特許 6457652 コラーゲン分解酵素の製造方法及びこれを利用したコラーゲントリペプチドの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6457652

(24)【登録日】2018年12月28日

(45)【発行日】2019年1月23日

(54)【発明の名称】コラーゲン分解酵素の製造方法及びこれを利用したコラーゲントリペプチドの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/56 20060101AFI20190110BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20190110BHJP

   C07K 1/18 20060101ALI20190110BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20190110BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/56

   C07K1/14

   C07K1/18

   C12P21/00 A

【請求項の数】6

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2017-545514(P2017-545514)

(86)(22)【出願日】2015年11月12日

(65)【公表番号】特表2017-537978(P2017-537978A)

(43)【公表日】2017年12月21日

(86)【国際出願番号】KR2015012181

(87)【国際公開番号】WO2016076647

(87)【国際公開日】20160519

【審査請求日】2017年9月6日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0158019

(32)【優先日】2014年11月13日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2015-0124453

(32)【優先日】2015年9月2日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12866BP

(73)【特許権者】

【識別番号】517167247

【氏名又は名称】アミコージェン・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002354

【氏名又は名称】特許業務法人平和国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シン、ヨンチュル

(72)【発明者】

【氏名】ピァオ、ゼゥ

(72)【発明者】

【氏名】チョイ、スリム

(72)【発明者】

【氏名】ワン、ユンソン

(72)【発明者】

【氏名】キム、イス

(72)【発明者】

【氏名】チュン、ジンヒ

(72)【発明者】

【氏名】ウォン、ジゥエウン

(72)【発明者】

【氏名】ヨン、ジホン

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０３２４３１４４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０３２３２９６３（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特開２００１−０３７４７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−０６１４７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 NAGANO H et al.，Purification of Collagenase and Specificity of Its Related Enzyme from Bacillus subtilis FS-2.，Biosci. Biotechnol. Biochem.，２０００年，vol.64, no.1，p.181-183

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／００

Ｃ０７Ｋ １／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

バチルスサブチリスＢＰ（受託番号ＫＣＴＣ １２８６６ＢＰ）を遠心分離する第１段階、
遠心分離された上澄み液を濃縮させる第２段階、及び
イオン交換クロマトグラフィー法を利用して精製する第３段階
を含むコラーゲン分解酵素の製造方法。

【請求項2】

前記イオン交換クロマトグラフィー法は、陽イオン交換クロマトグラフィーを利用して、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を０．１〜０．３Ｍの濃度で使用することを特徴とする請求項１に記載のコラーゲン分解酵素の製造方法。

【請求項3】

前記イオン交換クロマトグラフィー法は、陰イオン交換クロマトグラフィーを利用して、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を０．０９〜０．１５５Ｍの濃度で使用することを特徴とする請求項１又は２に記載のコラーゲン分解酵素の製造方法。

【請求項4】

前記イオン交換クロマトグラフィー法は、陽イオン交換クロマトグラフィーを利用して、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を０．１〜０．３Ｍの濃度で使用した後、
陰イオン交換クロマトグラフィーを利用して、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を０．０９〜０．１５５Ｍの濃度で使用することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン分解酵素の製造方法。

【請求項5】

バチルスサブチリスＢＰ（受託番号ＫＣＴＣ １２８６６ＢＰ）を遠心分離し、遠心分離された上澄み液を濃縮し、イオン交換クロマトグラフィー法を利用して精製してコラーゲン分解酵素を製造し、前記コラーゲン分解酵素を利用してコラーゲントリペプチドを製造することを特徴とするコラーゲントリペプチドの製造方法。

