特許 6461804 広域中和抗ＨＩＶ抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6461804

(24)【登録日】2019年1月11日

(45)【発行日】2019年1月30日

(54)【発明の名称】広域中和抗ＨＩＶ抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/10 20060101AFI20190121BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20190121BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20190121BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20190121BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20190121BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20190121BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20190121BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20190121BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20190121BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20190121BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20190121BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/10ZNA

   C12N15/13

   C12N15/63 Z

   C12N1/19

   C12N1/15

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K39/395 S

   A61P31/18

   A61K45/00

   G01N33/569 H

【請求項の数】13

【全頁数】71

(21)【出願番号】特願2015-538060(P2015-538060)

(86)(22)【出願日】2013年10月18日

(65)【公表番号】特表2015-534982(P2015-534982A)

(43)【公表日】2015年12月7日

(86)【国際出願番号】US2013065696

(87)【国際公開番号】WO2014063059

(87)【国際公開日】20140424

【審査請求日】2016年7月4日

(31)【優先権主張番号】61/715,642

(32)【優先日】2012年10月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】592054292

【氏名又は名称】ザ ロックフェラー ユニバーシティー

(73)【特許権者】

【識別番号】314005562

【氏名又は名称】カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】八田国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ムーケット，ヒューゴ

(72)【発明者】

【氏名】ヌッセンツヴァイク，ミッチェル

(72)【発明者】

【氏名】ビヨークマン，パメラ，ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】シャーフ，ルイーズ

【審査官】 市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０３０９０４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３が、配列番号６９〜７４のアミノ酸配列、配列番号３９〜４４のアミノ酸配列、配列番号５１〜５６のアミノ酸配列、配列番号５７〜６２のアミノ酸配列、配列番号６３〜６８のアミノ酸配列、配列番号７５〜８０のアミノ酸配列、配列番号８１〜８６のアミノ酸配列、配列番号８７〜９２のアミノ酸配列、配列番号９３〜９８のアミノ酸配列、配列番号９９〜１０４のアミノ酸配列、および配列番号１３１〜１３６のアミノ酸配列から成る群より選択されるＣＤＲセットのそれぞれの配列を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分。

【請求項2】

重鎖および軽鎖が、配列番号１３〜１４のアミノ酸配列、配列番号３〜４のアミノ酸配列、配列番号７〜８のアミノ酸配列、配列番号９〜１０のアミノ酸配列、配列番号１１〜１２のアミノ酸配列、配列番号１５〜１６のアミノ酸配列、配列番号１７〜１８のアミノ酸配列、配列番号１９〜２０のアミノ酸配列、配列番号２１〜２２のアミノ酸配列、配列番号２３〜２４のアミノ酸配列、および配列番号１２９〜１３０のアミノ酸配列のそれぞれの配列を含む、請求項１に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分。

【請求項3】

前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１または２に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分のＣＤＲ、重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする配列を含む、単離された核酸。

【請求項5】

請求項４に記載の核酸を含むベクター。

【請求項6】

請求項５に記載のベクターを含む培養細胞。

【請求項7】

（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分と（ｉｉ）医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項8】

ＨＩＶ感染症またはＨＩＶ関連疾患を予防または治療する方法において使用するための医薬組成物であって、
前記方法が、
かかる予防または治療を必要とする患者を同定する工程；および
治療有効量の請求項１〜３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分、を含む第一の治療薬を前記患者に投与する工程
を含む、医薬組成物。

【請求項9】

第二の治療薬を投与する工程をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記第二の治療薬が、抗ウイルス薬である、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

請求項６に記載の培養細胞を得る工程、
前記細胞を、前記ベクターによってコードされているポリペプチドを発現できる条件下および抗体またはその断片の構築する条件下、培地中で培養する工程、ならびに
前記抗体またはその断片を前記培養細胞または前記細胞の培地から精製する工程
を含む、抗ＨＩＶ抗体またはその断片の作製方法。

【請求項12】

医薬的有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離された抗ＨＩＶ抗体の医薬的に許容される投与単位と、
医薬的有効量の抗ＨＩＶ剤の医薬的に許容される投与単位と
を含み、
前記２つの医薬的に許容される投与単位が、単一の医薬的に許容される投与単位の形態を任意にとることができる、キット。

【請求項13】

前記抗ＨＩＶ剤が、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、侵入または融合阻害剤、およびインテグラーゼ阻害剤から成る群より選択されるものである、請求項１２に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に従って、２０１２年１０月１８日出願の米国特許仮出願第６１／７１５，６４２号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に援用する。

【0002】

連邦政府支援の研究または開発に関する陳述
本明細書に開示する発明は、少なくとも一部は、アメリカ国立衛生研究所からの助成番号Ｐ０１ ＡＩ０８１６７７のもと政府支援によりなされた。したがって、アメリカ合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。

【0003】

本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）に対する広域かつ強力な抗体に関する。

【背景技術】

【0004】

ＨＩＶは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こし、生命を危うくする日和見感染および悪性疾患をもたらす、消耗症候群、中枢神経系変性および強い免疫抑制をはじめとする臨床像を特徴とする、ヒトにおける状態である。１９８１年のその発見以来、ＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）により、世界中で少なくとも２千５００万人が死亡している。ＨＩＶ感染がたとえ毎年２．５％減少したとしても、今後２０年にわたって２〜６千万人が感染することになると予測される。ＨＩＶ感染の治療または抑制のための治療薬および方法が必要とされている。

【0005】

一部のＨＩＶ感染者は、彼らの血清中に広域中和ＩｇＧ抗体を見せる。しかし、これらの抗体の特異性および活性に関しては、有効なワクチンを設計する上でのそれらの潜在的重要性にもかかわらず、殆ど判っていない。動物モデルにおいて、中和抗体の受動伝達は、ウイルス攻撃に対する防御の一因となり得る。中和抗体応答は、ＨＩＶ感染者においても発現され得るが、血清応答の詳細な構成は、まだ十分に明らかにされていない。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、広域中和抗ＨＩＶ抗体の新規カテゴリーに関する。前記抗体のコンセンサス重および軽鎖アミノ酸配列を下に列挙するとともに、図３ａおよび３ｂに示す：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＳＶＳＧＸ_１ＳＸ_２Ｘ_３ＤＸ_４ＹＷＳＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＶＨＤＳＧＤＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＸ_５Ｘ_６ＳＬＤＴＳＫＮＱＶＳＬＫＬＸ_７Ｘ_８ＶＴＡＡＤＳＡＸ_９ＹＹＣＡＲＡＸ_１０ＨＧＸ_１１ＲＩＹＧＩＶＡＦＧＥＸ_１２ＦＴＹＦＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１）
ＳＸ_１ＶＲＰＱＰＰＳＬＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＸ_２ＣＧＥＸ_３ＳＬＧＳＲＡＶＱＷＹＱＱＲＰＧＱＡＰＳＬＩＩＹＮＮＱＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＰＤＸ_４Ｘ_５ＦＧＴＴＡＴＬＴＩＴＸ_６ＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＨＩＷＤＳＲＸ_７ＰＴＸ_８ＷＶＦＧＧＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号２）。

【0007】

配列番号１または２の配列において、各「Ｘ」は、いずれのアミノ酸残基であってもよく、またはアミノ酸がなくてもよい。好ましくは、各Ｘは、図３ａおよび３ｂに示すようなクローナル変異体１０−２５９、１０−３０３、１０−４１０、１０−８４７、１０−９９６、１０−１０７４、１０−１１２１、１０−１１３０、１０−１１４６、１０−１３４１および１０−１３６９、ならびに１０−１０７４抗体の人工修飾バージョン、１０−１０７４ＧＭ、の対応する位置の残基であり得る。

【0008】

したがって、本発明の１つの態様は、配列番号３３〜３８から成る群より選択される配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分を特徴とするが、ただし、前記抗体が、抗体ＰＧＴ−１２１、１２２または１２３でないことを条件とする。配列番号３３〜３８は、図３ａおよび３ｂに示すようなＫａｂａｔシステムによる重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）１〜３および軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）１〜３の配列を指す。１つの実施形態において、前記ＣＤＲは、配列番号３９〜１０４から成る群より選択される配列、すなわち、下記表１に示すようなＫＡＢＡＴシステムによるＣＤＲ配列を含有することができる。あるいは、前記ＣＤＲは、下記表１に示すようなＩＭＧＴシステムによる、それらの対応する抗体のＣＤＲ配列から選択される配列を含有することができる。

【0009】

１つの実施形態において、前記単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含有し、この際前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、配列番号３３〜３５のそれぞれの配列を含む。前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、配列番号３９〜４１、配列番号４５〜４７、配列番号５１〜５３、配列番号５７〜５９、配列番号６３〜６５、配列番号６９〜７１、配列番号７５〜７７、配列番号８１〜８３、配列番号８７〜８９、配列番号９３〜９５、配列番号９９〜１０１、および配列番号１３１〜１３３から成る群より選択されるＣＤＲＨセットのそれぞれの配列も含むことができる。あるいは、前記ＣＤＲＨは、下記表１に示すようなＩＭＧＴシステムによる、それらの対応する抗体のＣＤＲ配列から選択されるそれぞれの配列を含有することができる。

【0010】

別の実施形態において、前記単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含有し、この際前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、配列番号３６〜３８のそれぞれの配列を含む。例えば、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、配列番号４２〜４４、配列番号４８〜５０、配列番号５４〜５６、配列番号６０〜６２、配列番号６６〜６８、配列番号７２〜７４、配列番号７８〜８０、配列番号８４〜８６、配列番号９０〜９２、配列番号９６〜９８、配列番号１０２〜１０４、および配列番号１３４〜１３６から成る群より選択されるＣＤＲＬセットのそれぞれの配列を含むことができる。あるいは、前記ＣＤＲＬは、下記表１に示すようなＩＭＧＴシステムによる、それらの対応する抗体のＣＤＲ配列から選択されるそれぞれの配列を含有することができる。

【0011】

さらにもう１つの実施形態において、上述の単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分は、（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む。前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、配列番号３９〜４４、配列番号４５〜５０、配列番号５１〜５６、配列番号５７〜６２、配列番号６３〜６８、配列番号６９〜７４、配列番号７５〜７９、配列番号８１〜８６、配列番号８７〜９２、配列番号９３〜９８、配列番号９９〜１０４、および配列番号１３１〜１３６から成る群より選択されるＣＤＲセットのそれぞれの配列を含むことができる。あるいは、前記ＣＤＲＨおよびＣＤＲＬは、下記表１に示すようなＩＭＧＴシステムによる、それらの対応する抗体のＣＤＲ配列から選択されるそれぞれの配列を含有することができる。

【0012】

さらなる実施形態において、前記単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分は、（ｉ）配列番号１のコンセンサスアミノ酸配列を有する重鎖および（ｉｉ）配列番号２のコンセンサスアミノ酸配列を有する軽鎖の、一方または両方を含有する。前記重鎖は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および１２９から成る群より選択される配列を含有することができ、および前記軽鎖は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および１３０から成る群より選択される配列を含有することができる。例えば、前記重鎖および前記軽鎖は、配列番号３〜４、配列番号５〜６、配列番号７〜８、配列番号９〜１０、配列番号１１〜１２、配列番号１３〜１４、配列番号１５〜１６、配列番号１７〜１８、配列番号１９〜２０、配列番号２１〜２２、配列番号２３〜２４、および１２９〜１３０のそれぞれの配列を含むことができる。

【0013】

好ましい実施形態において、前記単離された抗ＨＩＶ抗体は、１０−２５９、１０−３０３、１０−４１０、１０−８４７、１０−９９６、１０−１０７４、１０−１０７４ＧＭ、１０−１１２１、１０−１１３０、１０−１１４６、１０−１３４１、および１０−１３６９から成る群より選択されるものである。それらの対応する重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＤＲＨ１〜３およびＣＤＲＬ１〜３を図３ａおよび３ｂに示す。さらに好ましい実施形態において、前記単離された抗ＨＩＶ抗体は、１０−１０７４様抗体、すなわち、１０−８４７、１０−９９６、１０−１０７４、１０−１０７４ＧＭ、１０−１１４６、および１０−１３４１からなる群より選択されるものである。この群の抗体は、現在のウイルスを中和する点でＰＧＴ１２１より強力である。上で論じた抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であることができる。

【0014】

第二の態様において、本発明は、上で論じた抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分、のＣＤＲ、重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする配列を有する、単離された核酸を提供する。前記核酸を有するベクター、および前記ベクターを有する培養細胞も特徴とする。

【0015】

前記核酸、ベクターおよび培養細胞を、抗ＨＩＶ抗体またはその断片を作るための方法に用いることができる。この方法は、数ある中でも、上述の培養細胞を得る工程、前記細胞を、そのベクターによってコードされているポリペプチドの発現および抗体またはその断片の構築を可能にする条件下で培地において培養する工程、および前記抗体または断片を前記培養細胞または前記細胞の培地から精製する工程を含む。

【0016】

第三の態様において、本発明は、（ｉ）上述の少なくとも１つの抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分と（ｉｉ）医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。

【0017】

第四の態様において、本発明は、ＨＩＶ感染またはＨＩＶ関連疾患を予防または処置する方法を提供する。この方法は、数ある中でも、かかる予防または治療を必要とする患者を特定するステップ；および治療有効量の上述の少なくとも１つの抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分、を含有する第一の治療薬を前記患者に投与するステップを含む。前記方法は、第二の治療薬、例えば、抗ウイルス薬を投与するステップをさらに含むことができる。

【0018】

第五の態様において、本発明は、医薬的有効量の上述の少なくとも１つの単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分、の医薬的に許容される投与単位と、医薬的有効量の抗ＨＩＶ薬の医薬的に許容される投与単位とを有するキットを提供する。前記２つの医薬的に許容される投与単位は、単一の医薬的に許容される投与単位の形態を場合によってはとることができる。例示的抗ＨＩＶ薬は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、侵入または融合阻害剤、およびインテグラーゼ阻害剤から成る群より選択されるものであることができる。

【0019】

第六の態様において、本発明は、被検体におけるＨＩＶ感染の診断、予後または治療モニタリング用のキットを提供する。前記キットは、被検体からの生体試料中の抗ＨＩＶ中和抗体に特異的に結合する１つ以上の検出試薬を含有する。前記キットは、ＰＣＲまたは質量分析を行うための試薬をさらに含むことができる。

【0020】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細を下の説明の中で述べる。本発明の他の特徴、目的および利点は、その説明およびクレームからはっきりするであろう。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1-1】ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様変異体の中和活性を示す図である。（Ａ）ＴＺＭ−ｂｌアッセイにおけるＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体の中和効力を比較するヒートマップ。より濃い色＝より強力な中和；白色＝中和なし。（Ｂ）９ウイルスに対する平均ＩＣ_８０（ｙ軸）とｇｐ１２０およびｇｐ１４０への結合についての見かけのＫ_Ｄ値（ｘ軸）の間の相関関係。

【図1-2】ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様変異体の中和活性を示す図である。（Ｃ）１１９ウイルスの拡張パネルに対するＴＺＭ−ｂｌアッセイにおけるＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−１０７４抗体の中和幅および効力を比較するグラフ。ｙ軸は、ｘ軸上に示されている濃度までのＩＣ_５０値の累積度数を示す。クモの巣グラフ（左上角）は、ＨＩＶ−１クレードによる中和されたウイルスの度数分布を示す。（Ｄ）モル中和率（ＭＮＲ；ＦａｂとＩｇＧのＩＣ_５０濃度比）を示すドットプロット。水平のバーは、全ウイルスの平均ＩＣ_５０を表す。

【図1-3】ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様変異体の中和活性を示す図である。（Ｅ）過去（Ｈｉｓｔ．）および現在（Ｃｏｎｔ．）の抗体陽転者から単離したウイルスに対するＰＧＴ１２１（濃い灰色）および１０−１０７４（薄い灰色）の中和効力を比較する棒グラフ。ｎｓ、有意でない；＊＊、ｐ＜０．００５。ＰＧＴ１２１および１０−１０７４による現在のウイルスの中和についての中央値ＩＣ_５０間の倍数での差（ｆｏｌｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を示す。

【図2】ＰＧＴ１２１_ＧＭおよび１０−１０７４_ＧＭ突然変異体抗体の結合および中和活性を示す図である。（Ａ）１０−１０７４、ＰＧＴ１２１、ＰＧＴ１２１_ＧＭおよび１０−１０７４_ＧＭ抗体とｇｐ１２０およびｇｐ１４０との結合についての見かけのＫ_Ｄ値を比較する棒グラフ。エラーバーは、３回の独立した実験から得たＫ_Ｄ値のＳＥＭを示す。「野生型」対「グリコミュータント（ｇｌｙｃｏｍｕｔａｎｔ）」抗体のＫ_Ｄ値間の倍数での差を示す。（Ｂ）グリカン（図７Ａ）のＰＧＴ１２１および１０−１０７４による結合と突然変異体抗体（ＰＧＴ１２１_ＧＭおよび１０−１０７４_ＧＭ）による結合とを比較する棒グラフ。結合の数値スコアを、１スポットにつき５ｆｍｏｌで整列させたプローブについての蛍光強度（２反復スポットでの平均）として測定する。（Ｃ）４０ウイルスのパネルに対するＴＺＭ−ｂｌアッセイにおけるＰＧＴ１２１、ＰＧＴ１２１_ＧＭ、１０−１０７４および１０−１０７４_ＧＭ抗体の中和幅および効力を比較するカバレッジグラフ。

【図3-1】ＰＧＴ１２１および１０−１０７４クローナル変異体の配列アラインメントを示す図である。（Ａ）ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体の重鎖（ＩｇＨ）ならびにすべてのクローナル変異体についての推定生殖細胞系（ＧＬ）ＶＨのアミノ酸アラインメント。Ｋａｂａｔ（．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２（２）：２１１−２５０）およびＩＭＧＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１００６−１０１２）により定義された、結晶構造、フレームワーク（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）に基づくアミノ酸番号付けを示す。カラー陰影は、酸性（赤色）、塩基性（青色）およびチロシン（緑色）アミノ酸を示す。

【図3-2】ＰＧＴ１２１および１０−１０７４クローン変異体の配列アラインメントを示す図である。（Ｂ）Ａと同じだが、軽鎖（ＩｇＬ）についてのもの。

【図4】ＰＧＴ１２１および１０−１０７４クローナル変異体の結合親和性を示す図である。（Ａ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定したＰＧＴ１２１ ＩｇＧ抗体変異体とＹＵ−２ ｇｐ１４０およびｇｐ１２０リガンドとの相互作用の結合親和性。Ｍ、ｍｏｌ／Ｌ；ｓ、秒；ＲＵ、応答単位；／、検出された結合なし。カイ^２値（Χ^２）＜１０は、曲線へのフィッティングに用いた１：１結合モデルが実験データを十分に説明することを示す。示されている平衡および速度定数は、ＩｇＧの二価結合の結果として生ずる結合活性効果を説明するための「見かけの」定数と考えられる。（Ｂ）ＰＧＴ１２１様（青色陰影）および１０−１０７４様（緑色陰影）についての会合（ｋ_ａ）および解離（ｋ_ｄ）速度定数を示すドットプロット。（Ｃ）ＩｇＧ抗体のｇｐ１２０およびｇｐ１４０へのそれらの結合についてのｋ_ａおよびｋ_ｄ値（ｘ軸）を、表４に示す９ウイルスに対するそれらの中和効力（平均ＩＣ_８０値）（ｙ軸）に対して比較する線形回帰グラフ。

【図5-1】ｇｐ１２０「コア」タンパク質、ｇｐ１２０^{ＧＤ３２４−５ＡＡ}突然変異体および線状ｇｐ１２０^Ｖ３ペプチドへのＰＧＴ１２１変異体の結合を示す図である。（Ａ）無傷のＹＵ−２ ｇｐ１２０と比較したＨＸＢ２ ｇｐ１２０^コアおよび２ＣＣ−コアタンパク質へのＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体のＥＬＩＳＡベースの結合分析。ｘ軸は、ｙ軸上に示されているＥＬＩＳＡ値（ＯＤ_{４０５ｎｍ}）を得るために要した抗体濃度（Ｍ）を示す。抗ＣＤ４ｂｓ抗体ＶＲＣ０１（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９（５９９３）：８５６−８６１）、抗Ｖ３ループ抗体１０−１８８（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（９）：ｅ２４０７８）および非ＨＩＶ反応性抗体ｍＧＯ５３（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１（５６３８）：１３７４−１３７７）を対照として使用した。すべての実験を少なくとも２反復で行った。代表データを示す。

【図5-2】ｇｐ１２０「コア」タンパク質、ｇｐ１２０^{ＧＤ３２４−５ＡＡ}突然変異体および線状ｇｐ１２０^Ｖ３ペプチドへのＰＧＴ１２１変異体の結合を示す図である。（Ｂ）（Ａ）と同じだが、ｇｐ１２０^{ＧＤ３２４−５ＡＡ}突然変異体タンパク質への結合についてのもの。すべての実験を少なくとも２回行った。代表データを示す。

