特許 6456885 １段階の工程によるマイタンシノイド−抗体複合体の調製

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6456885

(24)【登録日】2018年12月28日

(45)【発行日】2019年1月23日

(54)【発明の名称】１段階の工程によるマイタンシノイド−抗体複合体の調製

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20190110BHJP

   A61K 47/50 20170101ALI20190110BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20190110BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20190110BHJP

   A61K 31/537 20060101ALI20190110BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190110BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20190110BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/46

   A61K47/50

   A61K45/00

   A61K39/395 C

   A61K39/395 L

   A61K31/537

   A61P35/00

   A61P35/02ZNA

【請求項の数】33

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2016-167618(P2016-167618)

(22)【出願日】2016年8月30日

(62)【分割の表示】特願2014-502803(P2014-502803)の分割

【原出願日】2012年3月29日

(65)【公開番号】特開2016-204385(P2016-204385A)

(43)【公開日】2016年12月8日

【審査請求日】2016年9月21日

(31)【優先権主張番号】61/468,997

(32)【優先日】2011年3月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】502116335

【氏名又は名称】イムノゲン インコーポレーティッド

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100163658

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 順造

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(72)【発明者】

【氏名】リ、シンファン

(72)【発明者】

【氏名】ウォーフル、ジャレッド エム．

【審査官】 伊藤 良子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０３−１６１４９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０４−２６６８２９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体−マイタンシノイド複合体を調製する工程であって、
（ａ）抗体をマイタンシノイドと接触させて、前記抗体と前記マイタンシノイドとを含む第一の混合物を形成し、次いで、前記第一の混合物をｐＨが４〜９の溶液中でリンカーを含む二官能性架橋試薬と接触させて、（ｉ）前記抗体が前記リンカーを介して前記マイタンシノイドと化学的に結合している前記抗体−マイタンシノイド複合体と、（ｉｉ）遊離のマイタンシノイドと、（ｉｉｉ）反応副生成物とを含む第二の混合物を得る段階、
（ｂ）前記第二の混合物をさらなる前記マイタンシノイドと接触させて、第三の混合物を形成し、次いで、前記第三の混合物をｐＨが４〜９でさらなる二官能性架橋試薬と接触させて、第四の混合物を得る段階
を含む工程。

【請求項2】

（ｃ）前記第四の混合物を精製して、精製された抗体−マイタンシノイド複合体を得る段階をさらに含む、請求項１に記載の工程。

【請求項3】

段階（ｃ）を行う前に段階（ｂ）を１回以上繰り返す、請求項２に記載の工程。

【請求項4】

段階（ｃ）を行う前に段階（ｂ）をもう１回繰り返す、請求項２または３に記載の工程。

【請求項5】

各繰り返される段階（ｂ）は最初の段階（ｂ）の１時間以上後に行う、請求項３または４に記載の工程。

【請求項6】

前記第四の混合物をタンジェンシャルフローろ過、選択的沈殿、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィー、非吸着クロマトグラフィーまたはその組合せに供することにより精製して、前記抗体−マイタンシノイド複合体を前記遊離のマイタンシノイドおよび前記反応副生成物から精製する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の工程。

【請求項7】

前記第四の混合物を非吸着クロマトグラフィーに供することにより精製する、請求項６に記載の工程。

【請求項8】

前記第四の混合物をタンジェンシャルフローろ過に供することにより精製する、請求項６に記載の工程。

【請求項9】

前記第四の混合物を段階（ｂ）〜段階（ｃ）の間で保持して、不安定に結合したリンカーを前記抗体から解離させることをさらに含む、請求項２〜８のいずれか１項に記載の工程。

【請求項10】

前記第四の混合物を２℃〜８℃の温度で２０時間保持する、請求項９に記載の工程。

【請求項11】

前記第四の混合物の反応を段階（ｂ）〜段階（ｃ）の間で停止させて、任意の未反応のマイタンシノイドおよび／または未反応の二官能性架橋試薬の反応を停止させることをさらに含む、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の工程。

【請求項12】

前記第四の混合物を前記遊離のマイタンシノイドと反応する反応停止試薬と接触させることにより、前記混合物の反応を停止させる、請求項１１に記載の工程。

【請求項13】

前記反応停止試薬が、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミドおよびヨードアセトアミドプロピオン酸からなる群より選択される、請求項１２に記載の工程。

【請求項14】

前記段階（ａ）の接触が、前記抗体を反応容器中に準備し、前記反応容器に前記マイタンシノイドを加えて、前記抗体と前記マイタンシノイドとを含む前記第一の混合物を形成し、次いで、前記二官能性架橋試薬を前記第一の混合物に加えることにより行われる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の工程。

【請求項15】

前記段階（ａ）の接触が、ｐＨが７〜９の溶液中で行われる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の工程。

【請求項16】

前記段階（ａ）の接触が１６℃〜２４℃の温度で行われる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の工程。

【請求項17】

前記段階（ａ）の接触が０℃〜１５℃の温度で行われる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の工程。

【請求項18】

前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の工程。

【請求項19】

前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項１８に記載の工程。

【請求項20】

前記抗体が、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、トラスツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６、リツキシマブ、Ｈｅｒ２に結合する抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する抗体、ＣＤ２７Ｌに結合する抗体、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体、Ｃｒｉｐｔｏに結合する抗体、ＣＤ１３８に結合する抗体、ＥｐｈＡ２に結合する抗体、インテグリン標的抗体、ＣＤ３７に結合する抗体、葉酸に結合する抗体、Ｈｅｒ３に結合する抗体およびインスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦＩＲ）に結合する抗体からなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の工程。

【請求項21】

前記抗体が、ｈｕＣＤ３７−３抗体である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の工程。

【請求項22】

前記抗体が、トラスツズマブである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の工程。

【請求項23】

前記マイタンシノイドがチオール基を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の工程。

【請求項24】

前記マイタンシノイドがＮ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）である、請求項２３に記載の工程。

【請求項25】

前記マイタンシノイドがＮ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の工程。

【請求項26】

前記抗体が、ジスルフィド結合、酸に不安定な結合、光に不安定な結合、ペプチダーゼに不安定な結合、チオエーテル結合およびエステラーゼに不安定な結合からなる群より選択される化学結合を介して前記マイタンシノイドと化学的に結合している、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の工程。

【請求項27】

前記二官能性架橋試薬が、Ｎ−スクシンイミジルエステル部分、Ｎ−スルホスクシンイミジルエステル部分、マレイミド系部分またはハロアセチル系部分を含む、請求項１〜２２６のいずれか１項に記載の工程。

【請求項28】

前記二官能性架橋試薬が、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート（ＳＭＣＣ）、ＰＥＧ−ｍａｌ、スルホ−ＭａｌおよびＣＸ１−１からなる群より選択される、請求項２７に記載の工程。

【請求項29】

前記段階（ａ）の溶液がスクロースを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の工程。

【請求項30】

前記段階（ａ）の溶液が、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤およびリン酸緩衝剤からなる群より選択される緩衝剤を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の工程。

【請求項31】

前記段階（ａ）の溶液が、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）およびその組合せからなる群より選択される緩衝剤を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の工程。

【請求項32】

前記マイタンシノイドが、ＤＭ１であり、前記二官能性架橋試薬が、ＳＭＣＣであり、前記抗体が、ｈｕＣＤ３７−３抗体である、請求項１〜２１、および２３〜３１のいずれか１項に記載の工程。

【請求項33】

前記マイタンシノイドが、ＤＭ１であり、前記二官能性架橋試薬が、ＳＭＣＣであり、前記抗体が、トラスツズマブである、請求項１〜２０、および２２〜３１のいずれか１項に記載の工程。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年３月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／４６８，９９７号の利益を主張するものであり、上記出願は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
（電子提出された物件の参照による援用）
以下：
９，２３３バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件（名称「７１００８８ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴ」、２０１３年４月３日作成）、
と特定される、コンピューターで可読なヌクレオチド／アミノ酸の配列表が、本明細書中、参照によりその全体が援用される。

【背景技術】

【0002】

癌その他の疾患の治療に有用な抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は一般に、細胞結合物質、リンカーおよび細胞毒性物質の３つの異なる要素からなる。抗体などの細胞結合物質を細胞毒性物質にコンジュゲートする従来の方法は、抗体に２つの異なる反応段階を用いるものである。第一の反応段階（修飾段階）では、抗体をヘテロ二官能性リンカーと反応させてリンカー修飾抗体を作製する。次いで任意選択で、修飾抗体生成物を過剰のリンカーまたは加水分解されたリンカー試薬から精製する。第二の反応段階（コンジュゲーション段階）では、リンカー修飾抗体をチオールなどの反応基を含む細胞毒性物質と反応させて抗体−細胞毒性物質複合体を作製し、さらなる精製段階で再び精製する。

【0003】

実施が煩雑であったり、最適に望まれるものより純度や安定性が低い免疫複合体が得られたりする段階が妨げとなるため、これまでに記載されている抗体−細胞毒性物質複合体を製造する工程は複雑である。したがって、純度および／または安定性などの生成物の品質を改善すると同時に製造段階を１つ以上修正または削除することが望ましいと考えられる。

【0004】

上記のようなことを考慮すれば、実質的に高品質であり、かつ煩雑な段階を避け、また使用者の時間およびコストを削減しつつ調製することができる、細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を調製する改善された工程を開発することが、当該技術分野において必要とされている。本発明はこのような工程を提供するものである。上に挙げたものをはじめとする本発明の利点およびほかの発明の特徴は、本明細書で提供される本発明に関する記載から明らかになるであろう。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を調製する工程を提供し、この工程は、細胞結合物質を細胞毒性物質と接触させて、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む第一の混合物を形成し、次いで、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む第一の混合物を、ｐＨが約４〜約９の溶液中でリンカーを含む二官能性架橋試薬と接触させて、（ｉ）細胞結合物質がリンカーを介して細胞毒性物質と化学的に結合している細胞結合物質−細胞毒性物質複合体と、（ｉｉ）遊離の細胞毒性物質と、（ｉｉｉ）反応副生成物とを含む混合物を得る段階を含む。この工程は、混合物を精製して、精製された細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を得る段階をさらに含み得る。

【0006】

本発明の工程では、高い純度および／または安定性の細胞結合物質−細胞毒性物質複合体が得られる。複合体の高い純度および／または安定性を得るためには、最初に細胞毒性物質を細胞結合物質と接触させて、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物を形成した後に、混合物を二官能性架橋試薬と接触させることが不可欠である。

【0007】

また本発明には、本明細書に記載の工程に従って調製された細胞結合物質−細胞毒性物質複合体も含まれる。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明は、細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を調製する１段階の工程を提供する。この工程は、細胞結合物質（例えば、抗体）を細胞毒性物質と接触させて、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む第一の混合物を形成し、次いで、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む第一の混合物を、ｐＨが約４〜約９の溶液中でリンカーを含む二官能性架橋試薬と接触させて、細胞結合物質がリンカーを介して細胞毒性物質と化学的に結合している細胞結合物質−細胞毒性物質複合体と、遊離の細胞毒性物質と、反応副生成物とを含む第二の混合物を得ることを含む。次いで、第二の混合物を精製に供して、精製された細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を得る。

