なくとも二つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域、および前記第２相補領域の５’末端側に、前記標的核酸に対して相補的ではない第３領域を含み、前記第１相補領域の長さが、２から４残基のヌクレオチドであり、前記第２相補領域の長さが、６から１２残基のヌクレオチドであり、前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端方向に位置するポリヌクレオチド、並びに前記標的核酸をハイブリダイズさせるプロセスと、
前記ハイブリダイズされたポリヌクレオチド及び標的核酸を、核酸ポリメラーゼの存在下でインキュベートし、前記ポリヌクレオチドの３’末端から、前記標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を生成するプロセスと、を含むことを特徴とする、前記標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を生成する方法。

【請求項13】

前記核酸ポリメラーゼが、鎖置換活性を有することを特徴とする請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記逆転写酵素が、ＨＩＶ、ＭＭＬＶまたはＡＭＶから由来する逆転写酵素であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記標的核酸が、ＲＮＡであることを特徴とする請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記標的核酸が、非コードＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはデキャッピングｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標的核酸の３’末端及び５’末端に相補的な相補領域を含むポリヌクレオチド及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

核酸の増幅は、核酸ポリメラーゼの存在下で、プライマーの３’末端からヌクレオチド配列を伸長することを含む。前記プライマーは、標的核酸に対して相補的な配列を含む。ヌクレオチド配列を伸長させるため、プライマーと標的核酸は、特異的に安定してお互いにハイブリダイズされる必要があるが、プライマーの長さが短くなると、一般的には標的配列に対する特異性が低下する。短い標的核酸は、プライマーのデザインに困難さを伴う。プライマーと標的核酸がハイブリダイズした核酸産物の安定性は、相補的な配列の長さに比例することが知られている。一方、プライマーの長さが長くなれば、増幅される核酸の長さが短くなる。従って、プライマーを特異的に安定して標的核酸に結合させ、増幅される標的核酸に対する特異性を向上させるポリヌクレオチドの開発が、依然として要求されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１０／０１１２６４４号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２０１２／００７１３３２号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、従って、増幅される標的核酸に対する特異性を向上させるポリヌクレオチドを提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本願発明者らは、標的核酸の３’末端からの少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び標的核酸の５’末端からの少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域を含み、前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端側に位置するポリヌクレオチドによれば上記課題を解決できることを見出し、本願発明の完成に至った。本発明は、以下の内容をその骨子とする。
（１）標的核酸の３’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び標的核酸の５’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域を含み、前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端側に位置するポリヌクレオチド。
（２）前記第１相補領域が、前記標的核酸の３’末端のヌクレオチドに由来する２から７残基の連続ヌクレオチドに対して相補的であることを特徴とする（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）前記第２相補領域が、前記標的核酸の５’末端のヌクレオチドに由来する３から２０残基の連続ヌクレオチドに対して相補的であることを特徴とする（１）または（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）前記第１相補領域の長さが、２から７残基のヌクレオチドであることを特徴とする（１）から（３）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
（５）前記第２相補領域の長さが、３から２０残基のヌクレオチドであることを特徴とする（１）から（４）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
（６）前記標的核酸の長さが、１５から２００残基のヌクレオチドであることを特徴とする（１）から（５）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
（７）前記標的核酸が、ＲＮＡであることを特徴とする（１）から（６）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
（８）前記標的核酸が、非コードＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはデキャッピングｍＲＮＡであることを特徴とする（１）から（７）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
（９）前記第２相補領域の５’末端側に、前記標的核酸に対して相補的ではない第３領域をさらに含むことを特徴とする（１）から（８）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
（１０）前記第３領域が、プライマー配列、制限酵素認識部位またはプローブ結合部位を含むことを特徴とする（９）に記載のポリヌクレオチド。
（１１）前記第１相補領域及び前記第２相補領域のうち少なくとも一つが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド類似体を含むことを特徴とする（１）から（１０）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
（１２）前記第３領域が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド類似体を含むことを特徴とする（９）から（１１）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
（１３）標的核酸の３’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び標的核酸の５’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域を含み、前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端側に位置するポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、標的核酸を増幅するための組成物。
（１４）標的核酸の３’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び標的核酸の５’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域を含み、前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端側に位置するポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、標的核酸を増幅するためのキット。
（１５）標的核酸の３’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び標的核酸の５’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域を含み、前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端方向に位置するポリヌクレオチド、並びに標的核酸をハイブリダイズさせるプロセスと、前記ハイブリダイズされたポリヌクレオチド及び標的核酸を、核酸ポリメラーゼの存在下でインキュベートし、前記ポリヌクレオチドの３’末端から、前記標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を生成するプロセスと、を含むことを特徴とする、標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を生成する方法。
（１６）前記核酸ポリメラーゼが、鎖置換活性を有することを特徴とする（１５）に記載の方法。
（１７）前記鎖置換活性を有するポリメラーゼが、逆転写酵素であることを特徴とする（１６）に記載の方法。
（１８）前記逆転写酵素が、ＨＩＶ、ＭＭＬＶまたはＡＭＶから由来する逆転写酵素であることを特徴とする（１７）に記載の方法。
（１９）前記標的核酸が、ＲＮＡであることを特徴とする（１５）から（１８）のいずれか一つに記載の方法。
（２０）前記標的核酸が、非コードＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはデキャッピングｍＲＮＡであることを特徴とする（１５）から（１９）のいずれか一つに記載の方法。