【図5-3】ｇｐ１２０「コア」タンパク質、ｇｐ１２０^{ＧＤ３２４−５ＡＡ}突然変異体および線状ｇｐ１２０^Ｖ３ペプチドへのＰＧＴ１２１変異体の結合を示す図である。（ｃ）ｇｐ１２０^{Ｖ３−Ｃ３}オーバーラッピングペプチドに対するＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体ならびに対照抗体（陽性対照、１０−１８８、１−７９、２−５９および２−１２６１（Ｎａｔｕｒｅ ４５８（７２３８）：６３６−６４０））および陰性対照、ｍＧＯ５３）のＥＬＩＳＡ反応性を比較する棒グラフ。ｙ軸は、２μｇ／ｍＬのＩｇＧ抗体を試験することによって得たＥＬＩＳＡ値（ＯＤ_{４０５ｎｍ}）を示す。個々のペプチドのアミノ酸配列を右下に示す。すべての実験を少なくとも２回行った。代表データを示す。

【図6-1】ｇｐ１２０グリコシル化突然変異体および脱グリコシル化ｇｐ１２０へのＰＧＴ１２１の結合を示す図である。（Ａ）ｇｐ１２０、ｇｐ１２０^{ＮＮＴ３０１−３０３ＡＡＡ}、ｇｐ１２０^{Ｎ３３２Ａ}およびｇｐ１２０^{Ｎ３３２Ａ／ＮＮＴ３０１−３０３ＡＡＡ}へのＰＧＴ１２１および１０−１０７４抗体変異体のＥＬＩＳＡベースの結合分析。ｘ軸は、ｙ軸上に示されているＥＬＩＳＡ値（ＯＤ_{４０５ｎｍ}）を得るために要した抗体濃度（Ｍ）を示す。黒色断続線および連続線は、陽性（１０−１８８）および陰性（ｍＧＯ５３）抗体対照群の４つの抗原に対する平均反応性を示す。すべての実験を少なくとも２回行った。

【図6-2】ｇｐ１２０グリコシル化突然変異体および脱グリコシル化ｇｐ１２０へのＰＧＴ１２１の結合を示す図である。（Ｂ）未処理ｇｐ１２０（ＷＴ、野生型）、ＰＮＧａｓｅＦ消化ｇｐ１２０およびＥｎｄｏＨ消化ｇｐ１２０を比較する銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｌ、プロテインラダー。すべての実験を少なくとも２回行った。

【図6-3】ｇｐ１２０グリコシル化突然変異体および脱グリコシル化ｇｐ１２０へのＰＧＴ１２１の結合を示す図である。（Ｃ）（Ａ）と同じだが、未処理ｇｐ１２０とＰＮＧａｓｅ Ｆ処理ｇｐ１２０を比較するもの。すべての実験を少なくとも２回行った。

【図6-4】ｇｐ１２０グリコシル化突然変異体および脱グリコシル化ｇｐ１２０へのＰＧＴ１２１の結合を示す図である。（Ｄ）（Ａ）と同じだが、未処理ｇｐ１２０とＥｎｄｏＨ処理ｇｐ１２０を比較するもの。すべての実験を少なくとも２回行った。

【図7-1】グリカンへのＰＧＴ１２１および１０−１０７４クローナル変異体の結合を示す図である。（Ａ）Ｎ−グリカンへの直接結合をＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体について調査するためのグリカンマイクロアレイ分析において使用した１５ Ｎ−グリカンプローブのセットの単糖類配列。ＤＨは、Ｎ−グリカンが還元アミノ化によって結合された脂質タグ１，２−ジヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）を示す。注目すべき重要な特徴は、（ｉ）ＰＧＴ１２１群抗体は、１−３結合によってコアマンノースに連結されたガラクトース末端アンテナを有するモノアンテナＮ−グリカンプローブ１０（Ｎ２）を結合したが、コアマンノースに１−６結合されたアンテナを有する異性体Ｎ−グリカンプローブ１１（指定Ｎ４）を結合しなかったこと；（ｉｉ）バイアンテナプローブ１３（ＮＡ２）の場合と同様に、このガラクトース末端１−６結合アンテナの存在は、結合を許容し、（α２−３結合ではなく）α２−６結合シアル酸の存在も許容したこと、（ｉｉｉ）ガラクトースがなく、Ｎ−アセチルグルコサミンで終わる、バイアンテナプローブ１２（ＮＧＡ２）は、結合されなかった、ことである。

【図7-2】グリカンへのＰＧＴ１２１および１０−１０７４クローン変異体の結合を示す図である。（Ｂ）ＰＧＴ１２１様、１０−１０７４様および生殖細胞系列型（ＧＬ）抗体によるグリカン結合を比較する棒グラフ。１０−１８８、すなわち抗Ｖ３ループ抗体、を陰性対照として使用した。結合の数値スコアを１スポットにつき２ｆｍｏｌ（白色）および５ｆｍｏｌ（灰色）で配列したプローブについての蛍光強度（２回のスポットでの平均）として測定した。

【図8-1】高マンノースのみの（ｈｉｇｈ−ｍａｎｎｏｓｅ−ｏｎｌｙ）ｇｐ１２０およびウイルスに対する抗体結合および中和活性を示す図である。（Ａ）キフネンシンで処理した細胞において生産されたＹＵ−２ ｇｐ１２０（ｇｐ１２０_ｋｉｆ）と未処理細胞において生産されたｇｐ１２０（ＷＴ、野生型）を比較する銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｌ、プロテインラダー。（Ｂ）ＹＵ−２ ｇｐ１２０（ｇｐ１２０_ＷＴ）およびｇｐ１２０_ｋｉｆへのＰＧＴ１２１様（青色ラベル）および１０−１０７４様（緑色ラベル）抗体の結合のＥＬＩＳＡ比較。ｘ軸は、ｙ軸に示されているＥＬＩＳＡ値（ＯＤ_{４０５ｎｍ}）を得るために要した抗体濃度（Ｍ）を示す。

【図8-2】高マンノースのみの（ｈｉｇｈ−ｍａｎｎｏｓｅ−ｏｎｌｙ）ｇｐ１２０およびウイルスに対する抗体結合および中和活性を示す図である。（Ｃ）キフネンシンの存在（ウイルス_ｋｉｆ）または不在（ウイルス_ＷＴ）下で生産された選択ＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性シュードウイルスに対して評価したＰＧＴ１２１についての中和曲線。水平断続線は５０％中和を示し、ＩＣ_５０値をｘ軸上の抗体濃度から得ることができる。実験を３回行った。エラーバーは、３回測定のＳＤを示す。（Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ^−／−細胞（ウイルス_ＧｎＴ^−／−）においてまたは野生型細胞（ウイルス_ＷＴ）において生産されたＹＵ−２およびＰＶＯ．４シュードウイルスに対する選択抗体の中和活性を比較する棒グラフ。ｙ軸は、ｘ軸上に示されているウイルスの中和についての平均ＩＣ_５０値（μｇ／ｍＬ）を示す。エラーバーは、２回の独立した実験から得たＩＣ_５０値のＳＥＭを示す。

【図9-1】ＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−１０７４の中和活性を示す図である。（Ａ）示されているＨＩＶ−１クレードのウイルスに対するＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−７４の（ＴＺＭ−ｂｌアッセイおよび１１９シュードウイルスのパネルを使用して決定した）中和効力を比較するグラフ。ｘ軸は、５０％中和（ＩＣ_５０）を達成するために要した抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。ｙ軸は、ｘ軸上に示されている濃度までのＩＣ_５０値の累積度数を示す。

【図9-2】ＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−１０７４の中和活性を示す図である。（Ｂ）ＴＺＭ−ｂｌ中和アッセイによって決定したときの１１９ウイルスの拡張パネルに対するＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−１０７４の中和幅および効力を比較するグラフ。ｙ軸は、ｘ軸上に示されている濃度までのＩＣ_８０値の累積度数を示す。

【図9-3】ＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−１０７４の中和活性を示す図である。（Ｃ）グラフは、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４による選択ウイルスの中和曲線を示す。水平断続線は５０％中和を示し、ＩＣ_５０値をｘ軸上の抗体濃度から得ることができる。実験を３回行った。エラーバーは、３回測定のＳＤを示す。

【図10】過去対現在のクレードＢウイルスに対する中和活性を示す図である。選択ｂＮＡｂについての過去（Ｈｉｓｔ．）と、現在（Ｃｏｎｔ．）の抗体陽転者から単離したクレードＢウイルスに対する中和効力とを比較するドットプロット。水平バーは、患者１人あたりの全ウイルスについての中央値ＩＣ_５０を表す。群間差をマン・ホイットニー検定を用いて評価した。ｎｓ、有意でない。

【図11】１１広域作用性抗ＨＩＶ−１ ｍＡｂのパネルでの２つのＲ５指向性ＳＨＩＶの中和を示す表である。ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯ（Ａ）およびＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８（Ｂ）を中和するための算出ＩＣ５０値。

【図12】受身投与された中和ｍＡｂの血漿濃度とマカクの２つの異なるＲ５ＳＨＩＶの後のウイルス獲得との関係を示す図である。黒丸は、防御された（無獲得）サルを示し；白丸は、感染した動物を指す。

【図13-1】ｂＮＡｂの血漿濃度を示す表である。血漿試料における中和活性を測定することによりｍＡｂの濃度を決定した。（Ａ）あるｂＮＡｂに対しては感受性であるが、他のｂＮＡｂに対しては感受性でないＨＩＶ−１株（すなわち、ＨＩＶ−１株Ｘ２０８８＿９（１０−１０７４感受性）；ＨＩＶ−１株Ｑ７６９＿ｄ２２（３ＢＮＣ１１７感受性））に対する１０−１０７４および３ＢＮＣ１１７のＴＺＭ．ｂｌ中和アッセイにおいて測定されたＩＤ５０値。（Ｂ）抗体投与前（ｐｒｅＰ）の、しかし０．０１、０．１、１、１０および１００μｇ／ｍＬの抗体１０−１０７４（青色）または３ＢＮＣ１１７（緑色）でスパイクした血漿の中和活性。（Ａ）における測定ＩＤ５０値に基づき、血漿_ＩＤ５０力価として報告する（左カラム）および抗体濃度に変換した（右カラム）中和活性。

【図13-2】ｂＮＡｂの血漿濃度を示す表である。血漿試料における中和活性を測定することによりｍＡｂの濃度を決定した。（Ｃ）示されているマカク血漿試料においてｂＮＡｂ投与前（プレ採血）および後（日数）に測定した_ＩＤ５０力価（左カラム）およびｂＮＡｂの濃度（右カラム）。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明は、ｇｐ１２０上の、複合型Ｎ−グリカンを含む、炭水化物依存性エピトープを認識することができる、ＨＩＶに対する広域中和抗体（ｂＮＡｂ）の新規カテゴリーの予想外の発見に少なくとも一部は基づく。

【0023】

抗体は、殆どのワクチンの成功に不可欠であり、ＨＩＶに対する抗体は、最近のＲＶ１４４抗ＨＩＶワクチン試験では防御に唯一相関するものであるようである。一部のＨＩＶ−１感染患者は、感染の２〜４年後、ｇｐ１６０ウイルススパイクに対して広域中和血清活性を発現するが、突然変異による自己ウイルス脱出のため、これらの抗体は、感染したヒトを一般に防御しない。それにもかかわらず、広域中和活性は、ウイルスに対して選択圧をかけ、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）のマカクへの受動伝達は、ＳＨＩＶ感染に対する防御になる。それ故、かかる抗体を惹起するワクチンは、ヒトにおけるＨＩＶ感染に対して防御性であり得ると提案されている。

【0024】

単個細胞抗体クローニング法の開発により、ｂＮＡｂはＨＩＶ−１ ｇｐ１６０スパイク上のいくつかの異なるエピトープを標的にすることが明らかになった。大部分の強力なＨＩＶ−１ ｂＮＡｂは、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）を認識し（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３（６０４９）：１６３３−１６３７；Ｎａｔｕｒｅ ４７７（７３６５）：４６６−４７０；Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３４（６０６０）：１２８９−１２９３）、かつＶ１／Ｖ２（ＰＧ９／ＰＧ１６）（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５０）：２８５−２８９）およびＶ３ループ（ＰＧＴ）（Ｎａｔｕｒｅ ４７７（７３６５）：４６６−４７０）を含む、可変ループを伴う炭水化物依存性エピトープを認識する（Ｎａｔｕｒｅ ４７７（７３６５）：４６６−４７０；Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５０）：２８５−２８９；Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３４（６０５９）：１０９７−１１０３；Ｎａｔｕｒｅ ４８０（７３７７）：３３６−３４３）。今までに研究された抗体は小さなクローンファミリーの固有の例またはメンバーであるので、炭水化物依存性エピトープについては殆ど判っていない。

【0025】

ＰＧＴ抗体により標的にされるＨＩＶ−１およびエピトープに対する中和抗体応答をよりよく理解するために、我々は、ＰＧＴ１２１を生産したクレードＡ感染患者から、ｇｐ１６０特異的ＩｇＧメモリー応答を支配する大きいクローンファミリーのメンバーを単離した。本明細書に開示するように、ＰＧＴ１２１抗体は、配列、結合親和性、中和活性ならびに炭水化物およびＶ３ループの認識に従って、２つの群、すなわちＰＧＴ１２１様群および１０−１０７４様群に分かれる。１０−１０７４および関連ファミリーメンバーは、新規伝播ウイルスに対する広域反応性を含む、珍しい強力な中和を呈示する。以前に特性付けられた炭水化物依存性ｂＮＡｂとは異なり、ＰＧＴ１２１は、グリカンマイクロアッセイ実験において、高マンノースではなく複合型Ｎ−グリカンに結合する。ＰＧＴ１２１および１０−１０７４の、それらの生殖細胞系前駆体の構造および複合型Ｎ−グリカンに結合したＰＧＴ１２１の構造と比較した、結晶構造により、それらの独特な特性が合理的に説明される。

【0026】

１つの例では、高マンノースではなく複合型Ｎ−グリカンを認識する点でグリカン依存性ｂＮａｂの中でもユニークである、ＰＧＴ１２１をコードするＢ細胞クローンを単離するためにアッセイを行った。ＰＧＴ１２１クローンは、ＰＧＴ１２１様群および１０−１０７４様群に分かれ、これらは、配列、結合親和性、炭水化物認識および中和活性によって区別される。１０−１０７４群は、無タンパク質のグリカンに検出可能な程度に結合しないにもかかわらず、顕著な効力および幅を呈示する。リガンドを持たないＰＧＴ１２１、１０−１０７４およびそれらの生殖細胞系前駆体の結晶構造は、炭水化物認識差がＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３間のクレフトにマッピングされることを明示し、前記クレフトは、離れたＰＧＴ１２１構造では複合型Ｎ−グリカンによって占有されていた。ＰＧＴ１２１と１０−１０７４間のグリカン接触残基の交換により、中和活性におけるこれらの残基の重要性が確認された。ＨＩＶエンベロープは、高マンノースＮ−グリカンおよび複合型Ｎ−グリカンの様々な特性を呈示し、したがって、抗ＨＩＶ ｂＮＡｂによる複合型Ｎ−グリカン認識の最初の構造特性付けを含むこれらの結果は、抗体および最終的にはワクチンが広域中和活性をいかにして実現し得るのかを理解するために重要である。

【0027】

本明細書において用いる場合の用語「抗体」（Ａｂ）は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体および多反応性抗体）、および抗体断片を含む。したがって、用語「抗体」は、本明細書におけるいずれの文脈で用いる場合も、任意の特異的結合メンバー、免疫グロブリンクラスおよび／またはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ）；ならびにそれらの生物学的に関連した断片または特異的結合メンバー（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ（一本鎖または関連エンティティ）を、これらに限定されないが、含む）を、これらに限定されないが、含むことを意図したものである。抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を有する糖タンパク質、またはその抗原結合部分であると、当該技術分野では理解されている。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）で構成されている。軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。重鎖および軽鎖両方の可変領域は、フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。それら４つのＦＷＲ領域は相対的に保存される一方で、ＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は超可変領域に相当し、ＮＨ２末端からＣＯＯＨ末端へと次のように配列される：ＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３およびＦＷＲ４。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する一方で、そのアイソタイプに依存して、定常領域（単数または複数）は、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

【0028】

本明細書において用いる場合の「抗体」の定義には、キメラ抗体、ヒト化抗体および組換え抗体、トランスジェニック非ヒト動物から産生されたヒト抗体、ならびに当業者に利用可能な濃縮技術を用いてライブラリーから選択された抗体も含まれる。

【0029】

用語「可変」は、可変（Ｖ）ドメインのある一定のセグメントが抗体間で配列の点で大幅に異なることを指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を規定する。しかし、その可変性は、可変領域の１１０アミノ酸スパン全体にわたって均一に分布していない。それよりむしろ、Ｖ領域は、各々が９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる超可変性のより短い領域によって隔てられた、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチから成る。天然重鎖のおよび軽鎖の可変領域は、各々、３つの超可変領域によって接続された、主としてβシート構造をとる、４つのＦＲを含み、前記超可変領域は、前記βシート構造を接続する、および場合によっては前記βシート構造の一部を形成する、ループを形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲにより極めて互いに近接して互い保持され、他の鎖からの超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。

【0030】

本明細書において用いる場合の用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。

【0031】

本明細書において用いる場合の用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在することがある、起こり得る自然発生突然変異を除いて、同一である。用語「ポリクローナル抗体」は、異なる決定基（「エピトープ」）に対して配向した異なる抗体を含む調製物を指す。

【0032】

本明細書におけるモノクローナル抗体は、重および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、前記鎖（単数または複数）の残部は、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにかかる抗体の断片（ただし、それらの断片が所望の生物活性を呈示する場合に限る）における対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体を含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照されたい）。本記載発明は、ヒト抗体に由来する可変領域抗原結合配列を提供する。したがって、ここで主に対象となるキメラ抗体は、１つ以上のヒト抗原結合配列（例えば、ＣＤＲ）を有するとともに、非ヒト抗体に由来する１つ以上の配列、例えばＦＲまたはＣ領域配列、を含有する抗体を含む。加えて、ここに含まれるキメラ抗体は、ある抗体クラスまたはサブクラスのヒト可変領域抗原結合配列と、別の抗体クラスまたはサブクラスに由来する別の配列、例えばＦＲまたはＣ領域配列とを含むものである。

【0033】

「ヒト化抗体」は、一般に、非ヒトであるソースから導入された１つ以上のアミノ酸残基を有するヒト抗体であると考えられる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と呼ばれることが多く、この移入残基は、典型的に、「移入」可変領域から得られる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列を移入超可変配列で置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って行ってもよい（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）を参照されたい）。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、インタクトヒト可変領域より実質的に少ない可変領域が非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）である。

【0034】

「抗体断片」は、インタクト抗体の一部分、例えば、インタクト抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号明細書；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］を参照されたい）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0035】

「Ｆｖ」は、完全抗原認識および抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、緊密な、非共有結合で会合している１重鎖および１軽鎖可変領域ドメインの二量体を含有する。これらの２つのドメインのフォールディングから、６つの超可変ループ（ＨおよびＬ鎖から各々３ループ）が生まれ、前記ループは、アミノ酸残基を抗原結合に与え、抗原結合特異性を抗体に付与する。しかし、単一可変領域（または抗原に特異的なＣＤＲを３つだけ含む、Ｆｖの半分）であっても、全結合部位より低い親和性でではあるが、抗原を認識および結合する能力を有する。

【0036】

「一本鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」）は、単一ポリペプチド鎖へと接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができ、そのポリペプチドリンカーにより、ｓＦｖは抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓＦｖの総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ １９９５，ｉｎｆｒａを参照されたい。

【0037】

用語「ダイアボディ」は、Ｖドメインの鎖内対合ではなく鎖間の対合が実現され、その結果、二価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片になるように、ＶＨドメインとＶＬドメイン間に短いリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖ断片を構築することによって調製された、小さい抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より十分に記載されている。

【0038】

完全ヒト形態で生産することができるドメイン抗体（ｄＡｂ）は、約１１ｋＤａから約１５ｋＤａの範囲の、抗体の最小の公知抗原結合断片である。ｄＡｂは、免疫グロブリンの重および軽鎖（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）の頑強な可変領域である。それらは、微生物細胞培養で高度に発現され、例えば溶解度および温度安定性を含む（しかしこれらに限定されない）好適な生物物理学的特性を示し、ならびに例えばファージディスプレイなどのインビトロ選択システムによる選択および親和性成熟によく適している。ｄＡｂは、単量体として生物活性であり、それらの小さいサイズおよび固有の安定性のおかげで、より大きい分子にフォーマットして、長期血清半減期または他の薬理活性を有する薬物を作ることができる。これらの技術の例は、例えば、ラクダ重鎖Ｉｇに由来する抗体について国際公開第９４２５５９１号パンフレットに記載されており、加えて、米国特許出願公開第２００３０１３０４９６号明細書にはファージライブラリーからの単一ドメイン完全ヒト抗体の単離が記載されている。

【0039】

ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域が全くないインタクト結合部位を有する唯一の種である。したがって、それらは、インビボ使用中の非特異的結合低減に適している。ｓＦｖ融合タンパク質を、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端いずれかでエフェクタータンパク質の融合を生じさせるように構築することができる。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，上掲を参照されたい。前記抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されているような、例えば「線状抗体」であることもできる。かかる線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であることができる。