【0009】

一実施形態では、接触は、細胞結合物質を準備し、次いで細胞結合物質を細胞毒性物質と接触させて、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む第一の混合物を形成し、次いで、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む第一の混合物を二官能性架橋試薬と接触させることにより行われる。例えば、一実施形態では、細胞結合物質を反応容器中に準備し、この反応容器に細胞毒性物質を加え（これにより細胞結合物質と接触させ）、次いで、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物に二官能性架橋試薬を加える（これにより細胞結合物質と細胞毒性物質と含む混合物を接触させる）。一実施形態では、細胞結合物質を反応容器中に準備し、細胞結合物質を反応容器に加えた直後に細胞毒性物質を同容器に加える。別の実施形態では、細胞結合物質を反応容器中に準備し、細胞結合物質を反応容器中に準備した一定時間後に（例えば、細胞結合物質をスペースに提供した約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約１日以上後に）細胞毒性物質を同容器に加える。細胞毒性物質は急速に（すなわち、約５分、約１０分など短時間のうちに）加えても、（ポンプなどを用いて）徐々に加えてもよい。

【0010】

次いで、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物を、細胞結合物質を細胞毒性物質と接触させた直後に、または細胞結合物質を細胞毒性物質と接触させてからしばらく後の時点（例えば、約５分〜約８時間またはそれ以上後）で、二官能性架橋試薬と接触させることができる。例えば、一実施形態では、細胞結合物質を含む反応容器に細胞毒性物質を加えた直後に、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物に二官能性架橋試薬を加える。あるいは、細胞結合物質を細胞毒性物質と接触させた約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間またはそれ以上後に、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物を二官能性架橋試薬と接触させてもよい。

【0011】

別の実施形態では、細胞毒性物質および二官能性物質を複数のサイクル（例えば、１、２、３、４、５サイクルまたはそれ以上）で加える。例えば、本発明は、ａ）細胞結合物質を細胞毒性物質と接触させて、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む第一の混合物を形成し、次いで、第一の混合物を、ｐＨが約４〜約９の溶液中でリンカーを含む二官能性架橋試薬と接触させて、細胞結合物質がリンカーを介して細胞毒性物質と化学的に結合している細胞結合物質−細胞毒性物質複合体と、遊離の細胞毒性物質と、反応副生成物とを含む第二の混合物を得る段階と、ｂ）第二の混合物を細胞毒性物質と接触させて第三の混合物を形成し、次いで、第三の混合物を約４〜約９のｐＨで二官能性架橋試薬と接触させて、第四の混合物を得る段階と、ｃ）第四の混合物を精製して、精製された細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を得る段階とを含む工程を提供する。一実施形態では、段階ｂ）を段階ａ）の一定時間後（例えば、約１時間、約２時間、約３時間またはそれ以上後）に行う。別の実施形態では、段階ｃ）を行う前に段階ｂ）を複数回（例えば、１、２、３、４回またはそれ以上）繰り返してもよい。追加の段階ｂ）は最初の段階ｂ）の一定時間後（例えば、約１時間、約２時間、約３時間または後）に行ってもよい。

【0012】

別の実施形態では、二官能性架橋試薬を細胞毒性物質の添加が完了する前に加える。例えば、一実施形態では、細胞毒性物質を一定時間にわたって（例えば、約５分、約１０分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間またはそれ以上にわたって）継続的に細胞結合物質に加えて、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物を形成する。細胞毒性物質の添加が完了する前に、二官能性架橋試薬を細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物に加えるが、ただし、細胞毒性物質は常に二官能性架橋試薬よりも過剰モルの状態にある。一実施形態では、二官能性架橋試薬を一定時間にわたって（例えば、約５分、約１０分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間またはそれ以上にわたって）継続的に加える。

【0013】

細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物を二官能性架橋試薬と接触させた後、反応を約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間またはそれ以上（例えば、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間または約４８時間）進行させる。

【0014】

細胞結合物質を細胞毒性物質と、次いで二官能性架橋試薬と接触させること（すなわち、反応段階）をｐＨが約４〜約９（例えば、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５または約９）の溶液中で行う。一実施形態では、反応段階をｐＨが約６以下（例えば、約４〜約６、約４〜約５．５または約４．５〜約５．５）の溶液中で行う。

【0015】

別の実施形態では、本発明の工程は、細胞結合物質を細胞毒性物質、次いで二官能性架橋試薬とｐＨが約６以上（例えば、約６〜約９、約６〜約７、約７〜約９、約７〜約８．５、約７．５〜約８．５、約７．５〜約８．０、約８．０〜約９．０または約８．５〜約９．０）の溶液中で接触させることを含む。例えば、本発明の工程は、細胞結合物質を細胞毒性物質および二官能性架橋試薬とｐＨが約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９または約９．０の溶液中で接触させることを含む。特定の実施形態では、本発明の工程は、細胞結合物質を細胞毒性物質および二官能性架橋試薬とｐＨが約７．８（例えば、ｐＨが７．６〜８．０またはｐＨが７．７〜７．９）の溶液中で接触させることを含む。

【0016】

本発明の工程は、１段階の反応（すなわち、細胞結合物質を細胞毒性物質、次いで二官能性架橋試薬と接触させること）を当該技術分野で公知の任意の適切な温度で実施することを含む。例えば、１段階の反応を約２０℃以下（例えば、約−１０℃（ただし、溶液は、例えば、細胞毒性物質および二官能性架橋試薬を溶解するのに使用する有機溶媒が存在することにより凍結が防止されている）〜約２０℃、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６℃）、室温（例えば、約２０℃〜約３０℃または約２０℃〜約２５℃）または高温（例えば、約３０℃〜約３７℃）で行い得る。一実施形態では、細胞結合物質を細胞毒性物質および二官能性架橋試薬と接触させることを約１６℃〜約２４℃の温度（例えば、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃または約２５℃）で行う。

【0017】

別の実施形態では、細胞結合物質を細胞毒性物質、次いで二官能性架橋試薬と接触させることを約１５℃以下の温度（例えば、約−１０℃〜約１５℃または約０℃〜約１５℃）で行う。この点に関して、本発明の工程は、細胞結合物質を細胞毒性物質、次いで二官能性架橋試薬と約１５℃、約１４℃、約１３℃、約１２℃、約１１℃、約１０℃、約９℃、約８℃、約７℃、約６℃、約５℃、約４℃、約３℃、約２℃、約１℃、約０℃、約−１℃、約−２℃、約−３℃、約−４℃、約−５℃、約−６℃、約−７℃、約−８℃、約−９℃または約−１０℃の温度で接触させることを含み、ただし、溶液は、例えば、二官能性架橋試薬を溶解するのに使用する有機溶媒（１つまたは複数）の存在により凍結が防止されている。一実施形態では、本発明の工程は、細胞結合物質を細胞毒性物質、次いで二官能性架橋試薬と約−１０℃〜約１５℃、約０℃〜約１５℃、約０℃〜約１０℃、約０℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１０℃〜約１５℃または約５℃〜約１０℃の温度で接触させることを含む。別の実施形態では、本発明の工程は、細胞結合物質を細胞毒性物質、次いで二官能性架橋試薬と約１０℃の温度（例えば、８℃〜１２℃の温度または９℃〜１１℃の温度）で接触させることを含む。

【0018】

一実施形態では、本発明の工程は、細胞結合物質を高ｐＨ（例えば、約７以上）の溶液中、低温（例えば、約１５℃以下）で細胞毒性物質、次いで二官能性架橋試薬と接触させることを含む。例えば、一実施形態では、本発明の工程は、細胞結合物質をｐＨが約７．５の溶液中、約１５℃の温度で、ｐＨが約７．８の溶液中、約１０℃の温度で、ｐＨ約８．２の溶液中、約０℃の温度で、またはｐＨ約８．５の溶液中、約０℃の温度で細胞毒性物質、次いで二官能性架橋試薬と接触させることを含む。別の実施形態では、本発明の工程は、細胞結合物質をｐＨが７．０〜８．５（例えば、ｐＨが７．５〜８．０）の溶液中、５℃〜１５℃の温度で細胞毒性物質、次いで二官能性架橋試薬と接触させることを含む。

【0019】

一実施形態では、本発明の工程は、任意の未反応の細胞毒性物質および／または未反応の二官能性架橋試薬の反応を停止させる反応停止段階をさらに含む。細胞結合物質−細胞毒性物質の精製前に反応停止段階を実施する。例えば、本発明の工程は、（ａ）細胞結合物質を細胞毒性物質と接触させて、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物を形成し、次いで、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物をｐＨが約４〜約９の溶液中でリンカーを含む二官能性架橋試薬と接触させて、（ｉ）細胞結合物質がリンカーを介して細胞毒性物質と化学的に結合している細胞結合物質−細胞毒性物質複合体と、（ｉｉ）遊離の細胞毒性物質と、（ｉｉｉ）反応副生成物とを含む混合物を得る段階と、（ｂ）段階（ａ）で調製された混合物の反応を停止させて、任意の未反応の細胞毒性物質および／または未反応の二官能性架橋試薬の反応を停止させる段階と、（ｃ）混合物を精製して、精製された細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を得る段階とを含む。

【0020】

一実施形態では、混合物を反応停止試薬と接触させることにより混合物の反応を停止させる。本明細書で使用される「反応停止試薬」は、遊離の細胞毒性物質および／または二官能性架橋試薬と反応する試薬を指す。

【0021】

一実施形態では、マレイミドまたはハロアセトアミド反応停止試薬、例えば４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミドまたはヨードアセトアミドプロピオン酸などを用いて、細胞毒性物質中の任意の未反応の基（チオールなど）の反応を停止させることができる。反応停止段階は、細胞毒性物質、特に未反応のチオール基（ＤＭ１など）を有する細胞毒性物質の二量体化を防ぐのに役立つ。二量体化した細胞毒性物質は除去するのが困難な場合がある。また反応停止段階は、天然の抗体ジスルフィド基との任意の不必要なチオール−ジスルフィド交換反応を最小限に抑えるものでもある。極性のある荷電チオール反応停止試薬（４−マレイミド酪酸または３−マレイミドプロピオン酸など）による反応停止の際には、過剰な未反応の細胞毒性物質が、精製段階で共有結合した複合体から容易に分離することが可能な極性のある荷電水溶性付加物に変換される。このほか非極性および中性のチオール反応停止試薬を使用することができる。

【0022】

一実施形態では、混合物を未反応の二官能性架橋試薬と反応する反応停止試薬と接触させることにより混合物の反応を停止させる。例えば、任意の未反応の二官能性架橋試薬の反応を停止させるために、混合物に求核剤を加えることができる。好ましくは、求核剤は、求核剤を含むアミノ基、例えばリジン、タウリンおよびヒドロキシルアミンなどである。

【0023】

好適な実施形態では、混合物を反応停止試薬と接触させる前に、反応（すなわち、細胞結合物質を細胞毒性物質、次いで二官能性架橋試薬と接触させること）を完了まで進行させる。この点について、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物を二官能性架橋試薬と接触させた約１時間〜約４８時間後（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間後または約２５時間〜約４８時間後）に反応停止試薬を混合物に加える。