【発明の効果】

【0006】

本発明のポリヌクレオチドを使用すれば、標的核酸の３’末端に結合する領域（相補的な配列の長さ）を減らしつつ、標的核酸を優れた特異性で増幅することができる。

【0007】

本発明の組成物及びキットを使用すれば、標的核酸を優れた特異性で増幅することができる。

【0008】

本発明の標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を生成する方法によれば、標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を優れた特異性で生成できる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、本発明の一実施形態であるポリヌクレオチド、及び本発明の一実施形態である標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を生成する方法を示す図面である。

【図2】図２は、本発明の一実施形態であるポリヌクレオチドによる、プライミング効果を示すグラフである。

【図3】図３は、第１相補領域及び第２相補領域の長さと、プライミング効果との関係を示すグラフである。

【図4】図４は、本発明の一実施形態であるポリヌクレオチドの使用による検出感度を示すグラフである。

【図5A】図５Ａは、標的核酸であるｍｉＲ−１６についての、本発明の一実施形態のポリヌクレオチドの検出感度を示すグラフである。

【図5B】図５Ｂは、標的核酸であるｍｉＲ−２１についての、本発明の一実施形態のポリヌクレオチドの検出感度を示すグラフである。

【図5C】図５Ｃは、標的核酸であるｍｉＲ−２０６についての、本発明の一実施形態のポリヌクレオチドの検出感度を示すグラフである。

【図6A】図６Ａは、標的核酸であるｍｉＲ−１６についての特異性を示すグラフである。

【図6B】図６Ｂは、標的核酸であるｍｉＲ−２１０についての特異性を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、添付された図面を参照しつつ、本発明の望ましい実施形態について詳細に説明する。この点において、本発明は異なる実施形態を有しても良く、本明細書に明記された記載に限定されて解釈されるべきものではない。

【0011】

実施形態は、本願発明の詳細な説明の態様を単に説明するため、図面を参照し、以下に記載される。本明細書で使用される「及び／又は」という語句は、関連するリスト項目のいずれか、及び一つ以上の組み合わせの全てを含む。「少なくとも一つの」のような表現は、要素（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）のリストの前で使用されるときは、要素のリストの全体を修正（ｍｏｄｉｆｙ）し、当該リストの個々の要素を修正しない。

【0012】

本発明の一実施形態によれば、標的核酸の３’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び標的核酸の５’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域を含み、前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端側に位置するポリヌクレオチドが提供される。

【0013】

本発明に係るポリヌクレオチドの第１相補領域は、標的核酸の３’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに相補的である。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの第１相補領域は、標的核酸の３’末端のヌクレオチドに由来する、２残基、３残基、４残基、５残基、６残基または７残基の連続ヌクレオチドに対して相補的である。例えば、第１相補領域は、長さが２残基から７残基のヌクレオチドである。第１相補領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）またはヌクレオチド類似体（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）を含んでもよい。

【0014】

本発明に係るポリヌクレオチドの第２相補領域は、標的核酸の５’末端に由来する連続ヌクレオチドの一つ以上に対して相補的である。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの第２相補領域は、標的核酸の５’末端のヌクレオチドに由来する、３残基、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、１０残基、１１残基、１２残基、１３残基、１４残基、１５残基、１６残基、１７残基、１８残基、１９残基または２０残基の連続ヌクレオチドに対して相補的である。例えば、第２相補領域は、長さが３残基から２０残基のヌクレオチドである。第２相補領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド類似体を含んでもよい。