【0040】

ある実施形態において、本記載発明の抗体は、二重特異性または多重特異性である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例として、二重特異性抗体は、単一の抗原の２つの異なるエピトープに結合することができる。他のかかる抗体は、第一の抗原結合部位と第二の抗原のための結合部位を組み合わせることができる。あるいは、抗ＨＩＶアームを、白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）、またはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃガンマＲ）、例えばＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、に結合するアームと組み合わせて、細胞防御メカニズムを感染細胞に集中および局在させることができる。二重特異性抗体を使用して、殺細胞剤を感染細胞に局在させることもできる。二重特異性抗体を、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。例えば、国際公開第９６／１６６７３号パンフレットには二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃガンマＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５，８３７，２３４号明細書には二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃガンマＲＩ抗体が開示されている。例えば、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗Ｆｃアルファ抗体は、国際公開第９８／０２４６３号パンフレットにおいて報告されており；米国特許第５，８２１，３３７号明細書には二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体が教示されている。例えば、Ｍｏｕｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｔｈｅ Ａｐｐａｒｅｎｔ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｏｆ Ａｎｔｉ−ＨＩＶ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｂｙ Ｈｅｔｅｒｏｌｉｇａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ．４６７，５９１−５（２０１０）、およびＭｏｕｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＨＩＶ−１ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｅｔｅｒｏｌｉｇａｔｉｏｎ” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１２ Ｊａｎ １７；１０９（３）：８７５−８０も参照されたい。

【0041】

二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野において公知である。完全長二重特異性抗体の旧来の生産は、２つの免疫グロブリン重−軽鎖対の共発現に基づき、この場合、前記２本の鎖は異なる特異性を有する（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）を参照されたい）。類似の手順が、例えば、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。Ｍｏｕｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＨＩＶ−１ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｅｔｅｒｏｌｉｇａｔｉｏｎ” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１２ Ｊａｎ １７；１０９（３）：８７５−８０も参照されたい。

【0042】

あるいは、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変領域を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。この融合は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、Ｉｇ重鎖定常領域とのものである。いくつかの実施形態によると、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体の少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするおよび所望される場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、適する宿主細胞にコトランスフェクトする。これは、その構築に用いられる不等比の３つのポリペプチド鎖が所望の二重特異性抗体の最適な収量を与える実施形態では、３つのポリペプチド断片の相互比率の調整に、より大きい自由度を持たせる。しかし、等比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらすとき、または前記比が所望の鎖の組み合わせの収量に有意な影響を及ぼさないときには、２つのまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。

【0043】

抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技法も文献に記載されている。例えば、化学結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）には、インタクト抗体をタンパク質分解切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する手順が記載されている。これらの断片をジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウム、の存在下で還元して、ビシナルジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方をメルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体を、酵素の選択的固定のための薬剤として使用することができる。

【0044】

抗体の他の修飾を本明細書では企図している。例えば、様々な非タンパク質様ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに、抗体を結合させることができる。例えばコアセルベーション法によりもしくは界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース、もしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）内に、コロイドドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内に、またはマクロエマルジョン内に抗体を捕捉することもできる。かかる技法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。

【0045】

典型的には、本記載発明の抗体を、当該技術分野において利用可能なベクターおよび方法を用いて組換え生産する。インビトロ活性化Ｂ細胞によってヒト抗体を産生することもできる（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号明細書を参照されたい）。本発明において有用な分子遺伝学および遺伝子工学の一般的方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，ｅｄ．，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、およびＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）の現行版に記載されている。遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、商業ベンダー、例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎＴｅｃｈおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から入手可能である。

【0046】

内因性免疫グロブリン生産が不在の状態でヒト抗体の全レパートリーを生産できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）においてヒト抗体を生産することもできる。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体生産の完全阻害をもたらすことが記載されている。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイのかかる生殖細胞系突然変異体マウスへの移入は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の生産をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５９１，６６９号明細書（すべてＧｅｎＰｈａｒｍ）；米国特許第５，５４５，８０７号明細書；ならびに国際公開第９７／１７８５２号パンフレットを参照されたい。かかる動物を、本記載発明のポリペプチドを含むヒト抗体を生産するように遺伝子操作することができる。

【0047】

抗体断片の生産のために様々な技法が開発されている。旧来、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質分解消化によって得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７ （１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかし、今はこれらの断片を遺伝子組換えの宿主細胞によって直接生産することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片は、すべて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現および大腸菌から分泌させることができ、このことから大量のこれらの断片の容易な生産が可能である。Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）を参照されたい）。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片を遺伝子組換えの宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、インビボ半減期が増加されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号明細書に記載されている。抗体断片の他の生産法は、当業者には明白であろう。

【0048】

ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２）、細菌ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：２９−３４）および／または酵母ディスプレイ（Ｋｉｅｋｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０： １３０３−１３１０）を含む（しかしこれらに限定されない）濃縮法を用いてライブラリーから抗体断片を選択するための当該技術分野において公知である他の技法を前に論じた技法の代案として用いて、一本鎖抗体を選択してもよい。一本鎖抗体は、糸状ファージ技術を直接用いて生産された一本鎖抗体のライブラリーから選択される。ファージディスプレイ技術は当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，７３３，７４３号、同第５，８７１，９０７号、同第５，８７２，２１５号、同第５，８８５，７９３号、同第５，９６２，２５５号、同第６，１４０，４７１号、同第６，２２５，４４７号、同第６，２９１６５０号、同第６，４９２，１６０号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、同第６，５９３，０８１号明細書、ならびに他の米国特許ファミリーメンバー、または１９９２年５月２４日に出願された英国特許第９２０６３１８号に基づく優先権出願の願書に開示されているようなＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＡＴ）からの技術を参照されたい；Ｖａｕｇｈｎ，ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−３１４も参照されたい）。利用可能な組換えＤＮＡ技術、例えば、ＤＮＡ増幅法（例えば、ＰＣＲ）を用いて、またはことによるとそれぞれのハイブリドーマｃＤＮＡをテンプレートとして使用することにより、一本鎖抗体を設計し、構築してもよい。

【0049】

変異体抗体も本発明の範囲に含まれる。したがって、本出願に記載の配列の変異体も本発明の範囲に含まれる。親和性が向上された抗体配列のさらなる変異体を、当該技術分野において公知の方法を用いて得ることができ、それらの変異体は本発明の範囲内である。例えば、アミノ酸置換を用いて、親和性がさらに向上された抗体を得ることができる。あるいは、ヌクレオチド配列のコドン最適化を用いて、抗体生産のための発現系における翻訳効率を向上させることができる。

【0050】

かかる変異体抗体配列は、本出願に記載の配列と７０％以上の（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の）配列同一性を共有することになる。かかる配列同一性は、基準配列（すなわち、本出願に記載の配列）の完全長に対して算定される。本明細書において言及するときの同一率は、ＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により指定されたデフォルトパラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ ６２行列；ギャップ開始ペナルティ＝１１およびギャップ伸長ペナルティ＝１］を用いてＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を使用して決定したときのものである。例えば、本明細書に開示する配列の１つ以上についての少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０以上の近接するペプチドおよびこれらの間のすべての中間長のペプチドを含むペプチド配列が本発明によって提供される。本明細書において用いる場合、用語「中間長」は、引用値間の任意の長さ、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など、１５０、１５１、１５２、１５３などを記述することを意図したものである。

【0051】

本発明は、血清中で広域中和活性を有する抗体を、単独で、または他の抗体、例えば、ＶＲＣ０１、抗Ｖ３ループ、ＣＤ４ｂｓおよびＣＤ４ｉ抗体ならびにＰＧ９／ＰＧ１６様抗体（しかしこれらに限定されない）との組み合わせで提供する。

【0052】

別の実施形態によると、本発明は、ＨＩＶに感染しているまたはＨＩＶ感染の危険があるヒトまたは非ヒト霊長類患者に、ヒトにおけるＨＩＶに対する防御免疫応答またはＨＩＶウイルスの低減の誘導に十分な量およびスケジュールによる投与に適したＨＩＶ抗体組成物の調製および投与方法を提供する。

【0053】

別の実施形態によると、本発明は、本発明の少なくとも１つの抗体と医薬的に許容される担体とを含むワクチンを提供する。１つの実施形態によると、前記ワクチンは、本明細書に記載する少なくとも１つの抗体と医薬的に許容される担体とを含むワクチンである。前記ワクチンは、本明細書に記載する特性を有する複数の抗体を任意の組み合わせで含むことができ、および当該技術分野において公知であるようなＨＩＶを中和する抗体をさらに含むことができる。

【0054】

組成物が、ワクチン接種後の様々な亜型のＨＩＶ感染の進行を予防的にまたは治療的に処置するために、本明細書に開示する単一の抗体である場合があり、または同じであるまたは異なる本明細書に開示する抗体の組み合わせである場合もあることを理解されたい。かかる組み合わせは、所望の免疫性に従って選択することができる。抗体を動物またはヒトに投与するとき、それを、通常の当業者に公知であるような１つ以上の医薬的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントと併用することができる。前記組成物は、ＶＲＣ０１、ｂ１２、抗Ｖ３ループ、ＣＤ４ｂｓおよびＣＤ４ｉ抗体ならびにＰＧ９／ＰＧ１６様抗体を含む（しかしこれらに限定されない）、当該技術分野において公知の広域中和抗体をさらに含むことができる。

【0055】

さらに、ＨＩＶの治療についての患者における効果レベルの判定に関しては、特に、適切な動物モデルを利用でき、様々な遺伝子療法プロトコルのＨＩＶに対するインビボ有効性を評価するために幅広く実施されている（Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３ｂ），上掲）。これらのモデルとしては、マウス、サルおよびネコが挙げられる。これらの動物がＨＩＶ疾患に自然にかかりやすくなくても、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ節、胎児肝臓／胸腺または他の組織を用いて再構成されたキメラマウスモデル（例えば、ＳＣＩＤ、ｂｇ／ｎｕ／ｘｉｄ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ−ｈｕ、免疫適格ＳＣＩＤ−ｈｕ、骨髄切除ＢＡＬＢ／ｃ）をレンチウイルスベクターまたはＨＩＶに感染させ、ＨＩＶ病因モデルとして利用することができる。同様に、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）／サルモデルを利用することができ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）／ネコモデルを利用することもできる。前記医薬組成物は、ＡＩＤＳの治療的処置に使用するとき、本発明によるベクターと共に他の医薬を含有することができる。これらの他の医薬をそれらの旧来の様式で（すなわち、ＨＩＶ感染を処置するための薬剤として）使用することができる。

【0056】

別の実施形態によると、本発明は、有効量の単離されたＨＩＶ抗体、または親和性成熟バージョン、を含む抗体ベースの医薬組成物を提供し、これは、ＨＩＶウイルスの感染を低下させるための予防的または治療的処置の選択肢をもたらす。本発明の抗体ベースの医薬組成物を、当該技術分野において公知の任意の数の戦略（例えば、ＭｃＧｏｆｆ ａｎｄ Ｓｃｈｅｒ，２０００，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｉｎ ＭｃＮａｌｌｙ，Ｅ．Ｊ．，ｅｄ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；ｐｐ．１３９−１５８；Ａｋｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉｓ，２０００，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｔａｌｙｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ；ｐｐ．１４５−１７７；Ａｋｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：４７−１２７を参照されたい）によって製剤化してよい。患者への投与に適する医薬的に許容される組成物は、許容される温度範囲内での保管中に生物活性を保持する上に最大安定性を促進しもする製剤中に有効量の抗体を含有することになる。前記医薬組成物は、所望される製剤に依存して、医薬的に許容される希釈剤、医薬的に許容される担体および／または医薬的に許容される賦形剤、もしくは動物またはヒトへの投与用の医薬組成物の製剤化に一般に用いられる、そのようなビヒクルも含むことができる。前記希釈剤は、前記組み合わせの生物活性に影響を及ぼさないように選択される。かかる希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。本発明の医薬組成物または製剤において有用である賦形剤の量は、それを必要とする被検体に投与すべきときにその組成物を均一に分散させることができるようにその組成物全体にわたって抗体を均一に分配するのに役立つ量である。それは、所望の有益な緩和または治癒結果もたらすと同時に高すぎる濃度から起こるであろう一切の有害副作用を最少にする濃度に抗体を希釈するのに役立つことがある。それは、保存効果を有することもある。したがって、高い生理活性を有する抗体については、いっそう多くの賦形剤を利用することになる。その一方で、より低い生理活性を呈示するいずれの活性成分（単数または複数）についても、より少ない量の賦形剤を利用することになる。

【0057】

上記抗体を、および本明細書に記載する抗体の少なくとも１つまたは組み合わせを含む抗体組成物またはワクチン組成物を、ＨＩＶウイルス感染の予防的および治療的処置のために投与することができる。

【0058】

本発明は、軽鎖および重鎖の新規アミノ酸配列、ならびに図３に収載するような配列番号１および２の重および軽鎖についてのコンセンサス配列を含む、単離されたポリペプチドにも関する。

【0059】

他の関連した実施形態において、本発明は、図３に収載するＨＩＶ抗体のアミノ酸配列；配列番号１および２の重および軽鎖についてのコンセンサス配列、をコードするポリペプチド変異体を提供する。これらのポリペプチド変異体は、本明細書に記載する方法（例えば、標準パラメータを用いるＢＬＡＳＴ解析）を用いて決定したときに本発明のポリペプチド配列と比較して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％あるいはそれ以上の配列同一性を有する。アミノ酸の類似性などに考慮することにより、これらの値を適切に調整して、コードされたタンパク質の対応する同一性を決定することができることは、当業者には理解されるであろう。

【0060】

用語「ポリペプチド」は、その従来の意味で、すなわち、アミノ酸の配列として用いている。ポリペプチドは、特定の長さの生成物に限定されない。ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれ、かかる用語は、特に別段の指示がない限り、本明細書では交互に用いることができる。この用語は、自然に発生するものおよび自然に発生しないもの両方の、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、および当該技術分野において公知の他の修飾も含む。ポリペプチドは、タンパク質全体である場合もあり、またはその部分配列である場合もある。本発明に関連して対象となる特定のポリペプチドは、抗原またはＨＩＶ感染細胞に結合できる、ＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬを含むアミノ酸部分配列である。

【0061】

ポリペプチド「変異体」は、この用語を本明細書において用いる場合、本明細書に具体的に開示するポリペプチドとは１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入の点で典型的に異なるポリペプチドである。かかる変異体は、天然起源である場合もあり、または例えば、本発明の上記ポリペプチド配列の１つ以上の修飾、および本明細書に記載のポリペプチドの１つ以上の生物活性の評価、および／もしくは当該技術分野において周知の多数の技法のうちのいずれかの使用によって、合成的に生成される場合もある。

【0062】

例えば、あるアミノ酸を、タンパク質構造内の他のアミノ酸と、他のポリペプチド（例えば、抗原）または細胞に結合する能力のかなりの喪失を伴うことなく置換することができる。タンパク質の結合能力および性質は、そのタンパク質の生物学的機能活性を規定するので、あるアミノ酸配列置換をタンパク質配列、したがってその基礎となるＤＮＡコード配列に起こすことができ、それにより同様の特性を有するタンパク質を得られる。したがって、本開示組成物のペプチド配列、または前記ペプチドをコードする対応ＤＮＡ配列に、それらの生物学的有用性または活性を著しく喪失することなく、様々な変更を加えることができることが考えられる。

【0063】

多くの場合、ポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的置換を含有することになる。「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者によりそのポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー性が実質的に不変であると予想されるような、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸に置換されることである。

【0064】

アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどの、相対的類似性に基づく。例えば、様々な前述の特性を考慮に入れる置換は、当業者に周知であり、アルギニンとリシン；グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリンとロイシンとイソロイシンを含む。

【0065】

「相同性」または「配列同一性」は、配列をアラインし、必要に応じて、最大相同率を達成するためにギャップを挿入した後に非変異体配列と同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列変化での残基の百分率を指す。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド変異体は、本明細書に記載するポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のポリヌクレオチドまたはポリペプチド相同性を有する。

【0066】

かかる変異体ポリペプチド配列は、本出願に記載の配列と７０％以上（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の）配列同一性を共有することになる。さらなる実施形態において、本記載発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列の様々な長さの連続ストレッチを含むポリペプチド断片を提供する。例えば、本明細書に開示する配列の１つ以上についての連続する少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０またはそれ以上のペプチドおよびそれらの間のすべての中間長のペプチドを含むペプチド配列が本発明によって提供される。

【0067】

本発明は、本記載発明抗体の軽および重鎖の一部またはすべてをコードする核酸配列、およびそれらの断片も含む。遺伝子コードの冗長性のため、同じアミノ酸配列をコードするこれらの配列の変異体が存在することになる。

【0068】

本発明は、図３に収載するＨＩＶ抗体の重および軽鎖のペプチドをコードする単離された核酸配列、ならびに配列番号１および２の重および軽鎖のコンセンサス配列も含む。

【0069】

他の関連実施形態において、本記載発明は、図３に収載するＨＩＶ抗体の重および軽鎖のポリペプチド配列；配列番号１および２の重および軽鎖のコンセンサス配列、をコードするポリヌクレオチド変異体を提供する。これらのポリヌクレオチド変異体は、本明細書に記載する方法（例えば、標準パラメータを用いるＢＬＡＳＴ解析）を用いて決定したときに本発明のポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム配置などを考慮に入れることにより、これらの値を適切に調整して、２つのヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質の対応する同一性を決定することができることは、当業者には理解されるであろう。

【0070】

用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーを指すために本明細書では交互に用いられる。ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、追加のゲノムおよびプラスミド配列、ならびにより小さい操作された遺伝子セグメントであって、ポリペプチドを発現するまたは発現するように適応され得るセグメントを含むことができる。

【0071】

「単離された核酸」は、他のゲノムＤＮＡからはもちろん、天然に天然配列を伴う、タンパク質または複合体、例えばリボソームおよびポリメラーゼからも実質的に分離されている核酸である。この用語は、その天然に存在する環境から除去された核酸配列を包含し、組換体またはクローン化ＤＮＡ単離体、および化学合成類似体、または異種のシステムによって生合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸は、単離された形態の前記核酸を含む。したがって、これは、初めから単離されているような核酸を指し、人間の手で単離された核酸に後で加えられた遺伝子または配列を除外しない。

【0072】

ポリヌクレオチド「変異体」は、この用語を本明細書において用いる場合、本明細書に具体的に開示するポリヌクレオチドとは、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入の点で典型的に異なるポリヌクレオチドを指す。かかる変異体は、天然起源である場合もあり、または例えば、本発明のポリヌクレオチド配列の１つ以上の修飾、および本明細書に記載のコードされたポリペプチドの１つ以上の生物活性の評価、および／もしくは当該技術分野において周知の多数の技法のうちのいずれかの使用によって、合成的に生成される場合もある。

【0073】

本記載発明のポリヌクレオチドの構造に修飾を施すことができ、所望の特性を有する変異体または誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子をなお得ることができる。本発明のポリペプチドの等価のまたはさらには改善された変異体または部分を作り出すためにポリペプチドのアミノ酸配列を改変することが所望されるとき、典型的に、当業者は、コードするＤＮＡ配列のコドンの１つ以上を変更することになる。

【0074】

典型的に、ポリヌクレオチド変異体は、その変異体ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの免疫原性の結合特性が、本明細書に具体的に示すポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドに比べて実質的に減少されないような、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。

【0075】

さらなる実施形態において、本記載発明は、本明細書に開示する配列の１つ以上と同一のまたは相補的な配列の様々な長さの連続ストレッチを含むポリヌクレオチド断片を提供する。例えば、本明細書に開示する配列の１つ以上についての連続する少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００あるいはそれ以上のヌクレオチドおよびそれらの間のすべての中間長のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、引用値間の、例えば、１６、１７、１８、１９など、２１、２２、２３など、３０、３１、３２など、５０、５１、５２、５３など、１００、１０１、１０２、１０３など、１５０、１５１、１５２、１５３などの、および２００〜５００、５００〜１０００中のすべての整数を含む、任意の長さを包含するポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。

【0076】

本発明の別の実施形態において、本明細書が提供するポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはその相補配列に、中から高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズできるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリダイゼーション法は、分子生物学技術分野において周知である。例証のために、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを試験するための適切な中等度のストリンジェントな条件は、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０〜６０℃、５ｘＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション；続いて２回の６５℃で２０分間の、各々、０．１％ＳＤＳを含有する２ｘ、０．５ｘおよび０．２ｘＳＳＣでの洗浄を含む。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションを行う温度を変えることによって容易に操作することができることは、当業者には理解されるであろう。例えば、別の実施形態において、適切な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの温度を例えば６０〜６５℃または６５〜７０℃に上昇させることを除いて、上に記載したものを含む。

【0077】

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド変異体または断片によってコードされたポリペプチドは、天然ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドと同じ結合特異性を有する（すなわち、同じエピトープまたはＨＩＶ株に特異的にまたは優先的に結合する）。いくつかの実施形態において、本記載ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド変異体、断片およびハイブリダイゼーション配列は、本明細書に具体的に示すポリペプチド配列についてのものの少なくとも約５０％、少なくとも約７０％および少なくとも約９０％のレベルの結合活性を有するポリペプチドをコードする。