【請求項6】

前処理された魚鱗を水と２：８の重量比で混合する第１段階、
前記混合物を９０℃で５時間熱処理する第２段階、
バチルスサブチリスＢＰ（受託番号ＫＣＴＣ １２８６６ＢＰ）を遠心分離し、遠心分離された上澄み液を濃縮し、イオン交換クロマトグラフィー法を利用して精製してコラーゲン分解酵素を製造し、前記コラーゲン分解酵素を投入して３５℃で１２時間分解させる第３段階、
前記第３段階後の成分から遠心分離を介して異物を除去する第４段階、
前記第４段階後の成分をイオン交換クロマトグラフィーにより精製する第５段階、
前記精製された成分を濃縮させる第６段階、
前記濃縮された成分を、活性炭を利用して精製する第７段階、及び
前記第７段階後の成分を、フィルターを利用して除菌する第８段階
を含むコラーゲントリペプチドの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、コラーゲントリペプチドの製造方法に関するもので、より詳細には、コラーゲントリペプチドを特異的に多く作り出すコラーゲン分解酵素を利用して、高含量のコラーゲントリペプチドを得る、コラーゲントリペプチドを製造する方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）は、プロリン、オキシプロリン、グリシン、グルタミン酸など約１８種のアミノ酸で構成された動物の繊維性タンパク質であって、ヒトの場合、人体を構成している５，０００種類のタンパク質の中で最も多い３０％を占めている特殊な構造タンパク質である。特に、皮膚、骨、腱に多く存在していて、特に皮膚内の真皮層の７０％はコラーゲンで構成されており、コラーゲンが皮膚の構成成分として極めて重要な役割を果たしている。コラーゲンは、各種アミノ酸がポリペプチドの形態で結合して、３本にねじれている形状を示し、分子量は約３００，０００程度と極めて大きい。

【0003】

低分子コラーゲンは、コラーゲン分解酵素などにより分解されて分子量５，０００以下（通常３，０００〜５，０００)の低分子化されたもので、コラーゲンペプチドとも称され、この低分子コラーゲンが人体に入ると、人体内のタンパク質分解酵素によりさらに分解されて最終的にアミノ酸の形態で人体に吸収される。殆どのタンパク質の分子量が１２，０００〜７０，０００であるのに比べてコラーゲンの分子量は３００，０００で、極めて大きく吸収されにくいため、低分子コラーゲンは人体内での消化、吸収が容易なように抽出、分離、精製過程を経た後、分解過程を経て分子量が５，０００以下のペプチドの形態で作ったものである。

【0004】

コラーゲントリペプチドとは、アミノ酸が３個（グリシン−ｘ−ｙ）連結されている小さなコラーゲン（分子量が通常２００〜５００)を意味し、分子量が小さく皮膚を容易に透過するものと知られている。一方、アミノ酸が４個以上連結されていれば、分子構造が大きいので皮膚を透過できない。コラーゲントリペプチドは、皮膚透過後すぐに互いに再び連結されることにより、損傷したコラーゲン組織を修復する時間を短縮させるために貢献する。例えば、アモーレパシフィックでは、レーザー施術後の皮膚の再生を促進するために、コラーゲントリペプチドを含む組成物に対する特許を出願した（特許文献１)。また、摂取したときにも低分子コラーゲンより体内吸収率が高く、コラーゲンの生体効能を極大化させることができる長所がある。

【0005】

一般的に、コラーゲンは、主に牛、豚、魚、イカなどを原料にして酵素により加水分解されてコラーゲンペプチド組成物を得ることができる。しかしながら、一般的に使用されるタンパク質分解酵素では、トリペプチドの含量が極めて低く、高含量トリペプチド組成物を得るには困難があった。従って、高含量トリペプチドコラーゲン加水分解物を製造するための効率的な製造方法が引き続き要求されているのが実情である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】韓国公開特許１０−２０１３−０１２２５６９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、上述した問題点を解決するためのものであって、コラーゲントリペプチドの収率が高いコラーゲン分解酵素の製造方法を提供することである。

【0008】

さらに、本発明の他の目的は、収率が高いコラーゲン分解酵素を利用したコラーゲントリペプチドの製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上述した目的を達成するために、本発明のコラーゲン分解酵素の製造方法は、バチルスサブチリス菌株を遠心分離する第１段階と、遠心分離された上澄み液を濃縮させる第２段階と、イオン交換クロマトグラフィー法を利用して精製する第３段階を含むことを特徴とする。

【0010】

前記イオン交換クロマトグラフィー法は、陽イオン交換クロマトグラフィーを利用して塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を０．１〜０．３Ｍの濃度で使用することを特徴とする。

【0011】

前記イオン交換クロマトグラフィー法は、陰イオン交換クロマトグラフィーを利用して塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を０．０９〜０．１５５Ｍの濃度で使用することを特徴とする。

【0012】

さらに、本発明の他の実施形態のコラーゲントリペプチドの製造方法は、上述した方法で製造されるコラーゲン分解酵素を利用してコラーゲントリペプチドを製造することを特徴とする。