【0015】

本発明に係るポリヌクレオチドの第１相補領域は、第２相補領域の３’末端側に位置することができる。第１相補領域と第２相補領域は、互いに離隔していないか、または一つ以上のヌクレオチドによって離隔されていてもよい。

【0016】

本発明に係るポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡでもある。また、本発明に係るポリヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでもよい。本発明に係るポリヌクレオチドの第２相補領域は、例えば、ヌクレオチド類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでもよい。ヌクレオチド類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）は、第２相補領域だけではなく、第１相補領域にも含まれてもよい。すなわち、本発明の一実施形態は、第１相補領域及び第２相補領域のうち少なくとも一つが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド類似体を含む。本発明に係るポリヌクレオチドは、一本鎖でもある。ポリヌクレオチドの長さは、７残基から２００残基、７残基から１８０残基、７残基から１５０残基、７残基から１３０残基、７残基から１００残基、７残基から８０残基、７残基から５０残基、７残基から３０残基、７残基から２０残基、７残基から１５残基、または１０残基から４０残基でもある。

【0017】

本発明において、標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡとのキメラでもある。標的核酸は、一本鎖または二本鎖でもある。標的核酸は、長さが１５残基から２００残基、１５残基から１８０残基、１５残基から１５０残基、１５残基から１３０残基、１５残基から１００残基、１５残基から８０残基、１５残基から５０残基、１５残基から４０残基、または１５残基から３０残基のヌクレオチドでもある。標的核酸は、低分子ＲＮＡでもある。標的核酸である低分子ＲＮＡは、例えば、非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはデキャッピング（ｄｅｃａｐｐｉｎｇ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）でもある。真核細胞の天然ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を有する。しかし、生物学的試料またはそれから分離されたｍＲＮＡの保管中または処理中に、ｍＲＮＡは分解されることもある。その場合、分離産物は、天然ｍＲＮＡの５’キャップ構造を有さないこともある。５’キャップ構造は、三リン酸結合を介するｍＲＮＡの５’末端のリボース糖の５’−ＯＨに７−メチルグアニレートが結合した構造、またはその結合分解産物として、ｍＲＮＡの５’末端のリボース糖の５’−ＯＨにグアニレートが結合した構造である。また、標的核酸は、２００残基以上のヌクレオチドを有するＲＮＡでもよく、ＧＣ含有量が３０％未満であるか８０％以上である３０残基の連続した配列領域を有するＲＮＡでもよく、相補的配列を分子内に有することにより分子内二次構造（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成することができる５残基以上の連続したヌクレオチドを該ＲＮＡは含み、お互いに相補的な５残基以上の連続したヌクレオチドを該ＲＮＡは含み、またはこれらの組み合わせである。

【0018】

本発明に係るポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの第２相補領域の５’末端側に、標的核酸に対して相補的ではない第３領域をさらに含んでもよい。第３領域は、第２相補領域の５’末端側に位置することができる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドは、５’−第３領域−第２相補領域−第１相補領域−３’、という形態でもある。例えば、第３領域は、長さが３残基から２００残基のヌクレオチドである。例えば、第３領域は、３残基から２００残基、３残基から１８０残基、３残基から１５０残基、３残基から１３０残基、３残基から１００残基、３残基から８０残基、３残基から５０残基、３残基から４０残基、または３残基から３０残基でもある。第３領域は、プライマー配列、制限酵素認識部位、またはプローブ結合部位を含んでもよい。第３領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド類似体を含んでもよい。第３領域と第２相補領域は、離隔していないか、または一つ以上のヌクレオチドによって離隔されていてもよい。その場合、第３領域と第２相補領域とのリンカーは、プライマー結合部位、制限酵素認識部位またはプローブ結合部位を含んでもよい。

【0019】

本発明に係るポリヌクレオチドは、鋳型依存的な核酸合成において、プライマーとして機能することができる。従って、本発明に係るポリヌクレオチドは、プライマーとして使用されることもある。本発明に係るポリヌクレオチドは、試料中の標的核酸の存在を確認するためのプローブとして使用されることもある。

