特許第6459203号(P6459203)IP Force 特許公報掲載プロジェクト 2022.1.31 β版

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特許6459203ｙｊｊＫ遺伝子の発現が減弱された腸内細菌科の細菌を用いるＬ−アミノ酸の製造方法
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6459203
(24)【登録日】2019年1月11日
(45)【発行日】2019年1月30日
(54)【発明の名称】ｙｊｊＫ遺伝子の発現が減弱された腸内細菌科の細菌を用いるＬ−アミノ酸の製造方法
(51)【国際特許分類】
   C12N 15/09 20060101AFI20190121BHJP
   C12N 15/01 20060101ALI20190121BHJP
   C12P 13/24 20060101ALI20190121BHJP
   C12P 13/08 20060101ALI20190121BHJP
【ＦＩ】
   C12N15/09 ZZNA
   C12N15/01 Z
   C12P13/24 C
   C12P13/08 D
【請求項の数】6
【外国語出願】
【全頁数】35
(21)【出願番号】特願2014-89074(P2014-89074)
(22)【出願日】2014年4月23日
(65)【公開番号】特開2014-212790(P2014-212790A)
(43)【公開日】2014年11月17日
【審査請求日】2017年4月4日
(31)【優先権主張番号】2013118637
(32)【優先日】2013年4月23日
(33)【優先権主張国】RU
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000000066
【氏名又は名称】味の素株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100100549
【弁理士】
【氏名又は名称】川口 嘉之
(74)【代理人】
【識別番号】100126505
【弁理士】
【氏名又は名称】佐貫 伸一
(74)【代理人】
【識別番号】100131392
【弁理士】
【氏名又は名称】丹羽 武司
(74)【代理人】
【識別番号】100169041
【弁理士】
【氏名又は名称】堺 繁嗣
(72)【発明者】
【氏名】ストイノヴァ ナタリア ヴィクトロヴナ
(72)【発明者】
【氏名】サムソノフ ヴァレリ ヴァシリエヴィッチ
(72)【発明者】
【氏名】エリョーミナ ナタリア セルゲエヴナ
(72)【発明者】
【氏名】ポリアコヴァ エヴゲニヤ アレクサンドロヴナ
【審査官】 上條 肇
(56)【参考文献】
【文献】 国際公開第２０１１／１５２５６８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１４３９８３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】 特表２０１０−５２３１４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】 特開２０１０−２６３７８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】 特開２０１０−２０７１９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１４２４０４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】 Research in Microbiology，２００８年，Vol.159，pp.671-677
【文献】 Nat. Struct. Mol. Biol.，２０１４年 ２月，Vol.21, No.2，pp.143-151
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｐ １／００ − ４１／００
Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０
Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、
（ｉ）腸内細菌科の細菌を培養培地中で培養して、前記細菌中及び／又は前記培養培地中に前記Ｌ−アミノ酸を生産させる工程；及び、
（ｉｉ）前記細菌及び／又は前記培養培地から前記Ｌ−アミノ酸を回収する工程
を含み、
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−バリンまたはＬ−ヒスチジンであり、
前記細菌が、ｙｊｊＫ遺伝子を欠失するように改変されており、
前記ｙｊｊＫ遺伝子が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子である、方法：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ＡＢＣトランスポーターのＡＴＰ結合コンポーネントとしての機能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、且つ、ＡＢＣトランスポーターのＡＴＰ結合コンポーネントとしての機能を有するタンパク質。
【請求項2】
前記細菌がエシェリヒア属に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記細菌がエシェリヒア・コリ種に属する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記細菌がパントエア属に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記細菌がパントエア・アナナティス種に属する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ｙｊｊＫ遺伝子が、配列番号１の塩基配列を含む遺伝子、又は配列番号１に対して９０％以上の同一性を有する遺伝子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物産業に関し、具体的には、ｙｊｊＫ遺伝子の発現が減弱（ａｔｔｅｎｕａｔｅ）するように改変された腸内細菌科の細菌の発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
通常、Ｌ−アミノ酸は、天然の出所から得られた微生物株又はその変異体を用いた発酵法により工業的に製造される。典型的には、微生物はＬ−アミノ酸の生産収率が高まるように改変される。
【0003】
Ｌ−アミノ酸生産収率を高めるための多くの技術が報告されており、そのような技術としては、例えば、組換えＤＮＡによる微生物の形質転換（例えば特許文献１参照）並びにプロモーター、リーダー配列、及び／又はアテニュエーター等の調節領域の変化等の当業者に公知の技術が挙げられる（例えば、特許文献２及び特許文献３参照）。生産収率を高めるためのその他の技術としては、アミノ酸生合成に関わる酵素の活性を増強すること及び／又は生じるＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害への標的酵素の脱感作が含まれる（例えば、特許文献４〜８参照）。
【0004】
Ｌ−アミノ酸生産収率を高めるためのもう１つの方法は、標的Ｌ−アミノ酸の分解に関わる１又は複数の遺伝子、標的Ｌ−アミノ酸の前駆体の進路をＬ−アミノ酸生合成経路から外れさせる遺伝子、炭素、窒素、及びリン酸の流れの再分布に関わる遺伝子、並びに毒素をコードする遺伝子等の発現を減弱させることである。
【0005】
ｙｊｊＫ遺伝子産物が２次元ゲル電気泳動を用いて同定された（非特許文献１）。ＹｊｊＫタンパク質は後に、知られている最も大きなタンパク質ファミリーの１つの一員である推定ＡＢＣトランスポーター（ＡＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ）として特徴解析された。ＡＢＣトランスポーターは、膜二重層に埋まった２つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）及び細胞質中に位置する２つのヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）からなる共通する特徴的な構造を有する（非特許文献２）。原核生物のＡＢＣトランスポーターは、結合タンパク質を動員して基質を転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）させることができる。ヌクレオチド結合ドメインへのＡＴＰの結合及び加水分解により、基質を転位させるコンホメーション変化が促進される。ＡＢＣトランスポーターは取込み輸送体又は排出輸送体として機能し、イオン、毒素、抗生物質、脂質、多糖、栄養素、例えばアミノ酸、ペプチド、糖等の幅広い基質を輸送することができる。ＹｊｊＫタンパク質の機能についてはほとんど分かっていない（非特許文献３）。配列類似性によるアプローチから、このタンパク質がＡＢＣスーパーファミリーの一員（ＮＢＤ−ＮＢＤドメイン組成を有するトランスポーターのサブファミリー３）のＡＴＰ結合性コンポーネントであるということが予測されているだけである。
【0006】
腸内細菌科の改変細菌株によるＬ−アミノ酸生産に対するｙｊｊＫ遺伝子の減弱の影響を示すデータはこれまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】米国特許第４，２７８，７６５（Ａ）号明細書
【特許文献2】米国特許出願公開第２００６０２１６７９６（Ａ１）号明細書
【特許文献3】国際公開第９６１５２４６（Ａ１）号パンフレット
【特許文献4】国際公開第９５１６０４２（Ａ１）号パンフレット
【特許文献5】欧州特許出願公開第０６８５５５５（Ａ１）号明細書
【特許文献6】米国特許第４，３４６，１７０（Ａ）号明細書
【特許文献7】米国特許第５，６６１，０１２（Ａ）号明細書
【特許文献8】米国特許第６，０４０，１６０（Ａ）号明細書
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Link A.J. et al., Comparing the predicted and observed properties of proteins encoded in the genome of Escherichia coli K-12, Electrophoresis, 1997, 18(8):1259-1313
【非特許文献2】Rees D.C. et al., ABC transporters: the power to change, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2009, 10(3): 218-227
【非特許文献3】Linton K.J. and Higgins C.F., The Escherichia coli ATP-binding cassette (ABC) proteins, Mol. Microbiol., 1998, 28(1):5-13
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の一態様は、ｙｊｊＫ遺伝子の発現が減弱するように改変されたエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、より具体的にはエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）種に属し得る、腸内細菌科に属する細菌を提供することである。
【0010】
本発明のもう１つの態様は、後述するように腸内細菌科の細菌を用いてＬ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリン等のＬ−アミノ酸を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
これらの目的は、エシェリヒア属に属し得る、より具体的にはエシェリヒア・コリ種に属し得る、腸内細菌科に属する細菌の染色体上にあるｙｊｊＫ遺伝子の発現の減弱、特にｙｊｊＫ遺伝子の不活化が、微生物により高いＬ−アミノ酸（限定されるものではないが、特にＬ−バリン及びＬ−ヒスチジン）生産能を付与するという予期されなかった発見によって達成された。
【0012】
本発明の一態様は、Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、
（ｉ）腸内細菌科の細菌を培養培地中で培養して、細菌中及び／又は培養培地中に前記Ｌ−アミノ酸を生産させる工程；及び、
（ｉｉ）細菌及び／又は培養培地から前記Ｌ−アミノ酸を回収する工程、
を含み、細菌が、ｙｊｊＫ遺伝子の発現が減弱するように改変されている、方法を提供することである。
【0013】
本発明の更なる態様は、細菌がエシェリヒア属に属する、上記方法を提供することである。
【0014】
本発明の更なる態様は、細菌がＥ．ｃｏｌｉ種に属する、上記方法を提供することである。
【0015】
本発明の更なる態様は、細菌がパントエア属に属する、上記方法を提供することである
。
【0016】
本発明の更なる態様は、細菌がパントエア・アナナティス種に属する、上記方法を提供することである。
【0017】
本発明の更なる態様は、ｙｊｊＫ遺伝子の不活化により発現が減弱されている、上記方法を提供することである。
【0018】
本発明の更なる態様は、遺伝子が欠失されている、上記方法を提供することである。
【0019】
本発明の更なる態様は、ｙｊｊＫ遺伝子が、配列番号１の塩基配列又は配列番号１のバリアント塩基配列によってコードされている、上記方法を提供することである。
【0020】
本発明の更なる態様は、Ｌ−アミノ酸が、芳香族Ｌ−アミノ酸及び非芳香族Ｌ−アミノ酸からなる群から選択される、上記方法を提供することである。
【0021】
本発明の更なる態様は、芳香族Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンからなる群から選択される、上記方法を提供することである。
【0022】
本発明の更なる態様は、非芳香族Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、及びＬ−バリンからなる群から選択される、上記方法を提供することである。
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下に本発明を詳細に説明する。
【0024】
１．細菌
「Ｌ−アミノ酸生産菌」という語句は、細菌を培地中で培養した時に、Ｌ−アミノ酸を生産、排出若しくは分泌し、且つ／又は培養培地中又は細菌細胞中に蓄積させる能力を有する腸内細菌科の細菌を意味し得る。
【0025】
「Ｌ−アミノ酸生産菌」という語句はまた、野生型又は親株（例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２）より多くの量のＬ−アミノ酸を生産、排出若しくは分泌し、且つ／又は培地中に蓄積させることができる細菌を意味し得、更に、微生物が０．５ｇ／Ｌ以上又は１．０ｇ／Ｌ以上の量の標的Ｌ−アミノ酸を培地中に蓄積させることができることを意味し得る。細菌は、アミノ酸を単独で又は２種以上のアミノ酸の混合物として生産し得る。
【0026】
「Ｌ−アミノ酸生産能」という語句は、細菌を培地中で培養した時に、培地又は細菌細胞からＬ−アミノ酸を回収できるレベルでＬ−アミノ酸を生産、排出若しくは分泌し、且つ／又は培地又は細菌細胞中に蓄積させる細菌の能力を意味し得る。
【0027】
「Ｌ−アミノ酸」という語句は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンを意味し得る。
【0028】
「芳香族Ｌ−アミノ酸」という語句は、例えば、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプト
ファン、及びＬ−チロシンを含む。
【0029】
「非芳香族Ｌ−アミノ酸」という語句は、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、及びＬ−バリンを含む。
【0030】
Ｌ−アミノ酸は、１又は複数のＬ−アミノ酸ファミリーに属し得る。例えば、Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、及びＬ−プロリンを含むグルタミン酸ファミリー；Ｌ−システイン、グリシン、及びＬ−セリンを含むセリンファミリー；Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−スレオニンを含むアスパラギン酸ファミリー；Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、及びＬ−ロイシンを含むピルビン酸ファミリー；並びにＬ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンを含む芳香族ファミリーに属し得る。
【0031】
Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンが具体例である。Ｌ−ヒスチジン及びＬ−バリンが好ましい例である。
【0032】
腸内細菌科に属する細菌は、エンテロバクター（Enterobacter）、エルウィニア（Erwinia）、エシェリヒア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）、モルガネラ（Morganella）、パントエア（Pantoea）、フォトラブダス（Photorhabdus）、プロビデンシア（Providencia）、サルモネラ（Salmonella）、エルシニア（Yersinia）等の属に由来し得、Ｌ−アミノ酸生産能を有し得る。具体的には、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）データベース（www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されるものが用いられ得る。改変することができる腸内細菌科に由来する株の例としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、又はパントエア属の細菌が含まれる。
【0033】
本開示の主題に係るエシェリヒア細菌を得るために改変できるエシェリヒア細菌の株は特に限定されず、特にナイトハルトらの著書（Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-12, p. 2460-2488. In F.C. Neidhardt et al. (ed.), E. coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed. ASM Press, Washington, D.C., 1996）に記載されているものが用いられ得る。Ｅ．ｃｏｌｉ種が好適な例である。Ｅ．ｃｏｌｉの具体例としては、プロトタイプの野生型株であるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株に由来する、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ ４７０７６）等が含まれる。これらの株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １５４９， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１０８， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）から入手可能である。すなわち、各株に登録番号が付与されており、これらの登録番号を用いて株を注文することができる（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ参照）。株の登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【0034】