【0013】

さらに、本発明の他の実施形態のコラーゲントリペプチドの製造方法は、前処理された魚鱗を水と２：８の重量比で混合する第１段階と、前記混合物を９０℃で５時間熱処理する第２段階と、上述した方法により製造されるコラーゲン分解酵素を投入して３５℃で１２時間分解させる第３段階と、前記第３段階での成分から遠心分離を介して異物を除去する第４段階と、前記成分をイオン交換クロマトグラフィーにより精製する第５段階と、前記精製された成分を濃縮させる第６段階と、前記濃縮された成分を活性炭によって精製する第７段階と、前記成分をフィルターによって除菌する第８段階を含むことを特徴とする。

【発明の効果】

【0014】

本発明によるコラーゲン分解酵素の製造方法及びこれを利用したコラーゲントリペプチドの製造方法では下記のような効果がある。

【0015】

従来の製造工程を変えずに酵素を介したコラーゲン加水分解工程でトリペプチドの生産性が高い新規酵素を使用することにより、簡単にトリペプチドの含量が高いコラーゲン加水分解物を製造できる効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、本発明の好ましい実施形態により製造されるコラーゲン分解酵素の陽イオン交換を利用した分離精製である。Ａは精製されたコラーゲン分解酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果である（Ｍ：タンパク質サイズマーカー、ｃｏｎｃ：濃縮サンプル、ｗａｓｈ：洗浄、Ｅ１〜Ｅ５：溶出サンプル１〜５)。ＢはＡＫＴＡプライムでバッファーの濃度変化に伴うコラーゲン分解酵素のピークを示している（矢印は、それぞれの溶出サンプルに対する表示である）。

【図2】図２は、本発明の好ましい実施形態により製造されるコラーゲン分解酵素の陰イオン交換を利用した分離精製である。Ａは精製されたコラーゲン分解酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果である(Ｍ：タンパク質サイズマーカー、Ｐ１：ピーク１）。ＢはＡＫＴＡプライムでバッファーの濃度変化に伴うコラーゲン分解酵素のピークを示している（矢印はそれぞれの溶出サンプルに対する表示である）。

【図3】図３は、本発明の好ましい実施形態により製造されるコラーゲン分解酵素の温度別の酵素活性測定結果を示すグラフである。

【図4】図４は、本発明の好ましい実施形態により製造されるコラーゲン分解酵素の経時温度安定性の結果を示すグラフである。

【図5】図５は、本発明の好ましい実施形態により製造されるコラーゲン分解酵素のｐＨ別酵素活性の結果を示すグラフである。

【図6】図６は、本発明の好ましい実施形態により製造されるコラーゲン分解酵素と、一般のタンパク質分解酵素との、コラーゲントリペプチドの生産性を比較したＨＰＬＣデータである。

【図7】図７は、本発明の好ましい実施形態により製造されるコラーゲン分解酵素を利用して、コラーゲントリペプチドの含量が高いコラーゲン加水分解物を製造する製造工程である。

【図8】図８は、本発明の好ましい実施形態により製造されるコラーゲン分解酵素を利用して生産された製品のコラーゲントリペプチド（ＣＴＰ)の含量を分析したＨＰＬＣデータである。

【図9】図９は、本発明の好ましい実施形態により製造されるコラーゲン分解酵素を利用して生産された製品のグリシン−プロリン−ヒドロキシプロリン含量を分析したＨＰＬＣデータである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明によるコラーゲン分解酵素の製造方法及びこれを利用したコラーゲントリペプチドの製造方法の好ましい実施形態が添付された図面を参考に詳細に説明する。

【0018】

本発明のコラーゲン分解酵素の製造方法は、バチルスサブチリス菌株を遠心分離する第１段階と、遠心分離された上澄み液を濃縮させる第２段階と、イオン交換クロマトグラフィー法を利用して精製する第３段階を含めて構成することができる。