【0020】

本発明に係るポリヌクレオチドの一実施形態において、第１相補領域と第３領域との間に第２相補領域を位置させることにより、第１相補領域の長さを短くすることができ、逆転写によって生成されるＤＮＡの長さを増大させることができる。生成されるＤＮＡの長さが増大されることにより、標的核酸であるＲＮＡに特異的なプライマーをデザインすることが容易になる。さらに、第２相補領域が存在することにより、標的核酸の検出において、感度及び特異性を向上させることができる。

【0021】

本発明の別の実施形態では、標的核酸の３’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び標的核酸の５’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域を含み、前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端側に位置するポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、標的核酸を増幅するための組成物が提供される。

【0022】

本発明に係る組成物において、ポリヌクレオチド及び標的核酸は、前述の通りである。

【0023】

本発明に係る組成物は、標的核酸を増幅するための組成物である。増幅プロセスは、公知の核酸増幅方法でもよい。標的核酸の増幅は、ＤＮＡ増幅またはＲＮＡ増幅でもある。増幅方法は、サーマルサイクリング（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｉｎｇ）、または等温（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ）条件下で行われるものでもある。増幅プロセスの例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ：ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ：ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。増幅方法はまた、ＲＮＡ増幅方法を含んでもよい。増幅方法は例えば、逆転写（ＲＴ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含んでもよい。増幅プロセスは、標的核酸配列またはそれに相補的な配列のコピー数を増加させるプロセスである。本明細書で使用される「ＰＣＲ」という語句は、核酸ポリメラーゼを用いて、標的核酸に特異的に結合するプライマー対から標的核酸を増幅する方法である。

【0024】

従って、本発明に係る組成物は、標的核酸の増幅に要求される公知のマテリアル（ｍａｔｅｒｉａｌ）をさらに含むこともある。例えば、本発明に係る組成物は、核酸ポリメラーゼ、核酸ポリメラーゼ活性に適したバッファー、補助因子、及び／または基質をさらに含むこともある。核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、及びそれらの組み合わせから選択してもよい。「逆転写」という語句は、ＲＮＡを鋳型にした、ＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ鎖の合成を指す。核酸ポリメラーゼは、鎖置換活性を有することもある。例えば、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＭＬＶ（ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）またはＡＭＶ（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）から由来する一つ以上の逆転写酵素でもよい。核酸ポリメラーゼは、３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有さないこともある。本発明に係る組成物は、逆転写またはＰＣＲ増幅に必要なマテリアルを含むこともある。

【0025】

本発明の別の実施形態では、標的核酸の３’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び標的核酸の５’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域を含み、前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端側に位置するポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、標的核酸を増幅するためのキットが提供される。

【0026】

本発明に係るキットにおいて、ポリヌクレオチド及び標的核酸は、前述の通りである。

【0027】

本発明に係るキットは、標的核酸を増幅するためのキットである。増幅プロセスは、公知の核酸増幅方法でもよい。標的核酸の増幅は、ＤＮＡ増幅またはＲＮＡ増幅でもある。増幅方法は、サーマルサイクリング、または等温条件下で行われるものでもある。増幅プロセスの例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などが挙げられる。増幅方法はまた、ＲＮＡ増幅方法を含むこともある。例えば、逆転写（ＲＴ）または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。増幅プロセスは、標的核酸配列、またはそれに相補的な配列のコピー数を増加させる。「ＰＣＲ」という語句は、核ポリメラーゼを用いて、標的核酸に特異的に結合するプライマー対から標的核酸を増幅する方法である。

【0028】

従って、本発明に係るキットは、標的核酸の増幅に要求される公知のマテリアルをさらに含むこともある。例えば、本発明に係るキットは、核酸ポリメラーゼ、核酸ポリメラーゼ活性に適したバッファー、補助因子、及び／または基質をさらに含むこともある。例えば、本発明に係るキットは、標的核酸をさらに含んでもよい。核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及びそれらの組み合わせから選択してもよい。「逆転写」という語句は、ＲＮＡを鋳型にした、ＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ鎖の合成を指す。核酸ポリメラーゼは、鎖置換活性を有することもある。例えば、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ、ＭＭＬＶまたはＡＭＶから由来する逆転写酵素でもよい。核酸ポリメラーゼは、３’−＞５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないこともある。本発明に係るキットは、逆転写またはＰＣＲ増幅に必要なマテリアルを含むこともある。また、本発明に係るキットは、標的核酸を増幅するための使用についての説明書をさらに含んでもよい。