エンテロバクター属細菌の例としては、エンテロバクター・アグロメランス、エンテロバクター・アエロゲネス等が含まれる。パントエア属細菌の例としてはパントエア・アナナティス等が含まれる。エンテロバクター・アグロメランスの一部の株が、近年、１６Ｓ
ｒＲＮＡの塩基配列分析等に基づいて、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、又はパントエア・ステワルティイに再分類された。エンテロバクター属又はパントエア属のいずれかに属する細菌が、腸内細菌科に分類される細菌である限り、用いられ得る。パントエア・アナナティス株を遺伝子工学技術により掛け合わせる場合、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７）、及びこれらの誘導体を用いることができる。これらの株は単離された時にエンテロバクター・アグロメランスとして同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記の通り、最近になって、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列決定等に基づきパントエア・アナナティスに再分類された。
【0035】
Ｌ−アミノ酸生産菌
芳香族又は非芳香族Ｌ−アミノ酸を生産できる、腸内細菌科に属し且つｙｊｊＫ遺伝子の発現が減弱するように改変された本発明の細菌を用いることができる。
【0036】
細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を元々有していてもよく、変異法又はＤＮＡ組換え技術を用いてＬ−アミノ酸生産能を有するように改変されてもよい。細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を元々有している細菌中のｙｊｊＫ遺伝子の発現を減弱させることによって得ることができる。あるいは、細菌は、ｙｊｊＫ遺伝子の発現が既に減弱されている細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与することによって得ることができる。
【0037】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、エシェリヒア属に属する株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株２３７（ＶＫＰＭ Ｂ−７９２５）（米国特許出願公開第２００２／０５８３１５（Ａ１）号）及び変異体Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素（ロシア特許第２２１５７８３号）を有するその誘導株、Ｅ．ｃｏｌｉ株３８２（ＶＫＰＭ Ｂ−７９２６）（欧州特許出願公開第１１７０３５８（Ａ１）号）、Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするａｒｇＡ遺伝子が導入されたアルギニン生産株（欧州特許出願公開第１１７０３６１（Ａ１）号）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0038】
Ｌ−アルギニン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては更に、Ｌ−アルギニン生合成酵素をコードする１又は複数の遺伝子の発現が増強された株が含まれる。そのような遺伝子の例としては、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリン酸レダクターゼ遺伝子（ａｒｇＣ）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ａｒｇＪ）、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ遺伝子（ａｒｇＢ）、Ｎ−アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ遺伝子（ａｒｇＤ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子（ａｒｇＦ）、アルギニノコハク酸合成酵素遺伝子（ａｒｇＧ）、アルギニノコハク酸リアーゼ遺伝子（ａｒｇＨ）、及びカルバモイルリン酸合成酵素遺伝子（ｃａｒＡＢ）が含まれる。
【0039】
Ｌ−シトルリン生産菌
Ｌ−シトルリン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、エシェリヒア属に属する株、例えばＥ．ｃｏｌｉ変異体Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素株２３７／ｐＭＡＤＳ１１、２３７／ｐＭＡＤＳ１２、及び２３７／ｐＭＡＤＳ１３（ロシア特許第２２１５７８３（Ｃ２）号、欧州特許第１１７０３６１（Ｂ１）号、米国特許６７９０６４７（Ｂ２）号）、どちらも変異体フィードバック耐性カルバモイルリン酸合成酵素を有するＥ．ｃｏｌｉ株３３３（ＶＫＰＭ Ｂ−８０８４）及び３７４（ＶＫＰＭ Ｂ−８０８６）（ロシア特許第２２６４４５９（Ｃ２）号）、α−ケトグルタル酸合成酵素活性が増強され、フェレドキシンＮＡＤＰ+レダクターゼ、ピルビン酸合成酵素、又はα
−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が更に改変されたＥ．ｃｏｌｉ株（ＥＰ２１３３４１７（Ａ１）号）、並びにコハク酸デヒドロゲナーゼ及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が低減されたＰ．アナナティス株ＮＡ１ｓｕｃＡｓｄｈＡ（米国特許出願公開第２００９２８６２９０号）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0040】
Ｌ−シトルリンはＬ−アルギニン生合成経路の中間体であるので、Ｌ−シトルリン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成酵素をコードする１又は複数の遺伝子の発現が増強された株が含まれる。そのような遺伝子の例としては、Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素遺伝子（ａｒｇＡ）、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ遺伝子（ａｒｇＢ）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ遺伝子（ａｒｇＣ）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子（ａｒｇＤ）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ遺伝子（ａｒｇＥ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子（ａｒｇＦ／Ｉ）、及びカルバモイルリン酸合成酵素遺伝子（ｃａｒＡＢ）、又はこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0041】
Ｌ−シトルリン生産菌は更に、ａｒｇＧ遺伝子にコードされるアルギニノコハク酸合成酵素の不活化により、任意のＬ−アルギニン生産菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ ３８２株（ＶＫＰＭ Ｂ−７９２６）から容易に得ることができる。
【0042】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、エシェリヒア属に属する株、例えば、フィードバック耐性セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする種々のｃｙｓＥアレルで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１５（米国特許第６，２１８，１６８号、ロシア特許第２２７９４７７号）、細胞毒性物質を分泌するのに好適なタンパク質をコードする過剰発現される遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（米国特許第５，９７２，６６３号）、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したＥ．ｃｏｌｉ株（特開平１１−１５５５７１号）、ｃｙｓＢ遺伝子にコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇しているＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（国際公開第０１２７３０７（Ａ１）号）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１５（ｙｄｅＤ）（米国特許第６，２１８，１６８号）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0043】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、エシェリヒア属に属する株、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+（欧州特許第１１７２４３３号）が含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＬ３３４（ＶＫＰＭ Ｂ−１６４１）はｔｈｒＣ及びｉｌｖＡ遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン栄養要求株である（米国特許第４，２７８，７６５号）。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ１２（ＶＫＰＭ Ｂ−７）細胞上で増殖させたバクテリオファージＰ１を用いた一般的な形質導入法により、ｔｈｒＣ遺伝子の野生型アレルを導入した。その結果、Ｌ−グルタミン酸を生産できるＬ−イソロイシン栄養要求株ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+（ＶＫＰＭ Ｂ−８９６１）が得られた。
【0044】
Ｌ−グルタミン酸生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成酵素をコードする１又は複数の遺伝子の発現が増強された株が含まれるが、これに限定されるものではない。そのような遺伝子の例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｄｈＡ）、グルタミン合成酵素遺伝子（ｇｌｎＡ）、グルタミン酸合成酵素遺伝子（ｇｌｔＡＢ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｉｃｄＡ）、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（ａｃｎＡ、ａｃｎＢ）、クエン酸合成酵素遺伝子（ｇｌｔＡ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｃ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｃｅＥＦ、
ｌｐｄＡ）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ）、ホスホエノールピルビン酸合成酵素遺伝子（ｐｐｓＡ）、エノラーゼ遺伝子（ｅｎｏ）、ホスホグリセロムターゼ遺伝子（ｐｇｍＡ、ｐｇｍＩ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ｐｇｋ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇａｐＡ）、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ｔｐｉＡ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（ｆｂｐ）、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子（ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ）、及びグルコースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ｐｇｉ）が含まれる。
【0045】
クエン酸合成酵素遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が上昇するように改変された株の例としては、欧州特許出願公開第１０７８９８９（Ａ２）号、同第９５５３６８（Ａ２）号、及び同第９５２２２１（Ａ２）号に開示されているものが含まれる。
【0046】
Ｌ−グルタミン酸生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては更に、Ｌ−グルタミン酸生合成経路から逸らして（ｂｒａｎｃｈ ｏｆｆ）Ｌ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性を低減又は消失させた株が含まれる。そのような酵素の例としては、イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡ）、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ｓｕｃＡ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋ）、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ｉｌｖＧ）、アセト乳酸合成酵素（ｉｌｖＩ）、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｆｌ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）、及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｇａｄＡＢ）が含まれる。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損した又はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低減したエシェリヒア属に属する細菌及びそれらを得る方法が米国特許第５，３７８，６１６号及び同第５，５７３，９４５号に記載されている。具体的には、それらの株には以下が含まれる。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｓｕｃＡ：：ＫｍR
Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８５３）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８５４）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＪ１２９４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８１）
【0047】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｓｕｃＡ：：ＫｍRは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（以降、「ｓｕｃＡ遺伝子」と呼ぶ）を破壊することにより得られた株である。この株はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼが完全に欠損している。
【0048】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し且つアスパラギン酸代謝拮抗物質に対する耐性を有するものが含まれる。これらの株は更にα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損していてもよく、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＪ１３１９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８０７）（米国特許第５，９０８，７６８号）、更にＬ−グルタミン酸分解能が低くなっているＦＦＲＭ Ｐ−１２３７９（米国特許第５，３９３，６７１号）、ＡＪ１３１３８（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５６５）（米国特許第６，１１０，７１４号）等が含まれる。
【0049】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の例としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損しているかα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低減しており、前述したように得ることができる、パントエア属に属する変異株が含まれる。そのような株としては、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６．（米国特許第６，３３１，４１９号）が含まれる。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４５で１９９８年２月１９日に通商産業省 工業技術院 生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）、〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号120号室）に寄託された