【0019】

さらに、本発明の他の実施形態のコラーゲン分解酵素を利用したコラーゲントリペプチドの製造方法は、前処理された魚鱗を水と２：８の重量比で混合する第１段階（Ｓ１０)と、前記混合物を９０℃で５時間熱処理する第２段階（Ｓ２０)と、特許請求の範囲の請求項１に記載の製造方法により製造されるコラーゲン分解酵素を投入して３５℃で１２時間分解させる第３段階（Ｓ３０)と、前記第３段階における成分から遠心分離を介して異物を除去する第４段階（Ｓ４０)と、前記成分をイオン交換クロマトグラフィーにより精製する第５段階（Ｓ５０)と、前記精製された成分を濃縮させる第６段階（Ｓ６０)と、前記濃縮された成分を活性炭によって精製する第７段階（Ｓ７０)と、前記成分をフィルターによって除菌する第８段階（Ｓ８０)を含めて構成することができる。

【0020】

まず、本発明のコラーゲン分解酵素を製造する過程の具体的な実施例を説明する。

【0021】

＜実施例１＞コラーゲン分解活性保有新菌株を選別
ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）菌株であるバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、人体に無害であることが知られており、多様なタンパク質分解酵素、脂質分解酵素および糖転換酵素を生産することができ、食品製造及び飼料添加用として多く使用されてきた。さらに一部のバチルスサブチスはコラーゲン分解活性を有していることが報告されている（Ｎａｇａｎｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０００、６４（１）：１８１−３； Ｔｒａｎ ＬＨ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ、２００２、６７（３）：１１８４−７）。本発明では、コラーゲン分解活性を有している新規なバチルスサブチリス由来のコラーゲン分解酵素を分離してコラーゲン分解工程に適用することを試みた。

【0022】

韓国の慶尚南道晋州地域の土壌サンプルを採取して土壌３０ｇを２７０ｍｌの滅菌されたＰＢＳバッファーに入れて浮遊化させた後、常温で３０分ほど放置して粗めの粒子や不純物などを底に沈殿させて除去した。上澄み液１０ｍｌを９０ｍｌの滅菌されたＰＢＳバッファーに十分混ぜて１００ｍｌとし、再度同じ作業を繰り返して３次、４次、５次希釈液１００ｍｌを調製した。

【0023】

調製した３次、４次、５次希釈液２００ｍｌを１％ スキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ)と１．５％寒天（ａｇａｒ）が含まれたＬＢ（１％ Ｂａｃｔｏ−トリプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）固体培地に塗抹して３０℃で２４時間培養した後、透明環（ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅ）が生じるコロニーを選別した。選別された菌株をＬＢ液体培地中、２５℃〜３０℃において１８０ｒｐｍで２４時間培養した後、上澄み液を採って力価を測定した。力価測定方法は次のとおりである。精製された豚皮をバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＣａＣｌ_２）に入れて５６℃で溶かして終濃度２％の基質溶液を作った。基質溶液１５０μｌを３０℃で１５分間の予熱をした後、酵素１００μｌを添加して３０℃で３０分間反応させた。０．０１Ｎ ＨＣｌを５００μｌ入れて酵素反応を中止させ、５０μｌの２％ ニンヒドリン溶液を入れて４分間煮沸した後、５７０ｎｍで吸光度値を測定した。酵素ユニット値の定義は、３０℃で３０分間、カルシウムイオンを含むｐＨ７．４の溶液中で基質と反応させたとき、遊離される１μｍｏｌ Ｌ−ロイシンの値を酵素の１ユニットと定義した。

【0024】

測定の結果、５個の菌株（＃８、＃９、＃１５、＃６０、＃８６）がコラーゲン分解活性を強く示した（表１）。最も高い５個の菌株に対してＡＰＩ５０ＣＨＢキット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）を使用して、菌株の生理学的特性を分析してバチルス菌株であるものを１種（＃８６）選別した。追加的に１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の分析を通じて菌株を同定した。１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列分析の結果、選別菌株はバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と９９％以上の相同性を示した。この菌株をバチルスサブチリスＢＰ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＰ）と命名し、生命工学研究院遺伝子バンクに２０１５年７月１３日付で寄託した（受託番号ＫＣＴＣ １２８６６ＢＰ）。