【0078】

本記載発明のポリヌクレオチド、またはそれらの断片を、それ自体のコード配列の長さに関係なく、他のＤＮＡ配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコードセグメントなどと組み合わせることができるので、それらの全長は、かなり変動し得る。ほぼあらゆる長さの核酸断片が用いられる。例えば、長さ約１００００、約５０００、約３０００、約２０００、約１０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対などの全長（すべての中間長を含む）を持つ例示的なポリヌクレオチドセグメントが本発明の多くの実施に含まれる。

【0079】

本発明による核酸配列を含むベクター、例えば発現ベクターが、さらに本発明の範囲に含まれる。かかるベクターで形質転換された細胞も本発明の範囲に含まれる。

【0080】

本発明は、本発明の核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに本発明のポリペプチドの生産のための組換え法も提供する。本発明のベクターは、例えばプラスミド、ファージ、コスミドおよびミニ染色体を含む、任意のタイプの細胞または生物において複製できるものを含む。いくつかの実施形態において、本記載発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、そのポリヌクレオチドの成長もしくは複製に適したベクターであるか、または本記載発明のポリペプチドの発現に適したベクターである。かかるベクターは、当該技術分野において公知であり、市販されている。

【0081】

「ベクター」は、シャトルベクターおよび発現ベクターを含む。典型的に、プラスミド構築は、細菌のプラスミドの、それぞれ複製および選択のために、複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１複製起点）および選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）も含むことになる。「発現ベクター」は、細菌細胞または真核細胞中の、本発明の抗体断片を含む抗体の発現に必要な制御配列または調節要素を含有するベクターを指す。

【0082】

本明細書において用いる場合、用語「細胞」は、哺乳動物細胞またはヒト細胞など（しかしこれらに限定されない）の真核、多細胞種のものを（例えば、単細胞の酵母細胞とは対照的に）含むが、これらに限定されない、任意の細胞であることができる。細胞は、単一エンティティとして存在する場合もあり、または細胞のより大きなコレクションの一部である場合もある。かかる「細胞のより大きなコレクション」は、例えば、細胞培養物（混合されたものか純粋なもの）、組織（例えば、内皮、上皮、粘膜もしくは他の組織）、器官（例えば、肺、肝臓、筋肉および他の器官）、器官系（例えば、循環器系、呼吸器系、胃腸系、泌尿器系、神経系、外皮系もしくは他の器官系）、または生物（例えば、鳥類、哺乳類など）を含むことができる。

【0083】

本発明のポリヌクレオチドを全体として合成してもよく、または少しずつ合成して組み合わせてもよく、そして、例えば、適切な制限部位および制限酵素を用いる線状ベクターへの前記ポリヌクレオチドのサブクローニングを含む、ルーチンの分子生物学および細胞生物学法を用いて、ベクターに挿入してもよい。本記載発明のポリヌクレオチドを、そのポリヌクレオチドの各鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。これらのプライマーは、ベクターへのサブクローニングを助長するための制限酵素切断部位も含む。複製可能なベクター成分は、一般に、次のものの１つ以上を含むがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、および１つ以上の、マーカーまたは選択可能な遺伝子。

【0084】

本発明のポリペプチドを発現するために、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または機能的等価物を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入したコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入してよい。対象となるポリペプチドならびに適切な転写および翻訳制御要素をコードする配列を含有する発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を用いてよい。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ法、合成法、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。かかる技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載されている。

【0085】

本発明は、本発明の抗体、ポリペプチドおよび核酸を使用して診断および予後アッセイを実施する際に有用なキットも提供する。本発明のキットは、本発明のＨＩＶ抗体、ポリペプチドまたは核酸を標識された形態または未標識の形態いずれかで含む、適切な容器を含む。加えて、前記抗体、ポリペプチドまたは核酸を間接結合アッセイに適する標識された形態で供給するとき、そのキットは、適切な間接アッセイを行うための試薬をさらに含む。例えば、前記キットは、標識の性質に依存して酵素基質または誘導体化剤を含む、１つ以上の適する容器を含むことがある。対照試料および／または説明書も含むことがある。本発明は、ＰＣＲまたは質量分析によって生体試料中の本発明のＨＩＶ抗体の存在またはＨＩＶ抗体のヌクレオチド配列を検出するためのキットも提供する。

【0086】

本明細書において用いる場合の「標識」は、「標識された」抗体を生成するために抗体に直接または間接的に結合される検出可能な化合物または組成物を指す。標識を本明細書に開示するポリペプチドおよび／または核酸配列に結合することもできる。前記標識は、単独で検出可能であることができ（例えば、放射性同位元素標識もしくは蛍光標識）、または酵素標識の場合は、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学的変成を触媒することができる。本記載発明の抗体およびポリペプチドを、例えば、精製または診断応用に用いるために、エピトープタグまたは標識を含むように修飾することもできる。適する検出手段としては、標識、例えば、これらに限定されないが、放射性ヌクレオチド、酵素、補酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素原、酵素基質または補因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素などの使用を含む。

【0087】

別の実施形態によると、本発明は、診断方法を提供する。診断方法は、一般に、患者から採取した生体試料、例えば、血液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ試料または組織生検材料などをＨＩＶ抗体と接触させること、および前記抗体が前記試料に、対照試料または所定のカットオフ値と比較して、選択的に結合するかどうかを判定し、それによってＨＩＶウイルスの存在を示すことを含む。

【0088】

別の実施形態によると、本発明は、患者からの生体試料中の本発明のＨＩＶ抗体の存在を検出するための方法を提供する。検出方法は、一般に、患者から生体試料、例えば、血液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ試料または組織生検材料などを採取し、ＨＩＶ抗体またはそれらの断片、もしくはＨＩＶ抗体をコードする核酸を単離すること、および前記生体試料中のＨＩＶ抗体の存在について検査することを含む。また、本発明は、細胞におけるＨＩＶ抗体のヌクレオチド配列を検出するための方法を提供する。ＨＩＶ抗体のヌクレオチド配列を、本明細書に開示するプライマーを使用して検出してもよい。患者からの生体試料中のＨＩＶ抗体の存在を、公知の組換え法および／または質量分析装置の使用により決定してもよい。

【0089】

別の実施形態において、本発明は、生体試料において高度に保存されたコンセンサス配列を含む重鎖と高度に保存されたコンセンサス配列を含む軽鎖とを含むＨＩＶ抗体を検出するための方法を提供し、この方法は、哺乳動物被検体から免疫グロブリン含有生体試料を採取すること、前記試料からＨＩＶ抗体を単離すること、および前記重鎖および軽鎖の高度に保存されたコンセンサス配列を同定することを含む。前記生体試料は、血液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ試料または組織生検材料であってよい。前記アミノ酸配列を、例えばＰＣＲおよび質量分析を含む、当該技術分野において公知の方法によって決定してよい。

【0090】

用語「評価」（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）は、任意の形態の測定を含み、およびある要素が存在するか否かを決定することを含む。用語「判定」（ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ）、「測定」（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）、「評価」（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）、「評価」（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）および「分析」（ａｓｓａｙｉｎｇ）は、交互に用いられ、定量的および定性的決定を含む。評価は、相対的であることもあり、または絶対的であることもある。「の存在を評価」は、存在する何かの量を判定すること、および／またはそれが存在するのか、または不在であるのかを判定することを含む。本明細書において用いる場合、用語「判定」、「測定」および「評価」（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）および「分析」は、交互に用いられ、定量的決定と定性的判定の両方を含む。

【0091】

ＩＩ．ウイルス複製を低減させる方法
被検体におけるＨＩＶウイルス力価、ウイルス複製、ウイルス増殖またはＨＩＶウイルスタンパク質の量の増加を低減させるための方法をさらに提供する。別の態様によると、ある方法は、被検体における１つ以上のＨＩＶ株または単離体のＨＩＶ力価、ウイルス複製またはＨＩＶタンパク質の量の増加を低減させるのに有効な量のＨＩＶ抗体を被検体に投与することを含む。

【0092】

別の実施形態によると、本発明は、ウイルス複製を低減させる、またはさらなる宿主細胞または組織へのＨＩＶ感染の拡大を低減させる方法を提供し、この方法は、ｇｐ１２０上の抗原エピトープに結合する抗体またはその一部分と哺乳動物細胞を接触させることを含む。

【0093】

ＩＩＩ．治療方法
別の実施形態によると、本発明は、ウイルス感染症に感染した、例えばＨＩＶなどに感染した、哺乳動物を治療するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示するＨＩＶ抗体を含む医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含む。１つの実施形態によると、ＨＩＶに感染した哺乳動物を治療するための前記方法は、本発明の抗体またはその断片を含む医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含む。本発明の前記組成物は、開示する特性を有する１つより多くの抗体（例えば、複数の抗体または抗体のプール）を含むことができる。前記組成物は、当該技術分野において公知であるような他のＨＩＶ中和抗体、例えば、これらに限定されないが、ＶＲＣ０１、ＰＧ９およびｂ１２も含むことができる。

【0094】

受動免疫がウイルス性疾患の予防および治療のための有効で安全な戦略であることは証明されている。（例えば、Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３：６０２−１４（２０００）；Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１１４（２００２）；Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：２０４−１０（１９９９）；およびＩｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：２１１−１６（１９９９）を参照されたい）。ヒトモノクローナル抗体を使用する受動免疫は、ＨＩＶの救急予防および治療のための緊急治療戦略を実現する。

【0095】

ＨＩＶ関連疾患または障害の危険がある被検体としては、感染者と接触した患者、または何らかの他の方法でＨＩＶに曝露された患者を含む。疾患または障害を予防するか、あるいはその進行を遅らせるために、ＨＩＶ関連疾患または障害に特有の症状の兆候の前に予防薬の投与を行うことができる。

【0096】

ヒトおよび非ヒト患者のインビボでの治療のために、本発明のＨＩＶ抗体を含む医薬製剤を前記患者に投与または提供する。インビボ療法に使用するとき、本発明の抗体を前記患者に治療有効量（すなわち、患者のウイルス負荷量を無くすまたは低減させる量）で投与する。前記抗体を、公知の方法に従って、例えば、静脈内投与により、例えばボーラスとしてもしくはある期間にわたっての持続注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、関節滑液嚢内、クモ膜下、経口、局所または吸入経路により、ヒト患者に投与する。前記抗体を非経口投与することができ、可能な場合には標的細胞部位に投与することができ、または静脈内投与することができる。いくつかの実施形態では、抗体を静脈内または皮下投与によって投与する。本発明の治療用組成物を患者または被検体に全身投与してもよいし、非経口投与してもよいし、または局所投与してもよい。治療成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師には周知のルーチン手順によって容易に測定される。

【0097】

非経口投与のために、前記抗体を、医薬的に許容される非経口ビヒクルを伴う注射用単位剤形（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化してもよい。かかるビヒクルの例としては、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。非水性ビヒクルとしては、不揮発性油およびオレイン酸エチルが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームを担体として使用することができる。前記ビヒクルは、少量の添加剤、例えば、等張性および化学的安定性を向上させる物質、例えば緩衝液および保存薬などを含有することもある。前記抗体をかかるビヒクル中、約１ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化することができる。

【0098】

用量および薬剤投与計画は、医師によって容易に決定される様々な因子、例えば、感染の性質、例えばその治療指数、患者、および患者の病歴に依存する。一般に、治療有効量の抗体を患者に投与する。いくつかの実施形態において、投与される抗体の量は、患者体重の約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。感染のタイプおよび重症度に依存して、体重の約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体が、例えば１回以上の別々の投与によるか、または連続注入による、患者への投与のための初期候補の投与量である。この治療の経過は、従来の方法および分析によって、および医師もしくは他の当業者に公知の基準に基づいて、容易にモニターされる。処置成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師には公知のルーチン手順によって容易に測定可能である。

【0099】

他の治療法を本発明のＨＩＶ抗体の投与と併用してもよい。併用投与は、別々の製剤または単一の医薬製剤を使用する同時投与、およびいずれかの順序での逐次投与を含み、この際、好ましくは両方（またはすべての）活性薬剤がそれらの生物活性を同時に発揮する期間がある。かかる併用療法は、相乗治療効果をもたらすことができる。処置成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師には周知のルーチン手順によって容易に測定可能である。

【0100】

用語「治療する」または「治療」もしくは「緩和」は、交互に用いられ、治療的処置と、予防的または予防対策との両方を指し、この際目的は、標的とされる病的状態または障害を予防するまたは遅らせる（和らげる）ことである。治療を必要とする者は、障害を既に有する者、ならびに、障害に罹患しやすい者または障害を予防しなければならない者も含む。被検体または哺乳動物は、本発明の方法に従って治療量の抗体を受けた後、その患者が、次の１つ以上に関して観察可能なおよび／または測定可能な低減もしくは次の１つ以上の不在：感染細胞数の低減または感染細胞の不在；感染している全細胞のパーセントの低減；および／もしくは特定の感染に付随する症状の１つ以上のある程度の軽減；罹患率および死亡率低減、ならびに生活の質の問題の向上を示す場合、感染がうまく「治療される」。疾患の治療成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師に公知のルーチン手順によって容易に測定可能である。

【0101】

用語「治療有効量」は、被検体または哺乳動物における疾患または障害の治療に有効な抗体または薬物の量を指す。

【0102】

１つ以上のさらなる治療薬と「併用での」投与は、同時（同時に行う）投与および任意の順序での逐次投与を含む。

【0103】

本明細書において用いる場合の「担体」は、用いられる投与量および濃度で、曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、医薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含む。多くの場合、生理的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含むがこれに限定されない抗酸化物質；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、これらに限定されないが、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、これに限定されないが、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、これらに限定されないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含むが、これらに限定されない）；キレート剤、例えば、これに限定されないが、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、これらに限定されないが、マンニトールまたはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、これに限定されないが、ナトリウム；ならびに／または非イオン界面活性剤、例えば、これらに限定されないが、ＴＷＥＥＮ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳが挙げられるが、これらに限定されない。

【0104】

範囲の値が与えられている場合、文脈による別段の明確な指図がない限り下限の単位の十分の一までの、その範囲の上限と下限の間の各介在値、および表示範囲内の任意の他の表示または介在値が本発明に包含されると解される。これらのより小範囲に独立して含まれることがある、これらのより小範囲の上限および下限も、表示範囲内の一切の特別に除外される限度次第だが、本発明に包含される。表示範囲が、一方または両方の限度を含む場合、含まれるこれらの両方の限度のいずれかを除外する範囲も本発明に含まれる。

【実施例】

【0105】

実施例１
この実施例は、下の実施例２〜５において用いる材料および方法を記載する。

【0106】

ＨＩＶ抗体は、以前に記載されているようなｇｐ１４０特異的単一Ｂ細胞捕捉（Ｍｏｕｑｕｅｔ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６，ｅ２４０７８（２０１１）；Ｔｉｌｌｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９，１１２−２４（２００８）；およびＳｃｈｅｉｄ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４５８，６３６−４０（２００９））に従ってクローニングし、生成した。ＰＧＴ１２１_ＧＭおよび１０−１０７４_ＧＭ「グリコミュータント」抗体は、ＨＣ位置３２、５３、５４、５８、９７、１００ｌにおける１０−１０７４残基をＰＧＴ１２１に置換することによっておよびその逆によって産生させた。抗ｇｐ１４０−抗体のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質への結合特性は、以前に記載されている（Ｓｃｈｅｉｄ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３，１６３３−７（２０１１）；Ｗａｌｋｅｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７７，４６６−７０（２０１１）；およびＭｏｕｑｕｅｔ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６，ｅ２４０７８（２０１１））ようにＥＬＩＳＡ、ＳＰＲおよびグリカンマイクロアレイアッセイによって分析された。中和は、（ｉ）ＴＺＭ．ｂｌ細胞におけるルシフェラーゼベースの分析、および（ｉｉ）以前に記載されている（Ｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９，１０１０８−２５（２００５）；Ｅｕｌｅｒ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８５，７２３６−４５（２０１１）；およびＢｕｎｎｉｋ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６，９９５−７（２０１０））ような一次ＨＩＶ−１変異体での感染を用いるＰＢＭＣベースの分析を用いて評価した。ＰＧＴ１２１（「リガンドを持たない」および「リガンドを持つ」）、１０−１０７４およびＧＬ Ｆａｂ断片の構造を、それぞれ２．８Å、２．３Å、１．８Åおよび２．４Å分解能への分子置換によって解明した。

【0107】

単一Ｂ細胞ＲＴ−ＰＣＲおよびＩｇ遺伝子分析
患者１０（ｐｔ１０；Ｎａｔｕｒｅ ４７７（７３６５）：４６６−４７０では患者１７と呼ばれている）ＰＢＭＣからのｇｐ１４０^＋ＣＤ１９^＋ＩｇＧ^＋Ｂ細胞の単一細胞選別、ｃＤＮＡ合成およびＩｇ遺伝子のネステッドＰＣＲ増幅は、以前の研究（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（９）：ｅ２４０７８）で行った。ＰＧＴ１２１クローナル変異体によって発現されたＩｇλ遺伝子を、突然変異を受ける可能性のある領域（３１）を避けるためにリーダー領域内のさらに上流のフォワードプライマー（Ｌ−Ｖλ３−２１^＊０２：５’ＣＴＧＧＡＣＣＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧ ３’）を使用してＰＣＲ増幅した。すべてのＰＣＲ産物をシークエンシングし、Ｉｇ遺伝子使用、ＣＤＲ３分析およびＶＨ／Ｖκ体細胞超変異数について分析した（ＩｇＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔおよびＩＭＧＴ（登録商標）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）。ＣｌｕｓｔａｌＷ分析機能（デフォルトパラメータ）を有するＭａｃＶｅｃｔｏｒプログラム（ｖ．１２．５．０）を用いて多重配列アラインメントを行い、また、それらを用いて、隣接結合法によって（ベストツリーモードおよび外群付根法で）系統樹を生成した。あるいは、ＵＰＧＭＡ法を（ベストツリーモードで）用いて系統樹を生成した。

【0108】

ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体の生殖細胞系（ＧＬ）前駆体遺伝子セグメントを、ＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ）およびＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／）を使用してＶ_Ｈ４−５９^＊０１、Ｊ_Ｈ６^＊０３、Ｖ_Ｌ３−２１^＊０２およびＪ_Ｌ３^＊０２として同定した。（これらの遺伝子セグメントは、ヒト抗体のレパートリーの中で最も頻繁に使用されるものである（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（８）：ｅ２２３６５；Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６４（５）：３３７−３５０）。代表ＧＬ祖先配列を構築するために、我々は、ＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ）を使用して、１０−９９６（最少体細胞超変異を含有する抗体）のＩｇＨおよびＩｇＬ配列をＧＬ配列にアラインした。ＧＬ ＩｇＨ配列は、成熟Ｖ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントをそれらのＧＬ対応部分で置換し、Ｎ領域ヌクレオチドおよびＤ_Ｈ遺伝子セグメントを含むＣＤＲＨ３領域のために１０−９９６配列を使用することによって構築した。ＧＬ ＩｇＬ配列は、Ｖ_Ｌ３−２１^＊０２およびＪ_Ｌ３^＊０２遺伝子セグメント配列から構築した。

【0109】

抗体のクローニングおよび生産
精製され消化されたＰＣＲ産物をヒトＩｇγ_１発現またはＩｇλ発現ベクター（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９（１−２）：１１２−１２４）にクローニングした。その後、ＩｇＨおよびＩｇλ遺伝子を含有するベクターをシークエンシングし、元のＰＣＲ産物配列と比較した。ＰＧＴ１２１および１０−３０３は、同じＩｇλ遺伝子を共有し、ＩｇＨ遺伝子の位置２での１つのアミノ酸の違いを有した（図４）；それ故、ＰＧＴ１２１ ＩｇＧを生産するために、我々は、部位特異的突然変異（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により１０−３０３ＩｇＨ遺伝子に単一置換（Ｖ２Ｍ）を導入することによって生成した１０−３０３ＩｇλおよびＰＧＴ１２１ ＩｇＨ遺伝子を使用した。Ｈｉｓタグ付きＦａｂを生成するために、ＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ１ドメイン、続いて６ｘ−Ｈｉｓタグをコードするために我々の標準Ｉｇγ_１ベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１（５６３８）：１３７４−１３７７）を修飾することにより、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４ Ｖ_Ｈ遺伝子を６ｘＨｉｓ−ＩｇＣγ１発現ベクターにサブクローニングした。ＰＧＴ１２１_ＧＭ（Ｓ３２Ｙ、Ｋ５３Ｄ、Ｓ５４Ｒ、Ｎ５８Ｔ、Ｈ９７Ｒ、Ｔ１００ｌＹ）および１０−１０７４_ＧＭ（Ｙ３２Ｓ、Ｄ５３Ｋ、Ｒ５４Ｓ、Ｔ５８Ｎ、Ｒ９７Ｈ、Ｙ１００ｌＴ）突然変異体抗体をコードするＩｇＨ ＤＮＡ断片を、合成ミニ遺伝子（ＩＤＴ）として得、Ｉｇγ_１発現ベクターにサブクローニングした。