【0024】

本発明の工程は、任意選択で、反応段階（すなわち、細胞結合物質を細胞毒性物質および二官能性架橋試薬と接触させること）にスクロースを加えて、細胞結合物質−細胞毒性物質複合体の溶解度および回収率を増加させることを含み得る。望ましくは、スクロースを約０．１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）または２０％（ｗ／ｖ））の濃度で添加する。好ましくは、スクロースを約１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．５％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）または約１１％（ｗ／ｖ））の濃度で添加する。さらに、反応段階は緩衝剤の添加も含み得る。当該技術分野で公知の任意の適切な緩衝剤を使用することができる。適切な緩衝剤としては、例えば、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤およびリン酸緩衝剤が挙げられる。一実施形態では、緩衝剤は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）およびその組合せからなる群より選択される。

【0025】

反応段階後、細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を精製段階に供する。この点について、細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を、膜に基づくタンジェンシャルフローろ過工程であるタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）、非吸着クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、吸着ろ過、選択的沈殿または任意の他の適切な精製工程、およびその組合せを用いて、混合物の他の成分（例えば、遊離の細胞毒性物質および反応副生成物）から精製することができる。本発明の一実施形態では、単一の精製段階（例えば、ＴＦＦ）を用いて細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を精製する。好ましくは、単一の精製段階（例えば、ＴＦＦ）を用いて複合体を精製し適切な製剤にする。本発明の別の実施形態では、連続する２つの精製段階を用いて細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を精製する。例えば、最初に選択的沈殿、吸着ろ過、吸着クロマトグラフィーまたは非吸着クロマトグラフィーにより複合体を精製し、次いでＴＦＦにより精製する。当業者は、細胞結合物質−細胞毒性物質複合体の精製により、細胞毒性物質と化学的に結合した細胞結合物質を含む安定な複合体の単離が可能であることを理解するであろう。

【0026】

Ｐｅｌｌｉｃｏｎ型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、ＮＹ）およびＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ型システム（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）を含めた任意の適切なＴＦＦシステムを精製に使用し得る。

【0027】

任意の適切な吸着クロマトグラフィー樹脂を精製に使用し得る。好適な吸着クロマトグラフィー樹脂としては、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｈａｒｇｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、色素リガンドクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびその組合せが挙げられる。適切なヒドロキシアパタイト樹脂の例としては、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ Ｔｙｐｅ ＩおよびＴｙｐｅ ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＨＡ Ｕｌｔｒｏｇｅｌヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）およびセラミックフルオロアパタイト（ＣＦＴ Ｔｙｐｅ ＩおよびＴｙｐｅ ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。適切なＨＣＩＣ樹脂の例としては、ＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）が挙げられる。適切なＨＩＣ樹脂の例としては、ブチル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヘキシル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、フェニル−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびオクチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）製）ならびにＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐメチルおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｔ−ブチル樹脂（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。適切なイオン交換樹脂の例としては、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）製）ならびにＵｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。適切な混合モードイオン交換体としては、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢｘ樹脂（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ ＮＪ）が挙げられる。適切なＩＭＡＣ樹脂の例としては、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＰｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。適切な色素リガンド樹脂としては、Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＡｆｆｉ−ｇｅｌ Ｂｌｕｅ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。適切なアフィニティー樹脂としては、細胞結合物質が抗体である場合には、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が、また細胞結合物質が適切なレクチン結合部位を有する場合には、レクチンアフィニティー樹脂、例えばＬｅｎｔｉｌ Ｌｅｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が挙げられる。あるいは、細胞結合物質に特異的な抗体を用いてもよい。このような抗体を、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）固定化することができる。適切な逆相樹脂としては、Ｃ４、Ｃ８およびＣ１８樹脂（Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）が挙げられる。

【0028】

任意の適切な非吸着クロマトグラフィー樹脂を精製に使用し得る。適切な非吸着クロマトグラフィー樹脂の例としては、特に限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂（例えば、Ｓ−２００およびＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂（例えば、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５およびＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０およびＰ−１００）その他の当業者に公知の樹脂が挙げられる。

【0029】

一実施形態では、本発明の工程は、不安定に結合したリンカーを細胞結合物質から解離させる保持段階をさらに含む。保持段階は、細胞結合物質−細胞毒性物質複合体の精製前（例えば、反応段階の後、反応段階と反応停止段階の間または反応停止段階の後）に混合物を保持することを含む。例えば、本発明の工程は、（ａ）細胞結合物質を細胞毒性物質と接触させて、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物を形成し、次いで、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物をｐＨが約４〜約９の溶液中で、リンカーを与える二官能性架橋試薬と接触させて、（ｉ）細胞結合物質がリンカーを介して細胞毒性物質と化学的に結合している細胞結合物質−細胞毒性物質複合体と、（ｉｉ）遊離の細胞毒性物質と、（ｉｉｉ）反応副生成物とを含む混合物を得ることと、（ｂ）段階（ａ）で調製された混合物を保持して、不安定に結合したリンカーを細胞結合物質から解離させることと、（ｃ）混合物を精製して、精製された細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を得ることとを含む。

【0030】

別の実施形態では、本発明の工程は、（ａ）細胞結合物質を細胞毒性物質と接触させて、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物を形成し、次いで、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物をｐＨが約４〜約９の溶液中で、リンカーを与える二官能性架橋試薬と接触させて、（ｉ）細胞結合物質がリンカーを介して細胞毒性物質と化学的に結合している細胞結合物質−細胞毒性物質複合体と、（ｉｉ）遊離の細胞毒性物質と、（ｉｉｉ）反応副生成物とを含む混合物を得ることと、（ｂ）段階（ａ）で調製された混合物の反応を停止させて、任意の未反応の細胞毒性物質および／または未反応の二官能性架橋試薬の反応を停止させることと、（ｃ）段階（ｂ）で調製された混合物を保持して、不安定に結合したリンカーを細胞結合物質から解離させることと、（ｄ）混合物を精製して、精製された細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を得ることとを含む。

【0031】

あるいは、細胞結合物質−細胞毒性物質複合体の精製後に保持段階を実施し、次いで、さらなる精製段階を実施してもよい。

【0032】

好適な実施形態では、保持段階の前に反応（すなわち、細胞結合物質を細胞毒性物質、次いで二官能性架橋試薬と接触させること）を完了まで進行させる。この点について、細胞結合物質と細胞毒性物質とを含む混合物を二官能性架橋試薬と接触させた約１時間〜約４８時間後（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間後または約２４時間〜約４８時間後）に保持段階を実施することができる。

【0033】

保持段階は、溶液を適切な時間の間（例えば、約１時間〜約１週間、約１時間〜約２４時間、約１時間〜約８時間または約１時間〜約４時間）、適切な温度（例えば、約０℃〜約３７℃）に維持して、安定に結合したリンカーを細胞結合物質から実質的に解離させずに、不安定に結合したリンカーを細胞結合物質から解離させることを含む。一実施形態では、保持段階は、溶液を約２０℃以下（例えば、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６℃）、室温（例えば、約２０℃〜約３０℃または約２０℃〜約２５℃）または高温（例えば、約３０℃〜約３７℃）に維持することを含む。一実施形態では、保持段階は、溶液を約１６℃〜約２４℃の温度（例えば、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃または約２５℃）に維持することを含む。別の実施形態では、保持段階は、溶液を約２℃〜約８℃の温度（例えば、約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃または約１０℃）に維持することを含む。別の実施形態では、保持段階は、溶液を約３７℃の温度（例えば、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃または約４０℃）に維持することを含む。

【0034】

保持段階の持続時間は、保持段階を実施する温度およびｐＨによって決まる。例えば、保持段階を高温で実施することにより保持段階の持続時間を実質的に短くすることができ、最高温度は細胞結合物質−細胞毒性物質複合体の安定性によって制限される。保持段階は、溶液を約１時間〜約１日（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間または約２４時間）、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１４時間〜約２４時間、約１６時間〜約２４時間、約１８時間〜約２４時間、約２０時間〜約２４時間、約５時間〜約１週間、約２０時間〜約１週間、約１２時間〜約１週間（例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日または約７日）または約１日〜約１週間維持することを含み得る。

【0035】

一実施形態では、保持段階は、溶液を少なくとも約１２時間〜最大１週間の間、約２℃〜約８℃の温度に維持することを含む。別の実施形態では、保持段階は、溶液を一晩（例えば、約１２〜約２４時間、好ましくは約２０時間）、約２℃〜約８℃の温度に維持することを含む。

【0036】

保持段階のｐＨ値は、好ましくは約４〜約１０である。一実施形態では、保持段階のｐＨ値は、約４以上約６未満（例えば、４〜５．９）または約５以上約６未満（例えば、５〜５．９）である。別の実施形態では、保持段階のｐＨ値は約６〜約１０の範囲（例えば、約６．５〜約９、約６〜約８）にある。例えば、保持段階のｐＨ値は約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５または約１０であり得る。

【0037】

特定の実施形態では、保持段階は、混合物を２５℃、約６〜７．５のｐＨで約１２時間〜約１週間インキュベートすること、混合物を４℃、約４．５〜５．９のｐＨで約５時間〜約５日間インキュベートすること、または混合物を２５℃、約４．５〜５．９のｐＨで約５時間〜約１日間インキュベートすることを含み得る。

【0038】

本発明は、細胞毒性物質と化学的に結合した細胞結合物質を含む安定な複合体の組成物を調製する工程を提供し、ここでは、組成物は不安定な複合体を実質的に含まない。この点に関して、本発明は、実質的に純度および安定性の高い細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を調製する工程を提供する。このような組成物は複合体の純度および安定性が高いため、疾患の治療に使用することができる。マイタンシノイドなどの細胞毒性物質と化学的に結合した抗体などの細胞結合物質を含む組成物は、例えば、その教示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３７４，７６２号に記載されている。本発明の一態様では、実質的に純度の高い細胞結合物質−細胞毒性物質複合体には、次のような特徴が１つ以上ある：（ａ）複合体種の約９０％超（例えば、約９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％）、好ましくは約９５％超が単量体である、（ｂ）複合体調製物中の未コンジュゲートリンカーのレベルが約１０％未満（例えば、約９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下または０％）である（総リンカーに対して）、（ｃ）複合体種の１０％未満（例えば、約９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下または０％）が架橋されている、（ｄ）複合体調製物中の遊離の細胞毒性物質レベルが約２％未満（例えば、約１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１．０％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、０．１％以下または０％）（総細胞毒性物質に対するｍｏｌ／ｍｏｌ）であるおよび／または（ｅ）保管時（例えば、約１週間後、約２週間後、約３週間後、約１か月後、約２か月後、約３か月後、約４か月後、約５か月後、約６か月後、約１年後、約２年後、約３年後、約４年後または約５年後）に遊離の細胞毒性物質レベルの実質的な増加がみられない。遊離の細胞毒性物質レベルの「実質的な増加」は、特定の保管期間（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、約１年、約２年、約３年、約４年または約５年）の後に遊離の細胞毒性物質レベルの増加が約０．１％未満、約０．２％未満、約０．３％未満、約０．４％未満、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、約１．０％未満、約１．１％未満、約１．２％未満、約１．３％未満、約１．４％未満、約１．５％未満、約１．６％未満、約１．７％未満、約１．８％未満、約１．９％未満、約２．０％未満、約２．２％未満、約２．５％未満、約２．７％未満、約３．０％未満、約３．２％未満、約３．５％未満、約３．７％未満または約４．０％未満であることを意味する。