。これはその後、１９９９年１月１１日にブダペスト条約の条項に基づく国際寄託へと移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５の受託番号を付与された。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６は、αＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（ｓｕｃＡ）の破壊により、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損している。上記株は、単離された時にエンテロバクター・アグロメランスとして同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５６として寄託された。しかし、これは最近になって、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列決定等に基づき、パントエア・アナナティスとして再分類された。ＡＪ１３３５６はエンテロバクター・アグロメランスとして前述の寄託機関に寄託されたが、本明細書の目的のため、これらをパントエア・アナナティスとして記載する。
【0050】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、エシェリヒア属に属する株、例えばＥ．ｃｏｌｉ株２４（ＶＫＰＭ Ｂ−５９４５、ロシア特許第２００３６７７（Ｃ１）号）、Ｅ．ｃｏｌｉ株８０（ＶＫＰＭ Ｂ−７２７０、ロシア特許第２１１９５３６（Ｃ１）号）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＲＲＬ Ｂ−１２１１６−Ｂ１２１２１（米国特許第４，３８８，４０５号）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ−９３４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７５）及びＨ−９３４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７６）（米国特許第６，３４４，３４７）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ−９３４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７４）（欧州特許第１０８５０８７号）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＩ８０／ｐＦＭ２０１（米国特許第６，２５８，５５４号）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0051】
Ｌ−ヒスチジン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては更に、Ｌ−ヒスチジン生合成酵素をコードする１又は複数の遺伝子の発現が増強された株が含まれる。そのような遺伝子の例としては、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｉｓＧ）、ホスホリボシル−ＡＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子（ｈｉｓＩ）、ホスホリボシル−ＡＭＰシクロヒドロラーゼ／ホスホリボシル−ＡＴＰピロホスファターゼ遺伝子（ｈｉｓＩＥ）、ホスホリボシルホルムイミノ−５−アミノイミダゾールカルボキサミドリボチドイソメラーゼ遺伝子（ｈｉｓＡ）、アミドトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｉｓＨ）、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｉｓＣ）、ヒスチジノールホスファターゼ遺伝子（ｈｉｓＢ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｉｓＤ）等が含まれる。
【0052】
ｈｉｓＧ及びｈｉｓＢＨＡＦＩにコードされるＬ−ヒスチジン生合成酵素はＬ−ヒスチジンによって阻害されることが知られているので、フィードバック阻害に対する耐性を付与する変異をＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ中に導入することによってもＬ−ヒスチジン生産能を効率的に増強することができる（ロシア特許第２００３６７７号及び同第２１１９５３６号）。
【0053】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成酵素をコードするＤＮＡを有するベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＦＥＲＭ−Ｐ ５０３８及び５０４８（特開昭５６−００５０９９号）、アミノ酸搬出のための遺伝子であるｒｈｔで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株（欧州特許出願公開第１０１６７１０（Ａ）号）、スルファグアニジン、ＤＬ−１，２，４−トリアゾール−３−アラニン、及びストレプトマイシン耐性を付与されたＥ．ｃｏｌｉ ８０株（ＶＫＰＭ Ｂ−７２７０、ロシア特許第２１１９５３６号）、及びＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５＋ｈｉｓＧｒ ｈｉｓＬ’＿Δ ΔｐｕｒＲ（ロシア特許第２１１９５３６（Ｃ１）号及びDoroshenko V.G. et al., The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants, Prikl. Biochim. Mikrobiol. (Russian), 2013, 49(2):149-154）等が含まれる。
【0054】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに対する耐性を有する変異体（特開平５−３０４９６９号）、イソロイシンアナログ、例えばチアイソロイシン及びヒドロキサム酸イソロイシンに対する耐性を有する変異体、並びにＤＬ−エチオニン及び／又はヒドロキサム酸アルギニンに対する耐性を更に有する変異体（特開平５−１３０８８２号）が含まれるが、これらに限定されるものではない。更に、スレオニンデアミナーゼ及びアセトヒドロキシ酸合成酵素等のＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株も親株として用いることができる（特開平２−４５８号、欧州特許出願公開第０３５６７３９（Ａ１）号、及び米国特許第５，９９８，１７８号）。
【0055】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、エシェリヒア属に属する株、例えばロイシンに耐性のＥ．ｃｏｌｉ株（例えば株５７（ＶＫＰＭ Ｂ−７３８６、米国特許第６，１２４，１２１号））又はロイシンアナログ、例えばβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシンに耐性のＥ．ｃｏｌｉ（特開昭６２−３４３９７号及び特開平８−７０８７９号）；国際公開第９６／０６９２６号に記載の遺伝子工学的方法によって得られたＥ．ｃｏｌｉ株；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ−９０６８（特開平８−７０８７９号）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0056】
細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する１又は複数の遺伝子の発現を増強することにより改良することができる。例としては、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害を受けないイソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードする変異体ｌｅｕＡ遺伝子により代表されるｌｅｕＡＢＣＤオペロンの遺伝子が含まれる（米国特許第６，４０３，３４２号）。更に、細菌は、細菌細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする１又は複数の遺伝子の発現を増強することにより改良することができる。そのような遺伝子の例としては、ｂ２６８２及びｂ２６８３遺伝子（ｙｇａＺＨ遺伝子）（欧州特許出願公開第１２３９０４１（Ａ２）号）が含まれる。
【0057】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア科に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに対する耐性を有する変異体が含まれる。Ｌ−リジンアナログは、エシェリヒア属に属する細菌の成長を阻害するが、培地中にＬ−リジンが存在すると、この阻害は完全又は部分的に脱感作される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、ヒドロキサム酸リジン、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等が含まれるが、これらに限定されるものではない。エシェリヒア属に属する細菌を従来の人工的な突然変異誘発処理に晒すことで、これらのリジンアナログに対する耐性を有する変異体を得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＪ１１４４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５４３、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１８５；米国特許第４，３４６，１７０号参照）及びＥ．ｃｏｌｉ ＶＬ６１１が含まれる。これらの微生物では、Ｌ−リジンによるアスパルトキナーゼのフィードバック阻害が脱感作されている。
【0058】
Ｌ−リジン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては更に、Ｌ−リジン生合成酵素をコードする１又は複数の遺伝子の発現が増強されている株が含まれる。そのような遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（ｄａｐＡ）、アスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（ｄａｐＢ）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｌｙｓＡ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｄｈ）（米国特許第６，０４０，１６０号）、ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｓｄ）、及びアスパルターゼ遺伝子（ａｓｐＡ）（欧州特許出願公開第１２５３１９５（Ａ１）号）が含まれるが、これらに限定されるものではない。更に、親株は、エネルギー効率に関わる遺伝子（ｃｙｏ）（欧州特許出願公開第１１７０３７６（Ａ１）号）、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｐｎｔＡＢ）（米国特許第５，８３０，７１６号）、ｙｂｊＥ遺伝子（国際公開第２００５／０７３３９０号）、又はこれらの組合せの上昇した発現レベルを有し得る。
【0059】
Ｌ−アミノ酸生産菌は、Ｌ−アミノ酸生合成経路から逸らして別の化合物を生成させる反応を触媒する酵素の活性が低減しているかそのような活性がないものであり得る。更に、細菌は、Ｌ−アミノ酸の合成又は蓄積に負に働く酵素の活性が低減している又はそのような活性がないものであり得る。Ｌ−リジン生産に関与するそのような酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（ｃａｄＡ、ｌｄｃＣ）、リンゴ酸酵素等が含まれ、これらの酵素の活性が低減又は消失されている株が国際公開第９５／２３８６４号、同第９６／１７９３０号、同第２００５／０１０１７５号等に開示されている。
【0060】
リジンデカルボキシラーゼ活性を低減又は消失させるために、リジンデカルボキシラーゼをコードするｃａｄＡ及びｌｄｃＣ遺伝子の両方の発現を低減させることができる。両遺伝子の発現は、例えば国際公開第２００６／０７８０３９号に記載の方法により低減させることができる。
【0061】
Ｌ−リジン生産菌の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃＣ／ｐＣＡＢＤ２株（国際公開第２００６／０７８０３９号）が含まれ得る。この株は、リジン生合成遺伝子を含むプラスミドｐＣＡＢＤ２（米国特許第６，０４０，１６０号）を、リジンデカルボキシラーゼをコードするｃａｄＡ及びｌｄｃＣ遺伝子が破壊されたＷＣ１９６株に導入することにより構築された。
【0062】
ＷＣ１９６株は、Ｗ３１１０株の染色体上の野生型ｌｙｓＣ遺伝子を、３５２位のスレオニンがイソロイシンで置換された変異体アスパルトキナーゼＩＩＩをコードする変異体ｌｙｓＣ遺伝子で置換することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２に由来するＷ３１１０株から作り出され、この置換は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害の脱感作をもたらし（米国特許第５，６６１，０１２号）、得られた株にＡＥＣ耐性を付与した（米国特許第５，８２７，６９８号）。ＷＣ１９６株はＥ．ｃｏｌｉ ＡＪ１３０６９と命名され、工業技術院 生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）、〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号120号室）に１９９４年１２月６日に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４６９０が付与されている。その後、これは１９９５年９月２９日にブダペスト条約の条項に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２５２が付与されている（米国特許第５，８２７，６９８号）。ＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃＣ株自体もＬ−リジン生産菌の例である。
【0063】
ＷＣ１９６ΔｃａｄＡΔｌｄｃＣはＡＪ１１０６９２と命名され、工業技術院 生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号120号室）に２００８年１０月７日に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０２７で国際寄託として寄託された。
【0064】
Ｌ−メチオニン生産菌
Ｌ−メチオニン生産菌及びＬ−メチオニン生産菌を誘導するために用いることができる
親株の例としては、エシェリヒア細菌株、例えば株ＡＪ１１５３９（ＮＲＲＬ Ｂ−１２３９９）、ＡＪ１１５４０（ＮＲＲＬ Ｂ−１２４００）、ＡＪ１１５４１（ＮＲＲＬ Ｂ−１２４０１）、ＡＪ１１５４２（ＮＲＲＬ Ｂ−１２４０２）（英国特許第２０７５０５５号）；ノルロイシン、Ｌ−メチオニンアナログ等に耐性の株２１８（ＶＫＰＭ Ｂ−８１２５）（ロシア特許第２２０９２４８（Ｃ２）号）及び７３（ＶＫＰＭ Ｂ−８１２６）（ロシア特許第２２１５７８２（Ｃ２）号）が含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｅ．ｃｏｌｉ株７３は、２００１年５月１４日に受託番号ＶＫＰＭ Ｂ−８１２６でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Ｒｕｓｓｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ （ＶＫＰＭ））（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ
Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ， １１７５４５ Ｍｏｓｃｏｗ， １st Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ， １）に寄託され、２００２年２月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。更に、メチオニンリプレッサー欠損株並びにＬ−メチオニン生合成に関与するタンパク質、例えばホモセリントランススクシニラーゼ及びシスタチオニンγ−合成酵素をコードする遺伝子で形質転換された組換え株（特開２０００−１３９４７１号）も親株として用いることができる。
【0065】
Ｌ−オルニチン生産菌
Ｌ−オルニチン生産菌は任意のＬ−アルギニン生産菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ ３８２株（ＶＫＰＭ Ｂ−７９２６）から、ａｒｇＦ及びａｒｇＩ遺伝子の両方にコードされるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの不活化により容易に得ることができる。オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの不活化方法は本明細書に記載されている。
【0066】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、エシェリヒア属に属する株、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＡＪ１２７３９（ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｔｙｒＲ）（ＶＫＰＭ Ｂ−８１９７）、変異体ｐｈｅＡ３４遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ ＨＷ１０８９（ＡＴＣＣ ５５３７１）（米国特許第５，３５４，６７２号）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＷＥＣ１０１−ｂ（韓国特許第８９０３６８１号）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＲＲＬ Ｂ−１２１４１、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１４５、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１４６、及びＮＲＲＬ Ｂ−１２１４７（米国特許第４，４０７，９５２号）が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＢ（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５６６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＤ］（ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６５９）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＴｅｒｍ］（ＦＥＲＭ ＢＰ−１２６６２）、及びＡＪ１２６０４と命名されたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＢＲ−ａｒｏＧ４、ｐＡＣＭＡＢ］（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５７９）も親株として用いることができる（欧州特許第４８８４２４（Ｂ１）号）。更に、ｙｅｄＡ遺伝子又はｙｄｄＧ遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も用いることができる（米国特許出願公開第２００３／０１４８４７３（Ａ１）号及び同第２００３／０１５７６６７（Ａ１）号）。