【0029】

本発明の別の実施形態では、標的核酸の３’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び標的核酸の５’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域を含み、前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端方向に位置するポリヌクレオチド、並びに標的核酸をハイブリダイズさせるプロセスと、前記ハイブリダイズされたポリヌクレオチド及び標的核酸を、核酸ポリメラーゼの存在下でインキュベートし、前記ポリヌクレオチドの３’末端から、前記標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を生成するプロセスと、を含むことを特徴とする、標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を生成する方法が提供される。

【0030】

本発明に係る方法は、標的核酸の３’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び標的核酸の５’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域を含み、前記第１相補領域は、前記第２相補領域の３’末端方向に位置するポリヌクレオチド、並びに標的核酸とをハイブリダイズさせるプロセスを含む。

【0031】

本発明に係る方法において、ポリヌクレオチド及び標的核酸は、前述の通りである。すなわち、本発明に係る方法において、標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡとのキメラでもある。また、本発明に係る方法においては、標的核酸は、非コードＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはデキャッピングｍＲＮＡでもよい。

【0032】

ハイブリダイズプロセスは、公知の方法によって行われる。ハイブリダイズプロセスは例えば、核酸のハイブリダイゼーションに適切な公知のバッファー内で、ポリヌクレオチドと標的核酸とをインキュベートすることにより、行われる。ハイブリダイズプロセスは、適切な温度、例えば、０℃から２５℃、例えば４℃で行われる。ハイブリダイズ温度は、選択されるポリヌクレオチドと標的核酸の配列及び長さによって適宜選択される。ハイブリダイズプロセスは、適切な時間、例えば、１時間から１２時間（一晩）行われる。

【0033】

本発明に係る方法は、ハイブリダイズされた試料を、核酸ポリメラーゼ存在下でインキュベートし、標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を、本発明に係るポリヌクレオチドの３’末端から生成するプロセスを含む。

【0034】

核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素及びそれらの組み合わせから選択してもよい。「逆転写」という語句は、ＲＮＡを鋳型にした、ＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ鎖の合成を指す。核酸ポリメラーゼは、鎖置換活性を有するものでもよい。鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素でもよい。逆転写酵素は、例えば、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ、ＭＭＬＶまたはＡＭＶから由来する逆転写酵素でもよい。核酸ポリメラーゼは、３’ −＞５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないこともある。

【0035】

インキュベートプロセスは、核酸ポリメラーゼの活性に適切な条件で行われる。インキュベートプロセスは、核酸ポリメラーゼ、核酸ポリメラーゼ活性に適したバッファー、補助因子及び基質の存在下で行われる。例えば、インキュベートプロセスは、逆転写またはＰＣＲ増幅に必要なマテリアルの存在下で行われるものが挙げられる。

【0036】

インキュベートプロセス（生成プロセス）を経て、標的核酸に相補的なヌクレオチド配列が、本発明に係るポリヌクレオチドの３’末端から生成される。生成プロセスでは、ポリヌクレオチドの３’末端から伸長し、標的核酸とハイブリダイズしたポリヌクレオチドの５’末端を核酸ポリメラーゼが置換させることを含む。

【0037】

本発明に係る方法は、生産された産物、すなわち、標的核酸に相補的なヌクレオチド配列が存在するか否かを測定するプロセスをさらに含んでもよい。測定の結果、生産された産物が存在する場合、試料内に標的核酸が存在する。生産された産物が存在しない場合、試料内に標的核酸が存在しない。

【0038】

また、本発明に係る方法は、生産された産物、すなわち、標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を鋳型にして、核酸を増幅するプロセスをさらに含んでもよい。増幅プロセスは、公知の方法によって行われる。増幅方法については、前述の通りである。