【0110】

１０−１０７４_ＧＭについての重鎖配列を下に列挙し、突然変異に下線を引く。１０−１０７４_ＧＭの軽鎖配列は、１０−１０７４と同じである。
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＶＴＣＳＶＳＧＤＳＭＮＮＳＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＫＳＥＳＡＮＹＮＰＳＬＮＳＲＶＶＩＳＲＤＴＳＫＮＱＬＳＬＫＬＮＳＶＴＰＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＡＲＨＧＱＲＩＹＧＶＶＳＦＧＥＦＦＴＹＹＳＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ。

【0111】

抗体およびＦａｂ断片は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）−沈殿法（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（９）：ｅ２４０７８）を用いてＩｇＨおよびＩｇＬ発現プラスミドの指数成長ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）への一過性トランスフェクションにより生産した。プロテインＧセファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をその製造業者の説明書に従って使用してＩｇＧ抗体を親和性精製した。下で説明するようにＨｉｓＰｕｒ（商標）コバルト樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＦａｂ断片を親和性精製した。

【0112】

ＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をその製造業者の説明書に従って使用して、アラニン突然変異をｐＹＵ−２ ｇｐ１２０ベクター（Ｊ．Ｓｏｄｒｏｓｋｉ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌからの贈与品）の位置３０１から３０３（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ）、３２４から３２５（Ｇｌｙ−Ａｓｐ）および３３２（Ａｓｎ）（ＨＸＢｃ２アミノ酸番号付け）に導入した。同じ手順を用いて、ｐＹＵ−２ ｇｐ１２０^{Ｎ３３２Ａ}ベクターにおけるＡｓｎ２６２_{ｇｐ１２０}とＡｓｎ４０６_{ｇｐ１２０}の間に位置する各ＰＮＧＳに単一アラニン突然変異を導入することによって「二重グリカン」突然変異体を生成した。部位特異的突然変異をＤＮＡシークエンシングによって確認した。

【0113】

ＹＵ−２ ｇｐ１４０（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（１２）：５７１６−５７２５）、ＹＵ−２ ｇｐ１２０、ＨＸＢ２ｃ ｇｐ１２０^コア（Ｎａｔｕｒｅ ３９３（６６８６）：６４８−６５９）、ＨＸＢ２ｃ ２ＣＣコア（ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ５（５）：ｅ１０００４４５）タンパク質、およびＹＵ−２ ｇｐ１２０突然変異体タンパク質をコードする発現ベクターを使用して、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。高マンノースのみのＹＵ−２ ｇｐ１２０タンパク質（ｇｐ１２０_ｋｉｆ）を生産するために、２５μＭキフネシン（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をトランスフェション時に添加した。培養上清を回収し、１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム；ｐＨ７．４への試料の緩衝液交換を可能にする遠心分離ベースの濾過装置（Ｖｉｖａｃｅｌｌ １００、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｍｂｈ）を使用して濃縮した。ＨｉｓＰｕｒ（商標）コバルト樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をその製造業者の説明書に従って使用してアフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。

【0114】

脱グリコシル化反応のために、ＰＢＳ中の５０μｇのＨＥＫ ２９３Ｔ細胞生産ＹＵ−２ ｇｐ１２０を一晩、３７℃で、変性剤を含有しないそれぞれの反応バッファー中の２００ＵのＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）または１０，０００ＵのＥｎｄｏ Ｈ_ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してバッファーをＰＢＳに交換した後、グリコシダーゼ処理されたｇｐ１２０（２００ｎｇ）を、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて銀染色（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって検査した。

【0115】

ＥＬＩＳＡｓ
高結合性９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を一晩、ＰＢＳ中の１００ｎｇ／ウェルの精製ｇｐ１２０で被覆した。洗浄後、プレートを２時間、２％ＢＳＡ、１μＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（ブロッキングバッファー）でブロックし、その後、２時間、２６．７ｎＭ（またはＹＵ−２ ｇｐ１２０二重グリカン突然変異体を使用するＥＬＩＳＡについては４２７．２ｎＭ）の濃度のＩｇＧとともにインキュベートし、ＰＢＳで７回連続的に１：４希釈した。洗浄後、ヤギＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）（ブロッキングバッファー中０．８μｇ／ｍＬで）との１時間のインキュベーションにより、およびＨＲＰ色素原基質（ＡＢＴＳ溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（９）：ｅ２４０７８）の添加によりプレートを進めた。選択されたｇｐ１２０^Ｖ３オーバーラッピングペプチドへの抗体結合を、前に説明したペプチド−ＥＬＩＳＡ法を用いて試験した。

【0116】

競合ＥＬＩＳＡｓのために、ｇｐ１２０被覆プレートを２時間、ブロッキングバッファーでブロックし、その後、ＰＢＳ中の抗体競合物質の１：２系列希釈液（５．２から６６７ｎＭのＩｇＧ濃度範囲）中、ビオチン化抗体（ＰＧＴ１２１については２６．６ｎＭ、１０−１０７４については０．２１ｎＭ、１０−９９６については０．４３ｎＭ、および１０−１３６９については１．６７ｎＭの濃度で）とともに２時間インキュベートした。ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）を（ブロッキングバッファー中、０．８μｇ／ｍＬで）使用して、上で説明したようにプレートを進めた。すべての実験を少なくとも繰り返しで行った。

【0117】

グリカンマイクロアレイ分析
脂質に結合したグリカンプローブ（ネオ糖脂質）を、２つのレベル（２および５ｆｍｏｌ／スポット）で、繰り返し、ニトロセルロース被覆スライドガラスにロボット制御でプリントすること（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ８０８：１１７−１３６）により、マイクロアレイを生成した。高マンノースおよび複合型のＮグリカンに由来する１５のネオ糖脂質を含有するマイクロアレイを用いて、結合アッセイを行った。プローブの配列を図７Ａに示す。簡単に言うと、抗体を５０μｇ／ｍＬで試験し、結合をビオチン化抗ヒトＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７標識ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で検出した。

【0118】

表面プラズモン共鳴
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ）（Ｎａｔｕｒｅ ４６７（７３１５）：５９１−５９５）を用いて実験を行った。簡単に言うと、ＹＵ−２ ｇｐ１４０およびｇｐ１２０タンパク質を３００ＲＵのカップリング密度でＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ）上に第一級アミンカップリングさせた。抗ｇｐ１２０ ＩｇＧおよび生殖細胞系前駆体（ＧＬ）を、３５μＬ／分の流量と３分の会合相および５分の解離相で、１μＭおよび１０μＭでそれぞれフローセル上に注入した。１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．５の５０μＬ／分の流量での３０秒の注入によって、センサー面を再生した。解離（ｋ_ｄ（秒^−１））、会合（ｋ_ａ（Ｍ^−１秒^−１）および結合定数（Ｋ_Ｄ（Ｍ）またはＫ_Ａ（Ｍ^−１）を、バルク反射係数（ＲＩ）補正のない１：１結合モデルを使用して、背景差分後、動態解析から算定した（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア）。１：１結合モデルを使用して算定した二価ＩｇＧについての結合定数を、Ｋ_Ｄ値が潜在的結合活性効果（ａｖｉｄｉｔｙ ｅｆｆｅｃｔｓ）を含むことを強調するために、本文書では「見かけの」親和性と呼ぶ。

【0119】

中和アッセイ
ＴＺＭ．ｂｌ細胞におけるルシフェラーゼベースのアッセイ（Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９（１６）：１０１０８−１０１２５）を用いて、ウイルス中和を評価した。試験したＨＩＶ−１シュードウイルスは、主に、ｔｉｅｒ−２およびｔｉｅｒ−３ウイルス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４（３）：１４３９−１４５２）を含有した（表４および５）。高マンノースのみのシュードウイルスを、２５μＭキフネシンで処理された野生型細胞（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において（図８Ｃ）またはＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ^−／−細胞において（図８Ｄ）生産した。非線形回帰分析を用いて、最大半量の阻害が観察された濃度（ＩＣ_５０値）を算定した。１９８５年と１９８９年の間のセロコンバージョン日が判っているクレードＢ感染ドナー（「過去の抗体陽転者」、ｎ＝１４）または２００３年と２００６年のセロコンバージョン日が判っているクレードＢ感染ドナー（「現在の抗体陽転者」、ｎ＝２１）から単離した一次ＨＩＶ−１変異体（ｎ＝９５）での感染を用いて、以前に特性付けされたＰＢＭＣに基づくアッセイ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８５（１４）：７２３６−７２４５；Ｎａｔ Ｍｅｄ １６（９）：９９５−９９７）でも中和活性を評価した。各抗体の中和活性を、中和されたウイルスの割合を０．００１から５０μｇ／ｍＬの範囲のＩＣ_５０値にフィッティングするＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ５．０ｂ）を使用してベストフィット曲線下面積として算定した。（１０−１０７４で得られた）最高値によってすべてのＡＵＣ値を正規化することにより、相対曲線下面積（ＲＡＵＣ）値を導出した。

【0120】

統計分析
統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ５．０ｂ）で行った。ｇｐ１２０およびｇｐ１４０に対する抗体の見かけの結合親和性に対する、選択された９ウイルス株パネルに対するＴＺＭ−ｂｌアッセイにおける中和効力を、スピアマン相関検定を用いて分析した。マン・ホイットニー検定を用いて、（ｉ）ＰＧＴ１２１または１０−１０７４群に属する抗体のｇｐ１２０／ｇｐ１４０に対する親和性、および（ｉｉ）過去および現在の抗体陽転者から単離されたウイルスに対する中和活性を比較した。

【0121】

結晶化および構造決定
結晶化のために６ｘ−Ｈｉｓタグ付きＰＧＴ１２１、１０−１０７４および１０−９９６ＧＬ Ｆａｂを発現させた。Ｆａｂを一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞の上清から逐次的Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアフィニティー（Ｑｉａｇｅｎ）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。リガンドを持たないＰＧＴ１２１ Ｆａｂの結晶については、ＰＧＴ１２１ ＩｇＧを一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞の上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ）によって単離し、そのＩｇＧのパパイン切断によってＦａｂ断片を得、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。

【0122】

精製されたＦａｂをＰＢＳバッファー中８〜２０ｍｇ／ｍＬ（「リガンドを持たない」ＰＧＴ１２１、８ｍｇ／ｍＬ；１０−１０７４およびＧＬ、２０ｍｇ／ｍＬ）に濃縮した。３倍モル過剰のＮＡ２グリカンと混合し、２０℃で２時間インキュベートしたタンパク質試料（最終濃度：１５ｍｇ／ｍＬ）から、「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１ Ｆａｂ結晶を調製した。２０℃で、１：１のタンパク質対リザーバ比を用いて、４００ｎＬ液滴で、Ｍｏｓｑｕｉｔｏ（登録商標）結晶化ロボット（ＴＴＰ ｌａｂｓ）で、結晶化状態をスクリーニングした。「リガンドを持たない」ＰＧＴ１２１ Ｆａｂの結晶（Ｐ２_１２_１２_１；ａ＝５６．８、ｂ＝７４．７、ｃ＝１１４．９Å）を、２４％ＰＥＧ ４，０００、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、１０ｍＭ ＣｕＣｌ_２中で得、「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１ Ｆａｂの結晶（Ｐ２_１２_１２_１；ａ＝６７．８、ｂ＝６７．８、ｃ＝９４．１Å）を、１７％ＰＥＧ １０，０００、０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐＨ５．５、０．１Ｍ ＣＨ_３ＣＯＯＨＮＨ_４中で得た。１０−１０７４ Ｆａｂの結晶（Ｐ２_１；ａ＝６１．４、ｂ＝４０．３、ｃ＝８４．５Å；β＝９５．３９°）を、２５％ＰＥＧ ３，３５０、０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐＨ５．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ中で得、ＧＬ Ｆａｂの結晶（Ｐ２_１；ａ＝５４．９、ｂ＝３４４．７、ｃ＝５５．２Å；β＝９１．９５°）は、２０％ＰＥＧ ３，３５０、０．２４Ｍマロン酸ナトリウムｐＨ７．０、１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２中で得た。２０％グリセロール（「リガンドを持たない」および「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１ Ｆａｂ）または２０％エチレングリコール（１０−１０７４ＦａｂおよびＧＬ Ｆａｂ）を含有する母液に浸漬し、その後、液体窒素でフラッシュ冷却することによって、結晶を凍結保護した。

【0123】

Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ（ＳＳＲＬ）においてＰｉｌａｔｕｓ ６Ｍピクセル検出器（Ｄｅｃｔｒｉｓ）を用いてビームライン１２−２（波長＝１．０２９Å）で回折データを収集した。ＸＤＳを使用してデータにインデックスを付け、統合し、スケール化した。「リガンドを持たない」ＰＧＴ１２１ Ｆａｂ結晶から得たデータを用い、我々は、Ｐｈｅｎｉｘを使用して、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３ループ内の残基を除去した後の２つの検索モデル、すなわち、ＰＧＴ１２８ ＦａｂのＣ_Ｈ−Ｃ_Ｌドメイン（ＰＤＢコード３ＰＶ３）および２Ｆ５のＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌドメイン（ＰＤＢコード３ＩＤＪ）を用いて１つの非対称ユニット（重および軽鎖についての鎖ＨおよびＬ、それぞれ）につき１つのＦａｂの分子置換ソリューションを見つけた。その後、我々は、「リガンドを持たない」ＰＧＴ１２１構造を検索モデルとして用いて、「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１ Ｆａｂ（１つの非対称ユニットにつき１つのＦａｂ）、１０−１０７４ Ｆａｂ（１つの非対称ユニットにつき１つのＦａｂ）およびＧＬ（１つの非対称ユニットあたり４つのＦａｂ）についての分子置換ソリューションを見つけた。

【0124】

Ｐｈｅｎｉｘを用いて反復改良（ＧＬについての非結晶学的対称拘束を含む）を行い、Ｃｏｏｔを用いてモデルを電子密度マップに手動でフィッティングした。原子モデルをＰＧＴ１２１ Ｆａｂについては３．０Å分解能（Ｒ_ｗｏｒｋ＝２１．６％、Ｒ_ｆｒｅｅ＝２６．４％）に、１０−１０７４ Ｆａｂについては、１．９Å分解能（Ｒ_ｗｏｒｋ＝１８．７％、Ｒ_ｆｒｅｅ＝２２．３％）に、４つのＧＬ Ｆａｂ分子については２．４Å分解能（Ｒ_ｗｏｒｋ＝１９．４％、Ｒ_ｆｒｅｅ＝２３．７％）におよび「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１ Ｆａｂについては２．４Å分解能（Ｒ_ｗｏｒｋ＝２０．１％、Ｒ_ｆｒｅｅ＝２４．９％）に改良した。ＰＧＴ１２１ Ｆａｂの原子モデルは、ラマチャンドランプロットの好適、許容および非許容領域内に９５．２％、４．９％および０．０％の残基をそれぞれ含有する（１０−１０７４ Ｆａｂ：９８．８％、０．９％、０．２％；ＧＬ Ｆａｂ：９６．０％、３．８％、０．２３％；「リガンドを持つＰＧＴ１２１ Ｆａｂ：９６．７％、３．１％、０．２％）。ＰｙＭＯＬを分子可視化のために、およびＦａｂ構造の図を生成するために使用した。埋まっている表面積の算定は、１．４Åプローブを使用してＡｒｅａｉｍｏｌ（ＣＣＰ４スイート）で行った。

【0125】

ＰｙＭＯＬのＳｕｐｅｒスクリプトを用いてＦａｂ構造を整合した。ＰＤＢｅＦｏｌｄを用いて、ペアワイズＣαアラインメントを行った。

【0126】

実施例２ ＰＧＴ１２１クローン型の優勢および多様性
ＹＵ−２ ｇｐ１４０三量体を「ベイト」として使用してクレードＡ感染アフリカ人ドナーからｇｐ１４０特異的ＩｇＧメモリーＢ細胞を単離した。２３のユニークなクローンファミリーに対応する、８７のマッチする免疫グロブリン重（ＩｇＨ）および軽（ＩｇＬ）鎖遺伝子を同定した。ＩｇＨ抗ｇｐ１４０レパートリーでは１つのクローンファミリーが優勢であり、それはすべての増殖Ｂ細胞クローンの約２８％に相当する。このＢ細胞ファミリーは、ＰＧＴ１２１−１２３と同じクローンに対応し（Ｎａｔｕｒｅ ４７７（７３６５）：４６６−４７０）、３８メンバーを含有し、そのうち２９は、ヌクレオチドレベルでユニークな変異体であった（表３）。それらのＩｇＨヌクレオチド配列に基づき、ＰＧＴ１２１ファミリーは、２群に分かれる：ＰＧＴ１２１−１２３および９つの近縁変異体を含有するＰＧＴ１２１様群と、２０メンバーを含有する、１０−１０７４様の、第二の群。我々の旧来のプライマー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９（１−２）：１１２−１２４；Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１（５６３８）：１３７４−１３７７）は、フレームワーク領域１をコードする領域でのヌクレオチド欠失のためＰＧＴ１２１Ｂ細胞クローンによって発現されるＩｇＬ遺伝子を増幅しなかったが、大きく体細胞突然変異した遺伝子を増幅するように設計された新たなＩｇλ特異的プライマーを使用して３８Ｉｇλ遺伝子のうちの２４の遺伝子を得た（表３）。ＩｇＨ遺伝子の高い超突然変異レベル（平均でＶＨ遺伝子の１８．２％）と一致して、増幅されたＩｇλ遺伝子は、非常に突然変異しており（平均でＶλ遺伝子の１８．２％）、フレームワーク領域１（ＦＷＲ１）にヌクレオチド欠失（１２から２１ヌクレオチド）をおよびフレームワーク領域３（ＦＷＲ３）に９ヌクレオチド挿入を有した（図３Ｂおよび表３）。

【0127】

３つのＰＧＴ抗体（ＰＧＴ−１２１、−１２２および−１２３）、１１のＰＧＴ１２１および１０−１０７４クローナル変異体（１０−２５９、１０−３０３、１０−４１０、１０−８４７、１０−９９６、１０−１０７４、１０−１１２１、１０−１１３０、１０−１１４６、１０−１３４１、１０−１３６９、および１０−１０７４ＧＭ、）、推定生殖細胞系（ＧＬ）、およびコンセンサス配列の配列アラインメントを図３（ａ）および３（ｂ）に示す。ＩＭＧＴおよびＫＡＢＴ両方のシステムに従って、対応する重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲについての配列を下の表１に収載する。ＫＡＢＴシステムに従って配列に割り当てられた配列識別番号を下の表２に収載する。

【0128】

【表1-1】

【0129】

【表1-2】

【0130】

【表1-3】

【0131】

【表1-4】

【0132】

【表2】

【0133】

１１の新規のユニークな変異体を発現させ（表３）、ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＹＵ−２ ｇｐ１２０およびｇｐ１４０への結合を実証した。別段の注記がない限り、これらおよび他の実験についてのｇｐ１２０およびｇｐ１４０タンパク質は、複合型Ｎグリカンまたは高マンノースＮグリカンのいずれかをＰＮＧＳに結合させることができる哺乳動物細胞において発現させた。ｇｐ１２０との反応性レベルは、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４群に属する抗体間で異なり、後者のほうが、主として１０−１０７４類縁抗体についてのｇｐ１２０／ｇｐ１４０からの遅い解離（図４Ｂ）のため、高い見かけの親和性を呈示した（図３Ａ）。

【0134】

実施例３ ＰＧＴ１２１および１０−１０７４エピトープ
Ｖ３ループステムの近傍のＡｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}は、ＰＧＴ１２１による結合およびウイルス中和に極めて重要であると報告されており（Ｎａｔｕｒｅ ４７７（７３６５）：４６６−４７０）、それ故、我々は、ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体による抗原認識におけるＶ３の役割を調査した。Ｖ１−Ｖ３ループを欠く（ｇｐ１２０^コア）またはＶ３の一部分を保持する（２ＣＣ−コア）ＨＸＢ２ ｇｐ１２０「コア」タンパク質を使用し、およびＶ３ステムに二重アラニン置換を有するＹＵ−２ ｇｐ１２０突然変異体タンパク質（ｇｐ１２０^{ＧＤ３２４−５ＡＡ}）を使用して、ＥＬＩＳＡを行った。試験した抗体は、インタクトＹＵ−２ ｇｐ１２０と比較してＶ３ループを欠く変異体およびｇｐ１２０^{ＧＤ３２４−５ＡＡ}に対する減少した反応性を示し、１０−１０７４群抗体の結合が最も影響を受けた（図５ＡおよびＢ）。これらの結果は、両方の抗体群による認識が、Ｖ３ループの近傍のタンパク質決定基を必要とすることを示唆する。Ｖ３に及ぶオーバーラッピングペプチドに結合した抗体はなく、これは、標的エピトープが、不連続であること、および／または単離されたペプチドによって達成されない特定の高次構造を必要とすることを示唆する（図５Ｃ）。