【0067】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、エシェリヒア属に属する株、例えば、ｉｌｖＡ遺伝子が欠失しており、Ｌ−プロリンを生産することができる、Ｅ．ｃｏｌｉ ７０２ｉｌｖＡ（ＶＫＰＭ Ｂ−８０１２）（欧州特許出願公開第１１７２４３３（Ａ１）号）が含まれるが、これに限定されるものではない。Ｌ−プロリン生合成に関与する１又は複数の遺伝子の発現を増強することにより細菌を改良することができる。Ｌ−プロリン生産菌に用いることができる遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が脱感作されたグルタミン酸キナーゼをコードするｐｒ
ｏＢ遺伝子が含まれる（ドイツ特許出願公開第３１２７３６１（Ａ１）号）。更に、細菌細胞からＬ−アミノ酸を搬出するタンパク質をコードする１又は複数の遺伝子の発現を増強することにより細菌を改良することができる。そのような遺伝子の例としては、ｂ２６８２及びｂ２６８３遺伝子（ｙｇａＺＨ遺伝子）（欧州特許出願公開第１２３９０４１（Ａ２）号）を挙げることができる。
【0068】
Ｌ−プロリン生産活性を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、以下のＥ．ｃｏｌｉ株が含まれる：ＮＲＲＬ Ｂ−１２４０３及びＮＲＲＬ Ｂ−１２４０４（英国特許第２０７５０５６号）、ＶＫＰＭ Ｂ−８０１２（ロシア特許出願公開第２０００１２４２９５号）、ドイツ特許出願公開第３１２７３６１（Ａ１）号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al. in "The 15th Miami winter symposium", 1983, p.34に記載されているプラスミド変異体等。
【0069】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、エシェリヒア属に属する株、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＴＤＨ−６／ｐＶＩＣ４０（ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６）（米国特許第５、１７５、１０７号、同第５，７０５，３７１号）、Ｅ．ｃｏｌｉ ４７２Ｔ２３／ｐＹＮ７（ＡＴＣＣ ９８０８１）（米国特許第５，６３１，１５７号）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＲＲＬ−２１５９３（米国特許第５，９３９，３０７号）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＥＲＭ ＢＰ−３７５６（米国特許第５，４７４，９１８号）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＥＲＭ ＢＰ−３５１９及びＦＥＲＭ ＢＰ−３５２０（米国特許第５，３７６，５３８号）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ４４２（Gusyatiner et al., Genetika (Russian), 1978, 14:947-956）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＬ６４３及びＶＬ２０５５（欧州特許出願公開第１１４９９１１（Ａ２）号）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0070】
株ＴＤＨ−６は、ｔｈｒＣ遺伝子が欠損しており、スクロース資化性であり、ｉｌｖＡ遺伝子に漏出性（ｌｅａｋｙ）変異を有する。この株は更に、ｒｈｔＡ遺伝子に変異を有し、これは高濃度のスレオニン又はホモセリンに対する耐性を付与する。Ｂ−３９９６株は、変異体ｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡ*ＢＣオペロンをＲＳＦ１０１０由来ベクターに挿入することによって得られたプラスミドｐＶＩＣ４０を含む。この変異体ｔｈｒＡ遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に脱感作されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。Ｂ−３９９６株は１９８７年１１月１９日に受託番号ＲＩＡ １８６７でオール・ユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチバイオティクス（Ａｌｌ−Ｕｎｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ，
１１７１０５ Ｍｏｓｃｏｗ， Ｎａｇａｔｉｎｓｋａｙａ Ｓｔｒｅｅｔ ３−Ａ）に寄託された。この株は更に１９８７年４月７日に受託番号Ｂ−３９９６でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（ＶＫＰＭ）（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ， １１７５４５ Ｍｏｓｃｏｗ， １st Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ， １）に寄託された。
【0071】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＫＰＭ Ｂ−５３１８（欧州特許出願公開第０５９３７９２（Ａ１）号）もＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株として用いることができる。Ｂ−５３１８株は、イソロイシンに関して原栄養性であり、温度感受性ラムダファージＣ１リプレッサー及びＰＲプロモーターでプラスミドｐＶＩＣ４０中のスレオニンオペロンの調節領域が置換されている。ＶＫＰＭ Ｂ−５３１８株は１９９０年５月３日に受託番号ＶＫＰＭ Ｂ−５３１８でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（ＶＫＰＭ）に寄託された。
【0072】
細菌は、以下の１又は複数の遺伝子発現が増強されるように更に改変され得る：
・スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異体ｔｈｒＡ遺伝子；
・ホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子；
・スレオニン合成酵素をコードするｔｈｒＣ遺伝子；
・スレオニン及びホモセリン流出系の推定膜貫通タンパク質をコードするｒｈｔＡ遺伝子；
・アスパラギン酸−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｓｄ遺伝子；
・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）をコードするａｓｐＣ遺伝子。
【0073】
Ｅ．ｃｏｌｉのアスパルトキナーゼＩ及びホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子は明らかにされている（ＫＥＧＧ登録番号ｂ０００２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２；ヌクレオチド位置：３３７〜２，７９９；Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４５８０３）。ｔｈｒＡ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２の染色体上のｔｈｒＬ遺伝子とｔｈｒＢ遺伝子の間に位置する。
【0074】
Ｅ．ｃｏｌｉのホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子は明らかにされている（ＫＥＧＧ登録番号ｂ０００３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２；ヌクレオチド位置：２，８０１〜３，７３３；Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７４９８）。ｔｈｒＢ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２の染色体上のｔｈｒＡ遺伝子とｔｈｒＣ遺伝子の間に位置する。
【0075】
Ｅ．ｃｏｌｉのスレオニン合成酵素をコードするｔｈｒＣ遺伝子は明らかにされている（ＫＥＧＧ登録番号ｂ０００４；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２；ヌクレオチド位置：３，７３４〜５，０２０；Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４５１９８）。ｔｈｒＣ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２の染色体上のｔｈｒＢ遺伝子とｙａａＸ遺伝子の間に位置する。３つの遺伝子は全て単一のスレオニンオペロンｔｈｒＡＢＣとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増強するために、転写に影響を与えるアテニュエーター領域がオペロンから除去されることが望ましい（国際公開第２００５０４９８０８（Ａ１）号、同第２００３０９７８３９（Ａ１）号）。
【0076】
Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼＩ及びホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異体ｔｈｒＡ遺伝子並びにｔｈｒＢ及びｔｈｒＣ遺伝子は、Ｌ−スレオニン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６中に存在する周知のプラスミドｐＶＩＣ４０から１つのオペロンとして得ることができる。プラスミドｐＶＩＣ４０は米国特許第５，７０５，３７１号に詳細に記載されている。
【0077】
Ｅ．ｃｏｌｉのスレオニン及びホモセリンの搬出系のタンパク質（内膜トランスポーター）をコードするｒｈｔＡ遺伝子は明らかにされている（ＫＥＧＧ登録番号ｂ０８１３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２；ヌクレオチド位置：８４８，４３３〜８４９，３２０、相補体；Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７０４５）。ｒｈｔＡ遺伝子は、グルタミン輸送系の構成要素をコードするｇｌｎＨＰＱオペロンに近いＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２の染色体上のｄｐｓ遺伝子とｏｍｐＸ遺伝子の間に位置する。ｒｈｔＡ遺伝子はｙｂｉＦ遺伝子（ＫＥＧＧ登録番号Ｂ０８１３）と同一である。
【0078】
Ｅ．ｃｏｌｉのアスパラギン酸−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｓｄ遺伝子は明らかにされている（ＫＥＧＧ登録番号ｂ３４３３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２；ヌクレオチド位置：３，５７１，７９８〜３，５７２，９０１、相補体；Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４７９３９）。ａｓｄ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２の染色体上の同じ鎖上（逆鎖上にはｙｈｇＮ遺伝子）のｇｌｇＢ遺伝子とｇ
ｎｔＵ遺伝子の間に位置する。
【0079】
また、Ｅ．ｃｏｌｉのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするａｓｐＣ遺伝子も明らかにされている（ＫＥＧＧ登録番号ｂ０９２８；ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２；ヌクレオチド位置：９８３，７４２〜９８４，９３２、相補体；Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４５５５３）。ａｓｐＣ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２の染色体上の逆鎖上のｙｃｂＬ遺伝子と同じ鎖上のｏｍｐＦ遺伝子との間に位置する。
【0080】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、エシェリヒア属に属する株、例えば、変異体ｔｒｐＳ遺伝子にコードされるトリプトファニル−ｔＲＮＡ合成酵素が欠損したＥ．ｃｏｌｉ ＪＰ４７３５／ｐＭＵ３０２８（ＤＳＭ１０１２２）及びＪＰ６０１５／ｐＭＵ９１（ＤＳＭ１０１２３）（米国特許第５，７５６，３４５号）、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｓｅｒＡアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸合成酵素をコードするｔｒｐＥアレルを有するＥ．ｃｏｌｉ ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）（米国特許第６，１８０，３７３号）、酵素トリプトファナーゼが欠損したＥ．ｃｏｌｉ ＡＧＸ１７（ｐＧＸ４４）（ＮＲＲＬ Ｂ−１２２６３）及びＡＧＸ６（ｐＧＸ５０）ａｒｏＰ（ＮＲＲＬ Ｂ−１２２６４）（米国特許第４，３７１，６１４号）、ホスホエノールピルビン酸生産能が増強されているＥ．ｃｏｌｉ ＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０，ｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓ（国際公開第９７０８３３３号、米国特許第６，３１９，６９６号）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。ｙｅｄＡ遺伝子又はｙｄｄＧ遺伝子にコードされる同定されたタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌を用いることもできる（米国特許出願公開第２００３／０１４８４７３（Ａ１）号及び同第２００３／０１５７６６７（Ａ１）号）。
【0081】
Ｌ−トリプトファン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては更に、アントラニル酸合成酵素、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、及びトリプトファン合成酵素から選択される酵素の１又は複数の活性が増強された株が含まれる。アントラニル酸合成酵素及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼはどちらもＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を脱感作する変異がこれらの酵素に導入され得る。そのような変異を有する株の具体例としては、脱感作されたアントラニル酸合成酵素を有するＥ．ｃｏｌｉ ＳＶ１６４及びフィードバック脱感作ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする変異体ｓｅｒＡ遺伝子を含むプラスミドｐＧＨ５をＥ．ｃｏｌｉ ＳＶ１６４に導入することにより得られた形質転換株（国際公開第９４／０８０３１号）が含まれる。
【0082】
Ｌ−トリプトファン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては更に、脱感作アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株が含まれる（特開昭５７−７１３９７号、特開昭６２−２４４３８２号、米国特許第４，３７１，６１４号）。更に、トリプトファンオペロン（ｔｒｐＢＡ）中のトリプトファン合成酵素をコードする遺伝子の発現を増強することでＬ−トリプトファン生産能を付与することができる。トリプトファン合成酵素は、それぞれｔｒｐＡ及びｔｒｐＢ遺伝子にコードされるα及びβサブユニットからなる。更に、イソクエン酸リアーゼ−リンゴ酸合成酵素オペロンの発現を増強することでＬ−トリプトファン生産能を改良することができる（国際公開第２００５／１０３２７５号）。
【0083】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌を誘導するために用いることができる親株の例としては、ｉｌｖＧＭ
ＥＤＡオペロンを過剰発現するように改変された株（米国特許第５，９９８，１７８号）が含まれるが、これらに限定されるものではない。減弱に必要なｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの領域を除去することにより、生産されたＬ−バリンによりオペロンの発現が減弱されないようにするが望ましい。更に、オペロン中のｉｌｖＡ遺伝子を破壊してスレオニンデアミナーゼ活性を低減させることが望ましい。
【0084】
Ｌ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては更に、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の変異を有する変異体が含まれる（米国特許第５，６５８，７６６号）。例えば、イソロイシンｔＲＮＡ合成酵素をコードするｉｌｅＳ遺伝子に変異を有するＥ．ｃｏｌｉ
ＶＬ１９７０を用いることができる。Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＬ１９７０は１９８８年６月２４日に受託番号ＶＫＰＭ Ｂ−４４１１でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（ＶＫＰＭ）（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ， １１７５４５ Ｍｏｓｃｏｗ， １ｓｔ Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ， １）に寄託された。
【0085】
更に、生育にリポ酸を要求する且つ／又はＨ+−ＡＴＰアーゼを欠く変異体も親株として用いることができる（国際公開第９６／０６９２６号）。
【0086】