【0039】

以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0040】

[実施例１．二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの製造]
本実施例では、標的核酸の３’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第１相補領域、及び標的核酸の５’末端に由来する少なくとも一つの連続ヌクレオチドに対して相補的な第２相補領域を含み、前記第１相補領域が、前記第２相補領域の３’末端側に位置するポリヌクレオチド（以下、「二重ハイブリダイゼーションプライマー（ｄｕａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）」または「二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマー（ｄｕａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）」と称する。）を使用して、標的核酸に相補的な配列を二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの３’末端から生成させた。対照群として、第２相補領域を有しない一般的なプライマー（以下、「線形プライマー（ｌｉｎｅａｒ ｐｒｉｍｅｒ）」、「３’プライミング逆転写プライマー（３’ ｐｒｉｍｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）」、または「３’プライミングプライマー」と称する。）を使用した。また、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーは、第２相補領域の５’末端側に、標的核酸に対して相補的ではない領域（第３領域）を含む。標的核酸に対して相補的ではない領域（第３領域）は、ユニバーサルＰＣＲプライマー配列を含む。

【0041】

図１において、「１」は、標的核酸を示す。「１ａ」は、標的核酸の３’末端領域を示し、２ａ部分に対して相補的な核酸配列を有する。「１ｂ」は、標的核酸の５’末端領域を示し、２ｂ部分に対して相補的な核酸配列を有する。「２」は、逆転写プライマーを示す。「２ａ」は、逆転写プライマーの３’末端部分を示し、１ａ部分に対して相補的な核酸配列を有する（第１相補領域）。「２ｂ」は、逆転写プライマーの５’末端部分（図１（Ｂ）においては、さらにその５’末端側に第３領域が存在する。）を示し、１ｂ部分に対して相補的な核酸配列を有する（第２相補領域）。「２ｃ」は、ＰＣＲプライマー配列を含み、標的核酸に対して相補的ではない配列を有する（第３領域）。「３」は、逆転写酵素によって合成されたＤＮＡを示す。「３ｂ」は、１ｂと同一の核酸配列であり、ハイブリダイズされた２ｂ部分を逆転写酵素が１ｂに置換させながら生成した部分を示す。

【0042】

[実施例２．二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーによる標的核酸の検出効果]
二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーと３’プライミング逆転写プライマーとの標的核酸の検出効果を、それぞれ比較した。

【0043】

標的核酸であるｍｉＲＮＡ、３’プライミングプライマー、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマー及びｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲプライマーの配列を、表１に示す。表１の二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーにおいて、下線部分の核酸配列は標的核酸の３’末端に対して相補的な第１相補領域を示し、小文字で示した部分は標的核酸の５’末端に対して相補的な第２相補領域を示している。

【0044】

【表1】

【0045】

さらに、ユニバーサルＰＣＲプライマーの配列は、５’−ＣＧＧＴＧＡＧＧＴＣＴＴＴＧＧＴＴＣＡＴ−３’（配列番号６１）である。

【0046】

二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの第１相補領域の長さは、４残基であり、第２相補領域の長さは、６残基から８残基である。

【0047】

二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの使用による標的核酸の検出を、ＰＣＲによって確認した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、マイクロＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。逆転写反応のために、１２μｌのＲＴマスターミックス（５μｌの水、２μｌの５×バッファー液、２μｌの１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１μｌの０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１μｌのＲＮＡｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１μｌのＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ酵素）を、９６ウェルプレート内で、２μｌの１０μＭ ＤＨ（ｄｕａｌ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）−ＲＴプライマー（二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマー）及び５μｌの鋳型と混合した。なお、鋳型としては、コピー数５×１０^８のｍｉＲＮＡを用いた。逆転写反応は、１６℃で３０分、４２℃で１時間、７０℃で１５分間インキュベートし、該反応によりｃＤＮＡを得て、続いて、８０μｌのＴＥ（ｐＨ７．６の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）によってｃＤＮＡを５倍希釈した。逆転写反応後に、希釈されたｃＤＮＡの５μｌと、下記の試薬を混合して２０μｌの最終反応体積にし、ＬＣ４８０ ＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、９６ウェル・オプティカルＰＣＲプレートにて、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を３回反復測定した。ＰＣＲ反応混合物は、１０μｌの２×ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ｅｘｉｑｏｎ）、０．１μｌの１０ｕＭユニバーサルプライマー、０．１μｌの１０μＭ ｍｉＲＮＡ特異的プライマー、４．８μｌの水、及び５μｌの試料（前記ｃＤＮＡ）を含む。定量的ＰＣＲは、製造業者が推奨する条件にて行い、アンプリコン種類（増幅産物）の分析のために、解離溶解曲線をそれぞれの測定後に生成した。