【0135】

Ａｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}（以前の番号付け（Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ７（４）：１６６０−１６７４）ではＡｓｎ３３７_{ｇｐ１２０}）は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒと定義された有望なＮ−グリコシル化部位（ＰＮＧＳ）のＮ末端残基である。Ａｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}および／またはそのＮ結合グリカンが、新規ＰＧＴ１２１群および１０−１０７４群抗体のｇｐ１２０反応性に必要とされるかどうかを判定するために、我々は、ＥＬＩＳＡによってＹＵ−２ｇｐ１２０^{Ｎ３３２Ａ}へのそれらの結合を試験した。Ｎ３３２Ａ置換は、ＰＧＴ１２１およびすべての新規抗体変異体の結合を減少させたが、隣接グリコシル化部位を欠く突然変異体ｇｐ１２０（ｇｐ１２０^{ＮＮＴ３０１−３ＡＡＡ}突然変異体）に対するそれらの反応性は不変であった。Ａｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}ＰＮＧＳに加えて、ＰＮＧＳが、新規抗体による認識に影響を及ぼすかどうかを判定するために、我々は、ＹＵ−２ ｇｐ１２０におけるＮ３３２Ａ突然変異をＡｓｎ２６２_{ｇｐ１２０}とＡｓｎ４０６_{ｇｐ１２０}間に位置するＰＮＧＳの突然変異と組み合わせた一連の１１の二重グリカン突然変異体を構築した。ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体のすべてが、ｇｐ１２０^{Ｎ３３２Ａ}に対する親和性について匹敵する親和性で二重グリカン突然変異体の各々に結合した。

【0136】

ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体による全グリカン認識を比較するために、我々は、複合型Ｎ−グリカンと高マンノースＮ−グリカンの両方を切断するＰＮＧａｓｅ Ｆで処理したＹＵ−２ ｇｐ１２０へのそれらの結合を調査した。ｇｐ１２０は、それが変性されない限り、酵素的により完全に脱グリコシル化され得ないので、ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理は、天然にフォールディングされたｇｐ１２０の部分的な脱グリコシル化をもたらした（図６）。それにもかかわらず、前記２群の抗体の反応性は、ＰＮＧａｓｅ Ｆによるｇｐ１２０の部分的脱グリコシル化が、すべてのＰＧＴ１２１様抗体の結合活性を減少させたが、いずれの１０−１０７４様抗体の結合活性も減少させなかった点で異なった（図６Ｃ）。高マンノースＮ−グリカンを切断するが複合型Ｎ−グリカンを切断しないＥｎｄｏ Ｈで処理したＹＵ−２ ｇｐ１２０を用いて行った類似の実験は、ＰＧＴ１２１様抗体より１０−１０７４様抗体の結合に影響を及ぼした（図６Ｄ）。

【0137】

Ｎ−グリカンマイクロアレイにより、７つの試験したＰＧＴ１２１様抗体のうちの６つは、ガラクトースまたはα２−６結合シアル酸を末端に有する複合型モノまたはバイアンテナＮ−グリカンへの検出可能な結合を示すが、高マンノース型グリカンへの検出可能な結合を示さないことが明らかになった。これは、ＰＧＴ１２１−１２３の高マンノースＮグリカンへの結合がない、ならびにｇｐ１２０結合についてのＭａｎ_４およびＭａｎ_９デンドロンによる競合がないという以前の報告を確証し、拡張する（図７）。対照的に、１０−１０７４様抗体による無タンパク質のグリカンへの検出可能な結合はなかった（図７）。ＰＧＴ１２１様抗体は、無タンパク質の複合型Ｎ−グリカンに結合し、高マンノースＮ−グリカンには結合しなかったが、ＰＧＴ１２１様抗体は、ＰＮＧＳへの高マンノースグリカンの排他的結合をもたらすマンノシダーゼ阻害剤であるキフネシンで処理した細胞において生産されたＹＵ−２ ｇｐ１２０（ｇｐ１２０_ｋｉｆ）への結合を保持した（図８Ｂ）。ＰＧＴ１２１様抗体の大部分は、ｇｐ１２０_ｋｉｆへの結合に、小さいが再現性のある減少を呈示した。一方、１０−１０７４様抗体は、ｇｐ１２０_ｋｉｆへの完全結合を保持した（図８Ｂ）。これらの結果は、高マンノースＮグリカンはもちろん、複合型Ｎ−グリカンも、ＰＧＴ１２１様抗体のエピトープに関与し得るという仮説と一致する。

【0138】

各群の２つの代表メンバー（ＰＧＴ１２１様群についてはＰＧＴ１２１および１０−１３６９；１０−１０７４様群については１０−１０７４および１０−９９６）を用いて競合ＥＬＩＳＡによりエピトープマッピング実験を行った。４つすべての抗体が交差競合を示したが、ＰＧＴ１２１は、１０−９９６および１０−１０７４のｇｐ１２０への結合を逆の場合より穏やかに阻害した。標的エピトープをさらにマッピングするために、我々は、Ｖ３ループのクラウン（図５）、ＣＤ４ｂｓ、共受容体結合部位（ＣＤ４誘導型；ＣＤ４ｉ）、一群の高マンノースＮ−グリカン（２Ｇ１２）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（１４）：７２９３−７３０５；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２（３８）：１３３７２−１３３７７））または位置３０１および３３２のＶ３ループおよびＮ結合グリカン（ＰＧＴ１２８）を認識する抗ｇｐ１２０抗体を使用した。抗Ｖ３クラウン抗体は、ＰＧＴ１２１および１０−１３６９の結合を阻害したが、１０−９９６および１０−１０７４の結合に干渉しなかった。ＰＧＴ１２８、およびより少ない程度に２Ｇ１２は、４つすべての抗体のｇｐ１２０への結合を減少させたが、ＣＤ４ｂｓおよびＣＤ４ｉ抗体は、減少させなかった。

【0139】

考え合わせると、これらのデータは、ＰＧＴ１２１クローンメンバーが、Ｖ３ループおよびＡｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}関連グリカンの近傍のタンパク質決定基を含む部位を認識することを示唆する。しかし、クローンは、ｇｐ１２０に対する親和性が異なるとともにエピトープ形成におけるグリカンの役割が異なる２つのファミリー、ＰＧＴ１２１様群および１０−１０７４様群、に分かれる。

【0140】

実施例４ 広域かつ強力なＨＩＶ中和
新規ＰＧＴ１２１変異体の中和活性を評価するために、我々は、ｇｐ１２０位置３３２のＰＮＧＳを欠くＲ１１６６．ｃ１を含む１０のウイルス株を使用して、ＴＺＭ−ｂｌ細胞のＨＩＶ感染を阻害するそれらの能力を測定した。１０−１０７４様抗体を含めて、すべてのＰＧＴ１２１変異体は、９つのシュードウイルスを中和し、およびいずれもＲ１１６６．ｃ１コントロールを中和しなかった（図１Ａおよび表４）。中和活性は、ＨＩＶスパイクに対する親和性と相関し、１０−１０７４群は、ＰＧＴ１２１群よりわずかに大きい効力を示した（図１Ｂおよび図４Ｃ）。ＰＧＴ１２１／１０−１０７４抗体クローン型の代表的な生殖細胞系バージョン（ＧＬ）は、ｇｐ１２０／ｇｐ１４０を結合することができず、そのパネル内のいずれのウイルスも中和することもできなかった。これは、体細胞突然変異が結合および中和には必要であることを含意する。ＧＬ軽鎖と突然変異１０−１０７４−または１０−９９６−群重鎖の対合は、結合または中和をレスキューすることができなかった。これは、両方の突然変異鎖が抗体パラトープの正しい構築に寄与することを示唆する。

【0141】

１１９の中和困難シュードウイルス（ｔｉｅｒ−２およびｔｉｅｒ−３として分類される）の拡張パネルに対するＰＧＴ１２１の中和活性と２つの１０−１０７４様抗体（１０−９９６および１０−１０７４）の中和活性を比較するために次のアッセイを行った（表４および５）。１０−９９６および１０−１０７４は、ＰＧＴ１２１に類似した中和効力および幅を示した（図１Ｃ、図９ならびに表５および６）。予想どおり、ｇｐ１２０位置３３２および／または３３４（Ａｓｎ３３２−Ｘ−Ｓｅｒ３３４／Ｔｈｒ３３４ＰＮＧＳに及ぶ）のアミノ酸変化を有する大部分のウイルスは、中和に対して耐性であった（８３．８％がＰＧＴ１２１に対して耐性であり、１００％が１０−１０７４および１０−９９６に対して耐性であった）。中和に対して耐性のウイルスの大部分（１０−９９６については６８．５％、１０−１０７４については７２．５％およびＰＧＴ１２１については６０．８％）が、このＰＮＧＳでの突然変異に起因した（表７）。匹敵する中和活性がＩｇＧおよびＦａｂ形態のＰＧＴ１２１および１０−１０７４について観察された。これは、二価がそれらの活性にとって重要でないことを示唆する（図１Ｄ）。

【0142】

ＰＧＴ１２１および１０−１０７４による中和におけるＨＩＶエンベロープ上の複合型Ｎ−グリカンの潜在的役割を評価するために、我々は、２つの異なる方法で、高マンノースのみのビリオンを生産した：キフネシンで処理した細胞におけるシュードウイルスの構築による、結果としてＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ結合グリカンが得られる方法、またはＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ^−／−細胞における構築による、結果としてＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ結合グリカンが得られる方法。我々は、ＰＧＴ１２１が、３つのキフネシン由来ＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性株のうちの２つを、野生型細胞において生産されたそれらの対応物と等価に中和することを発見した（図８Ｃ）。ＧｎＴＩ^−／−細胞において生産された２つのＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性ウイルス株は、野生型細胞において生産されたそれらの対応物と同等にＰＧＴ１２１および１０−１０７４に対して感受性があった。複合型Ｎ−グリカンは、ＣＤ４結合部位が抗体結合しないようにある程度保護するという以前の報告と一致して、ＧｎＴＩ^−／−細胞において生産されたウイルスは、ＣＤ４結合部位抗体（ＮＩＨ４５−４６^Ｇ５４Ｗおよび３ＢＮＣ６０）に対してより感受性があった（図８Ｄ）。

【0143】

実施例５ 新規伝染ＨＩＶ−１
次に、我々は、伝染始祖（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｆｏｕｎｄｅｒ）ウイルスに対するＰＧＴ１２１および１０−１０７４の活性を、１９８５年と１９８９年の間に抗体陽転した個体（「過去の抗体陽転者」、ｎ＝１４）または２００３年と２００６年の間に抗体陽転した個体（「現在の抗体陽転者」、ｎ＝２５）のコホートから単離した９５のクレードＢウイルスを使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ベースのアッセイで中和を評価することによって調査した（５１、５２）。我々は、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４を、抗ＣＤ４ｂｓ ｂＮＡｂおよび他のｂＮＡｂ（ＶＲＣ０１、ＰＧ９／ＰＧ１６、ｂ１２、２Ｇ１２、４Ｅ１０および２Ｆ５を含む）と比較した。中和活性のクラスター化分析は、２つの群への分離を示した；ＰＧＴ１２１／１０−１０７４群は、抗ＣＤ４ｂｓおよびＰＧ９抗体を含む最も活性の高いＨＩＶ中和剤を含んだ（表８）。驚くべきことに、１０−１０７４は、このクレードＢウイルスパネルに対して非常に優れた中和効力を示し、試験したすべてのｂＮＡｂについて０．１μｇ／ｍＬで最大幅（９５のクレードＢウイルスの６７％）を呈示した（表８）。１０−１０７４は、現在のクレードＢウイルスに対してＰＧＴ１２１より高い効力（〜２０倍差）を示したが、両方の抗体は、現在のウイルスより過去のウイルスに対して有効であった（図１Ｅおよび図１０）。

【0144】

実施例６ ＰＧＴ１２１、１０−１０７４およびＧＬの結晶構造
ＰＧＴ１２１様抗体と１０７４様抗体間の差の構造決定因子を調査するために、我々は、ＰＧＴ１２１、１０−１０７４および代表的な生殖細胞系前駆体（ＧＬ）のＦａｂ断片の結晶構造をそれぞれ３．０Å、１．９Åおよび２．４Å分解能で解明した（表９）。前記３つのＦａｂの中での重および軽鎖可変ドメイン（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）の重ね合わせにより、主鎖構造の保存とともにＧＬに対する差が親和性成熟ＦａｂのＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３ループの小さな変位に限定されることが明らかになった（表１０）。

【0145】

抗体により共有される珍しい特徴は、それらの長い（２５残基）ＣＤＲＨ３ループであり、このループは、Ｖ_ＨドメインＦおよびＧ鎖を伸長する２本鎖逆平行βシートを形成する。各Ｆａｂにおいて、伸長ＣＤＲＨ３ループの先端は、主として非極性残基を含有する。類似の構造的特徴が、エピトープがｇｐ１２０ Ｖ１Ｖ２ループを含む炭水化物感受性抗体であるＰＧＴ１４５のＣＤＲＨ３について観察された。しかし、ＰＧＴ１４５のＣＤＲＨ３の伸長された２本鎖βシートは、先端に２つの硫酸化チロシンを含む、負の電荷を有する残基を主として含有する。ＰＧＴ１２１およびＰＧＴ１４５のＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌのアラインメント（表１０）は、ＣＤＲＨ３_{ＰＧＴ１４５}が以前のＣＤＲＨ３_{ＰＧＴ１２１}を伸長すること、ならびにその先端とＶ_Ｈドメインは整列されるが、ＰＧＴ１２１、１０−１０７４およびＧＬのＣＤＲＨ３はＶ_Ｌの方に傾くことを示す。Ｖ_Ｌの方へのＣＤＲＨ３_{ＰＧＴ１２１}／ＣＤＲＨ３_{１０−１０７４}／ＣＤＲＨ３_ＧＬの傾きは、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３間のクレフトを開き、これは、類縁の抗体では共有されない特徴である。

【0146】

ＰＧＴ１２１および１０−１０７４は、ＧＬに対しておよび互いに大きく異なる（１３２残基のうち、ＰＧＴ１２１_ＶＨは、１０−１０７４_ＶＨおよびＧＬ_ＶＨとそれぞれ３６および４５残基異なり、１０−１０７４_ＶＨとＧＬ_ＶＨは２９異なる）。これらのＰＧＴ１２１／１０−１０７４の差の大部分は、ＣＤＲ_ＶＨループおよびＣＤＲＬ３にある。興味深いことに、ＣＤＲＨ３における６つの置換（残基１００ｄ、１００ｆ、１００ｈ、１００ｊ、１００ｌ、１００ｎ）は、２残基ごとに置換されるように交互になっており、その結果、Ｖ_ＬへのＣＤＲＨ３の傾きに起因してＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３間のクレフトが再び表面に現れることになる。この領域は、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４の異なる微細な特異性の一因となる可能性が高い。重鎖フレームワーク領域３（ＦＷＲ３_ＨＣ）における５つの他の溶媒曝露置換（残基６４、７８、８０−８２；鎖ＤおよびＥ）は、ＨＩＶ抗体におけるフレームワーク領域がｇｐ１２０と接触できることを考えると、潜在的抗原接触部位である。微細な特異性差の一因となり得る他の差としては、１０−１０７４またはＧＬには存在しないＡｓｐ５６_ＨＣの近傍のＰＧＴ１２１上の負のパッチ（１０−１０７４およびＧＬにおけるＳｅｒ５６_ＨＣ）、ならびにＧＬの類似した表面では見いだせないＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ３上の正のパッチが挙げられる。

【0147】

ＰＧＴ１２１および１０−１０７４に共通の体細胞突然変異は、それらのエピトープの共有の特徴に関与し得る。ＰＧＴ１２１および１０−１０７４の重鎖は、（３６のＰＧＴ１２１−ＧＬ差および２９の１０−１０７４−ＧＬ差のうち）３つの共通の突然変異しか共有しない。対照的に、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４は、（３７のＰＧＴ１２１−ＧＬ差および３６の１０−１０７４−ＧＬ差のうち）１８の共通の軽鎖突然変異を共有し、それらには、鎖ＤおよびＥを接続するループの膨隆の原因となる、軽鎖ＦＷＲ３内への挿入、および低負電荷の表面をもたらす、ＣＤＲＬ２_ＧＬ内のＡｓｐ５０_ＬＣ−Ａｓｐ５１_ＬＣのＰＧＴ１２１と１０−１０７４両方におけるＡｓｎ５０_ＬＣ−Ａｓｎ５１_ＬＣへの置換が含まれる。ＬＣ_{ＰＧＴ１２１}およびＬＣ_{１０−１０７４}に導入される多数の共通の置換（ＬＣ置換のおおよそ５０％）は、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４によって共有されるエピトープの潜在的接触領域としてＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＦＷＲ２_ＬＣを指摘する。

【0148】

次に、Ａｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}結合およびＡｓｎ３０１_{ｇｐ１２０}結合グリカンならびにＶ３を認識するＰＧＴ１２８であって、複合型Ｎ−グリカン変性タンパク質を生産することができない細胞において発現される外部ドメイン／ミニＶ３ループ ｇｐ１２０との複合体として解明されたものであるＰＧＴ１２８の構造との比較を行った。ＰＧＴ１２１および１０−１０７４のＣＤＲＨ３ループとは異なり、ＰＧＴ１２８_{ＣＤＲＨ３}は、ＰＧＴ１２８_ＶＬの方に傾いておらず、ＣＤＲＨ３_{ＰＧＴ１２８}は、２本鎖βシートを含まない。加えて、ＣＤＲＨ３_{ＰＧＴ１２８}（１８残基）は、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４（２４残基）のＣＤＲＨ３より短いが、ＣＤＲＨ２_{ＰＧＴ１２８}は、ＰＧＴ１２１または１０−１０７４においても見られない６残基挿入を含有する。これらの差のため、ＰＧＴ１２８ではＣＤＲＨ２が最も顕著な特徴であるのに対し、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４ではＣＤＲＨ３が最も顕著である。ＣＤＲＨ２_{ＰＧＴ１２８}およびＣＤＲＬ３_{ＰＧＴ１２８}は一緒に、Ａｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}に結合しているＭａｎ_８／９を認識し、ＣＤＲＨ３_{ＰＧＴ１２８}は、Ｖ３ループ基部と接触する。このｇｐ１２０認識モードは、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４には、それらのＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３ループの構造的特徴がＰＧＴ１２８のものと有意に異なるので、不可能であり、これは、無タンパク質高マンノースグリカンを認識する、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４ではなく、ＰＧＴ１２８の能力（図７）と一致する。

【0149】

実施例７ ＰＧＴ１２１−グリカン複合体の結晶構造
複合型シアル化バイアンテナグリカンを伴うＰＧＴ１２１の２．４Å分解能構造を、ＮＡ２、複合型アシアリルバイアンテナグリカン（図７）を含む条件下で得た結晶を使用して解明した（表９）。驚くべきことに、我々の結晶構造におけるＰＧＴ１２１に結合したグリカンは、ＮＡ２ではなく、むしろ、結晶格子内の隣接ＰＧＴ１２１ Ｆａｂからの複合型Ｎグリカン、具体的にはＡｓｎ１０５_ＨＣに結合しているＮ−グリカンであった。このグリカン同一性は、Ａｓｎ１０５_ＨＣへのグリコシド結合についてのおよびＭａｎα１−３Ｍａｎアンテナ上の末端シアル酸についての電子密度があるため、明らかである（Ｍａｎα１−６Ｍａｎアンテナのガラクトースおよびシアル酸部分は、未解明であった）。結合グリカンの組成は、マイクロアレイ実験においてＰＧＴ１２１により結合されたα２−６シアル化Ａ２（２−６）グリカンの部分に対応し（図７）、かつ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されたタンパク質上のＰＮＧＳに結合している複合型Ｎ−グリカンでの予想したシアリル結合に対応した。この構造（「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１）のＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌドメインは、結合Ｎ−グリカンのないＰＧＴ１２１構造（「リガンドを持たない」ＰＧＴ１２１）のＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌドメインに有意差なく重なり合う（図１０）が、エルボ屈曲角（ｅｌｂｏｗ ｂｅｎｄ ａｎｇｌｅ）（Ｖ_Ｈ−Ｖ_ＬとＣ_Ｈ１−Ｃ_Ｌ擬二分子（ｐｓｅｕｄｏ−ｄｙａｄ）間の角度）は構造間で異なる。この差は、結晶格子力に依存して変動し得るエルボ屈曲角をＦａｂにとらせる柔軟性を反映する可能性が高い。

【0150】

ある結晶構造（「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造）では複合型Ｎ−グリカンの結合が観察され、別の構造（「リガンドを持たない」ＰＧＴ１２１構造）では観察されなかったことを考えると、我々は、ｇｐ１２０に結合していない複合型Ｎ−グリカンに対するＰＧＴ１２１の親和性は、結晶中のＰＧＴ１２１の濃度（〜１０ｍＭ）の範囲内であると推測する。単離されたグリカンを結合するためのＫ_Ｄが、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２−ＡｓｎへのＰＧ９結合について得られた１．６ｍＭ Ｋ_Ｄに匹敵する、１〜１０ｍＭの範囲内であると仮定すると、単離されたグリカンのＰＧＴ１２１結合についてのＫ_Ｄは、ｇｐ１２０に対するＰＧＴ１２１の親和性、ｎＭ範囲である、へのほんの小さな寄与を表す（図４Ａ）。