【0039】

本明細書で使用される「未コンジュゲートリンカー」という用語は、二官能性架橋試薬と共有結合し、二官能性架橋試薬のリンカーを介して細胞毒性物質と共有結合していない細胞結合物質を指す（すなわち、「未コンジュゲートリンカー」は、ＣＢＡ−Ｌ（ＣＢＡは細胞結合物質を表し、Ｌは二官能性架橋試薬を表す）で表すことができる。これに対し、細胞結合物質−細胞毒性物質複合体は、ＣＢＡ−Ｌ−Ｄ（Ｄは細胞毒性物質を表す）で表すことができる）。

【0040】

一実施形態では、細胞結合物質−細胞毒性物質複合体中の細胞毒性物質と細胞結合物質の平均モル比は約１〜約１０、約２〜約７、約３〜約５、約２．５〜約４．５（例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５）、約３．０〜約４．０、約３．２〜約４．２または約４．５〜５．５（例えば、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４または約５．５）である。

【0041】

本発明は、細胞毒性物質と化学的に結合した細胞結合物質を含む安定な複合体の組成物を調製することにより効率的な工程を提供する。一実施形態では、従来の細胞結合物質と細胞毒性物質の複合体を調製する工程に比べて、複合体の細胞毒性物質と細胞結合物質の平均モル比を同じにするのに必要な細胞毒性物質の量が少ない。

【0042】

細胞結合物質は、細胞、通常好ましくは動物細胞（例えば、ヒト細胞）と結合する任意の適切な物質であり得る。細胞結合物質は、好ましくはペプチドまたはポリペプチドである。適切な細胞結合物質としては、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体およびそのフラグメント）、インターフェロン（例えば、α、β、ガンマ）、リンホカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６）、ホルモン（例えば、インスリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、アンドロゲンおよびエストロゲンなどのステロイドホルモン）、増殖因子およびコロニー刺激因子、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ５：１５５−１５８（１９８４））など、栄養素輸送分子（例えば、トランスフェリン）、ビタミン（例えば、葉酸塩）ならびに細胞表面の標的分子と特異的に結合する他の任意の物質または分子が挙げられる。

【0043】

細胞結合物質が抗体である場合、抗体は抗原と結合し、抗原はポリペプチドまたはグリコトープであり、また膜貫通型分子（例えば、受容体）または増殖因子などのリガンドであり得る。抗原の例としては、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含めた成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；ｖｍｃ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）およびフォン・ヴィルブランド因子などの凝固因子；タンパク質Ｃなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ（活性化に応じて調節、通常Ｔ細胞により発現・分泌される））；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などの細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；プロテインＡまたはＤ；リウマトイド因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５もしくはＮＴ−６）などの神経栄養因子またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの線維芽細胞増殖因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含めたＴＧＦ−βなど；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３、ＦＬＴ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＣＥＡ、ＴＥＮＢ２、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、葉酸受容体、ＦＯＬＲ１、メソテリン、クリプト、α_ｖβ_６、インテグリン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、トランスフェリン受容体、ＩＲＴＡ１、ＩＲＴＡ２、ＩＲＴＡ３、ＩＲＴＡ４、ＩＲＴＡ５；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０．ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５２など、または米国特許出願公開第２００８／０１７１０４０号または米国特許出願公開第２００８／０３０５０４４号に開示され、その内容全体が参照により組み込まれる、１つ以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体と結合する抗体；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−βおよび−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えばＨＩＶエンベロープの一部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭなどのインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；エンドグリン、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、前立腺抗原、例えばＰＣＡ３、ＰＳＡ、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＴＭＥＦＦ２およびＳＴＥＡＰ１など；ＬＧＲ５、Ｂ７Ｈ４ならびに任意の上記ポリペプチドのフラグメントなどの分子が挙げられる。

【0044】

さらに、骨髄性細胞と結合するＧＭ−ＣＳＦを急性骨髄性白血病由来の罹患細胞に対する細胞結合物質として使用することができる。活性化Ｔ細胞と結合するＩＬ−２を移植片拒絶反応の予防、移植片対宿主病の治療および予防ならびに急性Ｔ細胞白血病の治療に使用することができる。メラノサイトと結合するＭＳＨを、黒色腫に対する抗体と同様に黒色腫の治療に使用することができる。葉酸を使用して、卵巣腫瘍その他の腫瘍で発現される葉酸受容体を標的にすることができる。上皮成長因子を用いて、肺癌および頭頸部癌などの扁平上皮癌を標的にすることができる。ソマトスタチンを用いて、神経芽腫およびその他のタイプの腫瘍を標的にすることができる。

【0045】

エストロゲン（またはエストロゲン類似物質）またはアンドロゲン（またはアンドロゲン類似物質）を細胞結合物質として、それぞれ乳癌および精巣癌を成功裏に標的とすることができる。

【0046】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、細胞表面の抗原と結合することができる任意の免疫グロブリン、任意の免疫グロブリンフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トライボディ、テトラボディ（Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５−２９０２（１９８３）；Ｓｐｒｉｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：４７０−４７８（１９７４）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０−２４４（１９６０），Ｋｉｍら，Ｍｏｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，７：２４８６−２４９７（２００８），Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｓ．，６：３４３−３５７（２００６））など、または免疫グロブリンキメラ（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むもの）を指す。任意の適切な抗体を細胞結合物質として使用することができる。当業者は、標的とする細胞集団によって適切な抗体の選択が決まるということを理解するであろう。この点について、特定の細胞集団（通常好ましくは、罹患細胞集団）で選択的に発現される細胞表面分子（すなわち、抗原）の種類および数によって、本発明の組成物で使用する適切な抗体の選択が決まる。細胞表面の発現プロファイルは腫瘍細胞型を含めた多種多様な細胞型に関して既知であり、未知のものがあれば、日常的な分子生物学技術および組織化学技術を用いてこれを決定することができる。

【0047】

抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよいが、最も好ましくはモノクローナル抗体である。本明細書で使用される「ポリクローナル」抗体は、通常は免疫化された動物の血清中に含まれる抗体分子の不均一な集団を指す。「モノクローナル」抗体は、特定の抗原に特異的な抗体分子の均一な集団を指す。モノクローナル抗体は通常、単一クローンのＢリンパ球（「Ｂ細胞」）により産生される。モノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技術を含めた当業者に公知の各種技術を用いて入手し得る（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：５１１−５１９（１９７６），ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）ならびにＣ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら（編），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５版，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１）を参照）。簡潔に述べれば、モノクローナル抗体作製のためのハイブリドーマ法では通常、任意の適切な動物、通常好ましくはマウスに抗原（すなわち、「免疫原」）を注射する。次いでこの動物を屠殺し、その脾臓から単離したＢ細胞をヒト骨髄腫細胞と融合する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで無限に増殖し、所望の特異性をもつ高力価の抗体を常時分泌するハイブリッド細胞（すなわち、「ハイブリドーマ」）ができる。当該技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて、所望の特異性をもつ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定することができる。このような方法としては、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット分析およびラジオイムノアッセイが挙げられる。ハイブリドーマの集団をスクリーニングして、それぞれが抗原に対する単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離する。各ハイブリドーマは単一のＢ細胞との融合に由来するクローンであるため、それが産生する抗体分子はすべて、その抗原結合部位およびアイソタイプを含めた構造が同一である。またモノクローナル抗体を、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（例えば、ＨａｓｋａｒｄおよびＡｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２）：３６１−６７（１９８４）ならびにＲｏｄｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：１４０−６７（１９８６）を参照）、バクテリオファージベクター発現システム（例えば、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−８１（１９８９）を参照）またはＦａｂおよびｓｃＦｖ（一本鎖可変領域）などの抗体フラグメントを含むファージディスプレイライブラリー（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号および同第５，９６９，１０８号ならびに国際公開第９２／０１０４７号および同第９９／０６５８７号を参照）を含めた他の適切な技術を用いて作製してもよい。

【0048】

モノクローナル抗体は、任意の適切な動物から単離することも任意の適切な動物で作製することもできるが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスまたはヒト、最も好ましくはヒトで作製する。マウスで抗体を作製する方法は当業者に公知であり、本明細書に記載されている。ヒト抗体に関して、適当な抗原を接種した、または適当な抗原で免疫化したヒト対象からポリクローナル抗体を単離することができることを当業者は理解するであろう。あるいは、既知の技術をマウスなどの非ヒト動物でのヒト抗体作製に適合させることにより、ヒト抗体を作製することができる（例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号および同第５，７１４，３５２号ならびに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号を参照）。

【0049】

ヒト抗体、特にヒトモノクローナル抗体はヒトに対する治療適用に理想的な選択であるが、一般にマウスモノクローナル抗体より作製するのが難しい。しかし、マウスモノクローナル抗体をヒトに投与すると即時に宿主抗体反応が誘導されて、抗体−細胞毒性物質複合体の治療能または診断能が低下し得る。このような合併症を回避するために、モノクローナル抗体がヒト免疫系により「異物」として認識されないことが好ましい。

【0050】

この目的のために、ファージディスプレイを用いて抗体を作製することができる。この点について、標準的な分子生物学技術および組換えＤＮＡ技術を用いて、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリーを作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）を参照）。所望の特異性をもつ可変領域をコードするファージを所望の抗原との特異的結合に関して選択し、選択された可変ドメインを含む完全ヒト抗体を構成する。構成された抗体をコードする核酸配列をハイブリドーマ作製に使用される骨髄腫細胞などの適切な細胞系に導入すると、モノクローナル抗体の特徴を有するヒト抗体がその細胞により分泌される（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら，上記，Ｈｕｓｅら，上記および米国特許第６，２６５，１５０号を参照）。あるいは、特定のヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックであるマウスからモノクローナル抗体を作製することができる。このような方法は当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号および同第５，５６９，８２５号ならびにＪａｎｅｗａｙら（上記）に記載されている。

【0051】

最も好ましくは、抗体はヒト化抗体である。本明細書で使用される「ヒト化」抗体とは、マウスモノクローナル抗体の抗原結合ループを形成している相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体分子のフレームワークに移植した抗体のことである。マウス抗体のフレームワークとヒト抗体のフレームワークが類似していることから、この方法により、抗原性がヒト抗体と同一であるが、ＣＤＲ配列が由来するマウスモノクローナル抗体と同じ抗原と結合するモノクローナル抗体が作製されることが当該技術分野において一般に認められている。ヒト化抗体を作製する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（上記）、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号、欧州特許第０２３９４００Ｂ１号ならびに英国特許第２１８８６３８号に詳細に記載されている。また、米国特許第５，６３９，６４１号およびＰｅｄｅｒｓｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５：９５９−９７３（１９９４）に記載されている抗体リサーフィシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）技術を用いてヒト化抗体を作製してもよい。本発明の組成物の複合体で使用する抗体は、最も好ましくはヒト化モノクローナル抗体であるが、上記のようなヒトモノクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体も本発明の範囲内にある。