【0048】

図２は、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの使用によるプライミング効果を示すグラフである。図２〜５Ｃにおいて、Ｃｐ（ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｐｏｉｎｔ、Ｃｐ値）は、サンプルからの蛍光強度が閾値に達して検出可能となるサイクル数を示す。Ｃｐ値が低いほど、少ないサイクル数で標的核酸が検出されたこと、すなわち逆転写によって合成されたＤＮＡが多いことを意味する。図２に示すように、３’プライミング逆転写プライマーを使用した場合に比べ、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーを使用した場合、Ｃｐ値が著しく低下した。

【0049】

[実施例３．第１相補領域及び第２相補領域の長さによる標的核酸の検出効果]
第１相補領域と第２相補領域との長さ（残基数）による標的核酸の検出効果を確認した。

【0050】

標的核酸であるｍｉＲＮＡ： ５’−ＣＧＧＵＧＡＧＧＵＣＵＵＵＧＧＵＵＣＡＵＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ−３’（配列番号６２）
ｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲプライマー： ５’−ＣＧＣＧＣＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴ−３’（配列番号６３）
ユニバーサルＰＣＲプライマー： ５’−ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ−３’（配列番号６４）
３’プライミング逆転写プライマー及び二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの配列を、表２に示す。表２において、核酸配列の下線部分は標的核酸の３’末端に対して相補的な第１相補領域を示し、小文字で示した部分は標的核酸の５’末端に対して相補的な第２相補領域を示している。

【0051】

【表2】

【0052】

第１相補領域及び第２相補領域の長さによる標的核酸の検出を、実施例２に記載した定量的ＰＣＲ法で確認した。

【0053】

図３は、第１相補領域及び第２相補領域の長さによるプライミング効果を示すグラフである。図３において、「ＲＴｘ」（ｘは２から６の整数である。）のうちの「ｘ」は、標的核酸の３’末端に特異的な配列の残基数、すなわち第１相補領域の残基数を示す。図３に示すように、標的核酸の５’末端に特異的な配列（すなわち、第２相補領域）を逆転写プライマーに含めることで、逆転写プライマーのうち、標的配列の３’末端に特異的な部分（すなわち、第１相補領域）の長さを短くすることができる。

【0054】

[実施例４．標的核酸ｍｉＲ−２１０に係わる検出感度の確認]
標的核酸であるｍｉＲ−２１０に対して、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーと３’プライミング逆転写プライマーとの検出感度を比較した。

【0055】

標的核酸としてのｍｉＲ−２１０、３’プライミングプライマー、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマー、ｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲプライマーの配列及びユニバーサルＰＣＲプライマーを、表３に示す。表３において、核酸配列の下線部分は標的核酸の３’末端に対して相補的な第１相補領域を示し、小文字で示した部分は標的核酸の５’末端に対して相補的な第２相補領域を示している。

【0056】

【表3】

【0057】

二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの使用による標的核酸の検出を、実施例２に記載した定量的ＰＣＲ法で確認した。

【0058】

図４は、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの使用による検出感度を示す。図４に示すように、３’プライミング逆転写プライマーを使用した場合に比べ、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーを使用した場合にＣｐ値が著しく低下した。

【0059】

[実施例５．標的核酸ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２０６に係わる検出感度の確認]
標的核酸であるｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２０６それぞれに対して、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの検出感度を比較した。

【0060】

標的核酸としてのｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２０６、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマー、ｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲプライマーの配列及びユニバーサルＰＣＲプライマーを、表４に示す。表４において、核酸配列の下線部分は標的核酸の３’末端に対して相補的な第１相補領域を示し、小文字で示した部分は標的核酸の５’末端に対して相補的な第２相補領域を示している。

【0061】

【表4】

【0062】

二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの使用による標的核酸の検出を、実施例２に記載した定量的ＰＣＲ法で確認した。

【0063】

図５ＡはｍｉＲ−１６についての検出感度、図５ＢはｍｉＲ−２１についての検出感度、図５ＣはｍｉＲ−２０６についての検出感度を示す。図５Ａから図５Ｃに示すように、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーを使用した場合、Ｃｐ値が著しく低かった。

【0064】

[実施例６．標的核酸ｍｉＲ−１６及びｍｉＲ−２１０に対する検出特異性の確認]
標的核酸であるｍｉＲ−１６及びｍｉＲ−２１０それぞれに対して、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの検出特異性を確認した。