【0025】

【表1】

【0026】

＜実施例２＞新規コラーゲン分解酵素（ＢＰ）の分離
バチルス由来のコラーゲン分解酵素（ＢＰ）の分離精製を試みた。菌株を１０００ｍｌのｍＴＢ培地（酵母エキス２．４％、トリプトン１．２％、グリセロール１％、ＫＨ_２ＰＯ_４ ２．３１％、Ｋ_２ＨＰＯ_４ １２．５４％）に３０℃、１８０ｒｐｍ、２４時間培養した後、６５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ここで得た上澄み液を慎重に新たなチューブに移して、３０ｋＤａフィルターを利用して５倍濃縮した。濃縮した上澄み液は、ＡＫＴＡプライム装置を利用してイオン交換クロマトグラフィー法（ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製した。

【0027】

この時使用した精製の条件は、Ａバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５))を結合バッファーとして使用し、Ｂバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ）を利用して傾斜（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を与えた。流速は５ｍｌ／分で流した。精製は陽イオン交換クロマトグラフィー法と陰イオン交換クロマトグラフィー法を使用したが、イオン交換樹脂には陽イオン交換樹脂であるＳＰセファロース樹脂（ＧＥヘルスケア、ニュージャージー州、米国)と陰イオン交換樹脂であるＱセファロース樹脂（ＧＥヘルスケア、ニュージャージー州、米国)をそれぞれ使用した。

【0028】

最初の陽イオン交換クロマトグラフィーでは、０．５Ｍ ＮａＣｌで傾斜（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を与え、各分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）別に精製タンパク質を得た。図１Ｂに示した通り、精製プロファイルでタンパク質ピークが示される分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）（Ｅ１〜Ｅ５）のタンパク質精製度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認した結果、Ｅ１、Ｅ２において目的の酵素と予想されるタンパク質が含まれており、特にＥ１に最も多くのコラーゲン分解酵素が含まれていることを確認した（図１Ａの矢印表示）。

【0029】

Ｅ１〜Ｅ５のＮａＣｌ濃度はＥ１：０．１〜０．２Ｍ、Ｅ２：０．２〜０．３Ｍ、Ｅ３：０．３〜０．４Ｍ、Ｅ４：０．４〜０．５Ｍ、Ｅ５：０．５Ｍであるため、陽イオン交換クロマトグラフィーで目的酵素を分離することができるＮａＣｌ濃度は０．１〜０．３Ｍであることが分かり、最も好ましくはＥ１部分の０．１〜０．２ＭのＮａＣｌ濃度で目的酵素の回収率が最も良いことが分かった。次にはＥ１を陰イオン交換クロマトグラフィー法で精製した。

【0030】

この時バッファーは、０．２５ＭのＮａＣｌを使用し、陽イオン交換クロマトグラフィーと同様に傾斜を与えた。図２Ｂに示した通り、精製プロファイルで陰イオン交換樹脂は０．０９〜０．１５５ＭのＮａＣｌでタンパク質ピークが示されることを確認した（図２Ｂの矢印表示）。

【0031】

この分画の精製度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認した結果、目的の酵素が殆ど精製されたことを確認した（図２ＡのＰ１）。従って、陰イオン交換クロマトグラフィーでは、０．０９〜０．１５５ＭのＮａＣｌで目的酵素の回収率が最も良いことが分かった。以降、精製された新規コラーゲン分解酵素はＢＰと命名した。

【0032】

＜実施例３＞ＢＰの酵素反応条件の実験
最適温度の実験では、２０〜７０℃の温度で酵素反応を進行して、力価を測定した。図３に示した通り、実験の結果、３０〜５５℃で酵素活性を有していて、特に５０℃で最も高い比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）と相対活性（ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示し、６０℃からは活性が急激に落ちることが確認された。

【0033】

実際の大量生産に適用するための温度安定性の実験を実施した。温度は３０℃、３５℃、４０℃、さらに５０℃に合わせて、それぞれの温度別試料を０時間から１２時間まで時間別にサンプリングしてそれぞれの残存活性を確認した。

【0034】

その結果、図４に示した通り、温度が低いほど酵素の安定化が持続されることが示され、３５℃と４０℃では１２時間が経過すると酵素の活性が５９．３％程度残っていることが確認された。これらの結果から、現在コラーゲントリペプチドの生産工程を３５℃に設定することが望ましかった。

【0035】

次に、最適ｐＨについて調べた。豚皮ゼラチン基質をそれぞれのｐＨ別に作られたバッファー（５０ｍＭ クエン酸−Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ５．０〜６．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０〜９．０）、５０ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３−ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ９．０〜１０．０））に溶かした後、酵素の活性を測定して最適ｐＨを確認した。ＢＰはｐＨ７．４で最も高い活性を示し、ｐＨ６〜１０まで中性領域で高い活性を示した。しかしながら、図５に示した通り、酸性や塩基性になるにつれて酵素の活性は同様に落ちることが確認された。