【0052】

また、少なくとも１つの抗原結合部位があり、標的細胞の表面に存在する少なくとも１つの抗原または受容体を認識してこれと結合する抗体フラグメントも本発明の範囲内にある。この点に関して、インタクト抗体分子のタンパク質分解による切断により、さまざまな抗原を認識してこれと結合する能力を保持する様々な抗体フラグメントを作製することができる。例えば、抗体分子をプロテアーゼであるパパインで限定消化すると、通常３つのフラグメントが生じ、このうち２つは同一のものであり、親抗体分子の抗原結合活性を保持しているためＦａｂフラグメントと呼ばれる。酵素ペプシンで抗体分子を切断すると、通常２つの抗体フラグメントが生じ、このうちの一方には抗体分子の両方の抗原結合アームがあり、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントと呼ばれる。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントをジチオスレイトールまたはメルカプトエチルアミンで還元すると、Ｆａｂ’フラグメントと呼ばれるフラグメントが生じる。一本鎖可変領域フラグメント（ｓＦｖ）の抗体フラグメントは、合成ペプチドを介して抗体軽鎖の可変（Ｖ）ドメインと連結した抗体重鎖のＶドメインを含む短縮されたＦａｂフラグメントからなるものであり、日常的な組換えＤＮＡ技術を用いてこれを作製することができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら，上記を参照）。同様に、組換えＤＮＡ技術によりジスルフィド安定化可変領域フラグメント（ｄｓＦｖ）を調製することができる（例えば、Ｒｅｉｔｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７−７０４（１９９４）を参照）。しかし、本発明に関連する抗体フラグメントは、上で例示したタイプの抗体フラグメントに限定されるものではない。所望の細胞表面受容体または抗原を認識しこれと結合する任意の適切な抗体フラグメントを用いることができる。抗体フラグメントについては、例えば、Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２８９５−２９０２（１９８３），Ｓｐｒｉｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１３：４７０−４７８（１９７４）およびＮｉｓｏｎｏｆｆら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０−２４４（１９６０）にさらに記載されている。当該技術分野で公知の任意の適切な方法、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降および競合阻害アッセイなどを用いて、抗体−抗原結合をアッセイすることができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら，上記および米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号を参照）。

【0053】

さらに、抗体はキメラ抗体またはその抗原結合フラグメントであってもよい。「キメラ」は、少なくとも２つの異なる種から得られるまたはそれに由来する少なくとも２つの免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域とマウス免疫グロブリン可変領域を組み合わせたものなどの２つの異なる免疫グロブリン）を含む、抗体またはそのフラグメントを意味する。また抗体は、ドメイン抗体（ｄＡｂ）またはその抗原結合フラグメント、例えば、ラクダ抗体（例えば、Ｄｅｓｍｙｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：７５２，（１９９６）を参照）または例えば新規な抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）などのサメ抗体（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３７４：１６８（１９９５）およびＳｔａｎｆｉｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５：１７７０−１７７３（２００４）を参照）などであってもよい。

【0054】

任意の適切な抗体を本発明との関連で使用することができる。例えば、モノクローナル抗体Ｊ５は、急性リンパ芽球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ）に特異的なマウスＩｇＧ２ａ抗体であり（Ｒｉｔｚら，Ｎａｔｕｒｅ，２８３：５８３−５８５（１９８０））、ＣＡＬＬＡを発現する細胞（例えば、急性リンパ芽球性白血病細胞）を標的とするのに使用することができる。モノクローナル抗体ＭＹ９は、ＣＤ３３抗原と特異的に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり（Ｇｒｉｆｆｉｎら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓ．，８：５２１（１９８４））、ＣＤ３３を発現する細胞（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞）を標的とするのに使用することができる。

【0055】

同様に、モノクローナル抗体の抗Ｂ４（Ｂ４とも呼ばれる）はＢ細胞上のＣＤ１９抗原と結合するマウスＩｇＧ１抗体であり（Ｎａｄｌｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２４４−２５０（１９８３））、ＣＤ１９を発現するＢ細胞または罹患細胞（例えば、非ホジキンリンパ腫細胞および慢性リンパ芽球性白血病細胞）を標的とするのに使用することができる。Ｎ９０１は、小細胞肺腫瘍を含めた神経内分泌起源の細胞上に存在するＣＤ５６（神経細胞接着分子）抗原と結合するマウスモノクローナル抗体であり、薬物を神経内分泌起源の細胞に対して標的化する複合体で使用することができる。Ｊ５、ＭＹ９およびＢ４抗体は、複合体の一部として使用する前にリサーフィス（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）するかヒト化するのが好ましい。抗体のリサーフィシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）またはヒト化は、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９６９−７３（１９９４）に記載されている。

【0056】

さらに、モノクローナル抗体Ｃ２４２はＣａｎＡｇ抗原と結合し（例えば、米国特許第５，５５２，２９３号を参照）、複合体を結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌および胃癌などのＣａｎＡｇ発現腫瘍に対して標的化するのに使用することができる。ＨｕＣ２４２はヒト化型のモノクローナル抗体Ｃ２４２である（例えば、米国特許第５，５５２，２９３号を参照）。ＨｕＣ２４２を産生するハイブリドーマはＥＣＡＣＣ識別番号９００１２６０１で寄託されている。ＨｕＣ２４２は、ＣＤＲ移植法（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号および同第５，６９３，７６２号を参照）またはリサーフィシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）技術（例えば、米国特許第５，６３９，６４１号を参照）を用いて調製することができる。ＨｕＣ２４２は、ＣａｎＡｇ抗原を発現する腫瘍細胞、例えば結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌および胃癌細胞などに対して複合体を標的化するのに使用することができる。

【0057】

卵巣癌および前立腺癌細胞を標的とするために、複合体中の細胞結合物質として抗ＭＵＣ１抗体を使用することができる。抗ＭＵＣ１抗体としては、例えば、抗ＨＭＦＧ−２（例えば、Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２８：１７−２１（１９８１）を参照）、ｈＣＴＭ０１（例えば、ｖａｎ Ｈｏｆら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６：５１７９−５１８５（１９９６）を参照）およびＤＳ６が挙げられる。また細胞結合物質としてＪ５９１などの抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を使用することにより、前立腺癌細胞を複合体の標的とすることができる（例えば、Ｌｉｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７：３６２９−３６３４（１９９７）を参照）。さらに、細胞結合物質として抗Ｈｅｒ２抗体、例えばトラスツズマブを使用することにより、乳癌、前立腺癌および卵巣癌などのＨｅｒ２抗原を発現する癌細胞を複合体の標的とすることができる。抗ＥＧＦＲ抗体を使用することにより、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する細胞およびそのＩＩＩ型欠損変異株ＥＧＦＲｖＩＩＩなどの変異体を複合体の標的とすることができる。抗ＥＧＦＲ抗体は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８３８５号および同ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８３７８号に記載されている。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、米国特許第７，７３６，６４４号および同第７，６２８，９８６号ならびに米国特許出願公開第２０１０／０１１１９７９号、同第２００９／０２４００３８号、同第２００９／０１７５８８７号、同第２００９／０１５６７９０号および同第２００９／０１５５２８２号に記載されている。また米国特許第７，９８２，０２４号に記載されているようなインスリン様成長因子受容体と結合する抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体も複合体に使用することができる。またＣＤ２７Ｌ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＥｐｈＡ２、インテグリン、ＣＤ３７、葉酸塩、ＣＤ２０、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＣＡ、ＴＭＥＦＦ２、ＳＴＥＡＰ１、エンドグリンおよびＨｅｒ３と結合する抗体も複合体に使用することができる。

【0058】

一実施形態では、抗体は、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）、ビバツズマブ、シブロツズマブ、リツキシマブ、ｈｕＤＳ６、国際公開第２０１０／１２４７９７号に記載されている抗メソテリン抗体（ＭＦ−Ｔなど）、米国特許出願公開第２０１０／００９３９８０号に記載されている抗ｃｒｉｐｔｏ抗体（ｈｕＢ３Ｆ６など）、米国特許出願公開第２００７／０１８３９７１号に記載されている抗ＣＤ１３８抗体（ｈｕＢ−Ｂ４など）、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８３８５号および同ＰＣＴ／ＵＳ１１／０５８３７８号に記載されている抗ＥＧＦＲ抗体（ＥＧＦＲ−７など）、米国特許第７，７３６，６４４号および同第７，６２８，９８６号ならびに米国特許出願公開第２０１０／０１１１９７９号および同第２００９／０２４００３８号、同第２００９／０１７５８８７号、同第２００９／０１５６７９０号および同第２００９／０１５５２８２号に記載されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、国際公開第２０１１／０３９７２１号および同第２０１１／０３９７２４号に記載されているヒト化ＥｐｈＡ２抗体（２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４など）；国際公開第２００８／０４７２４２号に記載されている抗ＣＤ３８抗体（ｈｕ３８ＳＢ１９など）、国際公開第２０１１／１０６５２８号および米国特許出願公開第２０１２／０００９１８１号に記載されている抗葉酸抗体（例えば、ｈｕＭｏｖ１９）；米国特許第５，９５８，８７２号および同第６，５９６，７４３号および同第７，９８２，０２４号に記載されている抗ＩＧＦ１Ｒ抗体；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５３号に記載されている抗ＣＤ３７抗体（例えば、ｈｕＣＤ３７−３）；米国特許出願公開第２００６／０１２７４０７号に記載されている抗インテグリンα_ｖβ_６抗体（例えば、ＣＮＴＯ９５）；ならびに国際公開第２０１２／０１９０２４号に記載されている抗Ｈｅｒ３抗体からなる群より選択される。

【0059】

特に好適な抗体は、本明細書に記載のヒト化モノクローナル抗体である。その例としては、特に限定されないが、ｈｕＮ９０１、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、ヒト化モノクローナル抗Ｈｅｒ２抗体（例えば、トラスツズマブ）、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ＣＮＴＯ９５、ｈｕＤＳ６およびリツキシマブが挙げられる（例えば、米国特許第５，６３９，６４１号および同第５，６６５，３５７号、米国特許仮出願第６０／４２４，３３２号（米国特許第７，５５７，１８９号に関連する）、国際（ＰＣＴ）公開第０２／１６４０１号、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，上記，Ｒｏｇｕｓｋａら，上記，Ｌｉｕら，上記，Ｎａｄｌｅｒら，上記，Ｃｏｌｏｍｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．，１９：４９−５６（２００１），Ｈｅｉｄｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１Ａ：２３８５−２３９１（１９９５），Ｗｅｌｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２：１１９３−１２０３（１９９４）およびＭａｌｏｎｅｙら，Ｂｌｏｏｄ，９０：２１８８−２１９５（１９９７）を参照）。その他のヒト化モノクローナル抗体は当該技術分野で公知であり、本発明に関連して使用することができる。

【0060】

一実施形態では、細胞結合物質は、ヒト葉酸受容体１と特異的に結合するヒト化抗葉酸抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ここでは、抗体は、（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸａａ_１ＦＸａａ_２Ｘａａ_３（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２およびＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３と、（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２およびＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含み、式中、Ｘａａ_１はＫ、Ｑ、ＨおよびＲから選択され、Ｘａａ_２はＱ、Ｈ、ＮおよびＲから選択され、Ｘａａ_３はＧ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、ＡおよびＶから選択される。好ましくは、重鎖ＣＤＲ２配列はＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号７）を含む。

【0061】

別の実施形態では、抗葉酸抗体は、ヒト葉酸受容体１と特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであり、アミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＦＭＮＷＶＫＱＳＰＧＱＳＬＥＷＩＧＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＴＡＨＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＦＡＶＹＹＣＴＲＹＤＧＳＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８）
を有する重鎖を含む。

【0062】

別の実施形態では、抗葉酸抗体は、２０１０年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号がＰＴＡ−１０７７２およびＰＴＡ−１０７７３または１０７７４であるプラスミドＤＮＡによりコードされる、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0063】