Ｌ−バリン生産株の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｈ−８１（ＶＫＰＭ Ｂ−８０６６）、ＮＲＲＬ Ｂ−１２２８７及びＮＲＲＬ Ｂ−１２２８８（米国特許第４，３９１，９０７号）、ＶＫＰＭ Ｂ−４４１１（米国特許第５，６５８，７６６号）、ＶＫＰＭ Ｂ−７７０７（欧州特許出願公開第１０１６７１０（Ａ２）号）等が含まれる。
【0087】
腸内細菌科に属する本発明の細菌はｙｊｊＫ遺伝子の発現が減弱するように改変されている。
【0088】
「ｙｊｊＫ遺伝子の発現が減弱するように改変された細菌」という語句は、非改変ｙｊｊＫ遺伝子を含む細菌（例えば野生型又は親株）と比べて、改変された細菌中でｙｊｊＫ遺伝子の発現が低減しているかｙｊｊＫ遺伝子が不活化されるように細菌が改変されていることを意味し得る。
【0089】
「ｙｊｊＫ遺伝子が不活化された（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）」という語句は、改変された遺伝子が、完全に不活性又は非機能的なタンパク質をコードすることを意味し得る。また、遺伝子の一部の欠失若しくは遺伝子全体の欠失、遺伝子にコードされるタンパク質中にアミノ酸置換を生じさせる１若しくは複数の塩基の置換（ミスセンス変異）、終止コドンの導入（ナンセンス変異）、遺伝子の読み枠のシフトを生じさせる１若しくは２個の塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子及び／若しくは転写終止シグナルの挿入、又はプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）等の遺伝子発現調節配列を含む遺伝子の隣接領域の改変等により、改変ＤＮＡ領域が自然には遺伝子を発現できないことでもあり得る。更に、遺伝子の不活化は、例えば従来の方法、例えば紫外線照射若しくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いた突然変異誘発処理、部位特異的突然変異誘発、相同組換えを用いた遺伝子破壊、及び／又は「Ｒｅｄ／ＥＴドリブンインテグレーション（Ｒｅｄ／ＥＴ−ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」又は「λＲｅｄ／ＥＴ仲介インテグレーション（λＲｅｄ／ＥＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」に基づく挿入−欠失突然変異誘発により行われ得る（Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(11):5978-5983; Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y. et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128)。
【0090】
「ｙｊｊＫ遺伝子の発現が減弱された」という語句は、ｙｊｊＫ遺伝子の発現が減弱さ
れた改変細菌中のＹｊｊＫタンパク質の量が非改変細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２等の野生型又は親株）と比べて低減していることを意味し得る。
【0091】
「ｙｊｊＫ遺伝子の発現が減弱された」という語句は更に、改変された細菌が、ｙｊｊＫ遺伝子の発現レベルが低減するように改変された、遺伝子に作動可能に連結された領域、例えば遺伝子発現を制御する配列、例えばプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、及び転写終止シグナル、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、及びその他の発現制御エレメント等を含むこと及び他の例（例えば、国際公開第９５／３４６７２号；Carrier T.A. and Keasling J.D., Biotechnol. Prog., 1999, 15:58-64参照）を意味し得る。
【0092】
染色体ＤＮＡ上のプロモーター等の遺伝子の発現制御配列をより弱いもので置換することにより、ｙｊｊＫ遺伝子の発現を減弱させることができる。プロモーターの強さは、ＲＮＡ合成の開始作用頻度により定義される。プロモーターの強さを評価する方法及び強力なプロモーターの例は、Goldstein et al., Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1:105-128）等に記載されている。更に、国際公開第００／１８９３５号に開示されているように、標的遺伝子のプロモーター領域中の数ヌクレオチドにヌクレオチド置換を導入することにより、弱めるべきプロモーターを改変することも可能である。更に、シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列中及び／若しくはＳＤ配列と開始コドンとの間のスペーサー中の数ヌクレオチドの置換並びに／又はリボソーム結合部位（ＲＢＳ）中の開始コドンのすぐ上流及び／若しくは下流の配列の置換がｍＲＮＡの翻訳効率に大きく影響することも知られている。このＲＢＳの改変をｙｊｊＫ遺伝子の転写低下と組み合わせてもよい。
【0093】
更に、遺伝子のコード領域中（米国特許第５，１７５，１０７号）、遺伝子発現を制御する領域中、若しくはｙｊｊＫ遺伝子構造の近位部分（ｙｊｊＫが遠位部分）中にトランスポゾン若しくは挿入配列（ＩＳ）を挿入することにより又は紫外線（ＵＶ）照射若しくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いた突然変異誘発等の従来の方法により、ｙｊｊＫ遺伝子の発現を減弱させることができる。更に、例えばλＲｅｄ／ＥＴ仲介組換えに基づく公知の染色体編集法により、部位特異的変異の導入を行うことができる。
【0094】
遺伝子のコピー数や有無の測定は、例えば、染色体ＤＮＡを制限酵素分解した後、遺伝子配列に基づくプローブを用いるサザンブロッティング、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等により行うことができる。遺伝子発現レベルは、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の様々な周知の方法を用いて、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を測定することにより決定することができる。遺伝子にコードされるタンパク質の量は、タンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のイムノブロッティングアッセイ（ウェスタンブロッティング分析）又は質量分析等を含む公知の方法により測定することができる。
【0095】
組換えＤＮＡ分子の操作方法及び分子クローニング、例えばプラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化、ライゲーション、及び形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択、変異の導入等は当業者に周知の通常の方法であり得る。これらの方法は、例えばSambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)又はGreen M.R. and Sambrook J.R., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012); Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak and Cheryl L. Patten, "Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA", 4th ed., Washington, DC, ASM Press (2009)に記載されている。
【0096】
ｙｊｊＫ遺伝子は、予測されるＡＢＣスーパーファミリーの融合トランスポーターサブユニットであるＡＴＰ結合コンポーネントＹｊｊＫ（京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）登録番号ｂ４３９１；Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot、アクセッション番号Ｐ０Ａ９Ｗ３）をコードする。ｙｊｊＫ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２；ヌクレオチド位置：４６２６８７８〜４６２８５４５、相補体；Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４８９０９）は、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ−１２の染色体上の逆鎖上のｎａｄＲ遺伝子とｓｌｔ遺伝子との間に位置する。ｙｊｊＫ遺伝子の塩基配列及びｙｊｊＫ遺伝子にコードされるＹｊｊＫタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。
【0097】
腸内細菌科に属する他の細菌種に由来するＡＢＣトランスポーターＡＴＰ結合タンパク質ＹｊｊＫのアミノ酸配列が知られている。ＹｊｊＫタンパク質の例は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ， ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）にアクセッション番号Ｆ２ＥＵ２５（パントエア・アナナティス、株ＡＪ１３３５５、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、Ｄ０ＺＶ６１（サルモネラ・チフィリウム（Salmonella typhimurium）、株１４０２８ｓ／ＳＧＳＣ ２２６２、サルモネラ・ジェネティック・ストック・センター（Ｔｈｅ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ：ＳＧＳＣ）、住所 Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２５００ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｄｒ． Ｎ．Ｗ． Ｃａｌｇａｒｙ， Ａｌｂｅｒｔａ， Ｃａｎａｄａ， Ｔ２Ｎ
１Ｎ４）、Ｐ０Ａ９Ｗ５（シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri））又はシゲラ・フレックスネリに由来するそのホモログであるカステッラーニ・アンド・チャルマーズ（Castellani and Chalmers）、ＡＴＣＣ ２９９０３、Ｂ２ＶＨ３０（エルウィニア・タスマニエンシス（Erwinia tasmaniensis）、株ＤＳＭ １７９５０／Ｅｔ１／９９、ライプニッツ研究所、ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニズム・アンド・セルカルチャー（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）、住所 Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ， ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ））、Ｃ７ＢＪＶ０（フォトラブダス・アシンビオティカ亜種アシンビオティカ（Photorhabdus asymbiotica subsp. asymbiotica）、株ＡＴＣＣ ４３９４９／３１０５−７７）等に記載されている。
【0098】
腸内細菌科の属、種、又は株の間でＤＮＡ配列中にいくらかの違いがあり得るため、ｙｊｊＫ遺伝子は配列番号１に示す遺伝子に限定されず、ＹｊｊＫタンパク質のバリアントをコードする、配列番号１のバリアント塩基配列である遺伝子又は配列番号１に相同な遺伝子を含み得る。
【0099】
「バリアントタンパク質」という語句は、配列番号２と比べて配列中に１又は複数の変化（１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加のいずれであってもよい）を有するが、ＹｊｊＫタンパク質と同様な活性若しくは機能を依然として維持している又はＹｊｊＫタンパク質の三次元構造が野生型若しくは非改変タンパク質と比べて顕著に変化していないタンパク質を意味し得る。バリアントタンパク質中の変化の数は、タンパク質の三次元構造中の位置又はアミノ酸残基の種類に依存する。変化の数は、厳密に限定されるものではないが、配列番号２中、１〜３０、別の例では１〜１５、別の例では１〜１０、別の例では１〜５であり得る。バリアントタンパク質中のこれらの変化は、タンパク質の活性又は機能に重要でないタンパク質の領域で起こり得る。これは、いくつかのアミノ酸が互いに高い相同性を有し、そのため、活性又は機能がそのような変化の影響を受けないか、ＹｊｊＫの三次元構造が野生型又は非改変タンパク質と比べて著しく変化しないためである。したがって、ｙｊｊＫ遺伝子にコードされるタンパク質バリアントは、ＹｊｊＫタンパク質の活性又は機能が維持されるかＹｊｊＫの三次元構造が野生型又は
非改変タンパク質と比べて著しく変化しないとして、コンピュータープログラムのＢＬＡＳＴを用いた時にパラメーター「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」として定義される相同性が、配列番号２に示すアミノ酸配列全体に対して８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上であり得る。
【0100】
１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加の例は、保存的変異であり得る。代表的な保存的変異は保存的置換である。保存的置換は、限定されるものではないが、置換部位が芳香族アミノ酸であれば、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ間；置換部位が疎水性アミノ酸であれば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、及びＶａｌ間；置換部位が親水性アミノ酸であれば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、及びＴｈｒ間；置換部位が極性アミノ酸であれば、Ｇｌｎ及びＡｓｎ間；置換部位が塩基性アミノ酸であれば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓ間；置換部部位が酸性アミノ酸であれば、Ａｓｐ及びＧｌｕ間；置換部位がヒドロキシル基を有するアミノ酸であれば、Ｓｅｒ及びＴｈｒ間、で相互に起こる置換であり得る。保存的置換の例としては、Ｓｅｒ又はＴｈｒによるＡｌａの置換、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓによるＡｒｇの置換、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、又はＡｓｐによるＡｓｎの置換、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、又はＧｌｎによるＡｓｐの置換、Ｓｅｒ又はＡｌａによるＣｙｓの置換、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、又はＡｒｇによるＧｌｎの置換、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐによるＧｌｕの置換、ＰｒｏによるＧｌｙの置換、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒによるＨｉｓの置換、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅによるＩｌｅの置換、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅによるＬｅｕの置換、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、又はＡｒｇによるＬｙｓの置換、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＰｈｅによるＭｅｔの置換、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕによるＰｈｅの置換、Ｔｈｒ又はＡｌａによるＳｅｒの置換、Ｓｅｒ又はＡｌａによるＴｈｒの置換、Ｐｈｅ又はＴｙｒによるＴｒｐの置換、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐによるＴｙｒの置換、及びＭｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕによるＶａｌの置換が含まれる。
【0101】
１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加の例は更に、アミノ酸配列の異なる位置における１又は複数の二次的変異によって変異が補償されることによりバリアントタンパク質の活性又は機能が維持されてＹｊｊＫタンパク質の活性又は機能と同様であるか野生型又は非改変タンパク質と比べてＹｊｊＫの三次元構造が顕著に変化しないとして、非保存的変異であり得る。
【0102】
タンパク質又はＤＮＡの相同性の程度を評価するために、ＢＬＡＳＴサーチ、ＦＡＳＴＡサーチ、及びＣｌｕｓｔａｌＷ法等の複数の計算方法を用いることができる。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ， ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）サーチは、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘに採用されている発見的サーチアルゴリズムであり、これらのプログラムは、Samuel
K. and Altschul S.F.（"Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877）の統計学的方法を用いてそれらの発見に有意性を付与する。コンピュータープログラムＢＬＡＳＴは、スコア、同一性、及び類似性の３つのパラメーターを計算する。ＦＡＳＴＡサーチ法はPearson W.R.（"Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA", Methods Enzymol., 1990, 183:63-98）に記載されている。ＣｌｕｓｔａｌＷ法はThompson J.D. et al.（"CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap
penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680）に
記載されている。
【0103】