【0151】

「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造内のグリカンは、Ｖ_Ｈドメインと排他的に相互作用し、３つすべてのＣＤＲ内の残基と広範に接触する（ＰＧＴ１２１_ＨＣ上の埋まっている表面積＝６００Å^２）。接触は、９つのアミノ酸での１０の直接の水素結合および１８の水媒介水素結合（図１１）を含み、枝分かれ部位のマンノースに結合したＮ−アセチルグルコサミン部分と１−３アンテナ上の末端シアル酸との間にグリカンを固定している。Ａｓｐ３１_ＨＣとの水媒介水素結合に加えて、ＰＧＴ１２１残基Ａｓｐ３１_ＨＣおよびＨｉｓ９７_ＨＣとの３つの直接の水素結合を含む、ＰＧＴ１２１とのいくつかの接触がこのシアル酸によってなされる。シアル酸は、水媒介グリカン内水素結合ネットワークにも寄与する。シアル酸との直接の接触は、我々のグリカンマイクロアレイ分析におけるＰＧＴ１２１のシアル化Ａ２（２−６）グリカンに対する、非シアル化ＮＡ２グリカンに対するよりも強い結合（図７）の説明になり得る。１−３アンテナのＮ−アセチルグルコサミンおよびガラクトース部分により確立される広範な水媒介タンパク質接触により、非シアル化モノおよびバイアンテナグリカンについてＰＧＴ１２１への観察された結合を説明することができるだろう（図７）。

【0152】

グリカンへの直接のまたはおそらくアミノ酸側鎖の接触に寄与する残基のうちの６つ（Ｓｅｒ３２_{ＨＣ−ＣＤＲＨ１}、Ｌｙｓ５３_{ＨＣ−ＣＤＲＨ２}、Ｓｅｒ５４_{ＨＣ−ＣＤＲＨ２}、Ａｓｎ５８_{ＨＣ−ＣＤＲＨ２}、Ｈｉｓ９７_{ＨＣ−ＣＤＲＨ３}、Ｔｈｒ１００ｌ_{ＨＣ−ＣＤＲＨ３}）は、１０−１０７４のもの（Ｔｙｒ３２_{ＨＣ−ＣＤＲＨ１}、Ａｓｐ５３_{ＨＣ−ＣＤＲＨ２}、Ａｒｇ５４_{ＨＣ−ＣＤＲＨ２}、Ｔｈｒ５８_{ＨＣ−ＣＤＲＨ２}、Ａｒｇ９７_{ＨＣ−ＣＤＲＨ３}、Ｔｙｒ１００ｌ_{ＨＣ−ＣＤＲＨ３}）と異なり、ＰＧＴ１２１様抗体間で高度に保存されるが、１０−１０７４様抗体間ではされない。１０−１０７４残基には、観察されたグリカン接触をなすための、または立体的衝突の原因となる嵩高い側鎖を有するための、対応する官能基がない。これらの残基のうちの４つは、ＧＬのもの（Ｔｙｒ３２_{ＨＣ−ＣＤＲＨ１}、Ｔｙｒ５３_{ＨＣ−ＣＤＲＨ２}、Ｇｌｎ９７_{ＨＣ−ＣＤＲＨ３}、Ｔｙｒ１００ｌ_{ＨＣ−ＣＤＲＨ３}）とも異なり、これは、我々のグリカンマイクロアレイにおける無タンパク質複合型グリカンへの１０−１０７４様抗体およびＧＬの結合の欠乏が、水素結合および／または立体的衝突（例えば、Ａｒｇ９７_{１０−１０７４}対してＨｉｓ９７_{ＰＧＴ１２１}；Ｔｙｒ１００ｌ_{１０−１０７４}対してＴｈｒ１００ｌ_{ＰＧＴ１２１}）の欠如に起因することを示唆する。ＣＤＲＨループにおいて、ＰＧＴ１２１と１０−１０７４群の間の配列の差の大部分のように、特に、我々が結合した複合型Ｎ−グリカンを観察したＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３の間のクレフトの表面について、ｇｐ１２０上の複合型グリカンの異なる認識は、観察されたそれらの微細な特異性の差のいくつかまたはすべての主要因でありうる。

【0153】

実施例８ グリカン含有抗体残基の置換は中和に影響を及ぼす
「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造から同定された複合型Ｎ−グリカン含有残基の寄与を評価するために、我々は、複合型グリカン含有残基をＰＧＴ１２１と１０−１０７４間で交換するように設計した２つの突然変異体抗体、すなわち、ＰＧＴ１２１残基（ＩｇＨ Ｙ３２Ｓ、Ｄ５３Ｋ、Ｒ５４Ｓ、Ｔ５８Ｎ、Ｒ９７Ｈ、Ｙ１００ｌＴにおける６置換）を有する１０−１０７４ ＩｇＧ、および相互置換を有するＰＧＴ１２１ ＩｇＧを産生した。「グリコミュータント」抗体（１０−１０７４_ＧＭおよびＰＧＴ１２１_ＧＭ）は、ＳＰＲによって測定したとき、ＹＵ−２ ｇｐ１２０／ｇｐ１４０に対して野生型に近い見かけの親和性を呈示した（図２Ａ）。これは、前記置換は、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４両方によって中和されたウイルス株に由来するエンベロープスパイクへの結合を破壊しなかったこと（図１Ａ）の証拠になる。ＰＧＴ１２１複合型Ｎ−グリカン含有残基を、両方の野生型抗体により結合されたｇｐ１２０／ｇｐ１４０への結合を破壊することなく１０−１０７４バックグラウンド内に適応させることができることは、微細な特異性差にもかかわらず抗原結合が総体的に類似していることを含意する。

【0154】

野生型ＰＧＴ１２１とは異なり、ＰＧＴ１２１_ＧＭは、マイクロアレイ実験においてグリカン結合を示さなかった。これは、置換位置の１０−１０７４残基が無タンパク質グリカン結合と適合性を有さないこと（図２Ｂ）を確証し、および「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造内のグリカンと接触している残基が前記マイクロアレイにおける複合型グリカンの認識に関与するという示唆を裏付ける。１０−１０７４_ＧＭもまた無タンパク質グリカンへの結合を示さなかった（図２Ｂ）。これは、無タンパク質複合型Ｎ−グリカンのための結合部位の生成に、置換されたものの他にも残基が関与することを示す。

【0155】

次に、ＴＺＭ−ｂｌベースのアッセイを用いて、野生型抗体と「グリコミュータント」抗体の中和を比較した。我々は、ＰＧＴ１２１または１０−１０７４に対して異なる耐性を有する株ならびに両方の野生型抗体に感受性の株を含む、４０のウイルス株を試験した（図２Ｃおよび表１２）。精製ＹＵ−２エンベロープタンパク質へのＰＧＴ１２１_ＧＭおよび１０−１０７４_ＧＭの結合と一致して、両方の突然変異体はＹＵ−２ウイルスを中和したが、ＰＧＴ１２１感受性株の６４％は、ＰＧＴ１２１_ＧＭに対して耐性であった（図２Ｃおよび表１２）。これは、「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造において同定されたグリカン含有残基が、ＰＧＴ１２１の中和活性に関係があることを示唆する。逆に、１０−１０７４_ＧＭは、４つの１０−１０７４感受性株（ＷＩＴＯ４１６０．３３、ＺＭ２１４Ｍ．ＰＬ１５、Ｃｅ１１７２＿Ｈ１、および３８１７．ｖ２．ｃ５９）に対する３倍より大きい効力増加を含めて、１０−１０７４感受性株に対して野生型１０−１０７４より高い平均効力を呈示した（図２Ｃおよび表１２）。一般に、１０−１０７４へのＰＧＴ１２１置換は、ＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性株では１０−１０７４_ＧＭに対する感受性を付与しないが、これらの株のうちの２つ（ＣＮＥ１９および６２３５７＿１４＿Ｄ３＿４５８９）は、１０−１０７４_ＧＭに対して感受性になった（それぞれ、ＩＣ_５０＝０．１９μｇ／ｍＬおよび４０．８μｇ／ｍＬ）。興味深いことに、これらは、インタクトＡｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}結合ＰＮＧＳを含む唯一のＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性株である。他のＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性株は、Ａｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}結合グリカンを欠き、かつＰＧＴ１２１_ＧＭおよび１０−１０７４_ＧＭに対して耐性であり、これは、野生型ＰＧＴ１２１に対するそれらの感受性が、隣接Ｎ−グリカン、および／またはエピトープのタンパク質部分による補償を必要とすることを含意する。機能の劇的な獲得が、１つの株（ＣＮＥ１９）に対する１０−１０７４_ＧＭについてのみ観察されたが、この結果は、１０−１０７４感受性株に対して１０−１０７４_ＧＭについて観察された一般的改善（図２Ｃ）とともに、結晶学的に同定されたグリカン含有残基がある状況ではＰＧＴ１２１様認識特性を１０−１０７４に移入する場合があり、および／または他の状況ではその効力に影響を及ぼす場合があるという解釈と一致する。加えて、ＰＧＴ１２１感受性株に対するＰＧＴ１２１_ＧＭの中和活性の喪失は、ＰＧＴ１２１の中和活性は、「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造において複合型Ｎ−グリカンと接触すると同定された残基を必要とすることの証拠となる。

【0156】

結果
ＰＧＴ１２１は、２つのクローン的に関連したメンバーのみを生じさせる、元をただせば機能性スクリーニングにおいてクレードＡ感染ドナーの血清中で同定された、グリカン依存性ｂＮＡｂである。ｇｐ１４０三量体を、単一細胞選別のための「ベイト」として使用して、２９の新たなクローナル変異体を単離した。ＰＧＴ１２１クローンファミリーは、近縁抗体のはっきりと異なる群、ＰＧＴ１２１群および１０−１０７４群、を含む。結果は、両方の群のエピトープが、Ａｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}およびＶ３ループの基部にＰＮＧＳを含むことを示唆する。ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体群は、アミノ酸配列、ｇｐ１２０／ｇｐ１４０結合親和性、および中和活性が異なり、１０−１０７４様抗体は、中和がＡｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}におけるインタクトＰＮＧＳに完全に依存するが、ＰＧＴ１２１様抗体は、Ａｓｎ３３２_{ｇｐ１２０}ＰＮＧＳを欠く一部のウイルス株を中和することができた。

【0157】

２つの抗体群間の注目に値する差は、ＰＧＴ１２１様抗体が炭水化物アレイにおいて複合型Ｎ−グリカンを結合したのに対して、１０−１０７４様抗体が試験したいずれの無タンパク質Ｎ−グリカンにも検出可能な結合を示さなかったことである（図７）。抗ＨＩＶ抗体による無タンパク質グリカン結合は、常に検出されるとは限らない；例えば、ＰＧ９は、ｇｐ１２０結合高マンノースグリカンを認識するが、マイクロアレイではいずれの無タンパク質グリカンへの結合も検出されなかった。したがって、グリカンマイクロアレイにおける陽性結果は、抗体エピトープの特定のグリカンの関与を含意するが、陰性結果は、グリカン認識を排除しない。例えば、たとえグリカンマイクロアレイ実験において検出可能でなくても、高マンノースグリカンは、ＰＧＴ１２１エピトープに関与することがあり、これは、高マンノースのみの形態のｇｐ１２０タンパク質およびビリオンの結合および中和と一致する（図８）。

【0158】

ＰＧＴ１２１、１０−１０７４およびそれらのＧＬ前駆体の間の差についての分子的基礎をそれらの結晶構造によって一部明らかにした。軽鎖体細胞突然変異体の大部分はＰＧＴ１２１および１０−１０７４間で共有されるが、重鎖の突然変異は異なるという発見は、軽鎖がｇｐ１２０エピトープの共有部分と接触し、重鎖がはっきりと異なる特徴部を認識することを示唆する。これらの三つの抗体のすべては、潜在エピトープの接近を可能にし得る非極性の先端を有する伸長したＣＤＲＨ３を呈示する。２つの成熟Ｆａｂの抗原結合部位の差は、主として、ＣＤＲＨ２と伸長したＣＤＲＨ３の間のクレフトに限局された。興味深いことに、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３間の推定抗原結合クレフトは、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４の代表的な生殖細胞系前駆体においても見つけられた。

【0159】

Ｖ_Ｈドメイン残基に結合している複合型シアル化Ｎ−グリカンが隣接ＰＧＴ１２１Ｆａｂの結合部位と相互作用する結晶構造からＰＧＴ１２１様抗体によるグリカン認識に関する構造情報を得た。「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造のいくつかの特徴は、それが、ＰＧＴ１２１様抗体によるｇｐ１２０上の複合型Ｎ−グリカンの認識を理解するために適していることを示唆する。第一に、α２−６シアル化グリカンＡ２（２−６）ＰＧＴ１２１に対応する構造におけるグリカンは、マイクロアレイにおいて結合する（図７）。第二に、前記グリカンは、エピトープ認識に関与することが構造分析により示唆されたＣＤＲＨ３とＣＤＲＨ２間のクレフトを用いてＰＧＴ１２１と相互作用し、このことは、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４構造におけるＶ_Ｌの方へのＣＤＲＨ３の異常な傾きを潜在的に説明する。第三に、グリカンと相互作用すると同定されたＶ_Ｈ残基の大部分は、ＰＧＴ１２１と１０−１０７４間で異なり、これにより、グリカンマイクロアレイにおける異なる結合プロファイルが合理的に説明され、およびタンパク質結合実験において明らかになった異なる微細な特異性を潜在的に説明する。第四に、ＰＧＴ１２１と１０−１０７４間の結晶学的に同定されたグリカン接触残基の交換は、一部分、それらの特性を転移した：ＰＧＴ１２１_ＧＭは、１０−１０７４同様、無タンパク質グリカンに結合しなかったが、ＰＧＴ１２１_ＧＭおよび１０−１０７４_ＧＭの両方が、精製ＹＵ−２ ｇｐ１２０／ｇｐ１４０への野生型に近い結合を保存した。ＰＧＴ１２１_ＧＭは、野生型ＰＧＴ１２１および１０−１０７４によって中和された一部のウイルス株を中和する能力を保持したが、ＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性である株を中和することはできなかった。これは、グリカン結合モチーフが、１０−１０７４耐性株に対するＰＧＴ１２１の中和活性にとって不可欠であることの証拠となる。相互交換のため、結晶学的に同定されたグリカンモチーフの転移と一致して、ならびにＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体のエピトープが類縁であるという仮説と一致して、１０−１０７４_ＧＭの中和効力は、１０−１０７４に対して増加され、または影響を受けず、およびある場合には、１０−１０７４_ＧＭは、ＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性株を強力に中和した。ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体に対して感受性のウイルスについてのＡｓｎ３３２ｇｐ１２０におけるＰＮＧＳとの相互作用以外、ＰＧＴ１２１中和データを入手できる株からのｇｐ１２０配列の分析において、１０−１０７４耐性株には一般にＡｓｎ３３２ｇｐ１２０関連ＰＮＧＳがないことを除き、ウイルス株の異なるカテゴリー（ＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４感受性、ＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性、ＰＧＴ１２１耐性／１０−１０７４感受性）についてＰＮＧＳ利用の明確なパターンは出てこない。

【0160】

実施例９ 抗ＨＩＶ−１中和ｍＡｂのインビボでの受動伝達
５つの単離された強力かつ広域作用性の抗ＨＩＶ中和モノクローナル抗体をアカゲザルに投与し、２４時間後にそれらのアガケザルを２つの異なるＳＨＩＶのいずれかで直腸内にチャレンジ感染した。チャレンジ感染した６０匹の動物から得た結果を併せることにより、曝露されたサルの５０％においてウイルス獲得を予防する血漿中の防御中和力価は、おおよそ１：１００であった。

【0161】

動物実験
この研究において用いたマカクは、ＭＨＣクラスＩＭａｍｕ−Ａ^＊０１対立遺伝子について陰性であった。

【0162】

Ｒ５指向性ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８の構築
ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯ（ＰＮＡＳ １０９，１９７６９−１９７７４（２０１２））ｇｐ１２０ Ｖ３コード領域の５’および３’の半分に対応するプライマー（フォワードプライマー：ＡＧＡＧＣＡＴＴＴＴＡＴＡＣＡＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＴＡＧＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＧＧＣ、およびリバースプライマー：ＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＣ）でのＰＣＲ突然変異誘発を用いて、これらのＶ３配列をｐＳＨＩＶＤＨ１２＿ＣＬ７分子クローンの遺伝的背景（Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８，５５１３−５５１９（２００４））に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＦＸ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して導入した。ゲル精製後、ＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で処理し、平滑末端結合してｐＳＨＩＶＤＨ１２＿Ｖ３ＡＤ８を生成し、それを使用してコンピテント細胞を形質転換させた。

【0163】

ウイルス
先ず、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して２９３Ｔ細胞をＳＨＩＶＡＤ８ＥＯまたはＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８分子クローンでトランスフェクトすることにより、ウイルスストックを調製した。４８時間後に培養上清を回収し、アリコートを使用するまで−８０℃で保管した。コンカナバリンＡ刺激性アカゲザルＰＢＭＣ（５００μＬ中、２×１０^６細胞）を１時間のスピノキュレーション（Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４，１００７４−１００８０（２０００））によりトラスフェクト細胞上清で感染させ、同数／体積の活性化ＰＢＭＣと混合し、培養培地を毎日置換して少なくとも１２日間、培養物を維持した。上清培地の試料をピークＲＴ生産時あたりでプールして個々のウイルスストックを調製した。

【0164】

抗体
１１のモノクローナル抗体（ＶＲＣ０１、ＮＩＨ４５−４６、４５−４６Ｇ５４Ｗ、４５−４６ｍ２、３ＢＮＣ１１７、１２Ａ１２、１ＮＣ９、および８ＡＮＣ１９５、１０−１０７４、ＰＧＴ１２１、およびＰＧＴ１２６）を単離し、生産した。ＤＥＮ３、デングウイルスＮＳ１特異的ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＰＮＡＳ １０９，１８９２１−１８９２５（２０１２））、または対照ヒトＩｇＧ（ＮＩＨ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｈｐｒｅａｇｅｎｔｓ．ｏｒｇ）を陰性対照抗体としてこの研究で使用した。曝露前受動伝達に選択したモノクローナル抗体を、ウイルスチャレンジ感染の２４時間前に静脈内投与した。

【0165】

血漿ウイルスＲＮＡレベルの定量
血漿中のウイルスＲＮＡレベルをリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ配列検出システム；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって決定した。

【0166】

血漿中の抗体濃度
サル血漿中の投与したモノクローナル抗体の濃度を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により、組換えＨＩＶ−１ＪＲＦＬ ｇｐ１２０（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）またはＨＩＶＩＩＩＢ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｃ）（Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，８３４０−８３４７（２００１））を使用して測定した。簡単に言うと、マイクロタイタープレートをＨＩＶ−１ ｇｐ１２０（２μｇ／ｍＬ）で被覆し、一晩、４℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、１％（容量／容量）ＢＳＡでブロックした。ブロッキング後、抗体または血漿試料の系列希釈物をそのプレートに添加し、１時間、室温でインキュベートした。アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２断片（Ｐｉｅｒｃｅ）で結合を検出し、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で視覚化した。中和モノクローナル抗体の減衰半減期を、抗体投与後第５日または第７日で開始する血漿濃度に基づく単一指数減衰式によって算定した（Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４，１３０２−１３１３（２０１０））。

【0167】

中和アッセイ
アカゲザルから採取した血漿試料中に存在する各ｍＡｂのインビトロ効力および中和活性を、２タイプの中和アッセイによって評価した；１）偽型チャレンジ感染ウイルスでのＴＺＭ−ｂｌエントリアッセイ（ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２６，８９−９８（２０１０））または２）複製可能なウイルスでの１４日ＰＢＭＣ複製アッセイ（Ｊ．ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６，２１２３−２１３０（２００２））。ＴＺＭ−ｂｌアッセイのために、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯまたはＳＨＩＶＤＨ１２＿Ｖ３ＡＤ８に由来するｅｎｖ遺伝子を発現する偽型ウイルスであって、それぞれのエンベロープタンパク質を発現するｐＮＬｅｎｖ１およびｐＣＭＶベクターで２９３Ｔ細胞をコトランスフェクトすることによって調製したものである偽型ウイルス（Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４，４７６９−４７８１（２０１０））とともに、系列希釈ｍＡｂまたは血漿試料をインキュベートした。５０％中和阻害用量（ＩＣ５０）力価を、細胞対照ＲＬＵ減算後、ウイルス対照ウェル中のレベルと比較した相対発光単位（ＲＬＵ）の５０％低下を生じさせる希釈度として算定した（Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４，１４３９−１４５２（２０１０））。サブタイプＢ ＨＩＶ−１単離体に対して広範な中和活性を呈示する（Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９１，２７９４−２８０３（２０１０））、コホート研究からの血漿試料を使用して、ＴＺＭ−ｂｌ細胞アッセイにより、ＳＨＩＶＤＨ１２＿Ｖ３ＡＤ８分子クローンの中和表現型（力価レベル）を決定した。