別の実施形態では、抗葉酸抗体は、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＦＭＮＷＶＫＱＳＰＧＱＳＬＥＷＩＧＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＴＡＨＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＦＡＶＹＹＣＴＲＹＤＧＳＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号９）
と少なくとも約９０％、９５％、９９％または１００％同一である重鎖可変ドメインと、ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＮＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号１０）；または
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＴＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号１１）と少なくとも約９０％、９５％、９９％または１００％同一である軽鎖可変ドメインとを含む、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0064】

細胞結合物質は抗体であることが好ましいが、細胞結合物質は非抗体分子であってもよい。適切な非抗体分子としては、例えば、インターフェロン（例えば、α−、β−またはγ−インターフェロン）、リンホカイン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４またはＩＬ−６）、ホルモン（例えば、インスリン）、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦおよびＶＥＧＦ）、コロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，５：１５５−１５８（１９８４）を参照）、ソマトスタチンおよびトランスフェリン（例えば、Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：９３２−９３７（１９８５）を参照）が挙げられる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦは骨髄性細胞と結合し、急性骨髄性白血病細胞を標的とする細胞結合物質として使用することができる。さらに、ＩＬ−２は活性化Ｔ細胞と結合し、移植片拒絶反応の予防、移植片対宿主病の治療および予防ならびに急性Ｔ細胞白血病の治療に使用することができる。上皮成長因子（ＥＧＦ）は肺癌および頭頸部癌などの扁平上皮癌を標的とするのに使用することができる。ソマトスタチンは神経芽腫細胞その他の腫瘍細胞型を標的とするのに使用することができる。

【0065】

複合体は任意の適切な細胞毒性物質を含み得る。本明細書で使用される「細胞毒性物質」は、細胞の死をもたらす、細胞死を誘導する、または細胞生存能を低下させる任意の化合物を指す。適切な細胞毒性物質としては、例えば、マイタンシノイドおよびコンジュゲート可能なアンサミトシン（例えば、２０１１年１１月３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１１／５９１３１号を参照）、タキソイド、ＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似物質ならびにドラスタチンおよびドラスタチン類似物質が挙げられる。本発明の好適な実施形態では、細胞毒性物質は、マイタンシノールおよびマイタンシノール類似物質を含めたマイタンシノイドである。マイタンシノイドは微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞に対して毒性の強い化合物である。適切なマイタンシノール類似物質の例としては、修飾された芳香環を有するものおよび他の位置に修飾を有するものが挙げられる。このようなマイタンシノイドは、例えば、米国特許第４，２５６，７４６号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６２，６６３号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，３７１，５３３号、同第４，４５０，２５４号、同第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号および同第６，３３３，４１０号に記載されている。

【0066】

修飾された芳香環を有するマイタンシノール類似物質の例としては、（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元により調製される）、（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および同第４，３０７，０１６号）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）もしくはアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を用いる脱メチル化またはＬＡＨを用いる脱塩素により調製される）および（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いるアシル化により調製される）が挙げられる。

【0067】

芳香環以外の位置の修飾を有するマイタンシノール類似物質の例としては、（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（マイタンシノールとＨ_２ＳまたはＰ_２Ｓ_５との反応により調製される）、（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ_２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ_２ＯＨまたはＣＨ_２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製される）、（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるマイタンシノールの変換により調製される）、（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および同第４，３１５，９２９号）（トレウィア・ヌディフローラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離される）、（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および同第４，３２２，３４８号）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるマイタンシノールの脱メチル化により調製される）および（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（マイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される）が挙げられる。

【0068】

本発明の好適な実施形態では、複合体は、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシンとしても知られるチオール含有マイタンシノイドＤＭ１を細胞毒性物質として用いるものである。ＤＭ１の構造は式（Ｉ）：

【0069】

【化1】

【0070】

で表される。

【0071】

本発明の別の好適な実施形態では、複合体は、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシンとしても知られるチオール含有マイタンシノイドＤＭ４を細胞毒性物質として用いるものである。ＤＭ４の構造は式（ＩＩ）：

【0072】

【化2】

【0073】

により表される。

【0074】

例えば硫黄原子を有する炭素原子上にモノ−またはジ−アルキル置換を有するチオールおよびジスルフィド含有マイタンシノイドを含めた、他のマイタンシノイドを本発明との関連で使用し得る。特に好適なものは、Ｃ−３位に（ａ）Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デスメチル官能基と、（ｂ）ヒンダードスルフィドリル基を有するアシル基を有するアシル化アミノ酸側鎖であって、チオール官能基を有するアシル基の炭素原子が１つまたは２つの置換基を有し、前記置換基がＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、さらに、置換基の１つがＨであってよく、アシル基が、カルボニル官能基と硫黄原子との間に少なくとも炭素原子３個の直鎖長を有するアシル化アミノ酸側鎖とを有する、マイタンシノイドである。

【0075】

本発明との関連で使用されるほかのマイタンシノイドとしては、式（ＩＩＩ）：

【0076】

【化3】

【0077】

により表される化合物が挙げられ、上式中、
Ｙ’は（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_９＝ＣＲ_１０）_ｐ（Ｃ≡Ｃ）_ｑＡ_ｏ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍＤ_ｕ（ＣＲ_１１＝ＣＲ_１２）_ｒ（Ｃ≡Ｃ）_ｓＢ_ｔ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺを表し、式中、
Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｒ_２はＨであってもよく，
Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_１１およびＲ_１２は、それぞれ独立してＨ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔは、それぞれ独立してゼロまたは１〜５の整数であり、ただし、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔのうちの少なくとも２つは同時にゼロになることがなく、
ＺはＨ、ＳＲまたはＣＯＲであり、式中、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニルまたは単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルである。

【0078】

式（ＩＩＩ）の好適な実施形態としては、（ａ）Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、ＺがＨである、（ｂ）Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、ＺがＨである、（ｃ）Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｚが−ＳＣＨ_３である、ならびに（ｄ）Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、Ｚが−ＳＣＨ_３である、式（ＩＩＩ）の化合物が挙げられる。

【0079】

また、このようなほかのマイタンシノイドとしては、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）または（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）：

【0080】

【化4】

【0081】

により表される化合物も挙げられ、上式中、
Ｙは（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺを表し、式中、
Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｒ_２はＨであってもよく、
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８は、それぞれ独立してＨ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎはゼロであってもよく、
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたはＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキルもしくはアルケニルまたは単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デスメチルに側鎖を有するマイタンシノイドを表す。

【0082】

式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）および（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の好適な実施形態としては、（ａ）Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、ＺがＨである、（ｂ）Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、ＺがＨである、（ｃ）Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ_３である、または（ｄ）Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ_３である、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）および（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の化合物が挙げられる。

【0083】

好ましくは、細胞毒性物質は式（ＩＶ−Ｌ）により表される。

【0084】

また、ほかの好適なマイタンシノイドとしては、式（Ｖ）：

【0085】

【化5】

【0086】

により表される化合物も挙げられ、上式中、
Ｙは（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺを表し、式中、
Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｒ_２はＨであってもよく、
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８は、それぞれ独立してＨ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎはゼロであってもよく、
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたはＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニルまたは単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルである。

【0087】

式（Ｖ）の好適な実施形態としては、（ａ）Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８がそれぞれＨであり；ｌおよびｍがそれぞれ１であり；ｎが０であり；ＺがＨである、（ｂ）Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり；Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり；ｎが０であり；ＺがＨである、（ｃ）Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ_３である、または（ｄ）Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ_３である、式（Ｖ）の化合物が挙げられる。

【0088】

さらなる好適なマイタンシノイドとしては、式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）または（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）：

【0089】

【化6】

【0090】

により表される化合物が挙げられ、上式中、
Ｙ_２は（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺ_２を表し、式中、
Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、Ｒ_２はＨであってもよく、
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８は、それぞれ独立してＨ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖環状アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎはゼロであってもよく、
Ｚ_２は、ＳＲまたはＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｍａｙは、マイタンシノイドの大環状構造である。

【0091】

ほかの好適なマイタンシノイドとしては、式（ＶＩＩ）：

【0092】

【化7】

【0093】

により表される化合物が挙げられ、上式中、
Ｙ_２’は（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_９＝ＣＲ_１０）_ｐ（Ｃ≡Ｃ）_ｑＡ_ｏ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍＤ_ｕ（ＣＲ_１１＝ＣＲ_１２）_ｒ（Ｃ≡Ｃ）_ｓＢ_ｔ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺ_２を表し、式中、
Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立してＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖分岐もしくはアルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、さらにＲ_２はＨであってもよく、
Ａ、ＢおよびＤは、それぞれ独立して３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_１１およびＲ_１２は、それぞれ独立してＨ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔは、それぞれ独立してゼロまたは１〜５の整数であり、ただし、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔのうちの少なくとも２つは同時にゼロになることがなく、
Ｚ_２は、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分岐もしくは環状のアルキルもしくはアルケニルまたは単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルである。

【0094】

式（ＶＩＩ）の好適な実施形態としては、Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルである式（ＶＩＩ）の化合物が挙げられる。

【0095】

マイタンシノイドのほかに、複合体に使用する細胞毒性物質は、タキサンまたはその誘導体であってもよい。タキサンは、ともに癌治療で広く用いられている細胞毒性天然産物であるパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））および半合成誘導体のドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））を含む化合物のファミリーである。タキサンは、チューブリンの脱重合を阻害して細胞死をもたらす有糸分裂紡錘体毒である。ドセタキセルおよびパクリタキセルは癌治療に有用であるが、正常細胞に対して非特異的な毒性があるため、その抗腫瘍活性は制限される。さらに、パクリタキセルおよびドセタキセルのような化合物自体が、細胞結合物質の複合体に使用できるほど十分に強力なものではない。

【0096】

細胞毒性複合体の調製に使用するのに好適なタキサンは、式（ＶＩＩＩ）：

【0097】

【化8】

【0098】

のタキサンである。

【0099】

タキサンを抗体などの細胞結合物質にコンジュゲートする方法とともに本発明との関連で使用することができるタキサンを合成する方法は、米国特許第５，４１６，０６４号、同第５，４７５，０９２号、同第６，３４０，７０１号、同第６，３７２，７３８号、同第６，４３６，９３１号、同第６，５９６，７５７号、同第６，７０６，７０８号、同第６，７１６，８２１および同第７，３９０，８９８号に詳細に記載されている。

【0100】

また細胞毒性物質は、ＣＣ−１０６５またはその誘導体であってもよい。ＣＣ−１０６５は、ストレプトマイセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離される強力な抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ−１０６５はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびビンクリスチンなどのよく使用される抗癌剤より約１０００倍以上強力である（Ｂｈｕｙａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４２：３５３２−３５３７（１９８２））。ＣＣ−１０６５およびその類似物質は、米国特許第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、同第６，３４０，７０１号および同第６，３７２，７３８号に開示されている。ＣＣ−１０６５の細胞傷害効力は、そのアルキル化活性およびＤＮＡ結合またはＤＮＡインターカレート活性と関係があるとされている。この２つの活性は分子の別々の部分に存在する。この点に関して、アルキル化活性はシクロプロパピロロインドール（ＣＰＩ）サブユニット内にあり、ＤＮＡ結合活性はＣＣ−１０６５の２つのピロロインドールサブユニット内に存在する。