更に、ｙｊｊＫ遺伝子はバリアント塩基配列であり得る。「バリアント塩基配列」という語句は、標準的な遺伝暗号表（例えば、Lewin B., "Genes VIII", 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458参照）による任意の同義アミノ酸コドンを用いてＹｊｊＫタンパク質をコードする塩基配列又はＹｊｊＫタンパク質の「バリアントタンパク質」をコードする塩基配列を意味し得る。ｙｊｊＫ遺伝子は、遺伝暗号の縮重によるバリアント塩基配列であり得る。
【0104】
「バリアント塩基配列」という語句は更に、限定されるものではないが、それが機能的タンパク質をコードするという条件で、配列番号１に示す配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、又はストリンジェントな条件下で塩基配列から作製することができるプローブを意味し得る。「ストリンジェントな条件」は、特異的ハイブリッド、例えば、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴを用いた時にパラメーター「同一性」で定義される相同性が７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であるハイブリッドが形成され、非特異的ハイブリッド、例えば、相同性が上記より低いハイブリッドが形成されない条件を含む。例えば、ストリンジェントな条件の例として、１×ＳＤＳ（標準クエン酸ナトリウム又は標準塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、又は別の例では０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの塩濃度、６０℃又は６５℃の温度で、１若しくは複数回、又は別の例では２若しくは３回の洗浄を挙げることができる。洗浄時間は、ブロッティングに用いられるメンブレンの種類によって決まり、原則としてメーカーが推奨する時間であり得る。例えば、正に帯電したナイロンメンブレンであるＡｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ（商標）−Ｎ＋（ＧＥヘルスケア社製）にストリンジェントな条件下で推奨される洗浄時間は１５分である。洗浄ステップは２〜３回行われ得る。プローブとして、配列番号１に示す配列に相補的な配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号１に示す配列に基づいて作製されたオリゴヌクレオチドをプライマー、塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型として用いたＰＣＲにより作製することができる。プローブの長さは５０ｂｐを超えることが推奨され、これはハイブリダイゼーション条件に基づいて好適に選択することができ、通常、１００ｂｐ〜１ｋｂｐである。例えば、長さが約３００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして用いる場合、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件の例として、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃、６０℃、又は６５℃を挙げることができる。
【0105】
エシェリヒア属、パントエア属、シゲラ属、エルウィニア属、及びフォトラブダス属のＹｊｊＫタンパク質をコードする遺伝子は既に解明されているので（上記参照）、ＹｊｊＫタンパク質のバリアントタンパク質をコードするバリアント塩基配列は、ｙｊｊＫ遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；
White T.J. et al., The polymerase chain reaction, Trends Genet., 1989, 5:185-189参照）により得ることができ、あるいは、野生型若しくは変異体ｙｊｊＫ遺伝子を含むＤＮＡをインビトロで例えばヒドロキシルアミンで処理することによる部位特異的変異誘発法又は紫外線（ＵＶ）照射若しくは変異剤、例えばそのような処理に通常用いられるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）及び亜硝酸で、野生型若しくは変異体ｙｊｊＫ遺伝子を有する微生物、例えば腸内細菌科に属する細菌を処理する方法で得ることができ、あるいは、全長遺伝子構造として化学的に合成することができる。他の微生物のＹｊｊＫタンパク質又はそのバリアントタンパク質をコードする遺伝子も同様に得ることができる。
【0106】
「野生型タンパク質」という語句は、腸内細菌科の野生型又は親細菌株、例えば野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株により自然に生産された天然タンパク質を意味し得る。野
生型タンパク質は、野生型細菌のゲノム中に自然に生じている野生型又は非改変遺伝子によってコードされ得る。
【0107】
「遺伝子に作動可能に連結された」という語句は、調節領域が、関心のある核酸分子又は遺伝子の塩基配列に、塩基配列の発現、好ましくは塩基配列にコードされる遺伝子産物の発現（例えば、増強された、上昇した、構成的な、基本的な、抗転写終結的な、減弱した、調節解除された、低減された、又は抑圧された発現）が可能であるように連結されていることを意味し得る。
【0108】
本明細書に記載の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を本来的に有している細菌のｙｊｊＫ遺伝子の発現を減弱させることにより得ることができる。あるいは、本明細書に記載の細菌は、ｙｊｊＫ遺伝子の発現が既に減弱されている細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより得ることができる。
【0109】
細菌は、本発明の範囲から逸脱することなく、既に記載した特性に加えて、他の特定の特性、例えば種々の栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受性、及び薬剤依存性を有し得る。
【0110】
２．方法
本発明の方法は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリン等のＬ−アミノ酸、又はその塩若しくはその混合物を製造する方法を含む。Ｌ−アミノ酸を製造する方法は、細菌を培養培地中で培養してＬ−アミノ酸を生産、排出、又は培養培地中に蓄積させるステップ及び培養培地及び／又は細菌細胞からＬ−アミノ酸を回収するステップを含み得る。回収されたアミノ酸は更に精製され得る。Ｌ−アミノ酸はその塩形態で生産され得る。例えば、Ｌ−アミノ酸のナトリウム、カリウム、アンモニウム等の塩が本方法により製造され得る。
【0111】
細菌の培養並びに培地等からのＬ−アミノ酸又はその塩の回収及び精製は、微生物を用いてＬ−アミノ酸を生産する従来の発酵法と同様に行われ得る。Ｌ−アミノ酸生産のための培養培地は、合成培地であってもよく、天然培地であってもよく、例えば、炭素源、窒素源、硫黄源、無機イオン、並びに必要に応じて他の有機及び無機成分を含む典型的な培地であり得る。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、及びデンプン加水分解物等の糖類；グリセロール、マンニトール、及びソルビトール等のアルコール；グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、及びコハク酸等の有機酸等を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及びリン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩；ダイズ加水分解物等の有機窒素；アンモニアガス；アンモニア水等を用いることができる。硫黄源としては、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン等が含まれ得る。ビタミンＢ１等のビタミン、要求される物質、例えばアデニン及びＲＮＡ等の核酸又は酵母エキスなどの有機栄養素が、微量であるとしても、適切な量で存在し得る。これら以外に、少量のリン酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が必要であれば添加され得る。
【0112】
培養は、好気性条件で１６〜７２時間又は１６〜６５時間行われ得、培養中の培養温度は３０〜４５℃又は３０〜３７℃に制御され得、ｐＨは５〜８又は６〜７．５に調整され得る。ｐＨは、無機又は有機、酸性又はアルカリ性の物質及びアンモニアガスを用いて調整され得る。
【0113】
培養後、細胞及び細胞片等の固体は遠心又は膜ろ過により液体培地から除去され得、その後、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、及び結晶化等の従来技術の任意の組合せにより、標的のＬ−アミノ酸又はその塩が発酵液から回収され得る。
【0114】
回収された標的Ｌ−アミノ酸は、標的物質に加えて、微生物細胞、培地成分、水分、及び微生物の副産物的代謝物質を含み得る。回収された標的物質の純度は、５０％以上、８５％以上、又は９５％以上である（米国特許第５，４３１，９３３号、日本特許第１２１４６３６号、米国特許第４，９５６，４７１号、同第４，７７７，０５１号、同第４，９４６，６５４号、同第５，８４０，３５８号、同第６，２３８，７１４号、米国特許出願公開第２００５／００２５８７８号）。
【実施例】
【0115】
以下に非限定的な例を参照して本発明を更に正確に説明する。
【0116】
実施例１
１．１．ｙｊｊＫ遺伝子が不活化されたＥ．ｃｏｌｉ株の構築
Datsenko K.A. and Wanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-664が開発した「λＲｅｄ／ＥＴ仲介インテグレーション」と呼ばれる方法を用いてｙｊｊＫ遺伝子を欠失させた。この方法に従い、ｙｊｊＫ遺伝子のいずれかの末端に隣接する領域に相同なＰＣＲプライマーＰ１（配列番号３）及びＰ２（配列番号４）、並びに鋳型染色体中にカナマイシン耐性（ＫｍR）を付与する遺伝子を構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ＩＳ５．１１：：ＬａｔｔＢｐｈｉ８０−ＫｍR−ＲａｔｔＢｐｈｉ８０（Minaeva N.I. et al., Dual-In/Out strategy for
genes integration into bacterial chromosome: a novel approach to step-by-step construction of plasmid-less marker-less recombinant E. coli strains with predesigned genome structure. BMC Biotechnol., 2008, 8:63）の染色体を鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は以下の通りである：最初の変性：９５℃３分；最初の２サイクルのプロファイル：９５℃１分、３４℃３０秒、７２℃４０秒；最後の３０サイクルのプロファイル：９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃４０秒；最後のステップ：７２℃５分。
【0117】
得られたＰＣＲ産物１（配列番号５）（１，９２２ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動で精製し、温度感受性複製起源を有するプラスミドｐＫＤ４６を含む株Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅのエレクトロポレーションに用いた（Minaeva N.I. et al., BMC Biotechnol., 2008, 8:63）。プラスミドｐＫＤ４６（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45）は、λファージの２，１５４ヌクレオチド（３１０８８〜３３２４１）ＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４５９）を含み、アラビノース誘導プロモーターＰaraBの制御下にλＲｅｄ／ＥＴ仲介インテグレーションシステムの遺伝子（α、β、エキソ遺伝子）を含む。プラスミドｐＫＤ４６は、ＰＣＲ産物を株Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅの染色体中に組み込むのに必須である。
【0118】
以下のようにしてエレクトロコンピテントセルを調製した：Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅを、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地中で３０℃にて一晩生育し、アンピシリン及びＬ−アラビノース（１ｍＭ）を含む５ｍＬのＳＯＢ培地（Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）で培養液を１００倍希釈した。得られた培養物を通気しながら３０℃でＯＤ600が約０．６になるまで生育した後、１００倍濃縮して氷冷脱イオン水で３回洗浄することによりエレクトロコンピテントにした。７０μＬの細胞及び約１００ｎｇのＰＣＲ産物１を用いてエレクトロポレーションを行った。１ｍＬのＳＯＣ培地（Sambrook J., Fritsch E.F. and
Maniatis T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）中、３７℃で２．５時間細胞をインキュベートし、溶原培地（Sambrook, J. and Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）、アガー（１．５％）、及びカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むプレートにまき、３７℃で生育してＫｍR組換え体を選択した。カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬ−アガー上で４２℃にて２回継代してｐＫＤ４６プラスミドを除去し、得られたコロニーのアンピシリン感受性を標準的な手法を用いて調べた。このようにして、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍR株を得た。
【0119】
１．２．ＰＣＲによるｙｊｊＫ遺伝子欠失の確認
ｙｊｊＫ遺伝子の欠失を含みカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）で特徴付けられた変異体をＰＣＲで確認した。遺伝子座特異的プライマーＰ３（配列番号６）及びＰ４（配列番号７）をＰＣＲに用いた。条件は以下の通りである：最初の変性：９４℃３分；３０サイクルのプロファイル：９４℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃２分；最終ステップ：７２℃６分。親ｙｊｊＫ+株であるＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅの染色体ＤＮＡを鋳型として用いた時、ＰＣＲ産物２（配列番号８）（１，７８３ｂｐ）が得られた。変異体ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍR株の染色体ＤＮＡを鋳型として用いた時、ＰＣＲ産物３（配列番号９）（１，９８９ｂｐ）が得られた。
【0120】
実施例２．ｙｊｊＫ遺伝子が不活化されたＬ−バリン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株の構築
Ｐ１形質導入（Miller J.H. "Experiments in molecular genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1972)）を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｈ−８１ Ｌ−バリン生産株からｙｊｊＫ遺伝子を欠失させた。株Ｈ−８１（欧州特許第１２３９０４１（Ａ２）号）は、２００１年１月３０日に受託番号ＶＫＰＭ Ｂ−８０６６でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（ＶＫＰＭ）（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ， １１７５４５ Ｍｏｓｃｏｗ， １st Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ， １）に寄託され、これはその後、２００２年２月１日にブダペスト条約の条項に基づく国際委託に移管されている。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍR株（実施例１）をドナーとして用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ−８１のｙｊｊＫ欠損変異体を、溶原培地（Sambrook, J. and Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）、アガー（１．５％）、及びカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むプレート上で選択した。このようにして、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ−８１ΔｙｊｊＫ：：ＫｍR株を得た。実施例１に記載したようにＰＣＲでΔｙｊｊＫ：：ＫｍR欠失を確認した。
【0121】
実施例３
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ−８１ΔｙｊｊＫ：：ＫｍR株によるＬ−バリンの生産
改変Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ−８１ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍR及び対照Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ−８１株のそれぞれをＬＢ培地（Sambrook, J. and Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されているように溶原培地ともいう）中で３２℃にて１８時間培養した。その後、得られた培養液０．２ｍＬを、２０×２００ｍｍ試験管中の発酵培地２ｍＬに接種し、ロータリーシェーカーを用いて２５０ｒｐｍ、３０℃で４８時間培養した。
【0122】
発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）は以下の通りである：
グルコース ６０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 １５．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．５