【0065】

標的核酸であるｍｉＲ−１６及びｍｉＲ−２１０、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマー、ｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲプライマーの配列及びユニバーサルＰＣＲプライマーを、表５に示す。表５において、核酸配列の下線部分は標的核酸の３’末端に対して相補的な第１相補領域を示し、小文字で示した部分は標的核酸の５’末端に対して相補的な第２相補領域を示している。表５において太字の核酸は、置換された核酸を示す。例えば、ｍｉＲ１６−Ｍ１Ａは、ｍｉＲ−１６の５’末端から最初の核酸であるウラシル（Ｕ）がアデノシン（Ａ）に置換された配列であるということを示す。以下、表５中のｍｉＲ１６−Ｍ１ＡからｍｉＲ１６−Ｍ２２Ｕまでを「変異ｍｉＲ１６」、ｍｉＲ２１０−Ｍ１ＡからｍｉＲ２１０−Ｍ２２Ｇまでを「変異ｍｉＲ２１０」と総称する。

【0066】

【表5】

【0067】

核酸配列が置換された標的核酸に係わる二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの特異性を、実施例２に記載した定量的ＰＣＲ法で確認した。

【0068】

図６ＡはｍｉＲ−１６に関する特異性、及び図６ＢはｍｉＲ−２１０に関する特異性を示す。図６Ａ（または図６Ｂ）において、ΔＣｐ値は、変異ｍｉＲ１６（または変異ｍｉＲ２１０）を用いた場合のＣｐ値から、ｍｉＲ−１６（またはｍｉＲ−２１０）を用いた場合のＣｐ値を差し引いた値である。図６Ａまたは図６Ｂにおいて、ΔＣｐ値が高いほど、使用プライマーのｍｉＲ−１６（またはｍｉＲ−２１０）に対する特異性が高いことを意味する。図６Ａ及び図６Ｂから分かるように、５’末端及び３’末端で、３’プライミングプライマーに比べ、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーで向上した特異性が示された。

【0069】

[実施例７．Ｌｅｔ−７ファミリーの間の交差反応性の確認]
Ｌｅｔ−７ファミリーについて、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの検出特異性（交差反応性）を確認した。

【0070】

標的核酸、二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマー及びｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲプライマーの配列を、表６に示す。表６において、核酸配列の下線部分は標的核酸の３’末端に対して相補的な第１相補領域を示し、小文字で示した部分は標的核酸の５’末端に対して相補的な第２相補領域を示している。表６において太字の核酸は、Ｌｅｔ−７ａに対して、Ｌｅｔ−７ファミリーに属するその他のｍｉＲにおいて置換されている核酸を示す。

【0071】

【表6】

【0072】

Ｌｅｔ−７ファミリーに対する二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの交差反応性（％）を実施例２に記載した定量的ＰＣＲ法で確認した。

【0073】

【表7】

【0074】

表７は、Ｌｅｔ−７ファミリーに対する二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの交差反応性（％）を示す。交差反応性は以下の方法により算出した。すなわち、ｍｉＲＮＡから得られたＣｐ値とｍｉＲＮＡのアイソフォームから得られたＣｐ値との差（ΔＣｐ値）を算出し、ΔＣｐ値が１の場合は２倍の差があるもの仮定して交差反応性を算出した。交差反応性が低いほど、表的配列に対する特異性が高いことを示す。表７に示すように、Ｌｅｔ−７ファミリーに対する二重ハイブリダイゼーション逆転写プライマーの交差反応性は、５％未満と非常に低いことが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0075】

本発明のポリヌクレオチド及びその用途は、例えば、核酸増幅関連の技術分野に効果的に適用可能である。

【符号の説明】

【0076】

１ 標的核酸、
１ａ 標的核酸の３’末端領域、
１ｂ 標的核酸の５’末端領域、
２ 逆転写プライマー、
２ａ 逆転写プライマーの３’末端領域（第１相補領域）、
２ｂ 逆転写プライマーの５’末端領域（第２相補領域）、
２ｃ 標的核酸に対して相補的ではない配列（第３領域）、
３ 逆転写酵素によって合成されたＤＮＡ、
３ｂ 標的核酸の５’末端領域にハイブリダイズされた逆転写プライマーの５’末端領域を置換しつつ、逆転写酵素が生成した部分。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【配列表】

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