【0101】

数種類のＣＣ−１０６５類似物質が当該技術分野で公知であり、複合体の細胞毒性物質として使用することもできる（例えば、Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３１：５９０−６０３（１９８８）を参照）。ＣＰＩ部分をシクロプロパベンゾインドール（ＣＢＩ）部分に置き換えた一連のＣＣ−１０６５類似物質が開発されている（Ｂｏｇｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：５８２３−５８３３（１９９０）およびＢｏｇｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１：１１５−１２０（１９９１））。これらのＣＣ−１０６５類似物質は、マウスで遅発毒性を惹き起こすことなく親薬物の高いｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を維持する。ＣＣ−１０６５と同様にこれらの化合物は、ＤＮＡの副溝と共有結合して細胞死をもたらすアルキル化剤である。

【0102】

ＣＣ−１０６５類似物質の治療効果は、腫瘍部位への標的化送達によりｉｎ ｖｉｖｏ分布を変化させて、非標的組織に対する毒性を弱め、全身毒性を弱めることにより、大幅に向上し得る。この目的のために、腫瘍細胞を特異的に標的とするＣＣ−１０６５の類似物質および誘導体と細胞結合物質との複合体が作製されている（例えば、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号および同第５，８４６，５４５号を参照）。これらの複合体は通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの高い標的特異的細胞毒性およびマウスのヒト腫瘍異種移植モデルにおける抗腫瘍活性を示す（例えば、Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：４０７９−４０８４（１９９５）を参照）。

【0103】

ＣＣ−１０６５類似物質を合成する方法は、米国特許第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、同第６，５３４，６６０号、同第６，５８６，６１８号、同第６，７５６，３９７号および同第７，３２９，７６０号に詳細に記載されている。

【0104】

メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリケアマイシン、ツブリシンおよびツブリシン類似物質、デュオカルマイシンおよびデュオカルマイシン類似物質、ドラスタチンおよびドラスタチン類似物質などの薬剤も本発明の細胞毒性物質として使用することができる。またドキサルビシン（ｄｏｘａｒｕｂｉｃｉｎ）／ダウノルビシン化合物（例えば、米国特許第６，６３０，５７９号を参照）も細胞毒性物質として使用することができる。

【0105】

細胞結合物質−細胞毒性物質複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏの方法で調製し得る。細胞毒性物質と抗体を連結するために連結基を用いる。適切な連結基は当該技術分野で公知であり、ジスルフィド基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基およびエステラーゼに不安定な基ならびに切断不可能な連結基がこれに含まれる。例えば、細胞結合物質をジスルフィド結合、酸に不安定な結合、光に不安定な結合、ペプチダーゼに不安定な結合、チオエーテル結合およびエステラーゼに不安定な結合からなる群より選択される化学結合を介して細胞毒性物質と化学的に結合させることができる。

【0106】

本発明に従えば、二官能性架橋試薬を介して細胞結合物質と細胞毒性物質を連結する。本明細書で使用される「二官能性架橋試薬」は、一方が細胞結合物質と反応することができ、他方が細胞毒性物質と反応することができる、２つの反応基をもち、細胞結合物質と細胞毒性物質を連結することにより複合体を形成する試薬を指す。

【0107】

リンカー試薬により、過度の毒性を伴わずに細胞毒性物質および細胞結合物質のそれぞれ治療特性（例えば、細胞毒性）および標的化特性が保持される限り、任意の適切な二官能性架橋試薬を本発明に関連して使用することができる。好ましくは、リンカー分子は、細胞毒性物質と細胞結合物質が互いに化学的に結合する（例えば、共有結合する）ように、化学結合（上記のような）を介して細胞毒性物質と細胞結合物質を連結する。

【0108】

一実施形態では、二官能性架橋試薬は切断不可能なリンカーを含む。切断不可能なリンカーとは、マイタンシノイド、タキサンまたはＣＣ−１０６５類似物質などの細胞毒性物質を安定で共有結合的な方法で細胞結合物質と連結することができる任意の化学的部分のことである。したがって、切断不可能なリンカーは、細胞毒性物質または細胞結合物質の活性状態が維持される条件下で、実質的に酸による切断、光による切断、ペプチダーゼによる切断、エステラーゼによる切断およびジスルフィド結合の切断に対して耐性がある。

【0109】

細胞毒性物質と細胞結合物質との間で切断不可能なリンカーを形成する適切な架橋試薬は当該技術分野で公知である。一実施形態では、細胞毒性物質はチオエーテル結合を介して細胞結合物質と連結される。切断不可能なリンカーの例としては、細胞毒性物質との反応のためのマレイミド系またはハロアセチル系部分を有するリンカーが挙げられる。このような二官能性架橋剤は当該技術分野で公知であり（米国特許出願公開第２０１０／０１２９３１４号、同第２００９／０２７４７１３号、同第２００８／００５０３１０号、同第２００５０１６９９３３号、同第２００９／０２７４７１３号、同第２０１０／０１２９３１４号を参照、またＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １１７，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ ６１１０５，ＵＳＡから入手可能な架橋剤）、特に限定されないが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）の「長鎖」類似物質であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロアート）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノアート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチラート（ＳＭＰＢ）およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアナート（ＰＭＰＩ）が挙げられる。ハロアセチル系部分を含む架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−ベンゾアート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−ヨードアセタート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−ブロモアセタート（ＳＢＡ）およびＮ−スクシンイミジル−３−（ブロモアセトアミド）プロピオナート（ＳＢＡＰ）、ビス−マレイミドポリエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、ＢＭ（ＰＥＯ）_２、ＢＭ（ＰＥＯ）_３、Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、５−マレイミド吉草酸ＮＨＳ、ＨＢＶＳ、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ（ＭＰＢＨ）、スクシンイミジル−（４−ビニルスルホニル）ベンゾアート（ＳＶＳＢ），ジチオビス−マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス−マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾアート（スルホ−ＳＩＡＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、Ｎ−（γ−マレイミドブトリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシミド（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｍｉｄｏ）エステル（スルホ−ＥＭＣＳ）、Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＫＭＵＳ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）ＣＸ１−１、スルホ−ＭａｌおよびＰＥＧ_ｎ−Ｍａｌが挙げられる。好ましくは、二官能性架橋試薬はＳＭＣＣである。

【0110】

【化9】

【0111】

一実施形態では、連結試薬は切断可能なリンカーである。適切な切断可能なリンカーの例としては、ジスルフィドリンカー、酸に不安定なリンカー、光に不安定なリンカー、ペプチダーゼに不安定なリンカーおよびエステラーゼに不安定なリンカーが挙げられる。ジスルフィド含有リンカーは、生理的条件下で生じ得るジスルフィド交換により切断可能なリンカーである。酸に不安定なリンカーは、酸性ｐＨで切断可能なリンカーである。例えば、エンドソームおよびリソソームなどの特定の細胞内区画はｐＨが酸性であり（ｐＨ４〜５）、酸に不安定なリンカーを切断するのに適した条件をもたらす。光に不安定なリンカーは、光の当たる体表および多くの体腔内で有用である。さらに、赤外光が組織を貫通することができる。ペプチダーゼに不安定なリンカーを用いて、細胞内外の特定のペプチドを切断することができる（例えば、Ｔｒｏｕｅｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：６２６−６２９（１９８２）およびＵｍｅｍｏｔｏら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４３：６７７−６８４（１９８９）を参照）。一実施形態では、切断可能なリンカーは穏やかな条件下、すなわち、細胞毒性物質の活性が影響を受けない細胞内条件下で切断される。

【0112】

別の実施形態では、細胞毒性物質はジスルフィド結合を介して細胞結合物質と連結される。リンカー分子は、細胞結合物質と反応することができる反応性化学基を含む。細胞結合物質との反応に好適な反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。さらに、リンカー分子は、細胞毒性物質と反応してジスルフィド結合を形成することができる反応性化学基、好ましくはジチオピリジル基を含む。ジスルフィド結合を介した細胞結合物質と細胞毒性物質の連結を可能にする二官能性架橋試薬は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３−７３７（１９７８）を参照）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号を参照）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６を参照）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号を参照）が挙げられる。ジスルフィド基の導入に使用することができる他の二官能性架橋試薬は当該技術分野で公知であり、すべてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９１３，７４８号、同第６，７１６，８２１号ならびに米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号および同第２０１０／０１２９３１４号に記載されている。

【0113】

切断不可能なリンカーを形成する硫黄原子を含まない他の架橋試薬も本発明の方法に使用することができる。このようなリンカーはジカルボン酸系部分から誘導され得る。適切なジカルボン酸系部分としては、特に限定されないが、
一般式（ＩＸ）：
ＨＯＯＣ−Ｘ_ｌ−Ｙ_ｎ−Ｚ_ｍ−ＣＯＯＨ
（ＩＸ）
のα，ω−ジカルボン酸が挙げられ、上式中、Ｘは、２〜２０個の炭素原子を有する直鎖または分岐のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、Ｙは、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル基であり、Ｚは、６〜１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換芳香族基またはヘテロ原子がＮ、ＯもしくはＳから選択される置換もしくは非置換複素環基であり、ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ０または１であり、ただし、ｌ、ｍおよびｎは同時にすべてがゼロになることはない。

【0114】

本明細書に開示される切断不可能なリンカーの多くが米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３Ａ１号に詳細に記載されている。

【0115】

以下の実施例は本発明をさらに説明するものであるが、当然ながら、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではないと解釈されるべきである。

【実施例】

【0116】

実施例１
これまでに記載されている工程（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号）および本出願の対象である１段階の工程を用いて、ヒト化ＣＤ３７−３抗体をヘテロ二官能性架橋試薬ＳＭＣＣおよびマイタンシノイドＤＭ１と反応させた。

【0117】

これまでに記載されている工程では、最初にｈｕＣＤ３７−３（１５ｍｇ／ｍＬ）をＳＭＣＣ（抗体量に対して６．５倍モル過剰）と反応させて修飾抗体を形成した。修飾反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡと１０％ＤＭＡとを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．９）中、１６℃で９０分間実施した。１Ｍ酢酸塩で反応を停止させてｐＨを４．５に調整し、修飾抗体を、平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｆ樹脂のカラムを用いて精製し、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で溶出させた。精製後、修飾抗体（５ｍｇ／ｍＬ）をマイタンシノイドＤＭ１（抗体量に対して６．８倍モル過剰；測定された抗体上のリンカー量に対して１．３倍過剰）と反応させて、コンジュゲート抗体を形成した。コンジュゲーション反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡと５％ＤＭＡとを含有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中、２０℃で約２０時間実施した。次いで反応混合物を、平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｆ樹脂のカラムを用いて精製し、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で溶出させた。

【0118】

本発明の工程では、ｈｕＣＤ３７−３（２．５ｍｇ／ｍＬ）ＤＭ１（抗体量に対して６．２倍モル過剰）、次いでＳＭＣＣ（抗体量に対して５．２倍過剰）と混合する。反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡと１０％ＤＭＡとを含有する５０ｍＭ ＥＰＰＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸］緩衝液（ｐＨ８．１）中、２０℃で約４時間実施した。１Ｍ酢酸塩の添加により反応を停止させて、ｐＨを５．０に調整した。次いで、反応混合物を２〜８℃で約２０時間保持した。保持後、反応混合物を０．２μｍのＰＶＤＦフィルターでろ過し、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いて精製し、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に透析ろ過した。