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
チアミン−ＨＣｌ ０．１
ＣａＣＯ3 ２５．０
ＬＢ培地 １０％（ｖ／ｖ）
【0123】
発酵培地を１１６℃で３０分間滅菌した。但し、グルコース及びＣａＣＯ3は別々に以下のように滅菌した：グルコースは１１０℃で３０分、ＣａＣＯ3は１１６℃で３０分。ＫＯＨ溶液でｐＨを７．０に調整した。
【0124】
培養後、蓄積されたＬ−バリンを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により測定した。ＴＬＣプレート（１０×２０ｃｍ）は、非蛍光指示薬を含むＳｏｒｂｆｉｌシリカゲル（Ｓｏｒｂｐｏｌｙｍｅｒ、ロシア連邦クラスノダール）の０．１１ｍｍ層でコーティングした。Ｃａｍａｇ Ｌｉｎｏｍａｔ ５サンプルアプリケーターを用いてサンプルをプレートにアプライした。イソプロパノール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水（１６：１６：５：１０、ｖ／ｖ）からなる移動相でＳｏｒｂｆｉｌプレートを展開した。ニンヒドリン（２％、ｗ／ｖ）のアセトン溶液を発色試薬として用いた。発色後、プレートを乾燥させ、Ｃａｍａｇ ＴＬＣ Ｓｃａｎｎｅｒ ３を吸光度モードで用いてスキャンし、ｗｉｎＣＡＴＳソフトウェア（バージョン１．４．２）を用いて５２０ｎｍで検出した。
【0125】
９個の独立した試験管発酵の結果を表１に示す。表１から分かるように、改変Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ−８１ΔｙｊｊＫ：：ＫｍR株は親Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ−８１株より多量のＬ−バリン（Ｖａｌ）を生産することができた。
【0126】
【表1】
【0127】
実施例４．ｙｊｊＫ遺伝子が不活化されたＬ−ヒスチジン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株の構築
ｙｊｊＫ遺伝子活性化のＬ−ヒスチジン生産への影響を調べるために、前述したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍR株（実施例１）の染色体に由来するＤＮＡ断片を、実施例２に記載されているように、Ｐ１形質導入（Miller J.H. "Experiments in molecular genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1972)）を用いてＬ−ヒスチジン生産株Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５＋ｈｉｓＧｒ ｈｉｓＬ’＿Δ ΔｐｕｒＲに導入した。ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの欠失をＰＣＲで確認した。このようにして、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５＋ｈｉｓＧｒ ｈｉｓＬ’＿Δ ΔｐｕｒＲ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍR株を得た。
【0128】
株Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５＋ｈｉｓＧｒ ｈｉｓＬ’＿Δ ΔｐｕｒＲはロシア特許第２１１９５３６（Ｃ１）号及びDoroshenko V.G. et al., The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants, Prikl. Biochim. Mikrobiol. (Russian), 2013, 49(2):149-154.に記載されている。
【0129】
実施例５．Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５＋ｈｉｓＧｒ ｈｉｓＬ’＿Δ ΔｐｕｒＲ株に
よるＬ−ヒスチジンの生産
改変Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５＋ｈｉｓＧｒ ｈｉｓＬ’＿Δ ΔｐｕｒＲ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍR株及び対照Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５＋ｈｉｓＧｒ ｈｉｓＬ’＿Δ ΔｐｕｒＲ株のそれぞれを、２ｍＬのＬ培地（Sambrook, J. and Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）中で３０℃にて３時間培養した。その後、得られた培養液０．１ｍＬを２０×２００ｍｍ試験管中の発酵培地２ｍＬに接種し、ロータリーシェーカー（２５０ｒｐｍ）上で３０℃にて６５時間培養した。
【0130】
発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）は以下の通りである。
グルコース ５０．０
豆濃* ０．２（Ｎ量として）
Ｌ−アスパルギン酸 １．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 １８．０
ＫＣｌ １．０
ＫＨ2ＰＯ4 ０．５
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2０ ０．４
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2０ ０．０２
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０２
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2０ ０．０２
アデノシン ０．２
チアミン−ＨＣｌ ０．００１
ベタイン ２．０
ＣａＣＯ3 ６０．０
*豆濃（Ｍａｍｅｎｏ）は、ダイズ加水分解物（味の素株式会社製）である。
【0131】
グルコース、硫酸マグネシウム、ベタイン、及びＣａＣＯ3を別々に滅菌した。滅菌前に６Ｍ ＫＯＨ溶液でｐＨを６．０に調整した。
【0132】
培養後、蓄積されたＬ−ヒスチジンを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で測定した。ＴＬＣプレート（１０×２０ｃｍ）は、非蛍光指示薬を含むＳｏｒｂｆｉｌシリカゲル（Ｓｏｒｂｐｏｌｙｍｅｒ、ロシア連邦クラスノダール）の０．１１ｍｍ層でコーティングした。Ｃａｍａｇ Ｌｉｎｏｍａｔ ５サンプルアプリケーターを用いてサンプルをプレートにアプライした。Ｓｏｒｂｆｉｌプレートをイソプロパノール：アセトン：２５％アンモニア水：水（６：６：１．５：１、ｖ／ｖ）からなる移動相で展開した。ニンヒドリン（２％、ｗ／ｖ）のアセトン溶液を発色試薬として用いた。発色後、プレートを乾燥させ、吸光度モードでＣａｍａｇ ＴＬＣ Ｓｃａｎｎｅｒ ３を用いてスキャンし、ｗｉｎＣＡＴＳソフトウェア（バージョン１．４．２）を用いて５２０ｎｍで検出した。
【0133】
７個の独立した試験管発酵の結果を表２に示す。表２から分かるように、改変Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５＋ｈｉｓＧｒ ｈｉｓＬ’＿Δ ΔｐｕｒＲ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍR株は、親Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５＋ｈｉｓＧｒ ｈｉｓＬ’＿Δ ΔｐｕｒＲ株より多量のＬ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）を生産することができた。
【0134】
【表2】
【0135】
実施例６．Ｅ．ｃｏｌｉ ３８２ΔｙｊｊＫ株によるＬ−アルギニンの生産
ｙｊｊＫ遺伝子不活化のＬ−アルギニン生産への影響を調べるために、前述したＥ．ｃｏｌｉ Ｇ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの染色体から得たＤＮＡ断片を、Ｐ１形質導入（Miller, J.H. "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY (1972)）によりアルギニン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株３８２に導入して株３８２ΔｙｊｊＫを得る。株３８２は、２０００年４月１０日に受託番号ＶＫＰＭ Ｂ−７９２６でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（ＶＫＰＭ）（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ
Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ， １１７５４５ Ｍｏｓｃｏｗ， １st Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ， １）に寄託され、その後、２００１年５月１８日にブダペスト条約に基づく寄託に移管されている。
【0136】
Ｅ．ｃｏｌｉ株３８２及び３８２ΔｙｊｊＫの両方を、３ｍＬの栄養培地中で振盪（２２０ｒｐｍ）しながら３７℃で１８時間別々に培養し、得られた培養液０．３ｍＬを、２０×２００ｍｍ試験管中の２ｍＬの発酵培地に接種し、ロータリーシェーカー（２２０ｒｐｍ）を用いて３２℃で４８時間培養する。
【0137】
培養後、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）からなる移動相を用いたペーパークロマトグラフィーにより、培地中に蓄積されたＬ−アルギニンの量を決定する。ニンヒドリン（２％）のアセトン溶液を発色試薬として用いる。Ｌ−アルギニンを含むスポットを切り取り、ＣｄＣｌ2の０．５％水溶液でＬ−アルギニンを溶出させ、５４０ｎｍでの分光測定によりＬ−アルギニンの量を評価する。
【0138】
発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）は以下の通りである。
グルコース ４８．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３５．０
ＫＨ2ＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
チアミン−ＨＣｌ ０．０００２
酵母エキス １．０
Ｌ−イソロイシン ０．１
ＣａＣＯ3 ５．０
【0139】
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌する。ＣａＣＯ3は１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨは７．０に調整する。
【0140】
実施例７．Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１５（ｙｄｅＤ）ΔｙｊｊＫによるＬ−システインの生産
ｙｊｊＫ遺伝子不活化のＬ−システイン生産への影響を調べるために、前述したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの染色体に由来するＤＮＡ断片をＰ１形質導入によりＬ−システイン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１５（ｙｄｅＤ）に導入して株ＪＭ１５（ｙｄｅＤ）ΔｙｊｊＫを得る。
【0141】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１５（ｙｄｅＤ）は、膜タンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子を有するＤＮＡで形質転換されており、いずれのＬ−アミノ酸の生合成経路にも関与しないＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１５（米国特許第６，２１８，１６８号）の誘導体である（米国特許第５，９７２，６６３号）。
【0142】
発酵の条件及びＬ−システイン生産を評価するための手順は米国特許第６，２１８，１６８号の実施例６に詳細に記載されている。
【0143】
実施例８．Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+ΔｙｊｊＫによるＬ−グルタミン酸の生産
ｙｊｊＫ遺伝子不活化のＬ−グルタミン酸生産への影響を調べるために、前述のＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの染色体に由来するＤＮＡ断片をＰ１形質導入によりＬ−グルタミン酸生産Ｅ．ｃｏｌｉ株ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+（欧州特許出願公開第１１７２４３３（Ａ１）号）に導入して株ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+ΔｙｊｊＫを得る。株ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+は２００４年１２月６日に受託番号Ｂ−８９６１でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（ＶＫＰＭ）（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ，
１１７５４５ Ｍｏｓｃｏｗ， １ Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ， １）に寄託され、その後、２００４年１２月８日にブダペスト条約に基づく寄託に移管されている。
【0144】
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+及びＶＬ３３４ｔｈｒＣ+ΔｙｊｊＫを、Ｌ−アガープレート上で３７℃にて１８〜２４時間別々に培養する。その後、ループ一掻き分の細胞を、２ｍＬの発酵培地の入った試験管に移す。
【0145】
発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）は以下の通りである。
グルコース ６０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２５．０
ＫＨ2ＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
チアミン−ＨＣｌ ０．１
Ｌ−イソロイシン ０．０７
ＣａＣＯ3 ２５．０
【0146】
グルコース及びＣａＣＯ3は別々に滅菌する。ｐＨは７．２に調整する。
【0147】
３０℃で３日間振盪培養する。培養後、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１からなる移動相を用いたペーパークロマトグラフィーを行い、次いでニンヒドリン（アセトン中１％溶液）で染色し、０．５％ＣｄＣｌ2を含む５０％エタノールで化合物を溶出させ、更にＬ−グルタミン酸を５４０ｎｍで評価することにより、生産されたＬ−グルタミン酸の量を決定する。
【0148】
実施例９．Ｅ．ｃｏｌｉ ５７ΔｙｊｊＫによるＬ−ロイシンの生産
ｙｊｊＫ遺伝子不活化のＬ−ロイシン生産への影響を調べるために、前述したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの染
色体に由来するＤＮＡ断片をＰ１形質導入によりＥ．ｃｏｌｉ Ｌ−ロイシン生産株５７（ＶＫＰＭ Ｂ−７３８６、米国特許第６，１２４，１２１号）に導入して株５７ΔｙｊｊＫを得る。株５７は１９９７年５月１９日に受託番号Ｂ−７３８６でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（ＶＫＰＭ）（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ， １１７５４５ Ｍｏｓｃｏｗ， １st Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ， １）に寄託されている。
【0149】
Ｌ−アガープレート上で３７℃にて１８〜２４時間、Ｅ．ｃｏｌｉ株５７及び５７ΔｙｊｊＫを別々に培養する。種培養を得るために、スクロース（４％）が添加された２ｍＬのＬ培地（Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press）の入った２０×２００ｍｍ試験管中で、ロータリーシェーカー（２５０ｒｐｍ）を用いて３２℃で１８時間株を生育する。その後、発酵培地に０．２ｍＬの種材料（１０％）を接種する。２０×２００ｍｍ試験管中の２ｍＬの最小発酵培地中で発酵を行う。２５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃で４８〜７２時間細胞を生育する。ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１からなる移動相を用いたペーパークロマトグラフィーにより、培地中に蓄積されたＬ−ロイシンの量を測定する。
【0150】
発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）は以下の通りである。
グルコース ６０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２５．０
Ｋ2ＨＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
チアミン−ＨＣｌ ０．０１
ＣａＣＯ3 ２５．０
【0151】
グルコースは別個に滅菌する。ＣａＣＯ3は１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨは７．２に調整する。
【0152】
実施例１０．Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＪ１１４４２ΔｙｊｊＫによるＬ−リジンの生産
ｙｊｊＫ遺伝子不活化のＬ−リジン生産への影響を調べるために、前述したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの染色体に由来するＤＮＡ断片をＰ１形質導入によりＬ−リジン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＪ１１４４２に導入して株ＡＪ１１４４２ΔｙｊｊＫを得る。株ＡＪ１１４４２は１９８１年５月５日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−５０８４で工業技術院 生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）、〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号120号室）に寄託され、１９８７年１０月２９日に最初の寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１５４３で寄託されている。ｐＣＡＢＤ２プラスミドは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を脱感作する変異を有するジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするｄａｐＡ遺伝子、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を脱感作する変異を有するアスパルトキナーゼＩＩＩをコードするｌｙｓＣ遺伝子、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするｄａｐＢ遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするｄｄｈ遺伝子を含む（米国特許第６，０４０，１６０号）。