【0036】

以下、上述したコラーゲン分解酵素（ＢＰ）を利用してコラーゲントリペプチドを製造する過程について説明する。

【0037】

＜実施例４＞ＢＰのコラーゲントリペプチドの生産性確認
前処理された魚鱗（魚の鱗）を撹拌機が装備されている反応器に魚鱗と水の重量比を２０：８０の割合で均一に混合して、約９０℃で５時間熱処理して４個の試料を準備した。４個の試料にＢＰ（製造社：アミコジェン）、Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ（製造社：ノボザイム、購入先：バイオシス）、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ １，０００Ｌ（製造社：ノボザイム、購入先：バイオシス）、Ｃｏｌｌｕｐｕｌｉｎ ＭＧ（製造社：ノボザイム、購入先：大鐘商事）の酵素を使用してコラーゲントリペプチドの生産性を比較した。

【0038】

各酵素の反応条件（温度、pH、酵素の使用量、反応時間）は下記の通りである。
− ＢＰ：３５℃、ｐＨ７．４、３０ユニット／ｇ（魚鱗）、１２時間
− Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ：６０℃、ｐＨ７．０、３０ユニット／ｇ（魚鱗）、１２時間
− Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ １，０００Ｌ：５５℃、ｐＨ６．０、３０ユニット／ｇ（魚鱗）、１２時間
− Ｃｏｌｌｕｐｕｌｉｎ ＭＧ：６０℃、ｐＨ７．０、３０ユニット／ｇ（魚鱗）、１２時間

【0039】

酵素処理後、８０℃で３０分間熱処理して酵素を失活した。次に４種の酵素を比較分析し、ＢＰのコラーゲントリペプチド生産性を確認した。

【0040】

製造されたコラーゲンペプチドの分析はＨＰＬＣ（ｇｉｌｓｏｎ社）を使用し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ペプチド １０／３００ＧＬカラム、移動相（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２）、流速：０．５ｍｌ／分の条件でコラーゲントリペプチド（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＴＰ）を分析した。ＣＴＰの標準物質には、３つのアミノ酸で構成されたグリシン−プロリン−ヒドロキシプロリン（ｇｌｙｃｉｎｅ−ｐｒｏｌｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ、ＧＰＨ）を使用した。

【0041】

図６に示した通り、分析の結果、ＣＴＰ標準物質の場合には、約５５分台でピークが形成されていることを確認できた。４種の酵素の分解活性を比較した結果、ＢＰの場合にはピークが殆ど遅れた時間に表れてコラーゲンが低分子化されたことがわかり、標準物質に同じ時間帯で大きなピークが表れ、ＣＴＰの含量が高いことが分かった。Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧは他のＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ １０００Ｌ、Ｃｏｌｌｕｐｕｌｉｎ ＭＧに比べて低分子の含量が高かったが、ＣＴＰの含量は、殆ど無いことが示された。この結果からＢＰがコラーゲントリペプチドの生産に極めて効果的であることが分かった。

【0042】

＜実施例５＞ＢＰを利用した高含量コラーゲントリペプチドの製造工程の確立
高含量コラーゲントリペプチドが含有された製品を生産するためにＢＰを利用した製造方法を確立した。前処理された魚鱗（魚の鱗）を攪拌機が装着されている反応器に、魚鱗と水の重量比を２０：８０の割合で均一に混合して、約９０℃で５時間熱処理を実施した。

【0043】

熱処理された前記液を３５℃で１０％ ＮａＯＨを投入して溶液内ｐＨ７．４になるように補正した。補正された前記液にＢＰを約３０ユニット／ｇ(魚鱗）投入後、３５℃で１２時間反応させた。酵素反応後、８０℃で３０分間熱処理して酵素を失活した。酵素処理されたコラーゲンペプチド液は、超高速連続遠心分離機を利用して異物を除去した後、イオン交換カラム精製を介して金属イオンなどの異物を除去した。