【0168】

動物防御力価の決定および統計分析
ウイルスチャレンジ感染した動物の５０または８０％のウイルス獲得を予防する結果となる、各Ｒ５ ＳＨＩＶに対する血漿中の中和力価の算定を、リードおよびミュンヒの方法（Ａｍ Ｊ Ｈｙｇ ２７，４９３−４９７（１９３８））を用いて行った。１つの有意な異常値の動物（ＤＥＷ７）は、算定から割愛した。６０匹すべての受動免疫サルを使用してインビボで滅菌免疫性（ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を付与するために要する血漿中の力価（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ｅｄ．３ｒｄ，２００７）の間の関係を、尤度比検定に基づくこのモデルからのｐ値を含んで、モデル化するために、プロビット回帰を用いた。様々なインビボ防御レベル（３３％、５０％、８０％、９０％および９５％）に必要な血漿力価をプロビッドモデル推定値から決定し、ブートストラップ法を用いて、９０％信頼区画を構築した。

【0169】

結果：
ＳＨＩＶＤＨ１２＿Ｖ３ＡＤ８は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯ同様、Ｔｉｅｒ２抗ＨＩＶ−１中和感受性特性を有した（表１３）。ＳＨＩＶＤＨ１２＿Ｖ３ＡＤ８を静脈内にまたは直腸内に接種したアカゲザルは、感染後（ＰＩ）第２から３週の時点で血漿の１０５から１０７ウイルスＲＮＡコピー／ｍＬの範囲でピークのウイルス血症を呈示した。大部分のＳＨＩＶＤＨ１２＿Ｖ３ＡＤ８感染動物において、血漿ウイルス負荷量は、第８から２０週ＰＩの間にバクグラウンドレベルに低下する。

【0170】

１１の最近報告された広域反応性抗ＨＩＶ−１ ｍＡｂに対するＳＨＩＶＡＤ８ＥＯの中和感受性を、最初にＴＺＭ−ｂｌアッセイシステムにおいて判定した（図１１ＡおよびＢ）。これらの抗体のうちの８つ、ＶＲＣ０１、ＮＩＨ４５−４６（２３）、４５−４６Ｇ５４Ｗ、４５−４６ｍ２、３ＢＮＣ１１７、１２Ａ１２、１ＮＣ９および８ＡＮＣ１９５は、ｇｐ１２０ ＣＤ４ ｂｓを標的にし（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３，１６３３−１６３７（２０１１））、ならびに３つ、１０−１０７４、ＰＧＴ１２１およびＰＧＴ１２６（Ｎａｔｕｒｅ ４７７，４６６−４７０（２０１１））は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｎ３３２グリカンの存在に依存した。ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯに対して試験したとき、３つのグリカン依存性ｍＡｂすべてが、ＣＤ４ ｂｓ ｍＡｂより大きい効力を呈示した（図１１Ａ）。ｇｐ１２０ Ｎ３３２グリカンを標的にする前記３つのｍＡｂについてのＩＣ５０値は、０．０９から０．１５μｇ／ｍＬの範囲であった。ＣＤ４ ｂｓ ｍＡｂは、最も強力である３ＢＮＣ１１７により、はるかに広範囲（０．１４から６．３４μｇ／ｍＬ）のＩＣ５０中和活性を呈示した。中和ｍＡｂ効力の同様の序列（グリカン依存性＞ＣＤ４ ｂｓ依存性）が、ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８でも観察されたが、その中和活性は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯについて観察されたＩＣ５０値と比較してはるかに広い（＞１００倍）範囲にわたって分布した（図１１Ｂ）。ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯより、グリカンターゲッティングｍＡｂに対して多少感受性が高く、ＣＤ４ ｂｓ中和ｍＡｂに対して耐性が高かった。

【0171】

図１１に示した結果に基づき、５つの中和ｍＡｂを曝露前受動伝達研究に選択した：ＶＲＣ０１（これは、特性付けすべき新たに単離された広域作用性ＮＡｂの第一のＣＤ４ｂｓ ＮＡｂであったので）；ＣＤ４ ｂｓ ｍＡｂ ４５−４６ｍ２および３ＢＮＣ１１７（これらの両方は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯおよびＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８に対して強い中和活性を呈示した）；ならびにｇｐ１２０ Ｎ３３２グリカン依存性ｍＡｂ、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４。

【0172】

受動伝達実験についてのプロトコルは、漸減量の中和ｍＡｂの静脈内投与および２４時間後の動物への直腸内チャレンジ感染であった。目標は、ウイルス獲得を阻止することであり、個々のマカクへのヒト化抗ＨＩＶ ｍＡｂの反復投与がそれらの効力を低下させることがあり得、および／またはことによると、アナフィラキシー反応を誘導することがあり得るという知識を加味して、単回接種後にインビボ感染を確立するために十分なサイズのＳＨＩＶチャレンジ感染用量を選択した。これに関して、我々は、アカゲザルにおいてＳＨＩＶＡＤ８の直腸内力価測定を以前に行い、アカゲザルＰＢＭＣにおけるエンドポイント希釈によって決定した１×１０３ ＴＣＩＤ５０の接種が、おおよそ３の動物感染用量５０（ＡＩＤ５０）を投与することと等価であることを報告した（Ｊ．ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８６，８５１６−８５２６（２０１２））。実際、３ ＡＩＤ５０の単回直腸内接種は、１０匹のアカゲザルのうちの１０匹においてＳＨＩＶＡＤ８ＥＯおよびＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８での感染の確立に成功する結果となった。

【0173】

第一の受動伝達実験の対照として、抗デングウイルスＮＳ１ ＩｇＧ１ ｍＡｂを動物に静脈内投与し、２４時間後にＳＨＩＶＡＤ８ＥＯでチャレンジ感染した。両方のサル（ＭＬ１およびＭＡＡ）が急速に感染し、第２週ＰＩに血漿ウイルス血症のピークレベルを生じた。ＶＲＣ０１は、ウイルス獲得に対する防御について試験した第一の抗ＨＩＶ−１中和ｍＡｂであり、それを５０ｍｇ／ｋｇの用量で２匹のマカクに投与した。接種を受けた２匹のマカクのうちの１匹（ＤＥＧＦ）は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯチャレンジ感染から完全に防御され、４５週の観察期間にわたって血漿ウイルス血症の形跡も細胞随伴性ウイルスＤＮＡの形跡もなかった。他方の５０ｍｇ／ｋｇ ＶＲＣ０１レシピエント（ＤＥＨ３）は感染したが、ピークの血漿ウイルス血症が第５週ＰＩまで遅延された。より少量（２０ｍｇ／ｋｇ）のＶＲＣ０１を投与した追加の二匹のマカクは、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯチャレンジ感染から防御されなかった。これらの結果を表１３に要約する。

【0174】

ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯチャレンジ感染に対するＰＧＴ１２１の防御特性を次に調査した。ＰＧＴ１２１は、ＴＺＭ−ｂｌアッセイにおいて測定された最も強力なグリカン標的化中和ｍＡｂの１つであった（図１１）。ＶＲＣ０１で得た結果に基づき、２０ｍｇ／ｋｇでのインビボＰＧＴ１２１ ｍＡｂ力価測定から始めることを選択した。チャレンジ感染を受けた２匹のサル（ＫＮＸおよびＭＫ４）は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯチャレンジ感染に耐えた。より少ない量（すなわち、５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇ）のＰＧＴ１２１を投与したとき、２匹動物のうち１匹、２匹動物のうち２匹、および２匹の動物のうち０匹が、それぞれ防御された（表１３）。

【0175】

ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８獲得を阻止するＶＲＣ０１およびＰＧＴ１２１ ｍＡｂの能力を同様に評価した（表１３）。ＶＲＣ０１で得られた結果は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯチャレンジ感染で観察されたものに匹敵した：３０ｍｇ／ｋｇの２匹のレシピエントのうちの１匹は、ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８感染の確立から防御された。ＰＧＴ１２１ ｍＡｂは、ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８獲得の予防においてＶＲＣ０１より著しく高かった：０．２ｍｇ／ｋｇ ＰＧＴ１２１の２匹のレシピエントのうちの２匹が感染に耐えた。ＰＧＴ１２１は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯインビボ感染に対して、ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８の予防において多少有効であるようでもあった（表１３）。この結果は、インビトロアッセイにおける２つのＳＨＩＶの中和についてのＰＧＴ１２１のＩＣ５０値の８倍差（図１１）と一致する。

【0176】

アカゲザルへの１０−１０７４、３ＢＮＣ１１７または４５−４６ｍ２中和ｍＡｂの受動伝達、続いてのＳＨＩＶＡＤ８ＥＯまたはＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８いずれかでのチャレンジ感染の結果を表１３に要約する。１０−１０７４ ｍＡｂは、両方のＳＨＩＶのインビボ獲得を強力に阻止した。ＣＤ４ｂｓ ３ＢＮＣ１１７および４５−４６ｍ２ ｍＡｂを、図１１に示すインビトロ中和実験における両方のＳＨＩＶに対するそれらのＩＣ５０値に基づいて、マカクへの受動伝達に選択した。３ＢＮＣ１１７は、５ｍｇ／ｋｇで２匹のサルのうちの２匹においてＳＨＩＶＡＤ８ＥＯ感染の阻止に成功したが、１ｍｇ／ｋｇの用量を与えた他の２匹の動物では阻止に成功しなかった（表１３）。これは、同じ量の３ＢＮＣ１１７を、ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８チャレンジ感染を受けたマカクに投与したときに観察された結果（２匹のうちの１匹が５ｍｇ／ｋｇで感染し、２匹のうちの１匹が１ｍｇ／ｋｇで感染した）に類似していた。

【0177】

受動伝達を受けたマカクから様々な時点で採取した血漿試料をＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ ＥＬＩＳＡによって分析して中和ｍＡｂ濃度を決定した。一般に、チャレンジ感染の時点（抗体投与の２４時間後）の各ｍＡｂの血漿濃度は、投与した抗体の用量と相関した（表１３）。

【0178】

血漿ｍＡｂ濃度とインビボ防御の関係を図１２に示す。評価した５つの中和ｍＡｂのうち、ＰＧＴ１２１は、両方のウイルスに対して明らかに最も有効であり、ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８は、このｍＡｂに対してのほうが多少大きい感受性を呈示した（２匹のサルのうちの２匹が０．２μｇ／ｍＬの血漿濃度で防御された）。対照的に、ほぼ４００μｇ／ｍＬのＶＲＣ０１の血漿濃度が、同じＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８チャレンジ感染ウイルスから２匹の動物のうちの１匹を防御するために必要であった（表１３）。この研究でマカクに投与した最も強力なＣＤ４ ｂｓ ｍＡｂ、３ＢＮＣ１１７は、いずれかのＳＨＩＶの獲得を予防する点でもＶＲＣ０１よりおおよそ６から１０倍有効であった（図１２、表１３）。

【0179】

ＰＧＴ１２１、１０−１０７４、３ＢＮＣ１１７およびＶＲＣ０１ ｍＡｂの循環半減期は、かなり似ていた：それぞれ３．５日、３．５日、３．３日および３．１日。対照的に、４５−４６ｍ２の半減期は極度に短く、決定することができなかった。２０ｍｇ／ｋｇのヒト化中和ｍＡｂ投与の２４時間後の数匹のマカクにおける血漿ｍＡｂ濃度（すなわち、おおよそ２５０μｇ／ｍＬ［表１３］）に基づき、２０ｍｇ／ｋｇの４５−４６ｍ２を受けた２匹のサルは、１５．０および１７．６μｇ／ｍＬの血漿ｍＡｂ濃度しか有さず、これは、２４時間での他の中和ｍＡｂに比べて９５％より大きな減衰であった。

【0180】

マカクをＳＨＩＶＡＤ８ＥＯおよびＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８でチャレンジ感染したとき、ｍＡｂ投与の２４時間後に採取した血漿試料を用いて中和力価を測定した。表１３に示すように、抗ウイルス血漿中和力価とＳＨＩＶ感染からの防御との間に良好な相関関係が観察された。２つのグリカン依存性ｍＡｂ（ＰＧＴ１２１および１０−１０７４）の投与の結果、ウイルスチャレンジ感染時に抗ＨＩＶ−１中和活性の最高力価が明確に得られた。４５−４６ｍ２ ｍＡｂのレシピエントにおいて測定された力価は、その極度に短いインビボ半減期のため、検出限界であったかまたは検出不能であった。

【0181】

チャレンジ感染を受けたサルの５０％においてウイルス獲得を予防するために必要とされる、血漿中で測定される、中和力価を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈにより記載された方法（Ａｍ Ｊ Ｈｙｇ ２７，４９３−４９７（１９３８））を用いて算定した。ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯでチャレンジ感染した２８匹のサル、またはＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８でチャレンジ感染した３２匹のサルについて、これらの防御力価を別々に導出した（表１５および１６）。ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯまたはＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８でチャレンジ感染した動物の５０％を防御するために要する血漿中和力価をそれぞれ１：１１５および１；９６であると算定した。これらの類似した力価が、１）同一の経路および接種サイズによるＳＨＩＶチャレンジ感染および２）同じ中和ｍＡｂ集団の投与後に得られたので、６０匹すべての動物からの中和データを併せ、プロビット回帰に付して、血漿中和力価とインビボ防御との関係を調査した。さらなる確認として、ＳＨＩＶウイルスについての項を６０匹すべてのマカクに関するプロビット回帰モデルに含めたとき、２つのＳＨＩＶウイルス間の差の証拠はなかった（ｐ＝０．１６）。６０匹のマカクの群全体に適用したとき、プロビット回帰は、１：１０４の血漿中和力価が動物の５０％においてウイルス獲得を予防すると推定した。データのプロビッド分析により、１：５７または１：３２９の５０％血漿中和力価が、被曝動物のそれぞれ３３％または８０％を防御することも推定した。

【0182】

実施例１０ 慢性感染のＨＩＶインビボモデルへの中和ｍＡＢの投与
方法の要約：ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯに対する広域作用性３ＢＮＣ１１７２４および１０−１０７４２３中和ｍＡｂの中和活性を、最初に、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯに対するＴＺＭ−ｂｌ細胞システムで判定した。Ｒ５指向性ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯでチャレンジ感染した慢性感染の動物におけるウイルス獲得を阻止するまたは血漿ウイルス血症を制御するそれらの能力を、血漿ウイルス負荷量および細胞随伴性ウイルス核酸をモニターすることにより評価した；ＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットのレベルをフローサイトメトリーによって測定した。循環ウイルス変異体のＳＧＡ分析および血漿中の抗体レベルの決定。ＮＡｂの血漿濃度を、１０−１０７４または３ＢＮＣ１１７のいずれかにのみ感受性があるＨＩＶ−１シュードウイルス調製物に対する中和活性を測定することによって決定した。

【0183】

結果：
慢性感染マカクの２つの群を評価した。１５９週間感染しており、循環ＣＤ４＋ Ｔ細胞の類似したおよび有意な減少を続けた２匹の臨床的に無症状の動物（ＤＢＺ３およびＤＣ９９Ａ）からなる第一の群（表１７）。進行中のＳＨＩＶ感染を治療するための治療法は、１０１０７４と３ＢＮＣ１１７の１０ｍｇ／ｋｇ用量での併用投与であった。ｍＡｂ投与時、マカクＤＢＺ３およびＤＣ９９Ａにおける血漿ウイルス負荷量は、それぞれ１．０８×１０４および７．６×１０３ＲＮＡコピー／ｍＬであった。両方のサルは、併用抗ＨＩＶ−１ ｍＡｂ治療に応答し、血漿ウイルス血症が直ぐにおよび急速に低減されて７から１０日以内に検出不能レベルになった。２つのｍＡｂの単回投与後の、マカクＤＢＺ３およびＤＣ９９Ａの血漿中の測定可能なＳＨＩＶＡＤ８ＥＯの抑制は、それぞれ、２７および４１日続いた。各場合において、血漿ウイルス血症は、治療前のレベルに逆戻りした。

【0184】

各々が同じく３年より長くＳＨＩＶＡＤ８ＥＯに感染しており、ならびに間欠性下痢およびまたは食欲低下の臨床な症状があった３匹の動物（ＤＢＸ３、ＤＣＦ１およびＤＣＭ８）の第二の群を、２つの中和抗体で治療した（表１７）。ｍＡｂ投与時、マカクＤＣＭ８における循環ＣＤ４＋ Ｔ細胞のレベルは、４３細胞／μＬしかなく、動物ＤＣＦ１（１０５細胞／μＬ）およびＤＢＸＥ（１５８細胞／μＬ）でのほうが多少高かった。血漿ウイルス負荷量は、動物ＤＢＸＥおよびＤＣＦ１では１０５ＲＮＡコピー／ｍＬを超えており、サルＤＣＭ８では有意に、より低かった（１．５９×１０３ ＲＮＡコピー／ｍＬ）。２つのｍＡｂのサルＤＢＸＥへの投与は、第０日での２．０×１０５ ＲＮＡコピーから第２０日での検出不能な血漿中レベルへの二相性の低下をもたらした。この後、数日以内に、ＤＢＸＥでは高い循環ウイルスレベルが復活した。より少量の血漿ウイルス負荷量および非常に少ない循環ＣＤ４＋ Ｔ細胞数を有するマカクＤＣＭ８は、ｍＡｂ処置開始後第６日と第２０日の間にウイルス血症の検出不能なレベルへの急速な低下を経験した。最後に、広域反応性抗ＨＩＶ−１ ＮＡｂを産生することが以前に報告されている動物ＤＣＦ１は、併用ｍＡｂ療法に応答して第６日までに血漿ウイルス血症の一時的および比較的ささやかな２７倍の低下を呈示した後、ウイルス負荷量が、高い治療前レベルに戻った。

【0185】

ＰＢＭＣ随伴性ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡレベルも抗体投与前および後に決定した（表１８）。各動物について、ｍＡｂ治療は、血漿ウイルス負荷量測定値とよく相関して細胞随伴性ウイルスＲＮＡレベルの低下をもたらした。抗体治療の結果として細胞随伴性ウイルスＤＮＡレベルについて一貫したパターンは観察されなかった。慢性ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯ感染サルへの中和ｍＡｂの投与も、特に、非常に高いウイルス負荷量を有する動物では、循環ＣＤ４＋ Ｔ細胞レベルに有益な効果を及ぼした。マカクＤＢＸＥおよびＤＣＦ１におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞数は、ｍＡｂ媒介ウイルス抑制期間には２から３倍増加したが、ウイルス血症が再び検出可能になるにつれて治療前のレベルに徐々に減少した。

【0186】

各ｍＡｂの血漿濃度を、一方または他方に感受性だが両方の抗体には感受性でない選択ＨＩＶ−１シュードウイルス株に対する血漿中和活性を測定することによって決定した（図１３Ａ）。すべての治療動物において、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯウイルス血症の抑制が、おおよそ１から３μｇ／ｍＬの閾血漿ｍＡｂ濃度に達するまで維持された（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。これは、血漿ウイルスＲＮＡレベルのささやかな一時的低下が観察されたマカクＤＣＦ１にも当てはまった。興味深いことに、臨床症状のあるマカクＤＣＭ８およびＤＣＦ１に投与されたｍＡｂは、半減期を短縮したか、または検出不能であった。前に述べたように、マカクＤＣＭ８は、極度に低いＣＤ４＋ Ｔ細胞レベル（４３細胞／μＬ血漿））を有し、マカクＤＣＦ１は、その悪化する臨床状態のため、治療開始後第５６日に安楽死させなければならなかった。ＤＣＦ１の剖検は、播種性胃腸クリプトスポリジウム症、膵炎および胆管炎を特徴とする、重度の腸症を明らかにした。

【0187】

ＳＧＡ分析を用いて、アミノ酸置換が、１０−１０７４または３ＢＮＣ１１７ ｍＡｂに対する感受性に影響を及ぼすと以前に示されたｇｐ１２０領域において起こったかどうかを判定した。各場合、免疫治療後に血漿中に存在するリバウンドウイルスは不変であった。再出現ウイルスの感受性をさらに試験するために、１０−１０７４と３ＢＮＣ１１７の併用療法（各々の１０ｍｇ／ｋｇ）を２匹の臨床的に無症状のサル（ＤＢＺ３およびＤＣ９９Ａ）に再び投与した。各動物のウイルス負荷量は、再び急速に降下し、第二免疫治療サイクルの第７日の時点で検出不能になった。ウイルス血症は、マカクＤＢＺ３において７日間、およびサルＤＣ９９Ａにおいて２１日より長く抑制された。考え合わせると、これらの結果は、これらの２匹の動物における第一処置サイクル後のウイルスの再出現は、抗体選択ウイルス耐性ではなくインビボでの不十分なｍＡｂレベルを表したことを示唆する。

【0188】

【表3】

【0189】

【表4】

【0190】

【表5】

【0191】

【表6】

【0192】

【表7】

【0193】

【表8】

【0194】

【表9】

【0195】

【表10】

【0196】

【表11】

【0197】

【表12】

【0198】

【表13】

【0199】

【表14】

【0200】

【表15】

【0201】

【表16】

【0202】

【表17】

【0203】

【表18】

【0204】

好ましい実施形態の上述の実施例および説明は、クレームによって定義される本発明を制限するものではなく、例証するものと考えるべきである。容易に理解されるように、上記の特徴の非常に多くの変形形態および組み合わせを、クレームに記載の本発明から逸脱することなく用いることができる。かかる変形形態は、本発明の範囲からの逸脱とはみなされず、すべてのかかる変形形態は、後続のクレームの範囲内に含まれると解釈される。本明細書において引用するすべての参考文献は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]