【0153】
ストレプトマイシン（２０ｍｇ／Ｌ）を含むＬ培地中で３７℃にてＥ．ｃｏｌｉ株ＡＪ１１４４２及びＡＪ１１４４２ΔｙｊｊＫを別々に培養し、得られた培養液０．３ｍＬを、５００ｍＬフラスコに入った要求される薬剤を含む２０ｍＬの発酵培地に接種する。培養は、撹拌速度１１５ｒｐｍで往復振盪機を用いて３７℃で１６時間行う。培養後、公知の方法（バイオテックアナライザーＡＳ２１０、サクラ精機株式会社製）で培地中のＬ−
リジン及び残留グルコースの量を測定する。その後、各株について消費グルコースに対してＬ−リジンの収率を計算する。
【0154】
発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）は以下の通りである。
グルコース ４０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２４．０
Ｋ2ＨＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
酵母エキス ２．０
【0155】
ＫＯＨでｐＨを７．０に調整し、培地を１１５℃で１０分間オートクレーブする。グルコース及び硫酸マグネシウムは別個に滅菌する。ＣａＣＯ3を１８０℃で２時間乾熱滅菌し、終濃度３０ｇ／Ｌで培地に加える。
【0156】
実施例１１．Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＪ１２７３９ΔｙｊｊＫによるＬ−フェニルアラニンの生産
ｙｊｊＫ遺伝子不活化のＬ−フェニルアラニン生産への影響を調べるために、前述したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの染色体に由来するＤＮＡ断片をＰ１形質導入によりフェニルアラニン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＪ１２７３９に導入して株ＡＪ１２７３９ΔｙｊｊＫを得る。株ＡＪ１２７３９は２００１年１１月６日に受託番号ＶＫＰＭ Ｂ−８１９７でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（ＶＫＰＭ）（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ， １１７５４５ Ｍｏｓｃｏｗ， １st Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ， １）に寄託され、その後、２００２年８月２３日にブダペスト条約に基づく寄託に移管されている。
【0157】
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＪ１２７３９及びＡＪ１２７３９ΔｙｊｊＫを栄養培地中で３７℃にて１８時間別々に培養し、得られた各培養液０．３ｍＬを、２０×２００ｍｍ試験管中の発酵培地３ｍＬに接種し、ロータリーシェーカーを用いて振盪しながら３７℃で４８時間培養する。培養後、培地中に蓄積されるＬ−フェニルアラニンの量を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で決定する。非蛍光指示薬を含むＳｏｒｂｆｉｌシリカゲル（Ｓｔｏｃｋ
Ｃｏｍｐａｎｙ Ｓｏｒｂｐｏｌｙｍｅｒ、ロシア連邦クラスノダール）の０．１１ｍｍ層でコーティングされた１０×１５ｃｍのＴＬＣプレートを用いる。プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝４０：４０：７：１６（ｖ／ｖ）からなる移動相でＳｏｒｂｆｉｌプレートを展開する。ニンヒドリン（２％）のアセトン溶液を発色試薬として用いる。
【0158】
発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）は以下の通りである。
グルコース ４０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 １６．０
Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
チアミン−ＨＣｌ ０．０００２
酵母エキス ２．０
チロシン ０．１２５
ＣａＣＯ3 ２０．０
【0159】
グルコース及び硫酸マグネシウムは別個に滅菌する。ＣａＣＯ3は１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨは７．０に調整する。
【0160】
実施例１２．Ｅ．ｃｏｌｉ ７０２ｉｌｖＡΔｙｊｊＫによるＬ−プロリンの生産
ｙｊｊＫ遺伝子不活化のＬ−プロリン生産への影響を調べるために、前述したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの染色体に由来するＤＮＡ断片をＰ１形質導入によりプロリン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株７０２ｉｌｖＡに導入して株７０２ｉｌｖＡΔｙｊｊＫを得る。株７０２ｉｌｖＡは２０００年７月１８日に受託番号ＶＫＰＭ Ｂ−８０１２でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（ＶＫＰＭ）（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ， １１７５４５ Ｍｏｓｃｏｗ， １st Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ， １）に寄託され、その後、２００１年５月１８日にブダペスト条約に基づく寄託に移管されている。
【0161】
Ｅ．ｃｏｌｉ株７０２ｉｌｖＡ及び７０２ｉｌｖＡΔｙｊｊＫを、Ｌ−アガープレート上で３７℃にて１８〜２４時間別々に培養する。その後、これらの株を実施例８（Ｌ−グルタミン酸の生産）と同じ条件下で培養する。
【0162】
実施例１３．Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ−３９９６ΔｙｊｊＫによるＬ−スレオニンの生産
ｙｊｊＫ遺伝子不活化のＬ−スレオニン生産への影響を調べるために、前述したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの染色体に由来するＤＮＡ断片をＰ１形質導入によりＬ−スレオニン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６に導入して株Ｂ−３９９６ΔｙｊｊＫを得る。株Ｂ−３９９６は１９８７年１１月１９日にオール・ユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチバイオティクス（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ， １１７１０５ Ｍｏｓｃｏｗ， Ｎａｇａｔｉｎｓｋａｙａ Ｓｔｒｅｅｔ， ３−Ａ）に受託番号ＲＩＡ １８６７で寄託されている。この株は更に、受託番号Ｂ−３９９６でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（ＶＫＰＭ）（住所 Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ， １１７５４５ Ｍｏｓｃｏｗ， １st
Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ， １）に寄託されている。
【0163】
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｂ−３９９６及びＢ−３９９６ΔｙｊｊＫの両方をＬ−アガープレート上で３７℃にて１８〜２４時間別々に培養する。種培養を得るために、ロータリーシェーカー（２５０ｒｐｍ）を用いて３２℃で１８時間、グルコース（４％）を添加した２ｍＬのＬ培地（Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press）を含む２０×２００ｍｍ試験管中で株を生育する。その後、発酵培地に種材料０．２ｍＬ（１０％）を接種する。発酵は２０×２００ｍｍ試験管中の２ｍＬの最小培地中で行われる。２５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃で６５時間細胞を生育する。
【0164】
培養後、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）からなる移動相を用いたペーパークロマトグラフィーにより、培地中に蓄積されたＬ−スレオニンの量を決定する。ニンヒドリン（２％）のアセトン溶液を発色試薬として用いる。Ｌ−スレオニンを含むスポットを切り取り、ＣｄＣｌ2の０．５％水溶液でＬ−スレオニンを溶出させ、Ｌ−スレオニンの量を５４０ｎｍの分光測定により評価する。
【0165】
発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）は以下の通りである。
グルコース ８０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２２．０
ＮａＣｌ ０．８
ＫＨ2ＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．８
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０２
チアミン−ＨＣｌ ０．０００２
酵母エキス １．０
ＣａＣＯ3 ３０．０
【0166】
グルコース及び硫酸マグネシウムは別個に滅菌する。ＣａＣＯ3は１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨは７．０に調整する。滅菌後に抗生物質を培地に導入する。
【0167】
実施例１４．Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）ΔｙｊｊＫによるＬ−トリプトファンの生産
ｙｊｊＫ遺伝子不活化のＬ−トリプトファン生産への影響を調べるために、前述したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの染色体に由来するＤＮＡ断片をＰ１形質導入によりＬ−トリプトファン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）に導入して株ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）ΔｙｊｊＫを得る。株ＳＶ１６４は、トリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸合成酵素をコードするｔｒｐＥアレルを有する。プラスミドｐＧＨ５は、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする変異体ｓｅｒＡ遺伝子を有する。株ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）は米国特許第６，１８０，３７３号又は欧州特許第０６６２１４３（Ｂ１）号に詳細に記載されている。
【0168】
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）及びＳＶ１６４（ｐＧＨ５）ΔｙｊｊＫを、テトラサイクリン（２０ｍｇ／Ｌ、ｐＧＨ５プラスミドのマーカー）を添加した栄養培地３ｍＬ中で３７℃にて１８時間、別々に振盪培養する。得られた培養液（それぞれ０．３ｍＬ）を、２０×２００ｍｍ試験管に入ったテトラサイクリン（２０ｍｇ／Ｌ）を含む発酵培地３ｍＬに接種し、ロータリーシェーカーを２５０ｒｐｍで用いて３７℃で４８時間培養する。培養後、培地中に蓄積されたＬ−トリプトファンの量を実施例１１（Ｌ−フェニルアラニンの生産）に記載したようにＴＬＣで決定する。発酵培地成分を表３に示すが、これらの成分は、示されているように、滅菌中の不都合な相互作用を回避するために別々のグループ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＨ）で滅菌すべきである。
【0169】
【表3】
【0170】
実施例１５．Ｅ．ｃｏｌｉ ３８２ΔａｒｇＧΔｙｊｊＫによるＬ−シトルリンの生産
ｙｊｊＫ遺伝子不活化のＬ−シトルリン生産への影響を調べるために、前述したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの染色体に由来するＤＮＡ断片をＰ１形質導入によりＬ−シトルリン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株３８２ΔａｒｇＧに導入して株３８２ΔａｒｇＧΔｙｊｊＫを得る。株３８２ΔａｒｇＧは、Datsenko K.A. and Wanner B.L.に最初に開発された「λＲｅｄ／ＥＴ仲介インテグレーション」と呼ばれる方法（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）により３８２株（ＶＫＰＭ Ｂ−７９２６）の染色体上のａｒｇＧ遺伝子を欠失させることにより得られたものである。この手法に従い、ａｒｇＧ遺伝子に隣接する両方の領域に相同なＰＣＲプライマー及び鋳型プラスミド中の抗生物質耐性を付与する遺伝子を構築する。プラスミドｐＭＷ１１８−λａｔｔＬ−ｃａｔ−λａｔｔＲ（国際公開第０５／０１０１７５号）をＰＣＲ反応の鋳型として用いる。
【0171】
Ｅ．ｃｏｌｉ株３８２ΔａｒｇＧ及び３８２ΔａｒｇＧΔｙｊｊＫの両方を３ｍＬの栄養培地中で３７℃にて１８時間、別々に振盪培養し、得られた培養液０．３ｍＬを、２０×２００ｍｍ試験管に入った発酵培地２ｍＬ中に接種し、ロータリーシェーカーを用いて
３２℃で４８時間培養する。
【0172】
培養後、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）からなる移動相を用いたペーパークロマトグラフィーにより、培地中に蓄積されたＬ−シトルリンの量を決定する。ニンヒドリン（２％）のアセトン溶液を発色試薬として用いる。シトルリンを含むスポットを切り取り、ＣｄＣｌ2の０．５％水溶液でＬ−シトルリンを溶出させ、Ｌ−シトルリンの量を５４０ｎｍの分光測定により評価する。
【0173】
発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）は以下の通りである。
グルコース ４８．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３５．０
ＫＨ2ＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
チアミン−ＨＣｌ ０．０００２
酵母エキス １．０
Ｌ−イソロイシン ０．１
Ｌ−アルギニン ０．１
ＣａＣＯ3 ５．０
【0174】
グルコース及び硫酸マグネシウムを別々に滅菌する。ＣａＣＯ3は１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨは７．０に調整する。
【0175】
実施例１６．Ｅ．ｃｏｌｉ ３８２ΔａｒｇＦΔａｒｇＩΔｙｊｊＫによるＬ−オルニチンの生産
ｙｊｊＫ遺伝子不活化のＬ−オルニチン生産への影響を調べるために、前述したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔａｔｔＢｐｈｉ８０ ｎａｔｉｖｅ ΔｙｊｊＫ：：ＫｍRの染色体に由来するＤＮＡ断片をＰ１形質導入によりＬ−オルニチン生産Ｅ．ｃｏｌｉ株３８２ΔａｒｇＦΔａｒｇＩに導入して株３８２ΔａｒｇＦΔａｒｇＩΔｙｊｊＫを得る。株３８２ΔａｒｇＦΔａｒｇＩは、Datsenko K.A. and Wanner B.L.に最初に開発された「λＲｅｄ／ＥＴ仲介インテグレーション」と呼ばれる方法（Datsenko K.A. and Wanner
B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）による３８２株（ＶＫＰＭ Ｂ−７９２６）の染色体上のａｒｇＦ及びａｒｇＩ遺伝子の連続的欠失により得られたものである。この手法に従い、ａｒｇＦ又はａｒｇＩ遺伝子に隣接する両方の領域に相同な２組のＰＣＲプライマー及び鋳型プラスミド中の抗生物質耐性を付与する遺伝子を構築する。プラスミドｐＭＷ１１８−λａｔｔＬ−ｃａｔ−λａｔｔＲ（国際公開第０５／０１０１７５号）をＰＣＲ反応の鋳型として用いる。
【0176】
Ｅ．ｃｏｌｉ株３８２ΔａｒｇＦΔａｒｇＩ及び３８２ΔａｒｇＦΔａｒｇＩΔｙｊｊＫの両方を、３ｍＬの栄養培地中で３７℃にて１８時間、別々に振盪培養し、得られた培養液０．３ｍＬを、２０×２００ｍｍ試験管に入った２ｍＬの発酵培地に接種し、ロータリーシェーカーを用いて３２℃で４８時間培養する。
【0177】
培養後、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）からなる移動相を用いたペーパークロマトグラフィーにより、培地中に蓄積されたオルニチンの量を決定する。ニンヒドリン（２％）のアセトン溶液を発色試薬として用いる。オルニチンを含むスポットを切り取り、ＣｄＣｌ2の０．５％水溶液でオルニチンを溶出させ、オルニチンの量を５４０ｎｍの分光測定により評価する。
【0178】
発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）は以下の通りである。
グルコース ４８．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３５．０
ＫＨ2ＰＯ4 ２．０
ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ １．０
チアミン−ＨＣｌ ０．０００２
酵母エキス １．０
Ｌ−イソロイシン ０．１
Ｌ−アルギニン ０．１
ＣａＣＯ3 ５．０
【0179】
グルコース及び硫酸マグネシウムは別個に滅菌する。ＣａＣＯ3は１８０℃で２時間乾熱滅菌する。ｐＨは７．０に調整する。
【0180】
本発明を、その好ましい実施形態を参照して詳細に説明したが、発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更及び均等物の使用が可能であることは当業者に明らかであろう。本明細書中で引用した全ての参考文献を参照により本願に援用する。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]
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