【0044】

前記の液は、真空減圧濃縮機を利用してＢｒｉｘ３５％まで濃縮した後、活性炭精製を通じて脱色、脱臭を行った。活性炭精製液をフィルタープレス濾過及び精密濾過（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ)で除菌後、噴霧乾燥機で粉末化して品質検査を実施し、包装段階を経て高含量トリペプチドを製造した（図７）。

【0045】

＜比較例＞：一般のタンパク質分解酵素を利用した高含量コラーゲントリペプチドの製造
新規ＢＰを利用した製造工程と比較のため、一般的に低分子コラーゲン分解工程に使用されるＡｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ（製造社：ノボザイム、購入先：バイオシス）を利用してコラーゲントリペプチド生産性を比較した。前処理された魚鱗を撹拌機が装着されている反応器に、魚鱗と水の重量比を２０：８０の割合で均一に混合して、約９０℃で５時間熱処理を実施した。

【0046】

熱処理された前記液を５５℃で１０％ ＮａＯＨを投入して溶液内ｐＨ７．５なるように補正した。補正された前記液にＡｌｃａｌａｓｅ酵素を約３０ユニット/ｇ(魚鱗)投入後、３５℃で１２時間処理した。酵素反応後、８０℃で３０分間熱処理して酵素を失活した。

【0047】

酵素処理されたコラーゲンペプチド液は、超高速連続遠心分離機を利用して異物を除去した後、イオン交換カラム精製を介して金属イオンなどの異物を除去した。前記の液は、真空減圧濃縮機を利用してＢｒｉｘ３５％まで濃縮した後、活性炭精製を介して脱色、脱臭を行った。活性炭精製液をフィルタープレス濾過及び精密濾過（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）で除菌後、噴霧乾燥機で粉末化して品質検査を実施した後、ＣＴＰ含量とＧＰＨ含量を比較した。

【0048】

ＣＴＰ含量は、前記実施例２と同様の方法で行い、ＧＰＨ含量分析は下記のような方法で行った。ＨＰＬＣ（ギルソン社）を使用し、Ｊｕｐｉｔｅｒ ４ｕ Ｐｒｏｔｅｏ ９０Ａカラム、移動相１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、流速：０．５ｍｌ／分の条件でＧＰＨの含量を分析した。試料はＢＰ及びＡｌｃａｌａｓｅを使用して製造されたコラーゲン加水分解物と日本ゼライス社から購入した他社製品を分析した。

【0049】

図８に示した通り、ＣＴＰ含量の場合、ＢＰを使用して製造されたコラーゲン加水分解物でＣＴＰ標準物質と同じ位置でピークが現れることを確認することができ、他社製品にも同じ位置にピークが発生したが、ＢＰ試料に比べてピークの大きさが小さく含量が少ないことが分かった。

【0050】

図９に示した通り、ＧＰＨ含量の場合にもＣＴＰの結果と同様に、ＡｌｃａｌａｓｅはＧＰＨのピークが現れず、他社製品に比べてＢＰ試料のピークが大きいため含量が極めて高いことが分かった。
ＢＰとＡｌｃａｌａｓｅを利用して生産された製品のコラーゲントリペプチド（ＣＴＰ）の含量を定量的に比較した結果、表２に示した通りＢＰは５６％、Ａｌｃａｌａｓｅは０％、他社製品は１８．１％の含量を保持しており、ＣＴＰの標準物質であるグリシン−プロリン−ヒドロキシプロリン（ｇｌｙｃｉｎｅ−ｐｒｏｌｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ、ＧＰＨ）の場合には、ＢＰは１３．１％、Ａｌｃａｌａｓｅは０％、他社製品は２．６％含有していた。この結果はＢＰを使用すると従来の販売中の製品に比べてコラーゲントリペプチドの含量が高いコラーゲン加水分解物を製造できることを示している。

【0051】

【表2】

【0052】

本発明の権利は上述した実施例に限定されず、特許請求の範囲に記載されたことにより定義され、本発明の分野で通常の知識を有する者が特許請求の範囲に記載された権利範囲内で様々な変形と改作を行えることは明らかである。

【産業上の利用可能性】

【0053】

コラーゲントリペプチドはアミノ酸が３個連結されている小さなコラーゲンであって、分子量が小さく皮膚を容易に透過して、皮膚透過後直ぐに再度連結されることにより損傷したコラーゲン組織を修復する時間を短縮させる。これは化粧品又は皮膚治療剤として多様に使用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】