【0119】

２つの工程から得られた複合体を、濃度および細胞毒性物質付加量（マイタンシノイドと抗体の比、ＭＡＲ）に関するＵＶ分光測定、未コンジュゲートリンカーのレベルを決定する質量分析、非還元性種のレベルを決定する還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、複合体単量体を決定するＳＥＣ−ＨＰＬＣならびに複合体単量体および遊離マイタンシノイド解離に関する保管時の安定性により分析した。

【0120】

ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計で２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける複合体の吸光度を測定し、２つの波長におけるＤＭ１および抗体のモル吸光係数を用いて抗体およびＤＭ１のモル濃度を計算することにより、濃度およびマイタンシノイドと抗体の比（ＭＡＲ）を決定した。

【0121】

複合体の未コンジュゲートリンカーのレベルを質量分析により分析した：個々の複合体種（未コンジュゲートリンカーを有するまたは有さない複合体を含む）のピーク面積を測定した；未コンジュゲートリンカーを含む面積の合計（リンカー数による重み付けを行った）と複合体全種の面積の合計（同様にリンカー数による重み付けを行った）の比により、未コンジュゲートリンカーのレベルを計算した。

【0122】

複合体の非還元性種のレベルを還元ＳＤＳゲル電気泳動により分析した：個々の還元された複合体種（還元された軽鎖、還元された重鎖、架橋された軽鎖−軽鎖、架橋された軽鎖−重鎖などを含む）のピーク面積を測定した；非還元性種の面積の合計と全種の面積の合計の比により非還元性種のレベルを計算した。

【0123】

複合体の単量体レベルをサイズ排除ＨＰＬＣにより分析した：単量体、二量体、凝集体および低分子種のピーク面積を、２５２ｎｍまたは２８０ｎｍの波長に設定した吸光度検出器を用いて測定した；単量体の面積と合計面積の比により単量体レベルを計算した。

【0124】

複合体中に存在する遊離マイタンシノイドの量をデュアルカラム（ＨｉＳｅｐおよびＣ１８カラム）ＨＰＬＣにより分析した：２５２ｎｍの波長に設定した吸光度検出器を用いて、遊離マイタンシノイド全種（勾配で溶出させ、既知の標準物質の溶出時間との比較により同定）のピーク面積を測定した；既知量の標準物質のピーク面積により作成した標準曲線を用いて、遊離マイタンシノイドの量を計算した。

【0125】

下の表１に示すように、本発明の工程を用いて製造された複合体の方が、未コンジュゲートリンカー、非還元性種および複合体単量体の点で、これまでに記載されている工程を用いて製造された複合体より優れていた。さらに、本発明の工程により製造された複合体の安定性の方が、４℃で５か月間保管した後の遊離マイタンシノイドの解離の点で大幅にすぐれていた。両工程により製造された複合体の単量体レベルは安定していた。

【0126】

【表1】

【0127】

この実施例で考察される実験結果は、実質的に高純度の細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を調製する工程が改善されていることを示すものである。本発明の工程を用いて得られた複合体の純度および安定性の改善に加え、２つの処理段階（修飾反応および修飾抗体の精製）の削除による処理時間および利便性の改善もみられる。

【0128】

実施例２
これまでに記載されている２つの工程および本出願の対象である改善された工程を用いて、ヒト化葉酸受容体抗体ｈｕＭｏｖ１９（米国特許出願公開第２０１２／０００９１８１号を参照）をヘテロ二官能性架橋試薬スルホ−ＳＰＤＢおよびマイタンシノイドＤＭ４と反応させた。

【0129】

これまでに記載されている工程Ａ（２段階の工程、例えば、Ｃｈａｒｉら，米国特許第５，２０８，０２０号）では、最初にｈｕＭｏｖ１９抗体（２０ｍｇ／ｍＬ）をスルホ−ＳＰＤＢ（抗体量に対して５．７倍モル過剰、ＤＭＡ（ジメチルアセトアミド）に溶解）と反応させて修飾抗体を形成した。修飾反応を、５％ＤＭＡを含有する５０ｍＭ ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ８．１）中、２０℃で１８０分間実施した。修飾抗体を、平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｆ樹脂のカラムを用いて精製し、２ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む５０ｍＭ ＥＰＰＳ（ｐＨ８．１）で溶出させた。精製後、修飾抗体（５．０ｍｇ／ｍＬ）をマイタンシノイドＤＭ４（ＤＭＡに溶解；抗体量に対して９．７倍モル過剰；測定された抗体上のリンカー量に対して１．７倍過剰）と反応させてコンジュゲート抗体を形成した。コンジュゲーション反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡと５％ＤＭＡとを含有する５０ｍＭ ＥＰＰＳ（ｐＨ８．１）中、室温で約１８時間実施した。次いで反応混合物を、平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｆ樹脂のカラムを用いて精製し、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で溶出させた。

【0130】

これまでに記載されている工程Ｂ（ワンポット工程、Ｄａｉら，米国特許第７，８１１，５７２号）では、最初にｈｕＭｏｖ１９抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）をスルホ−ＳＰＤＢ（抗体量に対して４．９倍モル過剰、ＤＭＡに溶解）と反応させて修飾抗体を形成した。修飾反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡと１０％ＤＭＡとを含有する５０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中、２０℃で６０分間実施した。コンジュゲーション反応の前に修飾抗体を精製しなかった。代わりに、未精製の修飾抗体を１０ｍｇ／ｍＬでマイタンシノイドＤＭ４（抗体量に対して８．３倍モル過剰、ＤＭＡに溶解）と反応させて、コンジュゲート抗体を形成した。コンジュゲーション反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡと１０％ＤＭＡとを含有する５０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中、室温で約１８時間実施した。次いで反応混合物を、平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｆ樹脂のカラムを用いて精製し、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で溶出させた。

【0131】

Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を用いて複合体を精製する本発明の工程（工程Ｃ、１段階の工程）では、ｈｕＭｏｖ１９抗体（６．０ｍｇ／ｍＬ）をＤＭ４（抗体量に対して９．７倍モル過剰、ＤＭＡに溶解）と混合し、次いでスルホ−ＳＰＤＢ（抗体量に対して５．７倍過剰、ＤＭＡに溶解）を加えた。反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡと１０％ＤＭＡとを含有する５０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．１）中、２０℃で約２０時間実施した。次いで反応混合物を、平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｆ樹脂のカラムを用いて精製し、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で溶出させた。

【0132】

タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いて複合体を精製する本発明の工程（工程Ｄ、１段階の工程）では、ｈｕＭｏｖ１９抗体（５．０ｍｇ／ｍＬ）をＤＭ４（抗体量に対して１０．２倍モル過剰、ＤＭＡに溶解）、次いでスルホ−ＳＰＤＢ（抗体量に対して６．０倍過剰、ＤＭＡに溶解）と混合した。反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡと１０％ＤＭＡとを含有する５０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中、２０℃で約２０時間時間実施した。次いでＴＦＦを用いて、反応混合物を精製し、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に透析ろ過した。

【0133】

異なる工程から得られた複合体を、ＵＶ分光測定（濃度およびマイタンシノイドと抗体の比、ＭＡＲに関する）、遊離マイタンシノイドを決定する逆相ＨＰＬＣ、未コンジュゲートリンカーのレベルおよび質量分布プロファイルを決定する質量分析、非還元性種のレベルを決定する還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、断片化のレベルを決定する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、複合体単量体を決定するＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。保管時の安定性を複合体単量体および遊離マイタンシノイド解離に関して評価した。分析方法論に関するさらなる詳細は、実施例１に記載されている。

【0134】

下の表２に示すように、本発明の工程を用いて製造された複合体は、単量体の点で、これまでに記載されている工程を用いて製造された複合体より優れていた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を用いて最後の複合体精製を実施したワンポット工程および１段階の工程（それぞれ工程Ｂおよび工程Ｃ）を用いて製造された複合体は、２段階の工程（工程Ａ）を用いて製造された複合体より遊離マイタンシノイドのレベルが高かった。しかし、異なる最終精製工程ＴＦＦを用いた場合（工程Ｄ）、最初の精製後および４℃で６週間の保管後ともに遊離マイタンシノイドのレベルはきわめて低く、２段階の工程で示されるレベルと同程度であった。他の重要な複合体の特性（例えば、断片化、非還元性種、質量分布プロファイルおよび未コンジュゲートリンカー）に関しては、本発明の工程を用いて製造された複合体は、これまでに記載されている工程により製造された複合体と同等であった。

【0135】

【表2】

【0136】

この実施例で考察される実験結果は、実質的に高純度の細胞結合物質−細胞毒性物質複合体を調製する工程が改善されていることを示すものである。本発明の工程を用いて得られた複合体の純度および安定性の改善に加え、２つの処理段階（修飾反応および修飾抗体の精製）の削除による処理時間および利便性の改善もみられる。

【0137】

実施例３
この実施例は、本明細書に記載の１段階の工程を用いて、各種のリンカーおよびマイタンシノイド細胞毒性物質から出発して複合体を製造し得ることを示すものである。

【0138】

ヒト化ｈｕＮ９０１抗体をマイタンシノイド（ＤＭ１またはＤＭ４）、次いでリンカー（スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢまたはＳＰＰ）と混合した。反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡと１０％ＤＭＡとを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中、２０℃で約２０〜２４時間実施した。次いで反応混合物を、平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５Ｆ樹脂のカラムを用いて精製し、１０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で溶出させた。

【0139】

下の表３に示すように、１段階の反応をリンカーとマイタンシノイドの種々の組合せで実施して、良好なＭＡＲおよび単量体レベルの複合体を得ることができる。

【0140】

【表3】

【0141】

本明細書に引用される刊行物、特許出願および特許を含めた参考文献はすべて、各参考文献が個別にかつ具体的に参照により組み込まれることが示され、その内容全体が本明細書に記載された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【0142】

本発明の記載との関連（特に、添付の特許請求の範囲との関連）における用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびにこれと同様の指示対象の使用は、本明細書に別途明記される場合または文脈からそうでないことが明らかである場合を除き、単数および複数をともに含むものと解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する、もつ（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別途注記されない限り、オープンエンドな用語（すなわち、「特に限定されないが、〜を含む」という意味である）として解釈されるべきである。本明細書における数値の範囲の記載は、本明細書に別途明記されない限り、単にその範囲に含まれる個々の数値を個別に記載する簡便な方法として用いることを意図したものであり、個々の数値は、本明細書に個々に記載された場合と同様に本明細書に組み込まれるものとする。本明細書に記載の方法はすべて、本明細書に別途明記される場合または文脈からそうでないことが明らかである場合を除き、任意の適切な順序で実施され得るものである。本明細書に記載されている、あらゆる具体例または例示的な言葉（例えば、「〜などの」）の使用は、単に本発明の理解を容易にすることを意図したものであって、別途請求されない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の言葉はいずれも、特許請求されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものではないと解釈されるべきである。

【0143】

本発明を実施するために、本発明者らが知る最良の形態を含めた本発明の好適な実施形態が本明細書に記載されている。これらの好適な実施形態の変更は、上述の記載を読めば当業者には明らかとなるであろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変更を用いることを予想するとともに、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、準拠法によって認められる、添付の特許請求の範囲に記載の内容の改変物および均等物をすべて包含する。さらに、本明細書に別途明記される場合または文脈からそうでないことが明らかである場合を除き、上記要素のその可能なあらゆる変更での任意の組合せが本発明に包含される。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]